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WO2011016382A1 - 生体分子固定基板及びその製造方法 - Google Patents

生体分子固定基板及びその製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2011016382A1
WO2011016382A1 PCT/JP2010/062757 JP2010062757W WO2011016382A1 WO 2011016382 A1 WO2011016382 A1 WO 2011016382A1 JP 2010062757 W JP2010062757 W JP 2010062757W WO 2011016382 A1 WO2011016382 A1 WO 2011016382A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biomolecule
group
linker molecule
substrate
hydrocarbon chain
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/062757
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
靖彦 多田
博史 吉田
斎藤　俊郎
奈良原　正俊
中川　裕章
Original Assignee
株式会社日立ハイテクノロジーズ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日立ハイテクノロジーズ filed Critical 株式会社日立ハイテクノロジーズ
Priority to US13/388,671 priority Critical patent/US9040251B2/en
Publication of WO2011016382A1 publication Critical patent/WO2011016382A1/ja

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/625—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier binding through the biotin-streptavidin system or similar
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a biomolecule-fixed substrate in which a biomolecule is fixed to a predetermined region of the substrate via a linker molecule, and a method for producing the same.
  • biosensors are used as means for detecting biomolecules such as specific genes and proteins according to such purposes.
  • the most common biosensor structure is a structure in which probe molecules that make biomolecules thin are immobilized on a solid surface.
  • the merit of a biosensor in which probe molecules are immobilized on a substrate is that many types of probe molecules can be immobilized on the same substrate by using a method such as spotting or inkjet. By using this biosensor substrate, it is possible to quickly perform a comprehensive analysis on many types of biomolecules at once.
  • a typical example of a biosensor using the substrate surface is a biomolecule detection element such as a DNA microarray or a protein chip.
  • Patent Document 1 a single molecule array using a single molecule array of polynucleotides is used.
  • a gene sequencing method by single molecule-based sequencing (SBS (Sequencing by Synthesis) method or the like) is disclosed.
  • SBS Single molecule-based sequencing
  • a polynucleotide of a sample modified with an appropriate primer is immobilized on the surface of a substrate, and this is used as a template to perform a base-by-base extension reaction to form a complementary strand of the sample polynucleotide.
  • a fluorescent dye is introduced at each end of the phosphate group of the purine skeleton, pyrimidine skeleton, or triphosphate of four different nucleotides, and each single molecule is extended for each extension step.
  • the introduced nucleotide is identified by detecting fluorescence.
  • the sequence for each single polynucleotide fixing site is read, and the sequence information of the specimen is comprehensively acquired.
  • it is important to detect with a high S / N ratio and improve sequencing accuracy during sequencing.
  • the average immobilization density of polynucleotide molecules is set in accordance with the pixel size of the CCD camera. That is, the average fixed density of the polynucleotide or the pixel resolution is adjusted so that the fluorescence signal from one polynucleotide is captured by one pixel as much as possible. Considering the spatial resolution of the detection optical system, the size of one pixel is not less than a submicron angle.
  • Non-Patent Document 2 reports a method using fluorescence enhancement in order to improve fluorescence detection sensitivity.
  • silver nanoparticles modified with DNA which is a probe molecule, are immobilized on a substrate and reacted with molecules in a fluorescently labeled sample.
  • excitation light is irradiated to detect the reaction amount, free electrons of silver nanoparticles cause localized plasmon resonance, and fluorescence is enhanced. It is said that the sensitivity can be improved by using this phenomenon.
  • fluorescence enhancement fields are arranged in a grid pattern at equal intervals on the substrate, one polymerase molecule is immobilized on the fluorescence enhancement field, and a DNA elongation reaction is performed. Since the fluorescence excited by evanescent is enhanced by the fluorescence enhancement field, the S / N ratio or S / B ratio of fluorescence detection is sufficiently high even if there is non-specific adsorption. However, since the size of the metal microparticles varies, the fluorescence enhancement effect may vary for each metal microparticle, and there remains a problem in detection accuracy. In addition, one probe molecule is immobilized on the metal microparticle using the liquid phase method, but the location to be immobilized is determined at random, so it may be immobilized between the metal microparticle and the substrate, and polymerase extension May inhibit the reaction.
  • the fluorescence enhancement field is provided in a grid shape, there is a possibility that variations in the fluorescence enhancement field can be reduced by forming a noble metal structure as the fluorescence enhancement field by lithography.
  • a method of selectively immobilizing probe molecules directly on the fluorescence enhancement field, and forming a metal surface having a composition different from the composition of the fluorescence enhancement field and the substrate as a scaffold for immobilizing the probe molecules, and selectively A method of fixing can be considered.
  • Non-Patent Document 3 there is a method in which a metal oxide surface made of TiO 2 is formed at a position where avidin, which is a biomolecule, is arranged, and a non-specific adsorption preventing film is formed on the other SiO 2 (quartz) surface. It is shown. In this case, it is considered that a biomolecule can be selectively introduced into a fluorescence enhancement field by introducing a metal oxide surface made of TiO 2 as a scaffold for a probe molecule.
  • the present invention provides a method for producing a biomolecule-immobilized substrate that can selectively immobilize biomolecules in a predetermined region of the substrate, and the biomolecule is manufactured by the method and selectively selects biomolecules in the predetermined region.
  • An object of the present invention is to provide a biomolecule-immobilized substrate fixed to a substrate.
  • the present invention that has achieved the above object includes the following.
  • a substrate having at least a first surface and a second surface, a hydrocarbon chain, and a functional group capable of selectively binding to the first surface at one end or side chain of the hydrocarbon chain
  • a first linker molecule bonded to the first surface via the functional group, a reactive group capable of binding to a hydrocarbon chain of the first linker molecule, and the reactive group and the above
  • a biomolecule-immobilized substrate comprising: a second linker molecule bonded to the first linker molecule via a bond with a hydrocarbon chain; and a biomolecule bonded via the second linker molecule.
  • the first surface is a metal oxide, and the functional group capable of selectively binding to the first surface is a phosphate group and / or a silanol group.
  • Biomolecule immobilization substrate is a metal oxide, and the functional group capable of selectively binding to the first surface is a phosphate group and / or a silanol group.
  • the first surface is a metal having a natural oxide film, and the functional group capable of selectively binding to the first surface is a phosphate group and / or a silanol group (1 )
  • the biomolecule-fixed substrate as described above.
  • the hydrocarbon chain of the first linker molecule has a phosphate group and / or a silanol group at the end of the alkyl group of Chemical Formula 1 and / or Chemical Formula 2 as described in (3) or (5) Biomolecule immobilization substrate.
  • m is an integer of 2 to 20.
  • at least one of X is alkoxy or chlorine, and may include methyl or ethyl) (7)
  • n is an integer of 1 or more
  • the latent reaction group is at least one photoreactive compound selected from the group consisting of an anthracion group, an anthraquinone group, a benzophenone group, an azide group, and derivatives thereof. Biomolecule fixed substrate.
  • a method for producing a biomolecule-immobilized substrate comprising: a step of bringing a second linker molecule into contact with the biomolecule; and a step of bringing the biomolecule into contact with each other via the second linker molecule by contacting the biomolecule.
  • the first surface is a metal oxide, and the functional group capable of selectively binding to the first surface is a phosphate group and / or a silanol group.
  • the first surface is a metal having a natural oxide film, and the functional group capable of selectively binding to the first surface is a phosphate group and / or a silanol group (16 ) Manufacturing method of a biomolecule-fixed substrate as described above.
  • the hydrocarbon chain of the first linker molecule has a phosphate group and / or a silanol group at the end of the alkyl group of Chemical Formula 5 and / or Chemical Formula 6 (19) or (21) A method for producing a biomolecule-immobilized substrate.
  • m is an integer of 2 to 20.
  • at least one of X is alkoxy or chlorine, and may include methyl or ethyl) (23)
  • the latent reactive group is at least one photoreactive compound selected from the group consisting of an anthracion group, an anthraquinone group, a benzophenone group, an azide group, and derivatives thereof (28) A method for producing a biomolecule-immobilized substrate.
  • biomolecule-immobilized substrate since biomolecules are selectively immobilized in a predetermined region on the substrate, noise due to nonspecific adsorption of biomolecules or linker molecules for immobilizing biomolecules Etc. can be greatly reduced. Further, according to the method for producing a biomolecule-immobilized substrate according to the present invention, it is possible to selectively immobilize biomolecules in a predetermined region on the substrate, and to produce a biomolecule-immobilized substrate having excellent detection sensitivity and the like. Can do.
  • FIG. Is a photograph showing fluorescence observation of the surface of the SiO 2 Au film of the fluorescent observation shows photographs (a) and the surface of the TiO 2 substrate and the SiO 2 on the substrate at the surface of the TiO 2 film on the substrate (b).
  • Is a photograph showing fluorescence observation of the surface of the SiO 2 Au film of the fluorescent observation shows photographs (a) and the surface of the TiO 2 substrate and the SiO 2 on the substrate at the surface of the TiO 2 film on the substrate (b).
  • the biomolecule-immobilized substrate according to the present invention includes a substrate 13 having at least a first surface 101 and a second surface 102 as shown in FIGS. 1 to 3, for example.
  • the 1st surface 101 means the area
  • the second surface 102 means a region where a biomolecule is not fixed.
  • the biomolecule is not particularly limited, but protein molecules such as antibodies and enzymes can be exemplified.
  • a first linker having a hydrocarbon chain and a functional group capable of selectively binding to the first surface 101 at one end or side chain of the hydrocarbon chain. It has a compound layer 201 made of molecules.
  • the first linker molecule has a functional group at one end, and can be bonded to the first surface 101 via this functional group.
  • the other end and the hydrocarbon chain in the first linker molecule do not inhibit the binding between the second linker molecule and the hydrocarbon chain, the details of which will be described later, and are the same as the above functional groups as long as they do not bind to the second surface 102. Or you may have a different functional group.
  • the compound layer 201 is selectively formed on the first surface 101 and is not formed on a region other than the first surface 101 such as the second surface 102.
  • the first surface 101 is made of a metal oxide such as TiO 2 , Ta 2 O 5 , Al 2 O 3 , Nb 2 O 5 , ZrO 2 , as the functional group in the first linker molecule, for example, phosphorus Acid groups and / or silanol groups can be used.
  • the 1st surface 101 consists of noble metals, such as Au, Ag, Cu, and Pt
  • a thiol group can be used as a functional group in a 1st linker molecule, for example.
  • the compound layer 201 can be selectively formed on the first surface 101 by appropriately selecting the functional group in the first linker molecule according to the material of the first surface 101.
  • the hydrocarbon chain in the first linker molecule refers to an alkyl group such as an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, and a hexyl group, an alkenyl group, and an alkynyl group as a basic skeleton. It has a structure having no adsorptive capacity.
  • the hydrocarbon chain preferably has 2 to 20 carbon atoms, more preferably 5 to 15 carbon atoms, and still more preferably 12 carbon atoms, but is not limited thereto.
  • a structure having a long hydrocarbon chain such as a polymer compound may be used.
  • the number average molecular weight is preferably 1,000 to 500,000, more preferably 5,000 to 200,000, still more preferably 10,000 to 100,000, but is not limited thereto.
  • the hydrocarbon chain includes those having a functional group such as a hydroxyl group, a phenyl group, a chloroalkyl group, an isocyanate group, or an epoxy group with respect to the basic skeleton.
  • the biomolecule-immobilized substrate according to the present invention has the compound layer 202 made of the second linker molecule having a reactive group capable of binding to the hydrocarbon chain of the first linker molecule.
  • a latent reactive group such as a photoreactive functional group and a thermochemically reactive functional group is preferably used.
  • a photoreactive functional group as a reactive group capable of binding to the hydrocarbon chain of the first linker molecule.
  • a photoreactive functional group for example, a photoreactive aryl ketone or a compound having an azide group is desirable.
  • Specific examples of the photoreactive aryl ketone include, but are not limited to, an anthracion group or a derivative thereof, an anthraquinone group or a derivative thereof, and a benzophenone group or a derivative thereof.
  • the biomolecule is directly or indirectly bonded to the second linker molecule.
  • the second linker molecule described above may have a structure in which a reactive group capable of binding to the hydrocarbon chain of the first linker molecule is introduced into the biomolecule, or is introduced into the biomolecule or biomolecule.
  • a structure in which a reactive group capable of bonding to the reactive group is introduced may be used.
  • the reactive group capable of binding to the biomolecule is not particularly limited, and examples thereof include biotin, avidin, and epoxide, but a functional group capable of binding complementary to the biomolecule is more preferable.
  • nucleic acid / complementary nucleic acid examples include nucleic acid / complementary nucleic acid, peptide nucleic acid / nucleic acid, enzyme / substrate, receptor / effector, lectin / sugar, antibody / antigen, avidin / biotin or streptavidin / biotin based binding.
  • a nucleic acid is immobilized as a biomolecule
  • a complementary nucleic acid is introduced as a reactive group into the second linker molecule.
  • an antigen is introduced as a reactive group into the second linker molecule.
  • avidin is introduced into the protein molecule and biotin is introduced into the second linker molecule as a reactive group, or the protein and the second linker molecule are reacted.
  • Biotin may be introduced as a group, and the protein and the second linker molecule may be bound via avidin.
  • the biomolecule-immobilized substrate shown in FIG. 1 is obtained by immobilizing biomolecules using the first linker molecule and the second linker molecule described above.
  • the scaffold 11 and the scaffold 11 are provided on one main surface of the substrate 13. It has the fluorescence enhancer 12 formed so as to be sandwiched.
  • the first surface 101 described above is the surface of the scaffold 11, and the second surface 102 is the surface of the fluorescence enhancer 12.
  • the fluorescence enhancer 12 has a function of enhancing fluorescence generated in the vicinity of the first surface 101, and has a shape in which the longitudinal section decreases toward the first surface 101 in order to amplify the enhancement function. Yes.
  • the material of the substrate 13 is not particularly limited as long as the excitation light to be used is transmitted, and it is desirable to use a material different from the fluorescence enhancer 12 and the scaffold 11.
  • the substrate 13 for example, an inorganic material such as glass or titania, a semiconductor such as silicon or GaAs, a metal such as copper, tantalum, or titanium, or a substrate made of an organic material such as epoxy resin or polyimide depending on the purpose. Just choose.
  • the material of the fluorescence enhancer 12 is preferably a metal, a metal alloy, or a metal laminate.
  • Examples of the material of the fluorescence enhancer 12 include Au, Pt, Ir, Pd, Ru, Ni, Ti, Sn, Ag, Cu, Rh, and Al.
  • the structure of the fluorescence enhancer is not limited to the illustrated structure, and may be any shape as long as it can enhance the light having the fluorescence wavelength to be detected.
  • a material different from the substrate 13 and the fluorescence enhancer 12 for example, a metal oxide such as TiO 2 , Ta 2 O 5 , Al 2 O 3 , Nb 2 O 5 , and ZrO 2 is used. preferable.
  • a noble metal such as Au, Ag, Cu, Pt can be used as the material of the scaffold 11.
  • the film thickness of the surface 11 is arbitrary, but it is preferably 0.1 nm or more and 10 nm or less in consideration of transmission of evanescent waves.
  • the biomolecule-immobilized substrate shown in FIG. 1 can be manufactured by, for example, a manufacturing process flowchart shown in FIG. First, the scaffold 11 and the fluorescence enhancer 12 are produced on one main surface of the substrate 13. The scaffold 11 and the fluorescence enhancer 12 can be manufactured to have a desired shape and size by applying a normal thin film forming / processing technique. Next, when this structure is immersed in a solution containing the first linker molecule, the first linker molecule binds only to the surface of the scaffold 11 (first surface 101), and the compound layer 201 is formed on the scaffold 11. (FIG. 4B).
  • the second linker molecule is selectively bonded to the first linker molecule, and the compound layer 202 is formed (FIG. 4C).
  • the first linker molecule and the second linker molecule may be bonded to each other by applying a solution containing the second linker molecule to one main surface of the structure.
  • a compound containing a latent reactive group is used as the second linker molecule, conditions are provided such that the latent reactive group such as electromagnetic waves and heat can bind to the hydrocarbon chain of the first linker molecule.
  • the scaffold 11 may be bound using a compound in which the first linker molecule and the second linker molecule are bound in advance.
  • adsorption-inhibiting molecules for preventing nonspecific adsorption of biomolecules are immobilized on the surface of the substrate 13 and the surface of the fluorescence enhancer 12 to form the adsorption-inhibiting layers 104 and 105 (FIG. 4D).
  • the biomolecule 301 is immobilized through the second linker molecule (FIG. 4 (e)).
  • the area of the scaffold 11 as viewed from the plane is larger than the area occupied by one molecule of the biomolecule 301, but is preferably smaller than the area occupied by two molecules.
  • a biomolecule-immobilized substrate in which biomolecules are immobilized only in a desired region such as the surface of the scaffold 11 (first surface 101) can be manufactured.
  • the first linker molecule can be selectively introduced only into the first surface 101, the living body to other regions such as the fluorescence enhancer 12 and the substrate 13 can be obtained. Molecular fixation can be prevented.
  • aminopropyl phosphate which was used as a linker molecule for immobilizing biomolecules, is a metal oxide surface such as TiO 2 where the amino group contained in aminopropyl phosphate, a noble metal surface such as Au, and even SiO 2 Since it is also adsorbed on the surface of the inorganic substance, when it is used for a structure as shown in FIG. In this case, when various reactions using biomolecules are detected using fluorescence, the reaction proceeds on the surface of the fluorescence enhancer 12 or the substrate 13 and causes noise, resulting in a serious problem of sensitivity reduction.
  • the biomolecule-immobilized substrate according to the present invention since biomolecules can be immobilized only on the surface of the scaffold 11 (first surface 101), generation of noise can be prevented and very excellent detection sensitivity is achieved. can do.
  • the biomolecule-immobilized substrate shown in FIG. 1 is obtained by immobilizing biomolecules using the first linker molecule and the second linker molecule described above.
  • the scaffold 11 and the scaffold 11 are provided on one main surface of the substrate 13. It has the fluorescence enhancer 12 formed so as to be sandwiched.
  • the first surface 101 described above is the surface of the scaffold 11, and the second surface 102 is the surface of the fluorescence enhancer 12.
  • the fluorescence enhancer 12 has a function of enhancing fluorescence generated on the first surface 101, and has a shape such that the longitudinal section decreases toward the first surface 101 in order to amplify the enhancement function. .
  • the material of the substrate 13 is not particularly limited as long as the excitation light to be used is transmitted, and it is desirable to use a material different from the fluorescence enhancer 12 and the scaffold 11.
  • the substrate 13 for example, an inorganic material such as glass or titania, a semiconductor such as silicon or GaAs, a metal such as copper, tantalum, or titanium, or a substrate made of an organic material such as epoxy resin or polyimide depending on the purpose. Just choose.
  • the material of the fluorescence enhancer 12 is preferably a metal, a metal alloy, or a metal laminate.
  • Examples of the material of the fluorescence enhancer 12 include Au, Pt, Ir, Pd, Ru, Ni, Ti, Sn, Ag, Cu, Rh, and Al.
  • the structure of the fluorescence enhancer is not limited to the illustrated structure, and may be any shape as long as it can enhance the light having the fluorescence wavelength to be detected.
  • a material different from the substrate 13 and the fluorescence enhancer 12 for example, a metal oxide such as TiO 2 , Ta 2 O 5 , Al 2 O 3 , Nb 2 O 5 , and ZrO 2 is used. preferable.
  • a noble metal such as Au, Ag, Cu, Pt can be used as the material of the scaffold 11.
  • the film thickness of the surface 11 is arbitrary, but it is preferably 0.1 nm or more and 10 nm or less in consideration of transmission of evanescent waves. Therefore, in the biomolecule-immobilized substrate shown in FIG.
  • the first linker molecule is selectively selected from metal oxides such as TiO 2 , Ta 2 O 5 , Al 2 O 3 , Nb 2 O 5 , and ZrO 2.
  • metal oxides such as TiO 2 , Ta 2 O 5 , Al 2 O 3 , Nb 2 O 5 , and ZrO 2.
  • a compound into which a phosphate group capable of binding is introduced may be used.
  • the biomolecule-immobilized substrate shown in FIG. 2 is obtained by immobilizing biomolecules using the first linker molecule and the second linker molecule described above, and a disc-shaped scaffold on one main surface of the substrate 13. 11 and fine particles as the fluorescence enhancer 12.
  • the fluorescence enhancer 12 is bonded through a second linker molecule, and a biomolecule 301 is fixed on the surface thereof.
  • the first surface 101 described above is the surface of the disk-shaped scaffold 11, and the second surface 102 is the surface 102 of the substrate 13.
  • the fluorescence enhancer 12 is a fine particle having a function of enhancing fluorescence generated in the vicinity.
  • the substrate 13 for example, a substrate made of an inorganic material such as glass or titania, a semiconductor such as silicon or GaAs, a metal such as copper, tantalum, or titanium, or an organic material such as epoxy resin or polyimide is used. You may select according to.
  • the fine particles of the fluorescence enhancer 12 are preferably noble metal nanoparticles such as Au, Pt, and Ag, but are not limited thereto, and compound semiconductors such as CdSe and CdS may be used.
  • the material of the scaffold 11 it is preferable to use a material different from that of the substrate 13, for example, a metal such as Ti, Ta, Al, Nb, and Zr.
  • the surface 101 has TiO 2 , Ta 2 O 5 , Al 2, respectively.
  • a first linker molecule that is a natural oxide film such as O 3 , Nb 2 O 5 , ZrO 2, and the like and capable of binding to the surface 101 may be used.
  • a metal oxide such as TiO 2 , Ta 2 O 5 , Al 2 O 3 , Nb 2 O 5 , or ZrO 2 may be used.
  • noble metals such as Au, Ag, Cu, and Pt can be used.
  • the film thickness of the scaffold 11 is arbitrary, but is preferably 0.1 nm or more and 10 nm or less in consideration of transmission of evanescent waves. Therefore, when the surface 101 is a metal oxide such as TiO 2 , Ta 2 O 5 , Al 2 O 3 , Nb 2 O 5 , ZrO 2 as the first linker molecule, TiO 2 , Ta 2 O 5 , A compound into which a phosphate group capable of selectively binding to a metal oxide such as Al 2 O 3 , Nb 2 O 5 , or ZrO 2 is introduced may be used.
  • the surface 101 is a noble metal or metal such as Au, Pt, Ir, Pd, Ru, Ni, Ti, Sn, Ag, Cu, Rh, and Al, Au, Pt, Ir, Pd, Ru, Ni, A compound into which a noble metal such as Ti, Sn, Ag, Cu, Rh and Al or a thiol group capable of binding to a metal is introduced may be used.
  • a noble metal such as Ti, Sn, Ag, Cu, Rh and Al or a thiol group capable of binding to a metal is introduced may be used.
  • FIG. 5 shows a manufacturing process flow chart of the biomolecule-fixed substrate shown in FIG.
  • a substantially circular scaffold 11 is produced on one main surface of the substrate 13 (FIG. 5A).
  • the substantially circular scaffold 11 can be manufactured by applying a conventionally known thin film forming / processing method.
  • this structure is immersed in a solution containing the first linker molecule, and the first linker molecule is selectively introduced into the top of the scaffold 11 (FIG. 5B). At this time, the first linker molecule selectively binds only to the surface of the scaffold 11 and does not adsorb to the surface of the substrate 13.
  • the second linker molecule selectively binds to the first linker molecule (FIG. 5C).
  • the first linker molecule and the second linker molecule may be bonded to each other by applying a solution containing the second linker molecule to one main surface of the structure.
  • a compound containing a latent reactive group is used as the second linker molecule, conditions are provided such that the latent reactive group such as electromagnetic waves and heat can bind to the hydrocarbon chain of the first linker molecule.
  • the scaffold 11 may be bound using a compound in which the first linker molecule and the second linker molecule are bound in advance.
  • adsorption inhibiting molecules for preventing nonspecific adsorption of biomolecules are immobilized on the surface of the substrate 13 to form an adsorption inhibiting layer 106 (FIG. 5D).
  • the fine particles of the fluorescence enhancement field 12 are immobilized via the second linker molecule (FIG. 5 (e)).
  • the biomolecule 301 is immobilized via the fluorescence enhancement field 12 (FIG. 5 (f)).
  • the area of the substantially circular scaffold 11 viewed from the plane is desirably smaller than the area occupied by one molecule of the biomolecule 301.
  • a biomolecule-immobilized substrate in which biomolecules are immobilized only in a desired region such as the surface of the substantially circular scaffold 11 (first surface 101) can be manufactured.
  • the biomolecule-immobilized substrate according to the present invention since the first linker molecule can be selectively introduced only into the first surface 101, the biomolecule is immobilized on other regions such as the surface of the substrate 13. Can be prevented. Accordingly, in the biomolecule fixing substrate shown in FIG. 2 as well, the biomolecules can be fixed only to the first surface 101 as in the biomolecule fixing substrate shown in FIG. Very good detection sensitivity can be achieved.
  • the biomolecule-immobilized substrate shown in FIG. 3 is obtained by immobilizing biomolecules using the first linker molecule and the second linker molecule described above, and has a substantially conical shape on one main surface of the substrate 13.
  • a fluorescence enhancer 12 is included.
  • the first surface 101 described above is the top surface of the substantially conical fluorescence enhancer 12, and the second surface 102 is the surface of the substrate 13.
  • the fluorescence enhancer 12 has a function of enhancing fluorescence generated at the top (first surface 101), and has a shape such that the cross section decreases toward the first surface 101 in order to amplify the enhancement function. It has become.
  • the fluorescence enhancer 12 itself is a region where biomolecules are immobilized. Therefore, in the biomolecule-immobilized substrate shown in FIG. 3, noble metals or metals such as Au, Pt, Ir, Pd, Ru, Ni, Ti, Sn, Ag, Cu, Rh and Al are used as the first linker molecule. A compound into which a thiol group capable of selectively binding is introduced may be used.
  • FIG. 6 shows a manufacturing process flow chart of the biomolecule-immobilized substrate shown in FIG.
  • the substantially cone-shaped fluorescence enhancer 12 is produced on one main surface of the substrate 13 (FIG. 6A).
  • the substantially cone-shaped fluorescence enhancer 12 can be produced by applying a conventionally known thin film formation / processing method.
  • this structure is immersed in a solution containing the first linker molecule, and the first linker molecule is selectively introduced into the top of the fluorescence enhancer 12 (FIG. 6B).
  • the first linker molecule selectively binds only to the top surface of the fluorescence enhancer 12 and does not adsorb to the surface of the substrate 13.
  • the second linker molecule selectively binds to the first linker molecule (FIG. 6C).
  • the first linker molecule and the second linker molecule may be bonded to each other by applying a solution containing the second linker molecule to one main surface of the structure.
  • a compound containing a latent reactive group is used as the second linker molecule, conditions are provided such that the latent reactive group such as electromagnetic waves and heat can bind to the hydrocarbon chain of the first linker molecule.
  • the scaffold 11 may be bound using a compound in which the first linker molecule and the second linker molecule are bound in advance.
  • adsorption inhibiting molecules for preventing nonspecific adsorption of biomolecules are fixed on the surface of the substrate 13 to form an adsorption inhibiting layer 106 (FIG. 6D). Thereafter, the biomolecule 301 is immobilized through the second linker molecule (FIG. 6 (e)). Further, it is desirable that the area of the substantially cone-shaped fluorescence enhancer 12 viewed from the top plane is smaller than the area occupied by one molecule of the biomolecule 301.
  • a biomolecule-immobilized substrate in which biomolecules are immobilized only in a desired region such as the top surface (first surface 101) of the substantially cone-shaped fluorescence enhancer 12 can be manufactured.
  • the biomolecule-immobilized substrate according to the present invention since the first linker molecule can be selectively introduced only into the first surface 101, the biomolecule is immobilized on other regions such as the surface of the substrate 13. Can be prevented. Therefore, in the biomolecule immobilization substrate shown in FIG. 3 as well, like the biomolecule immobilization substrate shown in FIGS. 1 and 2, the biomolecule can be immobilized only on the first surface 101, thereby preventing the generation of noise. And very good detection sensitivity can be achieved.
  • the biomolecule-immobilized substrates shown in FIGS. 1, 2 and 3 preferably immobilize a single biomolecule in a desired region (first surface 101).
  • a gene sequencing method based on single molecule-based sequencing (SBS (Sequencing by Synthesis) method or the like). That is, a nucleic acid synthesis reaction using a single DNA polymerase is performed using a fluorescently labeled nucleotide as a substrate, and fluorescence detection is performed for each single-base extension reaction using a predetermined nucleic acid fragment as a template. The sequence of the resulting nucleic acid fragment can be determined.
  • the DNA polymerase can be reliably fixed only in a predetermined region, so that noise from regions other than the reaction field can be prevented.
  • Example 1 The present embodiment will be described with reference to comparative examples as appropriate.
  • the results of introduction of biomolecules into will be described.
  • an alkyl phosphate having a phosphate group for binding to an alkyl chain and TiO 2 was used as the first linker molecule.
  • 1-dodecylphosphonic acid having carbon chain 12 was used as the alkyl phosphoric acid (see the following structural formula).
  • an alkyl phosphoric acid having a carbon chain of 12 is used, but it may be bonded to TiO 2 using a polymer chain such as Poly (vinyl phosphonic Acid).
  • a substrate processing method Specifically, a SiO 2 substrate having an Au film and a TiO 2 film was immersed in a solution in which 1-dodecylphosphonic acid was dissolved in a mixed solvent of heptane / isopropanol (v / v 99.5 / 0.5) for 48 hours. Thereafter, after washing with isopropanol, the amount of phosphorus adsorbed on the substrate surface was quantified using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS method) in order to evaluate the surface state of the substrate.
  • XPS method X-ray photoelectron spectroscopy
  • the amount of phosphorus adsorbed on the substrate surface before and after the treatment with 1-dodecylphosphonic acid was identified by XPS.
  • the integrated intensity of the peaks derived from P 2P on the Au film, TiO 2 film, and SiO 2 substrate were 0 cps and 530 cps, respectively. And 100 cps.
  • Biotin-dPEG3 TM -benzophenone (IRIS Biotech, see the following structural formula) was applied as a second linker molecule to the substrate treated with 1-Dodecylphosphonic Acid using a spin coater, and ultraviolet light (wavelength 365). nm) for 30 minutes to bond the benzophenone and the alkyl group on the substrate.
  • the compound which has a benzophenone group was used as a 2nd linker in a present Example, Photobiotin which has an azide group may be used.
  • the substrate was treated with 1-Dodecylphosphonic Acid as the first linker, and then Biotin-dPEG3 TM -benzophenone was bound to 1-Dodecylphosphonic Acid as the second linker.
  • the present invention is not limited to this. instead of shall, after prebound the 1-Dodecylphosphonic Acid and Biotin-dPEG3 TM -benzophenone, and purified using a 1-Dodecylphosphonic Acid of Biotin-dPEG3 TM -benzophenone bound, even if the substrate processing Good.
  • FIG. 7 (a) is a result obtained by imaging the surface of the TiO 2 film on SiO 2 substrate
  • FIG. 7 (b) results obtained by imaging the surface of the Au film on the surface and SiO 2 on the substrate of the SiO 2 substrate Is shown.
  • FIG. 7A a bright spot of 1 bright spot / ⁇ m 2 or more could be confirmed in the observation region in the TiO 2 film.
  • FIG. 7B only bright spots of 0.1 bright spot / ⁇ m 2 or less were observed from the surface of the SiO 2 substrate and the surface of the Au film.
  • the first linker molecule and the second linker molecule can be selectively introduced on the surface of the TiO 2 film, and are not introduced on the surface of the SiO 2 substrate and the surface of the Au film. It can be understood that the fixation was possible only on the surface of the TiO 2 film.
  • Example 2 the Au as fluorescence enhancing material 12 in the biomolecule substrate having the structure shown in FIG. 2 in the same manner as in Example 1, TiO 2 as a scaffold 11, consider the case of using the SiO 2 on the substrate 13, these The results of selectively introducing biomolecules on the three types of surfaces will be described.
  • poly (vinyl phosphonic acid) having an alkyl chain as the main chain and a phosphate group for bonding to TiO 2 in the side chain was used.
  • polyvinyl phosphate having a molecular weight of 24,000 was used (see the following structural formula).
  • Poly (vinyl phosphonic acid) having a molecular weight of 24,000 was used, but the present invention is not particularly limited, and Poly (vinyl phosphonic acid) having a larger molecular weight or smaller molecular weight may be used.
  • a substrate processing method Specifically, a SiO 2 substrate having an Au film and a TiO 2 film was immersed at 90 ° C. for 5 minutes in an aqueous solution in which Poly (vinyl phosphonic acid) was dissolved in ultrapure water so as to be 2 wt%. Thereafter, after washing with ultrapure water, the amount of phosphorus adsorbed on the surface of the substrate was quantified using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS method) in order to evaluate the surface state of the substrate.
  • XPS method X-ray photoelectron spectroscopy
  • the integrated intensity of the peak derived from P 2P in the Au film, TiO 2 film and SiO 2 substrate was 460 cps, 1500 cps and 0 cps.
  • EZ-Link TFPA-PEG 3 -Biotin which is a photobiotin having an azide group as a second linker molecule on a substrate subjected to Poly (vinyl phosphonic acid) treatment (Thermo-Pierce, see the following structure) was applied with a spin coater and irradiated with ultraviolet light (wavelength 365 nm) for 30 minutes to bond the benzophenone and the alkyl group on the substrate.
  • Poly (vinyl phosphonic acid) treatment Thermo-Pierce, see the following structure
  • ultraviolet light wavelength 365 nm
  • the compound which has an azide group was used as a 2nd linker in a present Example, you may use the biotin compound which has a benzophenone group.
  • the substrate was treated with Poly (vinyl phosphonic acid) as the first linker, and then Photobiotin was bonded to Poly (vinyl phosphonic acid) as the second linker.
  • the present invention is particularly limited to this. Instead, the substrate may be subjected to purification after poly (vinyl phosphonic acid) and Photobiotin are bonded in advance, and then the substrate is processed using Poly (vinyl phosphonic acid) bonded to Photobiotin.
  • Alexa Fluor (registered trademark) 532 which is a fluorescent dye having streptavidin, is dissolved in a weakly basic carbonate buffer, and the above-described SiO 2 substrate having an Au film and a TiO 2 film is immersed therein. Then, biotin contained in the second linker molecule introduced on the substrate surface and streptavidin contained in the fluorescent dye were combined to fix the fluorescent dye on the substrate. Thereafter, excess Alexa Fluor 532 was removed by washing with ultrapure water. Then, a fluorescence observation of the SiO 2 substrate surface having an Au film and a TiO 2 film was measured bright points derived fluorescence. The result is shown in FIG.
  • FIG. 8 (a) is the result obtained by imaging the surface of the TiO 2 film on SiO 2 substrate
  • FIG. 8 (b) results obtained by imaging the surface of the Au film on the surface and SiO 2 on the substrate of the SiO 2 substrate Is shown.
  • FIG. 8A a bright spot of 1 bright spot / ⁇ m 2 or more could be confirmed in the observation region in the TiO 2 film.
  • FIG. 8B only bright spots of 0.1 bright spot / ⁇ m 2 or less were observed from the surface of the SiO 2 substrate and the surface of the Au film.
  • the first linker molecule and the second linker molecule can be selectively introduced on the surface of the TiO 2 film, and are not introduced on the surface of the SiO 2 substrate and the surface of the Au film. It can be understood that the fixation was possible only on the surface of the TiO 2 film.
  • Comparative Example 1 In Comparative Example 1, the Au film and TiO 2 were used as the first linker molecule in the same manner as in Example 1 except that aminoalkyl phosphate having an amino group and a phosphate group for bonding to TiO 2 at the terminal was used. The first linker molecule was introduced into the SiO 2 substrate having the film. In this comparative example, specifically, 3-aminopropylphosphonic acid consisting of carbon chain 3 was used as the aminoalkyl phosphoric acid. An SiO 2 substrate having an Au film and a TiO 2 film was immersed in a solution in which 3-Aminopropylphosphonic acid was dissolved in ultrapure water for 48 hours. Thereafter, after washing with ultrapure water, the amount of phosphorus adsorbed on the surface of the substrate was quantified using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS method) in order to evaluate the surface state of the substrate.
  • XPS method X-ray photoelectron spectroscopy
  • the integrated intensity of the peak derived from P 2P in the Au film, TiO 2 film and SiO 2 substrate was 140 cps, 640 cps and It was 270 cps.
  • the first linker molecule used in this comparative example has an amino group in a part of the molecular structure, it cannot be selectively bonded to the TiO 2 film, and the surface of the Au film or the SiO 2 substrate It was confirmed that it was also bonded to the surface of In this case, when the biomolecule is immobilized via the first linker molecule, it can be predicted that the biomolecule is also immobilized on the surface of the Au film or the surface of the SiO 2 substrate.
  • the present invention can be applied to a substrate on which biomolecules such as proteins and nucleic acids are immobilized. Since the present invention is characterized by the manner of immobilizing biomolecules, it can be applied to all conventionally known substrates (for example, DNA microarrays and protein chips).

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Abstract

　基板における所定の領域に生体分子を選択的に固定する。　少なくとも第１の表面及び第２の表面を有する基板と；炭化水素鎖と当該炭化水素鎖の一方末端に上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基とを有し、上記官能基を介して上記第１の表面に結合した第１のリンカー分子と；上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる反応基を有し、上記反応基と上記炭化水素鎖との結合を介して第１のリンカー分子と結合した第２のリンカー分子と；上記第２のリンカー分子を介して結合した生体分子とを備える生体分子固定基板。

Description

生体分子固定基板及びその製造方法
　本発明は、基板の所定の領域にリンカー分子を介して生体分子を固定した生体分子固定基板及びその製造方法に関する。
　近年、ヒトゲノムＤＮＡの解読がほぼ終了したことにより、遺伝子の機能を解明する研究が盛んに行われており、生体内の遺伝子やたんぱく質を特異的かつ網羅的に検出する必要があり、遺伝子・タンパク質検出技術の開発が世界的に進められている。一方で、生体内に侵入した病原菌やウイルスを、遺伝子やタンパク質レベルで特定する技術も従来から検討されており、実用化されつつある。このような目的に応じて、特定の遺伝子やタンパク質などの生体分子を検出するための手段として、種々のバイオセンサが用いられている。最も一般的なバイオセンサの構造は、生体分子を細くするプローブ分子が固体表面に固定化されたものである。核酸を補足する場合には、プローブ分子として主に核酸が用いられ、タンパク質を補足する場合には、プローブ分子として主にタンパク質が用いられる。基板にプローブ分子を固定したバイオセンサのメリットは、同一の基板に、多種類のプローブ分子をスポッティングやインクジェットなどの方式を用いて固定できることである。このバイオセンサ基板を用いれば、多種類の生体分子に対する網羅的な解析を一度に迅速に行うことが出来る。そして基板表面を利用したバイオセンサの代表例が、ＤＮＡマイクロアレイやプロテインチップのような生体分子検出素子である。
　最近、DNAマイクロアレイで行われているような遺伝子発現解析の精度の大幅向上を狙って、特許文献１ないし非特許文献１に示されているように、ポリヌクレオチドの単一分子アレイを用いた単一分子ベースのシーケンシング(SBS(Sequencing by Synthesis)法等)による遺伝子配列決定方法が開示されている。この方法では、基板表面に適当なプライマーで修飾された検体のポリヌクレオチドを固定し、これを鋳型としてポリメラーゼによる一塩基ずつの伸長反応を実行し、検体ポリヌクレオチドの相補鎖を形成させるものである。この一塩基伸長の個々のステップでは、異なる４種のヌクレオチドにおけるプリン骨格、ピリミジン骨格又は3リン酸のリン酸基の末端部に蛍光色素をそれぞれ導入しておき、各単一分子について伸長ステップ毎に蛍光検出を行うことで、導入されたヌクレオチドを識別する。このステップを繰り返すことによって、単一ポリヌクレオチド固定サイトごとのシーケンスを読み取って、検体の配列情報を網羅的に取得する。ここでは、高いS/N比で検出し、シーケンシング時の配列決定正確性を向上させることが重要となる。この技術では、膨大な単一ポリヌクレオチド固定サイトからの蛍光の情報をCCDカメラで検出するため、そのCCDカメラの画素サイズに対応してポリヌクレオチド分子の平均的な固定密度を設定している。即ち、出来るだけ一個の画素で一個のポリヌクレオチド上からの蛍光信号を取り込むようにポリヌクレオチドの平均固定密度あるいは画素の解像度を調整している。一画素の大きさは検出光学系の空間分解能を考慮するとサブミクロン角以上となる。
　上述したようなシーケンシングを用いて少量のDNAサンプルを検出するために、蛍光検出感度を上げることも必要が必要となる。計測対象ではない蛍光性物質や発光性物質が蛍光検出領域に侵入すると、その蛍光または発光が検出されることになる。特に、遊離の蛍光体や試料溶液中の不純物質等が、エバネッセント場境界平面上に非特異的に吸着すると、これらの非特異吸着物質からの蛍光または発光や散乱光と、計測対象からの蛍光または発光との区別が困難になる。そのため、蛍光検出感度の低下や分析精度の低下を引き起こす結果となる恐れがある。これらの非特異吸着物質は、基板表面のコーティング等によってある程度防止することが可能であるが、完全に回避することは不可能である。そこで、蛍光検出感度を向上させるために、蛍光増強を用いる方法が非特許文献２に報告されている。ここでは、プローブ分子であるDNAを修飾した銀ナノ粒子を基板に固定し、蛍光標識された検体中の分子と反応させている。反応量を検出するために励起光を照射すると、銀ナノ粒子の自由電子が局在プラズモン共鳴を起こし、蛍光が増強する。この現象を用いることで感度を向上することができるとしている。
　また、基板に等間隔でグリッド状に蛍光増強場を配置し、ポリメラーゼ1分子を蛍光増強場に固定化し、ＤＮＡの伸長反応を行う方法がある。エバネッセントにより励起された蛍光は蛍光増強場により増強されるため、非特異的な吸着があっても、蛍光検出のＳ／Ｎ比またはＳ／Ｂ比が十分高くなる。しかしながら、金属微粒子の大きさにはバラツキが生じるため、蛍光増強効果にも金属微粒子1個1個に違いが生じる可能性があり、検出精度に問題が残る。また、金属微粒子に液相法を用いて、プローブ分子1個を固定するが、固定する箇所がランダムに決まるため、金属微粒子と基板との間に固定化される可能性があり、ポリメラーゼの伸長反応を阻害する可能性がある。
　蛍光増強場をグリッド状に設ける場合、蛍光増強場として貴金属の構造体をリソグラフィー技術により形成することで、蛍光増強場のバラツキを低減できる可能性がある。この際、蛍光増強場に直接プローブ分子を選択的に固定化する方法と、プローブ分子を固定する足場として蛍光増強場および基板の組成と異なる組成の金属表面を形成させ、プローブ分子を選択的に固定化する方法が考えられる。例えば、非特許文献３において、生体分子であるアビジンを配置する位置にTiO2からなる金属酸化物表面を形成し、他のSiO2(石英)表面には非特異吸着防止膜を形成する方法が示されている。この場合、TiO2からなる金属酸化物表面をプローブ分子の足場として導入すれば、選択的に生体分子を蛍光増強場に導入できるものと考えられる。
米国特許　第６，７８７，３０８号
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 100(7), p3960, 2003 Biochem. Biophys. Res. Comm. 306, p213, 2003 Chem. Mater. 16, p5670, 2004
　しかしながら、非特許文献３の方法においてはアビジンが物理的に吸着しただけの状態であり、結合力に乏しくデバイスに適用した場合には、伸長反応中などの操作中に脱離する可能性がある。そこで、検出対象となるDNA分子を化学結合で固定化する必要がある。例えば、アビジンの固定化にはビオチンとの特異的な結合を用いるのが一般的である。ビオチンを化学結合で固定化するためには、蛍光増強場にアミノ基を導入しビオチンのカルボキシル基とカップリング反応により結合すればよい。しかしながら、アミノ基を導入するためにアミノ基を末端に有する化合物を蛍光増強場に導入しようとすると、アミノ基が蛍光増強場以外にも吸着してしまう。
　以上のように、基板における所定の領域に選択的に生体分子を固定しようとする場合、生体分子を固定するための足場（リンカー分子とも呼ぶ）を当該領域に選択的に導入することが困難であるといった問題があった。そこで、本発明は、基板における所定の領域に生体分子を選択的に固定することができる生体分子固定化基板の製造方法を提供し、当該方法により製造され、所定の領域に生体分子を選択的に固定した生体分子固定基板を提供することを目的とする。
　前記目的を達成した本発明は、以下を包含する。
　（１）少なくとも第１の表面及び第２の表面を有する基板と、炭化水素鎖と、当該炭化水素鎖の一方末端、又は側鎖に上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基とを有し、上記官能基を介して上記第１の表面に結合した第１のリンカー分子と、上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる反応基を有し、上記反応基と上記炭化水素鎖との結合を介して第１のリンカー分子と結合した第２のリンカー分子と、上記第２のリンカー分子を介して結合した生体分子とを備える生体分子固定基板。
　（２）上記第１の表面は金属酸化物であり、上記第２の表面は貴金属であることを特徴とする（１）記載の生体分子固定基板。
　（３）上記第１の表面は金属酸化物であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はリン酸基及び/又はシラノール基であることを特徴とする（１）記載の生体分子固定基板。
　（４）上記第１の表面は自然酸化膜を有する金属であり、上記第２の表面は二酸化ケイ素あるいはサファイアであることを特徴とする（１）記載の生体分子固定基板。
　（５）上記第１の表面は自然酸化膜を有する金属であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はリン酸基及び/又はシラノール基であることを特徴とする（１）記載の生体分子固定基板。
　（６）上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖が化１及び/又は化２のアルキル基末端にリン酸基及び/又はシラノール基を有することを特徴とする（３）又は（５）記載の生体分子固定基板。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　（式中、mは２～２０の整数である。また、Xの少なくとも１つはアルコキシ、または塩素であり、メチル、又はエチルを含んでもよい）
　（７）上記第１のリンカー分子の炭素水素鎖が化３の側鎖にリン酸基を有する高分子鎖であることを特徴とする（３）又は（５）記載の生体分子固定基板。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　（式中、ｎは1以上の整数）
　（８）上記リン酸基を有する高分子鎖の数平均分子量が、1,000～500,000であることを特徴とする（７）記載の生体分子固定基板。
　（９）上記第１の表面は貴金属であり、上記第２の表面は二酸化ケイ素であることを特徴とする（１）記載の生体分子固定基板。
　（１０）上記第１の表面は貴金属であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はチオール基であることを特徴とする（１）記載の生体分子固定基板。
　（１１）上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖が化４のアルキル基末端にチオール基を有することを特徴とする（１０）記載の生体分子固定基板。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（式中、mは２～２０の整数である）
　（１２）上記第２のリンカー分子における反応基は、上記炭化水素鎖と結合しうる潜伏性反応基であることを特徴とする（１）記載の生体分子固定基板。
　（１３）上記潜伏性反応基は、アントラチオン基、アントラキノン基、ベンゾフェノン基、アジド基及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の光反応性化合物であることを特徴とする（１２）記載の生体分子固定基板。
　（１４）上記第２のリンカー分子は、上記生体分子又は上記生体分子に結合した反応基と選択的に結合しうる反応基を更に有していることを特徴とする（１）記載の生体分子固定基板。
　（１５）上記第２のリンカー分子に含まれるビオチンと上記生体分子に導入されるビオチンとが、アビジンを介して結合していることを特徴とする（１）記載の生体分子固定基板。
　（１６）少なくとも第１の表面及び第２の表面を有する基板に対して、炭化水素鎖と当該炭化水素鎖の一方末端、又は側鎖に上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基とを有する第１のリンカー分子を接触させる工程と、少なくとも、上記第１のリンカー分子が結合した上記第１の表面に対して、上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる反応基を有する第２のリンカー分子を接触させる工程と、生体分子を接触させることで、当該生体分子を上記第２のリンカー分子を介して結合させる工程とを含む、生体分子固定基板の製造方法。
　（１７）上記第２のリンカー分子を接触させる工程の後、少なくとも上記第２のリンカー分子が結合した上記第１の表面以外の領域に生体分子の吸着を阻害する吸着阻害分子を接触させ、当該領域に吸着阻害層を形成する工程を更に含むことを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（１８）上記第１の表面は金属酸化物であり、上記第２の表面は貴金属であることを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（１９）上記第１の表面は金属酸化物であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はリン酸基及び/又はシラノール基であることを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（２０）上記第１の表面は自然酸化膜を有する金属であり、上記第２の表面は二酸化ケイ素あるいはサファイアであることを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（２１）上記第１の表面は自然酸化膜を有する金属であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はリン酸基及び/又はシラノール基であることを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（２２）上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖が化５及び/又は化６のアルキル基末端にリン酸基及び/又はシラノール基を有することを特徴とする（１９）又は（２１）記載の生体分子固定基板の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　（式中、mは２～２０の整数である。また、Xの少なくとも１つはアルコキシ、または塩素であり、メチル、又はエチルを含んでもよい）
　（２３）上記第１のリンカー分子の炭素水素鎖が化７の側鎖にリン酸基を有する高分子鎖であることを特徴とする（１９）又は（２１）記載の生体分子固定基板の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　（式中、ｎは整数）
　（２４）上記リン酸基を有する高分子鎖の数平均分子量が、1,000～500,000であることを特徴とする（２３）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（２５）上記第１の表面は貴金属であり、上記第２の表面は二酸化ケイ素であることを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（２６）上記第１の表面は貴金属であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はチオール基であることを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（２７）上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖が化８のアルキル基末端にチオール基を有することを特徴とする（２６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式中、mは２～２０の整数である）
　（２８）上記第２のリンカー分子における反応基は、上記炭化水素鎖と結合しうる潜伏性反応基であることを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（２９）上記潜伏性反応基は、アントラチオン基、アントラキノン基、ベンゾフェノン基、アジド基及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の光反応性化合物であることを特徴とする（２８）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（３０）上記第２のリンカー分子は、上記生体分子又は上記生体分子に結合した反応基と選択的に結合しうる反応基を更に有していることを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　（３１）上記第２のリンカー分子に含まれるビオチンと上記生体分子に導入されるビオチンとが、アビジンを介して結合していることを特徴とする（１６）記載の生体分子固定基板の製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-181743号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明に係る生体分子固定基板においては、基板上の所定の領域に選択的に生体分子を固定しているため、生体分子や生体分子を固定するためのリンカー分子の非特異的な吸着によるノイズ等を大幅に低減することができる。また、本発明に係る生体分子固定基板の製造方法によれば、基板上の所定の領域に選択的に生体分子を固定することができ、検出感度等に優れた生体分子固定基板を製造することができる。
本発明を適用した生体分子固定基板の一例を示す要部平面図（ａ）及び要部断面図（ｂ）である。 本発明を適用した生体分子固定基板の他の例を示す要部平面図（ａ）及び要部断面図（ｂ）である。 本発明を適用した生体分子固定基板の他の例を示す要部平面図（ａ）及び要部断面図（ｂ）である。 図１に示した生体分子固定基板を製造するプロセスを示すフロー図である。 図２に示した生体分子固定基板を製造するプロセスを示すフロー図である。 図３に示した生体分子固定基板を製造するプロセスを示すフロー図である。 SiO2基板上のTiO2膜の表面における蛍光観察結果を示す写真（ａ）及びTiO2基板の表面及びSiO2基板上のAu膜の表面における蛍光観察結果を示す写真（ｂ）である。 SiO2基板上のTiO2膜の表面における蛍光観察結果を示す写真（ａ）及びTiO2基板の表面及びSiO2基板上のAu膜の表面における蛍光観察結果を示す写真（ｂ）である。
　以下、本発明に係る生体分子固定基板及びその製造方法について図面を参照しつつ詳細に説明する。
　本発明に係る生体分子固定基板は、例えば、図１～３に示すように、少なくとも第１の表面１０１及び第２の表面１０２を有する基板１３を備えている。ここで、第１の表面１０１とは、リンカー分子を介して生体分子を固定する領域を意味している。第２の表面１０２とは、生体分子を固定しない領域を意味している。ここで、生体分子とは、特に限定されないが、抗体や酵素等のタンパク質分子を例示することができる。
　本発明に係る生体分子固定基板においては、炭化水素鎖と、当該炭化水素鎖の一方末端、又は側鎖に上記第１の表面１０１と選択的に結合しうる官能基とを有する第１のリンカー分子からなる化合物層２０１を有している。第１のリンカー分子は、一方末端に官能基を有しており、この官能基を介して上記第１の表面１０１に結合することができる。第１のリンカー分子における他方末端及び炭化水素鎖は、詳細を後述する第２のリンカー分子と炭化水素鎖との結合を阻害せず、第２の表面１０２と結合しないかぎり、上記官能基と同じ又は異なる官能基を有していても良い。
　化合物層２０１は、第１の表面１０１上に選択的に形成され、第２の表面１０２等の第１の表面１０１以外の領域上には形成されない。例えば、第１の表面１０１がTiO2、Ta2O5、Al2O3、Nb2O5、ZrO2等の金属酸化物からなる場合、第１のリンカー分子における官能基としては、例えばリン酸基及び/又はシラノール基を使用することができる。第１の表面１０１がAu、Ag、Cu及びPtなどの貴金属からなる場合、第１のリンカー分子における官能基としては、例えばチオール基を使用することができる。このように、第１の表面１０１の材質に応じて第１のリンカー分子における官能基を適宜選択することで、第１の表面１０１に選択的に化合物層２０１を形成することができる。
　また、第１のリンカー分子における炭化水素鎖とは、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基及びヘキシル基等のアルキル基や、アルケニル基、アルキニル基を基本骨格として、上記第２の表面１０２に対して吸着能を有しない構造を有する。また、炭化水素鎖としては、好ましくは炭素数が２～２０、より好ましくは炭素数が５～１５、更に好ましくは炭素数が１２のものを使用するが、これらに限定されるものではなく、高分子化合物のような長鎖の炭化水素鎖を有する構造であってもよい。高分子化合物を用いる場合、数平均分子量が好ましくは1,000～500,000、より好ましくは5,000～200,000、さらに好ましくは10,000～100,000のものを使用するが、これらに限定されるものではない。また、炭化水素鎖には、上記基本骨格に対してヒドロキシル基、フェニル基、クロロアルキル基、イソシアネート基、もしくはエポキシ基等の官能基を有するものも含まれる。
　また、本発明に係る生体分子固定基板においては、上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる反応基を有する第２のリンカー分子からなる化合物層２０２を有している。上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる反応基としては、例えば、光反応性官能基及び熱化学反応性官能基等の潜伏性反応基を使用することが好ましい。特に上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる反応基としては、光反応性官能基を使用することが好ましい。光反応性官能基としては、例えば、光反応性アリールケトン、又はアジド基を有する化合物が望ましい。光反応性アリールケトンとしては、具体的にはアントラチオン基又はその誘導体、アントラキノン基又はその誘導体、ベンゾフェノン基又はその誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　さらに、本発明に係る生体分子固定基板において、生体分子は、第２のリンカー分子に直接的又は間接的に結合している。すなわち、上述した第２のリンカー分子は、上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる反応基を生体分子に導入した構造であってもよいし、生体分子又は生体分子に導入された反応基と結合しうる反応基を導入した構造であってもよい。生体分子と結合可能な反応基としては、特に限定されないが、ビオチン、アビジン及びエポキシド等が挙げられるが、さらに好ましくは生体分子と相補的に結合しうる官能基が望ましい。そのような例としては、核酸／相補的核酸、ペプチド核酸／核酸、酵素／基質、受容体／エフェクター、レクチン／糖、抗体／抗原、アビジン／ビオチンまたはストレプトアビジン／ビオチンの相互作用に基づく結合が挙げられる。すなわち、例えば、生体分子として核酸を固定する際には、上記第２のリンカー分子に反応基として相補的核酸を導入する。また、例えば、生体分子として抗体を固定する際には、上記第２のリンカー分子に反応基として抗原を導入する。さらに、例えば生体分子としてタンパク質を固定する際には、当該タンパク質分子にアビジンを導入し、第２のリンカー分子に反応基としてビオチンを導入する、若しくは、当該タンパク質及び上記第２のリンカー分子に反応基としてビオチンを導入し、アビジンを介して当該タンパク質と第２のリンカー分子とを結合しても良い。
　図１に示す生体分子固定基板は、上述した第１のリンカー分子と第２のリンカー分子を使用して生体分子を固定したものであり、基板１３の一主面に足場１１と、足場１１を挟み込むように形成された蛍光増強体１２と有している。上述した第１の表面１０１は足場１１の表面であり、第２の表面１０２は蛍光増強体１２の表面である。蛍光増強体１２は、第１の表面１０１付近において生じた蛍光を増強する機能を有し、当該増強機能を増幅するため第１の表面１０１に向かって縦断面が減少するような形状となっている。
　ここで、基板１３の材質としては、特に限定されるものではなく、使用する励起光が透過すればよく、また蛍光増強体１２及び足場１１と異なる材質を用いるのが望ましい。基板１３としては、例えばガラスやチタニア等の無機物、シリコンやGaAsのような半導体、銅、タンタル、チタンのような金属、さらには、エポキシ樹脂やポリイミドのような有機物からなる基板を目的に応じて選択すればよい。
　蛍光増強体１２の材質としては、金属、金属の合金、あるいは金属の積層体が好ましい。蛍光増強体１２の材質としては、例えばAu、Pt、Ir、Pd、Ru、Ni、Ti、Sn、Ag、Cu、Rh及びAlを挙げることができる。なお、蛍光増強体の構造は、図示した構造に限定されるものではなく、検出する蛍光波長の光を増強できればよく、例えば、ナノ粒子のような球状であっても良い。
　足場１１の材質としては、基板１３及び蛍光増強体１２とは異なる材質、例えば、TiO2、Ta2O5、Al2O3、Nb2O5、ZrO2などの金属酸化物を用いることが好ましい。あるいは、蛍光増強体１２にTi、Ni、Al、Sn、Pd等を使用した場合、足場１１の材質としてはAu、Ag、Cu、Ptなどの貴金属を使用することもできる。表面１１の膜厚は任意であるが、エバネッセント波の透過を考慮し、0.1 nm以上、10 nm以下であることが望ましい。
　図１に示した生体分子固定基板は、例えば図４に示す製造プロセスフロー図により製造することができる。まず、基板１３の一主面上に足場１１及び蛍光増強体１２を作製する。これら足場１１及び蛍光増強体１２は、通常の薄膜形成・加工技術を適用して所望の形状及び寸法となるように作製することができる。次に、この構造体を第１のリンカー分子を含む溶液に浸漬すると、第１のリンカー分子は足場１１の表面（第１の表面１０１）のみに結合し、足場１１上に化合物層２０１が形成される（図４（ｂ））。次に、第２のリンカー分子を含む溶液に構造体を浸漬すると、第２のリンカー分子は第１のリンカー分子と選択的に結合し、化合物層２０２が形成される（図４（ｃ））。なお、上記構造体の一主面に第２のリンカー分子を含む溶液を塗布することで、第１のリンカー分子と第２のリンカー分子とを結合させても良い。このとき、第２のリンカー分子として潜伏性反応基を含む化合物を使用する場合には、電磁波や熱といった潜伏性反応基が第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる条件を与える。また、予め第１のリンカー分子と第２のリンカー分子とを結合させた化合物を用いて、足場１１に結合させてもよい。次に、基板１３の表面や蛍光増強体１２の表面に生体分子の非特異的な吸着を防止するための吸着阻害分子を固定し、吸着阻害層１０４、１０５を形成する（図４（ｄ））。その後、第２のリンカー分子を介して、生体分子３０１を固定化する（図４（ｅ））。また、足場１１の平面上からみた面積は生体分子３０１の１分子辺りの分子占有面積よりも大きいが、２分子の占有面積よりも小さいことが望ましい。
　以上のようにして、足場１１の表面（第１の表面１０１）といった所望の領域のみに生体分子を固定した生体分子固定基板を製造することができる。特に、本発明に係る生体分子固定基板においては、第１のリンカー分子を第１の表面１０１のみに選択的に導入することができるため、蛍光増強体１２や基板１３といった他の領域への生体分子の固定を防止することができる。従来、生体分子の固定にリンカー分子として使用されていたアミノプロピルリン酸は、アミノプロピルリン酸に含まれるアミノ基がTiO2といった金属酸化物の表面や、Auといった貴金属表面、更にはSiO2といった無機物表面にも吸着するため、図１に示したような構造体に対して用いた場合には蛍光増強体１２や基板１３の表面にも生体分子が固定されることとなる。この場合、生体分子を用いた各種反応について蛍光を利用して検出しようとすると、蛍光増強体１２や基板１３の表面においても同反応が進行してノイズの原因となり感度低下が大きな問題となる。ところが、本発明に係る生体分子固定基板においては、足場１１の表面（第１の表面１０１）のみに生体分子を固定できるため、ノイズの発生を防止することができ非常に優れた検出感度を達成することができる。
　図１に示す生体分子固定基板は、上述した第１のリンカー分子と第２のリンカー分子を使用して生体分子を固定したものであり、基板１３の一主面に足場１１と、足場１１を挟み込むように形成された蛍光増強体１２と有している。上述した第１の表面１０１は足場１１の表面であり、第２の表面１０２は蛍光増強体１２の表面である。蛍光増強体１２は、第１の表面１０１において生じた蛍光を増強する機能を有し、当該増強機能を増幅するため第１の表面１０１に向かって縦断面が減少するような形状となっている。
　ここで、基板１３の材質としては、特に限定されるものではなく、使用する励起光が透過すればよく、また蛍光増強体１２及び足場１１と異なる材質を用いるのが望ましい。基板１３としては、例えばガラスやチタニア等の無機物、シリコンやGaAsのような半導体、銅、タンタル、チタンのような金属、さらには、エポキシ樹脂やポリイミドのような有機物からなる基板を目的に応じて選択すればよい。
　蛍光増強体１２の材質としては、金属、金属の合金、あるいは金属の積層体が好ましい。蛍光増強体１２の材質としては、例えばAu、Pt、Ir、Pd、Ru、Ni、Ti、Sn、Ag、Cu、Rh及びAlを挙げることができる。なお、蛍光増強体の構造は、図示した構造に限定されるものではなく、検出する蛍光波長の光を増強できればよく、例えば、ナノ粒子のような球状であっても良い。
　足場１１の材質としては、基板１３及び蛍光増強体１２とは異なる材質、例えば、TiO2、Ta2O5、Al2O3、Nb2O5、ZrO2などの金属酸化物を用いることが好ましい。あるいは、蛍光増強体１２にTi、Ni、Al、Sn、Pd等を使用した場合、足場１１の材質としてはAu、Ag、Cu、Ptなどの貴金属を使用することもできる。表面１１の膜厚は任意であるが、エバネッセント波の透過を考慮し、0.1 nm以上、10 nm以下であることが望ましい。したがって、図１に示した生体分子固定基板においては、第１のリンカー分子として、TiO2、Ta2O5、Al2O3、Nb2O5、ZrO2などの金属酸化物と選択的に結合しうるリン酸基が導入された化合物を使用するとよい。
　また図２に示した生体分子固定基板は、上述した第１のリンカー分子と第２のリンカー分子を使用して生体分子を固定したものであり、基板１３の一主面に円板形の足場１１を有し、かつ蛍光増強体１２として微粒子を有している。蛍光増強体１２は第２のリンカー分子を介して結合しており、さらにその表面には生体分子３０１が固定されている。上述した第１の表面１０１は円板形の足場１１の表面であり、第２の表面１０２は基板１３の表面１０２である。蛍光増強体１２は、付近に生じた蛍光を増強する機能を有する微粒子である。
　ここで、基板１３としては、例えばガラスやチタニア等の無機物、シリコンやGaAsのような半導体、銅、タンタル、チタンのような金属、さらには、エポキシ樹脂やポリイミドのような有機物からなる基板を目的に応じて選択すればよい。
　蛍光増強体１２の微粒子としては、Au、Pt、Agなどの貴金属ナノ粒子が好ましいが、これに限定されるものではなく、CdSe、CdSなどの化合物半導体を用いてもよい。
　足場１１の材質としては、基板１３とは異なる材質、例えば、Ti、Ta、Al、Nb、Zrなどの金属を用いることが好ましく、その場合表面１０１はそれぞれTiO2、Ta2O5、Al2O3、Nb2O5、ZrO2などの自然酸化膜であり、表面１０１と結合可能な第1のリンカー分子を使用すればよい。あるいは、TiO2、Ta2O5、Al2O3、Nb2O5、ZrO2などの金属酸化物を用いればよい。また、Au、Ag、Cu、Ptなどの貴金属を使用することもできる。足場１１の膜厚は任意であるが、エバネッセント波の透過を考慮し、0.1 nm以上、10 nm以下であることが望ましい。したがって、第１のリンカー分子として、表面１０１がTiO2、Ta2O5、Al2O3、Nb2O5、ZrO2などの金属酸化物である場合は、TiO2、Ta2O5、Al2O3、Nb2O5、ZrO2などの金属酸化物と選択的に結合しうるリン酸基が導入された化合物を使用するとよい。また、表面１０１がAu、Pt、Ir、Pd、Ru、Ni、Ti、Sn、Ag、Cu、Rh及びAl等の貴金属又は金属である場合は、Au、Pt、Ir、Pd、Ru、Ni、Ti、Sn、Ag、Cu、Rh及びAl等の貴金属又は金属と結合しうるチオール基が導入された化合物を使用するとよい。
　図２に示した生体分子固定基板の製造プロセスフロー図を図５に示す。先ず、基板１３の一主面に略円形状の足場１１を作製する（図５（ａ））。略円形の足場１１は、従来公知の薄膜形成・加工法を適用して作製することができる。次に、この構造体を第１のリンカー分子を含む溶液に浸漬し、足場１１の頂部に選択的に第１のリンカー分子を導入する（図５（ｂ））。このとき、第１のリンカー分子は、足場１１の表面にのみ選択的に結合し、基板１３の表面に対しては吸着しない。次に、第２のリンカー分子を含む溶液に構造体を浸漬すると、第２のリンカー分子は第１のリンカー分子と選択的に結合する（図５（ｃ））。なお、上記構造体の一主面に第２のリンカー分子を含む溶液を塗布することで、第１のリンカー分子と第２のリンカー分子とを結合させても良い。このとき、第２のリンカー分子として潜伏性反応基を含む化合物を使用する場合には、電磁波や熱といった潜伏性反応基が第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる条件を与える。また、予め第１のリンカー分子と第２のリンカー分子とを結合させた化合物を用いて、足場１１に結合させてもよい。次に、基板１３の表面に生体分子の非特異的な吸着を防止するための吸着阻害分子を固定し、吸着阻害層１０６を形成する（図５（ｄ））。その後、第２のリンカー分子を介して、蛍光増強場１２の微粒子を固定化する（図５（ｅ））。さらに、蛍光増強場１２を介して生体分子３０１を固定化する（図５（ｆ））。また、略円形の足場１１の平面上からみた面積は生体分子３０１の１分子辺りの分子占有面積よりも小さいことが望ましい。
　以上のようにして、略円形の足場１１の表面（第１の表面１０１）といった所望の領域のみに生体分子を固定した生体分子固定基板を製造することができる。特に、本発明に係る生体分子固定基板においては、第１のリンカー分子を第１の表面１０１のみに選択的に導入することができるため、基板１３の表面といった他の領域への生体分子の固定を防止することができる。したがって、図２に示した生体分子固定基板においても、図１に示した生体分子固定基板と同様に、第１の表面１０１のみに生体分子を固定できるため、ノイズの発生を防止することができ非常に優れた検出感度を達成することができる。
　一方、図３に示した生体分子固定基板は、上述した第１のリンカー分子と第２のリンカー分子を使用して生体分子を固定したものであり、基板１３の一主面に略円錐形の蛍光増強体１２を有している。上述した第１の表面１０１は略円錐形の蛍光増強体１２における頂部の表面であり、第２の表面１０２は基板１３の表面である。蛍光増強体１２は、頂部（第１の表面１０１）において生じた蛍光を増強する機能を有し、当該増強機能を増幅するため第１の表面１０１に向かって横断面が減少するような形状となっている。図２に示した生体分子固定基板は、蛍光増強体１２そのものが生体分子を固定する領域となっている例である。したがって、図３に示した生体分子固定基板においては、第１のリンカー分子として、Au、Pt、Ir、Pd、Ru、Ni、Ti、Sn、Ag、Cu、Rh及びAl等の貴金属又は金属と選択的に結合しうるチオール基が導入された化合物を使用するとよい。
　図３に示した生体分子固定基板の製造プロセスフロー図を図６に示す。先ず、基板１３の一主面に略円錐形の蛍光増強体１２を作製する（図６（ａ））。略円錐形の蛍光増強体１２は、従来公知の薄膜形成・加工法を適用して作製することができる。次に、この構造体を第１のリンカー分子を含む溶液に浸漬し、蛍光増強体１２の頂部に選択的に第１のリンカー分子を導入する（図６（ｂ））。このとき、第１のリンカー分子は、蛍光増強体１２の頂部表面にのみ選択的に結合し、基板１３の表面に対しては吸着しない。次に、第２のリンカー分子を含む溶液に構造体を浸漬すると、第２のリンカー分子は第１のリンカー分子と選択的に結合する（図６（ｃ））。なお、上記構造体の一主面に第２のリンカー分子を含む溶液を塗布することで、第１のリンカー分子と第２のリンカー分子とを結合させても良い。このとき、第２のリンカー分子として潜伏性反応基を含む化合物を使用する場合には、電磁波や熱といった潜伏性反応基が第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる条件を与える。また、予め第１のリンカー分子と第２のリンカー分子とを結合させた化合物を用いて、足場１１に結合させてもよい。次に、基板１３の表面に生体分子の非特異的な吸着を防止するための吸着阻害分子を固定し、吸着阻害層１０６を形成する（図６（ｄ））。その後、第２のリンカー分子を介して、生体分子３０１を固定化する（図６（ｅ））。また、略円錐形の蛍光増強体１２における頂部の平面上からみた面積は生体分子３０１の１分子辺りの分子占有面積よりも小さいことが望ましい。
　以上のようにして、略円錐形の蛍光増強体１２における頂部の表面（第１の表面１０１）といった所望の領域のみに生体分子を固定した生体分子固定基板を製造することができる。特に、本発明に係る生体分子固定基板においては、第１のリンカー分子を第１の表面１０１のみに選択的に導入することができるため、基板１３の表面といった他の領域への生体分子の固定を防止することができる。したがって、図３に示した生体分子固定基板においても、図１及び２に示した生体分子固定基板と同様に、第１の表面１０１のみに生体分子を固定できるため、ノイズの発生を防止することができ非常に優れた検出感度を達成することができる。
　特に、図１、２及び３に示した生体分子固定基板は、所望の領域（第１の表面１０１）に、単一の生体分子を固定化することが好ましい。例えば、単一の生体分子としてＤＮＡポリメラーゼを固定することによって、単一分子ベースのシーケンシング(SBS(Sequencing by Synthesis)法等)による遺伝子配列決定方法に好適なものとなる。すなわち、単一のＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応を、基質として蛍光標識されたヌクレオチドを使用して行い、所定の核酸断片を鋳型とした一塩基の伸長反応毎に蛍光検出を行うことで、鋳型となった核酸断片の配列を決定することができる。特に、本発明に係る生体分子固定基板によれば、ＤＮＡポリメラーゼを所定の領域にのみ確実に固定できるため、反応場以外の領域からのノイズを防止することができる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　本実施例では、比較事例を適宜参照しながら説明する。まず、図１に示した構成の生体分子固定基板における蛍光増強体１２としてAuを、足場１１としてTiO2を、基板１３にSiO2を用いる場合を考え、これら３種類の表面に対して選択的に生体分子を導入した結果について説明する。
（基板の準備）
　まず、Au、TiO2、SiO2の3種類の基板表面を準備した。Au膜及びTiO2膜をそれぞれSiO2基板上にスパッタ法により成膜した。Au膜及びTiO2膜の厚さは１０ｎｍ程度とした。SiO2は合成石英基板を用いた。酸素ガスを用いた反応性ドライエッチ（ＲＩＥ）により基板表面を洗浄すると同時に、水酸基を導入した。ＲＩＥ処理はＩＣＰドライエッチ装置を用いて実施した。ＲＩＥ条件は出力１００W、酸素ガス圧力１Pa、ガス流量１０ｃｍ３/分、エッチング時間６０～１８０秒とした。
（基板の表面処理）
　第１のリンカー分子として、アルキル鎖とTiO2に結合させるためのリン酸基を有するアルキルリン酸を用いた。アルキルリン酸としては、具体的に炭素鎖12の1-Dodecylphosphonic Acidを用いた（下記構造式を参照）。本実施例においては、炭素鎖12のアルキルリン酸を用いたが、Poly(vinyl phosphonic Acid)のような高分子鎖を用いてTiO2に結合してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　以下、基板の処理方法について記す。具体的には、1-Dodecylphosphonic Acidをヘプタン／イソプロパノール（v/v 99.5/0.5）の混合溶媒に溶解させた溶液に、Au膜及びTiO2膜を有するSiO2基板を48時間浸漬した。その後、イソプロパノールで洗浄した後、基板の表面状態を評価するために、基板表面のリンの吸着量をX線光電子分光法（XPS法）を用いて定量した。
　1-Dodecylphosphonic Acidの処理前後における基板表面のリンの吸着量をXPSで同定したところ、Au膜、TiO2膜及びSiO2基板におけるP 2Pに由来するピークの積分強度はそれぞれ、0 cps、530 cps及び100 cpsであった。
　さらに、1-Dodecylphosphonic Acid処理を行った基板に対して、第２のリンカー分子としてBiotin-dPEG3TM-benzophenone（IRIS Biotech社、下記構造式を参照）をスピンコーターにより塗布し、紫外光(波長 365 nm)を30分間照射し、ベンゾフェノンと基板上のアルキル基を結合させた。なお、本実施例における第２のリンカーとしては、ベンゾフェノン基を有する化合物を用いたが、アジド基を有するPhotobiotinを用いてもよい。
　また、本実施例では第１のリンカーとして1-Dodecylphosphonic Acidで基板処理を行った後に、第２のリンカーとしてBiotin-dPEG3TM-benzophenoneを1-Dodecylphosphonic Acidに結合させたが、特にこれに限定されるものではなく、1-Dodecylphosphonic AcidとBiotin-dPEG3TM-benzophenoneを予め結合させた後に、精製を行い、Biotin-dPEG3TM-benzophenoneが結合した1-Dodecylphosphonic Acidを用いて、基板処理を行ってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（生体分子の結合）
　ストレプトアビジンを有する蛍光色素であるAlexa Fluor（登録商標） 532を弱塩基性の炭酸バッファーに溶解させ、上述したAu膜及びTiO2膜を有するSiO2基板を浸漬させることで、基板表面に導入した第２のリンカー分子に含まれるビオチンと蛍光色素に含まれるストレプトアビジンと結合させ、基板上に蛍光色素を固定した。その後、超純水で洗浄することで、過剰なAlexa Fluor 532を除去した。そして、Au膜及びTiO2膜を有するSiO2基板表面の蛍光観察を行い、蛍光由来の輝点数を測定した。その結果を図７に示す。なお、図７（ａ）はSiO2基板上のTiO2膜の表面を撮像した結果であり、図７（ｂ）はSiO2基板の表面及びSiO2基板上のAu膜の表面を撮像した結果を示している。図７（ａ）から分かるように、TiO2膜には観察領域内において1輝点/μm2以上の輝点を確認することができた。一方、図７（ｂ）から分かるように、SiO2基板の表面及びAu膜の表面からは0.1輝点/μm2以下の輝点しか観察されなかった。この結果から、第１のリンカー分子及び第２のリンカー分子をTiO2膜の表面に選択的に導入することができ、SiO2基板の表面及びAu膜の表面には導入されず、蛍光色素をTiO2膜の表面にのみ固定できたことが理解できる。
〔実施例２〕
　本実施例では、実施例１と同様に図2に示した構成の生体分子固定基板における蛍光増強体１２としてAuを、足場１１としてTiO2を、基板１３にSiO2を用いる場合を考え、これら３種類の表面に対して選択的に生体分子を導入した結果について説明する。
（基板の準備）
　まず、Au、TiO2、SiO2の3種類の基板表面を準備した。Au膜及びTiO2膜をそれぞれSiO2基板上にスパッタ法により成膜した。Au膜及びTiO2膜の厚さは１０ｎｍ程度とした。SiO2は合成石英基板を用いた。酸素ガスを用いた反応性ドライエッチ（ＲＩＥ）により基板表面を洗浄すると同時に、水酸基を導入した。ＲＩＥ処理はＩＣＰドライエッチ装置を用いて実施した。ＲＩＥ条件は出力１００W、酸素ガス圧力１Pa、ガス流量１０ｃｍ３/分、エッチング時間６０～１８０秒とした。
（基板の表面処理）
　第１のリンカー分子として、アルキル鎖を主鎖とし、かつ、TiO2に結合させるためのリン酸基を側鎖に有するPoly(vinyl phosphonic Acid)を用いた。ポリビニルリン酸としては、具体的に分子量24,000のものを用いた（下記構造式を参照）。本実施例においては、分子量24,000のPoly(vinyl phosphonic Acid)用いたが、特に限定されるものではなく、より大きな分子量、又は、より小さな分子量のPoly(vinyl phosphonic Acid)を用いてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　以下、基板の処理方法について記す。具体的には、Poly(vinyl phosphonic Acid)を2 wt%になるように超純水に溶解させた水溶液に、Au膜及びTiO2膜を有するSiO2基板を90℃で5分浸漬した。その後、超純水で洗浄した後、基板の表面状態を評価するために、基板表面のリンの吸着量をX線光電子分光法（XPS法）を用いて定量した。
　Poly(vinyl phosphonic Acid)の処理前後における基板表面のリンの吸着量をXPSで同定したところ、Au膜、TiO2膜及びSiO2基板におけるP 2Pに由来するピークの積分強度はそれぞれ、460 cps、1500 cps及び0 cpsであった。
　さらに、Poly(vinyl phosphonic Acid)処理を行った基板に対して、第２のリンカー分子としてアジド基を有するPhotobiotinであるEZ-Link TFPA-PEG3-Biotin （Thermo-Pierce社、下記構造を参照）をスピンコーターにより塗布し、紫外光(波長 365 nm)を30分間照射し、ベンゾフェノンと基板上のアルキル基を結合させた。なお、本実施例における第２のリンカーとしては、アジド基を有する化合物を用いたが、ベンゾフェノン基を有するビオチン化合物を用いてもよい。
　また、本実施例では第１のリンカーとしてPoly(vinyl phosphonic Acid)で基板処理を行った後に、第２のリンカーとしてPhotobiotinをPoly(vinyl phosphonic Acid)に結合させたが、特にこれに限定されるものではなく、Poly(vinyl phosphonic Acid)とPhotobiotinを予め結合させた後に、精製を行い、Photobiotinが結合したPoly(vinyl phosphonic Acid)を用いて、基板処理を行ってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（生体分子の結合）
　実施例１と同様に、ストレプトアビジンを有する蛍光色素であるAlexa Fluor（登録商標） 532を弱塩基性の炭酸バッファーに溶解させ、上述したAu膜及びTiO2膜を有するSiO2基板を浸漬させることで、基板表面に導入した第２のリンカー分子に含まれるビオチンと蛍光色素に含まれるストレプトアビジンと結合させ、基板上に蛍光色素を固定した。その後、超純水で洗浄することで、過剰なAlexa Fluor 532を除去した。そして、Au膜及びTiO2膜を有するSiO2基板表面の蛍光観察を行い、蛍光由来の輝点数を測定した。その結果を図８に示す。なお、図８（ａ）はSiO2基板上のTiO2膜の表面を撮像した結果であり、図８（ｂ）はSiO2基板の表面及びSiO2基板上のAu膜の表面を撮像した結果を示している。図８（ａ）から分かるように、TiO2膜には観察領域内において1輝点/μm2以上の輝点を確認することができた。一方、図８（ｂ）から分かるように、SiO2基板の表面及びAu膜の表面からは0.1輝点/μm2以下の輝点しか観察されなかった。この結果から、第１のリンカー分子及び第２のリンカー分子をTiO2膜の表面に選択的に導入することができ、SiO2基板の表面及びAu膜の表面には導入されず、蛍光色素をTiO2膜の表面にのみ固定できたことが理解できる。
〔比較例１〕
　比較例１では、第１のリンカー分子として、末端にアミノ基とTiO2に結合させるためのリン酸基を有するアミノアルキルリン酸を用いた以外は実施例１と同様に、Au膜及びTiO2膜を有するSiO2基板に第１のリンカー分子を導入した。本比較例において、具体的にアミノアルキルリン酸としては炭素鎖3からなる3-Aminopropylphosphonic Acidを用いた。3-Aminopropylphosphonic Acidを超純水に溶解させた溶液に、Au膜及びTiO2膜を有するSiO2基板を48時間浸漬した。その後、超純水で洗浄した後、基板の表面状態を評価するために、基板表面のリンの吸着量をX線光電子分光法（XPS法）を用いて定量した。
　3-Aminopropylphosphonic Acid処理前後における基板表面のリンの吸着量をXPSで同定したところ、Au膜、TiO2膜及びSiO2基板におけるP 2Pに由来するピークの積分強度はそれぞれ、140 cps、640 cps及び270 cpsであった。すなわち、本比較例で使用した第１のリンカー分子は、分子構造の一部にアミノ基が存在するため、TiO2膜に選択的に結合させることができず、Au膜の表面やSiO2基板の表面にも結合していることが確認された。この場合、第１のリンカー分子を介して生体分子を固定すると、生体分子はAu膜の表面やSiO2基板の表面にも固定されることが予測できる。
　本発明は、タンパク質や核酸等の生体分子を固定した基板に適用することができる。本発明は、生体分子の固定様式に特徴を有するため、あらゆる従来公知の基板（例えば、ＤＮＡマイクロアレイやプロテインチップ）等に応用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
１１…足場、１２…蛍光増強体、１３…基板、１０１…第１の表面、１０２…第２の表面、２０１及び２０２…化合物層、３０１…生体分子

Claims (20)

  1. 　少なくとも第１の表面及び第２の表面を有する基板と、
    　炭化水素鎖と、当該炭化水素鎖の一方末端、又は側鎖に上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基とを有し、上記官能基を介して上記第１の表面に結合した第１のリンカー分子と、
    　上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる反応基を有し、上記反応基と上記炭化水素鎖との結合を介して第１のリンカー分子と結合した第２のリンカー分子と、
    　上記第２のリンカー分子を介して結合した生体分子と
    　を備える生体分子固定基板。
  2. 　上記第１の表面は金属酸化物であり、上記第２の表面は貴金属であることを特徴とする請求項１記載の生体分子固定基板。
  3. 　上記第１の表面は金属酸化物であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はリン酸基及び/又はシラノール基であることを特徴とする請求項１記載の生体分子固定基板。
  4. 　上記第１の表面は自然酸化膜を有する金属であり、上記第２の表面は二酸化ケイ素あるいはサファイアであることを特徴とする請求項１記載の生体分子固定基板。
  5. 　上記第１の表面は自然酸化膜を有する金属であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はリン酸基及び/又はシラノール基であることを特徴とする請求項１記載の生体分子固定基板。
  6. 　上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖が化１及び/又は化２のアルキル基末端にリン酸基及び/又はシラノール基を有することを特徴とする請求項３又は５記載の生体分子固定基板。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　（式中、mは２～２０の整数である。また、Xの少なくとも１つはアルコキシ、または塩素であり、メチル、又はエチルを含んでもよい）
  7. 　上記第１のリンカー分子の炭素水素鎖が化３の側鎖にリン酸基を有する高分子鎖であることを特徴とする請求項３又は５記載の生体分子固定基板。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　（式中、ｎは1以上の整数）
  8. 　上記第１の表面は貴金属であり、上記第２の表面は二酸化ケイ素であることを特徴とする請求項１記載の生体分子固定基板。
  9. 　上記第１の表面は貴金属であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はチオール基であり、上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖が化４のアルキル基末端にチオール基を有することを特徴とする請求項１記載の生体分子固定基板。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、mは２～２０の整数である）
  10. 　上記第２のリンカー分子における反応基は、上記炭化水素鎖と結合しうる潜伏性反応基であり、上記潜伏性反応基は、アントラチオン基、アントラキノン基、ベンゾフェノン基、アジド基及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の光反応性化合物であることを特徴とする請求項１記載の生体分子固定基板。
  11. 　上記第２のリンカー分子は、上記生体分子又は上記生体分子に結合した反応基と選択的に結合しうる反応基を更に有していることを特徴とする請求項１記載の生体分子固定基板。
  12. 　上記第２のリンカー分子に含まれるビオチンと上記生体分子に導入されるビオチンとが、アビジンを介して結合していることを特徴とする請求項１記載の生体分子固定基板。
  13. 　少なくとも第１の表面及び第２の表面を有する基板に対して、炭化水素鎖と当該炭化水素鎖の一方末端、又は側鎖に上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基とを有する第１のリンカー分子を接触させる工程と、
    　少なくとも、上記第１のリンカー分子が結合した上記第１の表面に対して、上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖と結合しうる反応基を有する第２のリンカー分子を接触させる工程と、
    　生体分子を接触させることで、当該生体分子を上記第２のリンカー分子を介して結合させる工程とを含む、生体分子固定基板の製造方法。
  14. 　上記第２のリンカー分子を接触させる工程の後、少なくとも上記第２のリンカー分子が結合した上記第１の表面以外の領域に生体分子の吸着を阻害する吸着阻害分子を接触させ、当該領域に吸着阻害層を形成する工程を更に含むことを特徴とする請求項１３記載の生体分子固定基板の製造方法。
  15. 　上記第１の表面は金属酸化物であり、上記第１の表面と選択的に結合しうる官能基はリン酸基及び/又はシラノール基であることを特徴とする請求項１３記載の生体分子固定基板の製造方法。
  16. 　上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖が化５及び/又は化６のアルキル基末端にリン酸基及び/又はシラノール基を有することを特徴とする請求項１３記載の生体分子固定基板の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     　（式中、mは２～２０の整数である。また、Xの少なくとも１つはアルコキシ、または塩素であり、メチル、又はエチルを含んでもよい）
  17. 　上記第１のリンカー分子の炭素水素鎖が化７の側鎖にリン酸基を有する高分子鎖であることを特徴とする請求項１３記載の生体分子固定基板の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     　（式中、ｎは整数）
  18. 　上記第１の表面は貴金属であり、上記第１のリンカー分子の炭化水素鎖が化８のアルキル基末端にチオール基を有することを特徴とする請求項１３記載の生体分子固定基板の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式中、mは２～２０の整数である）
  19. 　上記第２のリンカー分子における反応基は、上記炭化水素鎖と結合しうる潜伏性反応基であり、上記潜伏性反応基は、アントラチオン基、アントラキノン基、ベンゾフェノン基、アジド基及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種の光反応性化合物であることを特徴とする請求項１３記載の生体分子固定基板の製造方法。
  20. 　上記第２のリンカー分子は、上記生体分子又は上記生体分子に結合した反応基と選択的に結合しうる反応基を更に有し、上記第２のリンカー分子に含まれるビオチンと上記生体分子に導入されるビオチンとが、アビジンを介して結合していることを特徴とする請求項１３記載の生体分子固定基板の製造方法。
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