JP6338900B2 - Kluyveromyces属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法 - Google Patents
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Description
(2)上記Kluyveromyces属に属する酵母は、Kluyveromyces marxianusであることを特徴とする、(1)記載の変異体酵母。
(3)上記遺伝子が、Kluyveromyces marxianus由来ALD2遺伝子、ALD2-2遺伝子、ALD5遺伝子、ALD6遺伝子及びPDA1遺伝子並びにこれらの遺伝子に機能的に等価な遺伝子から成る群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子であることを特徴とする、(1)又は(2)記載の変異体酵母。
(4)上記ALD2遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、(3)記載の変異体酵母。
(a) 配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c) 配列番号2のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(5)上記ALD2-2遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、(3)記載の変異体酵母。
(a) 配列番号4のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号4のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c) 配列番号4のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(6)上記ALD5遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、(3)記載の変異体酵母。
(a) 配列番号6のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c) 配列番号6のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(7)上記ALD6遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、(3)記載の変異体酵母。
(a) 配列番号8のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号8のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c) 配列番号8のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(8)上記PDA1遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、(3)記載の変異体酵母。
(a) 配列番号10のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号10のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニットタンパク質
(c) 配列番号10のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニットタンパク質
(9)(1)〜(8)のいずれか1記載の変異体酵母をキシロース含有培地にて培養する工程と、その後、培地よりエタノールを回収する工程とを含む、エタノールの製造方法。
(10)上記培養する工程を、上記変異体酵母とリグノセルロースを含むバイオマスと糖化酵素とを含む反応系で実施することを特徴とする、(9)記載のエタノールの製造方法。
以上で説明した変異体酵母を利用することで、キシロース等の糖を基質としたエタノール発酵を行うことができる。特に、上述した本発明に係る変異体酵母は、優れたキシロース代謝能、すなわちキシロースからのエタノール収率が優れているため、キシロース含有培地を利用したエタノール発酵に好適である。キシロース含有培地とは、Kluyveromyces属酵母が生育しうる培地であってエタノール合成の基質となる糖成分として少なくともキシロースを含有する培地を意味する。なお、キシロース含有培地は、キシロース以外の糖成分、例えばグルコースを含有していても良い。
本実施例では、Kluyveromyces属酵母としてKluyveromyces marxianusを使用し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(ALD2遺伝子、ALD2-2(ALD3)遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子)並びにピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット遺伝子(PDA1遺伝子)の各遺伝子の破壊株を作製し、キシロースからのエタノール収率を比較検討した。
接合、胞子形成によるura3- leu2-変異株の作製
Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株のura3-株であるRAK3605株(Nonklang, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 74: 7514-7521, 2008)を基準株として使用した。K. marxianus DMKU3-1042株由来の栄養要求性変異株は、低頻度で2倍体になることを明らかにしている。紫外線変異により、多重栄養要求性変異株を取得することは可能であるが、その結果、染色体DNAに変異が入る確率が上昇する。より安定な株を作製するために、接合と胞子形成により、2倍体から簡単に多重栄養要求性株を作製する(Yarimizu, T. et al., Yeast 30: 485-500, 2013)ために以下の株を作製した。
K. marxianusは非相同末端結合修復が高頻度で起こることから、S. cerevisiaeのように相同組換え修復を利用して遺伝子破壊を容易に行うことができない(Nonklang, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 74: 7514-7521, 2008)。そこで、非相同末端結合修復に必須のKU70遺伝子を破壊することで相同組換えを高頻度に起こさせる株の作製を行った。RAK4174株からKU70を破壊したRAK4736株(ura3-1 leu2-2 ku70Δ::ScLEU2)を作製した(Abdel-Banat, B. M. et al., Yeast 27: 29-39, 2010)。
以上のように作製されたALD2破壊株、ALD2-2破壊株、ALD5破壊株、ALD6破壊株及びPDA1破壊株についてキシロースを利用したエタノール発酵試験を行った。
YPX(キシロース20g/L)培地20mlを加えた50mlアシストチューブに上記破壊株を一白金耳植菌し、30℃、140rpmで6〜8時間振とう培養した。次に、その菌液2.5%を、YPX培地(キシロース:20g/L)200mlが入った500ml三角フラスコで、30℃、140rpm、一晩振とう培養した。培養後の酵母を遠心回収、滅菌水で3回洗浄し、OD600=30の酵母懸濁液を調製した。
糖成分としてキシロースを含有する培地にて上記破壊株を培養した際の「培地中のエタノール収率」を図2に示す。図2に示すように、各遺伝子破壊株では、野生株(DMKU3-1042株)と比較し、キシロースからのエタノール収率が1.8〜3.5倍に向上していた。
Claims (4)
- キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する遺伝子を減弱化した変異体酵母であって、前記変異体酵母がクルイベロマイセス(Kluyveromyces)属に属する酵母であり、前記遺伝子が、ALD2遺伝子及びALD2-2遺伝子並びにこれらの遺伝子に機能的に等価な遺伝子から成る群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子であり、
(a)前記ALD2遺伝子又はその機能的に等価な遺伝子が、配列番号2記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号2記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、
(b)前記ALD2-2遺伝子又はその機能的に等価な遺伝子が、配列番号4記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号4記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、
前記変異体酵母。 - 上記クルイベロマイセス属に属する酵母は、クルイベロマイセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)であることを特徴とする、請求項1記載の変異体酵母。
- 請求項1又は2記載の変異体酵母をキシロース含有培地にて培養する工程と、
その後、培地よりエタノールを回収する工程と、
を含む、エタノールの製造方法。 - 上記培養する工程を、上記変異体酵母とリグノセルロースを含むバイオマスと糖化酵素とを含む反応系で実施することを特徴とする、請求項3記載のエタノールの製造方法。
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