JP7104949B2 - Ｃａｒをコードするヌクレオチド配列、このｃａｒを発現するｒｏｂｏ１ ｃａｒ－ｎｋ細胞、その調製及び使用 - Google Patents

Description

本発明は、生物医学の分野に属し、具体的には、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、このＣＡＲを発現するＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、その調製及び使用に関する。

乳腺は、皮膚、線維組織、乳腺の腺体、脂肪で構成さていれる。乳がんは、乳腺の腺体の上皮組織に発生する悪性腫瘍であり、乳がんの患者は、９９％が女性であり、男性はわずか１％である。

乳腺は人の生命と活動を維持するための重要な器官ではなく、粘膜内の乳がんは致命的ではない。しかし、乳がん細胞は正常な細胞特性を失うため、細胞間の接続が緩んでおり、容易に脱落する。がん細胞が脱落すると、遊離のがん細胞は血液やリンパ液とともに全身に広がって転移し、生命を脅かす可能性がある。現在、乳がんは女性の心身健康を脅かす一般的な腫瘍になっている。

世界的な乳がんの発生率は、１９７０年代後半から上昇している。米国では女性の８人に１人が乳がんを発症する。中国は乳がんの発生率が高い国ではないが、近年の中国の乳がん発生率の増加率は、高リスク国よりも１－２％高くなっている。

キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）修飾免疫細胞は、遺伝子工学的手法により免疫細胞を修飾し、外因性抗腫瘍遺伝子を発現させる。ＣＡＲ遺伝子は主に細胞外認識ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを含む。前者は腫瘍表面の特定の分子を認識し、後者は腫瘍表面分子の認識後に免疫細胞応答を開始することで細胞毒性の役割を果たす。ＣＡＲ遺伝子は、主にＴ細胞をベクターとする。しかし、ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して腫瘍を治療するとき、ＩＬ－６などのサイトカインが急激に上昇し、サイトカインストームが発生し、標的／標的外毒性や神経毒性などの問題があり、重症の場合、患者の生命を危険にさらす恐れがある。また、Ｔ細胞は体外で分離する必要がある（この過程には時間と費用が掛かる）。さらに、Ｔ細胞は特定の患者に対して改変されるが、一部の患者はＴ細胞を採取できないか、Ｔ細胞の準備過程を待つ十分な時間がない可能性がある。ＣＡＲ－Ｔは現在、汎用のＣＡＲ－Ｔに発展しているが、実際にはこの発展に伴い、臨床上のリスクと操作上の困難が増加している。さらに、ＣＡＲ－Ｔのコストも高く、これらの制限により、一部の患者はＣＡＲ－Ｔ免疫療法を受けることができない可能性がある。

ナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ、ＮＫ）細胞は、非特異的免疫系の重要な部分であり、自然免疫系の応答の主要なメディエーター細胞である。ＮＫ細胞は広域スペクトル免疫細胞であり、異常細胞（例えば、がんやウイルス感染細胞）を迅速に発見して破壊する特異的機能を有し、事前に感作したりＨＬＡマッチングしたりすることなく、異常細胞を溶解する強力な活性を示す。免疫細胞（ＮＫ細胞を含む）を用いたがんの治療は、近年の新しい傾向であり、この新しい治療法は、従来の手術、化学療法、放射線療法では効果のない腫瘍の治療に新たな希望をもたらすと期待されている。

上記事情に鑑み、本発明によれば、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、このＣＡＲを発現するＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、その調製及び使用が提供される。この細胞は、腫瘍を特異的に識別して殺傷することができ、より効果的な腫瘍殺傷活性を有し、毒性と副作用が少なく、安全性がより高い。

本発明の一態様によれば、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達領域を含み、前記抗原結合ドメインは、腫瘍特異抗原ＲＯＢＯ１に特異的に結合可能であり、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域によりＮＫ細胞を活性化するキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列が提供される。

例示的には、前記抗原結合ドメインは、腫瘍特異抗原ＲＯＢＯ１のＩｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４、Ｉｇ５、ＦＮ１、ＦＮ２及びＦＮ３ドメインのうちの１種又は複数種に特異的に結合可能である。

例示的には、前記抗原結合ドメインは、腫瘍特異抗原ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合可能である。

例示的には、前記抗原結合ドメインは、ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖである。

例示的には、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ及びＣＤ１５４からなる群より選択される。

好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。

例示的には、前記共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含み、前記共刺激分子は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、４－１ＢＢ及びＯＸ４０からなる群より選択される。

好ましくは、前記共刺激シグナル伝達領域は、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。

本発明の一実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、構造がｓｃＦＶ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζである融合タンパク質であり、前記ＳＣＦＶ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：１又は配列番号：３に示される。

本発明の一実施形態において、前記ＳＣＦＶ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：２又は配列番号：４に示される。

本発明の別の態様によれば、前記キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む構築物が提供される。

本発明の別の態様によれば、前記ヌクレオチド配列によってコードされるキメラ抗原受容体が提供される。

本発明の別の態様によれば、キメラ抗原受容体を発現できるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞が提供される。前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達領域を含み、前記抗原結合ドメインは、腫瘍特異抗原ＲＯＢＯ１に特異的に結合可能であり、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域によりＮＫ細胞を活性化する。

例示的には、前記抗原結合ドメインは、腫瘍特異抗原ＲＯＢＯ１のＩｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４、Ｉｇ５、ＦＮ１、ＦＮ２及びＦＮ３ドメインのうちの１種又は複数種に特異的に結合可能である。

例示的には、前記抗原結合ドメインは、腫瘍特異抗原ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合可能である。

例示的には、前記抗原結合ドメインは、ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖである。

例示的には、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ及びＣＤ１５４からなる群より選択され、好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり、及び／又は
前記共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含み、前記共刺激分子は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、４－１ＢＢ及びＯＸ４０からなる群より選択され、好ましくは、前記共刺激シグナル伝達領域は、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。

例示的には、Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＳＣＦＶ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質を発現することができ、この融合タンパク質は、ＲＯＢＯ１－ＦＮ３ドメインを標的としてＲＯＢＯ１分子を特異的に識別することができる。

本発明の一実施形態において、前記ＳＣＦＶ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のアミノ配列は、配列番号：１若しくは配列番号：３に示され、又は配列番号：１、３に示される配列の相同性配列等である。

例示的には、前記ＳＣＦＶ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号：２若しくは配列番号：４に示され、又は配列番号：２、４に示される配列の相同性配列等である。

本発明の一実施形態において、前記ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、肺がん細胞系、膵臓がん細胞系、肝がん細胞系、神経膠腫細胞系、乳腺細胞系、結腸がん細胞系若しくは前立腺がん細胞系を効果的に殺傷又は死滅できる。

例示的には、前記細胞肺がん細胞系はＨ１２９９又はＡ５４９である。

例示的には、前記膵臓がん細胞系はＡＳＰＣ－１又はＢＸＰＣ３である。

例示的には、前記肝がん細胞系はＨｅｐＧ２である。

例示的には、前記神経膠腫細胞系はＵ８７－ＭＧ又はＳＨ－ＳＹ５Ｙである。

例示的には、前記乳がん細胞系はＭＣＦ－７、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１５９９、ＨＣＣ１８０６、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ１９３７又はＭＤＡ－ＭＢ－４５３である。

本発明の別の態様によれば、前記ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の調製方法が提供される。前記調製方法は、以下のステップ（１）から（３）を含む。
ステップ（１）において、前記ヌクレオチド配列を合成して増幅し、前記ヌクレオチド配列をレンチウイルス発現ベクターにクローニングする。好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、ＳＣＦＶ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質遺伝子である。
ステップ（２）において、レンチウイルスパッケージングプラスミド及びステップ（１）で得られたレンチウイルス発現ベクタープラスミドを２９３Ｔ細胞に感染させ、レンチウイルスをパッケージングして調製する。
ステップ（３）において、ステップ（２）で得られたレンチウイルスをＮＫ－９２細胞に感染させ、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を得る。

本発明によれば、前記ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む医薬組成物がさらに提供される。

例示的には、前記医薬組成物におけるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞と腫瘍細胞とのエフェクター細胞対標的細胞比は（０．５～１）：２であり、好ましくは、前記エフェクター細胞対標的細胞比は、（０．５～１）：１である。

例示的には、前記医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容される添加剤をさらに含む。

例示的には、前記医薬組成物の剤形は水剤である。

本発明による薬学的に許容される添加剤は、好ましくは、薬学的に許容される注射剤用添加剤、例えば、等張性無菌塩溶液（リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど、又はこれらの塩の混合物）、又は無菌水若しくは生理食塩水を加えることで注射用溶質等が形成される乾燥した、例えば凍結乾燥した組成物である。

本発明によれば、前記ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞又は医薬組成物を用いてがんを治療及び／又は予防する方法であって、有効量のＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む医薬品を治療を必要とする患者に投与することを含む方法がさらに提供される。

例示的には、前記がんは、ＲＯＢＯ１分子を高発現する腫瘍及び関連疾患である。

例示的には、前記がんは、肝がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん、前立腺がん、神経膠腫又は肺がんなどである。

本発明の一実施形態において、前記がんは乳がんである。

例示的には、前記ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の投与量は（０．５～５）×１０^９細胞／回である。

例示的には、前記ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む医薬品の投与方法は、腫瘍内注射、静脈注射、胸腔内注射又は局所介入である。

本発明の一実施形態において、前記ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む医薬品の投与方法は静脈注射である。

本発明によれば、がんを治療及び／又は予防する医薬品の調製における前記ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞又は医薬組成物の使用を提供する。

例示的には、前記がんは、Ｒｏｂｏ１を高発現する腫瘍及び関連疾患である。

例示的には、前記がんは、肝がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん、前立腺がん、神経膠腫又は肺がんであり、好ましくは、前記がんは乳がんである。

本発明で提供されるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、以下の利点の少なくとも１つを有する。ＲＯＢＯ１分子を標的抗原とするＲＯＢＯ１抗体をＣＡＲ－ＮＫ細胞の構築に用い、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞により腫瘍細胞を特異的に殺傷し、腫瘍類疾患の治療薬としてＲＯＢＯ１分子を高発現する腫瘍の治療に適用でき、かつサイトカインストームなどの不良な現象はなく、従来の手術、化学療法、放射線療法では効果のない腫瘍の治療に新しい治療法を提供する。また、ＮＫ９２細胞にＣＡＲを導入することにより、標的性が大幅に向上するとともに抗腫瘍標的ＲＯＢＯ１が増加し、これによって標的性が向上し、抗腫瘍性能も高くなる。さらに、このＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、殺傷効果が明らかに高いので、腫瘍をより効果的に殺傷することができる。つまり、本発明で構築されるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＣＡＲの導入によりＮＫ９２細胞を改変することにより、標的性が向上するとともに、ＮＫ細胞を用いることで安全性が大幅に向上し、毒性と副作用が小さく、コストが低く、ＮＫ細胞、ＣＡＲ及び抗ＲＯＢＯ１標的の相乗効果により、殺傷効果が高く、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもはるかに優れている。

本発明の実施例１で提供されるレンチウイルスプラスミドベクターＰＲＲＬＳＩＮ－ＳＣＦＶ（ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）の構造模式図である。 図２ａ－２ｂは、本発明の実施例３で提供されるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫをフローサイトメトリーにより測定したＣＡＲ細胞の陽性率の結果を示す図である。 図３ａ－３ｂは、本発明の実施例３で提供されるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫをフローサイトメトリーにより測定したＣＤ５６分子陽性率の結果を示す図である。 図４ａ－４ｂは、本発明の実施例４で提供されるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔをフローサイトメトリーにより測定した陽性率の結果を示す図である。 本発明の実施例５で提供されるＲＯＢＯ１－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞のＨ１２９９細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例５で提供されるＲＯＢＯ１－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞のＡ５４９細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例５で提供されるＲＯＢＯ１－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞のＡＳＰＣ－１細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例５で提供されるＲＯＢＯ１－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞のＨｅｐＧ２細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例６で提供されるＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例６で提供されるＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ９２細胞のＵ８７－ＭＧ細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例７で提供されるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のＭＣＦ７細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例７で提供されるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のＨＣＣ１１４３細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例７で提供されるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のＨＣＣ１１８７細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例７で提供されるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のＨＣＣ１５９９細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例７で提供されるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のＨＣＣ１８０６細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例７で提供されるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のＨＣＣ３８細胞殺傷実験の結果を示す図である。 本発明の実施例８で提供されるＲｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の乳がん治療実験の前後比較の結果を示す図である。 本発明の実施例８で提供される病巣にＲｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を直接注射した後のサイトカインの測定結果を示す図である。 本発明の実施例８で提供されるＲｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を静脈注入した後のサイトカインの測定結果を示す図である。 本発明の実施例８で提供されるＲｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞による治療過程の模式図である。 本発明の実施例８で提供される乳がん患者の組織化学検出の結果を示す図である。 本発明の比較例１におけるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞とＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＴのＨＣＣ１９３７細胞殺傷実験の比較結果を示す図である。 本発明の比較例１におけるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞とＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＴのＭＣＦ７細胞殺傷実験の比較結果を示す図である。 本発明の比較例１におけるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞とＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＴのＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞殺傷実験の比較結果を示す図である。 本発明の比較例１におけるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞とＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＴのＢＸＰＣ３細胞殺傷実験の比較結果を示す図である。

別段の定義がない限り、本発明で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明で説明される技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

具体的には、本発明によるＳＣＦＶ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、この融合タンパク質をコードすることができる任意のＤＮＡ配列である。好ましくは、この配列は、配列番号：２に示される配列若しくはその相補配列、又は配列番号：４に示される配列若しくはその相補配列である。また、本発明によるＳＣＦＶ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で配列番号：２又は配列番号：４に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズし、この融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はその相補配列である。
本明細書に記載の「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、及び高ストリンジェントな条件の１つであってもよく、好ましくは高ストリンジェントな条件である。例示的には、「低ストリンジェントな条件」は、３０℃、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳ、５２％ホルムアミドの条件であり、「中ストリンジェントな条件」は、４０℃、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳ、５２％ホルムアミドの条件であり、「高ストリンジェントな条件」は、５０℃、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳ、５２％ホルムアミドの条件である。当業者は、温度が高いほど、相同性がより高いポリヌクレオチドが得られることを理解できる。さらに、当業者は、対応するストリンジェンシーを達成するためにハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える温度、プローブ濃度、プローブ長さ、イオン強度、時間、及び塩濃度などの複数の要因によって形成される包括的な結果を選択できる。

さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェア用システムで設定されたデフォルトパラメータにより計算する場合、配列番号：６のポリヌクレオチドと約６０％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１以上、９９．２以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上又は９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。

ヌクレオチド配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムＢＬＡＳＴ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３，１９９３）により決定することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくプログラムＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸは既に開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮにより塩基配列を分析するとき、例えば、パラメータはｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２である。また、ＢＬＡＳＴＸによりアミノ酸配列を分析するとき、例えば、パラメータはｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３である。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いるとき、各プログラムを採用するシステムは、デフォルトのパラメータ値を設定できる。

本発明の医薬品の有効量は、がんの治療、がん症状の緩和又はがん細胞の抑制のための任意の量であり、約０．１－１０．０×１０^９細胞に相当する量であり得る。当業者は、本明細書に開示される内容に基づいて有効量を決定することができる。

本発明によれば、本発明の医薬品（医薬、薬剤）又は医薬組成物は、任意の有効量で被験者に投与することができる。好ましくは、本発明の医薬品（医薬、薬剤）又は医薬組成物は、複数回投与、例えば、約２～約２０回投与、より好ましくは約４～１０回投与で投与することができる。特に好ましい実施形態では、投与過程において、本発明の医薬品（医薬、薬剤）又は医薬組成物は、注射、注入又は経口投与などにより約３週間に１回の頻度で被験者に投与される。特に好ましい実施形態では、投与は、腫瘍部位への注射である。

本発明の医薬品（医薬、薬剤）又は医薬組成物は、任意の適切な経路による投与のための任意の適切な方法で製剤化できることを理解されたい。

本発明の医薬品（医薬、薬剤）又は医薬組成物は、通常の用量単位で被験者に投与する。例えば、用量単位は、日１回、週１回、月１回又はそれ以上などであり得る。用量単位は、２回／週、即ち週に２回、例えば３日に１回投与することができる。

本発明の医薬品に含まれる医薬品に関する説明書は、適応症（乳がんなど）、投与量（上記で例示したものなど）、副作用などの内容を含み得る。

本発明において、「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然源又は組換え源に由来する完全な免疫グロブリン、又は完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は通常、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体及びヒト化抗体などを含む、様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９， Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９， Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。

「抗体断片」という用語は、無傷抗体の一部であって、無傷抗体の抗原性可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、抗体断片から形成される線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、並びに多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。

特に明記しない限り、「コーディングヌクレオチド」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。

「レンチウイルス」という用語は、非周期性及び有糸分裂細胞に効果的に感染することができるレトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、かなりの量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達できるため、遺伝子送達ベクターの最も効果的な方法の１つである。

「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要であり、細胞の合成機構によって認識又は誘導されるＤＮＡ配列として定義される。

「特異的結合」という用語は、特定の抗原を識別するが、サンプル中の他の分子を実質的に識別又は結合しないことを指す。

「ベクター」という用語は、単離された核酸を含む物質の組成物であり、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる。多くのベクターは、当技術分野で知られており、線形ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない。したがって、「ベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミド又はウイルスが含まれる。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

「がん」という用語は、異常な細胞の急速で制御されない成長を特徴とする疾患として定義される。がん細胞は局所的に、又は血流とリンパ系を介して体の他の部分に広がる可能性がある。様々ながんの例には、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんなどが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書において、「包含」は「含む」、「含有」又は「ことを特徴とする」と同義であり、包括的又は開放的であり、列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書において、「包含」という用語は、特に本発明の方法、使用、又は製品を説明するとき、前記成分、部材又はステップから実質的に構成され、及び前記成分、部材又はステップから構成される製品、方法及び使用を含むと理解され得る。本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つ又は複数の要素、１つ又は複数の限定がない場合において適切に実施され得る。

本明細書で使用される用語及び表現は、限定的な用語ではなく説明的な用語として使用されており、このような用語及び表現の使用は、示され又は説明される特徴又はその一部の均等物を排除することを意図していないが、保護を請求される本発明の範囲内で様々な改変が可能であることを認識すべきである。したがって、本発明は好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示されているが、当業者は本明細書に開示された概念の改変及び変形を採用することができ、そのような改変及び変形は添付する特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると見なされることを理解されたい。

本明細書に記載の英語の名称は、大文字と小文字が区別されない。例えば、ＲＯＢＯ１、Ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ１などは同じ意味であり、Ｒｏｂｏ１ ＣＡＲ－ＮＫ、Ｒｏｂｏ１－ＣＡＲ ＮＫは同じ意味であり、Ｒｏｂｏ１ ＣＡＲ－ＮＫとＡｎｔｉ Ｒｏｂｏ１－ＣＡＲ ＮＫは同じ意味であり、いずれも抗ＲＯＢＯ１分子のＣＡＲ－ＮＫ細胞を表す。Ｒｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫとＡｎｔｉ Ｒｏｂｏ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫは同じ意味であり、いずれも変異型の抗ＲＯＢＯ１分子のＣＡＲ－ＮＫ細胞を表す。ＮＫ－９２、ＮＫ９２はいずれもＮＫ９２細胞を表す。

本発明による「ＮＫ」は、正常なヒトＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞系であり、ＮＫ－９２細胞、ＹＴ細胞、ＮＫＬ細胞、ＨＡＮＫ－１細胞、ＮＫ－ＹＳ細胞、ＫＨＹＧ－１細胞、ＳＮＫ－６細胞及びＩＭＣ－１細胞などを含む。本発明の具体的な実施例では、ＮＫ－９２細胞を例として説明する。

本発明をより明確に説明するために、以下の実施例により詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示的な説明にすぎず、本発明を限定するものとして解釈されない。

実施例１：レンチウイルスベクターの調製
ＳＣＦＶ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子配列（そのアミノ酸配列は配列番号：１に示され、遺伝子配列は配列番号：２に示される）及び変異型ＳＣＦＶ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子配列（そのアミノ酸配列は配列番号：３に示され、遺伝子配列は配列番号：４に示される）をそれぞれ合成した。ＳＣＦＶ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子を例としてＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の調製過程を説明する。変異型ＳＣＦＶ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子を用いてＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を調製する過程は同じである。

酵素切断によりＳＣＦＶ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子配列を遺伝子の上流がＥＰ－１αプロモーターであるように変換してＰＲＲＳＬＩＮベクターに接続した。ベクターでＳｔｂｌ３大腸菌株を変換し、アンピシリンでスクリーニングし、陽性クローンを取得し、プラスミドを抽出し、酵素切断によりクローンを同定したところ、ＰＲＲＬＳＩＮ－ＳＣＦＶ（ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）レンチウイルストランスフェクションベクターを得た（図１を参照）。

実施例２：レンチウイルスの調製
（１）トランスフェクションの時に２９３Ｔ細胞が約８０％コンフルエントになりかつ培養皿に均一に分布することを確保するために、トランスフェクションの２４時間前に約８×１０^６／皿で２９３Ｔ細胞を１５ｃｍ培養皿に接種した。
（２）溶液Ａ及び溶液Ｂの準備
溶液Ａ：６．２５ｍｌ ２×ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ緩衝液（５つの大きな皿を一緒にパッケージングする量であり、効果が最も高い）。

溶液Ｂ（以下のプラスミドを加えた混合物）：１１２．５μｇ ＰＲＲＬＳＩＮ－ＳＣＦＶ（ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）（ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｓｍｉｄ）、３９．５μｇ ｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－Ｇ ｅｎｖｅｌｏｐ）、７３μｇ ｐＣＭＶＲ８．７４（ｇａｇ，ｐｏｌ，ｔａｔ，ｒｅｖ）、６２５μｌ ２Ｍカルシウムイオン溶液。溶液Ａの総体積は６．２５ｍｌであった。

溶液Ｂを十分に均一に混合した後、溶液Ａを穏やかにボルテックスしながら溶液Ｂを一滴ずつ加え、ＡとＢの混合溶液を得た後、５－１５分間静置した。前記ＡとＢの混合溶液を穏やかにボルテックスし、２９３Ｔ細胞含有培養皿に一滴ずつ加え、培養皿を静かに前後に振ってＤＮＡとカルシウムイオンの混合物を均一に分布させ、さらにこの培養皿（培養皿を回転してはいけない）をインキュベーター内で１６－１８時間培養した。新鮮な培地を交換した後、引き続き培養し、４８時間及び７２時間後にそれぞれウイルスを含む上清を収集し、５００ｇ、２５℃で１０分間遠心分離した。ＰＥＳ膜（０．４５μｍ）で濾過した。７０％エタノールでベックマンコールターのＵｌｔｒａ－ｃｌｅａｒ ＳＷ２８ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅｓを消毒した後、紫外線ランプ下で３０分間消毒した。濾過したレンチウイルスを含む上清を遠沈管に移した。遠沈管の底部に２０％スクロース（８ｍｌ上清に１ｍｌスクロースを加える）を一層慎重に敷いた。ＰＢＳで遠沈管を平衡化し、２５０００ｒｐｍ（８２，７００ｇ）、４℃で２時間遠心分離した。遠沈管を慎重に取り出し、上清を捨て、遠沈管を転倒させて残留液体を除去した。１００μｌ ＰＢＳを加え、遠沈管を密閉し、４℃で２時間静置し、２０分間ごとに軽くボルテックスし、５００ｇで１分間（２５℃）遠心分離した後、ウイルス上清を収集した。さらに、収集したウイルス上清を氷上で冷却した後、－８０℃で保存した。

実施例３：ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の調製
ＮＫ－９２細胞の密度を２－３×１０^５／ｍｌに調整し、体積比（Ｖ／Ｖ）によるウイルス：細胞培地＝１：５で、実施例２で調製したウイルスを加え、さらにポリブレン８μｇ／ｍｌを加えた。４時間後に、等量の新鮮な完全培地を追加して細胞密度を１×１０^５／ｍｌに調整した後、引き続き培養した。翌日、全ての細胞を遠心分離し、新鮮な培地を加え、引き続き培養した。細胞密度が２－３×１０^５／ｍｌに維持されるように１－２日ごとに培地を補給した。７２時間後にＣＡＲ抗体染色を行い、フローサイトメトリーによりＲＯＢＯ１ ＣＡＲ ＮＫ－９２陽性細胞を選別して拡大培養した。培地の色の変化、細胞密度、細胞形態を毎日観察し、記録した。

フローサイトメトリーにより選別した後、陽性のＲＯＢＯ１ ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞をＧＭＰワークショップで引き続き培養し、臨床使用に必要な量に増幅した後、遠心分離及び３回の洗浄（ＰＢＳ溶液）を行い、最後にＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ ９２を生理食塩水中に再懸濁し、臨床治療輸液に用いた。

細胞品質の安全性を保証するために、臨床治療前に薬局方に記載の方法に従ってＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ ９２に対して品質検査を行った。測定結果を表１に示す。

表１：ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞の品質検査

フローサイトメトリーによりＣＡＲ ＮＫ－９２細胞の陽性率を測定し、フローサイトメトリーの結果を図２ａ及び図２ｂに示す。図２ａ及び図２ｂにおいて、用いた抗体は、ＡＰＣ蛍光標識抗体であり、横座標で示され、ＮＫ９２細胞がＣＡＲ分子の発現に成功すると、このシグナル値は著しく高くなる。図２ａ及び図２ｂから分かるように、ＡＰＣ蛍光標識のシグナル値は著しく高くなり、ＮＫ－９２細胞がＣＡＲ分子の発現に成功したことを示しており、ＣＡＲ－ＮＫ９２の陽性率は９８．８９％であった。

図３ａ及び図３ｂは、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫフローサイトメトリーによるＣＤ５６分子陽性率の結果を示す図である。図３ａは対照群、図３ｂは実験群を示す。図３ａ及び３ｂから分かるように、ＣＤ５６分子は陽性であり、調製したＣＡＲ－ＮＫ９２細胞はＣＤ５６分子を失わず、他の形態の分化は発生せず、ＮＫ細胞の基本的な特性は保持されていることを示している。

同じ方法でＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を調製した。

実施例４：ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
（１）Ｔ細胞の調製：健常者から血液１００ＭＬを採取し、（１５／５０ｍｌ ＢＤチューブ）Ｆｉｃａｌｌ試薬による密度勾配遠心でＰＢＭＣを分離し、Ｔ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５、血清（５％）／血漿、ＩＬ－２ ３００ＩＵ（輸入）／ｍｌ、５００ＩＵ（国内）／ｍｌ、二重抗体１０％）を用いて分離したＰＢＭＣを活性化培養し、活性化培養したＰＢＭＣを得た。その後、活性化培養したＰＢＭＣを再懸濁し、ＣＤ３＋のＴ細胞（一般にはＰＢＭＣの５０％－６０％を占める）を分離した。磁気ビーズを用いてＣＤ３＋のＴ細胞（磁気ビーズ：Ｔ＝３：１）を収集し（残りの細胞は他の実験に使用できる）、Ｔ細胞を得た。

（２）ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製：（１）で得られたＴ細胞を１×１０^６／ｍｌの密度で２４－４８時間培養し、２～３日後に培地を交換し、培地を交換して培養したＴ細胞を得た。さらに、培地を交換して培養したＴ細胞を細胞密度が３～５×１０^６個／ｍｌになるまで新鮮な培地で細胞濃縮し、ウイルス形質導入を行った。ウイルス：細胞培地＝１：１０の体積比（Ｖ／Ｖ）でウイルス（実施例２の方法により調製される）を添加した後、十分に均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間静置培養した後、培地を補給し、細胞濃度１×１０^５／ｍｌまで希釈した。２日目に培地を交換し、全ての細胞を遠心分離し、新鮮な培地を加え、培養しながら観察し、２～３日後に培地半量交換（培地半量交換とは、一般的に培地で遠心分離した後、新鮮な培地で細胞を希釈し、培養フラスコに加えることをいう）を行って細胞密度を２～３×１０^５／ｍｌに維持し、７日間の連続培養後、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。このＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞に用いたＲＯＢＯ１の配列はＲＯＢＯ１Ｍと同じであった。

また、フローサイトメトリーによりＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ陽性細胞を選別して拡大培養した。フローサイトメトリーによりＣＡＲ ＮＫ－Ｔ細胞の陽性率を測定し、フローサイトメトリーの結果を図４ａ及び図４ｂに示す。用いた抗体はＡＰＣ蛍光標識抗体であり、横座標で示される。Ｔ細胞がＣＡＲ分子の発現に成功すると、このシグナル値は著しく高くなる。図４ａ及び図４ｂから分かるように、ＡＰＣ蛍光標識のシグナル値は著しく高くなり、Ｔ細胞がＣＡＲ分子の発現に成功したことを示しており、Ｔ細胞の陽性率は９６．４４％であった。

実施例５：ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の体外腫瘍に対する殺傷効果の評価
ＣＣＫ－８方法（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｇ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ２ ｉｎ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ， Ｒｕｉ Ｗａｎ Ｚｉ－Ｗｅｉ Ｗａｎｇ Ｈｕｉ Ｌｉ ，ｅｔ ａｌ．を参照）によりＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の異なる腫瘍細胞系に対する殺傷効果を評価した。腫瘍細胞系は、肺がん細胞系Ｈ１２９９、肺がん細胞系Ａ５４９、膵臓がん細胞系ＡＳＰＣ－１及び肝がん細胞系ＨｅｐＧ２を含む。実験の操作方法は以下の通りである。
（１）２４ウェルプレート中で１ｍｌ腫瘍細胞懸濁液（２Ｘ１０^４個／ウェル）を調製した。培養プレートをインキュベーターで１２時間前培養した。
（２）２４ウェルプレートの培養上清を捨て、各ウェルに１ｍｌエフェクター細胞を加え、エフェクター細胞数と標的細胞数の比は１：１であった。培地対照ウェルに１ｍｌ培地のみを加え、各実験を３回繰り返した。エフェクター細胞と標的細胞を合計４時間インキュベートした。
（３）各ウェルに１００ｕｌ ＣＣＫ－８溶液を加え、培養プレートをインキュベーター内で２時間インキュベートした。
（４）マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
（５）殺傷率＝（Ａｓ－Ａｂ）／（Ａｃ－Ａｂ）Ｘ１００％
Ａｓ：試験ウェル（腫瘍細胞含有培地、ＣＣＫ－８、ＣＡＲ－ＮＫ）
Ａｃ：対照ウェル（腫瘍細胞含有培地、ＣＣＫ－８）
Ａｂ：ブランク対照（細胞及びＣＡＲ－ＮＫを含有しない培地、ＣＣＫ－８）
ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の体外腫瘍に対する殺傷効果評価の実験結果を図５ａ－５ｄに示す。

図５ａ－５ｄの実験結果は、ＲＯＢＯ１－ＣＡＲ ＮＫ ９２細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ ９２細胞が肺がん細胞系Ｈ１２９９、肺がん細胞系Ａ５４９、膵臓がん細胞系ＡＳＰＣ－１及び肝がん細胞系ＨｅｐＧ２のいずれに対しても強い殺傷効果を有し、その効果が普通のＮＫ－９２細胞よりも高いことを実証している。

また、図５ａ－５ｄから分かるように、ＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ ９２細胞の殺傷効果は、ＲＯＢＯ１－ＣＡＲ ＮＫ ９２細胞よりも優れており、腫瘍をより効果的に殺傷できる。この結果に鑑み、後続の臨床実験は、ＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ ９２細胞を用いて行った。

実施例６：ＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の神経膠腫細胞に対する殺傷効果の評価
ＣＣＫ－８方法によりＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の神経膠腫細胞系Ｕ８７－ＭＧ及び神経膠腫細胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙに対する殺傷効果を評価した。ＮＫ ９２細胞を対照とした。その実験結果を図５ｆ及び図５ｅに示す。

また、図５ｆ及び図５ｅの実験結果は、ＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ細胞の神経膠腫細胞系Ｕ８７－ＭＧ及び神経膠腫細胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙに対する殺傷効果がＮＫ ９２細胞よりも優れていることを示している。

実施例７：ＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の乳がん細胞に対する殺傷効果の評価
ＣＣＫ－８方法によりＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の乳腺細胞系ＭＣＦ－７、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１５９９、ＨＣＣ１８０６及びＨＣＣ３８に対する殺傷効果を評価した。ＮＫ ９２細胞を対照とした。その実験結果を図６ａ－６ｆに示す。

実験結果は、ＲＯＢＯ１Ｍ－ＣＡＲ ＮＫ細胞の乳腺細胞系ＭＣＦ－７、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１５９９、ＨＣＣ１８０６及びＨＣＣ３８に対する殺傷効果がＮＫ ９２細胞よりもはるかに優れていることを示している。

本発明のＡｎｔｉ ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、肺がん細胞系Ｈ１２９９、肺がん細胞系Ａ５４９、膵臓がん細胞系ＡＳＰＣ－１、肝がん細胞系ＨｅｐＧ２、細胞神経膠腫細胞系Ｕ８７－ＭＧ、神経膠腫細胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙ、乳腺細胞系ＭＣＦ－７、乳腺細胞系ＨＣＣ１１４３、乳腺細胞系ＨＣＣ１１８７、乳腺細胞系ＨＣＣ１５９９、乳腺細胞系ＨＣＣ１８０６及び乳腺細胞系ＨＣＣ３８などの多くのがん細胞に対して殺傷作用を有し、腫瘍患者の治療に希望を与える。

実施例８：乳がんの臨床治療におけるＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の使用
一、患者状況
王某、女性、５５歳。２０１６年６月、シャワーを浴びていた時に偶然に右乳房に索状腫物があることに気付き、腫物は押しても動かず、乳首が黄色みを帯び、臭い液が分泌され、右側の腋窩に多発性リンパ節症があり、痛みがなく、吐き気も嘔吐もなく、目眩、頭痛、その他の不快感もないため、患者は注意を払わなかった。

２０１７年０２月、患者は腰痛のため病院に行った。２０１７－０２－１３、頭部検査及び胸部ＣＴの結果は、１．右大脳基底核のラクナ梗塞、左上前頭洞と篩骨洞炎症；２．右乳房病変（右腋窩リンパ節転移を伴う右乳がんと考えられる）；３．右上葉の胸膜下の複数の結節、右下葉の線維性病巣；４．右下葉石灰化巣、左肺舌区と右下葉の線維性病巣、右胸少量水貯溜；５．胸椎、腰椎、両側肋骨、仙骨、両側腸骨、恥骨多発性骨破壊（右第７／１０肋骨、左第３肋骨、左恥骨病変を伴う転移と考えられる）；６．子宮肥大を示した。２０１７－０２－１４、病院で局所生検を行った結果、（右乳房）浸潤性乳管がんグレードＩＩであった。免疫病理的検査の結果は、がん細胞Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（＋）、Ｋｉ－６７（＋）、約１０％、ＥＲ（＋）、強、陽性率約９０％、ＰＲ（－）、Ｈｅｒ２（－）、ＣＫ７（＋）、Ｐ６３（－）、ＣＫ５／６（－）であった。病歴と病理診断と合わせて右乳房浸潤性乳管がんと診断された。患者は化学放射線療法を受けることを拒否し、退院した。

２０１７年０４月、患者は、腫物が増大したため、病院に行った。２０１７－０４－１１、胸部・腹部ＣＴで再検査した結果、脊椎と肋骨への複数の転移を伴う右乳がん、両側腋窩に複数の腫大リンパ節陰影、両肺に複数の小結節陰影が示され、転移と考えられた。両肺に感染を伴う慢性気管支炎があり、両胸に胸水が貯留した。岩舒（Ｙａｎｓｈｕ）、強林坦（Ｔａｚｏｂａｃｔａｍ Ｓｏｄｉｕｍ ａｎｄ Ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ゾレドロン酸などを用いて治療したが、あまり効果がなかった。５月１２日、レトロゾールを患者に経口投与して治療したところ、翌日に患者が心房細動を発症し、ジゴキシン、ベタロック及び麝香保心丸で治療した後、改善した。

２０１７年５月１７日、症状は主に動悸、胸悶で、両下肢が不随意に痙攣し、下肢の動きが制限され、腰背部痛が明らかであった。身体検査した結果、右乳房腫物が比較的大きく、腫物サイズは約１０＊７ｃｍであり、局所皮膚に多くの潰瘍があり、心電図に心房細動が示された。

２０１７－０５－１９、改善ＰＥＴ－ＣＴにより、右乳腺に病変があり、ＦＤＧ摂取量が増加したことが分かり、両肺、多発性リンパ節、多発性骨転移を伴う悪性と考えられた。また、両肺に炎症があり、両側性胸水貯留があった。検査により、全身多発性骨転移が示され、ゾレドロン酸で骨を保護した。患者は、心房細動のため、全身静脈内化学療法に耐えることができず、家族と相談した後、全身化学療法を拒否し、免疫細胞療法を検討した。

二、治療設計
治療設計前に、病理組織化学により患者のＲＯＢＯ１標的の発現を測定した。発現結果を図１０に示す。結果は陽性であり、Ｒｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞で治療することができる。患者に重度の局所病巣及び骨転移病巣があることに鑑み、まず、腫瘍組織内に直接注射し、さらに全身治療を行う治療計画を設計した。患者にＲｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を隔日投与で週に２回直接注射した。初期注射細胞数は１×１０^９細胞／回であり、有害反応が発生しない場合、２×１０^９細胞／回に増加する。輸液に関連する有害反応を減らすために、細胞注射前に患者にデキサメタゾンと塩酸プロメタジンを投与し、耐性が良好であれば、デキサメタゾンの用量を低減するか又はデキサメタゾンを使用しない。患者が局所注射後に反応がした場合、患者に全身治療を与える。

三、治療過程
２０１７年５月２５日から２０１７年６月２９日にかけて、この患者に合計８回（２回は１×１０^９細胞、６回は２×１０^９細胞）のＲｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞腫瘍部位の直接注射を与えた。６月１７日から６月２９日まで、患者に細胞を静脈内注入した（２×１０^９細胞／回、３回／週、隔日投与、合計５回）。治療過程を図９に示す。図９は、Ｒｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞治療過程の模式図である。同図には、実線の矢印は腫瘍組織内への直接注射、破線の矢印は静脈内注入を示す。

四、治療結果
５月２５日及び６月６日に右乳房にＲｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を２回局所注射したところ、右乳房の腫物は６＊５ｃｍの大きさまで明らかに小さくなり、乳房局所潰瘍も大幅に改善し、治療は有効であった。

６月１２日、頭部ＣＴでの再検査により異常がなく、胸部と腹部の強化ＣＴにより病状が安定したことが示された。

６月１５日からＲｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の局所及び全身治療を同時に１か月以上与えた結果、右乳房の腫物は明らかに２＊３ｃｍまで小さくなり、潰瘍部位は基本的に治癒した。

７月１７日、胸部強化ＣＴで再検査した結果、胸水は明らかに少なくなり、動悸と胸悶がなくなり、肩の痛みは基本的に緩和され、右乳房の腫物は５月より明らかに小さくなり（図７）、病状が安定し、徐々に回復していることを示している。

国内外で報告されたＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて腫瘍を治療する際に、ＩＬ－６などのサイトカインが急激に上昇し、その結果、サイトカインストームが発生し、重症の場合、患者の生命を危険にさらす恐れがある。そこで、研究者はさらに、Ｒｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞で腫瘍を治療するときの患者体内のサイトカインの変化状況を調べた。その結果を図８ａ、図８ｂに示す。

図８ａ及び図８ｂの結果から明らかなように、Ｒｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の腫瘍局部注射及び血液注射のいずれの場合においても、患者体内にはＩＬ－１０のみが一時的に増加し、ＩＬ－６などの他のサイトカインの有意な変化はなかった。治療中の患者の良好な状態と組み合わせて考慮すると、このＲｏｂｏ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞製品は、安全性が高く、サイトカインストームなどの有害反応を回避し、腫瘍を効果的に治療し、生存率を向上させることができる。

比較例１：ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の殺傷効果
ＣＦＳＥ染色法（Ａ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ａｎｎａ Ｓｃｈｅｒｂａｋｏｖａ，１，２ Ｈｅｌｅｎ Ｌｕｓｔ，１，２ Ｈｅｌｅ Ｅｖｅｒａｕｓ，１，２，３ Ａｌａｒ Ａｉｎｔｓ１，２，４＊を参照）によりＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の異なる腫瘍細胞系に対する殺傷効果を調べ、Ｔ細胞を対照とした。腫瘍細胞系は、乳がん細胞系ＨＣＣ１９３７、ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３及び膵臓がん細胞系ＢＸＰＣ３を含む。実験の操作方法は以下の通りである。
（１）事前に標的細胞を処理し、１μｌのＣＦＳＥに１Ｘ１０^６個の細胞があるように標的細胞をＣＦＳＥに加え、暗所でインキュベーターで１５分間インキュベートし、１０％のＢＳＡで停止させ、ＰＢＳで２回洗浄し、２４ウェルプレートに調製した５００μｌ腫瘍細胞懸濁液（８Ｘ１０^４個／ウェル）を加えた。培養プレートをインキュベーターで１２時間前培養した。
（２）エフェクター細胞対標的細胞が０．５：１及び１：１の割合で５００μｌのエフェクター細胞を加え、各実験を３回繰り返し、エフェクター細胞と標的細胞を合計４時間インキュベートした。
（３）４時間後、上清を１．５のＥＰチューブにピペットで移し、各ウェルに２００μｌのパンクレアチンを加えて１分間消化した後、移した上清で細胞をピペッティングし、遠心分離した後ＰＢＳで再懸濁し、１ｕｌの７－ＡＡＤを加え、暗所で１５分間インキュベートした後、機器で調べた。
（４）殺傷率＝（標的細胞の殺傷率－自発死亡率）／（１－自発死亡率）Ｘ１００％
ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の体外腫瘍殺傷効果についての評価実験の結果を図１１－１４に示す。

図１１－１４の実験結果は、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、いずれも乳がん細胞系ＨＣＣ１９３７、ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３及び膵臓がん細胞系ＢＸＰＣ３に対して強い殺傷効果を有し、それぞれの効果は普通のＴ細胞よりも強いことを実証した。

また、図１１－１４から分かるように、ＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫの殺傷効果は、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも明らかに優れ、腫瘍をより効果的に殺傷することができる。

要約すると、本発明で提供されるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞では、ＲＯＢＯ１分子を標的抗原とするＲＯＢＯ１抗体をＣＡＲ－ＮＫ細胞の構築に用い、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞により腫瘍細胞を特異的に殺傷し、腫瘍類疾患の治療薬としてＲＯＢＯ１分子を高発現する腫瘍の治療に適用でき、かつサイトカインストームなどの不良な現象がなく、従来の手術、化学療法、放射線療法では効果のない腫瘍の治療に新しい治療法を提供する。また、ＮＫ９２細胞にＣＡＲを導入することにより、標的性が大幅に向上するとともに抗腫瘍標的ＲＯＢＯ１が増加し、これによって標的性が向上し、抗腫瘍性能も高くなる。さらに、このＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、殺傷効果が明らかに高いので、腫瘍をより効果的に殺傷することができる。つまり、本発明で構築されるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＣＡＲの導入によりＮＫ９２細胞を改変することにより、標的性が向上するとともに、ＮＫ細胞を用いることで安全性が大幅に向上し、毒性と副作用が小さく、コストが低く、ＮＫ細胞、ＣＡＲ及び抗ＲＯＢＯ１標的の相乗効果により、殺傷効果が高く、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもはるかに優れている。

以上の説明は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を制限するものではない。本発明の趣旨及び原則内でなされる任意の改変、同等置換などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。

Claims (9)

1. キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチドであって、
   前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達領域を含み、前記抗原結合ドメインは、腫瘍特異抗原ＲＯＢＯ１に特異的に結合可能であり、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域によりＮＫ細胞を活性化し、
   前記抗原結合ドメインは、ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗原結合断片は、変異型ｓｃＦｖであり、
   前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８であり、前記共刺激シグナル伝達領域は、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを含み、
   前記キメラ抗原受容体は、構造がｓｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζである融合タンパク質であり、前記ｓｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：３に示されることを特徴とする、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド。
2. 前記ｓｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質をコードするヌクレオチドは、配列番号：４に示されることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド。
3. キメラ抗原受容体を発現するＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞であって、
   前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達領域を含み、
   前記抗原結合ドメインは、腫瘍特異抗原ＲＯＢＯ１に特異的に結合可能であり、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域によりＮＫ細胞を活性化し、
   前記抗原結合ドメインは、ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗原結合断片は、変異型ｓｃＦｖであり、
   前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８であり、前記共刺激シグナル伝達領域は、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを含み、
   前記キメラ抗原受容体は、構造がｓｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζである融合タンパク質であり、前記ｓｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：３に示されることを特徴とする、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞。
4. 前記ｓｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質をコードするヌクレオチドは、配列番号：４に示されることを特徴とする、請求項３に記載のＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞。
5. 有効治療量の請求項３又は４に記載のＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含むことを特徴とする、腫瘍を治療するための医薬組成物。
6. 前記医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤をさらに含み、前記医薬組成物の剤形は水剤であることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記腫瘍は、肝がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん、前立腺がん、神経膠腫又は肺がんであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
8. がんを治療及び／又は予防する医薬品の調製における請求項３又は４に記載のＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の使用。
9. 前記がんは、肝がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん、前立腺がん、神経膠腫又は肺がんであることを特徴とする、請求項８に記載の使用。

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