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WO2013163917A1 - 化合物jk12a及其制备 - Google Patents

化合物jk12a及其制备 Download PDF

Info

Publication number
WO2013163917A1
WO2013163917A1 PCT/CN2013/073959 CN2013073959W WO2013163917A1 WO 2013163917 A1 WO2013163917 A1 WO 2013163917A1 CN 2013073959 W CN2013073959 W CN 2013073959W WO 2013163917 A1 WO2013163917 A1 WO 2013163917A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
jk12a
acid
compound
preparation
argon
Prior art date
Application number
PCT/CN2013/073959
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
成永之
成志
周敏
王兆俊
李慧珍
范圣刚
Original Assignee
连云港金康和信药业有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 连云港金康和信药业有限公司 filed Critical 连云港金康和信药业有限公司
Priority to CN201380019596.3A priority Critical patent/CN104334561B/zh
Priority to JP2015504854A priority patent/JP5925381B2/ja
Priority to EP13784533.5A priority patent/EP2837632B1/en
Priority to US14/394,434 priority patent/US9090623B2/en
Priority to KR1020147030853A priority patent/KR101673979B1/ko
Publication of WO2013163917A1 publication Critical patent/WO2013163917A1/zh

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D487/20—Spiro-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D487/18—Bridged systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
    • C07D475/02—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4
    • C07D475/04—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with an oxygen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2

Definitions

  • the present invention belongs to the field of heterocyclic compounds (C07D) wherein the heterocyclic compound contains two or more heterocyclic rings, and in the same ring system, only nitrogen is used as a heterocyclic atom, wherein at least one six-membered ring carries at least one nitrogen Atom (471/00).
  • the present invention relates to the compound [4-(2-amino-10-methyl-4-oxo-6,7,8,9-tetraar-4a,7-cyclic iminepyrimidine [4,5-b] ⁇ [1,4] Diazepine-5(4H)-yl)benzoyl]-glutamic acid and its crystal form, preparation method and application. Background technique
  • Aplaminal was the first compound discovered to have a triazabicyclo[3,2,1]octane structure, which was first isolated from the black spotted sea rabbit by Takeshi Kuroda and Hideo Kigoshi et al. in 2008 (Org. Lett., Vol. 10, No. 3, p489-491, 2008), the specific structure is as follows:
  • Patent Document CN1864663 discloses a pharmaceutical composition of 5,7,14-triazatetracyclic
  • Patent document CN102282148A discloses 11-(2-pyrrolidin-1-yl-ethoxy)-14,19-dioxa-5,7,26-triaza-tetracyclo[19 ⁇ 3 ⁇ 1 ⁇ 1 ( 2,6) ⁇ 1(8,12)] Twenty-seven carbon-1(25), 2(26),3,5,8,10,12(27),16,21,23-decene citric acid salt.
  • Patent Document CN1509288 discloses citrate of 5,8,14-triazatetracyclo[10.3.1.02, 11.04, 9]-"h hexa-2(11),3,5,7,9-pentaene.
  • Patent Document CN1509174 discloses 5,8,14-triazatetracyclo[10.3.1.02, 11.04, 9]-"h hexa-2(11),3,5,7,9,pentaene tartrate.
  • Patent Document CN1589148 discloses 5,8,14-triazatetracyclo[10 ⁇ 3 ⁇ 1 ⁇ 0 ⁇ 2,10 ⁇ 04,8)-"h hexa-2(11),3,5,7,9- Pentasuccinates and pharmaceutical compositions thereof. These patent documents all disclose chemical structures such as triazatetracyclo rings.
  • the inventors have carefully studied and accidentally developed a simple, feasible and economical method to successfully prepare a triazabicyclo[3,2,1]octane structure by using 5-methyltetrafluorofolate as a raw material.
  • a novel compound that has a significant inhibitory effect on T lymphocyte proliferation.
  • a first object of the present invention is to provide a novel compound having a triazabicyclo[3,2,1]octane structure and characterizing its structure, the chemical name of which is [4-(2-amino-) 10-methyl-4-oxo-6,7,8,9-tetraar-4a,7-cyclic imidopyrimido[4,5-b][l,4]diazepine-5(4H) -Base) Benzoyl glutamic acid, hereinafter referred to as JK12A.
  • a second object of the present invention is to provide a crystal form of the above compound JK12A.
  • a third object of the present invention is to provide a process for producing the above compound JK12A.
  • a fourth object of the present invention is to provide an application of the above compound JK12A.
  • the present invention proposes a compound JK12A having the following structure:
  • the present invention proposes the compound JK12A crystal.
  • the present invention proposes a pharmaceutically acceptable salt of the compound JK12A or a stereoisomer of the salt.
  • the salt is a crystalline salt.
  • the present invention also provides the crystalline form I of the compound JK12A, using Cu-Ka radiation, and its X-ray diffraction pattern, the angle of 2 in the degree of 13.3 ⁇ 0.2, 14.0 ⁇ 0.2, 16.9 soil 0.2, 19 ⁇ 1 ⁇ There are diffraction peaks at 0 ⁇ 2, 24 ⁇ 4 ⁇ 0 ⁇ 2, and 27 ⁇ 6 ⁇ 0 ⁇ 2.
  • the present invention also provides the crystalline form I of the compound JK12A, using Cu-Ka radiation, and its X-ray diffraction pattern, the degree of 2 turns expressed in degrees is 13.3, 14.0, 16.9, 19.1, 24.4, 27.6. Diffraction peaks.
  • the further X-ray diffraction pattern of Form I of Compound JK12A is substantially as shown in Figure 11.
  • the present invention also provides the crystal form of the compound JK12A, using Cu-Ka radiation, the X-ray diffraction pattern thereof, the angle of 2 ⁇ expressed in degrees is 6.8 ⁇ 0.2, 12.2 ⁇ 0.2, 13.7 ⁇ 0.2, 15.9 ⁇ 0.2, There are diffraction peaks at 18.4 ⁇ 0.2 and 23.0 ⁇ 0.2.
  • the present invention also provides a crystal form of the compound JK12A, using Cu-Ka radiation, and its X-ray diffraction pattern, the angles of 2 in degrees are 6.8, 12.2, 13.7, 15.9, 18.4, 23.0 most diffraction peaks.
  • the further X-ray diffraction pattern of Form II of Compound JK12A is substantially as shown in FIG.
  • the present invention provides a process for the preparation of the compound JK12A, which comprises the step of oxidizing 5-methyltetrafluorofolate.
  • the invention provides a preparation method of the crystal form I of the compound JK12A crystal, which comprises the following steps:
  • the present invention also provides a process for the preparation of the crystalline form II of the compound JK12A crystal, which comprises crystallizing the compound JK12A in a polar medium by ultrasonic waves at pH 3.
  • the polar medium is water or a mixture of water and a polar water-soluble organic solvent.
  • the present invention provides a method for preparing a crystal form of the compound JK12A, which comprises the following steps:
  • the purity of the I crystal form and the second crystal form of the compound JK12A crystal prepared by the above method can reach 98.0% or more. .
  • the present invention also provides a conversion method for converting the compound JK12A into 5-methyltetrafluorofolate by reducing the compound JK12A to 5-methyltetrafluorofolate.
  • the invention further provides a conversion method for converting the compound JK12A into 5-methyltetrafluorofolate, one embodiment of the conversion method is: dissolving the compound JK12A in water, adding a reducing agent to carry out the reaction, and finally obtaining 5- Methyltetrafluorofolate.
  • the compound JK12A to which the present invention relates can be characterized in various ways.
  • the compound JK12A is characterized in that it is synthesized by oxidizing 5-methyltetrafluorofolate.
  • the chemical name of 5-methyltetrafluorofolate is N-[4-[[(2-amino-1,4,5,6,7,8-hexafluoro-4-oxo-5-methyl-6) -Acridine)methyl]amino]benzoyl]-L-glutamic acid.
  • 5-methyltetrafluorofolate is oxidized using an oxidizing agent.
  • the oxidant used may be air, or oxygen, or argon peroxide.
  • the compound JK12A is characterized in that it is produced by the following method:
  • step a nitrogen or an inert gas may be used; preferably nitrogen is used; the 5-methyltetrafluorofolate solution is adjusted to a pH of 6 to 8 with a base until the solid dissolves.
  • step b) high surface active materials can be used as catalysts and/or treated with ultrasonics; the oxidizing agent is preferably air, or oxygen, or argon peroxide.
  • the reaction solution is preferably adjusted to a pH of from 3 to 5 using an acid. After the solid precipitated, it was filtered, washed and dried. The preparation process is carried out at normal temperature and normal pressure. The time taken for each step is judged by those skilled in the art based on the amount of the raw material (5-methyltetrafluorofolate), the type of base and acid used, and the like.
  • the invention also relates to various stereoisomers of the compound JK12A, such as
  • the JK12A of the present invention can be characterized by one or more of the following:
  • the crystal form of the compound JK12A crystal is characterized in that the preparation method comprises the following steps:
  • said polar medium is water or a mixture of water and a water-miscible organic solvent.
  • the method does not specifically require the amount of the polar medium to be used, and the amount of the general reaction or crystallization medium is preferably used.
  • the 5-methyltetrafluorofolate is selected from the group consisting of (6S)-5-methyltetrafluorofolate, (6R)-5-methyltetrafluorofolate, (6R,S)-5-methyltetrafluorofolate, preferably (6S) -5-methyltetrafluorofolate.
  • the base is an inorganic or organic base capable of forming a salt with 5-methyltetrafluorofolate, the inorganic base being selected from alkali, carbonate, and argon carbonate of an alkali metal or alkaline earth metal.
  • Salt the organic base is selected from the group consisting of ammonia, amines, pyridines or piperazines; preferably: potassium argon oxide, sodium argon oxide, calcium argon oxide, magnesium argon oxide, carbonic acid clock, sodium carbonate, potassium argon carbonate, argon carbonate Sodium, ammonia, monomethylamine, 4-dimethylpyridine or piperazine; the base may be added directly or in the form of a solution such as an aqueous solution.
  • the pH of the solution is generally adjusted to 6.0 to 8.0 by neutralization with a base, and the pH of the solution is preferably adjusted to 7.0 to 7.5.
  • the oxidant is air, or oxygen, or argon peroxide.
  • the step of adding a high surface active substance is further included.
  • the high surface active material is selected from the group consisting of activated carbon, activated silica gel, activated alumina, preferably activated carbon, wherein the high surface active substance is used in an amount of 0.05 to 10 times, preferably 0.5 to 2 times the mass of 5-methyltetrafluorofolate. More preferably, it is 0.5 to 1 time. More preferably, a high surface active material is added between step b) and step c), that is to say after the addition of the high surface active material, followed by the addition of the oxidizing agent.
  • the stirring time is preferably determined by HPLC to determine the completion of the reaction of the starting material 5-methyltetrafluorofolate, and is usually 10 hours or longer, preferably 12-24 hours.
  • the acid is an organic acid or an inorganic acid.
  • the inorganic acid is selected from the group consisting of hydrochloric acid, acid and argon bromate; and the organic acid is selected from the group consisting of formic acid, acetic acid, and benzoic acid.
  • the pH of the solution is preferably adjusted to 4 to 5 by acid. It will be understood that after the crystals are precipitated, there may be steps such as filtration, washing and drying.
  • the crystal form of the compound JK12A crystal is further characterized in that the main peak of the X-ray diffraction pattern is expressed by the 2 ⁇ and d-spacing measured by CuKa using copper radiation (within the range of the error shown):
  • the crystal form of the compound JK12A crystal is characterized in that the compound JK12A is crystallized in a polar medium under the conditions of pH 3 by means of ultrasonic treatment.
  • the polar medium is water or a mixture of water and a polar water-soluble organic solvent.
  • the crystal form of the crystal of the compound JK12A is characterized in that it is produced by the following steps:
  • the form of the compound JK12A may be amorphous or crystalline.
  • the polar medium is water or a mixture of water and a polar water-soluble organic solvent.
  • the base is an organic base or an inorganic base.
  • the inorganic base is selected from the group consisting of potassium argon oxide, sodium argon oxide, calcium argon oxide, magnesium argon oxide, carbonic acid clock, sodium carbonate, potassium arcarbonate, sodium argon carbonate;
  • the organic base is selected from the group consisting of ammonia water and monomethylamine. , 4-dimethylpyridine or piperazine.
  • the base can be added directly or in the form of a solution such as an aqueous solution.
  • the pH of the solution is preferably adjusted to 7.0 to 8.0 by alkali neutralization, and the pH of the solution is more preferably adjusted to 7.0 to 7.5.
  • the acid is an organic acid or a mineral acid.
  • the inorganic acid is selected from the group consisting of hydrochloric acid, acid and argon bromate; and the organic acid is selected from the group consisting of formic acid, acetic acid, and benzoic acid.
  • the pH of the solution is preferably adjusted to 3 to 4 by acid.
  • Ultrasound can be used in step b) to facilitate rapid dissolution of the compound JK12A.
  • the use of ultrasonic waves in step c) facilitates the formation of Form II crystals, and the length of time used for ultrasonic waves is judged by those skilled in the art and can be stopped after a sufficient amount of solids have precipitated.
  • the crystal form of the compound JK12A is also characterized in that the main peak of the X-ray diffraction pattern is expressed by the 2 ⁇ and d-spacing measured by CuKa of copper radiation (within the range of error shown):
  • the present invention also relates to a process for the conversion of the compound JK12A to 5-methyltetrafluorofolate, characterized in that the compound JK12A is reduced to 5-methyltetrafluorofolate.
  • This method can also be applied to the purification of 5-methyltetrafluorofolate.
  • the crude 5-methyltetrafluorofolate was oxidized to JK12A, and after crystallization, it was reduced to 5-methyltetrafluorofolate, and the chemical purity and optical purity of the obtained 5-methyltetrafluorofolate were remarkably improved.
  • the compound JK12A of the present invention One of the uses is to prepare and purify 5-methyltetrafluorofolate.
  • the present invention relates to a process for producing 5-methyltetrafluorofolate, characterized in that the compound JK12A is subjected to a reduction reaction to produce 5-methyltetrafluorofolate.
  • the method for preparing 5-methyltetrafluorofolate is as follows: the compound JK12A is first dissolved in water, and then reacted by adding a reducing agent, and separated to obtain 5-methyltetrafluorofolate.
  • the reducing agent is preferably a boron argon compound, a reducing gas, or a mercapto group-containing compound.
  • the boron argon compound is selected from the group consisting of sodium borohydride, potassium borofluoride, and potassium tri-tert-butylborohydride; the reducing gas is selected from the group consisting of argon-boron; the thiol-containing compound is selected from the group consisting of mercaptoethanol, and a half. Cystine, sodium sulfonate.
  • the separation treatment means that 5-methyltetrafluorofolate is separated from the solution, and the separation treatment method is a prior art, and the relevant reference documents cited above can be referred to.
  • the base is an inorganic or organic base capable of forming a salt with 5-methyltetrafluorofolate, the inorganic base being selected from the group consisting of alkali, carbonate, and argon carbonate salts of an alkali metal or alkaline earth metal; Ammonia water, amines, pyridines or piperazines; preferably: potassium argon oxide, sodium argon oxide, calcium argon oxide, magnesium argon oxide, carbonic acid clock, sodium carbonate, potassium argon carbonate, sodium arsenate, ammonia, monomethylamine, 4-dimethylpyridine or piperazine; the base may be added directly or in the form of a solution such as an aqueous solution.
  • the present invention also relates to a salt acceptable for the compound JK12A, which is selected from the group consisting of alkali metal salts or alkaline earth metal salts, preferably a clock salt, a sodium salt, a calcium salt, a magnesium salt, a barium salt, a barium salt, more preferably a calcium salt.
  • a salt acceptable for the compound JK12A which is selected from the group consisting of alkali metal salts or alkaline earth metal salts, preferably a clock salt, a sodium salt, a calcium salt, a magnesium salt, a barium salt, a barium salt, more preferably a calcium salt.
  • the invention further relates to a process for the preparation of the compound JK12A calcium salt, which comprises the steps of: a) adding the compound JK12A to a polar medium;
  • the polar medium is water, or a mixture of water and a polar water-soluble organic solvent, preferably water; and in step b), the base is an organic or inorganic base.
  • the inorganic base is selected from the group consisting of potassium argon oxide, sodium argon oxide, calcium argon oxide, magnesium argon oxide, carbonic acid clock, sodium carbonate, potassium arcarbonate, sodium argon carbonate; the organic base is selected from the group consisting of ammonia water and monomethylamine. , 4-dimethylpyridine or noise.
  • the use of the compound JK12A in the preparation of a medicament is as a pharmaceutically active ingredient.
  • the immunobiological activity experiment of Example 16 showed that Compound JK12A can be used to prepare a drug.
  • the compound JK12A is also used in the preparation of food additives.
  • the pharmaceutical preparation or composition of the present invention contains the above compound JK12A or a salt thereof, and the compound JK12A or a salt thereof prepared by the method of the present invention is desirable for a pharmaceutical preparation.
  • the pharmaceutical preparations of the present invention may contain one or more excipients, and the excipients are added to the preparation for various purposes.
  • the above formulations can be prepared according to methods known in the art.
  • JK12A prepared by the present invention is given below.
  • UV analysis Ultraviolet (UV) analysis:
  • Scan range: 200.00 to 900. 00 nm
  • Test results The main absorption peaks and attributions are listed in Table 1. The infrared absorption spectrum spectrum is shown in Figure 2.
  • Example 12 Reduction of JK12A Take 3 g of JK12A, the purity is 96.64%, add 60 g of water, adjust the pH to 7.0 with 10% argon oxide under stirring, dissolve all the solids, then slowly add 2 g of KBH 4 , continue stirring for 1 h, and then detect the reaction solution, 5- The methyltetrafluorofolate content was 71.26%.
  • mice were sacrificed by depolarization, and the spleen was aseptically prepared to prepare a single cell suspension, and the red blood cell lysate was used to remove red blood cells to adjust the cell concentration.
  • Mouse spleen lymphocyte suspension 5xl0 5 /well was inoculated into 96-well plates, ConA (final concentration 5 g / ml), different concentrations of compounds, and corresponding ConA-free control wells and drug-free control wells were added. Incubate for 48 hours at 37 ° C in a 5% C0 2 incubator. Eight hours before the end of the culture, 25 ⁇ l of 3 ⁇ -thymidine ( ⁇ /ml) was added to each well. Continue to train until the end of the experiment.
  • the cells were collected on a glass fiber membrane by a cell harvester, and after adding scintillation fluid, the amount of 3 H-TdR held in the cell DNA was read on a Beta counter (MicroBeta Trilux, PerkinElmer), and the cell proliferation was represented by a cpm value.
  • Beta counter MicroBeta Trilux, PerkinElmer
  • Example 17 X-ray diffraction pattern conditions and data of J crystal form of JK12A: Bruker D8 advance XRD
  • Table 8 X-ray diffraction pattern data of Form I of JK12A
  • Example 18 X-ray diffraction pattern conditions and data for Form II of JK12A Instrument Model: Bruker D8 advance XRD

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Abstract

本发明涉及化合物[4-(2-氨基-10-甲基-4-氧-6,7,8,9-四氢-4a,7-环亚胺嘧啶并[4,5-b][1,4]二氮杂卓-5(4H)-基)苯甲酰]-谷氨酸，筒称JK12A，该化合物具有式I结构。本发明还涉及化合物JK12A的晶型和盐、及其制备方法和用途。本发明的化合物JK12A可用于制备作为药物活性成分的药物或食品添加剂。

Description

化合物 JK12A及其制备 技术领域
本发明属于杂环化合物领域（C07D) ， 其中， 所述杂环化合物含 两个或更多杂环， 并且在同一环系中只有氮作为杂环原子， 其中至少 一个六元环带至少一个氮原子 （471/00) 。 具体地， 本发明涉及化合 物 [4-(2-氨基 -10-甲基 -4-氧 -6,7,8,9-四氩 -4a,7-环亚胺嘧啶并 [4,5-b】 [1,4] 二氮杂卓 -5(4H)-基)苯甲酰】 -谷氨酸及其晶型、 制备方法和应用。 背景技术
具有三氮杂双环 [3,2,1】辛烷结构的化合物， 由于其独特的分子结 构， 深受化学家及医药专家关注。
Figure imgf000003_0001
Aplaminal 是首个被发现具有三氮杂双环 [3,2,1】辛烷结构的化合 物， 该化合物最早于 2008年由 Takeshi Kuroda和 Hideo Kigoshi等 人从黑斑海兔中分离提取出 （Org. Lett., Vol. 10, No. 3, p489-491 ， 2008) ， 具体结构如下：
Figure imgf000003_0002
该文献对 Aplaminal的结构进行的 NMR及单晶 X-衍射表征。 据 报道 Aplaminal具有抗 HeLa S3 细胞毒性 (IC50= 0.51 ug/mL), 其更 多的临床试验还在研究中。
由于生物提取制备 Aplaminal的成本极高， 收率非常低， 181¾海 兔中只能提取出 2mg Aplaminal,因此 Amos B. Smith III和 Zhuqing Liu等人 (Org. Lett., Vol. 10, No. 19, p4363-4365 ， 2008) ， 通过人工 合成方法， 以 N-Boc-(D)-丝氨酸为原料， 经羟基保护、 縮合、 还原等 9步反应合成得到 Aplaminal, 收率 17%， 具体反应过程如下：
Figure imgf000004_0001
8 (-)"9
Figure imgf000004_0002
{+)-11 H~
Figure imgf000004_0003
{+)-12 {+)-13
Figure imgf000005_0001
但是人工合成具有三氮杂双环 [3,2,1】辛烷结构的化合物同样相当 困难， 上述合成 aplaminal的方法， 反应步骤冗长， 需要使用昂贵的 试剂， 如二异丁基氩化铝 （DIBAL-H) 、 钯和铂， 中间过程难控制， 安全性小， 收率低， 也不适宜工业化生产。
目前有关其他的三氮杂环化合物的报道也不少。 专利文献 CN1864663 公开的 药物組合物 为 5,7,14—三氮杂四环
[10.3.1.0(2,11).0(4,9)]一十六碳一 2(11)3,5,7,9—五烯。 专利文献 CN102282148A公开 11-(2-吡咯烷 -1-基-乙氧基) -14,19-二氧杂 -5,7,26- 三 氮 杂 - 四 环 [19·3·1·1(2,6)·1(8,12)】 二 十 七 碳 -1(25),2(26),3,5,8,10,12(27),16,21,23-十烯柠檬酸盐。 专利文献 CN1509288 公开 5,8,14—三氮杂四环 [10.3.1.02， 11.04， 9]一" h六一 2(11),3,5,7,9—五烯的柠檬酸盐。专利文献 CN1509174公开 5,8,14—三 氮杂四环 [10.3.1.02， 11.04， 9】一" h六一2(11),3,5,7,9,—五烯的酒石酸盐。 专利文献 CN1589148公开 5,8,14—三氮杂四环 [10·3·1·0·2,10·04,8)—" h 六一 2(11),3,5,7,9—五烯的琥珀酸盐及其药用組合物。 这些专利文献都 公开有三氮杂四环这样的化学结构。
本发明人经过认真研究， 意外的开发了一种简单、 可行、 经济的 方法，成功地利用 5-甲基四氩叶酸为原料制备出具有三氮杂双环 [3,2,1】 辛烷结构的新化合物， 该化合物对 T淋巴细胞增殖具有显著的抑制作 用。 发明内容 本发明的第一目的是提供一种新的、 具有三氮杂双环 [3,2,1】辛烷 结构的化合物， 并对其结构进行表征， 其化学名称为 [4-(2-氨基 -10-甲 基 -4-氧 -6,7,8,9-四氩 -4a,7-环亚胺嘧啶并 [4,5-b】[l,4】二氮杂卓 -5(4H)-基) 苯甲酰卜谷氨酸， 以下简称为 JK12A。
本发明的第二目的是提供一种上述化合物 JK12A的晶型。
本发明的第三目的是提供一种上述化合物 JK12A的制备方法。 本发明的第四目的是提供一种上述化合物 JK12A的应用。
为此， 本发明提出化合物 JK12A 其具有下式结构：
Figure imgf000006_0001
或所述化合物 JK12A的立体异构体。
本发明提出所述的化合物 JK12A晶体。
本发明提出所述的化合物 JK12A 的在药学上可接受的盐或该盐 的立体异构体。 所述的盐是结晶盐。
本发明还提供所述的化合物 JK12A的 I晶型， 使用 Cu-Ka辐射， 其 X-射线衍射图， 以度表示的 2Θ角在 13.3 ±0.2、 14.0 ±0.2、 16.9土 0.2、 19·1±0·2、 24·4±0·2、 27·6±0·2处有衍射峰。
进一步地， 本发明还提供所述的化合物 JK12A的 I晶型， 使用 Cu-Ka辐射，其 X-射线衍射图， 以度表示的 2Θ角在 13.3、 14.0、 16.9、 19.1、 24.4、 27.6最具衍射峰。 化合物 JK12A的 I晶型进一步 X-射线 衍射图谱基本上如图 11。
本发明还提供所述的化合物 JK12A的 II晶型，使用 Cu-Ka辐射， 其 X-射线衍射图， 以度表示的 2Θ角在 6.8±0.2、 12.2±0.2、 13.7±0.2、 15.9±0.2、 18.4±0.2、 23.0±0.2处有衍射峰。
进一步地， 本发明还提供化合物 JK12A的 II晶型， 使用 Cu-Ka 辐射， 其 X-射线衍射图， 以度表示的 2Θ角在 6.8、 12.2、 13.7、 15.9、 18.4、 23.0最具衍射峰。 化合物 JK12A的 II晶型进一步 X-射线衍射 图谱基本上如图 12。
本发明提供所述的化合物 JK12A的制备方法， 该方法包括对 5- 甲基四氩叶酸进行氧化的步骤。
本发明提供所述的化合物 JK12A晶体的 I晶型的制备方法， 包括 如下步骤：
a) 将所述 5-甲基四氩叶酸加入极性介质中；
b) 用碱将 pH值调节至 6〜8；
c) 加入氧化剂， 搅拌；
d) 用酸调节 pH值至 3〜5；
e) 析出晶体。
本发明还提供化合物 JK12A晶体的 II晶型的制备方法， 该方法 包括将所述化合物 JK12A在极性介质中，通过超声波在 pH 3结晶。 所述极性介质为水或者水与极性水溶性有机溶剂的混合物。
进一步地， 本发明提供化合物 JK12A的 II晶型的制备方法， 包 括如下步骤：
a) 取所述化合物 JK12A加入极性介质中；
b) 用碱将 pH值调节至 6〜10， 直至固体溶解；
c) 进行超声波处理， 并用酸调节 pH值至 3〜6， 析出晶体。
通过上述方法制备的化合物 JK12A晶体的 I晶型和 II晶型的纯 度可达 98.0%以上。 。
本发明还提供将化合物 JK12A转化为 5-甲基四氩叶酸的转化方 法， 该转化方法是将化合物 JK12A还原为 5-甲基四氩叶酸。
本发明又提供将化合物 JK12A转化为 5-甲基四氩叶酸的转化方 法，该转化方法的一个实施方式是，将所述化合物 JK12A在水中加碱 溶解， 加入还原剂进行反应， 最后得到 5-甲基四氩叶酸。
本发明的化合物 JK12A在制备作为药物活性成分的药物或食品 添加剂方面的用途。 附图说明
图 1.JK12A的紫外光谱；
图 2.JK12A的红外光谱；
图 3.JK12A的高分辨质谱图；
图 4.JK12A的核磁共振氩谱；
图 5.JK12A的核磁共振碳谱；
图 6.JK12A的核磁共振 DEPT135谱；
图 7.JK12A的核磁共振 iH HCOSY谱；
图 8.JK12A的核磁共振 ^^HNOESY谱；
图 9.JK12A的核磁共振 HSQC谱；
图 10.JK12A的核磁共振 HMBC谱；
图 11.JK12A的 I晶型 X-射线衍射图谱；
图 12.JK12A的 II晶型 X-射线衍射图谱。 具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案， 下面结合本发明的具体实施 例对本发明的技术方案作进一步说明， 但其不限制本发明。
本发明涉及的所述化合物 JK12A可以通过多种方式表征。
所述化合物 JK12A的特征在于，通过对 5-甲基四氩叶酸进行氧化 而合成。其中，5-甲基四氩叶酸的化学名称为 N-[4-[[(2-氨基 -1,4,5,6,7,8- 六氩 -4-氧 -5-甲基 -6-喋啶基)甲基】氨基】苯甲酰】-L-谷氨酸。 有关 5-甲基 四氩叶酸的特征可参见专利文献 CN1122337A、 CN92100247.5、 CN200910134474.4 、 CN200610041541.4 、 CN00108884.X 、 GR3029552T3, 因此， 所述专利文献所公开的技术内容被引入本发明 的申请文件， 作为本发明的技术公开的一部分。
在本发明中， 使用氧化剂对 5-甲基四氩叶酸进行氧化。 如下文所 述， 所使用氧化剂可以是空气、 或者氧气、 或者过氧化氩。
所述化合物 JK12A的特征在于， 其通过下述方法制备：
a) 在极性介质中将 5-甲基四氩叶酸用碱溶解；
b) 加入氧化剂， 反应生成所述化合物 JK12A; c) 加入酸使所述化合物 JK12A从溶液中分离。
其中，在步骤 a)中可以使用氮气或情性气体保护；优选使用氮气； 用碱将 5-甲基四氩叶酸溶液调至 pH值为 6〜8， 直至固体溶解。 在步 骤 b)中可以使用高表面活性物质作为催化剂和 /或使用超声波处理；氧 化剂优选空气、 或者氧气、 或者过氧化氩。 在步骤 c)中， 优选使用酸 将所述反应溶液调至 pH值至 3〜5。 在固体析出后进行过滤、 洗涤和 干燥。 所述制备过程在常温、 常压下进行。 各步骤所用时间由本领域 技术人员根据原料 （5-甲基四氩叶酸） 用量、 所使用的碱和酸的种类 等要素判断。
所述化合物 JK12 A 结构为
Figure imgf000009_0001
本发明还涉及所述化合物 JK12A 的多种立体异构体， 如
[4-((4aS,7R)-2-氨基 -10-甲基 -4-氧 -6,7,8,9-四氩 -4a,7-环亚胺嘧啶并
[4,5-1)】[1,4】二氮杂卓 -5(4H)-基)苯甲酰】-L-谷氨酸、 [4-((4aS,7S)-2-氨基 -10-甲基 -4-氧 -6,7,8,9-四氩 -4a,7-环亚胺嘧啶并 [4,5-b】 [1,4】二氮杂卓 -5(4H)-基）苯甲酰】-L-谷氨酸、 [4-((4aR,7S)-2-氨基 -10-甲基 -4-氧 -6,7,8,9-四氩 -4a,7-环亚胺嘧啶并 [4,5-b】 [1,4]二氮杂卓 -5(4H)-基)苯甲 酰】 -L-谷氨酸、 [4-((4aR,7R)-2-氨基 -10-甲基 -4-氧 -6,7,8,9-四氩 -4a,7-环 亚胺嘧啶并 [4,5-bHl,4】二氮杂卓 -5(4H)-基)苯甲酰卜 L-谷氨酸等。
本发明的 JK12A可通过以下一种或多种方式来表征：
*在约 203.0nm， 252.5nm和 295.5nm具有最大吸收峰的紫外光
*在约 SSSScm ^ 2885cm 1608cm 1558cm 1508cm
1421cm-1和 1321cm-1具有峰的红外光谱；
參在约 1.89、 2.04、 2.31、 3.43、 3.49、 3.86、 3.90、 3.94、 4.21、
6.48、 7.62具有氩化学位移的 iHNMR谱； •在约 28.37、 31.26、 34.25、 45.18、 55.04、 55.16、 55.93、 68.80、 112.23、 129.17、 146.36、 165.58、 169.50、 171.74、 176.65、 179.29、 182.49具有碳化学位移的 13CNMR谱；
*在约 m/z=456.16376 ( [M-H]-) 具有峰的 HR-MS (ESI-) 谱； 说明 JK12A 的分子量为 457， 其元素組成为 C20H23N7O6。 本发明还涉及所述化合物 JK12A晶体。通过实验， 发明人找到了 两种晶型。
所述化合物 JK12A晶体的 I晶型的特征在于：其制备方法包括如 下步骤：
a) 将所述 5-甲基四氩叶酸加入极性介质中；
b) 用碱将 pH值调节至 6〜8；
c) 加入氧化剂， 搅拌；
d) 用酸调节 pH值至 3〜5；
e) 析出晶体。
优选地， 在所述步骤 a) 中， 所述极性介质是水或者水和与水可 混溶的有机溶剂的混合物。 本方法对极性介质的用量并无具体要求， 以一般的反应或结晶介质用量为宜。 所述 5-甲基四氩叶酸选自 （6S) -5-甲基四氩叶酸， （6R) -5-甲基四氩叶酸， （6R,S) -5-甲基四氩叶 酸， 优选 （6S) -5-甲基四氩叶酸。
在所述步骤 b) 中， 所述碱为能与 5-甲基四氩叶酸成盐的无机碱 或有机碱， 所述无机碱选自碱金属或碱土金属的碱、 碳酸盐、 碳酸氩 盐； 所述有机碱选自氨水、 胺类、 啶类或哌嗪类； 优选： 氩氧化钾、 氩氧化钠、 氩氧化钙、 氩氧化镁、 碳酸钟、 碳酸钠、 碳酸氩钾、 碳酸 氩钠、 氨水、 一甲胺、 4-二甲基吡啶或哌嗪； 碱可直接投加， 也可以 以溶液的形式（如水溶液）加入。用碱中和调节溶液 pH值一般为 6.0〜 8.0， 优选调节溶液 pH值至 7.0〜7.5。
在所述步骤 c) 中， 所述氧化剂为空气、 或者氧气、 或者过氧化 氩。
优选地， 在步骤 c) 之前还包括加入高表面活性物质的步骤， 所 述高表面活性物质选自活性炭、 活性硅胶、 活性氧化铝， 优选活性炭， 其中所述高表面活性物质的用量为 5-甲基四氩叶酸质量的 0.05〜： 10 倍， 优选为 0.5〜2倍， 更优选为 0.5〜1倍。 更为优选地， 在步骤 b) 和步骤 c) 之间加入高表面活性物质， 也就是加入高表面活性物质之 后， 紧接着加入氧化剂。所述搅拌时间以 HPLC检测原料 5-甲基四氩 叶酸反应结束为宜， 一般为 10小时以上， 优选 12-24小时。
在所述步骤 d) 中， 所述酸为有机酸或无机酸。 优选地， 所述无 机酸选自盐酸、 疏酸、 氩溴酸； 有机酸选自甲酸、 醋酸、 苯甲磺酸。 用酸调节溶液的 pH值时优选调节至 4〜5。 可以理解的是， 在晶体析 出后， 可以有过滤、 洗涤和干燥等步骤。
所述化合物 JK12A晶体的 I晶型的特征还在于： X-射线衍射图谱 的主要峰以使用铜辐射 CuKa测定的 2Θ和 d-间距表示如下（在所示误 差范围内） ：
表 1: I晶型的 X-射线衍射图谱的特征峰
Figure imgf000011_0001
所述化合物 JK12A晶体的 II晶型的特征在于：所述化合物 JK12A 借助于超声波处理， 在极性介质中在 pH 3的条件下结晶。 优选地， 所述极性介质为水、 或者水与极性水溶性有机溶剂的混合物。 进一步 地， 所述化合物 JK12A晶体的 II晶型的特征在于， 其通过下述步骤 制备：
a) 将所述化合物 JK12A加入极性介质中；
b) 用碱将 pH值调节至 6〜10， 直至固体溶解；
c) 进行超声波处理， 并用酸调节 pH值至 3〜6， 析出晶体。 在步骤 a)中，所述化合物 JK12A的形态可以是无定形或 I晶型。 所述极性介质为水、 或者水与极性水溶性有机溶剂的混合物。 在所述 步骤 b) 中， 所述碱为有机碱或无机碱。 优选地， 所述无机碱选自氩 氧化钾、 氩氧化钠、 氩氧化钙、 氩氧化镁、 碳酸钟、 碳酸钠、 碳酸氩 钾、 碳酸氩钠； 所述有机碱选自氨水、 一甲胺、 4-二甲基吡啶或哌嗪。 碱可直接投加， 也可以以溶液的形式 （如水溶液） 加入。 用碱中和调 节溶液 pH值优选为 7.0〜8.0，更为优选地调节溶液 pH值至 7.0〜7.5。
在所述步骤 c) 中， 所述酸为有机酸或无机酸。 优选地， 所述无 机酸选自盐酸、 疏酸、 氩溴酸； 有机酸选自甲酸、 醋酸、 苯甲磺酸。 用酸调节溶液的 pH值时优选调节至 3〜4。 超声波可以在步骤 b) 中 使用， 以利于所述化合物 JK12A快速溶解。 在步骤 c) 中使用超声波 是利于形成 II晶型， 超声波使用的时间长度由本领域技术人员判断， 可在足够量的固体析出后停止。
所述化合物 JK12A的 II晶型的特征还在于： X-射线衍射图谱的 主要峰以用铜辐射 CuKa测定的 2Θ和 d-间距表示如下（在所示误差范 围内） ：
表 2: II晶型的 X-射线衍射图谱的特征峰
Figure imgf000012_0001
本发明还涉及所述的化合物 JK12A转化为 5-甲基四氩叶酸的转 化方法， 其特征在于： 将所述化合物 JK12A还原为 5-甲基四氩叶酸。 该方法也可应用于 5-甲基四氩叶酸的提纯。 粗品 5-甲基四氩叶酸氧化 为 JK12A,结晶析出后， 再还原为 5-甲基四氩叶酸， 所得 5-甲基四氩 叶酸的化学纯度及光学纯度显著提高。 为此， 本发明的化合物 JK12A 的用途之一是制备和提纯 5-甲基四氩叶酸。
本发明涉及 5-甲基四氩叶酸的制备方法， 其特征在于， 将所述化 合物 JK12A通过还原反应生成 5-甲基四氩叶酸。
优选地， 5-甲基四氩叶酸的制备方法在于： 将所述化合物 JK12A 先在水中加碱溶解， 然后加入还原剂进行反应， 经分离处理得到 5-甲 基四氩叶酸。其中， 所述还原剂优选为硼氩化合物、 或者还原性气体、 或者含巯基化合物。 所述硼氩化合物选自硼氩化钠、 硼氩化钾、 三叔 丁基硼氩化钾； 所述还原性气体选自 ¾、 甲硼氩； 所述含巯基化合物 选自巯基乙醇、 半胱氨酸、 巯乙基磺酸钠。 所述分离处理是指将 5-甲 基四氩叶酸从溶液中分离出来， 分离处理方法是已有技术， 可参见上 文引用的相关对比文件。
所述碱为能与 5-甲基四氩叶酸成盐的无机碱或有机碱， 所述无机 碱选自碱金属或碱土金属的碱、 碳酸盐、 碳酸氩盐； 所述有机碱选自 氨水、 胺类、 啶类或哌嗪类； 优选： 氩氧化钾、 氩氧化钠、 氩氧化 钙、 氩氧化镁、 碳酸钟、 碳酸钠、 碳酸氩钾、 碳酸氩钠、 氨水、 一甲 胺、 4-二甲基吡啶或哌噪； 碱可直接投加， 也可以以溶液的形式 （如 水溶液） 加入。
本发明还涉及化合物 JK12A可接受的盐，其选自碱金属盐或碱土 金属盐， 优选钟盐、 钠盐、 钙盐、 镁盐、 钡盐、 锶盐， 更优选钙盐。
本发明还涉及化合物 JK12A钙盐的制备方法， 其包括如下步骤： a) 将所述化合物 JK12A加入极性介质中；
b) 用碱将 pH值调节至 7〜8， 直至固体溶解；
c) 加入氯化钙；
d) 进行超声波处理， 析出固体， 然后过滤、 洗涤、 干燥。
在步骤 a) 中， 所述极性介质为水、 或者水与极性水溶性有机溶 剂的混合物， 优选为水； 在步骤 b) 中， 所述碱为有机碱或无机碱。 优选地， 所述无机碱选自氩氧化钾、 氩氧化钠、 氩氧化钙、 氩氧化镁、 碳酸钟、 碳酸钠、 碳酸氩钾、 碳酸氩钠； 所述有机碱选自氨水、 一甲 胺、 4-二甲基吡啶或派噪。 所述的化合物 JK12A在制备药物方面的用途是作为药物活性成 分。 实施例 16的免疫生物活性实验表明， 化合物 JK12A可用于制备 药物。 所述的化合物 JK12A也用于制备食品添加剂。
本发明的药学制剂或組合物含有上述化合物 JK12A或其盐，通过 本发明方法制备的化合物 JK12A或其盐对于药学制剂是理想的。除了 活性組分之外， 本发明的药学制剂可以含有一种或多种赋形剂， 将赋 形剂加入到制剂中用于各种目的。 上述制剂可根据本领域已知的方法 制备。
下文给出对本发明所制备的 JK12A的分析
1. 紫外 （UV) 分析：
仪器型号： 北京普析通用， TU-1901
样品浓度： 0.02366mg/ml
溶剂： 甲醇
扫描范围： 200.00 至 900. 00 nm
扫描间隔： 0.50 nm
测试结果： 本品紫外光谱显示 203.0nm， 252.5nm和 295.5nm有 最大吸收， 归属为 -C=0和苯环的 K带吸收， 紫外吸收光谱见图 1.
2. 红外 （IR) 分析：
仪器型号： Shimadzu, FTIR Presitage 21
测试条件： KBr压片法
测试结果： 主要的吸收峰及归属列于表 1， 红外吸收光谱谱图见 图 2·
表 3: 所述化合物 JK12A的主要红外吸收峰
吸收峰 (cm 1) 振动类型 相应基团 吸收峰强度
3383 υ ΝΗ2 υ OH u NH -NH2 -OH-NH s
2885 u CH -CH-，-CH2 w
1608 υ C=0 -c=o s
1558 υ C=N -C=N s
1508,1421 υ C=C -C=C s
1321 υ C-N -C-N m 3. 高分辨质谱 （HR-MS) 分析：
仪器型号： Bruker Daltonics,Inc" APEX III 7.0TESLAFTMS 测试结果： 本品采用高分辨质谱测定元素組成。 在质谱电喷雾电 离源负离子模式下检测得到 456.16376 峰， 证明本品的元素組成为
C2oH23N706。 数据列表如表 2， 质谱图见图 3。
表 4: 高分辨元素組成分析数据列表
Figure imgf000015_0001
4.核磁共振谱 （NMR分析）
仪器型号： Bruker, AVANCE 111500MHz UltraShield-Plus digital NMR spectrometer
溶剂： D20
测试项目：
^ NMR, 13C-NMR, DEPT135, ^^HCOSY
H - HNOESY,HSQC,HMBC
测试结果： NMR谱图见图 4-10。 归属情况列于表 3和表 4。 表 5: ¾化学位移
Figure imgf000015_0002
1.89-1.97 m 1H H-23' H-23,24,22 H-23, 24,22 表 6: 13C化学位移
Figure imgf000016_0001
实施例 1: JK12A的 I晶型制备
在氮气保护下取 5克 5-甲基四氩叶酸于反应瓶中， 加入 50克水， 搅拌， 用饱和碳酸钠调溶液 pH至 7.5， 固体完全溶清， 加入 2.5克活 性炭， 氧气球密闭过夜反应。 HPLC检测原料反应完毕， 过滤， 滤液 用 50%的醋酸调 pH至 4.8， 析出晶体， 过滤， 滤饼分别用乙醇、 丙酮 洗涤， 真空干燥得到 3.0克黄色固体， 化学纯度 87.53%
实施例 2: JK12A的 I晶型制备
在氮气保护下取 5克 5-甲基四氩叶酸于反应瓶中， 加入 40克水， 搅拌， 用 90%—甲胺调溶液 pH至 7.0， 固体完全溶清， 加入 2.5克活 性炭， 氧气球密闭过夜反应。 HPLC检测原料反应完毕， 过滤， 滤液 用 10%盐酸调 pH至 3.0， 析出晶体， 过滤， 滤饼分别用乙醇、 丙酮洗 涤， 真空干燥得到 2.5克黄色固体， 化学纯度 97.37%。
实施例 3: JK12A的 I晶型制备
在氮气保护下取 5克 5-甲基四氩叶酸于反应瓶中， 加入 40克水， 搅拌， 用 10%氩氧化钠调溶液 pH至 7.5， 固体完全溶清， 加入 2.5克 活性炭，敞口过夜反应。 HPLC检测原料反应完毕，过滤，滤液用 50% 的醋酸调 pH至 4.2， 析出晶体， 过滤， 滤饼分别用乙醇、 丙酮洗涤， 真空干燥得到 2.3克黄色固体， 化学纯度 95.00%。
实施例 4: JK12A的 I晶型制备
在氮气保护下取 73.3克 5-甲基四氩叶酸于反应瓶中，加入 580克 水， 搅拌， 用 10% 氩氧化钠调溶液 pH至 7.2， 固体完全溶清， 加入 40克活性炭，氧气球密闭过夜反应。 HPLC检测原料反应完毕，过滤， 滤液用 50%的醋酸调 pH至 4.0， 析出晶体， 过滤， 滤饼分别用乙醇、 丙酮洗涤， 真空干燥得到 47.8克黄色固体， 化学纯度 96.20%
实施例 5: JK12A的 I晶型制备
在氮气保护下取 10克 5-甲基四氩叶酸于反应瓶中，加入 80克水， 搅拌， 用 10% 氩氧化钠调溶液 pH至 7.3， 固体完全溶清， 加入 5克 活性炭， 敞口搅拌过夜反应。 HPLC检测原料反应完毕， 过滤， 滤液 用 50%的醋酸调 pH至 4.0， 析出晶体， 过滤， 滤饼分别用乙醇、 丙酮 洗涤， 真空干燥得到 6.0克黄色固体 JK12A, 化学纯度 99.42%。
实施例 6: JK12A的 I晶型制备
在氮气保护下取 5克 5-甲基四氩叶酸于反应瓶中， 加入 40克水， 搅拌， 用 10% 氩氧化钠调溶液 pH至 7.5， 固体完全溶清， 加入 5克 活性炭， 氧气球密闭过夜反应。 HPLC检测原料反应完毕， 过滤， 滤 液用 50%的醋酸调 pH至 4.8， 析出晶体， 过滤， 滤饼分别用乙醇、 丙 酮洗涤， 真空干燥得到 2.7克黄色固体 JK12A, 化学纯度 99.60%。
实施例 7: JK12A的 I晶型制备
在氮气保护下取 5克 5-甲基四氩叶酸于反应瓶中， 加入 50克水， 搅拌， 用 10% 氩氧化钠调溶液 pH至 7.2， 固体完全溶清， 加入 4克 活性硅胶， 氧气球密闭过夜反应。 HPLC检测原料反应完毕， 过滤， 滤液用 50%的醋酸调 pH至 4.5， 析出晶体， 过滤， 滤饼分别用乙醇、 丙酮洗涤， 真空干燥得到 2.3克黄色固体 JK12A, 化学纯度 98.41%。
实施例 8: JK12A的 II晶型制备
取 2.0克 JK12A,加入 22克水，置于冰水锅中，搅拌下滴加 10% 氩氧化钠， 调节溶液 pH至 6.7， 固体完全溶解， 将反应液转入超声仪 中， 滴加 50%的醋酸调节溶液 pH至 5.2， 反应 30min后过滤， 滤饼 分别用水、 乙醇、 丙酮洗涤， 真空干燥得 1.0克黄色固体 JK12A, 化 学纯度 98.2%。
实施例 9 ： JK12A的 II晶型制备
取 5.0克 JK12A,加入 50克水，置于冰水锅中，搅拌下滴加 10% 氩氧化钠， 调节溶液 pH至 7.5， 固体完全溶解， 将反应液转入超声仪 中， 滴加 50%的醋酸至溶液 pH4.0， 反应 30min后过滤， 滤饼分别用 水、 乙醇、 丙酮洗涤， 真空干燥得 2.2克黄色固体 JK12A, 化学纯度 98.5%。
实施例 10: JK12A的 II晶型制备
取 8.0克 JK12A,加入 120克水，置于冰水锅中，搅拌下滴加 10% 氩氧化钠， 调节溶液 pH至 8.0， 固体完全溶解， 将反应液转入超声仪 中， 滴加 50%的醋酸至溶液 pH5.0， 反应 30min后过滤， 滤饼分别用 水、 乙醇、 丙酮洗涤， 真空干燥得 5.2克黄色固体 JK12A, 化学纯度 98.7%。
实施例 11: JK12A钙盐的制备
取 4.0克 JK12A, 加入 20克水， 室温下搅拌， 加入 10%氩氧化 钠， 调节溶液 pH至 7.0， 固体完全溶解， 将反应液降温至 10°C， 加入 4.0克 50%氯化钙溶液， 搅拌 10分钟后加入 25ml 乙醇， 超声反应 30min, 过滤， 滤饼分别用乙醇、 丙酮洗涤， 真空干燥， 得 JK12A钙 盐 3.5克， 化学纯度 97.6%。
实施例 12: JK12A的还原 取 3克 JK12A, 纯度 96.64%， 加入 60克水， 搅拌下用 10%氩氧 化钠调 pH至 7.0， 固体全部溶解， 然后緩慢加入 2克 KBH4， 继续搅 拌 lh后， 检测反应液， 5-甲基四氩叶酸含量为 71.26%。
实施例 13 ： JK12A的还原
取 3克 JK12A, 纯度 96.64%， 加入 60克水， 搅拌下用 10%氩氧 化钠调 pH至 7.2， 固体全部溶解， 然后緩慢加入 2克 NaBH4， 继续搅 拌 1.5h后， 检测反应液， 5-甲基四氩叶酸含量为 79.32%。
实施例 14: JK12A的还原
取 10克 JK12A, 纯度 96.64%， 加入 150克水， 搅拌下用 10%氩 氧化钠调 pH至 7.0， 固体全部溶解，然后加入 1.0克 Pd/C，搅拌均匀， 通入 H2， 加压至 0.2MPa， 搅拌 2h后， 检测反应液， 5-甲基四氩叶酸 含量为 70.32%。
实施例 15: 5-甲基四氩叶酸的提纯
取 10克 5-甲基四氩叶酸， 化学纯度 82%， 光学纯度 90%， 加入 到 100克水中，搅拌下用 10%氩氧化钠调溶液 PH到 7.0， 固体全部溶 解， 加入 5克活性炭， 氧气球密闭反应， HPLC检测原料反应完毕， 过滤， 滤液用 10%盐酸调 pH至 3.0， 析出晶体， 过滤， 滤饼分别用乙 醇、丙酮洗涤，真空干燥得到 5.2克黄色固体 JK12A,化学纯度 97.8%。 将此固体加入 80克水中， 搅拌下用 10%氩氧化钠调溶液 PH到 7.0， 緩慢加入 12克硼氩化钠， 反应 4小时后， 用 10%盐酸调 pH至 3.0， 析出晶体， 过滤， 滤饼分别用乙醇、 丙酮洗涤， 真空干燥， 得到 2.9 克 5-甲基四氩叶酸， 化学纯度 98.1%， 光学纯度 96%。
实施例 16: 免疫生物活性
实验方法：
小鼠脾脏淋巴细胞的制备：
小鼠脱脊推处死， 无菌取其脾脏制备单个细胞悬液， 红细胞裂解 液去除红细胞， 调节细胞浓度。
CCK-8法检测化合物对小鼠脾脏淋巴细胞活性的影响：
小鼠脾脏淋巴细胞悬液 5xl05/孔接种于 96孔板， 同时加入不同浓 度化合物， 另设相应的溶媒对照及培养液本底对照， 总体积为 200μ1。
37°C, 5% C02培养箱中培养 48 小时。 结束培养前 8-10 小时加入 CCK-8溶液。 至培养结束， 于酶标仪 450nM (参比 650nM) 处测定 OD值。
3H-TdR摻入法检测化合物对小鼠脾脏 T淋巴细胞增殖功能的影 响：
小鼠脾脏淋巴细胞悬液 5xl05/孔接种于 96孔板， 加入 ConA (终 浓度 5 g/ml) ， 不同浓度化合物， 并设相应的无 ConA对照孔以及无 药物对照孔。 37°C， 5% C02培养箱中培养 48小时。 培养结束前 8小 时， 每孔加入 25 μ13Η-胸腺嘧啶核苷酸 （ΙΟμΟ/ml) 。 继续培养至实 验结束。 将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤維膜上， 加入闪烁液后于 Beta记数仪 (MicroBeta Trilux, PerkinElmer) 读取捧入细胞 DNA 的 3H-TdR量， 以 cpm值代表细胞增殖的情况。
表 7: 实验结果
Figure imgf000020_0001
初步筛选结果显示， 所述化合物 JK12A在 （1.024和 0.41 uM) 小鼠 T淋巴细胞增殖有显著的抑制作用。 实施例 17: JK12A的 I晶型的 X-射线衍射图谱条件及数据 仪器型号： Bruker D8 advance XRD
衍射线： 铜辐射 CuKa (40 kV, 40 mA)
扫描速率： 8°/min (20值）
扫描范围： 5 ° ~ 45 ° (2Θ值）
Peak Search Report (41 Peaks, Max P/N = 25.4)
PEAK: 27-pts/ParaBolic Filter, Threshold=3.0, Cutoff=0.1%
BG=3/1.0, Peak-Top=Summit
表 8: JK12A的 I晶型的 X-射线衍射图谱数据
Figure imgf000021_0001
20 26.718 3.3337 955 702 21.3 11858 10.1 0.287
21 27.581 3.2314 1010 1376 41.8 39313 33.5 0.486
22 28.039 3.1796 989 1111 33.8 39585 33.7 0.606
23 29.019 3.0745 941 833 25.3 11044 9.4 0.225
24 29.921 2.9838 828 1160 35.2 22209 18.9 0.325
25 30.919 2.8897 676 381 11.6 7114 6.1 0.317
26 32.319 2.7676 743 1000 30.4 31248 26.6 0.531
27 33.062 2.7072 876 153 4.6 888 0.8 0.099
28 33.499 2.6729 858 280 8.5 5549 4.7 0.337
29 33.880 2.6436 759 468 14.2 13836 11.8 0.503
30 34.338 2.6094 710 386 11.7 8649 7.4 0.381
31 35.818 2.5049 634 501 15.2 10222 8.7 0.347
32 36.700 2.4467 630 335 10.2 9973 8.5 0.506
33 37.980 2.3672 630 128 3.9 4291 3.7 0.570
34 38.296 2.3483 641 142 4.3 1751 1.5 0.210
35 38.941 2.3109 665 340 10.3 5087 4.3 0.254
36 39.476 2.2808 651 136 4.1 3806 3.2 0.476
37 40.444 2.2284 605 152 4.6 985 0.8 0.110
38 42.020 2.1484 445 216 6.6 8224 7.0 0.647
39 42.360 2.1320 452 169 5.1 6117 5.2 0.615
40 44.098 2.0519 494 166 5.0 4528 3.9 0.464
41 44.422 2.0377 537 172 5.2 3979 3.4 0.393
实施例 18 ： JK12A的 II晶型的 X-射线衍射图谱条件及数据 仪器型号： Bruker D8 advance XRD
衍射线： 铜辐射 CuKa (40 kV, 40 mA)
扫描速率： 8°/min (20值）
扫描范围： 5 ° ~ 45 ° (2Θ值）
Peak Search Report (45 Peaks, Max P/N = 32.8)
PEAK: 21-pts/ParaBolic Filter, Threshold=3.0, Cutoff=0.1% BG=3/1.0, Peak-Top=Summit 表 9: JK12A的 I晶型的 X-射线衍射图谱数据
2Θ d(A) BG Height 1% Area 1% FWHM
6.802 12.9849 441 2177 43.6 38932 29.4 0.304
7.882 11.2075 458 98 2 548 0.4 0.095
9.054 9.7587 446 318 6.4 4551 3.4 0.243
12.159 7.2733 757 4722 94.5 91934 69.5 0.331
12.631 7.0024 906 511 10.2 3179 2.4 0.106
13.241 6.681 886 2183 43.7 75245 56.9 0.586
13.66 6.477 797 4995 100 132219 100 0.45
13.899 6.3661 798 2640 52.9 123894 93.7 0.798
14.903 5.9395 728 571 11.4 6392 4.8 0.19
15.938 5.556 700 3967 79.4 62015 46.9 0.266
16.761 5.285 659 827 16.6 14318 10.8 0.294
17.358 5.1047 664 1072 21.5 14176 10.7 0.225
18.36 4.8282 736 4076 81.6 64427 48.7 0.269
19.158 4.6289 485 2105 42.1 35665 27 0.288
19.581 4.5299 753 504 10.1 5465 4.1 0.184
21.079 4.2112 607 1678 33.6 32369 24.5 0.328
21.96 4.0441 620 1720 34.4 25073 19 0.248
23.019 3.8605 553 1857 37.2 25628 19.4 0.235
24.28 3.6627 763 765 15.3 14228 10.8 0.316
24.861 3.5785 916 1834 36.7 35340 26.7 0.328
26.001 3.4241 707 1953 39.1 29063 22 0.253
26.745 3.3305 635 1184 23.7 18539 14 0.266
27.721 3.2154 610 1411 28.2 30555 23.1 0.368
28.34 3.1466 578 866 17.3 14546 11 0.286
29.701 3.0054 664 468 9.4 6144 4.6 0.223
30.281 2.9491 666 2674 53.5 51357 38.8 0.327
31.836 2.8085 600 261 5.2 1807 1.4 0.118
32.239 2.7743 538 337 6.7 8170 6.2 0.412
32.643 2.7409 552 344 6.9 8454 6.4 0.418
32.918 2.7187 583 355 7.1 3694 2.8 0.177
33.52 2.6712 657 933 18.7 10292 7.8 0.188 /3〇 6s6po20siM
Figure imgf000024_0001

Claims

权 利 要 求 书
1. 化合物 [4-(2-氨基 -10-甲基 -4-氧 -6,7,8,9-四氩 -4a，7-环亚胺嘧啶 并 [4，5-b】[l，4】二氮杂卓 -5(4H)-基)苯甲酰】-谷氨酸， 在此简称 JK12A, 其具有下式结构：
Figure imgf000025_0001
或所述化合物 JK12A的立体异构体。
2. 根据权利要求 1所述的化合物 JK12A晶体。
3. 根据权利要求 1所述的化合物 JK12A的在药学上可接受的盐 或该盐的立体异构体。
4. 根据权利要求 3所述的盐， 其特征在于： 所述的盐是结晶盐。
5. 根据权利要求 3或 4所述的盐， 其特征在于： 所述盐为钙盐。
6. 根据权利要求 2所述的化合物 JK12A晶体， 其特征在于： 所 述化合物 JK12A的晶体为 I晶型或 II晶型， 其中，
I晶型 X-射线衍射图谱在 2Θ角为 13.3±0.2、 14.0±0.2、 16.9±0.2、 19.1±0.2、 24.4±0.2、 27.6±0.2处有衍射峰； 或者
II晶型 X-射线衍射图谱在 2Θ角为 6.8±0.2、 12.2±0.2、 13.7±0.2、 15·9±0·2、 18·4±0·2、 23·0±0·2处有衍射峰。
7. 根据权利要求 6所述化合物 JK12A晶体， 其特征在于：
I晶型 X-射线衍射图谱在 2Θ角为 13.3、 14.0、 16.9、 19.1、 24.4、 27.6处有衍射峰； 或者
II晶型 X-射线衍射图谱在 2Θ角为 6.8、 12.2、 13.7、 15.9、 18.4、 23.0处有衍射峰。
8. 根据权利要求 2所述化合物 JK12A晶体， 其特征在于：
I晶型 X-射线衍射图谱基本上如图 11 ; II晶型 X-射线衍射图谱基本上如图 12。
9. 所述化合物 JK12A的制备方法， 其特征在于： 对 5-甲基四氩 叶酸进行氧化。
10.根据权利要求 9所述的制备方法，其用于制备根据权利要求 6 至 8中任意一项所述化合物 JK12A晶体的 I晶型， 其特征在于： 所述 制备方法包括如下步骤：
a) 将所述 5-甲基四氫叶酸加入极性介质中；
b) 用碱将 pH值调节至 6〜8；
c) 加入氧化剂， 搅拌；
d) 用酸调节 pH值至 3〜5；
e) 析出晶体。
11.根据权利要求 10所述的制备方法， 其特征在于： 在所述步骤 a) 中， 所述极性介质是水或者水和与水可混溶的有机溶剂的混合物。
12.根据权利要求 10所述的制备方法， 其特征在于： 在所述步骤 b) 中， 所迷碱为有机碱或无机碱。
13.根据权利要求 10所述的制备方法， 其特征在于： 在所述步骤 c) 中， 所述氧化剂为空气、 或者氧气、 或者过氧化氩。
14.根据权利要求 12所述的制备方法， 其特征在于： 所述无机碱 选自氩氧化钾、 氩氧化钠、 氩氧化钙、 氩氧化镁、 碳酸钾、 碳酸钠、 碳酸氩钾、 碳酸氩钠； 所述有机碱选自氨水、 一甲胺、 4-二甲基吡啶 或哌嗪。
15.根据权利要求 10所述的制备方法， 其特征在于： 在所述步骤 d) 中， 所述酸为有机酸或无机酸，
16.根据权利要求 15所述的制备方法， 其特征在于： 所述无机酸 选自盐酸、 疏酸、 氩溴酸； 有机酸选自甲酸、 醋酸、 苯甲磺酸。
17.根据权利要求 10至 16中任意一项所述的制备方法， 其特征 在于： 还包括在步骤 c) 之前加入高表面活性物质的步骤， 所述高表 面活性物质选自活性炭、 活性硅胶、 活性氧化铝， 其中所述高表面活 性物质的用量为 5-甲基四氫叶酸质量的 0.05〜10倍， 优选为 0.5〜2 倍， 更优选为 0.5〜1倍。
18. JK12A 晶体的 II 晶型制备方法， 其特征在于： 所述化合物 JK12A借助于超声波处理， 在极性介质中在 pH 3的条件下结晶。
19.根据权利要求 18所述的制备方法， 其特征在于： 所述极性介 质为水、 或者水与极性水溶性有机溶剂的混合物。
20.根据权利要求 18或 19所述的制备方法， 其特征在于： a) 将所述化合物 JK12A加入极性介质中；
b) 用碱将 pH值调节至 6〜10， 直至固体溶解；
c) 进行超声波处理， 并用酸调节 pH值至 3〜6， 析出晶体。
21.根据权利要求 20所述的制备方法， 其特征在于： 在所述步骤 b) 中， 所迷碱为有机碱或无机碱。
22.根据权利要求 21所述的制备方法， 其特征在于： 所述无机碱 选自氩氧化钾、 氩氧化钠、 氩氧化钙、 氩氧化镁、 碳酸钾、 碳酸钠、 碳酸氩钾、 碳酸氩钠； 所述有机碱选自氨水、 一甲胺、 4-二甲基吡啶 或哌嗪。
23.根据权利要求 20所述的制备方法， 其特征在于： 在所述步骤 c) 中， 所迷酸为有机酸或无机酸。
24.根据权利要求 23所述的制备方法， 其特征在于： 所述无机酸 选自盐酸、 疏酸、 氩溴酸； 有机酸选自甲酸、 醋酸、 苯甲磺酸。
25.将根据权利要求 1所述的化合物 JK12A转化为 5-甲基四氩叶 酸的转化方法，其特征在于：将所述化合物 JK12A还原为 5-甲基四氩
26.根据权利要求 25所述的转化方法， 其特征在于： 将所述化合 物 JK12A先在水中加碱溶解， 然后加入还原剂进行反应， 经分离处理 得到 5-甲基四氩叶酸。
27.根据权利要求 26所述的转化方法， 其特征在于： 所述还原剂 为硼氩化合物、 或者还原性气体、 或者含疏基化合物。
28.根据权利要求 27所述的转化方法， 其特征在于： 所述硼氩化 合物选自硼氩化钠、 硼氩化钾、 三叔丁基硼氩化钾； 所述还原性气体 选自 H2、 甲硼氩； 所述含疏基化合物选自巯基乙醇、 半胱氨酸、 巯乙 基磺酸钠。
29.根据权利要求 1所述的化合物 JK12A作为制备药物的活性成 分或作为食品添加剂方面的用途。
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