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KR20100115186A - 병원성 미생물 검출용 프라이머, 이를 이용한 병원성 미생물의 검출방법 및 검출키트 - Google Patents

병원성 미생물 검출용 프라이머, 이를 이용한 병원성 미생물의 검출방법 및 검출키트 Download PDF

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KR20100115186A
KR20100115186A KR1020090033798A KR20090033798A KR20100115186A KR 20100115186 A KR20100115186 A KR 20100115186A KR 1020090033798 A KR1020090033798 A KR 1020090033798A KR 20090033798 A KR20090033798 A KR 20090033798A KR 20100115186 A KR20100115186 A KR 20100115186A
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유선아
이수리
임정화
명지선
이민수
전향숙
최성욱
이나리
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시드바이오칩스(주)
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Abstract

본 발명은 병원성 미생물 검출용 프라이머, 이를 이용한 병원성 미생물의 검출방법 및 검출키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식품에 위해한 병원성 미생물의 특정 유전자를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머, 상기 프라이머를 사용한 중합효소연쇄반응을 통해 식중독의 원인이 되는 병원성 미생물들을 검출하는 방법 및 검출키트에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머를 사용한 병원성 미생물의 검출방법은 정확하고 신속하게 병원성 균을 검출할 수 있는 효과가 있으며 미생물의 농도가 100 내지 1 CFU/ml인 미량 농도에서도 병원성 균을 검출할 수 있는 효과가 있다.
병원성, 미생물, 프라이머, 식중독, 중합효소연쇄반응

Description

병원성 미생물 검출용 프라이머, 이를 이용한 병원성 미생물의 검출방법 및 검출키트{PCR primer for detecting pathogenic microorganism, and method and test kit for detecting pathogenic microorganism using the same}
본 발명은 병원성 미생물 검출용 프라이머, 이를 이용한 병원성 미생물의 검출방법 및 검출키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식품에 위해한 병원성 미생물의 특정 유전자를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머, 상기 프라이머를 사용한 중합효소연쇄반응을 통해 식중독의 원인이 되는 병원성 미생물들을 검출하는 방법 및 검출키트에 관한 것이다.
최근들어 식생활의 패턴 변화와 급격한 환경 변화로 인해 식중독 발생 비중이 점차 증가하고 있고 규모 면에서도 집단화 및 대형화가 되고 있어 현 시점에서 식품 안정성을 확보하기 위한 대책이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
일반적으로 식품 안정성의 확보는 식품 안정성 확보를 위한 미생물학적 검사의 유효성을 확보하는 것과 매우 밀접하게 연관되어 있는데, 미생물학적 측면에서 식품을 평가하는 것은 식품의 품질관리를 목적으로 식품의 미생물 오염 정도와 그 식품에 이용되고 있는 유용한 미생물을 확인하는 것 및 어떤 식품이 어떤 병원성 미생물에 오염 되었는가를 분석하는 것에 그 의의가 있다. 따라서 미생물학적 검사와 관련하여 단시간에 질병을 유발할 수 있는 세균성 식중독의 원인균을 조기에 발견하고 예방할 뿐만 아니라 집단적인 발병을 막을 수 있는 검사 시스템의 개발은 매우 중요한 문제라 할 수 있다.
한편, 미국 질병통계 및 예방센터의 통계에 의하면, 식품매개에 의해 연간 500만건 이상의 질병이 발생하고 있고, 이 중 약 4000명은 사망하는 것으로 알려져 있으며, 우리나라의 경우에도 매년 발병 통계가 증가하고 있고, 원인 식품으로는 육류 및 식육가공품이 약 50% 이상을 차지하고 있으며 원인병원체는 살모넬라균이 약 50%, 포도상구균이 약 20% 인 것으로 알려져 있다.
이와 같이 식품매개에 의해 발명하는 질병들 중, 특히 식중독이란 발열, 구토질, 구토, 설사 및 복통 등의 증세를 동반하는 질환으로 세균이 원인인 세균성 식중독이 대부분을 차지한다. 상기 세균성 식중독은 그 발병 형태에 따라 감염형과 독소형으로 분류되며, 감염형 식중독은 오염된 식품의 섭취시 세균이 장관 내에서 증식하여 일으키는 식중독으로, 살모넬라 속 균(Salmonella spp), 대장균 O157(Escherichia . coli O157 : H7, E. coli O157:H7) 또는 비브리오 속 균(Vibrio sp .) 등이 주된 원인균이다. 독소형 식중독은 식품 중에서 세균이 증식하면서 독소를 생산하여 식품 내에 존재하는 독소를 섭취함으로써 발생하는 식중독이다. 따라서 이러한 경우 원인균이 식품 내에서 이미 사멸되었어도 독소가 잔존할 때에는 식중독이 발생할 수 있으며, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 등이 주된 원인균이다.
따라서 최근에는 이러한 식중독을 일으킬 수 있는 병원성 미생물들을 조기에 검출하고 미량의 병원성 미생물도 검출할 수 있는 방법들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 대한민국 공개특허 제1999-65107호에는 중합효소연쇄반응을 이용하여 병원성 대장균 O157:H7이 가지고 있는 특이 유전자를 검출할 수 있는 다종 유전자 동시 검출방법이 개시된 바 있다.
그러나 이러한 종래기술에 따른 병원성 미생물을 검출할 수 있는 방법들은 비교적 높은 농도의 미생물이 존재할 경우에만 검출이 가능하기 때문에 낮은 농도의 미생물이 존재 시에는 병원균의 존재를 검출하지 못하는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 식품에 위해한 11종의 병원성 미생물들에 대해 상기 균들의 특이 유전자만을 증폭하여 미생물들의 존재를 검출할 수 있는 프라이머들을 고안하였으며, 상기 프라이머들을 이용한 PCR 방법으로 매우 낮은 농도의 미생물도 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 식품에 위해한 병원성 미생물 검출용 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 병원성 미생물 검출용 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응으로 병원성 미생물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 병원성 미생물 검출용 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응으로 병원성 미생물을 검출할 수 있는 검출키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어진 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어진 살모넬라 속 균주(Salmonella spp.)검출용 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18, 또는 서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)검출용 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어진 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. coli : ETEC)검출용 프라이머 쌍; 및 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 및 서열번호 29와 30의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 중에서 선택되는 대장균 O157(E. coli O157:H7)검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 병원성 미생물 검출용 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)으로 병원성 미생물을 탐지하는 단계를 포함하는 병원성 미생물 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 상기 프라이머, 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 병원성 미생물 검출키트를 제공한다.
본 발명의 병원성 미생물 검출용 프라이머는 식품에 위해한 병원성 미생물의 오염 여부를 빠르고 용이하게 판정할 수 있을 뿐만 아니라 병원성 미생물의 농도가 1 CFU/ml인 미량의 농도에서도 병원성 균을 검출할 수 있으므로 세균성 식중독의 예방에 매우 효과적으로 활용될 수 있으며, 나아가 식품 위해 미생물을 검출할 수 있는 제품의 상용화에도 활용될 수 있으므로 산업적 측면에서도 그 효과가 매우 크 다고 할 수 있다.
본 발명은 식품에 위해한 병원성 미생물 검출용 프라이머 및 상기 프라이머를 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 병원성 미생물이란 식품을 매개로 인간에게 발생하는 질병의 원인균을 의미하며, 바람직하게는 식중독을 유발하는 병원성 미생물일 수 있다.
상기 병원성 미생물은 바람직하게는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .), 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. col : ETEC) 및 대장균 O157(E. coli O157:H7)일 수 있다.
본 발명의 병원성 미생물 검출용 프라이머는 각각의 병원성 미생물의 특이 유전자를 탐지하여 병원성 미생물을 검출할 수 있는 프라이머를 말하며, 바람직하게는 상기 병원성 미생물의 특이 유전자를 탐지하여 병원성 미생물의 특이 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 프라이머 쌍은 상기 기재된 병원성 미생물들 중, 1종 이상의 미생물을 검출할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있고, 바람직하게는 11종의 병원성 미생물의 특이 유전자를 동시에 탐지할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있으며, 구체적으로는, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어진 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어진 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .)검출용 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18, 또는 서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)검출용 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어진 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. coli: ETEC)검출용 프라이머 쌍; 및 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 및 서열번호 29와 30의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 중에서 선택되는 대장균 O157(E. coli O157:H7)검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 병원성 미생물 검출용 프라이머 쌍 중에서 하기에 기재된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라 이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머 쌍은 리스테리아 모노사이토게네스의 특이 유전자를 약 407bp로 증폭시킬 수 있다.
서열번호 1(SBC-IAP-2-F): 5'-GCAGAAGTGAAAACGGAAGC-3'
서열번호 2(SBC-IAP-2-R): 5'-CCGTTACCACCCCATGAATA-3'
또한, 하기에 기재된 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 쌍은 스타필로코커스 아우레우스의 특이 유전자를 약 301bp로 증폭시킬 수 있다.
서열번호 3(SBC-NUCA-4-F): 5'-TTAATTAAAGCGATTGATGGTG-3'
서열번호 4(SBC-NUCA-4-R): 5'-CATAAGCAACTTTAGCCAAGC-3'
하기 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 검출용 프라이머 쌍은 쉬겔라 속 균주의 특이 유전자를 약 369bp로 증폭시킬 수 있으며, 상기 쉬겔라 속 균주는 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)로 이루어진 군중에서 선택될 수 있다.
서열번호 5(SBC-IPAH-2-F): 5'-GGAGCTTCGACAGCAGTCTT-3'
서열번호 6(SBC-IPAH-2-R): 5'-GAGGGAGAACCAGTCCGTAA-3'
하기 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열 로 이루어진 프라이머로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 쌍은 클로스트리디움 퍼프리젠스의 특이 유전자를 419bp로 증폭시킬 수 있다.
서열번호 7(SBC-CPE-1-F): 5'-TGGTTGGATATTAGGGGAACC-3'
서열번호 8(SBC-CPE-2-R): 5'-AAACACATCTTTCACCAGTTTCAA-3'
하기 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머 쌍은 캄필로박터 제주니의 특이 유전자를 723bp로 증폭시킬 수 있다.
서열번호 9(SBC-HIPO-1-F): 5'-AACCTGCTGAAGAGGGTTTG-3'
서열번호 10(SBC-HIPO-1-R): 5'-TTGCAGCCCTAGCTAAAAGC-3'
하기 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)검출용 프라이머 쌍은 바실러스 세레우스의 특이 유전자를 350bp로 증폭시킬 수 있다.
서열번호 11(SBC-entFM-2-F): 5'-GGTGGCAAAACAGGAACGAC-3'
서열번호 12(SBC-entFM-2-R): 5'-AGCGTTGTATGTAGCTGGGC-3'
하기 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)검출용 프라이머 쌍은 예르시니아 엔테로콜리티카의 특이 유전자를 205bp로 증폭시킬 수 있다.
서열번호 13(SBC-AIL-2-F): 5'-TTATGCGCAAAGCCATGTAA-3'
서열번호 14(SBC-AIL-2-R): 5'-TGGCCCCATTGTTACTGAAT-3'
하기 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 살모넬라 속 균주(Salmonella spp.)검출용 프라이머 쌍은 살모넬라 속 균주의 특이 유전자를 217bp로 증폭시킬 수 있으며, 상기 살모넬라 속 균주는 살모넬라 콜레라에슈이스(Salmonella choleraesuis subsp), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 본고리(Salmonella bongori) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
서열번호 15(SBC-INVA-5-F): 5'-TGGTTGATTTCCTGATCGCA-3'
서열번호 16(SBC-INVA-5-R): 5'-CCAATAACGAATTGCCCGAA-3'
하기 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)검출용 프라이머 쌍, 및 하기 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)검출용 프라이머 쌍은 비브리오 파라헤몰리티커스의 특이 유전자를 각각 285bp 및 170bp로 증폭시킬 수 있다.
서열번호 17(SBC-GYRB-1-F): 5'-CGGTAGTAAACGCACTGTCA-3'
서열번호 18(SBC-GYRB-1-R): 5'-AGTGATCTTGCTTGTCCGCT-3'
서열번호 19(SBC-TOXR-3-F): 5'-TAGCGACGCCTTCTGACGCA-3'
서열번호 20(SBC-TOXR-3-R): 5'-ACGGAACTGAGATTCCGCTG-3'
하기 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. coli : ETEC)검출용 프라이머 쌍, 및 하기 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. col: ETEC)검출용 프라이머 쌍은 장독성 대장균의 특이 유전자를 각각 298bp 및 116bp로 증폭시킬 수 있다.
서열번호 21(SBC-LT-3-F): 5'-CCCTCACCCATATGAACAGG-3'
서열번호 22(SBC-LT-3-R): 5'-CTGGGTCTCCTCATTACAAG-3'
서열번호 23(SBC-STh-1-F): 5'-CCCTCACCCATATGAACAGG-3'
서열번호 24(SBC-STh-1-R): 5'-CTGGGTCTCCTCATTACAAG-3'
또한, 하기 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 대장균 O157(E. coli O157:H7)검출용 프라이머 쌍, 하기 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 대장균 O157(E. coli O157:H7)검출용 프라이머 쌍, 및 하기 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 대장균 O157(E. coli O157:H7)검출용 프라이머 쌍은 대장균 O157의 특이 유전자를 각각 331bp, 111bp 및 213bp로 증폭시킬 수 있다.
서열번호 25(SBC-STX1-3-F): 5'-CTGTGGCAAGAGCGATGTTA-3'
서열번호 26(SBC-STX1-3-R): 5'-GCCGGACACATAGAAGGAAA-3'
서열번호 27(SBC-STX2-1-F): 5'-GTTCCGGAATGCAAATCAGT-3'
서열번호 28(SBC-STX2-1-R): 5'-TGACAAAACGCAGAACTGCT-3'
서열번호 29(SBC-UIDA-3-F): 5'-GAATTGAGCAGCGTTGGTGG-3'
서열번호 30(SBC-UIDA-3-R): 5'-TTGACCCACACTTTGCCGTA-3'
따라서 본 발명의 병원성 미생물 검출용 프라이머 쌍은 11종의 병원성 미생물 각각에 대하여 특이성을 가지고 있을 뿐만 아니라 균주별로 특이 유전자를 서로 다른 크기로 증폭시킬 수 있기 때문에 11종의 병원성 미생물을 동시에 탐지할 수 있다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 상기 병원성 미생물 검출용 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)으로 병원성 미생물을 탐지하는 단계를 포함하는 병원성 미생물 검출방법을 제공한다.
상기 병원성 미생물 검출방법에서 사용될 수 있는 프라이머는, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 쌍;서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어진 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어진 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .)검출용 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18, 또는 서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)검출용 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어진 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. coli : ETEC)검출용 프라이머 쌍; 및 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 및 서열번호 29와 30의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 중에서 선택되는 대장균 O157(E. coli O157:H7)검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍일 수 있다.
또한, 상기 PCR은 당업계에 공지된 통상의 PCR 기기를 사용하여 일반적인 PCR 반응 조건에 따라 수행될 수 있거나 또는 일부 변형하여 실시할 수 있다. 상기 PCR을 이용한 병원성 미생물을 탐지하는 방법은 본 발명의 미생물 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 각 미생물의 특정 DNA를 증폭시킨 후, 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계를 통해 수행될 수 있으며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 PCR 반응산물이 전기영동 등을 통하여 예상되는 DNA 산물의 크기와 일치하는지를 확인함으로써 수행될 수 있다.
또한 상기 미생물 검출방법에 사용되는 주형 DNA의 시료는 병원성 미생물이 발견될 수 있는 모든 물질, 바람직하게는 식품, 사료 및 가검물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 식품으로부터 수득할 수 있다.
상기 주형 DNA는 당업계에서 통상적으로 사용되는 DNA 추출방법을 통해 수득할 수 있으며, 상기 DNA 추출방법은 이에 제한되지는 않으나, 알카라인 추출법, 열수추출법, 컬럼 추출법 및 페놀/클로로포름 추출법 일 수 있고, 바람직하게는 열수추출법일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 인위적으로 병원성 미생물에 오염된 식품, 즉, 스킴 밀크(skim milk)의 시료를 채취하고, 이를 생리식염수에 현탁한 후 프로타아제 K(Proteinase K)를 처리하였고, 이후 열수추출하여 PCR 반응에 필요한 주형 DNA를 수득하였으며, 본 발명의 미생물 검출용 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 통상적인 PCR 검출 수단인 전기영동을 통해 증폭된 DNA 산물 크기가 사용한 프라이머의 예상 PCR 반응산물의 크기와 일치하는지를 확인함으로써 상기 시료로부터 병원성 미생물의 존재 여부를 확인할 수 있었다. 또한 상기와 같은 본 발명의 방법을 통해 스킴 밀크에 약 1 CFU/ml의 미량의 농도로 존재하는 병원성 미생물도 검출할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 병원성 미생물 검출방법은 미생물의 특이 유전자의 증폭 여부만으로도 미생물의 존재 여부를 확인할 수 있기 때문에 시료에 존재하는 미생물을 매우 쉽고 빠르게 검출할 수 있을 뿐만 아니라 기존의 미생물을 검출할 수 있는 한계인 약 105 CFU/ml를 약 100 내지 1 CFU/ml로 증진시킬 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 본 발명의 미생물 검출용 프라이머 쌍을 포함하는 병 원성 미생물 검출용 검출키트를 제공한다.
상기 검출키트는 상기 미생물 검출용 프라이머 쌍 및 중합효소연쇄반응을 이용한 미생물 검출키트의 통상적인 구성성분을 포함할 수 있으며, 상기 통상적인 구성성분은 반응완충액, DNA 중합효소 및 dNTP 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 병원성 미생물 검출키트는 상기 기술한 본 발명에 따른 병원성 미생물 검출용 프라이머 쌍, 즉, 각 균주별 프라이머 쌍으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍, Taq DNA 중합효소, dNTP, 완충용액 및 주형 DNA를 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
병원성 미생물들의 게놈 DNA 수득
본 발명자들은 식품에 위해한 병원성 미생물의 지표 세균인 리스테리아속(Listeria) 1종, 스타필로코코스속(Staphylococcus) 1종, 쉬겔라속(Shigella) 3종, 클로스트리듐속(Clostridium) 1종, 캄필로박터속(Campylobacter) 1종, 바실러스속(Bacillus) 1종, 예르시니아속(Yersinia) 1종, 살모넬라속(Salmonella) 4종, 비브리오속(Vibrio) 1종, 독소형 박테리아속(ETEC) 1종 및 대장균(E. coli) 1종의 미생물을 포함한 총 11종에 속하는 16종류의 병원성 미생물들을 한국 미생물 보존 센터, 한국 생물자원 센터 및 The global bioresource 센터로부터 구입하였고, 상기 균주들을 하기 표 1에 기재된 배양 조건에 따라 배양한 후, QiaAmp DNA 정제 키트(QIAGEN)를 사용하여 각 미생물들의 게놈 DNA를 추출하였다.
배양조건
배지 균주
BHI(37℃) 바실러스속(Bacillus)
클로스트리듐속(Clostridium)(43℃ 혐기성)
리스테리아속(Listeria)
예르시니아속(Yersinia)
쉬겔라속(Shigella)
LB(37℃) 살모넬라속(Salmonella)
독소형 박테리아속(ETEC)
비브리오속(Vibrio)
스타필로코코스속(Staphylococcus)
대장균(E. coli)
CB, NB 캄필로박터속(Campylobacter)(42℃ 미호기성)
상기에서 BHI(Brain heart infusion) 배지는 BD사(미국)로부터 구입한 것을 사용하였고, 상기 LB(Luria-bertani) 배지는 머크사(독일)로부터 구입한 것을 사용하였으며, 상기 CB(Campy BAP) 배지는 한일코메드(대한민국)로부터 구입한 것을 사용하였고, 상기 NB(Nutrient broth) 배지는 BD사(미국)로부터 구입한 것을 사용하였다.
< 실시예 2>
병원성 미생물들의 특이 유전자 증폭용 프라이머의 설계 및 합성
본 발명자들은 상기 실시예 1의 식품 위해식중독을 일으킬 수 있는 병원성 미생물들에 대해 각 미생물들의 특이 유전자들을 증폭하여 병원성 미생물들을 탐지할 수 있도록 하기에 기재된 표 1의 PCR 프라이머들을 설계 및 합성하였고, 이때 상기 프라이머들은 프라이머의 Tm 값 및 CG%가 각각 50~60℃ 및 40~55%의 범위가 되도록 하였다.
고안된 프라이머들의 목록
검출 미생물 프라이머 염기서열 서열
번호		 증폭산물 크기(bp)
Listeria monocytogenes SBC-IAP-2-F 5'-GCAGAAGTGAAAACGGAAGC-3' 1 407
SBC-IAP-2-R 5'-CCGTTACCACCCCATGAATA-3' 2
Staphylococcus aureus SBC-NUCA-4-F 5'-TTAATTAAAGCGATTGATGGTG-3' 3 301
SBC-NUCA-4-R 5'-CATAAGCAACTTTAGCCAAGC-3' 4
Shigella spp. SBC-IPAH-2-F 5'-GGAGCTTCGACAGCAGTCTT-3' 5 369
SBC-IPAH-2-R 5'-GAGGGAGAACCAGTCCGTAA-3' 6
Clostridium perfringens SBC-CPE-1-F 5'-TGGTTGGATATTAGGGGAACC-3' 7 419
SBC-CPE-2-R 5'-AAACACATCTTTCACCAGTTTCAA-3' 8
Campylobacter jejuni SBC-HIPO-1-F 5'-AACCTGCTGAAGAGGGTTTG-3' 9 723
SBC-HIPO-1-R 5'-TTGCAGCCCTAGCTAAAAGC-3' 10
Bacillus cereus SBC-entFM-2-F 5'-GGTGGCAAAACAGGAACGAC-3' 11 350
SBC-entFM-2-R 5'-AGCGTTGTATGTAGCTGGGC-3' 12
Yersinia enterocolitica SBC-AIL-2-F 5'-TTATGCGCAAAGCCATGTAA-3' 13 205
SBC-AIL-2-R 5'-TGGCCCCATTGTTACTGAAT-3' 14
Salmonella spp . SBC-INVA-5-F 5'-TGGTTGATTTCCTGATCGCA-3' 15 217
SBC-INVA-5-R 5'-CCAATAACGAATTGCCCGAA-3' 16
Vibrio parahaemolyticus SBC-GYRB-1-F 5'-CGGTAGTAAACGCACTGTCA-3' 17 285
SBC-GYRB-1-R 5'-AGTGATCTTGCTTGTCCGCT-3' 18
SBC-TOXR-3-F 5'-TAGCGACGCCTTCTGACGCA-3' 19 170
SBC-TOXR-3-R 5'-ACGGAACTGAGATTCCGCTG-3' 20
Enterotoxigenic E. coli (ETEC) SBC-LT-3-F 5'-CCCTCACCCATATGAACAGG-3' 21 298
SBC-LT-3-R 5'-CTGGGTCTCCTCATTACAAG-3' 22
SBC-STh-1-F 5'-CCCTCACCCATATGAACAGG-3' 23 116
SBC-STh-1-R 5'-CTGGGTCTCCTCATTACAAG-3' 24
E. coli O157:H7 SBC-STX1-3-F 5'-CTGTGGCAAGAGCGATGTTA-3' 25 331
SBC-STX1-3-R 5'-GCCGGACACATAGAAGGAAA-3' 26
SBC-STX2-1-F 5'-GTTCCGGAATGCAAATCAGT-3' 27 111
SBC-STX2-1-R 5'-TGACAAAACGCAGAACTGCT-3' 28
SBC-UIDA-3-F 5'-GAATTGAGCAGCGTTGGTGG-3' 29 213
SBC-UIDA-3-R 5'-TTGACCCACACTTTGCCGTA-3' 30
< 실시예 3>
본 발명의 프라이머들을 이용한 각 균주별 특이 유전자의 증폭 및 서열분석
본 발명자들에 의해 고안된 상기 실시예 2의 프라이머들이 실제로 각 병원성 미생물들의 특이 유전자들을 증폭시켜 병원성 미생물을 검출할 수 있는지 확인하기 위해 PCR(중합효소연쇄반응)을 수행하였다. 이때 PCR을 위한 프라이머는 상기 실시예 2에서 설계한 15쌍의 각 균주별 프라이머쌍을 각각 사용하였고, 주형은 상기 실시예 1에서 수득한 균주들의 게놈 DNA를 사용하였다. 각 균주별 프라이머쌍을 사용하여 수행한 PCR의 조건은 하기 표 3에 기재된 바와 같고, 각 반응액의 조성에 있어서, 10× ExTaq 버퍼 및 10mM dNTP 혼합액의 농도는 모든 반응액 각각에 대하여 최종 농도가 1× 및 0.8mM이 되도록 하였으며, 그 외의 각 균주별 PCR 반응액의 조성은 하기 표 3에 기재된 바와 같다.
Figure 112009023477736-PAT00001
PCR이 끝난 후, 각 반응액 중 5ul를 2% 아가로즈 젤에 전기영동하여 프라이머 설계 시 각 종별로 예상하는 PCR 산물이 증폭되었는지 확인하였고, 남은 45ul는 1.5% 아가로즈 젤에 전기영동 한 후, 인비트로젠의 젤 추출 키트(gel extraction kit)를 사용하여 PCR 반응 산물의 DNA 절편을 추출하였다. 이후 상기 추출한 각 종별로 증폭된 DNA 절편들은 서열분석을 위해 프로메가의 pGEM-T easy 벡터로 클로닝하였고, 이를 박테리아에 형질 전환 시킨 후, Ampicillin/X-gal/IPTG LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 이때 형성된 콜로니들 중 상기 PCR 반응 산물의 DNA 절편이 올바르게 클로닝된 흰색 콜로니들만을 선별하여 LB 배지에서 배양한 후, 인비트로젠의 플라스미드 DNA miniprep 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 이후 상기 추출한 플라스미드 DNA는 솔젠트(주)에 의뢰하여 클로닝된 유전자, 즉, 증폭된 DNA의 염기서열을 분석하였다.
그 결과, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 Listeria monocytogenes 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서는 예상 크기의 407bp DNA 절편이 증폭된 것을 확인하였고, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍과 Staphylococcus aureus 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서는 예상 크기의 301bp DNA 절편이 증폭된 것을 확인하였으며, 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍과 쉬겔라속(Shigella)에 속하는 Shigella boydii , Shigella flexneri 및 Shigella sonnei 각각의 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서는 예상 크기의 369bp DNA 절편이 증폭된 것을 확인하였고, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍과 Clostridium perfringens 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서는 예상 크기의 419bp DNA 절편이 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍과 Campylobacter jejuni 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서는 예상 크기의 723bp DNA 절편이 증폭된 것을 확인하였고, 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍과 Bacillus cereus 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서는 예상 크기의 350bp DNA 절편이 증폭된 것을 확인하였으며, 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍과 Yersinia enterocolitica 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서는 예상 크기의 205bp DNA 절편이 증폭된 것을 확인하였으며, 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍과 살모넬라속(Salmonella)에 속하는 Salmonella choleraesuis subsp, Salmonella enteritidis, Salmonella bongori 및 Salmonella enterica 각각의 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서는 예상 크기의 217bp DNA 절편이 증폭된 것을 확인하였고, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍 각각을 Vibrio parahaemolyticus 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서 예상 크기의 285bp 및 170bp DNA 절편이 각각 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍 각각을 Enterotoxigenic E. coli(ETEC) 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서 예상 크기의 298bp 및 116bp의 DNA 절편이 각각 증폭된 것을 확인할 수 있었고, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍 각각을 E. coli O157:H7 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 반응에서는 예상 크기의 331bp, 111bp 및 213bp의 DNA 절편이 각각 증폭된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 각각의 증폭된 DNA 절편을 시퀀싱 의뢰하여 염기서열을 분석한 결과, 각 균주들의 증폭 DNA 염기서열이 본 출원인이 의도한 각 균주들의 특이 유전자에 해당하는 것임을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 결과를 토대로 본 발명자들은 상기 실시예 2에서 고안한 본 발명의 프라이머들이 각 균주들의 특이 유전자들을 증폭할 수 있도록 바르게 고안된 것임을 알 수 있었다.
<실시예 4>
본 발명에 따른 프라이머들의 균주별 특이성 분석
상기 실시예 2에서 고안된 프라이머들이 각각의 특정 미생물에 대하여 특이성을 갖는지를 조사하였다. 상기 조사는 실시예 1의 병원성 미생물인 11종들의 게놈 DNA를 각각 주형으로 하고 상기 실시예 2에서 고안한 각 균주별 프라이머 쌍을 순차적으로 각각 사용하여 총 11번의 PCR을 수행함으로써 이루어졌다. 즉, 11종의 게놈 DNA를 각각 주형으로 하면서, 첫 번째 PCR은 각 균주별 주형 DNA에 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 각각 첨가하여 수행하였으며, 두 번째 PCR은 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍을, 세 번째 PCR은 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍을, 네 번째 PCR은 서열번호 7 및 8의 프라이머쌍을, 다섯 번째 PCR은 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍을, 여섯 번째 PCR은 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍을, 일곱 번째 PCR은 서열번호 13 및 14의 프라이머쌍을, 여덟 번째 PCR은 서열번호 15 및 16의 프라이머쌍을, 아홉 번째 PCR은 서열번호 17과 18, 및 서열번호 19와 20의 프라이머쌍을, 열 번째 PCR은 서열번호 21과 22, 및 서열번호 23과 24의 프라이머쌍을, 열한 번째 PCR은 서열번호 25와 26, 27과 28, 및 29와 30의 프라이머쌍을 첨가하여 수행하였다. 한편, 이때 내부 대조군(internal control)으로는 상기 11종의 미생물과는 전혀 유사성이 없는 식물 유전자인 애기장대(Arabidopsis thaliana) AT-IC01(진뱅크 번호: At1g45145) 또는 AT-IC02(진뱅크 번호: At3G18780)를 사용하였고, 상기 AT-IC01을 증폭할 수 있는 프라이머로 서열번호 31(AF 1F): 5'-AGTGATTGCTTGCCATACCC-3' 및 서열번호 32(AF 2R): 5'-AAGCCCTGGACATAACAAGA-3'를 사용하였으며, 상기 AT-IC02를 증폭할 수 있는 프라이머로는 서열번호 33(AT 1F): 5'-TGCCAATCTACGAGGGTTTC-3' 및 서열번호 34(AT 1R):5'-TTCTCGATGGAAGAGCTGGT-3'를 사용하였다. PCR 반응을 위한 반응액의 성분은 하기 표 4에 기재된 바와 같으며, 각 반응액은 95℃에서 5분 동안 초기변성 시킨 후, 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 결합 및 72℃에서 1초 동안의 연장 반응을 40회 반복한 다음, 72℃에서 10분 동안 반응시킴으로써 PCR 반응을 실시하였고, 이러한 PCR 반응은 각 균주별 프라이머 쌍을 사용하여 세 번씩 반복 실험을 수행하였다. PCR 반응 후 반응 산물은 2% 아가로즈 젤에 전기영동하여 각 프라이머 쌍이 종별로 특이성을 갖는지 확인하였다.
프라이머의 균주별 특이성을 위한 PCR 반응액의 조성
PCR 반응액 조성 부피 최종 농도
FastStart 10X 버퍼 2.0ul 1X
40mM dNTP 혼합액 0.4ul 0.8mM
FastStart Taq(5U/ul) 0.2ul 1U
내부대조군의 프라이머 쌍(10uM) 1.0ul 0.3uM
각 균주별 프라이머 쌍(10uM) 1.6ul 0.5uM
내부대조군의 주형 DNA(gDNA) 1.0ul 40pg DNA
각 균주별 주형 DNA(gDNA) 1.0ul 10ng DNA
물 12.8ul
합계 20.0ul
그 결과, 도 1 내지 도 11의 각 A 도면에서 보는 바와 같이, 본 발명자들이 고안한 상기 표 2의 각 프라이머 쌍은 각 종에 대해서만 특이성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 Listeria monocytogenes 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 Staphylococcus aureus 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍은 쉬겔라 속에 속하는 Shigella boydii, Shigella flexneri 및 Shigella sonnei 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 Clostridium perfringens 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍은 Campylobacter jejuni 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍은 Bacillus cereus 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍은 Yersinia enterocolitica 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍은 살모넬라속에 속하는 Salmonella choleraesuis subsp , Salmonella enteritidis , Salmonella bongori 및 Salmonella enterica 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍은 Vibrio parahaemolyticus 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍은 Enterotoxigenic E. coli(ETEC) 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰고, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍은 E. coli O157:H7 균주의 특이 유전자만을 증폭시켰다.
따라서 상기 결과로 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 상기 15쌍의 프라이머 쌍 모두가 병원성 미생물 각각에 대하여 매우 우수한 균주 특이성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5>
본 발명에 따른 프라이머의 병원성 미생물 검출 감도 분석
본 발명에 따른 각 종별 프라이머들이 병원성 미생물을 어느 정도까지 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여 프라이머의 병원성 미생물 검출 감도를 측정하였다. 이를 위해 먼저 상기 11종의 균주들을 BHI 또는 LB 플레이트에 도말하여 37℃의 온도에서 16시간 동안 배양하였고, 자라난 콜로니들 중 한 개의 콜로니를 5ml의 BHI 또는 LB 배지에 접종하여 다시 37℃의 온도에서 16시간 동안 종배양하였다. 종배양된 각 균주별 배양액 중 300ul를 10ml의 BHI 또는 LB 배지에 첨가하고 37℃에서 5시간 배양하였다. 한편, 이때 상기 균주들 중 Clostridium perfringens 및 Campylobacter jejuni 균주들은 플레이트에 형성된 하나의 콜로니를 42℃의 온도에서 48시간 동안 각각 혐기성/미량호기성 조건으로 배양하였다. 이후 상기 배양액들의 OD 600이 2.0에 이르면 살린(saline, 0.9% 염화나트륨) 용액으로 1ml의 배양액을 10배씩 연속 희석시켰다. 희석된 배양액 중 100ul를 다시 BHI 또는 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이후 30~300개의 유효한 콜로니 수를 가지는 플레이트의 콜로니 수를 세어 CFU/ml을 계산하였다. 각 균주별로 계산된 CFU/ml의 균수를 살린 용액으로 10배씩 희석하여 연속 희석된 CFU/ml 샘플들(즉, 각 균주별로 CFU/ml가 1× 105, 1× 104, 1× 103, 1× 102, 1× 101, 1× 100인 샘플)을 제조하였다. 이후 1.5ml의 튜브에 상기 샘플들을 100ul씩 옮겨 담은 후, 10분간 가열하여 세포들을 용해시키고, 13000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이후 상층액 90ul를 새로운 1.5ml의 튜브에 옮겨 4℃에서 보관하였으며, 상기 각 균주별 및 희석별 샘플들의 1ul에 해당하는 CFU를 하기 표 5의 조성들과 혼합하여 PCR 반응을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분 동안 초기변성 시킨 후, 95℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 20초 동안 결합 및 72℃에서 30초 동안의 연장 반응을 40회 반복한 다음, 72℃에서 10분 동안 반응시킴으로써 PCR 반응을 실시하였고, 이러한 PCR 반응은 상기 실시예 2에서 고안한 15쌍의 각 종별 프라이머를 사용하여 세 번씩 반복 실험을 수행하였다. PCR 반응이 끝나면 반응 산물 10ul를 2% 아가로즈 젤에 전기영동하여 각 프라이머 쌍의 CFU/ml에서의 PCR 감도(sensitivity)를 확인하였다.
프라이머의 미생물 검출 감도 확인을 위한 PCR 반응액 조성
PCR 반응액 조성 부피 최종 농도
FastStart 10X 버퍼 2.0ul 1X
40mM dNTP 혼합액 0.4ul 0.8mM
FastStart Taq(5U/ul) 0.3ul 1U
목적 균주의 프라이머 쌍(10uM) 0.6ul 0.3uM
목적 균주의 주형 DNA(CFU/ml) 1.0ul 각 균주별로 희석된 CFU/ml
물 15.7ul
합계 20.0ul
상기 표 5에서 목적 균주의 프라이머 쌍은 상기 실시예 2에서 고안한 각 균주별 특이 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 사용한 것이며, 상기에서 목적 균주의 주형 DNA(CFU/ml)는 균주별로 희석된 CFU/ml, 즉 각 균주에 대한 CFU/ml이 1× 105, 1× 104, 1× 103, 1× 102, 1× 101 및 1× 100인 샘플을 각각 사용하였다.
그 결과, 도 1 내지 도 11의 각 B 도면에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주별 프라이머 쌍은 상기 11종의 병원성 미생물들을 1× 105 ~ 1× 101 CFU/ml의 농도에서도 검출할 수 있는 것으로 나타났고, 특히 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens)를 1× 100 CFU/ml의 농도에서도 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
< 실시예 6>
본 발명의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 식품의 병원성 미생물 탐지
본 발명자들은 본 발명의 병원성 미생물 검출용 프라이머들이 병원성 미생물로 오염된 식품으로부터 상기 미생물들을 검출할 수 있는지와 검출 한계를 확인하기 위하여 인위 제조된 오염 우유의 배양액을 대상으로 PCR을 수행하였다. 이를 위해 먼저 1% 스킴 밀크(skim milk)를 30분간 중탕 처리한 후, 400ul의 스킴 밀크에 300ul의 살린 용액 및 상기 실시예 5에서 각 균주별로 연속 희석시켜 계산된 균주별 CFU/ml의 샘플들을 각각 100ul씩 섞어서 혼합하였다. 이후 13000rpm에서 5분간 원심분리 한 다음, 상등액을 제거하고 모아진 균체를 500ul의 살린 용액으로 세척한 후 13000rpm에서 다시 원심분리 하였다. 이후 상등액을 제거하고 세척하여 모아진 균체에 100ul의 5% Chelex-100(Bio-Rad사)와 21mg/ml의 프로테아제 K를 첨가한 다음, 56℃의 water bath에서 30분간 반응시킨 후, 5분간 가열처리하였다. 그런 뒤 13000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 새 튜브에 옮겼고, 상기 열 추출하여 수득한 상등액은 PCR반응을 위한 주형으로 사용하였다. PCR 반응액은 하기 표 6의 조성들로 제조하였고, 반응 조건은 95℃에서 5분 동안 초기변성 시킨 후, 95℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 20초 동안 결합 및 72℃에서 30초 동안의 연장 반응을 40회 반복한 다음, 72℃에서 10분 동안 반응시킴으로써 PCR을 실시하였고, 이러한 PCR 반응은 각 종별 프라이머 쌍을 사용하여 세 번씩 반복 실험을 수행하였다. PCR 반응이 끝나면 반응 산물은 2% 아가로즈 젤에 전기영동하여 각 균주별 특이 유전자의 증폭 산물의 형성 유무로 병원성 미생물의 오염 여부 및 각 샘플별 CFU/ml에서의 PCR 감도(sensitivity)를 확인하였다.
PCR 반응액 조성
PCR 반응액 조성 부피 최종 농도
FastStart 10X 버퍼 2.0ul 1X
40mM dNTP 혼합액 0.4ul 0.8mM
FastStart Taq(5U/ul) 0.3ul 1U
각 균주별 프라이머 쌍(10uM) 0.6ul 0.3uM
주형 DNA(CFU/ml) 1.0ul
물 15.7ul
합계 20.0ul
그 결과, 도 1 내지 도 11의 각 C 도면에서 보는 바와 같이, 본 발명의 프라이머들은 PCR 반응을 통해 스킴 밀크에 오염된 각 균주들의 특이 유전자들을 각각 증폭시켰으며, 이로써 본 발명에서 고안된 프라이머들이 각 병원성 미생물들로 오염된 우유로부터 상기 미생물들을 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 미생물의 수가 극히 미량인 1× 100 CFU/ml의 농도에서도 본 발명의 프라이머들에 의해 11종의 균주별 특이 유전자들이 증폭된 것을 확인함으로써 본 발명의 프라이머들이 식품에 위해한 병원성 미생물들을 검출할 수 있는 검출 감도가 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다.
도 1a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 1c는 각 CFU/ml 농도별로 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 균주에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 각 CFU/ml 농도별로 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이 다.
도 3a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 각 CFU/ml 농도별로 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .)에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4c는 각 CFU/ml 농도별로 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens)에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 캄필로 박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 각 CFU/ml 농도별로 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 각 CFU/ml 농도별로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 각 CFU/ml 농도별로 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 살모넬라 속 균주(Salmonella spp.) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8b는 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8c는 각 CFU/ml 농도별로 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .)에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9b는 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9c는 각 CFU/ml 농도별로 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. col : ETEC) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10b는 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. col : ETEC)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. col : ETEC) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10c는 각 CFU/ml 농도별로 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. col : ETEC)에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. col : ETEC) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 11종의 병원성 미생물 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 대장균 O157(E. coli O157:H7) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11b는 대장균 O157(E. coli O157:H7)의 각 CFU/ml 농도에 대하여 본 발명의 대장균 O157(E. coli O157:H7) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11c는 각 CFU/ml 농도별로 대장균 O157(E. coli O157:H7)에 오염된 스킴 밀크를 시료로 하여 본 발명의 대장균 O157(E. coli O157:H7) 검출용 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
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Claims (5)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머 쌍;
    서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 쌍;
    서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 쉬겔라 속 균주(Shigella spp.) 검출용 프라이머 쌍;
    서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 쌍;
    서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 프라이머 쌍;
    서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 프라이머 쌍;
    서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어진 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 검출용 프라이머 쌍;
    서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어진 살모넬라 속 균주(Salmonella spp.) 검출용 프라이머 쌍;
    서열번호 17 및 18, 또는 서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머 쌍;
    서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어진 장독성 대장균(Enterotoxigenic E. col: ETEC) 검출용 프라이머 쌍; 및
    서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 및 서열번호 29 및 30의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 중에서 선택되는 대장균 O157(E. coli O157:H7) 검출용 프라이머 쌍;
    으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 병원성 미생물 검출용 프라이머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .)는 쉬겔라 보이디(Shigella boydii), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)로 이루어진 군중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 병원성 미생물 검출용 프라이머.
  3. 제1항에 있어서, 상기 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .)는 살모넬라 콜레라에슈이스(Salmonella choleraesuis subsp), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 본고리(Salmonella bongori) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로 이루어진 군중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 병원성 미생물 검출용 프라이머.
  4. 제1항의 병원성 미생물 검출용 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반 응(Polymerase chain reaction, PCR)으로 병원성 미생물을 탐지하는 단계를 포함하는 병원성 미생물 검출방법.
  5. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 제1항의 프라이머, 반응완충액, dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 병원성 미생물 검출키트.
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