[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2012173260A1 - ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法 - Google Patents

ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012173260A1
WO2012173260A1 PCT/JP2012/065434 JP2012065434W WO2012173260A1 WO 2012173260 A1 WO2012173260 A1 WO 2012173260A1 JP 2012065434 W JP2012065434 W JP 2012065434W WO 2012173260 A1 WO2012173260 A1 WO 2012173260A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
blood coagulation
time
reagent
blood
measuring
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/065434
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正裕 家子
千鶴 森川
恵子 服部
Original Assignee
学校法人東日本学園・北海道医療大学
積水メディカル株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人東日本学園・北海道医療大学, 積水メディカル株式会社 filed Critical 学校法人東日本学園・北海道医療大学
Priority to JP2013520613A priority Critical patent/JP5640189B2/ja
Priority to CN201280029832.5A priority patent/CN103688177B/zh
Priority to KR1020137033385A priority patent/KR102001662B1/ko
Priority to US14/127,041 priority patent/US9970046B2/en
Priority to EP12801236.6A priority patent/EP2722675B1/en
Priority to CA2839125A priority patent/CA2839125C/en
Priority to ES12801236.6T priority patent/ES2613723T3/es
Publication of WO2012173260A1 publication Critical patent/WO2012173260A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/104—Lupus erythematosus [SLE]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the blood coagulation time of a test blood sample for the purpose of detecting lupus anticoagulant.
  • the blood coagulation time measurement is performed by using a blood coagulation factor activator (hereinafter sometimes simply referred to as an activator) and / or a reagent for measuring blood coagulation time, such as Ca 2+ , in the sample blood or the sample blood mixture.
  • a blood coagulation factor activator hereinafter sometimes simply referred to as an activator
  • a reagent for measuring blood coagulation time such as Ca 2+
  • Time from the time of addition to the formation of a detectable fibrin clot blood clotting time: hereinafter sometimes referred to simply as clotting time.
  • the formation of a fibrin clot may also be referred to simply as clotting). It is carried out for screening for the presence or absence of abnormalities in the blood coagulation system or for measuring the activity of individual blood coagulation factors.
  • Typical examples include blood clotting tests such as prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), and thrombin time.
  • PT prothrombin time
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • thrombin time a blood coagulation factor
  • the blood coagulation factor may be simply referred to as a coagulation factor in the present specification.
  • PT is the time from the addition of a mixed solution of tissue thromboplastin and Ca 2+ to the test plasma until coagulation.
  • Factor VII, factor X, factor V prothrombin related to the extrinsic system coagulation mechanism It is a comprehensive examination of coagulation activity such as fibrinogen.
  • APTT is the time from the addition of a sufficient amount of phospholipid and activator (kaolin, silicic anhydride, ellagic acid, etc.) and a suitable amount of Ca 2+ to the test plasma until coagulation.
  • phospholipid and activator kaolin, silicic anhydride, ellagic acid, etc.
  • Ca 2+ a suitable amount of Ca 2+ to the test plasma until coagulation.
  • Comprehensive examination of coagulation activity related to coagulation mechanism such as factor XII, factor XI, prekallikrein, high molecular weight kininogen, factor IX, factor VIII, factor X, factor V, prothrombin, fibrinogen Is.
  • the abnormality in these blood coagulation tests means that the coagulation time is prolonged.
  • Abnormalities in the blood coagulation system reflect signs or results of a tendency to bleeding or blood clot (blood coagulation tendency) in vivo.
  • the causes of the prolongation of the clotting time are as follows: 1) deficiency or reduction of blood coagulation factor, 2) presence of antibody against blood components constituting the blood coagulation system, 3) presence of antibody against components in blood coagulation time measurement reagent, 4) Presence of an antibody against a complex of a blood component constituting the blood coagulation system and a component in the reagent for measuring the blood coagulation time, and 5) administration of a drug that inhibits the blood coagulation reaction.
  • the cause of the prolongation of the coagulation time is, for example, a decrease in blood coagulation activity due to a lack of coagulation factors, It cannot be distinguished whether an antibody (inhibitor) to a component or the like is a decrease in blood coagulation activity due to inhibition of the coagulation reaction.
  • a blood coagulation correction test (hereinafter referred to as “mixing”) is performed in which normal plasma is added to the test plasma and the degree to which the blood coagulation time is corrected (normalized) is graphed to determine the cause of the extension.
  • Mixing is performed in which normal plasma is added to the test plasma and the degree to which the blood coagulation time is corrected (normalized) is graphed to determine the cause of the extension.
  • Test "or” mixing test ") Non-Patent Document 1).
  • a mixing test is performed as follows, for example. Prepare a sample prepared by adding and mixing normal plasma such that the mixing ratio of normal plasma to the test plasma is 0%, 20%, 50%, 80%, 100%, and measure APTT. Do. The results are plotted on a graph (horizontal axis: mixed normal plasma ratio or test plasma ratio (%), vertical axis: clotting time (seconds)), and the cause of prolonged clotting time visually from the shape of the graph Are identified and determined. For example, when the test plasma is deficient in coagulation factor, the clotting time is greatly shortened by adding a small amount of normal plasma (20% in FIG. 1A) and approaches the value when 100% normal plasma is measured.
  • a convex curve is shown below a straight line (broken line) connecting the points of 100% test plasma and 100% normal plasma (FIG. 1A). If there is a clotting factor inhibitor in the test plasma, the clotting factor inhibitor inactivates the clotting factor inhibitor in the normal plasma that was added even if the addition rate of normal plasma was increased. The degree of improvement is small, and a convex curve is shown (FIG. 1B).
  • LA Lupus anticoagulant
  • LA is known as a coagulation factor inhibitor that affects the sensitivity of a blood coagulation time measurement reagent.
  • LA is defined as an immunoglobulin that inhibits phospholipid-dependent coagulation in vitro without inhibiting individual clotting factor activity and is not a single antibody. Since the presence of phospholipids is essential for the coagulation reaction, many blood clotting time measurement reagents are usually rich in phospholipids. LA reacts with and consumes phospholipids in the reagent, and as a result, it inhibits the coagulation reaction and prolongs the coagulation time. Therefore, the results of coagulation tests such as PT and APTT become abnormal. Often. However, since LA has different reaction intensity depending on the type of phospholipid (origin, composition of phospholipid, etc.), it is known that LA positive / negative determination results differ depending on the blood coagulation time measurement reagent used.
  • warfarin an oral anticoagulant
  • warfarin an oral anticoagulant
  • the method using the plasma of healthy subjects not only dilutes LA in the test plasma, but also contains substances that interfere with LA measurement (phospholipids, platelet-derived membrane disruptions, etc.) contained in the plasma of healthy subjects. In some cases, it may be added. In particular, when LA is weakly positive, there is a problem that false negative may occur.
  • the blood coagulation time is not affected by the deficiency of blood coagulation factors and can detect LA easily and more sensitively than the recommended method of ISTH. Development of a measurement method has been strongly desired.
  • the present inventors have determined that the blood coagulation time is measured after adding a specific blood coagulation factor to the test sample (for example, plasma) instead of the healthy person plasma. As a result, it was found that the blood coagulation time for detection can be measured easily and sensitively, and the present invention has been completed.
  • a specific blood coagulation factor for example, plasma
  • the present invention provides a blood coagulation for LA detection, which comprises measuring a blood coagulation time by adding a buffer composition containing a blood coagulation factor to a blood sample before or during measurement of the blood coagulation time.
  • a method for measuring time is provided.
  • the present invention also provides an auxiliary reagent used in combination with a reagent for measuring blood coagulation time for detecting lupus anticoagulant, which mainly comprises a buffer composition containing a blood coagulation factor.
  • the present invention provides a reagent kit for measuring blood coagulation time for detecting lupus anticoagulant comprising the following (A) and (B).
  • B Auxiliary reagent mainly comprising a buffer composition containing a blood coagulation factor.
  • vitamin K-dependent coagulation factors such as blood samples derived from warfarin users, vitamin K deficient patients or liver failure patients (cirrhosis, fulminant hepatitis, chronic hepatitis patients, etc.) , And FX
  • the presence or absence of LA can be confirmed easily and sensitively. Therefore, the correct treatment policy for patients with LA can be determined.
  • it is not necessary to prepare healthy person plasma it is possible to solve the problems that existed in the past, such as the difference between batches of healthy person plasma and the difficulty in stably obtaining it.
  • the method of the present invention is particularly noteworthy in that it has become possible to easily and sensitively detect LA that may have been overlooked by the plasma mixing test of healthy subjects. This is a completely unexpected effect that cannot be predicted from the simple idea of replacing the conventional addition of healthy plasma with individual plasma components.
  • the method for measuring the blood coagulation time for LA detection of the present invention is characterized in that a buffer composition containing a blood coagulation factor is added to a blood sample before or during measurement of the blood coagulation time.
  • the blood sample used in the method of the present invention is preferably whole blood or plasma, and is usually prepared by adding an anticoagulant such as sodium citrate to blood collected from a subject.
  • an anticoagulant such as sodium citrate
  • the method of the present invention is particularly useful when the subject is a blood sample derived from a subject for which detection of LA has been difficult.
  • blood samples include blood samples from warfarin users, vitamin K deficient, and hepatic failure patients.
  • the blood coagulation time measurement means may be any phospholipid-dependent blood coagulation time measurement reagent or measurement means sensitive to LA, and the prothrombin time (PT), Known reagents for measuring activated partial thromboplastin time (APTT), diluted PT (dPT), diluted APTT (dAPTT), kaolin clotting time (KCT), diluted Russell snake venom time (dRVVT), and the like can be used.
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • dPT diluted PT
  • dAPTT diluted APTT
  • KCT kaolin clotting time
  • dRVVT diluted Russell snake venom time
  • the main component of the reagent for measuring prothrombin time is calcium and tissue thromboplastin
  • the main component of the reagent for measuring activated partial thromboplastin time (APTT) is phospholipid
  • contact Factor activators negatively charged substances such as kaolin, silicic acid anhydride, ellagic acid
  • KCT kaolin coagulation time
  • KCT kaolin and calcium
  • diluted Russell snake venom time The main components of the reagent for measuring (dRVVT) are Russell snake venom and phospholipid.
  • PT measurement reagent examples include Coagpia (registered trademark) PT-S (manufactured by Sekisui Medical), Thrombocheck PT plus (manufactured by Sysmex Corporation), and STA reagent series PT (manufactured by Roche Diagnostics). It is commercially available.
  • Coagpia registered trademark
  • PT-S manufactured by Sekisui Medical
  • Thrombocheck PT plus manufactured by Sysmex Corporation
  • STA reagent series PT manufactured by Roche Diagnostics
  • Examples of the reagent for measuring APTT include Coagpia (registered trademark) APTT-N (manufactured by Sekisui Medical), Thrombocheck APTT-SLA (manufactured by Sysmex), APTT Liquid RD, and PTT LA reagent “RD” (Roche Diagnostics). Etc.) are commercially available.
  • Examples of the reagent form include a dry form which is dissolved at the time of use and a solution form. One or more of these reagents may be combined with a buffer composition (auxiliary reagent) containing the blood coagulation factor of the present invention to form a kit.
  • PT blood coagulation time measurement reagent
  • APTT blood coagulation time measurement reagent
  • dRVVT blood coagulation time measurement reagents
  • PT blood coagulation time measurement reagent
  • APTT APTT
  • dRVVT dRVVT
  • dRVVT it is not necessary to perform a mixing test.
  • Examples of the buffer solution composition containing a blood coagulation factor used in the present invention include a buffer solution composition containing at least one blood coagulation factor that is considered to be deficient in a test blood sample, such as FII, FVII, A buffer composition comprising one or more selected from FVIII, FIX, FX, FXI and FXII is preferred, and further a buffer composition comprising at least one selected from FII, FVII, FIX and FX Things are preferred. Furthermore, when measuring PT, the buffer solution containing 1 type, or 2 or more types chosen from FII, FVII, and FX is preferable.
  • a buffer composition containing one or more selected from FII, FVIII, FIX, FX, FXI and FXII is preferred, and particularly one or two selected from FIX and FX.
  • a buffer composition containing the above is preferred.
  • the buffer composition containing 1 type, or 2 or more types chosen from FII and FX is preferable.
  • the buffer composition of the present invention is added to the test sample, the sample is diluted with the buffer composition, and the blood coagulation factor concentration in the sample is diminished, thereby affecting the clotting time.
  • FTT, FXI, and FXII can be included in APTT, dAPTT, and KCT, FVII can be included in PT, and FX can be included in dRVVT.
  • the buffer solution a known buffer solution such as Good buffer solution such as HEPES can be appropriately used.
  • the pH of the buffer solution may be any pH that does not inactivate the blood coagulation factor contained in the buffer solution composition, preferably pH 6-9, more preferably pH 6.5-8.0.
  • the concentration of the buffer solution is preferably 5 mM to 100 mM, more preferably 5 mM to 50 mM, as long as the buffer capacity during storage is maintained.
  • the concentration of the blood coagulation factor in the buffer composition is preferably in the range of 0.01 U / mL to 10 U / mL as the concentration of the blood coagulation factor after adding the buffer composition to the blood sample, and further 0 A range of 1 U / mL to 5 U / mL is preferred. What is necessary is just to set the mixing ratio of a blood sample and a buffer solution composition suitably in consideration of the density
  • the dilution rate of the blood sample with the buffer composition is preferably 3 times or less, more preferably 2 times or less.
  • glycylglycine or glycylglycylglycine disclosed in JP-B-06-050999 may be added.
  • you may add a preservative, an ionic strength regulator, etc. suitably, as long as the effect of this invention is not impaired.
  • the buffer composition containing the blood coagulation factor is added to the blood sample before or during measurement of the blood coagulation time.
  • adding the buffer composition before measuring the blood coagulation time corresponds to pretreatment of the blood sample. That is, the buffer composition is added to a blood sample to pretreat the blood sample, and then the blood clotting time is measured using a blood coagulation measurement reagent.
  • adding at the time of measuring the blood coagulation time corresponds to measuring the blood coagulation time by adding the buffer composition to a part of the reagent for blood coagulation measurement.
  • it is preferable to add the buffer solution composition to the blood sample before measuring the blood coagulation time because it is easy to ensure the storage stability of the coagulation factor contained in the buffer composition.
  • a method for measuring the blood coagulation time for example, a change in transmitted light or a change in scattered light caused by a blood coagulation reaction that occurs when a reagent containing calcium and phospholipid (a reagent for blood coagulation time measurement) is added to a blood sample.
  • a method for detecting coagulation can be suitably used by physically measuring the optical change of the sample and the viscosity of the measurement sample.
  • the concentration of calcium in the blood coagulation time measurement reagent can be appropriately set according to the type of blood coagulation time measurement method. For example, in the case of the APTT measurement method, it is preferably about 20 mM to 25 mM, and in the case of the PT measurement method, it is preferably 10 mM to 12.5 mM.
  • the phospholipid those conventionally used for blood coagulation time measuring reagents can be preferably used.
  • the fatty acid side chain of the phospholipid is not particularly limited, but palmitic acid, oleic acid, and stearic acid are preferable.
  • Examples of the phospholipid include phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, and phosphatidylcholine.
  • the phospholipid may be a natural product such as bovine brain-derived, rabbit brain-derived, human placenta-derived, soybean-derived, or the like, or one produced by gene recombination.
  • the concentration of the phospholipid in the measurement sample is, for example, 1 ⁇ g / mL to 200 ⁇ g / mL in the APTT reagent, 10 ⁇ g / mL to 300 ⁇ g / mL in the PT reagent, and 1 ⁇ g / mL to 300 ⁇ g / mL in the dRVVT measurement reagent. Is preferred.
  • the pH of the blood coagulation time measurement reagent can be appropriately set in consideration of the pH when mixed with the buffer composition of the present invention.
  • the pH of the measurement reagent itself is pH 6.0 to 8 0.0, more preferably pH 7.0 to 7.6, which can be appropriately adjusted using a buffer used in a conventional reagent for measuring blood coagulation time. Examples of the buffer include, but are not limited to, HEPES or TRIS.
  • the above-mentioned reagent for measuring blood coagulation time can contain, in addition to the above-mentioned components, components contained in conventionally known reagents for measuring blood coagulation time.
  • components contained in conventionally known reagents for measuring blood coagulation time include activators, snake venoms, tissue factors, and the like.
  • activator include ellagic acid, kaolin, celite, colloidal silica, silicic anhydride, alumina, and magnesium.
  • Examples of snake venom include Russell snake venom, textarin snake venom, and ecarin snake venom.
  • tissue factor include natural and genetically modified tissue thromboplastins such as those derived from rabbit brain, human placenta, and bovine brain.
  • the method of the present invention can also be applied to a blood coagulation correction test (mixing test) described in Non-Patent Document 1. That is, the present invention can be applied to a method in which a normal blood sample is added to a test blood sample and the degree to which the blood coagulation time is corrected is graphed and determined. More specifically, for example, a test sample prepared by adding Pooled Normal Plasma (manufactured by Precision Biological Inc; hereinafter abbreviated as PNP) or a buffer composition of the present invention as a normal plasma and diluted 1: 1. And Normal plasma is added to this test sample, a sample prepared by mixing so that the ratio of normal plasma is 0%, 20%, 50%, 80%, and 100% is prepared, and APTT is measured. The results can be plotted on a graph (horizontal axis: mixed normal plasma ratio or test plasma ratio (%), vertical axis: clotting time (seconds)) and visually determined from the shape of the graph. .
  • PNP Pooled Normal Plasma
  • a blood sample derived from a warfarin user a person with vitamin K deficiency or a liver insufficiency can be obtained only by measuring the conventional blood coagulation time except that the buffer composition is simply added. Even if it exists, the presence or absence of LA can be detected and determined accurately.
  • the buffer solution composition containing the blood coagulation factor can be used as an auxiliary reagent used in combination with a blood coagulation time measurement reagent for detecting lupus anticoagulant.
  • the combination of (A) an activated partial thromboplastin time measurement reagent or diluted Russell snake venom time measurement reagent and (B) an auxiliary reagent mainly comprising a buffer composition containing a blood coagulation factor is It is useful as a reagent kit for measuring blood coagulation time for coagulant detection.
  • Example 1 The test plasma was diluted 1: 1 with the auxiliary reagent described in Table 1 as a sample, and a normal mixing test was performed to compare the shapes of the curves in the graph.
  • ⁇ Measurement item> (1) APTT screening test Using PTT LA reagent “RD” (Roche Diagnostics), measurement was performed with an automatic blood coagulation analyzer STA-R (Roche Diagnostics). . The cut-off value described in the package insert of the reagent was used for the determination. The reagent is measured using a PTT LA reagent containing cephalin, which is a phospholipid, and silica, which is a contact factor activator (negatively charged substance), and a calcium chloride solution that is separately manufactured. It can be used in the method of the present invention in combination with the blood coagulation factor-containing buffer composition (auxiliary reagent) of the invention.
  • the reagent is composed of a reagent 1 containing Russell snake venom and phospholipid, and a reagent 2 containing Russell snake venom and an excessive amount of phospholipid, and the blood coagulation factor-containing buffer composition of the present invention (auxiliary reagent) And can be used in the method of the present invention.
  • Phospholipid neutralization method test A clotting LA (manufactured by Roche Diagnostics) reagent was used, and measurement was performed with a blood coagulation analyzer ST4 (manufactured by Roche Diagnostics). The cut-off value described in the package insert of the reagent was used for the determination.
  • auxiliary reagent> Based on HBS (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM sodium chloride), the blood coagulation factors shown in Table 1 were added to prepare each auxiliary reagent. All blood clotting factors are available from Haematologic Technologies Inc. The thing of was used.
  • Test plasma is plasma collected from a patient receiving warfarin for both A and B.
  • the mixed test of both plasmas A and B showed a downward tendency and was LA negative.
  • the plasma A is an S-shaped graph that is almost linear, and is convex upward or downward. Such determination was difficult (in the column of normal plasma addition in Table 3, right figure in FIG. 2).
  • the auxiliary reagent 1-4 of the present invention was used, the plasma A became a clear and convex graph and could be easily determined as positive (column of auxiliary reagent in Table 3, FIG. 4).
  • plasma B was clearly convex downward and could be determined to be negative (in Table 3, column of auxiliary reagent, FIG. 5).
  • the negative determination in the mixed test of plasma A was a false negative due to warfarin administration, and it was easily determined that it was actually LA positive. This is not possible with conventional mixing tests or variations of mixing tests.
  • Plasma B was positive in the APTT screening test and dRVVT test, but both were false positives due to warfarin administration and could be judged to be LA negative in practice.
  • Example 2 A measurement sample was prepared by adding and mixing 0.5 volume of the auxiliary reagent described later to 9.5 volume of the test plasma, and a dRVVT test was performed to determine the ratio of clotting time.
  • dRVVT test DVVtest registered trademark
  • DVVconfirm both manufactured by Sekisui Diagnostics
  • the dRVVT test was performed using a sample incubation time of 216 seconds and the APTT freezing point parameter.
  • the cut-off value (t / c) in this example was 1.3 or less, and LA was detected and determined.
  • the reagent is composed of Russell snake venom, DVVtest (registered trademark) reagent containing phospholipid and calcium, Russell snake venom, DVVconfirm reagent containing excessive amounts of phospholipid and calcium, and contains the blood coagulation factor of the present invention It can be used in the method of the present invention in combination with a buffer composition (auxiliary reagent).
  • ⁇ Buffer composition of the present invention auxiliary reagent> FX and FII were combined so that the concentration of FX was 20 times thicker than the concentration described in the row of Table 4, and the concentration of FII was 20 times thicker than the concentration described in the column of Table 4, and dissolved in HBS.
  • Auxiliary reagents were prepared. For FX and FII, Haematologic Technologies Inc. The thing of was used.
  • LA positive (+) which may be determined as LA negative (false negative) in the dRVVT test, and (+) plasma of a subject who has warfarin administration (L (+) Even when W (+) plasma) was measured, it was possible to make an original determination of LA positive without being affected by warfarin administration.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　ワルファリン服用者、ビタミンＫ欠乏者あるいは肝不全患者の血液試料においても、血液凝固因子の欠乏の影響を受けず、ＩＳＴＨの推奨法に比べ、容易かつ感度よくＬＡ検出が可能な血液凝固時間の測定方法の提供。　血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料に、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加して血液凝固時間を測定することを特徴とする、ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法。

Description

ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法
　本発明は、ループスアンチコアグラントを検出する目的で、被検血液試料の血液凝固時間を測定する方法に関する。
　血液凝固時間測定は、血液凝固因子の活性化剤（以下、単に活性化剤と言う場合もある。）及び／又はＣａ２＋などから成る血液凝固時間測定用試薬を、検体血液又は検体血液混合物に添加した時点から、検出可能なフィブリン塊が形成されるまでの時間（血液凝固時間：以下、単に凝固時間と言う場合もある。また、フィブリン塊の形成を、単に凝固と言う場合もある。）を測定するもので、血液凝固系の異常の有無のスクリーニング、又は個々の血液凝固因子の活性測定のために実施されている。典型的な例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン時間などの血液凝固試験がある。以下、本明細書において血液凝固因子を、単に凝固因子と言う場合もある。
　ＰＴとは、被検血漿に組織トロンボプラスチン及びＣａ２＋の混合液を添加してから凝固するまでの時間であり、外因系凝固機序に関係する第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、プロトロンビン、フィブリノゲン等の凝固活性を総合的に検査するものである。また、ＡＰＴＴとは、被検血漿に十分量のリン脂質及び活性化剤（カオリン、無水ケイ酸、エラグ酸など）と適量のＣａ２＋を添加してから凝固するまでの時間であり、内因系凝固機序に関係する第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子、プレカリクレイン、高分子キニノゲン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、プロトロンビン、フィブリノゲン等の凝固活性を総合的に検査するものである。一般的に、これら血液凝固試験における異常とは、凝固時間が延長することを指す。血液凝固系の異常は、生体内での出血傾向又は血栓傾向（血液凝固傾向）の兆候あるいは結果を反映している。
　当該凝固時間の延長原因としては、１）血液凝固因子の欠乏又は低下、２）血液凝固系を構成する血液成分に対する抗体の存在、３）血液凝固時間測定用試薬中の成分に対する抗体の存在、４）血液凝固系を構成する血液成分と血液凝固時間測定用試薬中の成分との複合体に対する抗体の存在、５）血液凝固反応を阻害する薬剤の投与などが考えられる。
　しかし、血液凝固時間の測定を行うだけでは、凝固時間の延長原因が、例えば、単に凝固因子欠乏による血液凝固活性の低下なのか、血液凝固系を構成する成分又は血液凝固時間測定用試薬中の成分等に対する抗体（インヒビター）が凝固反応を阻害することによる血液凝固活性の低下なのか等を鑑別することはできない。その一方で、当該延長原因の違いにより治療方針が異なるため、当該延長原因の鑑別は重要である。そこで、当該延長原因の鑑別のために、被検血漿に正常血漿を添加し、その血液凝固時間が補正される（正常化する）程度をグラフ化して判定する血液凝固補正試験（以下、「混合試験」あるいは「ミキシングテスト」ということもある）が行われている（非特許文献１）。
　従来、ミキシングテストは、例えば、次のようにして実施されている。
　被検血漿に対して、正常血漿の混合割合が０％、２０％、５０％、８０％、１００％となるように正常血漿を添加、混合して調製した試料を準備し、ＡＰＴＴの測定を行う。その結果をグラフ（横軸：混合した正常血漿の割合又は被検血漿の割合（％）、縦軸：凝固時間（秒））にプロットし、当該グラフの形状から視覚的に凝固時間の延長原因を鑑別、判定する。例えば、被検血漿が凝固因子欠乏の場合、少量の正常血漿の添加（図１（Ａ）では２０％）で凝固時間は大きく短縮して正常血漿１００％を測定した場合の値に近づくため、被検血漿１００％と正常血漿１００％のポイントを結んだ直線（破線）よりも下に凸のカーブを示す（図１（Ａ））。
　被検血漿中に凝固因子インヒビターが存在する場合は、正常血漿の添加割合を高くしても添加した正常血漿中の凝固因子を当該凝固因子インヒビターが失活させるため、正常血漿の添加による凝固時間の改善度合いが小さく、上に凸のカーブを示す（図１（Ｂ））。
　血液凝固時間測定用試薬の感受性に影響する凝固因子インヒビターとして、ループスアンチコアグラント（以下、ＬＡ）が知られている。ＬＡは、個々の凝固因子活性を阻害することなく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるリン脂質依存性の凝固反応を阻害する免疫グロブリンと定義されており、単一の抗体ではない。凝固反応にはリン脂質の存在が必須であるため、通常、多くの血液凝固時間測定用試薬にはリン脂質が豊富に含まれている。ＬＡは、当該試薬中のリン脂質と反応して、これを消費し、結果的に凝固反応を阻害して凝固時間を延長させるため、ＰＴやＡＰＴＴのような凝固検査の結果が異常となり発見されることが多い。しかし、ＬＡはリン脂質の種類（由来、リン脂質の組成等）により反応強度が異なるため、使用する血液凝固時間測定用試薬によってもＬＡ陽性・陰性の判定結果が異なることが知られている。
検査と技術，Ｖｏｌ．３４，ｎｏ．８，２００６年８月，ｐ７３５－７４２ Ｕｐｄａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｌｕｐｕｓ　ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７：ｐｐ１７３７－１７４０，２００９
　抗凝固療法として、緊急時には即効性があり静脈内投与が可能なヘパリン、長期投与による予防には経口抗凝固薬であるワルファリンが用いられている。このうち、ワルファリンは、生体内でのビタミンＫの作用に拮抗することにより、血液凝固因子のうち第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子の肝臓での生合成を抑制することが知られている。それ故、ワルファリン服用者、ビタミンＫ欠乏者、あるいは肝不全患者（肝硬変、劇症肝炎、あるいは慢性肝炎患者など）の場合、従来のミキシングテストによる血液凝固時間の延長原因の確認方法では、ＬＡなどの抗リン脂質抗体による凝固時間の延長であるのか、ワルファリンの作用、ビタミンＫの欠乏、あるいは肝不全に基づく血液凝固因子の欠乏による凝固時間の延長であるのかが不明確であり、原因の鑑別が困難であった。この問題は、ワルファリン投与を受けていて、さらにＬＡ陽性である場合に、より深刻である。何故なら、ＬＡ陽性を確認あるいは疑い、抗凝固療法を開始した場合には、ＬＡの検出とその消長の監視、追跡が重要であるが、それが正確にできないことになるからである。
　国際血栓止血学会（ＩＳＴＨ）では、ＬＡ検出の際、不足した凝固因子を補うため、被検血漿に対して等量の健常者血漿を混合した後に測定することが推奨されている。ここで、使用する健常者血漿については、血小板数が１０７／ｍＬを下回るように二重に遠心処理をし、かつ全ての血液凝固因子の活性がほぼ１００％であるものを各施設で自家調製して用いることとされている（非特許文献２）。しかし、血液凝固因子の中には活性が非常に不安定で失活しやすいものもあるため、全ての血液凝固因子の活性をほぼ１００％に保ったまま健常者血漿を調製するのは非常に困難であり、安定入手が容易でないという問題を有していた。また、健常者血漿の調製においては、貯留（プール）、混合する人数が多いほど、凝固因子活性の個人毎のばらつきを平均化できるが、施設によっては健常者の人数を確保できず、血漿提供者に偏りができるためバッチ間の品質の差が生じてしまう問題もある。さらに、健常者血漿を用いる方法は、被検血漿中のＬＡを希釈してしまうだけでなく、健常者血漿に含まれるＬＡ測定を妨害する物質（リン脂質、血小板由来の膜破砕物等）を添加してしまう場合もあり、特にＬＡが弱陽性の場合は、偽陰性化してしまう可能性があるという問題もあった。
　従って、ワルファリン服用者、ビタミンＫ欠乏者あるいは肝不全患者においても、血液凝固因子の欠乏の影響を受けず、前記のＩＳＴＨの推奨法に比べ、容易かつ感度よくＬＡ検出が可能な血液凝固時間の測定方法の開発が強く望まれていた。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、健常者血漿ではなく、特定の血液凝固因子を被検試料（たとえば血漿）に添加した後に血液凝固時間を測定することにより、健常者血漿を用いなくとも、簡便かつ鋭敏に検出用の血液凝固時間の測定が可能であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料に、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加して血液凝固時間を測定することを特徴とする、ＬＡ検出用血液凝固時間の測定方法を提供するものである。
　また、本発明は、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を主成分とする、ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間測定用試薬と組みあわせて使用する補助試薬を提供するものである。
　さらに、本発明は、以下の（Ａ）、（Ｂ）を含むループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間測定用試薬キットを提供するものである。
（Ａ）活性化部分トロンボプラスチン時間測定用試薬又は希釈ラッセル蛇毒時間測定用試薬
（Ｂ）血液凝固因子を含む緩衝液組成物を主成分とする補助試薬。
　本発明方法によれば、ワルファリン服用者、ビタミンＫ欠乏者あるいは肝不全患者（肝硬変、劇症肝炎、あるいは慢性肝炎患者など）由来の血液試料などのビタミンＫ依存性凝固因子（ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、及びＦＸ）が欠乏している場合においても、ＬＡの有無を簡便かつ鋭敏に確認することが可能である。従って、ＬＡを有する患者の正しい治療方針を決定できる。また、健常者血漿を準備する必要がないため、従来問題となっていた健常者血漿のバッチ間差や安定入手が難しいという問題をも解消できる。さらに、本発明方法の特筆すべきところは、これまで健常者血漿の混合試験によっても見落とされる可能性のあったＬＡを、簡便かつ鋭敏に検出することができるようになったことである。これは、従来の健常血漿の添加を、個々の血漿成分に置き換え添加するという単純な発想からは予測できない、全く意外な効果である。
従来法によるミキシングテストの結果を示すモデル図である。（Ａ）は凝固因子欠乏症、（Ｂ）は凝固因子インヒビター型、（Ｃ）は凝固時間の延長原因が不明確な場合のパターンをそれぞれ示す。 未処理血漿Ａ及び正常血漿添加血漿Ａをそれぞれサンプルとした場合のミキシングテストの結果を示す図である。 未処理血漿Ｂ及び正常血漿添加血漿Ｂをそれぞれサンプルとした場合のミキシングテストの結果を示す図である。 補助試薬１－４を添加した血漿Ａをサンプルとした場合のミキシングテストの結果を示す図である。 補助試薬１－４を添加した血漿Ｂをサンプルとした場合のミキシングテストの結果を示す図である。
　本発明のＬＡ検出用血液凝固時間の測定方法は、血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料に、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加することを特徴とする。
　本発明方法に用いられる血液試料は、全血又は血漿が好ましく、通常、被検者から採取した血液に、クエン酸ナトリウムなどの抗凝固剤を加えて調製される。これらの血液試料のうち、従来ＬＡ検出が困難であった被検者由来の血液試料を対象とする場合に、本発明方法は特に有用である。そのような血液試料としては、ワルファリン服用者、ビタミンＫ欠乏者、肝不全患者由来の血液試料が挙げられる。
　血液凝固時間の測定手段、すなわち、血液凝固時間測定用試薬としては、ＬＡに感受性を示すリン脂質依存性の血液凝固時間測定用試薬あるいは測定手段であればいずれでもよく、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、希釈ＰＴ（ｄＰＴ）、希釈ＡＰＴＴ（ｄＡＰＴＴ）、カオリン凝固時間（ＫＣＴ）、及び希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）などを測定する公知の試薬を用いることができる。これらの試薬のうち、例えば、プロトロンビン時間（ＰＴ）を測定する試薬の主成分は、カルシウム及び組織トロンボプラスチンであり、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定する試薬の主成分は、リン脂質、接触因子活性化剤（カオリン、無水ケイ酸、エラグ酸等の陰性荷電体）及びカルシウムであり、カオリン凝固時間（ＫＣＴ）を測定する試薬の主成分は、カオリン及びカルシウムであり、希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）を測定する試薬の主成分は、ラッセル蛇毒、リン脂質である。これらの成分は、適宜に独立した試薬として、あるいは混合された試薬として使用することができる。また、前記試薬としてはいずれも市販品を使用できる。ＰＴ測定用試薬としては、例えばコアグピア（登録商標）ＰＴ－Ｓ（積水メディカル社製）、トロンボチェックＰＴプラス（シスメックス社製）、及びＳＴＡ試薬シリーズＰＴ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などが市販されている。ＡＰＴＴ測定用試薬としては、例えばコアグピア（登録商標）ＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル社製）、トロンボチェックＡＰＴＴ－ＳＬＡ（シスメックス社製）、ＡＰＴＴリキッドＲＤおよびＰＴＴ　ＬＡ試薬「ＲＤ」（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などが市販されている。試薬の形態としては、使用時に溶解される乾燥形態、あるいは溶液形態を挙げることができる。
これらの試薬の１以上と本発明の血液凝固因子を含有する緩衝液組成物（補助試薬）を組み合わせてキットとすることもできる。
　これらの血液凝固時間測定用試薬のうち、ＰＴ、ＡＰＴＴ又はｄＲＶＶＴがＬＡ検出感度の点で好ましい。また、ＰＴ又はＡＰＴＴを測定する場合には、正常血漿と被検血漿のミキシングテストを採用するのが好ましい。ｄＲＶＶＴを測定する場合には、特にミキシングテストを行わなくてもよい。
　本発明に用いられる血液凝固因子を含む緩衝液組成物としては、被検血液試料が欠乏していると考えられる血液凝固因子の少なくとも１種を含む緩衝液組成物が挙げられ、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ及びＦＸＩＩから選ばれる１種又は２種以上を含む緩衝液組成物が好ましく、さらに少なくともＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸから選ばれる１種又は２種以上を含む緩衝液組成物が好ましい。さらにＰＴを測定する場合には、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ及びＦＸから選ばれる１種又は２種以上を含有する緩衝液が好ましい。ＡＰＴＴを測定する場合には、ＦＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ及びＦＸＩＩから選ばれる１種又は２種以上を含有する緩衝液組成物が好ましく、特にＦＩＸ及びＦＸから選ばれる１種又は２種以上を含有する緩衝液組成物が好ましい。またｄＲＶＶＴを測定する場合には、ＦＩＩ及びＦＸから選ばれる１種又は２種以上を含有する緩衝液組成物が好ましい。尚、被検試料に本発明の緩衝液組成物を添加した際に、当該緩衝液組成物により試料が希釈され、試料中の血液凝固因子濃度が薄まることにより凝固時間に影響するような場合には、前記の緩衝液組成物に、用いる試薬に応じて補填が必要な血液凝固因子を含ませておくことができる。例えば、ＡＰＴＴ、ｄＡＰＴＴ及びＫＣＴにおいてはＦＶＩＩＩ、ＦＸＩ及びＦＸＩＩを、ＰＴにおいてはＦＶＩＩを、ｄＲＶＶＴにおいてはＦＸを含ませておくことができる。
　ここで緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液など、公知の緩衝液を適宜用いることができる。緩衝液のｐＨは、緩衝液組成物に含まれる血液凝固因子を失活させないｐＨであればよく、ｐＨ６～９が好ましく、ｐＨ６．５～８．０がより好ましい。また緩衝液の濃度は、保存中の緩衝能が保たれていればよく、５ｍＭ～１００ｍＭが好ましく、５ｍＭ～５０ｍＭがより好ましい。
　当該緩衝液組成物中の血液凝固因子の濃度は、血液試料に当該緩衝液組成物を添加した後の血液凝固因子の濃度として、０．０１Ｕ／ｍＬ～１０Ｕ／ｍＬの範囲が好ましく、さらに０．１Ｕ／ｍＬ～５Ｕ／ｍＬの範囲が好ましい。血液試料と緩衝液組成物の混合割合は、緩衝液組成物中の血液凝固因子の濃度を考慮して適宜設定すればよい。緩衝液組成物による血液試料の希釈倍率としては３倍以下が好ましく、２倍以下がより好ましい。
　尚、当該緩衝液組成物には、血液凝固因子の安定化剤として公知のものを、適宜添加してもよい。例えば、特公平０６－０５０９９９号公報で開示されているグリシルグリシンやグリシルグリシルグリシンなどを添加してもよい。また、本発明の効果を損ねないことを限度として保存剤やイオン強度調整剤などを適宜添加してもよい。
　本発明方法においては、血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料に、上記血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する。ここで、血液凝固時間の測定前に緩衝液組成物を添加するのは、血液試料の前処理に相当する。すなわち、血液試料に前記緩衝液組成物を添加して血液試料を前処理し、次いで血液凝固測定用試薬を用いて血液凝固時間を測定する。一方、血液凝固時間の測定時に添加するのは、血液凝固測定用試薬の一部に前記緩衝液組成物を添加して、血液凝固時間を測定することに相当する。これらの添加時期のうち、血液凝固時間の測定前に、血液試料に前記緩衝液組成物を添加する方が、緩衝液組成物に含有させる凝固因子の保存安定性を確保しやすい点で好ましい。
　血液凝固時間の測定方法としては、例えば、血液試料にカルシウム及びリン脂質を含む試薬（血液凝固時間測定用試薬）を添加して生じる血液凝固反応に伴い変化する透過光変化、あるいは散乱光変化などの光学的変化や測定試料の粘度を物理的に測定することにより、凝固を検出する方法を好適に用いることができる。
　カルシウムとしては、無機酸とカルシウムとの塩を用いるのが好ましい。このようなカルシウム塩としては、塩化カルシウムなどが挙げられる。また、無機酸とカルシウムとの塩以外のカルシウム塩としては、乳酸カルシウムが挙げられる。血液凝固時間測定用試薬中のカルシウムの濃度は、血液凝固時間測定法の種類に応じて適宜設定することができる。例えばＡＰＴＴ測定法の場合、２０ｍＭ～２５ｍＭ程度であり、ＰＴ測定法の場合、１０ｍＭ～１２．５ｍＭであるのが好ましい。
　リン脂質としては、従来から血液凝固時間測定用試薬に用いられるものを好適に用いることができる。リン脂質の脂肪酸側鎖は、特に限定されないが、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸が好ましい。当該リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンなどが挙げられる。また、リン脂質は、ウシ脳由来、ウサギ脳由来、ヒト胎盤由来、大豆由来などの天然のもの、あるいは遺伝子組み換えにより作製されたものであってもよい。測定試料中のリン脂質の濃度は、例えばＡＰＴＴ試薬中で１μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、ＰＴ試薬で１０μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬであり、ｄＲＶＶＴ測定試薬で１μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬであるのが好ましい。
　血液凝固時間測定用試薬のｐＨは、本発明の緩衝液組成物と混合された際のｐＨを考慮して適宜設定することができるが、当該測定用試薬自体のｐＨとしてはｐＨ６．０～８．０が好ましく、より好ましくはｐＨ７．０～７．６であり、従来の血液凝固時間測定用試薬に用いられる緩衝剤を用いて適宜調整できる。当該緩衝剤としては、例えばＨＥＰＥＳ、あるいはＴＲＩＳなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
　上記の血液凝固時間測定用試薬には、上記の成分以外に、従来公知の血液凝固時間測定用試薬に含まれる成分を含むことができる。このような成分としては、例えば活性化剤、蛇毒、組織因子などが挙げられる。活性化剤としては、エラグ酸、カオリン、セライト、コロイドシリカ、無水ケイ酸、アルミナ、マグネシウムなどが挙げられる。蛇毒としては、ラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒、エカリン蛇毒などが挙げられる。組織因子としては、ウサギ脳由来、ヒト胎盤由来、ウシ脳由来などの天然及び遺伝子組換えの組織トロンボプラスチンが挙げられる。
　本発明方法は、非特許文献１記載の血液凝固補正試験（ミキシングテスト）にも適用することができる。すなわち、被検血液試料に正常血液試料を添加し、その血液凝固時間が補正される程度をグラフ化して判定する方法に適用できる。
　より詳細には、例えば被検血漿に、正常血漿としてＰｏｏｌｅｄ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｐｌａｓｍａ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ　Ｉｎｃ製；以下、ＰＮＰと略す）あるいは本発明の緩衝液組成物を１：１で加え希釈したものを被検試料とする。この被検試料に正常血漿を添加し、正常血漿の割合が０％、２０％、５０％、８０％、１００％となるように混合して調製した試料を準備し、ＡＰＴＴの測定を行う。その結果をグラフ（横軸：混合した正常血漿の割合又は被検血漿の割合（％）、縦軸：凝固時間（秒））にプロットし、当該グラフの形状から視覚的に判定することができる。
　本発明方法を用いれば、単に前記の緩衝液組成物の添加を行う以外は、従来の血液凝固時間の測定を行うのみで、ワルファリン服用者、ビタンミンＫ欠乏者あるいは肝不全患者由来の血液試料であっても、正確にＬＡの有無を検出、判定することができる。
　前記血液凝固因子を含む緩衝液組成物は、ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間測定用試薬と組みあわせて使用する補助試薬として用いることができる。
　また、（Ａ）活性化部分トロンボプラスチン時間測定用試薬又は希釈ラッセル蛇毒時間測定用試薬と、（Ｂ）血液凝固因子を含む緩衝液組成物を主成分とする補助試薬との組みあわせは、ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間測定用試薬キットとして有用である。
　以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
　被検血漿を表１記載の補助試薬にて１：１に希釈したものをサンプルとし、通常の混合試験を実施して、グラフにおけるカーブの形状を比較した。
＜測定項目＞
（１）ＡＰＴＴスクリーニング試験
　ＰＴＴ　ＬＡ試薬「ＲＤ」（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を使用し、血液凝固自動分析装置ＳＴＡ－Ｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）にて測定を実施した。判定には試薬の添付文書に記載されているカットオフ値を使用した。当該試薬は、リン脂質であるセファリン、接触因子活性化剤（陰性荷電体）であるシリカを含有するＰＴＴ　ＬＡ試薬と、別途、自製する塩化カルシウム溶液を使用して測定を行うものであり、本発明の血液凝固因子含有緩衝液組成物（補助試薬）と組み合わせて本発明の方法に使用することが可能なものである。
（２）ｄＲＶＶＴ試験
　ＬＡテスト「グラディポア」（医学生物学研究所社製）試薬を使用し、血液凝固自動分析装置ＳＴＡ－Ｒにて測定を実施した。判定には試薬の添付文書に記載されているカットオフ値を使用した。当該試薬は、ラッセル蛇毒とリン脂質を含有する試薬１、ラッセル蛇毒と過剰量のリン脂質を含有する試薬２、から構成されており、本発明の血液凝固因子含有緩衝液組成物（補助試薬）と組み合わせて本発明の方法に使用することが可能なものである。
（３）リン脂質中和法試験
　スタクロットＬＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）試薬を使用し、血液凝固分析装置ＳＴ４（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）にて測定を実施した。判定には試薬の添付文書に記載されているカットオフ値を使用した。
（４）混合試験
　ＰＴＴ　ＬＡ試薬「ＲＤ」（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を使用し、血液凝固自動分析装置ＣＰ２０００（積水メディカル社製）にて測定を実施した。正常血漿としてＰｏｏｌｅｄ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｐｌａｓｍａ（以下ＰＮＰ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ　Ｉｎｃ．）を使用した。サンプル混合割合は０％、１０％、２０％、５０％、１００％に設定し、ＣＰ２０００のミキシングテスト機能を使用して自動希釈にて測定を行った。判定はグラフを描画し上に凸であれば陽性とした。判定が困難なものは判定保留とした。
（５）混合試験変法
　被検血漿をＰＮＰあるいは後述の補助試薬１－４にて１：１希釈したものをサンプルカップにとり、ＣＰ２０００にセットして（４）と同様に測定を実施した。判定はグラフを描画し、上に凸であれば陽性とした。判定が困難なものは判定保留とした。
＜本発明の緩衝液組成物：補助試薬＞
　ＨＢＳ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）をベースに、表１に示した血液凝固因子を添加して各補助試薬を調製した。血液凝固因子は全てＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．の物を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　　補助試薬組成
＜被検血漿＞
　被検血漿は、Ａ、Ｂともにワルファリンの投与を受けている患者より採取した血漿である。
＜結果＞
　表２に示すとおり、血漿Ａは、ＡＰＴＴスクリーニング試験、ｄＲＶＶＴ試験、およびリン脂質中和法の全てのＬＡ検査で陽性となった。血漿ＢはＡＰＴＴスクリーニング試験、ｄＲＶＶＴ試験にて陽性となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表３中未処理の欄、図２左図、図３左図に示したとおり、血漿Ａ、Ｂともに混合試験は下に凸の傾向となり、ＬＡ陰性であった。混合試験変法のうち、一般的に推奨されている正常血漿（ＰＮＰ）を使用する方法では、血漿Ａはほぼ直線に近いＳ字型のグラフとなり、上に凸であるか下に凸であるかの判定が困難であった（表３中正常血漿添加の欄、図２右図）。これに対し、本発明の補助試薬１－４を使用した場合は、血漿Ａは明瞭な上に凸のグラフとなり、容易に陽性と判定できた（表３中補助試薬の欄、図４）。血漿Ｂについてはいずれの場合も明瞭に下に凸となり、陰性と判定できた（表３中補助試薬の欄、図５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明により、血漿Ａの混合試験の陰性判定はワルファリン投与による偽陰性であり、実際にはＬＡ陽性であることが容易に判断できた。これは、従来の混合試験あるいは混合試験変法ではなしえなかったことである。また、血漿ＢについてはＡＰＴＴスクリーニング試験、ｄＲＶＶＴ試験にて陽性となったが、いずれもワルファリン投与による偽陽性であり、実際にはＬＡ陰性であることが判断できた。
実施例２
　被検血漿９．５容量に対し、後記補助試薬０．５容量を添加、混合して測定試料を調製し、ｄＲＶＶＴ試験を実施して凝固時間の比を求めた。
＜測定項目＞
（１）ｄＲＶＶＴ試験
　血液凝固時間測定用試薬として、ＤＶＶｔｅｓｔ（登録商標）及びＤＶＶｃｏｎｆｉｒｍ（ともにセキスイ・ダイアグノスティクス社製）を使用し、血液凝固自動分析装置ＣＰ２０００（積水メディカル社製）にて、測定試料のインキュベーション時間２１６秒、ＡＰＴＴ凝固点パラメータを使用して、ｄＲＶＶＴ試験を行った。本実施例でのカットオフ値（ｔ／ｃ）は、１．３以下とし、ＬＡの検出、判定を行った。当該試薬は、ラッセル蛇毒、リン脂質及びカルシウムを含有するＤＶＶｔｅｓｔ（登録商標）試薬、ラッセル蛇毒、過剰量のリン脂質及びカルシウムを含有するＤＶＶｃｏｎｆｉｒｍ試薬、から構成されており、本発明の血液凝固因子含有緩衝液組成物（補助試薬）と組み合わせて本発明の方法に使用することが可能なものである。
＜本発明の緩衝液組成物：補助試薬＞
　ＦＸの濃度が表４の行に記載の濃度の２０倍濃厚、ＦIIの濃度が表４の列に記載の濃度の２０倍濃厚になるようＦＸ、ＦIIを組み合わせて、ＨＢＳに溶解し、２８通りの補助試薬を調製した。ＦＸ、ＦIIともＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．の物を使用した。
＜被検血漿＞
　ＬＡ陰性でワルファリンの投与がない血漿：Ｌ（－）Ｗ（－）血漿として、ＡＫキャリブラントＡ（シスメックス社製）を、ＬＡ陰性でワルファリンの投与がある血漿：Ｌ（－）Ｗ（＋）血漿として、ＡＫキャリブラントＤ（シスメックス社製）を、ＬＡ陽性でワルファリンの投与がない血漿：Ｌ（＋）Ｗ（－）血漿として、Ｌｕｐｕｓ　ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　ｐｌａｓｍａ（ＴＲＩＮＡ社製）を、ＬＡ陽性でワルファリンの投与がある血漿：Ｌ（＋）Ｗ（－）血漿として、Ｌｕｐｕｓ　ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　ｐｌａｓｍａ（ビジコム社製）を使用した。
＜結果＞
　結果を表４に示した。
ＦII、ＦＸとも添加されていない（０Ｕ／ｍＬ）場合、
Ｌ（－）Ｗ（－）の血漿は、ＬＡ陰性；
Ｌ（－）Ｗ（＋）の血漿は、ＬＡ陰性；
Ｌ（＋）Ｗ（－）の血漿は、ＬＡ陽性；
Ｌ（＋）Ｗ（＋）の血漿は、ＬＡ陰性；
と判定され、Ｌ（＋）Ｗ（＋）の血漿について、ＬＡ偽陰性の結果が得られた。
　また、Ｌ（－）Ｗ（＋）の血漿は、ＬＡ陰性ではあったものの、ｔ／ｃ値が０．６２と異常値を示した。
　これに対して、各被検血漿にＦII、ＦＸのいずれか１種以上を添加した場合、Ｌ（－）Ｗ（－）の血漿、Ｌ（－）Ｗ（＋）の血漿、及びＬ（＋）Ｗ（－）の血漿の判定結果を維持したまま、Ｌ（＋）Ｗ（＋）の血漿のｔ／ｃ値のみをカットオフ値以上に増加させ、得られるべきＬＡ陽性の結果が得られた。
　また、Ｌ（－）Ｗ（＋）の血漿にＦII、ＦＸのいずれか１種以上を添加した場合、ｔ／ｃ値が１付近に近づきワルファリン投与の影響を低減できることが確認された。この成績とＬ（＋）Ｗ（＋）の血漿の成績を勘案すると、本発明の方法を用いるｄＲＶＶＴ試験は、ワルファリン投与中であってもＬＡを正確に検出できることを示しており、例えば、ワルファリン投与中のＬＡ治療効果のモニター等に極めて有用である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明の方法によれば、ｄＲＶＶＴ試験でＬＡ陰性（偽陰性）と判定されることがあるＬＡ陽性（＋）で、かつワルファリンの投与がある（＋）被検者の血漿（Ｌ（＋）Ｗ（＋）の血漿）を測定した場合でも、ワルファリン投与の影響を受けることなく、ＬＡ陽性という本来の判定をすることが可能であった。

Claims (9)

  1. 　血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料に、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加して血液凝固時間を測定することを特徴とする、ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法。
  2. 　血液凝固因子が、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ及びＦＸＩＩから選ばれる１種又は２種以上である請求項１記載の測定方法。
  3. 　血液試料が、全血又は血漿である請求項１又は２記載の測定方法。
  4. 　血液凝固時間の測定前に、血液試料に、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する請求項１～３のいずれか１項記載の測定方法。
  5. 　血液試料が、ワルファリン服用者、ビタンミンＫ欠乏者及び肝不全患者から選ばれる者由来である請求項１～４のいずれか１項記載の測定方法。
  6. 　血液凝固時間の測定手段が、活性化部分トロンボプラスチン時間又は希釈ラッセル蛇毒時間である請求項１～５のいずれか１項記載の測定方法。
  7. 　血液凝固因子を含む緩衝液組成物を主成分とする、ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間測定用試薬と組みあわせて使用する補助試薬。
  8. 　ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間測定用試薬が、活性化部分トロンボプラスチン時間又は希釈ラッセル蛇毒時間の測定に用いられるものである、請求項７記載の補助試薬。
  9. 　以下の（Ａ）、（Ｂ）を含むループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間測定用試薬キット。
    （Ａ）活性化部分トロンボプラスチン時間測定用試薬又は希釈ラッセル蛇毒時間測定用試薬
    （Ｂ）血液凝固因子を含む緩衝液組成物を主成分とする補助試薬。
PCT/JP2012/065434 2011-06-17 2012-06-15 ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法 WO2012173260A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013520613A JP5640189B2 (ja) 2011-06-17 2012-06-15 ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法
CN201280029832.5A CN103688177B (zh) 2011-06-17 2012-06-15 狼疮抗凝物检测用血液凝固时间的测定方法
KR1020137033385A KR102001662B1 (ko) 2011-06-17 2012-06-15 루프스 안티코아귤란트 검출용 혈액 응고시간의 측정방법
US14/127,041 US9970046B2 (en) 2011-06-17 2012-06-15 Method of measuring blood coagulation time to detect lupus anticoagulants
EP12801236.6A EP2722675B1 (en) 2011-06-17 2012-06-15 Method of measuring blood coagulation time to detect lupus anticoagulants
CA2839125A CA2839125C (en) 2011-06-17 2012-06-15 Method of measuring blood coagulation time to detect lupus anticoagulants
ES12801236.6T ES2613723T3 (es) 2011-06-17 2012-06-15 Método de medición del tiempo de coagulación sanguínea para detectar anticoagulantes de Lupus

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011135174 2011-06-17
JP2011-135174 2011-06-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012173260A1 true WO2012173260A1 (ja) 2012-12-20

Family

ID=47357238

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/065434 WO2012173260A1 (ja) 2011-06-17 2012-06-15 ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9970046B2 (ja)
EP (1) EP2722675B1 (ja)
JP (2) JP5640189B2 (ja)
KR (1) KR102001662B1 (ja)
CN (1) CN103688177B (ja)
CA (1) CA2839125C (ja)
ES (1) ES2613723T3 (ja)
WO (1) WO2012173260A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021099360A (ja) * 2015-03-20 2021-07-01 株式会社日立ハイテク 自動分析装置及び自動分析方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6871673B2 (ja) * 2015-03-31 2021-05-12 学校法人東日本学園 血液検体を判定するための方法、装置及びコンピュータプログラム、並びに血液検体分析装置
JP6499488B2 (ja) * 2015-03-31 2019-04-10 学校法人東日本学園 凝固時間の測定方法、ループスアンチコアグラントの存否の判定方法及びループスアンチコアグラント検出用試薬キット
CA3020980C (en) 2016-04-25 2023-10-24 Instrumentation Laboratory Company Method and kit for identifying lupus anticoagulant (la) associated with antiphospholipid syndrome
JP6837851B2 (ja) * 2017-01-31 2021-03-03 シスメックス株式会社 血液検体の判定方法、並びに血液検体の分析のための装置及びコンピュータプログラム
CN108761104A (zh) * 2018-05-21 2018-11-06 深圳优迪生物技术有限公司 凝血激活剂及其应用
CN109709344A (zh) * 2018-12-29 2019-05-03 贵州金玖生物技术有限公司 一种活化凝血检测试剂、其制备方法及其应用
CN112557665B (zh) * 2020-11-10 2023-06-09 北京美创新跃医疗器械有限公司 一种狼疮抗凝物的确认试剂及其制备方法
CN114778858A (zh) * 2022-06-23 2022-07-22 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种狼疮抗凝物检测试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0650999B2 (ja) 1988-09-12 1994-07-06 日本商事株式会社 血液凝固因子安定化法
JPH06324048A (ja) * 1993-05-15 1994-11-25 Shimizu Seiyaku Kk 血液凝固能検査用試薬及び血液凝固能の検査方法
WO2001048486A1 (fr) * 1999-12-24 2001-07-05 International Reagents Corporation Moyen de stabilisation de compositions et reactifs

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2461969A1 (de) 1974-12-31 1976-07-08 Behringwerke Ag Stabiles blutplasma, verfahren zu dessen herstellung und seine verwendung als vergleichsplasma bei gerinnungs- untersuchungen
US4877741A (en) 1988-10-24 1989-10-31 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Treatment of human plasma with brown recluse spider toxin to emulate a lupus anticoagulant
JP3055933B2 (ja) 1989-07-20 2000-06-26 アナリティカル・コントロール・システムズ・インコーポレーテッド 改良された安定な凝固対照
DE19749197A1 (de) * 1997-11-07 1999-05-12 Dade Behring Marburg Gmbh Verfahren zur Bestimmung des antikoagulatorischen Potentials einer Probe
CN1126758C (zh) 2001-08-16 2003-11-05 四川高维系统工程技术有限公司 凝血因子ⅸ复合物的制备方法
KR101006070B1 (ko) 2001-12-21 2011-01-06 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 인자 ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물
EP3103869A1 (en) 2003-03-18 2016-12-14 Novo Nordisk Health Care AG Method for the production of factor vii polypeptides
EP1707634A1 (en) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
EP1920068A4 (en) 2005-07-28 2008-08-13 American Diagnostica Inc LUPIC ANTICOAGULANT TEST
CN101221189B (zh) * 2007-01-12 2012-08-15 上海太阳生物技术有限公司 一种用于测定活化部分凝血活酶时间aptt的体外诊断试剂盒
CN101861142A (zh) 2007-11-22 2010-10-13 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 含醛化合物对液体配制因子VII(a)多肽的稳定化
CN101903030A (zh) 2007-12-21 2010-12-01 灵感生物制药学有限公司 含海藻糖的稳定化因子ix制剂
JP4505045B2 (ja) 2008-06-18 2010-07-14 積水メディカル株式会社 血液凝固時間の延長原因の判定法
DK2537862T3 (en) 2008-06-24 2015-06-15 Octapharma Ag A method of purifying coagulation factor VIII

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0650999B2 (ja) 1988-09-12 1994-07-06 日本商事株式会社 血液凝固因子安定化法
JPH06324048A (ja) * 1993-05-15 1994-11-25 Shimizu Seiyaku Kk 血液凝固能検査用試薬及び血液凝固能の検査方法
WO2001048486A1 (fr) * 1999-12-24 2001-07-05 International Reagents Corporation Moyen de stabilisation de compositions et reactifs

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection", JOURNAL OF THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, vol. 7, 2009, pages 1737 - 1740
KAZUHIKO KAGAWA: "Blood coagulation compensation test", MODERN MEDICAL LABORATORY, vol. 34, no. 8, 1 August 2006 (2006-08-01), pages 735 - 742, XP008172319 *
KENSA TO GIJUTSU (EXAMINATION AND TECHNOLOGY, vol. 34, no. 8, August 2006 (2006-08-01), pages 735 - 742
MASAHIRO IEKO ET AL.: "Cross-Mixing Test to Detect Lupus Anticoagulant for Diagnosis of Antiphospholipid Syndrome", THE JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL PATHOLOGY, vol. 57, no. 10, 25 October 2009 (2009-10-25), pages 990 - 998, XP008172335 *
NOBUKO KANNO ET AL., LUPUS ANTICOAGULANT SOKUTEI NO TAMENO KESSHO KENTAI SAKUSEI TO KENSA NO GENJO, vol. 37, no. 13, 1 December 2009 (2009-12-01), pages 1484 - 1490, XP008172316 *
See also references of EP2722675A4 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021099360A (ja) * 2015-03-20 2021-07-01 株式会社日立ハイテク 自動分析装置及び自動分析方法
JP7193564B2 (ja) 2015-03-20 2022-12-20 株式会社日立ハイテク 自動分析装置及び自動分析方法
US11946941B2 (en) 2015-03-20 2024-04-02 Hitachi High-Tech Corporation Automatic analysis device and automatic analysis method

Also Published As

Publication number Publication date
KR102001662B1 (ko) 2019-10-01
ES2613723T3 (es) 2017-05-25
JP5640189B2 (ja) 2014-12-17
EP2722675A4 (en) 2015-02-25
CA2839125C (en) 2019-08-06
US9970046B2 (en) 2018-05-15
CN103688177B (zh) 2017-07-04
JP2014209134A (ja) 2014-11-06
KR20140033422A (ko) 2014-03-18
US20140127726A1 (en) 2014-05-08
JPWO2012173260A1 (ja) 2015-02-23
EP2722675B1 (en) 2017-01-11
CN103688177A (zh) 2014-03-26
JP6025105B2 (ja) 2016-11-16
EP2722675A1 (en) 2014-04-23
CA2839125A1 (en) 2012-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6025105B2 (ja) ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法
US8357539B2 (en) Activated partial thromboplastin time measuring reagent, activated partial thromboplastin time measuring method, and determination method for determining presence or absence of blood coagulation inhibitor
US8759108B2 (en) Reagent kit for detecting lupus anticoagulant and method of determining presence or absence of lupus anticoagulant
US20140295470A1 (en) Method and reagent kit for measuring activated partial thromboplastin time
JP2013205087A (ja) 凝固時間測定用試薬、凝固時間測定用試薬キットおよび凝固時間の測定方法
DK149475B (da) Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af den biologiske aktivitet af herapin i plasma
Rimsans et al. Overview and practical application of coagulation assays in managing anticoagulation with direct oral anticoagulants (DOACs)
US20110177541A1 (en) Method for adjusting the coagulation time in calibrator or control plasmas
CA2839117C (en) Method for detecting lupus anticoagulants
JP2007503589A (ja) 活性化混合物
JP6634557B2 (ja) プロテインｓの活性測定試薬キット及び活性測定方法
US20090263903A1 (en) Method for determining prothrombin time
CN103649758B (zh) 狼疮抗凝物的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12801236

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013520613

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2839125

Country of ref document: CA

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2012801236

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012801236

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137033385

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14127041

Country of ref document: US