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WO2007102400A1 - 核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置 - Google Patents

核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置 Download PDF

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Publication number
WO2007102400A1
WO2007102400A1 PCT/JP2007/053949 JP2007053949W WO2007102400A1 WO 2007102400 A1 WO2007102400 A1 WO 2007102400A1 JP 2007053949 W JP2007053949 W JP 2007053949W WO 2007102400 A1 WO2007102400 A1 WO 2007102400A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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dna
fluorescence
reaction
fluorescence intensity
value
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/053949
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yuichi Tamaoki
Akifumi Iwama
Yasuaki Sonoda
Original Assignee
Sanyo Electric Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanyo Electric Co., Ltd. filed Critical Sanyo Electric Co., Ltd.
Priority to CN2007800080432A priority Critical patent/CN101395261B/zh
Priority to US12/281,540 priority patent/US20090155891A1/en
Priority to EP07737629.1A priority patent/EP1992682B1/en
Publication of WO2007102400A1 publication Critical patent/WO2007102400A1/ja
Priority to KR1020087021716A priority patent/KR101344673B1/ko
Priority to US14/339,092 priority patent/US10544453B2/en

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for detecting a polynucleotide product obtained in real time by using a polymerase chain reactin (PCR) force.
  • PCR polymerase chain reactin
  • PCR is a cyclic enzyme reaction that replicates DNA strands, and the PCR product (nucleic acid amplification product) replicated in the previous cycle is used as a template for successive cycles.
  • Target sequence molecules can be amplified exponentially.
  • Real-time PCR for example, uses a sequence-specific probe (TaqMan probe) labeled with two types of fluorescent dyes that interfere with each other, and applies excitation light to the PCR product to excite fluorescence and measure the fluorescence intensity. In this way, PCR product amplification can be monitored in real time.
  • a threshold ((6) in Fig. 7) is set in the exponential amplification region of the amplification curve in a known sample, and the point where the threshold and the amplification curve intersect (threshold cycle number) Ct ( Figure 8 (8)) is calculated.
  • the initial DNA amount is scaled by the Log value, and a calibration curve showing this linear relationship can be created. Based on this calibration curve, estimate the initial DNA amount of the test sample. This allows accurate quantification based on PCR amplification kinetics.
  • PCR The product concentration [DNA] is amplified exponentially by a power of 2 in the number of cycles, but the efficiency e gradually decreases in the early, middle and late cycles, so the amplification curve is shown in Fig. 7.
  • the situation is as shown.
  • the horizontal axis in Fig. 7 shows the number of cycles, and the vertical axis shows the fluorescence intensity. It is amplified exponentially at the beginning of the cycle ((5) in Fig. 7) and becomes linear in the middle of the cycle ((6 in Fig. 7). )) In the latter part of the cycle, amplification is stopped due to the plateau effect ((7) in FIG. 7).
  • Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2005-516630
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 2909216
  • reaction vessel used for real-time PCR a vessel called a microplate having a plurality of wells (reaction region composed of depressions, for example, 96) is generally used.
  • the reaction solution with a predetermined initial DNA concentration is dispensed into the well, but the error curve on the apparatus varies depending on the reaction container due to the following factors.
  • reaction vessel (microplate) is mainly used because the method of covering the well by attaching the above-mentioned seal film with adhesive on the entire surface of one side is inexpensive.
  • each well is irradiated with excitation light through this seal film, and the fluorescence emitted by the PCR product (reactant) is also detected by the photodetection unit such as a CCD camera through these seal films (this is the optical system of the device). Configure).
  • the seal film and the reaction vessel body constitute an important element of the optical system for measuring the fluorescence intensity. It is difficult to expect.
  • FIG. 4 is an actual image of the reaction container before PCR detected by the light detection unit.
  • the force around the reaction container well appears black as a whole.
  • the brightness of each pixel in this image which is the background (fluorescence intensity of the background), is not necessarily constant, as shown by (1) in the figure. Spots are generated due to dirt or stray light.
  • these spots overlap the images of the well part (96 images shown in circles in Figure 5) as shown in (2) in Fig. 5, and the fluorescence intensity of the well body is redundant. End up.
  • an empty reaction vessel containing no DNA is first prepared, and the fluorescence intensity in an empty state is measured for each well and stored as a standard correction value. Then, such an optical system was calibrated by performing a correction process of subtracting the stored correction value from the actual measured value of fluorescence intensity.
  • the error due to contamination of the empty reaction vessel is unique to each reaction vessel, there is an error in the measured value when using the correction values for other empty reaction vessels that are standard. There was a problem that occurred.
  • the first fluorescence signal is corrected with the second fluorescence signal, but in addition to the solution that emits the first fluorescence that must be originally measured, a second reference signal is used. Therefore, it is necessary to add a solution that emits a fluorescent light, so that the work becomes complicated and the cost increases. Furthermore, the second fluorescent solution is dispensed with very high accuracy, and the effect cannot be obtained unless it is measured with high accuracy. Furthermore, special optics are used to measure the second fluorescence. A filter must be installed, and the optical filter must be replaced with a solution that emits the first fluorescence and a solution that emits the second fluorescence for each measurement. There is a problem that extra time is required.
  • the present invention has been made to solve the conventional technical problem, and effectively eliminates an error factor on the apparatus without using the second fluorescent signal used for correction. It is an object of the present invention to provide a real-time detection apparatus for nucleic acid amplification products that can be eliminated or reduced.
  • the device of the invention of claim 1 is a device that gives temperature cycles to a plurality of reaction regions and detects fluorescence intensity from nucleic acid amplification products in each reaction region in real time, and is obtained from the reaction regions.
  • the fluorescence measurement value [DNA] raw and the fluorescence measurement value [DNA] bg obtained from the region outside the reaction region in the vicinity of this reaction region are detected, and the fluorescence measurement value [DNA] bg is inserted from the fluorescence measurement value [DNA] raw.
  • the fluorescence intensity [DNA] real of the reaction region is determined by bow I.
  • the fluorescence measurement value [DNA] bg is a simple average or a predetermined weighting of fluorescence measurement values obtained from a plurality of regions outside the reaction region in the vicinity of the reaction region. It is the average value after performing.
  • the apparatus of the invention of claim 3 detects the fluorescence measurement value [DNA] bg each time the fluorescence measurement value [DNA] raw is detected in each of the above inventions, and the fluorescence measurement value [DNA] raw force fluorescence measurement. Fluorescence intensity [DNA] real is determined by subtracting the value [DNA] bg
  • the apparatus of the invention of claim 4 provides temperature cycles to a plurality of reaction regions, and detects fluorescence intensity from nucleic acid amplification products in each reaction region in real time, and each temperature cycle is performed n times.
  • Each reaction region force is normalized to the fluorescence intensity [DNA] n obtained using the maximum value of the fluorescence intensity [DNA] n or a related value [DNA] max, and the normalized fluorescence intensity is obtained.
  • the threshold cycle number Ct is calculated by setting the threshold Th in the exponential amplification region of the amplification curve drawn using [DNA] nN.
  • the apparatus of the invention of claim 5 is the above, wherein the fluorescence intensity [DNA] n for each reaction region is Fluorescence intensity [DNA] nN is calculated by dividing a large value or a related value [DNA] max or a value common to the reaction region to be compared with a value obtained by comparison. To do.
  • the apparatus of the invention of claim 6 provides the fluorescence intensity [DNA] base before the exponential amplification region in claim 4 or claim 5, the fluorescence intensity [DNA] n and the maximum value for each reaction region. Or draw an amplification curve by subtracting it from its associated value [DNA] max
  • a nucleic acid amplification product real-time detection device that gives a temperature cycle to a plurality of reaction regions and detects fluorescence intensity from nucleic acid amplification products in each reaction region in real time is obtained from the reaction region.
  • the fluorescence measurement value [DNA] raw and the fluorescence measurement value [DNA] bg obtained from the region outside the reaction region in the vicinity of this reaction region are detected, and the fluorescence measurement value [DNA] bg is obtained from the fluorescence measurement value [DNA] raw.
  • the fluorescence intensity [DNA] real of the reaction region is determined, so that for each reaction region, the error intensity of the reaction region and its surroundings, dirt, and background fluorescence intensity due to stray light are determined.
  • the original fluorescence intensity [DNA] real of the nucleic acid amplification product of the reaction region thus excluded can be obtained. This makes it possible to create an accurate amplification curve and to quantify it. In this case, since it is not necessary to use the second fluorescence signal, the cost and the workability are not deteriorated, and the time required for data acquisition and processing can be shortened.
  • the fluorescence measurement value [DNA] bg is a simple average of fluorescence measurement values obtained from a plurality of regions outside the reaction region in the vicinity of the reaction region or a predetermined weighting. Since the average value is obtained after performing the calculation, it is possible to calculate the fluorescence intensity of the background more accurately and determine the fluorescence intensity [DNA] real with high accuracy.
  • a real-time detection apparatus for a nucleic acid amplification product that applies a temperature cycle to a plurality of reaction regions and detects the fluorescence intensity from the nucleic acid amplification product in each reaction region in real time.
  • the fluorescence intensity [DNA] n obtained from each reaction region every n temperature cycles is normalized using the maximum value of the fluorescence intensity [DNA] n or the related value [DNA] max. Since the threshold Th is set in the exponential amplification region of the amplification curve drawn using the normalized fluorescence intensity [DNA] nN, the threshold cycle number C t is calculated. Corrects and reduces the variation in fluorescence intensity in each reaction area due to error factors on the instrument such as optical system errors, calibration solution concentration errors, calibration solution dispensing errors, and reaction solution dispensing errors. High threshold cycle number Ct can be calculated.
  • the fluorescence intensity [DNA] n for each reaction region is a maximum value or a related value [DNA] max, or a reaction region to be compared thereto.
  • the fluorescence intensity [DNA] nN is calculated by dividing the common value by the calculated value, so that the normalization effect is suppressed and the correction effect at the threshold is sufficiently secured while the middle of the cycle is started. It is possible to approximate the later-stage amplification curve to the actual data, and to easily understand the behavior of the data due to factors other than the error factors on the equipment.
  • the fluorescence intensity [DNA] base before the exponential amplification region is expressed as the fluorescence intensity [DNA] n and the maximum value or Since the amplification curve was drawn by subtracting from the related value [DNA] max, the status of the fluorescence intensity from the nucleic acid amplification product itself excluding the fluorescence intensity generated from the reaction solution in the reaction region was grasped. Will be able to.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a real-time detection device R according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a longitudinal side view of a reaction detection device 1 constituting the real-time detection device R of FIG. 1
  • FIG. 3 is a reaction detection device. 1 is a plan sectional view of 1.
  • the real-time detection device R of the present invention includes a reaction detection device 1 and a processing device C including a computer that processes detection data from the reaction detection device 1 in real time.
  • the reaction detection apparatus 1 according to the embodiment is an apparatus that performs propagation of chromosomal DNA as a reaction sample and detects a reaction state related to the proliferation by an optical measurement method.
  • the reaction detection device 1 includes a main body 3 having a reaction chamber 4 formed on the upper surface, and a reaction detection unit 5 disposed on the upper surface of the main body 3 behind the reaction chamber 4.
  • the reaction chamber 4 is provided with a reaction block 6 made of a heat conductive material such as an ano-remium.
  • This reaction block 6 holds a reaction vessel 7 having a plurality of wells 7 containing a reaction solution in which DNA (target template: DNA, etc.), various reagents, a medium solution, etc. are mixed.
  • a plurality of holding holes 8 are formed.
  • the reaction vessel 7 used in the present embodiment is 12 in the vertical direction, 8 in the horizontal direction, and a total of 96 reaction regions 7 ⁇ are formed in a body, and each of the wells 7 ⁇ Is a microplate connected by a connecting wall (area outside the well 7 (reaction area), that is, outside reaction area).
  • the reaction vessel is not limited to one in which the well is integrally formed, and may be composed of a plurality of tubes.
  • the number of wels 7 ⁇ is not limited to this. For example, 384 units integrated into one unit are easy to handle.
  • Each well 7 ⁇ of the reaction vessel 7 is formed with an opening on the upper surface, and the upper surface opening is attached with a seal lid 9 to prevent evaporation due to temperature treatment of the reaction solution. .
  • a light-transmitting synthetic resin material is used.
  • a Peltier element 10 for heating and cooling the reaction block 6 is provided in the main body 2.
  • the temperature of the Peltier element 10 is controlled by a control device (not shown), so that the reaction block 6 is heated and cooled cyclically, whereby the DNA (reaction sample) in each well 7 of the reaction vessel 7 Is cultured (amplified).
  • a dark chamber constituting portion 12 is provided from the reaction detection portion 5 provided on the upper surface of the rear end of the main body 2 to the other end, in this embodiment, over the front end of the main body 2 where the reaction chamber 4 is formed.
  • the front surface of the darkroom component 12 is formed to open forward, and the front opening 2 is provided with the cover 2 formed so as to be inclined downward toward the front.
  • the cover 2 is configured to be movable back and forth by a rail member 13 formed in front of the darkroom component 12, that is, from the front of the upper surface of the main body 3 to the rear portion of the chamber component 12.
  • the cover 2 is accommodated in the darkroom component 12 in a state of moving rearward.
  • a pressing member 15 for pressing the reaction vessel 7 against the reaction block 6 facing the reaction block 6 in the reaction chamber 4 in a state where the cover 2 is closed is a body. It is provided movably.
  • the pressing member 15 is a plate material made of an aluminum material having good thermal conductivity, and a plurality of through holes are formed corresponding to the upper surface of each well 7A.
  • a Fresnel lens 21 as an optical lens is disposed above the pressing member 15.
  • the Fresnel lens 21 is generally formed with a plurality of grooves on a plane, and thereby refracts incident light to enlarge it.
  • the Fresnel lens 21 refracts and enlarges the incident light, it has an optical characteristic of converging and transmitting the incident light in a parallel or nearly parallel state. The light is projected with the distortion of each optical path corrected.
  • a reflection plate 22 is disposed above the reaction block 6 on the surface constituting the reaction chamber 4 side of the cover 2 that closes the front upper side of the reaction chamber 4.
  • the reflecting plate 22 in this embodiment is composed of a mirror composed of a flat plate, and the light from the light source lamp 23 described later is bent toward the Fresnel lens 21 in detail.
  • a light source lamp 23 a filter device 35 having a plurality of bandpass filters, a reflector 26, a CCD camera 27, and a filter driving device that rotates the filter device 35. And 28.
  • the light source lamp 23 is a lamp that irradiates light containing excitation light for exciting fluorescence from the reaction solution according to the amount of the DNA product to be detected in the reaction solution, and is generally a halogen lamp. Is used.
  • the reflection plate 26 polarizes the reflection plate 22 by bending light of a predetermined wavelength irradiated from the light source lamp 23 at a predetermined angle. Further, the reflecting plate 26 has a property of transmitting predetermined fluorescence. In the present embodiment, the light from the light source lamp 23 disposed on the side of the reaction detector 5 is bent forward by the reflector 26 so that the light from the light source lamp 23 is applied to the reflector 22. .
  • the filter device 35 is a device configured by arranging several types of band-pass filters in a ring shape, and is rotated by the filter driving device 28, whereby the light source lamp 23 and the reflector 2 A predetermined bandpass filter is selected and positioned between the reflector 6 and the reflector 22 and the camera 27.
  • the one located between the light source lamp 23 and the reflector 26 is referred to as a bandnos filter 24, and the one located between the reflector 22 and the camera 27 is referred to as a bandpass filter 25.
  • the bandpass filter 24 is an optical filter having a property of transmitting only light having a wavelength necessary for exciting fluorescence from the reaction solution out of light components from the light source lamp 23.
  • the light that has passed through is used as excitation light for exciting fluorescence from a specific component of the reaction solution.
  • the bandpass filter 25 is an optical filter having a property of transmitting only a predetermined fluorescent component from the fluorescence emitted from the reaction solution in each well 7A of the reaction vessel 7 and the reflected light through the reflection plate 22. Here, the reflected light other than the fluorescent light is blocked.
  • the camera 27 is a device that detects the fluorescence that has passed through the bandpass filter 25, and the fluorescence image detected by the camera 27 is captured by the control device and transmitted to the processing device C for each reaction.
  • the concentration of the solution ie the amount of amplification, is analyzed.
  • These band-pass filters 24 and 25 are arbitrarily determined based on the reaction solution to be detected and the combination of the band-pass filters 24 and 25 based on the type of fluorescent dye used correspondingly. And shall be used selectively.
  • the control device controls the Peltier element 10 so that the reaction solution in the reaction vessel 7 held in the holding hole 8 of the reaction block 6 has a heat denaturation temperature of, for example, + 95 ° C. Then, a heat denaturation step is performed to heat denature the reaction solution. Next, the control device controls the Peltier cooling element 10, cools the reaction block 6 to, for example, + 60 ° C., and anneals the DNA in the reaction solution stored in the reaction vessel 7 and thermally denatured. And the extension process. The control device repeats this heat denaturation step, annealing step, and extension step multiple times, for example, 40 times, thereby culturing (amplifying) DNA or the like by PCR.
  • the reaction detection unit 5 periodically performs a detection operation such as after the end of one cycle in order to detect the amplification state of the DNA in the reaction solution in the reaction vessel 7. To do.
  • the detection operation first, the light emitted from the light source lamp 23 reaches the reflection plate 26 via the band pass finometer 24.
  • the bandpass filter 24 is supplied from the light source lamp 23. Of the light, only light having a wavelength necessary to excite fluorescence, that is, excitation light is transmitted.
  • the excitation light passes through the dark room component 12 by the reflector 26 and is irradiated in the direction of the reflector 22. Further, the excitation light is directed toward the Fresnel lens 21 provided facing the reaction block 6 by the reflector 22. That is, it irradiates from top to bottom.
  • the excitation light applied to the Fresnel lens 21 is focused by the optical characteristics of the lens 21, and is parallel or parallel to each of the wells 7A of the reaction vessel 7 accommodated in the reaction block 6.
  • the incident angle is changed to an angle close to parallel.
  • the excitation light that has passed through the lens 21 enters the respective wells 7A through the respective through holes formed in the pressing member 15 at an incident angle that is parallel or close to parallel.
  • Excitation light incident at a parallel or near-parallel angle in each of the wells 7A is irradiated onto the DNA in the wells 7A to which a predetermined fluorescent dye has been added in advance, so that the amount of the PCR product is increased. Fluorescent light is emitted. The generated fluorescence and reflected light from other PCR products reach the reflector 22 through the through holes and Fresnel lens 21 formed in the holding member 15 in the same manner.
  • the fluorescent light and other reflected light that has reached the reflecting plate 22 are opposed to the reflecting plate 22 while forming an optical path in the dark room constituting portion 12 in a substantially horizontal direction by the action of the reflecting plate 22. Since the inside of the dark room constituting part 12 is a dark room due to the cover 2 being closed, it is possible to suppress inconvenience that the fluorescence is attenuated.
  • the reflection plate 26 is made of a material that can transmit fluorescence, the reflected light and fluorescence transmitted through the reflection plate 26 are irradiated to the band-pass filter 25. It becomes. As described above, in the band-pass filter 25, only predetermined fluorescence can be transmitted in accordance with the type of the filter 25. Therefore, the camera 27 disposed behind the band-pass filter 25 has only predetermined fluorescence. It will be irradiated.
  • the camera 27 detects the fluorescence state of the PCR product in each of the walls 7A of the reaction vessel 7 by photographing the received fluorescence. Then, detection data (image data shown in FIGS. 4 to 6) regarding the detected fluorescence state of each PCR product duct is sent from the control device to the processing device C and analyzed by the processing device C. Of each sample The concentration, that is, the amount of amplification of DNA or the like can be detected. Since the positional relationship between each 7A and the image is known in advance, the fluorescence intensity of each of the 7A images can be measured by calculating the brightness of each pixel of the 7A image, and the amount of PCR product can be determined from this fluorescence intensity. Can be grasped.
  • the processing device C includes an arithmetic processing unit (CPU) 31 that processes the detection data transmitted from the reaction detection device 1, and a storage device connected to the arithmetic processing unit 31 ( Storage means) 32, keyboard (or input means such as mouse) 33, display (output means) 3 4, printer (output means) 36, external storage device 37 such as floppy disk, CD, DVD, memory, etc. .
  • the detection data transmitted from the reaction detection device 1 is stored in the storage device 32, processed as described later by the arithmetic processing unit 31, and displayed on the display 34 or the like.
  • FIG. 6 is an image of detection data sent from the reaction detector 1 to the processor C.
  • the 96 round images that appear white in each image are the fluorescence emitted from the PCR product in each of the wells 7A.
  • SYBR Premix Ex Taq registered trademark
  • a reaction solution is prepared from PCR Forward Primer, PCR Reverse Primer, Template (initial DNA) and dH 2 O 2.
  • the reaction solution of 0.2 ⁇ ⁇ / ⁇ L is dispensed into the 48 uel 7A in the upper half (Group X), and the 48 uel 7A in the lower half is dispensed.
  • a double concentration of 0.4 pg // i L of reaction solution is dispensed (Y group).
  • the temperature cycle is 40 times.
  • the brightness of each pixel is not always constant, as shown in FIG. 4 (1). Spots are generated by light. As the reaction progresses, these spots overlap the image of the well 7A and become redundant with the original fluorescence intensity of the well 7A, as shown in (2) of FIG.
  • the arithmetic processing unit 31 of the processing device C executes the following processing to obtain the original fluorescence intensity of the well. That is, for example, in the case of the second 7A (B11) well 7A from the right in FIG. 6, the fluorescence measurement value [DNA] rawB 11 of the B11 wel 7A ((4) in FIG. 6) is measured. And stored in the storage device 32. Next, the fluorescence measurement values [DNA] bgl, [DNA] bg2, [DNA] bg3, and [DNA] bg4 at the surrounding four points on the connecting wall near B7 of the B11 were measured. The average value of the fluorescence measurement values (background fluorescence measurement value) is obtained and stored in the storage device 32. Then, the average fluorescence intensity [DNA] realB 1 of B 11 is calculated by deriving this average value from the fluorescence measurement value [DNA] rawBll as shown in equation (2).
  • [DNA] realB 11 [DNA] rawB 11 one (([DNA] bg 1 + [DNA] bg2 + [DNA] b g3 + [DNA] bg4) / 4) ⁇ ' ⁇ ⁇ (2)
  • fluorescence measurement values [DNA] bgl, [DNA] bg2, [DNA] bg3, and [DNA] bg4 around four points around the well 7A were measured, and the average value was measured as a fluorescence measurement value [ Subtract from DNA] raw
  • the present invention is not limited to this, and an average of one point, two points, or three points may be used.
  • the fluorescence intensity of the background can be calculated more accurately and the fluorescence intensity [DNA] real can be determined with high accuracy.
  • the force using a simple average of the fluorescence measurement values at four points around the 7A of the well 7A is not limited to this, and it may be averaged after predetermined weighting is performed for each point in consideration of stains. .
  • the fluctuation (drift) of the fluorescence intensity of the background before and after the reaction is not clear.
  • the fluorescence measurement values [DNA] bg 1 to [DNA] bg4 were detected, and the fluorescence measurement value [DNA] raw to the fluorescence measurement value [DNA] bg Since the fluorescence intensity [DNA] real is determined by subtracting the average value of 1 to [DNA] bg4, the original fluorescence intensity [DNA] real of the DNA product is always maintained even if the background fluorescence intensity fluctuates during the reaction. It can be obtained accurately in real time.
  • Figure 8 shows the amplification curves for all 96 well 7A.
  • the horizontal axis is the number of temperature cycles, and the vertical axis is the fluorescence intensity.
  • the reaction curve must be seen as two lines because the reaction solutions with different concentrations are dispensed in the X group in the upper half and the Y group in the lower half as shown in Figs. Bananare.
  • the threshold cycle number Ct should also be 2 points.
  • the amplification curve of each well 7A varies and the threshold value The number of cycles Ct also occurs multiplely as shown in (8) and (9).
  • the arithmetic processing unit 31 normalizes the data based on a predetermined selection command from the keyboard (mouse) 33. That is, the arithmetic processing unit 31 determines the fluorescence intensity [DNA] n determined for each temperature cycle number n and stored in the storage device 32 (the original fluorescence intensity [DNA] real for the nth temperature cycle number), and Comparison with the maximum fluorescence intensity [DNA] max for each well 7A (maximum fluorescence intensity [DNA] real up to n number of temperature cycles; stored in storage device 32) Using the value Z common to the target uel 7A (all uels 7A in the embodiment), the fluorescence intensity [DNA] nN normalized by the calculation of the equation (3) is obtained.
  • the factor that the fluorescence intensity varies in the plateau region in the latter half of the cycle is also caused by the variation in the chemical reaction that is caused by only the above-mentioned error factors on the apparatus.
  • the factor it is considered that the fluorescence intensity in the exponential amplification region is not proportionally affected. In other words, it may be better not to completely match the fluorescence intensities in the plateau effect region.
  • the value of Z may be determined as shown in Equation (4).
  • ⁇ is a coefficient common to each well 7 ⁇ .
  • the arithmetic processing unit 31 calculates the above-mentioned maximum value [DNA] max by a moving average of the fluorescence intensity. This is because the fluorescence intensity [DNA] real actually has a saw-tooth shape. However, the maximum value used for normalization may be the peak value of this saw, using a value such as 90% of the peak value (both values related to the maximum value). There is no problem. [0063] (D) Baseline correction
  • (10) in Fig. 8 shows that the reaction solution itself in 1S Well 7A, which is a region where reaction results cannot be detected at the beginning of the cycle, generates a certain amount of fluorescence from the beginning.
  • the fluorescence intensity is not zero. Therefore, based on an instruction from the keyboard (mouse) 33, the arithmetic processing unit 31 corrects the baseline. That is, the arithmetic processing unit 31 uses the average value [DNA] base of the fluorescence intensity of each well 7A in the region (10) at the beginning of the cycle as a base line, and uses this average value as described above for [DNA] n and [DNA] max.
  • the normalization process described above is performed after subtracting from.
  • the initial fluorescence intensity in Figures 9 and 10 is 0 because this process is performed ([DNA] base may use the minimum value of [DNA] n).
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a real-time detection device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a longitudinal side view of a reaction detection device constituting the real-time detection device of FIG.
  • FIG. 3 is a cross-sectional plan view of the reaction detection device of FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing a state of fluorescence intensity in the background of a reaction vessel.
  • FIG. 5 is a diagram showing the state of fluorescence intensity after reaction.
  • FIG. 6 is another diagram showing the state of fluorescence intensity after reaction.
  • FIG. 9 is a DNA amplification curve when the data in FIG. 8 is normalized.
  • FIG. 10 is a DNA amplification curve when incomplete normalization of the data in FIG. 8 is performed.
  • FIG. 11 is a functional block diagram of a processing device constituting the real-time detection device of FIG.

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Abstract

　修正のために用いる第２の蛍光信号を用いること無く、装置上の誤差要因を効果的に排除又は低減することができる核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置を提供する。複数のウエル７Ａに温度サイクルを与え、各ウエル７Ａにおける核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出する。ウエル７Ａから得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗと、このウエル７Ａ近傍における周辺の連結壁から得られる蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇとを検出し、蛍光測定値［ＤＮＡ］ｒａｗから蛍光測定値［ＤＮＡ］ｂｇを差し引くことにより、当該ウエル７Ａの蛍光強度［ＤＮＡ］ｒｅａｌを決定する。

Description

明 細 書
核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置
技術分野
[0001] 本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reactin : PCR)力、ら得ら れるポリヌクレオチド生成物をリアルタイムに検出する装置に関するものである。 背景技術
[0002] PCRは DNA鎖を複製する循環的な酵素反応で、前のサイクルで複製された PCR プロダクト (核酸増幅生成物）が連続するサイクルのテンプレートとして用いられること になる関係上、 目的とする標的配列分子を指数関数的に増幅させることができる。リ アルタイム PCRは、例えば互いに干渉しあう二種類の蛍光色素で標識した配列特異 的なプローブ（TaqManプローブ）を用い、 PCRプロダクトに励起光を当てて蛍光を 励起させ、この蛍光強度を測定することで PCRプロダクトの増幅をリアルタイムでモニ タリングする。
[0003] そして、定量的に用いるときは、既知試料における増幅曲線の指数関数的増幅領 域に閾値（図 7の（6) )を設定し、この閾値と増幅曲線が交わる点（閾値サイクル数 Ct 。図 7の（8) )を算出する。この閾値サイクル数 Ctと検查試料の初期 DNA量との間に は初期 DNA量を Log値で目盛ると直線関係があり、この直線関係を示す検量線を 作成できる。この検量線をもとに検查試料の初期 DNA量を推定する。これにより、 P CRの増幅速度論に基づいた正確な定量が可能である。
[0004] ここで、実際の PCR効率は 100%ではないため、増幅される PCRプロダクトの濃度 は式（1)で示される。
[DNA] = [DNA] (l +e)。 · · · ·（：!）
0
[DNA] ： PCRプロダクトの濃度
[DNA] ：標的テンプレートの初期濃度
0
e：平均 PCR効率
[0005] 即ち、平均 PCR効率 eが 100% (即ち、上記式（1)において e = 1)であれば、 PCR プロダクトの濃度 [DNA]は 2のサイクル数乗で指数関数的に増幅していくが、サイク ルの初期と中期と後期とで効率 eが徐々に低下してくるため、増幅曲線は図 7に示す ような状況となる。図 7の横軸はサイクル数、縦軸は蛍光強度を示しており、サイクノレ 初期では指数関数的に増幅し（図 7の（5) )、サイクル中期では直線関数的となり（図 7の（6) )、サイクル後期ではプラトー効果により増幅しなくなる（図 7の（7) )。
[0006] 尚、このプラトー効果を引き起こす化学反応的な要因としては次のようなものがある
• dNTPとプライマーの加水分解
•DNAポリメラーゼ（テンプレート（铸型）のコピーをつくるための DNA合成酵素）の 熱による失活
•1本鎖 PCRフラグメントの再会合によるプライマーアニーリング効率の低下 •非特異的 PCRプロダクトによる競合素材
'ピロホスフェートのような PCR阻害物質の蓄積
•DNAポリメラーゼのェキソヌクレアーゼ活性による PCRプロダクトの加水分解
[0007] 従って、リアルタイム PCRにおいては上記式（1)の関係が成立する指数関数的増 幅領域での測定が前提条件となる（特許文献 1参照)。
特許文献 1 :特表 2005— 516630号公報
特許文献 2 :特許第 2909216号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] また、リアルタイム PCRに用いられる反応容器としては、複数のゥエル（凹みから構 成される反応領域。例えば 96個。）を有するマイクロプレートと称される容器が一般的 に用いられ、各ゥエルに所定の初期 DNA濃度の反応溶液が分注されるが、装置上 の誤差要因としては次のようなものによって反応容器のゥエル毎に増幅曲線がばら
'光学系の誤差
'校正溶液の濃度誤差
'校正溶液の分注誤差 •反応容器の蓋やシールフィルムの光透過性誤差
•反応容器の汚れ誤差
•反応溶液の分注誤差
[0009] ここで、反応容器 (マイクロプレート）は、片面の全域に接着剤が付レ、た前述したシ ールフィルムを貼り付けることでゥエルに蓋をする方法が安価として主流となっている
。そして、このシールフィルムを通して励起光が各ゥエルに照射され、 PCRプロダクト (反応物）が発した蛍光もこのシールフィルムを通して CCDカメラなどの光検出部によ り検出される（これらが装置の光学系を構成する）。このようにシールフィルムや反応 容器の本体は、蛍光強度の測定上光学系の重要な要素を構成しているにもかかわ らず、これらは消耗品であるため、均一で精度の高い光学性能を期待することは困難 である。
[0010] 図 4は光検出部により検出される PCR前の反応容器の実際の画像である。反応容 器のゥエルの周囲は全体としては黒く見える力 背景となるこの画像の各ピクセルの 輝度（背景の蛍光強度）は必ずしも一定では無ぐ同図中に（1)で示すように光学系 の汚れや、迷走光などにより斑が発生している。 PCR反応が開始されると、この斑は 図 5中に（2)で示すようにゥエル部分の画像（図 5に丸く映っている 96個の画像）に 重なり、ゥエル本体の蛍光強度に冗長されてしまう。
[0011] そこで従来では、最初に DNAの入っていない空の反応容器を準備し、各ゥエル毎 に空の状態の蛍光強度を測定し、スタンダードな補正値として記憶する。そして、実 際の蛍光強度の測定値力 記憶された補正値を差し引く補正処理を行うことによって 、このような光学系の校正を行っていた。し力しながら、空の反応容器の汚れによる誤 差は各反応容器固有のものであるため、スタンダードとされた他の空の反応容器によ る補正値を用いた場合、測定値に誤差が生じる問題があった。
[0012] また、特許文献 2では第 1の蛍光信号を第 2の蛍光信号で修正しているが、本来測 定しなければならない第 1の蛍光を発する溶液の他に、参照用の第 2の蛍光を発す る溶液を追加しなければならなレ、ので、作業が繁雑となると共にコストも高騰すること になる。更に、第 2の蛍光を発する溶液は非常に高精度に分注され、精度良く測定さ れなければ効果が得られない。更にまた、第 2の蛍光を測定するために格別な光学 フィルタを装備しなければならず、また、測定の都度、光学フィルタを第 1の蛍光を発 する溶液用と第 2の蛍光を発する溶液用とで入れ替えなければならないなど、データ の取得と処理に要する時間が余分に必要となる問題がある。
[0013] 本発明は、係る従来の技術的課題を解決するために成されたものであり、修正のた めに用いる第 2の蛍光信号を用いること無ぐ装置上の誤差要因を効果的に排除又 は低減することができる核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置を提供することを目 的とするものである。
課題を解決するための手段
[0014] 請求項 1の発明の装置は、複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域に おける核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出するものであって、反応 領域から得られる蛍光測定値 [DNA]rawと、この反応領域近傍における反応領域 外領域から得られる蛍光測定値 [DNA]bgとを検出し、蛍光測定値 [DNA] rawから 蛍光測定値 [DNA] bgを差し弓 Iくことにより、当該反応領域の蛍光強度 [DNA] real を決定することを特徴とする。
[0015] 請求項 2の発明の装置は、上記において蛍光測定値 [DNA]bgは、反応領域近傍 における複数の反応領域外領域から得られる蛍光測定値の単純平均、若しくは、所 定の重み付けを行った後の平均値であることを特徴とする。
[0016] 請求項 3の発明の装置は、上記各発明において蛍光測定値 [DNA]rawの検出の 都度、蛍光測定値 [DNA]bgを検出し、当該蛍光測定値 [DNA]raw力 蛍光測定 値 [DNA]bgを差し引くことで、蛍光強度 [DNA]realの決定を行うことを特徴とする
[0017] 請求項 4の発明の装置は、複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域に おける核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出するものであって、温度 サイクル n回毎に各反応領域力 得られる蛍光強度 [DNA]nを、当該蛍光強度 [D NA] nの最大値若しくはそれに関連する値 [DNA] maxを用レヽて正規化し、当該正 規化された蛍光強度 [DNA]nNを用いて描かれる増幅曲線の指数関数的増幅領域 に閾値 Thを設定することにより、閾値サイクル数 Ctを算出することを特徴とする。
[0018] 請求項 5の発明の装置は、上記において反応領域毎の蛍光強度 [DNA]nを、最 大値若しくはそれに関連する値 [DNA]max、或いは、それに比較対象とする反応 領域に対して共通する値をカ卩えた値で除することにより蛍光強度 [DNA]nNを算出 することを特徴とする。
[0019] 請求項 6の発明の装置は、請求項 4又は請求項 5において指数関数的増幅領域以 前の蛍光強度 [DNA] baseを、各反応領域毎の蛍光強度 [DNA] n及び最大値若し くはそれに関連する値 [DNA]maxから差し引いて増幅曲線を描くことを特徴とする
発明の効果
[0020] 本発明では、複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域における核酸増 幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出する核酸増幅生成物のリアルタイム 検出装置において、反応領域から得られる蛍光測定値 [DNA]rawと、この反応領 域近傍における反応領域外領域から得られる蛍光測定値 [DNA]bgとを検出し、蛍 光測定値 [DNA]rawから蛍光測定値 [DNA]bgを差し引くことにより、当該反応領 域の蛍光強度 [DNA]realを決定するので、各反応領域毎に当該反応領域及びそ の周辺の光透過性の誤差や汚れ、迷走光による背景の蛍光強度を除外した当該反 応領域の核酸増幅生成物本来の蛍光強度 [DNA] realを得ることができるようになる 。これにより、正確な増幅曲線の作成と定量化を実現することが可能となる。この場合 、第 2の蛍光信号を用いる必要も無いので、コストの高騰や作業性の悪化も発生せず 、データの取得と処理に要する時間を短縮することができるようになるものである。
[0021] 請求項 2の発明では、上記に加えて蛍光測定値 [DNA]bgを、反応領域近傍にお ける複数の反応領域外領域から得られる蛍光測定値の単純平均、若しくは、所定の 重み付けを行った後の平均値としたので、より正確な背景の蛍光強度を算出して、精 度の高レ、蛍光強度 [DNA] realの決定を行うことができるようになる。
[0022] 請求項 3の発明では、上記各発明に加えて蛍光測定値 [DNA]mwの検出の都度 、蛍光測定値 [DNA]bgを検出し、当該蛍光測定値 [DNA]rawから蛍光測定値 [D NA]bgを差し引くことで、蛍光強度 [DNA]realの決定を行うようにしたので、反応中 に背景の蛍光強度が変動しても、常に核酸増幅生成物本来の蛍光強度 [DNA]rea 1をリアルタイムで精度良く得ることができるようになる。 [0023] 請求項 4の発明では、複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域におけ る核酸増幅生成物からの蛍光強度をリアルタイムで検出する核酸増幅生成物のリア ルタイム検出装置にぉレ、て、温度サイクル n回毎に各反応領域から得られる蛍光強 度 [DNA] nを、当該蛍光強度 [DNA] nの最大値若しくはそれに関連する値 [DNA ] maxを用レ、て正規化し、当該正規化された蛍光強度 [DNA] nNを用レ、て描かれる 増幅曲線の指数関数的増幅領域に閾値 Thを設定することにより、閾値サイクル数 C tを算出するようにしたので、光学系の誤差、校正溶液の濃度誤差、校正溶液の分注 誤差や反応溶液の分注誤差などの装置上の誤差要因に伴う各反応領域の蛍光強 度のバラツキを補正して低減し、確度の高い閾値サイクル数 Ctの算出が可能となる。
[0024] 請求項 5の発明では、上記に加えて反応領域毎の蛍光強度 [DNA]nを、最大値 若しくはそれに関連する値 [DNA]max、或いは、それに比較対象とする反応領域 に対して共通する値をカ卩えた値で除することにより蛍光強度 [DNA]nNを算出する ようにしたので、正規化の効果を抑制して、閾値での補正効果を充分確保しながら、 サイクル中期から後期の増幅曲線を実際のデータに近似させ、装置上の誤差要因 以外の要因に伴うデータの挙動把握を容易にすること力 Sできるようになる。
[0025] 請求項 6の発明では、請求項 4又は請求項 5に加えて指数関数的増幅領域以前の 蛍光強度 [DNA] baseを、各反応領域毎の蛍光強度 [DNA]n及び最大値若しくは それに関連する値 [DNA] maxから差し引いて増幅曲線を描くようにしたので、反応 領域の反応溶液そのものから発生する蛍光の強度を排除した核酸増幅生成物その ものからの蛍光強度の状況を把握することができるようになる。
発明を実施するための最良の形態
[0026] 以下、図面に基づき本発明の実施形態を詳述する。
実施例 1
[0027] 図 1は本発明の実施例のリアルタイム検出装置 Rの構成図、図 2は図 1のリアルタイ ム検出装置 Rを構成する反応検出装置 1の縦断側面図、図 3は反応検出装置 1の平 断面図である。本発明のリアルタイム検出装置 Rは、反応検出装置 1とこの反応検出 装置 1からの検出データをリアルタイムで処理するコンピュータから成る処理装置 Cと 力 構成される。 [0028] 実施例の反応検出装置 1は、反応試料としての染色体 DNAの増殖を行うと共に、 当該増殖に関する反応状態を光学的測定方法により検出を行う装置である。この反 応検出装置 1は、上面に反応室 4を形成した本体 3と、当該反応室 4の後方であって 本体 3の上面に配設された反応検出部 5を備えている。そして、この反応室 4には、ァ ノレミニゥム等の熱伝導性材料にて形成された反応ブロック 6が設けられてレ、る。この 反応ブロック 6には、内部に DNA (標的テンプレート： DNAなど）や各種試薬、培 地となる溶液等を混合した反応溶液を収容した複数のゥエル 7Α· ·を有する反応容 器 7を保持するための複数の保持穴 8が形成されている。
[0029] 本実施例において用レ、られる反応容器 7は、縦に 12個、横に 8個、合計 96個の反 応領域としてのゥエル 7Α· ·がー体に形成され、各ゥエル 7Α· ·が連結壁（ゥエル 7Α (反応領域)外の領域、即ち、反応領域外領域）にて連結されたマイクロプレートであ る。尚、反応容器としてはゥエルが一体成形されたものに限らず、複数本のチューブ にて構成されるものであってもよい。また、当該ゥエル 7Αの個数は、これに限られるも のではなぐこれ以外にも、例えば 384個を一体に構成したものが、取り扱い性がよ レ、。また、反応容器 7の各ゥエル 7Αは、上面に開口して形成されており、当該上面開 口は、反応溶液の温度処理による蒸発を阻止するため、シール製の蓋 9が貼り付け られている。また、本実施例において、蛍光強度の検出には当該蓋 9を透過して検出 が行われることから、光透過性の合成樹脂材料が使用される。
[0030] そして、この本体 2内には、反応ブロック 6を加熱、冷却するペルチェ素子 10を備え ている。尚、このペルチェ素子 10は、図示しない制御装置により温度制御されること で、反応ブロック 6をサイクル的に加熱 '冷却し、これにより、反応容器 7の各ゥエル 7 Α内の DNA (反応試料）の培養（増幅）が行われる。
[0031] この本体 2の後端上面に設けられた反応検出部 5から他端、本実施例では、反応 室 4が形成される本体 2前端上方にわたって暗室構成部 12が設けられる。この暗室 構成部 12の前面は、前方に向けて開放して形成されていると共に、この前面開口に は、前方に向けて低く傾斜して形成される前記カバー 2が開閉自在に設けられる。そ して、このカバー 2は、暗室構成部 12の前方、即ち、本体 3上面前部から該喑室構成 部 12内後部にわたって構成されるレール部材 13により、前後に移動可能に構成さ れ、後方に移動した状態で該カバー 2は、暗室構成部 12内に収容される。
[0032] そして、このカバー 2内には、該カバー 2が閉塞された状態で反応室 4の反応ブロッ ク 6に臨んで反応容器 7を反応ブロック 6に押しつけるための押さえ部材 15がー体に 移動自在に設けられている。この押さえ部材 15は、熱伝導性の良いアルミニウム材 などにより構成される板材であり、各ゥエル 7Aの上面に対応して複数の透孔が形成 されている。
[0033] 更に、この押さえ部材 15の上側には光学レンズとしてのフレネルレンズ 21が配設さ れる。このフレネルレンズ 21は、一般に平面上に複数の溝が形成されており、これに よって、入射した光を屈折させて拡大するものである。このとき、フレネルレンズ 21は 、入射した光を屈折させて拡大するに際して、入射光を平行若しくは平行に近い状 態に収束させて透過する光学特性を有しており、これにより、入射光は、各光路の歪 みが修整された状態で、投光されることとなる。
[0034] —方、反応ブロック 6の上方において、反応室 4の前上方を閉塞するカバー 2の反 応室 4側を構成する面には、反射板 22が配設される。本実施例における反射板 22 は、平板にて構成されるミラーなどから構成されており、詳細は後述する光源ランプ 2 3からの光をフレネルレンズ 21に向けて屈曲させるものである。
[0035] 他方、反応検出部 5内には、光源ランプ 23と、複数のバンドパスフィルタを備えたフ ィルタ装置 35と、反射板 26、 CCDカメラ 27と、フィルタ装置 35を回転させるフィルタ 駆動装置 28とを備えている。
[0036] 光源ランプ 23は、反応液内の検出対象となる DNAプロダクトの量に応じて当該反 応溶液から蛍光を励起させるための励起光を含む光を照射するランプであり、一般 にハロゲンランプが用いられる。反射板 26は、光源ランプ 23から照射された所定の 波長の光を所定の角度に屈曲させることで、反射板 22に偏光させるものである。また 、この反射板 26は、所定の蛍光を透過する性質を有している。本実施例では、反応 検出部 5の側部に配設される光源ランプ 23からの光を当該反射板 26によって前方 に屈曲させることで、当該光源ランプ 23の光が反射板 22に照射される。
[0037] フィルタ装置 35は、数種類のバンドパスフィルタを輪状に配置することにより構成さ れる装置であり、フィルタ駆動装置 28により回転することで、光源ランプ 23と反射板 2 6との間や反射板 22とカメラ 27との間に所定のバンドパスフィルタを選択して位置さ せるものである。尚、図中、光源ランプ 23と反射板 26との間に位置させるものをバン ドノスフィルタ 24とし、反射板 22とカメラ 27との間に位置させるものをバンドパスフィ ノレタ 25とする。
[0038] バンドパスフィルタ 24は、光源ランプ 23からの光の成分のうち、反応溶液から蛍光 を励起するのに必要な波長の光だけを透過する性質を有する光学フィルタであり、当 該フィルタ 24を通過した光は、反応溶液の特定成分から蛍光を励起させるための励 起光とされる。
[0039] バンドパスフィルタ 25は、反射板 22を介して反応容器 7の各ゥエル 7A内の反応溶 液から発する蛍光及び反射光から所定の蛍光成分だけを透過する性質を有する光 学フィルタであり、ここで、当該蛍光以外の反射光は遮断される。
[0040] カメラ 27は、バンドパスフィルタ 25を透過した蛍光を検出する装置であり、当該カメ ラ 27にて検出された蛍光画像が前記制御装置に取り込まれ、処理装置 Cに送信され て各反応溶液の濃度、即ち増幅量が分析される。尚、これらバンドパスフィルタ 24、 2 5は、検出対象となる反応溶液、更には、これに対応して用いられる蛍光染料の種類 に基づいて、これらバンドパスフィルタ 24、 25の組み合わせが任意に決定され、選択 的に使用されるものとする。
[0041] 以上の構成により、前記制御装置は、前記ペルチェ素子 10を制御し、反応ブロック 6の保持穴 8に保持された反応容器 7内の反応溶液を例えば + 95°Cの熱変性温度 とし、反応溶液を熱変性させる熱変性工程を行う。次いで、制御装置は、ペルチェ冷 却素子 10を制御し、反応ブロック 6を例えば + 60°Cに冷却して、反応容器 7内に収 容されて熱変性された反応溶液中の DNAのアニーリング工程と伸張工程を行う。制 御装置は、この熱変性工程と、アニーリング工程と、伸張工程を 1サイクルとして複数 回、例えば 40回繰り返すことにより、 PCR法による DNA等の培養（増幅）を行う。
[0042] この培養の過程又は、終了時において、反応検出部 5は、反応容器 7内の反応溶 液の DNAの増幅状態を検出するため、一サイクル終了後など、定期的に検出動作 を実行する。検出動作は、まず、光源ランプ 23から照射された光がバンドパスフィノレ タ 24を介して反射板 26に到達する。バンドパスフィルタ 24は、光源ランプ 23からの 光のうち、蛍光を励起させるのに必要な波長の光、即ち、励起光だけを透過させる。 当該励起光は、反射板 26により暗室構成部 12内を通過して反射板 22方向に照射 され、更に、反射板 22によって当該励起光は、反応ブロック 6に臨んで設けられるフ レネルレンズ 21に向けて、即ち、上から下方向に向かって照射される。
[0043] 当該フレネルレンズ 21に照射された励起光は、当該レンズ 21の光学特性により、 光を集束し、反応ブロック 6に収容される反応容器 7の各ゥエル 7Aに対して平行若し くは、平行に近い角度に入射角度が変更される。これにより、当該レンズ 21を透過し た励起光は、押さえ部材 15に形成された各透孔を介して平行若しくは、平行に近い 角度の入射角度にて各ゥエル 7Aに入射される。
[0044] 各ゥエル 7A内に平行若しくは平行に近い角度にて入射された励起光は、予め所 定の蛍光染料が添加されたゥエル 7A内の DNAに照射されることで、 PCRプロダクト の量に応じた蛍光を発する。この発生した蛍光及びその他の PCRプロダクトからの反 射光は、同様に押さえ部材 15に形成された各透孔及びフレネルレンズ 21を介して 反射板 22に到達する。
[0045] その後、反射板 22に到達した蛍光及びその他の反射光は、該反射板 22の作用に よって暗室構成部 12内を略水平方向に光路を形成しながら、当該反射板 22に対向 いて、暗室構成部 12内は、カバー 2が閉塞されていることにより、暗室とされているこ とから、蛍光が減衰等される不都合を抑制することができる。
[0046] このとき、反射板 26は、蛍光を透過可能とする材料にて構成されていることから、当 該反射板 26を透過した反射光及び蛍光は、バンドパスフィルタ 25に照射されることと なる。バンドパスフィルタ 25では、上述したように、当該フィルタ 25の種類に応じて、 所定の蛍光のみが透過可能とされているため、その後方に配設されるカメラ 27には、 所定の蛍光のみが照射されることとなる。
[0047] そして、カメラ 27では、受光された蛍光を撮影することにより、反応容器 7の各ゥェ ノレ 7A内の PCRプロダクトの蛍光状態を検出する。そして、この検出された各 PCRプ 口ダクトの蛍光状態に関する検出データ（図 4〜図 6に示す画像データ）は、制御装 置から処理装置 Cに送出され、この処理装置 Cにて分析されることにより、各試料の 濃度、即ち、 DNA等の増幅量を検出することができる。各ゥエル 7Aの位置と画像の 位置関係は予め分かっているので、ゥエル 7Aの画像の各ピクセルの輝度を求めるこ とで、ゥエル 7Aそれぞれの蛍光強度が測定でき、この蛍光強度から PCRプロダクト の量を把握することができる。
[0048] 処理装置 Cは、図 11に示すように反応検出装置 1から送信される検出データの処 理を行う演算処理部（CPU) 31と、この演算処理部 31に接続された記憶装置 (記憶 手段） 32、キーボード (或いはマウスなどの入力手段） 33、ディスプレイ（出力手段） 3 4、プリンタ（出力手段） 36、 FD、 CD、 DVD,メモリなどの外部記憶装置 37などから 構成されている。反応検出装置 1から送信された検出データは記憶装置 32に記憶さ れ、演算処理部 31により後述する処理が行われてディスプレイ 34などに表示出力さ れる。
[0049] 次に、この処理装置 Cにおける検出データの処理手順について説明する。図 5、図
6は反応検出装置 1から処理装置 Cに送られてくる検出データの画像である。各画像 で白く映っている 96個の丸画像がそれぞれのゥエル 7A内の PCRプロダクトから発 せられた蛍光である。尚、実施例では、 SYBR Premix Ex Taq (登録商標）をべ ~~スとし、 PCR Forward Primerと、 PCR Reverse Primerと、 Template (初期 値として与えるえ DNA)と、 dH O から反応溶液を調整する。また、図 5、図 6では上 半分の 48個のゥエル 7A内に 0. 2ρ§/ μ Lの濃度の反応溶液が分注されており（X グループ）、下半分の 48個のゥエル 7A内にはその倍の濃度の 0. 4pg/ /i Lの反応 溶液が分注されている（Yグループ)。そして、温度サイクルは 40回である。
[0050] 反応開始から温度サイクルの回数が進むと、 DNAの増幅量に応じて蛍光強度が 増加する。この過程をプロットしたものが前述した図 7の増幅曲線である。この増幅曲 線は各ゥエル 7A毎に得られ、ディスプレイ 34に表示される（図 8)。そして、キーボー ド (マウス） 33を用いて指数関数的増幅領域 (図 7の（5) )に閾値 Th (図 7の（11) )を 設定すると、そのときのサイクル数 Ct (閾値サイクル数 Ct)はこの図では 24. 5と読み 取れる。この閾値サイクル数 Ctと検查試料の初期 DNA量との間には相関関係があり 、この直線関係を示す検量線を作成できる。演算処理部 31はこの検量線をもとに検 查試料の初期 DNA量を推定する。これにより、 PCRの増幅速度論に基づいた正確 な定量が可能となる。
[0051] (A)装置上の誤差要因の除去
前述した如く反応開始前において、反応検出装置 1のカメラ 27で撮影された画像 データでは、各ピクセルの輝度は必ずしも一定では無ぐ図 4の（1)に示すように光 学系の汚れや迷走光などにより斑が発生する。反応が進むとこの斑は図 5の（2)に示 すようにゥエル 7Aの画像に重なってゥエル 7A本来の蛍光強度に冗長されてしまう。
[0052] そこで、処理装置 Cの演算処理部 31では、ゥエル本来の蛍光強度を求めるために 次の処理を実行する。即ち、例えば図 6の右から 2番目で且つ上から二段目（B11) のゥエル 7Aの場合、当該 B11のゥエル 7A (図 6の（4) )の蛍光測定値 [DNA]rawB 11を測定し、記憶装置 32に記憶する。次に、当該 B11のゥエル 7Aの近傍の連結壁 部分における周囲 4点の蛍光測定値 [DNA]bgl、 [DNA]bg2、 [DNA]bg3、 [D NA]bg4を測定し、これら 4点の蛍光測定値の平均値 (背景の蛍光測定値）を求めて 記憶装置 32に記憶する。そして、式（2)の如く蛍光測定値 [DNA]rawBl lからこの 平均値を差し弓 Iくことで、 B 11のゥエル 7A本来の蛍光強度 [DNA] realB 1を算出す る。
[DNA] realB 11 = [DNA] rawB 11一（（ [DNA] bg 1 + [DNA] bg2+ [DNA] b g3 + [DNA]bg4) /4) · ' · · (2)
[0053] この処理を蛍光測定値 [DNA]rawの検出の都度、 96個全てのゥエルについてそ れぞれ実行し、全てのゥエル 7A本来の蛍光強度 [DNA] realを決定する。これによ り、各ゥエル 7A (反応領域）毎に当該ゥエル 7A及びその周辺の光透過性の誤差や 汚れ、迷走光による背景の蛍光測定値 [DNA]bgを除外した当該ゥエル 7Aの DNA プロダクト本来の蛍光強度 [DNA] realが得られる。
[0054] 従って、正確な増幅曲線の作成と定量化を実現することが可能となる。この場合、 従来例で説明した第 2の蛍光信号を用レ、る必要も無ぐ処理装置 Cにおける演算処 理のみで済むので、コストの高騰や作業性の悪化も発生せず、データの取得と処理 に要する時間を短縮することができるようになる。
[0055] 尚、実施例ではゥエル 7Aの周囲 4点の蛍光測定値 [DNA]bgl、 [DNA]bg2、 [D NA]bg3、 [DNA]bg4を測定してその平均値を蛍光測定値 [DNA]rawから差し引 いたが、それに限らず、 1点或いは 2点若しくは 3点の平均でもよい。但し、実施例の ように 4点の平気値を用いれば、より正確は背景の蛍光強度を算出して精度の高い 蛍光強度 [DNA] realの決定を行うことができるようになる。また、実施例ではゥエル 7 A周囲 4点の蛍光測定値の単純平均を使用した力 それに限らず、汚れ具合の斑も 考慮し、各点毎に所定の重み付けを行った後に平均してもよい。
[0056] また、反応前と反応後で背景の蛍光強度の変動（ドリフト）は明確ではない。しかし ながら、実施例では蛍光測定値 [DNA]rawの検出の都度、蛍光測定値 [DNA]bg 1〜 [DNA] bg4を検出し、蛍光測定値 [DNA] rawから蛍光測定値 [DNA] bg 1〜 [ DNA]bg4の平均値を差し引き、蛍光強度 [DNA] realを決定しているので、反応中 に背景の蛍光強度が変動しても、常に DNAプロダクト本来の蛍光強度 [DNA]real をリアルタイムで精度良く得ることができる。
[0057] (B)正規化 1
次に、図 8は 96個の全てのゥエル 7Aの増幅曲線を示している。横軸は温度サイク ル数、縦軸は蛍光強度である。前述した如く図 5、図 6の上半分の Xグループと下半 分の Yグループで濃度の異なる反応溶液が分注してある関係上、本来ならば反応曲 線は 2本の線に見えなければならなレ、。また、閾値サイクル数 Ctも 2点となるはずで ある。し力しながら、前述した光学系の誤差、校正溶液の濃度誤差、校正溶液の分 注誤差や反応溶液の分注誤差などの装置上の誤差要因により、各ゥエル 7Aの増幅 曲線はバラツキ、閾値サイクル数 Ctも（8)、（9)のように複数生じる（バラツキ）。
[0058] そこで、演算処理部 31はキーボード（マウス） 33からの所定の選択指令に基づき、 データの正規化を行う。即ち、演算処理部 31は、温度サイクル数 n毎に決定して記 憶装置 32に記憶している蛍光強度 [DNA]n (温度サイクル数 n回目の本来の蛍光 強度 [DNA]real)と、各ゥエル 7A毎の蛍光強度の最大値 [DNA] max (温度サイク ル数 n回目までの蛍光強度 [DNA]realのうちで最大のもの。記憶装置 32に記憶さ れている。）と、比較対象とするゥエル 7A (実施例では全ゥエル 7A)に共通する値 Z を用レ、、式（3)の演算により正規化された蛍光強度 [DNA]nNを得る。
[DNA] nN = [DNA] n/ ( [DNA] max + Z) …（3)
[0059] この処理により、各ゥエル 7Aの蛍光強度は正規化される。図 9は Z=0の場合であ る。この正規化により、各ゥエル 7Aの装置上の誤差要因に伴う蛍光強度のバラツキ が補正低減されるので、 Xグループ、 Yグループそれぞれで閾値サイクル数 Ctのバラ ツキが図 8の場合に比して低減される。これにより、確度の高い閾値サイクル数の算 出が可能となる。尚、図 9では全体のスケールを適当な値にするために [DNA] nN に全ゥエル共通の値を乗算して表示してレ、る。
[0060] (C)正規化 2
ここで、サイクル後期のプラトー領域で蛍光強度がばらつく要因としては、上述した 装置上の誤差要因だけでなぐケミカルな反応のバラツキによっても発生する。そして 、その要因に関しては指数関数的増幅領域の蛍光強度に比例的に影響しないこと が考えられる。即ち、プラトー効果の領域での蛍光強度を完全に一致させないほうが 良い場合もある。
[0061] その場合は、キーボード（マウス） 33を用いて式（3)の Zの値を大きくする。図 10は Z = 20000とした場合の各ゥエル 7A毎の増幅曲線を示している。 Zの値を大きくする と云うことは、正規化の効果を弱くしていることになる。し力 ながら、図 10では特にサ イタル中期から後期の増幅曲線の挙動が実際の蛍光強度の動き（図 8)に近似してい ること力 S分力る。一方で、閾値での補正効果は充分確保されていることが分かる。こ れにより、正規化の効果を抑制して、閾値での補正効果を充分確保しながら、サイク ル中期から後期の増幅曲線を実際のデータに近似させ、装置上の誤差要因以外の 要因に伴うデータの挙動把握を容易にすることができるようになる。
[0062] ここで、このような不完全な正規化を行う際には、式 (4)のように Zの値を決定しても よい。
Z = a [DNA] max + β …（4)
、 βは各ゥエル 7Αに共通する係数。
また、演算処理部 31は前述した最大値 [DNA] maxを、蛍光強度の移動平均で算 出している。なぜならば蛍光強度 [DNA] realは実際にはのこぎり状を呈するからで ある。し力 ながら、正規化に使用する最大値としては、このノコギリのピーク値であつ てもよく、当該ピーク値の例えば 90%などの数値 (何れも最大値に関連する値）を使 用しても差し支えない。 [0063] (D)ベースラインの補正
ここで、図 8の（10)はサイクル初期で反応結果を検出できないレベルの領域である 1S ゥエル 7A内の反応溶液そのものが最初から一定の蛍光を発生しているので、こ の領域でも一般的には蛍光強度は 0では無い。そこで、キーボード（マウス） 33からの 指示に基づき、演算処理部 31はベースラインの補正を行う。即ち、演算処理部 31は 、サイクル初期の領域（10)での各ゥエル 7Aの蛍光強度の平均値 [DNA] baseをべ ースラインとし、この平均値を前述した [DNA]n及び [DNA]maxから差し引いてか ら上述した正規化の処理を行っている。図 9、図 10で初期の蛍光強度が 0となってい るのは、この処理を行っているためである（[DNA]baseは [DNA]nの最小値を使用 しても差し支えない）。
[0064] これにより、ゥエル 7A内の反応溶液そのものから発生する蛍光の強度を排除した P CRプロダクトそのものからの蛍光強度の状況を把握することができるようになる。
[0065] 尚、上記実施例で示した物質、量、数はそれに限定されるものでないことは云うまで もない。
図面の簡単な説明
[0066] [図 1]本発明の実施例のリアルタイム検出装置の構成図である。
[図 2]図 1のリアルタイム検出装置を構成する反応検出装置の縦断側面図である。
[図 3]図 2の反応検出装置の平断面図である。
[図 4]反応容器の背景の蛍光強度の状態を示す図である。
[図 5]反応後の蛍光強度の状態を示す図である。
[図 6]反応後の蛍光強度の状態を示すもう一つの図である。
[図 7]或るゥエルの DNA増幅曲線である。
[図 8]全ゥエルの DNA増幅曲線である。
[図 9]図 8のデータを正規化した場合の DNA増幅曲線である。
[図 10]図 8のデータの不完全な正規化を行った場合の DNA増幅曲線である。
[図 11]図 1のリアルタイム検出装置を構成する処理装置の機能ブロック図である。

Claims

請求の範囲
[1] 複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域における核酸増幅生成物から の蛍光強度をリアルタイムで検出する装置であって、
前記反応領域力 得られる蛍光測定値 [DNA]mwと、該反応領域近傍における 反応領域外領域力 得られる蛍光測定値 [DNA]bgとを検出し、前記蛍光測定値 [ DNA]rawから前記蛍光測定値 [DNA]bgを差し引くことにより、当該反応領域の蛍 光強度 [DNA]realを決定することを特徴とする核酸増幅生成物のリアルタイム検出 装置。
[2] 前記蛍光測定値 [DNA]bgは、前記反応領域近傍における複数の反応領域外領 域から得られる蛍光測定値の単純平均、若しくは、所定の重み付けを行った後の平 均値であることを特徴とする請求項 1に記載の核酸増幅生成物のリアルタイム検出装 置。
[3] 前記蛍光測定値 [DNA]rawの検出の都度、前記蛍光測定値 [DNA]bgを検出し 、当該蛍光測定値 [DNA]rawから蛍光測定値 [DNA]bgを差し引くことで、前記蛍 光強度 [DNA]realの決定を行うことを特徴とする請求項 1又は請求項 2に記載の核 酸増幅生成物のリアルタイム検出装置。
[4] 複数の反応領域に温度サイクルを与え、各反応領域における核酸増幅生成物から の蛍光強度をリアルタイムで検出する装置であって、
前記温度サイクル n回毎に各反応領域力 得られる蛍光強度 [DNA]nを、当該蛍 光強度 [DNA] nの最大値若しくはそれに関連する値 [DNA] maxを用レ、て正規化 し、当該正規化された蛍光強度 [DNA]nNを用いて描かれる増幅曲線の指数関数 的増幅領域に閾値 Thを設定することにより、閾値サイクル数 Ctを算出することを特 徴とする核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置。
[5] 前記反応領域毎の蛍光強度 [DNA]nを、前記最大値若しくはそれに関連する値 [ DNA]max、或いは、それに比較対象とする前記反応領域に対して共通する値を加 えた値で除することにより前記蛍光強度 [DNA]nNを算出することを特徴とする請求 項 4に記載の核酸増幅生成物のリアルタイム検出装置。
[6] 前記指数関数的増幅領域以前の前記蛍光強度 [DNA] baseを、前記各反応領域 毎の蛍光強度 [DNA]n及び最大値若しくはそれに関連する値 [DNA] maxから差 し引いて前記増幅曲線を描くことを特徴とする請求項 4又は請求項 5に記載の核酸 増幅生成物のリアルタイム検出装置。
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