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WO2014021163A1 - 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法 - Google Patents

組換え酵母を用いたエタノールの製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2014021163A1
WO2014021163A1 PCT/JP2013/070036 JP2013070036W WO2014021163A1 WO 2014021163 A1 WO2014021163 A1 WO 2014021163A1 JP 2013070036 W JP2013070036 W JP 2013070036W WO 2014021163 A1 WO2014021163 A1 WO 2014021163A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
yeast
strain
ethanol
pcr
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/070036
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
大西　徹
Original Assignee
トヨタ自動車株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by トヨタ自動車株式会社 filed Critical トヨタ自動車株式会社
Publication of WO2014021163A1 publication Critical patent/WO2014021163A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ethanol using recombinant yeast.
  • acetic acid is known as a fermentation inhibitor contained in a reaction system in an ethanol production method utilizing ethanol fermentation. That is, in the reaction system containing acetic acid, the efficiency of ethanol fermentation is reduced, and the ethanol yield is known to be lower than that in the reaction system not containing acetic acid.
  • acetic acid is contained in a large amount in the hydrolysis product of cellulosic biomass and inhibits ethanol fermentation of yeast.
  • yeast introduced with a xylose utilization gene significantly inhibits ethanol fermentation using xylose as a sugar source (Non-patent Documents 1 and 2).
  • moromi fermented saccharified cellulosic biomass with cellulase mainly contains unfermented residues, difficult-to-ferment residues, enzymes and fermentation microorganisms.
  • the reaction liquid containing moromi for the subsequent fermentation the fermentation microorganisms can be reused, the amount of new input microorganisms for fermentation can be reduced, and the cost can be reduced.
  • acetic acid contained in the moromi is also brought in at the same time. As a result, the concentration of acetic acid contained in the fermentation medium increases, which may inhibit ethanol fermentation.
  • acetic acid As another method for avoiding fermentation inhibition by acetic acid, it is conceivable to metabolize acetic acid in the medium simultaneously with ethanol fermentation.
  • the metabolism of acetic acid is an aerobic reaction and overlaps with the metabolic pathway of ethanol. Therefore, when fermentation is performed under aerobic conditions, acetic acid may be metabolized, but at the same time, the target substance ethanol is also metabolized.
  • yeast has an acetic acid biosynthesis pathway, and the ALD4 gene, ALD5 gene and ALD6 gene, which are acetaldehyde dehydrogenase genes, are involved in acetic acid biosynthesis. Therefore, by destroying those genes, it is considered that acetic acid production decreases (Non-patent Document 5), and fermentation inhibition may be avoided.
  • ALD6 gene-disrupted strains do not change or decrease the ethanol productivity in a medium using glucose as a sugar source (Non-patent Document 6).
  • the present invention provides a method for producing ethanol using a recombinant yeast that can improve ethanol fermentation efficiency in the presence of acetic acid and can realize excellent ethanol productivity, in view of the above-described circumstances. For the purpose.
  • the present invention includes the following.
  • the ethanol production method according to the present invention can achieve excellent ethanol productivity without reducing the efficiency of ethanol fermentation even when acetic acid is contained in the medium. Therefore, the ethanol production method according to the present invention is particularly preferably applied to a system (for example, simultaneous saccharification and fermentation) in which a sugar component obtained by saccharifying cellulosic biomass is used as a raw material for ethanol fermentation.
  • a system for example, simultaneous saccharification and fermentation
  • the method for producing ethanol according to the present invention is a method for synthesizing ethanol from a medium containing acetic acid using a mutant yeast strain lacking a specific acetaldehyde dehydrogenase gene.
  • the yeast mutant used in the method for producing ethanol according to the present invention is one lacking a specific acetaldehyde dehydrogenase gene.
  • the specific acetaldehyde dehydrogenase gene is an acetaldehyde dehydrogenase gene called ALD4 gene, ALD5 gene, and ALD6 gene in Saccharomyces cerevisiae. That is, when the yeast mutant used in the method for producing ethanol according to the present invention is prepared from a wild Saccharomyces cerevisiae strain, at least one acetaldehyde dehydration selected from the group consisting of these ALD4 gene, ALD5 gene and ALD6 gene is used. Deletion of elementary enzyme gene.
  • a yeast mutant used in the method for producing ethanol according to the present invention is produced using a yeast other than Saccharomyces cerevisiae
  • at least one of genes corresponding to the ALD4 gene, ALD5 gene and ALD6 gene in the yeast is used.
  • One acetaldehyde dehydrogenase gene is deleted.
  • the base sequence of the ALD4 gene of Saccharomyces cerevisiae and the amino acid sequence of the protein encoded by the ALD4 gene are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the nucleotide sequence of the ALD5 gene of Saccharomyces cerevisiae and the amino acid sequence of the protein encoded by the ALD5 gene are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • the nucleotide sequence of the ALD6 gene of Saccharomyces cerevisiae and the amino acid sequence of the protein encoded by the ALD6 gene are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.
  • the acetaldehyde dehydrogenase gene to be deleted is not limited to those specified in SEQ ID NOs: 1 to 6, but is a gene that has a different base sequence or amino acid sequence, but has a paralogous relationship or a narrowly defined homologous relationship. There may be.
  • the acetaldehyde dehydrogenase gene is not limited to those specified by these SEQ ID NOs: 1 to 6, and for example, 70% or more, preferably 80% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 More preferably, it may encode a protein having an amino acid sequence having a sequence similarity or identity of 90% or more, most preferably 95% or more, and having acetaldehyde dehydrogenase activity. Sequence similarity and identity values can be calculated by the BLASTN or BLASTX program that implements the BLAST algorithm (default setting).
  • sequence similarity was calculated by comparing the total of amino acid residues that completely matched when paired amino acid sequences were subjected to pair-wise alignment analysis and amino acid residues having similar physicochemical functions. Calculated as a percentage of the total number of all amino acid residues.
  • identity value is calculated as the ratio of the number of amino acid residues in all amino acid residues compared by calculating the amino acid residues that completely match when a pair of amino acid sequences are subjected to pair-wise alignment analysis. .
  • the acetaldehyde dehydrogenase gene is not limited to those specified in SEQ ID NOs: 1 to 6, and for example, one or several amino acids are substituted for the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 4 or 6. It may be a protein having a deleted, inserted or added amino acid sequence and encoding a protein having acetoacetaldehyde dehydrogenase activity.
  • everal means, for example, 2 to 30, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, and most preferably 2 to 5.
  • the acetaldehyde dehydrogenase gene is not limited to those specified in these SEQ ID NOs: 1 to 6, and for example, all or part of the complementary strand of DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5
  • it may be one that hybridizes under stringent conditions and encodes a protein having acetoacetaldehyde dehydrogenase activity.
  • stringent conditions means the conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed, and is appropriately determined with reference to, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) can do.
  • the stringency can be set according to the temperature at the time of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution, and the temperature at the time of the washing step of Southern hybridization and the salt concentration contained in the solution. More specifically, as stringent conditions, for example, the sodium concentration is 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, and the temperature is 42 to 68 ° C., preferably 42 to 65 ° C. More specifically, it is 5 ⁇ SSC (83 mM NaCl, 83 mM sodium citrate), and the temperature is 42 ° C.
  • a gene consisting of a base sequence different from SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or a gene encoding an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2, 4 or 6 functions as an acetaldehyde dehydrogenase gene
  • an expression vector in which the gene is inserted between an appropriate promoter and terminator, etc. transform a host such as yeast using this expression vector, and measure the acetaldehyde dehydrogenase activity of the expressed protein. That's fine.
  • Acetaldehyde dehydrogenase activity can be measured by preparing a solution containing acetaldehyde or NADP + as a substrate, allowing the protein to be tested to act at an appropriate temperature, and spectroscopically measuring the produced NADH or NADPH. .
  • the yeast mutant strain used in the method for producing ethanol according to the present invention is a yeast having xylose metabolic ability, in addition to lacking a specific acetaldehyde dehydrogenase gene as described above.
  • having xylose metabolism ability means that, when xylose metabolism-related gene is imparted by introducing xylose metabolism-related gene, it inherently has xylose metabolism-related gene and inherently has xylose metabolism ability. It is meant to include any case. That is, in the case of yeast having xylose metabolism ability, it means that both recombinant yeast introduced with a xylose metabolism-related gene and yeast originally having a xylose metabolism-related gene are included.
  • Yeast having the ability to metabolize xylose can assimilate xylose contained in the medium to produce ethanol.
  • the xylose contained in the medium may be obtained by a process of saccharifying xylan, hemicellulose or the like containing xylose as a constituent sugar, or xylan or hemicellulose or the like contained in the medium is saccharified by a saccharifying enzyme. May be supplied to the medium. In the latter case, it means a so-called simultaneous saccharification and fermentation system.
  • Genes related to xylose metabolism are xylose reductase gene encoding xylose reductase that converts xylose to xylitol, xylitol dehydrogenase gene encoding xylitol dehydrogenase that converts xylitol to xylulose, and xylulose is phosphorylated to produce xylulose 5-phosphate It is meant to include a xylulokinase gene encoding xylulokinase. Xylulose 5-phosphate produced by xylulokinase enters the pentose phosphate pathway and is metabolized.
  • genes related to xylose metabolism include, but are not limited to, xylose reductase gene and xylitol dehydrogenase gene derived from Pichia stipitis, and xylulokinase gene derived from Saccharomyces cerevisiae (Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol 66: 3381-3386 and Toivari MN et al., Metab. Eng. 3: 236-249).
  • a xylose reductase gene derived from Candida ⁇ ⁇ ⁇ tropicalis or Candida prapsilosis can be used as the xylose reductase gene.
  • xylitol dehydrogenase gene a xylitol dehydrogenase gene derived from Candida tropicalis or Candida prapsilosis can be used.
  • xylulokinase gene a xylulokinase gene derived from Pichia stipitis can also be used.
  • a xylose isomerase gene derived from Streptomyces murinus cluster or the like can also be used.
  • yeasts that inherently have the ability to metabolize xylose include, but are not limited to, Pichia stipitis, Candida tropicalis, Candida prapsilosis, and the like.
  • the acetaldehyde dehydrogenase gene to be introduced into yeast having xylose metabolic ability is not particularly limited, and any organism-derived gene may be used.
  • the acetaldehyde dehydrogenase gene is modified in accordance with the codon usage in the yeast to be introduced when using genes derived from organisms other than fungi such as yeast, such as bacteria, animals, plants, insects, and algae. It is preferable to use the gene obtained.
  • the yeast mutant used in the method for producing ethanol according to the present invention may be a yeast further introduced with another gene.
  • another gene for example, the gene involved in sugar metabolisms, such as glucose, can be mentioned.
  • a yeast mutant modified to have ⁇ -glucosidase activity by introducing a ⁇ -glucosidase gene can also be used.
  • ⁇ -glucosidase activity means an activity catalyzing a reaction of hydrolyzing a ⁇ -glycoside bond of a sugar. That is, ⁇ -glucosidase can decompose cellooligosaccharides such as cellobiose into glucose.
  • the ⁇ -glucosidase gene can also be introduced as a cell surface display type gene.
  • the cell surface display type gene is a gene modified so that a protein encoded by the gene is expressed so as to be displayed on the surface layer of the cell.
  • the cell surface-presenting ⁇ -glucosidase gene is a gene obtained by fusing a ⁇ -glucosidase gene and a cell surface localized protein gene.
  • the cell surface localized protein refers to a protein that is fixed on the cell surface layer of yeast and is present on the cell surface layer.
  • ⁇ - or a-agglutinin which is an aggregating protein, FLO protein and the like can be mentioned.
  • a cell surface localized protein has a secretory signal sequence on the N-terminal side and a GPI anchor attachment recognition signal on the C-terminal side. Although it has the same secretory protein in that it has a secretion signal, the cell surface localized protein is different from the secreted protein in that it is transported by being immobilized on the cell membrane via a GPI anchor.
  • the GPI anchor attachment recognition signal sequence is selectively cleaved, and is bound to the GPI anchor at the newly protruding C-terminal portion and fixed to the cell membrane. Thereafter, the base of the GPI anchor is cleaved by phosphatidylinositol-dependent phospholipase C (PI-PLC). Next, the protein cut off from the cell membrane is incorporated into the cell wall, fixed to the cell surface layer, and localized on the cell surface layer (see, for example, JP-A-2006-174767).
  • PI-PLC phosphatidylinositol-dependent phospholipase C
  • the ⁇ -glucosidase gene is not particularly limited, and examples thereof include ⁇ -glucosidase genes derived from Aspergillus aculeatus (Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64: 4857-4861).
  • ⁇ -glucosidase gene a ⁇ -glucosidase gene derived from Aspergillus oryzae, a ⁇ -glucosidase gene derived from Clostridium cellulovorans, a ⁇ -glucosidase gene derived from Saccharomycopsis fibligera, and the like can be used.
  • the recombinant yeast used in the method for producing ethanol according to the present invention may be one in which a gene encoding another enzyme constituting cellulase is introduced in addition to or in addition to the ⁇ -glucosidase gene.
  • cellulase is composed of exo-type cellobiohydrolase (CBH1 and CBH2) that releases cellobiose from the end of crystalline cellulose, and amorphous cellulose (amorphous cellulose) chains are randomized, although crystalline cellulose cannot be degraded.
  • CBH1 and CBH2 exo-type cellobiohydrolase
  • amorphous cellulose (amorphous cellulose) chains are randomized, although crystalline cellulose cannot be degraded.
  • An endo-type endoglucanase (EG) that cleaves can be mentioned.
  • a yeast mutant strain that can be used in the present invention can be prepared.
  • the deficiency of the above-mentioned acetaldehyde dehydrogenase gene is synonymous with suppressing the gene, suppressing or reducing the expression level of the gene, and inhibiting the function of the protein encoded by the gene. It means to include.
  • Deletion of a gene means that a region including a part or all of the coding region of the gene is deleted from the chromosome, and that the gene is destroyed by incorporating a transposon or the like into the coding region of the gene.
  • the method for reducing the expression level of the gene is not particularly limited, and examples thereof include a method for reducing the transcription amount by modifying the expression control region of the gene, a method for selectively degrading the transcription product of the gene, and the like. be able to.
  • transposon method as a technique for suppressing a gene, the so-called transposon method, transgene method, post-transcriptional gene silencing method, RNAi method, nonsense-mediated decay (NNM) method, ribozyme method, antisense method, miRNA (Micro-RNA) method, siRNA (small interfering RNA) method and the like.
  • the above-mentioned acetaldehyde dehydrogenase gene may be deleted in a recombinant yeast in which a gene related to xylose metabolism is introduced into a yeast that does not have xylose metabolism ability, or in yeast that originally has xylose metabolism ability.
  • the gene may be introduced even if it is deficient, or a gene related to xylose metabolism may be introduced into yeast having no ability to metabolize xylose and the gene may be deficient.
  • the acetaldehyde dehydrogenase gene may be deleted in yeast that does not have xylose metabolism, and then xylose metabolism may be imparted by introducing a gene related to xylose metabolism into the recombinant yeast.
  • yeasts such as Candida Shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccaromyces pombe, and Saccharomyces cerevisiae is particularly preferable.
  • the yeast may be an experimental strain used for experimental convenience, or an industrial strain (practical strain) used for practical utility. Examples of industrial strains include yeast strains used for wine, sake and shochu making.
  • yeast having homothallic properties is synonymous with homothallic yeast.
  • the yeast having homothallic properties is not particularly limited, and any yeast can be used. Examples of yeast having homothallic properties include, but are not limited to, Saccharomyces cerevisiae ⁇ OC-2 strain (NBRC2260).
  • yeasts with homothallic properties include alcoholic yeasts (Taken 396, NBRC0216) (Source: “Characteristics of Alcoholic Yeast”, Sakekenkai Bulletin, No37, p18-22 (1998.8)), isolated in Brazil and Okinawa Ethanol producing yeast (Source: “Genetic properties of wild strains of Saccharomyces cerevisiae isolated in Brazil and Okinawa” Journal of Japanese Agricultural Chemical Society, Vol.65, No.4, p759-762 (1991.4)) and 180 (Source: Alcohol The screening of yeast having a strong fermenting ability ”, Journal of Japan Brewing Association, Vol.82, No.6, p439-443 (1987.6)).
  • yeast having homothallic properties can be used as a yeast having homothallic properties by introducing the HO gene so that it can be expressed. That is, in the present invention, the yeast having homothallic properties is meant to include yeast into which the HO gene has been introduced so as to be expressed.
  • the Saccharomyces cerevisiae OC-2 strain is preferable because it is a strain that has been confirmed to be safe and has been used in the winemaking scene. Further, the Saccharomyces cerevisiae OC-2 strain is preferable because it has excellent promoter activity under high sugar concentration conditions, as shown in the Examples described later. In particular, the Saccharomyces cerevisiae OC-2 strain is preferable because it has an excellent promoter activity of the pyruvate decarboxylase gene (PDC1) under high sugar concentration conditions.
  • PDC1 pyruvate decarboxylase gene
  • the promoter of the gene to be introduced is not particularly limited.
  • the promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene (TDH3), the promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1), the hyperosmotic response 7 gene ( HOR7) promoters can be used.
  • the pyruvate decarboxylase gene (PDC1) promoter is preferred because of its high ability to highly express a downstream target gene.
  • the above-described gene may be introduced into the yeast genome together with a promoter controlling expression and other expression control regions.
  • the above-described gene may be introduced so that the expression is controlled by a promoter of a gene originally present in the genome of yeast as a host or other expression control regions.
  • any conventionally known method known as a yeast transformation method can be applied. Specifically, for example, electroporation method “Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”, spheroplast method “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”, acetic acid Lithium Method “J. Bacteriology, 153, p163 (1983)”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual The method can be implemented, but is not limited thereto.
  • the medium for ethanol fermentation is not particularly limited.
  • the yeast mutant described above has the characteristic that the efficiency of ethanol fermentation does not decrease even if acetic acid is contained in the medium, or the efficiency of ethanol fermentation is improved when acetic acid is contained in the medium. ing. Therefore, the yeast mutant described above is more preferably used in a system in which ethanol fermentation is performed using a medium containing acetic acid.
  • the medium containing acetic acid is not particularly limited, and examples thereof include a medium containing a carbon source obtained by saccharifying cellulosic biomass with a saccharifying enzyme.
  • a medium containing a carbon source obtained by saccharifying cellulosic biomass with a saccharifying enzyme When cellulosic biomass is saccharified with a saccharification enzyme, fermentation inhibitors such as acetic acid are produced. Therefore, when ethanol is produced using a medium obtained by saccharifying cellulosic biomass with a saccharifying enzyme, acetic acid is contained in the medium.
  • the medium obtained by saccharifying cellulosic biomass with a saccharifying enzyme may be a medium after saccharifying cellulosic biomass with a saccharifying enzyme, or may be a medium before saccharification treatment containing cellulosic biomass and saccharifying enzyme. . In the medium before saccharification treatment containing cellulosic biomass and saccharification enzyme, saccharification treatment by saccharification enzyme and ethanol fermentation by the
  • yeast mutant having xylose metabolism ability as the yeast mutant described above.
  • ethanol fermentation can be performed using xylose derived from hemicellulose as a carbon source in addition to glucose derived from cellulose contained in cellulosic biomass.
  • the cellulosic biomass may be one that has been subjected to conventionally known pretreatment.
  • pre-processing For example, the process which decomposes
  • a treatment such as a treatment in which the pulverized cellulose biomass is immersed in a dilute sulfuric acid solution, an alkali solution or an ionic liquid, a hydrothermal treatment, or a fine pulverization treatment may be applied.
  • the saccharification rate of biomass can be improved.
  • the saccharification method is not particularly limited, and examples thereof include an enzyme method using a cellulase preparation such as cellulase or hemicellulase.
  • the cellulase preparation contains a plurality of enzymes involved in the degradation of cellulose chains and hemicellulose chains, and exhibits a plurality of activities such as endoglucanase activity, endoxylanase activity, cellobiohydrolase activity, glucosidase activity, and xylosidase activity.
  • the cellulase preparation is not particularly limited, and examples thereof include cellulase produced by Trichoderma reesei, Acremonium cerulolyticus, and the like. As the cellulase preparation, a commercially available product may be used.
  • the method for producing ethanol according to the present invention includes a step of saccharifying cellulosic biomass contained in a medium with a saccharification enzyme, and a step of ethanol fermentation using a carbon source such as glucose or xylose produced by saccharification. It is preferable to use a so-called simultaneous saccharification and fermentation treatment in which the saponification proceeds simultaneously.
  • the simultaneous saccharification and fermentation treatment means a treatment that is carried out simultaneously without distinguishing between the step of saccharifying cellulosic biomass and the ethanol fermentation step.
  • the cellulase preparation and the above-described yeast mutant are added to a medium containing cellulosic biomass (may be after pretreatment), and the yeast mutant is cultured in a predetermined temperature range.
  • the culture temperature is not particularly limited, but can be 25 to 45 ° C., preferably 30 to 40 ° C. in consideration of the efficiency of ethanol fermentation.
  • the pH of the culture solution is preferably 4-6. Moreover, you may stir and shake in the case of culture
  • ethanol is recovered from the medium after ethanol fermentation.
  • the method for recovering ethanol is not particularly limited, and any conventionally known method can be applied.
  • a liquid layer containing ethanol and a solid layer containing yeast mutants and solid components are separated by solid-liquid separation operation.
  • ethanol contained in the liquid layer is separated and purified by a distillation method, whereby high purity ethanol can be recovered.
  • the purity of ethanol can be adjusted as appropriate according to the intended use of ethanol.
  • acetic acid is known to inhibit the growth and proliferation of yeast and to reduce the efficiency of ethanol fermentation using xylose as a sugar source.
  • a yeast mutant lacking a predetermined acetaldehyde dehydrogenase gene is used, ethanol fermentation efficiency does not decrease even in a medium containing acetic acid, or ethanol fermentation efficiency is improved. To do. Therefore, the ethanol production method according to the present invention can achieve an excellent ethanol yield as compared with the case of using yeast that does not lack the acetaldehyde dehydrogenase gene.
  • Example 1 ⁇ Test stock>
  • xylose metabolism gene S. stipitis derived xylose reductase gene (XYL1) and xylitol dehydrogenase gene (XYL2) host-derived XKS1 gene and Strain Uz326 introduced into the GRE3 locus (see reference examples below)
  • Uz644 strain that gave histidine requirement to Uz326 strain
  • Uz644 strain as the parent strain Uz675 strain that disrupted ALD4 gene
  • Uz677 that disrupted ALD5 gene Uracil-requiring mutant Uz632 of Uz679 strain with disrupted ALD6 gene and tryptophan-requiring OC2-T strain (Saitoh, S.
  • a DNA fragment containing the ALD4 gene and its 5 ′ upstream and 3 ′ downstream untranslated regions was amplified by PCR using the genomic DNA of yeast BY4742 (manufactured by Open Biosystems) as a template.
  • TB3248 and TB3249 were used as PCR primers (primer base sequences are summarized in Table 2. Hereinafter, the base sequences of other primers are also the same).
  • the PCR primer design for DNA sequence amplification of the yeast BY4742 strain containing TB3248 and TB3249 was based on the DNA sequence data of the Saccharomyces Genome Database.
  • the amplified DNA fragment was cloned into a plasmid using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (manufactured by Life Technologies) and named pCR-5U_ALD4-ALD4-3U_ALD4.
  • pCR-5U_ALD4-ALD4-3U_ALD4 as a template, 5 ′ upstream and 3 ′ downstream untranslated regions of the ALD4 gene and a region containing pCR-BluntII-TOPO, and genomic DNA of yeast BY4742 strain as a template
  • a DNA fragment containing the TRP1 gene and its promoter and terminator region was amplified by PCR.
  • the PCR primers used were TB3486 and TB3460, TB2800 and TB2799 designed so that the DNA fragments obtained by amplification overlap each other by about 15 bp.
  • the above two DNA fragments were cloned using In-Fusion® HD® Cloning® Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and named pCR-5U_ALD4-TRP1-3U_ALD4.
  • a DNA fragment containing the ALD5 gene and its 5 ′ upstream and 3 ′ downstream untranslated regions was amplified by PCR using the genomic DNA of yeast BY4742 strain as a template.
  • TB3469 and TB3470 were used as PCR primers.
  • the amplified DNA fragment was cloned into a plasmid using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit and named pCR-5U_ALD5-ALD5-3U_ALD5.
  • DNA fragments of the 5 ′ upstream and 3 ′ downstream untranslated regions of the ALD5 gene and the region containing pCR-BluntII-TOPO were amplified by PCR.
  • a DNA fragment containing the TRP1 gene, its promoter and terminator region was amplified by PCR using the genomic DNA of the yeast BY4742 strain as a template.
  • TB3631 designed so that the DNA fragment obtained by amplification overlaps with a DNA fragment amplified by PCR using genomic DNA of yeast BY4742 as a template. And used TB3599.
  • the DNA fragment obtained by each PCR was cloned using In-Fusion HD Cloning Kit and named pCR-5U_ALD5-TRP1-3U_ALD5.
  • a DNA fragment containing the ALD6 gene and its 5 ′ upstream and 3 ′ downstream untranslated regions was amplified by PCR using the genomic DNA of yeast BY4742 strain as a template.
  • TB3406 and TB3408 were used as PCR primers, respectively.
  • the amplified DNA fragment was cloned into a plasmid using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit and named pCR-5U_ALD6-ALD6-3U_ALD6.
  • DNA fragments of the 5 ′ upstream and 3 ′ downstream untranslated regions of the ALD6 gene and the region containing pCR-BluntII-TOPO were amplified by PCR.
  • a DNA fragment containing the TRP1 gene, its promoter and terminator region was amplified by PCR using the genomic DNA of the yeast BY4742 strain as a template.
  • TB3710 designed so that the DNA fragment obtained by amplification overlaps by about 15 bp with the DNA fragment amplified by PCR using genomic DNA of yeast BY4742 strain as a template. And used TB3600.
  • the DNA fragment obtained by each PCR was cloned using In-Fusion® HD® Cloning® Kit and named pCR-5U_ALD6-TRP1-3U_ALD6.
  • ⁇ DNA fragment for HIS3 gene disruption A DNA fragment containing the HIS3 gene and its 5 ′ upstream and 3 ′ downstream untranslated regions was amplified by PCR using the genomic DNA of yeast BY4742 strain as a template. TB3164 and TB3165 were used as PCR primers. The amplified DNA fragment was cloned into a plasmid using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit and named pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3.
  • pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3 As a template, 5 'upstream and 3' downstream untranslated regions of the HIS3 gene and a region containing pCR-BluntII-TOPO, and pAUR101 (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template
  • the AUR1-C gene, its promoter, and a DNA fragment containing a terminator region were amplified by PCR.
  • the PCR primers used were TB3458 and TB3459, TB2885 and TB2859 designed so that the DNA fragments obtained by amplification overlap each other by about 15 bp.
  • the DNA fragment obtained by each PCR was cloned using In-Fusion® HD® Cloning® Kit and named pCR-5U_HIS3-AUR1-C-3U_HIS3.
  • ⁇ HIS3 gene disruption strain Using the pCR-5U_HIS3-AUR1-C-3U_HIS3 prepared as described above as a template, DNA fragments other than pCR-Blunt II TOPO in the vector portion were amplified by PCR. TB3164 and TB3165 were used as PCR primers. Using the DNA fragment amplified by PCR, the Uz326 strain overexpressed xylose-utilizing genes (XYL1, XYL2, XKS1) in the diploid homothallic yeast Saccharomyces cerevisiaeOC2 was transformed into the Frozen-EZ Yeast Transformation II kit (ZYMO RESEARCH The product was transformed according to the protocol attached to the kit.
  • the ALD5 gene disruption DNA fragment and the ALD6 gene disruption DNA fragment were amplified by PCR (primers were TB3469, TB3470, TB3406, respectively). And TB3408), ALD5 gene and ALD6 gene disruption strains were obtained by transformation and doubling.
  • the ALD5 gene disruption strain derived from the Uz644 strain was the Uz677 strain
  • the ALD6 gene disruption strain was the Uz679 strain.
  • the ALD5 gene disruption strain derived from the Uz632 strain was designated as the Uz830 strain
  • the ALD6 gene disruption strain was designated as the Uz832 strain.
  • Ethanol and glucose in the fermentation broth were quantified using HPLC (LC-10A; Shimadzu Corporation). Specifically, in HPLC, AminexHPX-87H was used as a column, 0.01N H 2 SO 4 was used as a mobile phase, the flow rate was 0.6 ml / min, and the temperature was 30 ° C.
  • the detector used was a differential refractive index detector: RID-10A.
  • a medium containing cellulose and a saccharifying enzyme (cellulase preparation: Cellic TM CTec2) is a so-called simultaneous saccharification in which the saccharification step by saccharifying enzyme and ethanol fermentation by the test strain proceed simultaneously. It corresponds to the fermentation system.
  • Tables 4 and 5 show the results of quantification of ethanol and glucose in the fermentation broth of XR / XDH non-introduced strains (Uz632 strain and Ald gene-disrupted strain derived from Uz632 strain). As can be seen from Tables 4 and 5, the ethanol yield in the medium containing acetic acid decreased in the control strain Uz632 in both the simultaneous saccharification fermentation system and the normal ethanol fermentation system not containing saccharification treatment.
  • the ethanol yield in the medium containing acetic acid was superior to that of the Uz632 strain in both the simultaneous saccharification fermentation system and the normal ethanol fermentation system that did not include saccharification treatment. It was revealed that an ethanol yield equivalent to that obtained when a medium containing no acetic acid was used can be achieved.
  • Table 6 shows the results of quantifying ethanol and glucose in the fermentation broth of the XR / XDH-introduced strain (Uz644 strain and Ald gene-disrupted strain derived from the Uz644 strain).
  • the ethanol strain of the control strain Uz644 decreased in the medium containing acetic acid in the simultaneous saccharification and fermentation system.
  • the Uz644 strain had no significant difference in ethanol yield between a medium containing acetic acid and a medium not containing acetic acid in a normal ethanol fermentation system without saccharification treatment. That is, in yeast having xylose metabolism ability, ethanol fermentation inhibition by acetic acid was confirmed only in the simultaneous saccharification and fermentation system.
  • XYL1, XYL2, and XKS1 gene overexpression in the homothallic diploid yeast Saccharomyces cerevisiae OC2-T strain (Saitoh, S. et al., J. Ferment. Bioeng. 1996, 81, 98-103) A procedure for producing a strain into which the GRE3 gene has been heterogeneously introduced will be described.
  • RNA fragment containing the GRE3 gene and its 5 ′ upstream and 3 ′ downstream untranslated regions was amplified by PCR.
  • TB2358 (5′-TGGGAATATTACCGCTCGAAG-3 ′: SEQ ID NO: 27) and TB2359 (5′-AAGGGGGAAGGTGTGGAATC-3 ′: SEQ ID NO: 28) were used as PCR primers, respectively.
  • PCR primer design for the DNA sequence amplification of yeast BY4742 strain was referred to the DNA sequence data of Saccharomyces Genome Database.
  • plasmid pUC19 as a template, a linear DNA fragment containing the full length of pUC19 that was cleaved at the multicloning site of pUC19 was amplified by PCR.
  • TB2373 (5′-CACACCTTCCCCCTTGATCCTCTAGAGTCGACC-3 ′: SEQ ID NO: 29) and TB2374 (5′-GCGGTAATATTCCCAGATCCCCGGGTACCGAGCTC-3 ′: SEQ ID NO: 30) were used as PCR primers, respectively.
  • the above two DNA fragments were cloned using In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit (Takara Bio) and named pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3.
  • the primers for PCR are TB3018 (5'-AACGAGGCGCGCTCTTCCAGCCAGTAAAATCCA-3 ': SEQ ID NO: 31) and TB3017 (5'-GCTATGGTGTGTGGGCTTTAAAAAATTTCCAATTTTCCTTTACG-3': SEQ ID NO: 32), TB2210 (5'-CCCACACACCATAGCTTCAAAATG-3 ': SEQ ID NO: 33) TB2269 (5'-TCTTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAGCAAG-3 ': SEQ ID NO: 34), TB2345 (5'-AATCTAATCTAAAGAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGAC-3': SEQ ID NO: 35) and TB2346 (5'-CTGCGGCCGGCCGCATTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTC-3 ': 140 TGCGGCCGGCCGCAGC-3 ′: SEQ ID NO: 37) and TB2683 (5′-GCGCCTCGTTCAGAAT
  • pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3 as a template, a linear DNA fragment containing the entire length of the plasmid as cleaved between the HIS3 terminator region and the 3 ′ downstream untranslated region of the GRE3 gene, and the yeast BY4742 strain
  • the XYL1 gene was amplified by PCR using a DNA fragment containing the TDH2 promoter region, a DNA fragment containing the ILV3 terminator region, and the genomic DNA of Pichia stipitis as a template.
  • the primers for PCR are TB9020 (5'-TCCAGCCAGTAAAATCCATAC-3 ': SEQ ID NO: 39), TB2457 (5'-CCGTCAAGAGAGCGCGCCTCGTTCAG-3': SEQ ID NO: 40), TB2844 (5'-GCGCTCTCTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3 ': SEQ ID NO: 41), respectively.
  • TB2595 (5'-TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3 ': SEQ ID NO: 42), TB2314 (5'-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3': SEQ ID NO: 43) and TB2455 (5'-GGGGCCTATAATGCATTAGACGAAGATAGGAATCTTG-3 ': SEQ ID NO: 44, TB-4)
  • AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3 ′: SEQ ID NO: 45) and TB3019 (5′-ATTTTACTGGCTGGAATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3 ′: SEQ ID NO: 46) were used.
  • PCR primer design for XYL1 gene sequence amplification referred to the Pichia stipitis XYL1 gene (registration number XM_001385144) registered in GeneBank.
  • the above four DNA fragments were cloned using In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit and named pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3.
  • pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3 as a template, linear DNA containing the entire length of the plasmid as cleaved between the ILV3 terminator region and the 3 'downstream untranslated region of the GRE3 gene
  • the XYL2 gene was amplified by PCR using the fragment, genomic DNA of yeast BY4742 strain as a template, DNA fragment containing PDC1 promoter region and DNA fragment containing ILV6 terminator region, and genomic DNA of Pichia stipitis.
  • the primers for PCR were TB2375 (5'-AGTTGCTTGACACGGTGGAAGAAGGTCCAGCCAGTAAAATCCATA-3 ': SEQ ID NO: 47) and TB3021 (5'-ATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3': SEQ ID NO: 48), TB2010 (5'-TTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC-3 ': SEQ ID NO: 49), respectively.
  • TB2261 (5'-CCGTGTCAAGCAACTATGGG-3 ': SEQ ID NO: 50), TB3022 (5'-TATAATCTACGAAATTAATAAGAAAGGTGACCGTG-3': SEQ ID NO: 51) and TB2347 (5'-GTTAGTCTCTCGGCCTTGCG-3 ': SEQ ID NO: 52), TB2351 (5'- GGCCGAGAGACTAACTTACTCAGGGCCGTCAAT-3 ′: SEQ ID NO: 53) and TB2352 (5′-GTCAAATCAATCAAAATGACTGCTAACCCTTCC-3 ′: SEQ ID NO: 54) were used.
  • the PCR primer design for XYL2 gene sequence amplification was based on the Pichia stipitis XYL2 gene (registration number AF127801 or X55392) registered in GeneBank.
  • the above four DNA fragments were cloned using In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit and named pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3.
  • OC2-T strain was transformed with Frozen-EZ Yeast Transformation II kit (ZYMO RESEARCH) according to the protocol attached to the kit. After transformation, it was spread on a plate using xylose as a sole carbon source and cultured at 30 ° C. for 7 days to obtain a transformant.
  • ZYMO RESEARCH Frozen-EZ Yeast Transformation II kit
  • Genomic DNA was prepared from the transformant, and TB2356 (5'-TGGGGCTAAACGAGATTTGG-3 ': SEQ ID NO: 55) and TB592 (5'-GAAATTTAGTATGCTGTGCTTGGG-3': primers outside the inserted DNA fragment and inside the vector were prepared by PCR. Using SEQ ID NO: 56), it was confirmed that one copy was normally integrated into the chromosome.

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Abstract

　酢酸の存在下においてエタノール発酵効率を向上させることができ、優れたエタノール生産性を実現する。　サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae）におけるALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つのアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子に相当するアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損した酵母変異株を、酢酸を含む培地にて培養し、培地中のエタノールを回収する。

Description

組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
　本発明は、組換え酵母を用いたエタノールの製造方法に関する。
　一般に、エタノール発酵を利用したエタノールの製造方法において、反応系に含まれる発酵阻害物質として酢酸が知られている。すなわち、酢酸を含む反応系では、エタノール発酵の効率が低下し、酢酸を含まない反応系と比較してエタノール収率が低くなるといった問題が知られている。例えば、セルロース系バイオマスを利用したエタノール製造において、酢酸は、セルロース系バイオマスの加水分解物に多く含まれ、酵母のエタノール発酵を阻害することが知られている。特に、キシロースの資化遺伝子を導入した酵母においては、キシロースを糖源としたエタノール発酵を著しく阻害することが知られている（非特許文献１及び２）。
　一方、セルロース系バイオマスをセルラーゼで糖化したものを発酵したもろみには、主として、未発酵残査、難発酵残渣、酵素及び発酵用微生物が含まれている。もろみを含む反応液を次に行う発酵に利用することで発酵用微生物の再利用ができ、発酵用微生物の新規投入量を削減でき、低コスト化を図ることができる。しかし、この場合、もろみに含まれる酢酸も同時に持ち込まれることになり、その結果、発酵培地に含まれる酢酸の濃度が上昇し、エタノール発酵を阻害する虞がある。また、発酵槽内のもろみを、減圧に保持したフラッシュタンクに送り、フラッシュタンク内でエタノールを除去した後、もろみを発酵槽に返送するような連続発酵法においても、酢酸をもろみから取り除くことは難しいため、酢酸による発酵阻害が重要な問題となる。
　酢酸による発酵阻害を回避するため、エタノール発酵で一般的に用いられる菌株であるサッカロマイセス・セレビジエのLPP1遺伝子やENA1遺伝子の過剰発現（非特許文献３）、FPS1遺伝子の破壊（非特許文献４）により、酢酸存在下でエタノールの発酵能力が改善されている報告がある。しかしながら、これらの報告は、グルコースを基質とした場合のエタノール発酵の結果であり、酢酸により発酵が著しく阻害されるキシロースを基質とした場合のエタノール発酵に対する効果は不明である。また、これらに報告された変異酵母を用いたとしても、上述したような発酵菌体再利用や連続発酵の際に問題になる酢酸の持ち込み量を減らすことには繋がらない。
　酢酸による発酵阻害を回避する別の方法としては、培地中の酢酸をエタノール発酵と同時に代謝させることが考えられる。しかし、酢酸の代謝は好気的な反応であり、エタノールの代謝経路と重複する。そのため、好気的な条件で発酵を行うと酢酸を代謝させることができる可能性はあるものの、同時に目的物質であるエタノールも代謝される。
　ところで、酵母は酢酸生合成経路を有しており、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子であるALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子が酢酸生合成に関与している。そこで、それらの遺伝子を破壊することで、酢酸生産量が低下し(非特許文献５)、発酵阻害が回避される可能性が考えられる。しかし、ALD6遺伝子の破壊株はグルコースを糖源とした培地でのエタノール生産性が変化しないか低下することが報告されている(非特許文献６)。一方、キシロース還元酵素遺伝子とキシリトール脱水素酵素遺伝子が導入され、キシロースを資化可能になった酵母においては、ALD6遺伝子の破壊により、キシロースの資化が改善することが報告されている(非特許文献７及び特許文献１)。しかしこれらの報告では、キシロース還元酵素遺伝子及びキシリトール脱水素酵素遺伝子をALD6破壊株に導入した組み換え酵母におけるエタノール生産を検討しているが、キシロースからのエタノール生産速度が向上しているものの、エタノールの収率はほぼ変わらないとの結果となっている。なお、ALD6破壊株については、非特許文献６にエタノール発酵データが開示されており、エタノール生産性が変化しないか低下することが報告されている。
WO 2003/078643 WO 2011/010923
FEMS Yeast Research, vol. 9, 2009, 358-364 Enzyme and Microbial Technology 33, 2003, 786-792 Biotechnol. Bioeng. 2009 103(3):500-512 Biotechnol. Lett. 2011 33: 277-284 Microbiology 2004 150: 2209-2220 Yeast 2002 19,295-301 Appl. Environ. Microbiol. 2004 70:2892-2897
　そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、酢酸の存在下においてエタノール発酵効率を向上させることができ、優れたエタノール生産性を実現できる組換え酵母を用いたエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子における特定のアイソフォームを欠損した酵母変異株は、酢酸の存在下においてエタノール発酵効率が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下を包含する。
（１）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つのアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子に相当するアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損した酵母変異株を、酢酸を含む培地にて培養し、
　培地中のエタノールを回収することを特徴とするエタノールの製造方法。
（２）上記酵母変異株は、キシロース代謝能を有することを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
（３）上記酵母変異株は、キシロース代謝関連遺伝子が導入されていることを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
（４）上記培地は、セルロース系バイオマスの加水分解物を含むことを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
（５）上記培地は、セルロース系バイオマスと当該セルロース系バイオマスを糖化する糖化酵素を含むことを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
（６）上記酵母変異株は、外来遺伝子の非導入株であることを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-171396号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明に係るエタノールの製造方法では、培地中に酢酸が含まれている場合であってもエタノール発酵の効率を低下させることなく、優れたエタノール生産性を達成することができる。したがって、本発明に係るエタノールの製造方法は、特に、セルロース系バイオマスを糖化してなる糖成分をエタノール発酵の原料として利用する系（例えば、同時糖化発酵）に適用することが好ましい。
　以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
　本発明に係るエタノールの製造方法は、特定のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損した酵母変異株を使用し、酢酸を含有する培地からエタノールを合成する方法である。
＜酵母変異株＞
　本発明に係るエタノールの製造方法に使用される酵母変異株は、特定のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損したものである。特定のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子とは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）においてはALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子と呼称されるアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子である。すなわち、本発明に係るエタノールの製造方法に使用する酵母変異株を、サッカロマイセス・セレビシエ野生株から作製する場合、これらALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子からなる群から選ばれる少なくとの１つのアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損させる。
　また、サッカロマイセス・セレビシエ以外の酵母を用いて、本発明に係るエタノールの製造方法に使用する酵母変異株を作製する場合、当該酵母においてALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子に相当する遺伝子のうち少なくとも１つのアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損させる。
　より具体的に、欠損対象のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、サッカロマイセス・セレビシエのALD4遺伝子の塩基配列及び当該ALD4遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。また、サッカロマイセス・セレビシエのALD5遺伝子の塩基配列及び当該ALD5遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。さらに、サッカロマイセス・セレビシエのALD6遺伝子の塩基配列及び当該ALD6遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。
　ただし、欠損対象のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、配列番号１～６にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
　また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１～６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２、４又は６のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
　さらに、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１～６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２、４又は６のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、アセトアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２～３０個、好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個、最も好ましくは２～５個である。
　さらにまた、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、これら配列番号１～６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１、３又は５の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトアセトアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25～500mM、好ましくは25～300mMであり、温度が42～68℃、好ましくは42～65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
　上述したように、配列番号１、３又は５と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号２、４又は６とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば酵母等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のアセトアルデヒド脱水素酵素活性を測定すればよい。アセトアルデヒド脱水素酵素活性は、基質としてアセトアルデヒド又はNADP+を含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、生成するNADH又はNADPHを分光学的に計測して測定することができる。
　ところで、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される酵母変異株は、上述したように特定のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損している以外に、キシロース代謝能を有する酵母であることが好ましい。ここで、キシロース代謝能を有するとは、キシロース代謝関連遺伝子を導入することでキシロース代謝能が付与された場合、本来的にキシロース代謝関連遺伝子を有しておりキシロース代謝能を本来的に有している場合のいずれも含む意味である。すなわち、キシロース代謝能を有する酵母といった場合、キシロース代謝関連遺伝子を導入した組換え酵母とキシロース代謝関連遺伝子を本来的に有する酵母のいずれも含む意味である。
　キシロース代謝能を有する酵母は、培地中に含まれるキシロースを資化してエタノールを生産することができる。なお、培地中に含まれるキシロースとは、キシロースを構成糖とするキシランやヘミセルロース等を糖化するプロセスによって得られたものでも良いし、培地に含まれるキシランやヘミセルロース等が糖化酵素により糖化されることで培地に供給されるものであってもよい。後者の場合は、所謂、同時糖化発酵の系を意味する。
　キシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
　キシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。なお、ストレプトマイセスムリナスクラスター由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子等を利用することもできる。
　また、キシロース代謝能を本来的に有する酵母としては、特に限定されないが、Pichia stipitis、Candida tropicalis及びCandida prapsilosis等を挙げることができる。
　一方、キシロース代謝能を有する酵母に導入するアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、特に限定されず、如何なる生物由来の遺伝子を使用しても良い。また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、酵母等の真菌以外の生物、例えば、細菌や動物、植物、昆虫、藻類由来の遺伝子を使用する場合、導入する酵母におけるコドン使用頻度に併せて塩基配列を改変した遺伝子を使用することが好ましい。
　なお、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される酵母変異株は、更に他の遺伝子が導入された酵母であってもよい。他の遺伝子としては特に限定されないが、例えば、グルコース等の糖代謝に関与する遺伝子を挙げることができる。一例としては、β－グルコシダーゼ遺伝子を導入することでβ－グルコシダーゼ活性を有するように改変した酵母変異株を使用することもできる。
　ここでβ－グルコシダーゼ活性とは、糖のβ-グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する活性を意味する。すなわち、β－グルコシダーゼは、セロビオース等のセロオリゴ糖をグルコースに分解することができる。β－グルコシダーゼ遺伝子は、細胞表層提示型遺伝子として導入することもできる。ここで、細胞表層提示型遺伝子とは、当該遺伝子がコードするタンパク質が細胞の表層にディスプレイされるように発現するように改変された遺伝子である。例えば、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子とは、βグルコシダーゼ遺伝子と細胞表層局在タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子である。細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα-またはａ-アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、N末端側に分泌シグナル配列及びC末端側にGPIアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はGPIアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は、細胞膜通過の際、GPIアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したC末端部分でGPIアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC（PI-PLC）によりGPIアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する（例えば、特開２００６－１７４７６７号公報参照）。
　βグルコシダーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、Aspergillus aculeatus由来のβグルコシダーゼ遺伝子（Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4857-4861）を挙げることができる。その他にも、βグルコシダーゼ遺伝子としては、Aspergillus oryzae由来のβグルコシダーゼ遺伝子、Clostridium cellulovorans由来のβグルコシダーゼ遺伝子及びSaccharomycopsis fibligera由来のβグルコシダーゼ遺伝子等を利用することができる。
　また、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、βグルコシダーゼ遺伝子に加えて、或いはβグルコシダーゼ遺伝子以外に、セルラーゼを構成する他の酵素をコードする遺伝子を導入したものでもよい。βグルコシダーゼ以外にセルラーゼを構成する酵素としては、結晶セルロースの末端からセロビオースを遊離するエキソ型のセロビオハイドロラーゼ（CBH1及びCBH2）、結晶セルロースを分解できないが非結晶セルロース（アモルファスセルロース）鎖をランダムに切断するエンド型のエンドグルカナーゼ（EG）を挙げることができる。
＜酵母変異体の作製＞
　宿主となる酵母ゲノムにおける、上述したアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損させることにより、本発明に使用できる酵母変異株を作製することができる。ここで、上述したアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損させるとは、当該遺伝子を抑制することと同義であり、当該遺伝子の発現量を抑制又は減少させること、当該遺伝子によりコードされるタンパク質の機能を阻害することを含む意味である。遺伝子を欠損させるとは、当該遺伝子のコーディング領域の一部又は全部を含む領域を染色体より欠失させること、当該遺伝子のコーディング領域にトランスポゾン等を組み込むことで当該遺伝子を破壊すること意味する。また、遺伝子の発現量を減少させる方法としては、特に限定されないが、当該遺伝子の発現制御領域を改変して転写量を低減する方法、当該遺伝子の転写産物を選択的に分解する方法等を挙げることができる。
　本発明において遺伝子を抑制する手法としては、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を挙げることができる。
　ここで、上述のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、キシロース代謝能を有しない酵母に対してキシロース代謝関連遺伝子を導入した組換え酵母において欠損させても良いし、キシロース代謝能を本来的に有する酵母において欠損させても導入しても良いし、キシロース代謝能を有しない酵母にキシロース代謝関連遺伝子を導入するとともに当該遺伝子を欠損させてもよい。また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子をキシロース代謝能を有しない酵母において欠損させ、その後、キシロース代謝関連遺伝子を当該組換え酵母に導入することでキシロース代謝能を付与しても良い。
　宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae及びSchizosaccaromyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。
　また、宿主となる酵母としては、ホモタリック性を有する酵母を使用することが好ましい。特開２００９－３４０３６号公報に開示される手法によれば、ホモタリック性を有する酵母を利用することで、簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能となる。ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
　なかでも、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、従来ワイン醸造の場面で利用されてきた安全性を確認されている菌株であるため好ましい。また、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、後述する実施例で示したように、高糖濃度の条件下におけるプロモーター活性が優れた菌株であるため好ましい。特にSaccharomyces cerevisiae OC-2株は、高糖濃度条件においてピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーター活性が優れているため好ましい。
　また、導入する遺伝子のプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
　すなわち、上述した遺伝子は、発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに酵母のゲノムに導入してもよい。または、上述した遺伝子は、宿主となる酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。
　また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
＜エタノール製造＞
　以上で説明した酵母変異株を使用してエタノールを製造する際、エタノール発酵用培地としては特に限定されない。上述した酵母変異株は、培地中に酢酸が含まれていてもエタノール発酵の効率が低下しないか、又は培地中に酢酸が含まれているときにエタノール発酵の効率が向上するといった特徴を有している。よって、上述した酵母変異体は、酢酸を含有するような培地を用いてエタノール発酵する系に使用することがより好ましい。
　酢酸を含有する培地としては、特に限定されないが、セルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化して得られる炭素源を含む培地を挙げることができる。セルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化すると酢酸等の発酵阻害物質が生産される。よって、セルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化して得られる培地を使用してエタノールを製造する場合には、培地に酢酸が含まれることとなる。なお、セルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化して得られる培地とは、セルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化した後の培地でも良いし、セルロース系バイオマスと糖化酵素とを含む糖化処理前の培地でもよい。セルロース系バイオマスと糖化酵素とを含む糖化処理前の培地とは、糖化酵素による糖化処理と上記酵母変異株によるエタノール発酵とが同時に起こることとなる。
　特に、セルロース系バイオマスを用いてエタノールを製造する場合、上述した酵母変異株としては、キシロース代謝能を有する酵母変異株を使用することが好ましい。キシロース代謝能を有する酵母変異体を使用することで、セルロース系バイオマスに含まれるセルロースに由来するグルコースに加えて、ヘミセルロースに由来するキシロースを炭素源としてエタノール発酵を行うことができる。
　ここで、セルロース系バイオマスとしては、従来公知の前処理を施したものであっても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。また、前処理としては、例えば、粉砕したセルロース系バイオマスを希硫酸溶液やアルカリ溶液、イオン液体に浸漬する処理、水熱処理、微粉砕処理といった処理を適用しても良い。これら前処理により、バイオマスの糖化率を向上させることができる。
　なお、糖化方法としては、特に限定されないが、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ製剤を利用する酵素法等を挙げることができる。セルラーゼ製剤は、セルロース鎖及びヘミセルロース鎖の分解に関与する複数の酵素を含んでおり、エンドグルカナーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ活性及びキシロシダーゼ活性等の複数の活性を示す。セルラーゼ製剤としては、特に限定されないが、例えば、Trichoderma reeseiや、Acremonium cellulolyticusなどが生産するセルラーゼを挙げることができる。セルラーゼ製剤としては、市販されているものを使用しても良い。
　以上のように、本発明に係るエタノールの製造方法は、培地に含まれるセルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化する工程と、糖化により生成されたグルコースやキシロース等の炭素源を利用したエタノール発酵の工程とが同時に進行する、いわゆる同時糖化発酵処理とすることが好ましい。ここで、同時糖化発酵処理とは、セルロース系バイオマスを糖化する工程とエタノール発酵工程とを区別せずに同時に実施する処理を意味する。
　同時糖化発酵処理では、セルロース系バイオマス（前処理後であってもよい）を含む培地にセルラーゼ製剤と上述した酵母変異体とを加え、所定の温度範囲で当該酵母変異体を培養する。培養温度としては特に限定されないが、エタノール発酵の効率を考慮して25～45℃とすることができ、30～40℃とすることが好ましい。また、培養液のpHを4～6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。
　本発明に係る酵母変異体を利用したエタノールの製造方法では、エタノール発酵の後、培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、酵母変異体や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
　一般に、バイオマスに由来する糖を利用してエタノールを製造する場合、上述した前処理や糖化処理において酢酸やフルフラールといった発酵阻害物質が生産される場合がある。特に酢酸については、酵母の生育・増殖を阻害し、キシロースを糖源とするエタノール発酵の効率を低下させることが知られている。しかしながら、本発明においては、所定のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損した酵母変異株を使用しているため、酢酸を含有する培地においてもエタノール発酵の効率が低下しないか、又はエタノール発酵の効率が向上する。よって、本発明に係るエタノールの製造方法は、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損していない酵母を使用した場合と比較して優れたエタノール収率を達成できる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
＜供試株＞
　本実施例では、ワイン酵母（Saccharomyces cerevisiae）OC2株（NBRC2260）にキシロース代謝遺伝子であるS. stipitis由来キシロース還元酵素遺伝子（XYL1）及びキシリトール脱水素酵素遺伝子（XYL2）と、宿主由来のXKS1遺伝子とをGRE3遺伝子座に導入したUz326株（後述の参考例を参照）、Uz326株にヒスチジン要求性を付与したUz644株、Uz644株を親株として、ALD4遺伝子を破壊したUz675株、ALD5遺伝子を破壊したUz677株、ALD6遺伝子を破壊したUz679株と、トリプトファン要求性のOC2-T株(Saitoh, S.ら、J. Ferment. Bioeng. 1996年、81巻、98-103頁)のウラシル要求性変異株Uz632株を親株として、ALD4遺伝子を破壊したUz828株、ALD5遺伝子を破壊したUz830株、ALD6遺伝子を破壊したUz832株を使用した。これら供試株を表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜ALD4遺伝子破壊用DNA断片＞
　酵母BY4742株（Open Biosystems社製）のゲノムDNAを鋳型として、ALD4遺伝子とその5'上流及び3'下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはTB3248とTB3249を使用した（プライマーの塩基配列は表２に纏めて示した。以下、他のプライマーの塩基配列も同様）。なお、これらTB3248及びTB3249を含む酵母BY4742株のDNA配列増幅ためのPCRプライマーの設計は、Saccharomyces Genome DatabaseのDNA配列データを参考にした。増幅したDNA断片はZero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（ライフテクノロジーズ社製）を使用して、プラスミドにクローニングし、pCR-5U_ALD4-ALD4-3U_ALD4と命名した。
　得られたpCR-5U_ALD4-ALD4-3U_ALD4を鋳型として、ALD4遺伝子の5'上流及び3'下流非翻訳領域とpCR-BluntII-TOPOを含む領域のDNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TRP1遺伝子とそのプロモーターとターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれ増幅して得られたDNA断片が約15bp重複するように設計したTB3486とTB3460、TB2800とTB2799を使用した。上記２つのDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いてクローニングし、pCR-5U_ALD4-TRP1-3U_ALD4と命名した。
＜ALD5遺伝子破壊用DNA断片＞
　酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、ALD5遺伝子とその5'上流及び3'下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはTB3469とTB3470を使用した。増幅したDNA断片はZero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを使用して、プラスミドにクローニングし、pCR-5U_ALD5-ALD5-3U_ALD5と命名した。
　得られたpCR-5U_ALD5-ALD5-3U_ALD5を鋳型として、ALD5遺伝子の5'上流及び3'下流非翻訳領域とpCR-BluntII-TOPOを含む領域のDNA断片をPCRで増幅した。また、上述した＜ALD4遺伝子破壊用DNA断片＞と同様に、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TRP1遺伝子とそのプロモーターとターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。pCR-5U_ALD5-ALD5-3U_ALD5を鋳型としたPCRでは、増幅して得られたDNA断片が、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型としたPCRで増幅するDNA断片と約15bp重複するように設計したTB3631とTB3599を使用した。各PCRで得られたDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kitを用いてクローニングし、pCR-5U_ALD5-TRP1-3U_ALD5と命名した。
＜ALD6遺伝子破壊用DNA断片＞
　酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、ALD6遺伝子とその5'上流及び3'下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB3406とTB3408を使用した。増幅したDNA断片はZero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを使用して、プラスミドにクローニングし、pCR-5U_ALD6-ALD6-3U_ALD6と命名した。
　得られたpCR-5U_ALD6-ALD6-3U_ALD6を鋳型として、ALD6遺伝子の5'上流及び3'下流非翻訳領域とpCR-BluntII-TOPOを含む領域のDNA断片をPCRで増幅した。また、上述した＜ALD4遺伝子破壊用DNA断片＞と同様に、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TRP1遺伝子とそのプロモーターとターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。pCR-5U_ALD6-ALD6-3U_ALD6を鋳型としたPCRでは、増幅して得られたDNA断片が、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型としたPCRで増幅するDNA断片と約15bp重複するように設計したTB3710とTB3600を使用した。各PCRで得られたDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kitを用いてクローニングし、pCR-5U_ALD6-TRP1-3U_ALD6と命名した。
＜HIS3遺伝子破壊用DNA断片＞
　酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、HIS3遺伝子とその5'上流及び3'下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはTB3164とTB3165を使用した。増幅したDNA断片はZero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを使用して、プラスミドにクローニングし、pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3と命名した。
　得られたpCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3を鋳型として、HIS3遺伝子の5'上流及び3'下流非翻訳領域とpCR-BluntII-TOPOを含む領域のDNA断片と、pAUR101（タカラバイオ社製）を鋳型として、AUR1-C遺伝子とそのプロモーターとターミネーター領域を含むDNA断片とをPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれ増幅して得られたDNA断片が約15bp重複するように設計したTB3458とTB3459、TB2885とTB2859を使用した。各PCRで得られたDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kitを用いてクローニングし、pCR-5U_HIS3-AUR1-C-3U_HIS3と命名した。
＜HIS3遺伝子破壊株＞
　上述のように作製したpCR-5U_HIS3-AUR1-C-3U_HIS3を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはTB3164とTB3165を使用した。PCRで増幅したDNA断片を用いて、2倍体のホモタリックな酵母Saccharomyces cerevisiaeOC2株にキシロース資化遺伝子（XYL1、XYL2、XKS1）を過剰発現させたUz326株をFrozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH社製）を用いて、キット添付のプロトコールに従い、形質転換した。形質転換後、オーレオバシジンを含むYPDプレートにまいて、30℃で7日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成培地（1% リン酸カリウム、0.1% イーストエキストラクト、0.05% ブドウ糖、2% 寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のHIS3遺伝子座領域の両方にAUR1-C遺伝子が組み込まれHIS3遺伝子が破壊されている株を取得した。これをUz644株とした。
＜ALD4・ALD5・ALD6遺伝子破壊株＞
　上述のように作製したpCR-5U_ALD4-ALD4-3U_ALD4を鋳型として、ベクター部分のpCR-Blunt II TOPO以外のDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはTB3248とTB3249を使用した。PCRで増幅したDNA断片を用いて、Uz644株と、トリプトファン要求性の2倍体酵母Saccharomyces cerevisiae OC2-T株を5-フルオロオロチン酸添加培地で生育した株を選抜し（Boeke, J.D., et al. 1987 Methods Enzymol.;154:164-75.）、ウラシル要求性株となったUz632株とを、Frozen-EZ Yeast Transformation IIキットを用いて形質転換した。形質転換後、トリプトファンを含まない完全合成培地（SC）培地（Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）にまいて、30℃で7日間培養し、形質転換体を得た。本株を胞子形成培地で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行いALD4遺伝子がホモ破壊されている株を取得し、Uz644株から得られた株をUz675株とし、Uz632株から得られた株をUz828株とした。
　また、同様にpCR-5U_ALD5-ALD5-3U_ALD5、pCR-5U_ALD6-TRP1-3U_ALD6を鋳型として、ALD5遺伝子破壊用DNA断片とALD6遺伝子破壊用DNA断片をPCRで増幅し（それぞれプライマーはTB3469とTB3470、TB3406とTB3408）、形質転換・2倍化を行いALD5遺伝子とALD6遺伝子破壊株を取得した。Uz644株由来のALD5遺伝子破壊株はUz677株、ALD6遺伝子破壊株はUz679株とした。Uz632株由来のALD5遺伝子破壊株はUz830株、ALD6遺伝子破壊株はUz832株とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜フラスコ発酵試験＞
　上述のように作製した供試株を用いてフラスコ発酵試験を実施した。先ず、グルコース濃度20g/LのYPD液体培地を100ml容バッフル付きフラスコに20ml分注し、供試株を植菌し、30℃、120rpmで24時間培養を行った。集菌後、表３に示す組成の発酵培地（12ml）を分注した10ml容フラスコに植菌し、振盪培養（80rpm、振幅35mm、30℃、n=１）にて発酵試験を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　発酵液中のエタノール及びグルコースを、HPLC（LC-10A；島津製作所）を使用して定量した。具体的に、HPLCでは、カラムとしてAminexHPX-87Hを使用し、移動相として0.01NのH2SO4を使用し、流量を0.6ml/minとし、温度を30℃とする条件とした。また、検出器は示差屈折率検出器：RID-10Aを使用した。
　なお、表３に示した発酵培地のうち、セルロースと糖化酵素（セルラーゼ製剤：CellicTMCTec2）を含む培地は、糖化酵素による糖化工程と供試株によるエタノール発酵とが同時に進行する、いわゆる同時糖化発酵の系に対応している。
＜発酵試験結果＞
　XR/XDH非導入株（Uz632株及び当該Uz632株に由来するAld遺伝子破壊株）について発酵液中のエタノール及びグルコースを定量した結果を表４及び５に示した。表４及び５から判るように、同時糖化発酵の系及び糖化処理を含まない通常のエタノール発酵の系ともに、コントロールであるUz632株では、酢酸を含有する培地におけるエタノール収率が低下した。一方、供試株のうちAld遺伝子破壊株を使用した場合、同時糖化発酵の系及び糖化処理を含まない通常のエタノール発酵の系ともに、酢酸を含有する培地におけるエタノール収率がUz632株よりも優れ、酢酸を含有しない培地を使用したときと同等のエタノール収率が達成できることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　また、XR/XDH導入株（Uz644株及び当該Uz644株に由来するAld遺伝子破壊株）について発酵液中のエタノール及びグルコースを定量した結果を表６に示した。表６から判るように、コントロール株であるUz644株は、同時糖化発酵の系で酢酸を含有する培地ではエタノール収率が低下した。これに対して、Uz644株は、糖化処理を含まない通常のエタノール発酵の系では酢酸を含有する培地と酢酸を含有しない培地との間でエタノール収率に有意な差は無かった。すなわち、キシロース代謝能を有する酵母では、同時糖化発酵の系においてのみ酢酸によるエタノール発酵阻害が確認された。そして、表６に示すように、キシロース代謝能を有する酵母において、Ald4遺伝子、Ald5遺伝子及びAld6遺伝子のいずれかを破壊することで、同時糖化発酵の系における酢酸によるエタノール発酵阻害を防止することができ、エタノール収率の低下を改善できることが明らかとなった。また、エタノールとグルコースの濃度は反比例することから、酢酸が培地に存在する同時糖化発酵の条件では、グルコースの資化能力が改善することで、ALD4、ALD5、ALD6破壊株のエタノール発酵能率が改善することが考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
〔参考例〕
　上述した実施例で使用したUz326株の作製手順について説明する。まず、ホモタリックな2倍体酵母のSaccharomyces cerevisiae OC2-T株(Saitoh, S.ら、J. Ferment. Bioeng. 1996年、81巻、98-103頁)にXYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子をヘテロに導入した株を以下のように作製し、胞子形成培地（1% リン酸カリウム、0.1% イーストエキストラクト、0.05% ブドウ糖、2% 寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のGRE3遺伝子座領域の両方にXYL1、XYL2、XKS1遺伝子が組み込まれGRE3遺伝子が破壊されている株を取得した。これをUz326株とした。
　詳細に、ホモタリックな2倍体酵母のSaccharomyces cerevisiae OC2-T株(Saitoh, S.ら、J. Ferment. Bioeng. 1996年、81巻、98-103頁)にXYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子をヘテロに導入した株の作製手順について説明する。
＜XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊用DNA断片の作成＞
　酵母BY4742株（Open Biosystems）のゲノムDNAを鋳型として、GRE3遺伝子とその5’上流・3’下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2358（5'-TGGGAATATTACCGCTCGAAG-3'：配列番号２７）とTB2359（5'-AAGGGGGAAGGTGTGGAATC-3'：配列番号２８）を使用した。なお、酵母BY4742株のDNA配列増幅ためのPCRプライマー設計は、Saccharomyces Genome DatabaseのDNA配列データを参考にした。プラスミドpUC19を鋳型として、pUC19のマルチクローニングサイトで切断されるようなpUC19全長を含む直鎖状DNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2373（5'-CACACCTTCCCCCTTGATCCTCTAGAGTCGACC-3'：配列番号２９）とTB2374（5'-GCGGTAATATTCCCAGATCCCCGGGTACCGAGCTC-3'：配列番号３０）を使用した。上記二つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit(タカラバイオ)を用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3と命名した。
　pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3を鋳型として、GRE3遺伝子の5’上流・3’下流非翻訳領域とpUC19を含む領域のDNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TEF1プロモーター領域を含むDNA断片、XKS1遺伝子、HIS3ターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB3018（5'-AACGAGGCGCGCTCTTCCAGCCAGTAAAATCCA-3'：配列番号３１）とTB3017（5'-GCTATGGTGTGTGGGCTTTAAAAAATTTCCAATTTTCCTTTACG-3'：配列番号３２）、TB2210（5'-CCCACACACCATAGCTTCAAAATG-3'：配列番号３３）とTB2269（5'-TCTTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAGCAAG-3'：配列番号３４）、TB2345（5'-AATCTAATCTAAAGAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGAC-3'：配列番号３５）とTB2346（5'-CTGCGGCCGGCCGCATTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTC-3'：配列番号３６）、TB1401（5'-TGCGGCCGGCCGCAGC-3'：配列番号３７）とTB2683（5'-GCGCCTCGTTCAGAATGA-3'：配列番号３８）を使用した。上記四つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3と命名した。
　pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3を鋳型として、HIS3ターミネーター領域と、GRE3遺伝子の3’下流非翻訳領域の間で切断したようなプラスミド全長を含む直鎖状DNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TDH2プロモーター領域を含むDNA断片と、ILV3ターミネーター領域を含むDNA断片、ピキア・スチピチスのゲノムDNAを鋳型としてXYL1遺伝子をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB9020（5'-TCCAGCCAGTAAAATCCATAC-3'：配列番号３９）とTB2457（5'-CCGTCAAGAGAGCGCGCCTCGTTCAG-3'：配列番号４０）、TB2844（5'-GCGCTCTCTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3'：配列番号４１）とTB2595（5'-TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3'：配列番号４２）、TB2314（5'-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3'：配列番号４３）とTB2455（5'-GGGGCCTATAATGCATTAGACGAAGATAGGAATCTTG-3'：配列番号４４）、TB2456（5'-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3'：配列番号４５）とTB3019（5'-ATTTTACTGGCTGGAATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3'：配列番号４６）を使用した。なお、XYL1遺伝子配列増幅のためのPCRプライマー設計は、GeneBankに登録されているピキア・スチピチスXYL1遺伝子（登録番号XM_001385144）を参考にした。上記四つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3と命名した。
　pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3を鋳型として、ILV3ターミネーター領域と、GRE3遺伝子の3’下流非翻訳領域の間で切断したようなプラスミド全長を含む直鎖状DNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、PDC1プロモーター領域を含むDNA断片とILV6ターミネーター領域を含むDNA断片、ピキア・スチピチスのゲノムDNAを鋳型として、XYL2遺伝子をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2375（5'-AGTTGCTTGACACGGTGGAAGAAGGTCCAGCCAGTAAAATCCATA-3'：配列番号４７）とTB3021（5'-ATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3'：配列番号４８）、TB2010（5'-TTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC-3'：配列番号４９）とTB2261（5'-CCGTGTCAAGCAACTATGGG-3'：配列番号５０）、TB3022（5'-TATAATCTACGAAATTAATAAGAAAGGTGACCGTG-3'：配列番号５１）とTB2347（5'-GTTAGTCTCTCGGCCTTGCG-3'：配列番号５２）、TB2351（5'-GGCCGAGAGACTAACTTACTCAGGGCCGTCAAT-3'：配列番号５３）とTB2352（5'-GTCAAATCAATCAAAATGACTGCTAACCCTTCC-3'：配列番号５４）を使用した。なお、XYL2遺伝子配列増幅のためのPCRプライマー設計は、GeneBankに登録されているピキア・スチピチスXYL2遺伝子（登録番号AF127801もしくはX55392）を参考にした。上記四つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3と命名した。
　pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3を鋳型とし、GRE3遺伝子の5’上流非翻訳領域からGRE3遺伝子の3’下流非翻訳領域までのDNA断片をPCRで増幅し、本断片をXYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊株作成に用いた。
＜XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子へテロ破壊株作製＞
　XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊用DNA断片を用いて、OC2-T株をFrozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH）を用いて、キット添付のプロトコールに従い、形質転換した。形質転換後、キシロースを単独炭素源としたプレートにまいて、30℃で7日間培養し、形質転換体を得た。形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法により挿入DNA断片の外側とベクター内側のプライマーであるTB2356（5'-TGGGGCTAAACGAGATTTGG-3'：配列番号５５）とTB592（5'-GAAATTTAGTATGCTGTGCTTGGG-3'：配列番号５６）を用いて、染色体に正常に1コピー組込まれていることを確認した。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (6)

  1. 　サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae）におけるALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つのアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子に相当するアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を欠損した酵母変異株を、酢酸を含む培地にて培養し、
    　培地中のエタノールを回収することを特徴とするエタノールの製造方法。
  2. 　上記酵母変異株は、キシロース代謝能を有することを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
  3. 　上記酵母変異株は、キシロース代謝関連遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
  4. 　上記培地は、セルロース系バイオマスの糖化処理物を含むことを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
  5. 　上記培地は、セルロース系バイオマスと当該セルロース系バイオマスを糖化する糖化酵素を含むことを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
  6. 　上記酵母変異株は、外来遺伝子の非導入株であることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
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