KR20080103548A

KR20080103548A - 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치

Info

Publication number: KR20080103548A
Application number: KR1020087021716A
Authority: KR
Inventors: 유우이찌 다마오끼; 아끼후미 이와마; 야스아끼 소노다
Original assignee: 산요덴키가부시키가이샤
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2008-11-27
Also published as: JP4854334B2; CN103232936A; EP1992682B1; US20140335531A1; CN101395261A; US10544453B2; EP1992682A4; CN103232936B; WO2007102400A1; CN101395261B; JP2007236219A; EP1992682A1; KR101344673B1; US20090155891A1

Abstract

수정을 위해 사용하는 제2 형광 신호를 사용하는 일 없이, 장치상의 오차 요인을 효과적으로 배제 또는 저감시킬 수 있는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치를 제공한다. 복수의 웰(7A)에 온도 사이클을 부여하여, 각 웰(7A)에 있어서의 핵산 증폭 생성물로부터의 형광 강도를 실시간으로 검출한다. 웰(7A)로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]raw와, 이 웰(7A) 근방에 있어서의 주변의 연결벽으로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]bg를 검출하고, 형광 측정값 [DNA]raw로부터 형광 측정값 [DNA]bg를 뺌으로써 당해 웰(7A)의 형광 강도 [DNA]real을 결정한다.

웰, 형광 강도, 반응 블록, 검출 장치, 반사판

Description

핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치 {APPARATUS FOR REAL-TIME DETECTION OF NUCLEIC ACID AMPLIFICATION PRODUCT}

본 발명은 폴리메라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction : PCR)으로부터 얻어지는 폴리뉴클레오티드 생성물을 실시간으로 검출하는 장치에 관한 것이다.

PCR은 DNA 사슬을 복제하는 순환적인 효소 반응으로, 이전의 사이클에서 복제된 PCR 프로덕트(핵산 증폭 생성물)가 연속되는 사이클의 템플릿으로서 사용되게 되는 관계상, 목적으로 하는 표적 배열 분자를 지수 함수적으로 증폭시킬 수 있다. 실시간 PCR은, 예를 들어 서로 간섭하는 2종류의 형광 색소로 표식한 배열 특이적인 프로브(TaqMan 프로브)를 사용하여, PCR 프로덕트에 여기광을 쬐어 형광을 여기시키고, 이 형광 강도를 측정함으로써 PCR 프로덕트의 증폭을 실시간으로 모니터링한다.

그리고 정량적으로 사용할 때에는, 기지 시료에 있어서의 증폭 곡선의 지수 함수적 증폭 영역에 임계값[도7의 (6)]을 설정하고, 이 임계값과 증폭 곡선이 교차되는 점[임계값 사이클 수 Ct. 도7의 (8)]을 산출한다. 이 임계값 사이클 수 Ct와 검사 시료의 초기 DNA량의 사이에는 초기 DNA량을 Log값으로 눈금을 그은 바, 직선 관계가 있고 이 직선 관계를 나타내는 검량선(檢量線)을 작성할 수 있다. 이 검량선을 바탕으로 검사 시료의 초기 DNA량을 추정한다. 이에 의해, PCR의 증폭 속도론을 기초로 한 정확한 정량이 가능하다.

여기서, 실제의 PCR 효율은 100 ％가 아니므로, 증폭되는 PCR 프로덕트의 농도는 식 (1)로 나타내어진다.

[DNA] = [DNA]₀(1 + e)^c …… (1)

[DNA] : PCR 프로덕트의 농도

[DNA]₀ : 표적 템플릿의 초기 농도

e : 평균 PCR 효율

c : 사이클 수

즉, 평균 PCR 효율 e가 100 ％[즉, 상기 식 (1)에 있어서 e = 1]이면, PCR 프로덕트의 농도 [DNA]는 2의 사이클 수 제곱으로 지수 함수적으로 증폭해 가지만, 사이클의 초기와 중기와 후기에서 효율 e가 서서히 저하되므로, 증폭 곡선은 도7에 나타내는 바와 같은 상황으로 된다. 도7의 횡축은 사이클 수, 종축은 형광 강도를 나타내고 있고, 사이클 초기에서는 지수 함수적으로 증폭하고[도7의 (5)], 사이클 중기에서는 직선 함수적으로 되고[도7의 (6)], 사이클 후기에서는 플래토 효과(plateau effect)에 의해 증폭하지 않게 된다[도7의 (7)].

또한, 이 플래토 효과를 야기시키는 화학 반응적인 요인으로서는 다음과 같은 것이 있다.

·dNTP와 프라이머의 가수 분해

·DNA 폴리메라제[템플릿(주형)의 카피를 만들기 위한 DNA 합성 효소]의 열에 의한 실활

·1개 사슬 PCR 프래그먼트의 재회합에 의한 프라이머 어닐링 효율의 저하

·비특이적 PCR 프로덕트에 의한 경합 소재

·피로포스페이트와 같은 PCR 저해 물질의 축적

·DNA 폴리메라제의 엑소누클레아제 활성에 의한 PCR 프로덕트의 가수 분해

따라서, 실시간 PCR에 있어서는 상기 식 (1)의 관계가 성립되는 지수 함수적 증폭 영역에서의 측정이 전제 조건이 된다(특허 문헌 1 참조).

특허 문헌 1 : 일본 특허 출원 공표 제2005-516630호 공보

특허 문헌 2 : 일본 특허 제2909216호 공보

또한, 실시간 PCR에 사용되는 반응 용기로서는 복수의 웰(오목부로 구성되는 반응 영역. 예를 들어, 96개)을 갖는 마이크로 플레이트라 불리는 용기가 일반적으로 사용되고, 각 웰에 소정의 초기 DNA 농도의 반응 용액이 분주(分注)되지만, 장치상의 오차 요인으로서는 다음과 같은 것에 의해 반응 용기의 웰마다 증폭 곡선이 변동된다.

·광학계의 오차

·교정 용액의 농도 오차

·교정 용액의 분주 오차

·반응 용기의 덮개나 밀봉 필름의 광 투과성 오차

·반응 용기의 오염 오차

·반응 용액의 분주 오차

여기서, 반응 용기(마이크로 플레이트)는 한쪽 면의 전역에 접착제가 접착된 전술한 밀봉 필름을 부착함으로써 웰에 뚜껑을 덮는 방법이 저렴한 것으로서 주류로 되어 있다. 그리고 이 밀봉 필름을 통과하여 여기광이 각 웰에 조사되고, PCR 프로덕트(반응물)가 발한 형광도 이 밀봉 필름을 통과하여 CCD 카메라 등의 광 검출부에 의해 검출된다(이들이 장치의 광학계를 구성함). 이와 같이 밀봉 필름이나 반응 용기의 본체는 형광 강도의 측정상 광학계의 중요한 요소를 구성하고 있음에도 불구하고, 이들은 소모품이므로 균일하고 정밀도가 높은 광학 성능을 기대하는 것은 곤란하다.

도4는 광 검출부에 의해 검출되는 PCR 앞의 반응 용기의 실제 화상이다. 반응 용기의 웰의 주위는 전체적으로는 검게 보이지만, 배경이 되는 이 화상의 각 픽셀의 휘도(배경의 형광 강도)는 반드시 일정한 것은 아니며, 도4의 (1)로 나타내는 바와 같이 광학계의 오염이나, 미주광(迷走光, stray light) 등에 의해 불균일이 발생하고 있다. PCR 반응이 개시되면, 이 불균일은 도5 중에 (2)로 나타내는 바와 같이 웰 부분의 화상(도5에 둥글게 찍혀 있는 96개의 화상)에 겹쳐 웰 본체의 형광 강도로 쓸데없이 길어져 되어 버린다.

그래서 종래에는, 처음에 DNA가 들어 있지 않은 빈 반응 용기를 준비하고, 각 웰마다 빈 상태의 형광 강도를 측정하여 스탠다드한 보정값으로서 기억한다. 그리고 실제의 형광 강도의 측정치로부터 기억된 보정값을 빼는 보정 처리를 행함으로써 이러한 광학계의 교정을 행하고 있었다. 그러나 빈 반응 용기의 오염에 의한 오차는 각 반응 용기 고유의 것이므로, 스탠다드하게 된 다른 빈 반응 용기에 의한 보정값을 이용한 경우 측정치에 오차가 발생되는 문제가 있었다.

또한, 특허 문헌 2에서는 제1 형광 신호를 제2 형광 신호로 수정하고 있지만, 본래 측정해야 하는 제1 형광을 발하는 용액 외에, 참조용의 제2 형광을 발하는 용액을 추가해야 하므로 작업이 번잡해지는 동시에 비용도 상승하게 된다. 또한, 제2 형광을 발하는 용액은 매우 고정밀도로 분주되어, 정밀도 좋게 측정되지 않으면 효과가 얻어지지 않는다. 또한, 제2 형광을 측정하기 위해 각별한 광학 필터를 장비해야 하고, 또한 측정시마다 광학 필터를 제1 형광을 발하는 용액용과 제2 형광을 발하는 용액용으로 교체해야 하는 등, 데이터의 취득과 처리에 필요로 하는 시간이 필요 이상으로 필요해지는 문제가 있다.

본 발명은 이러한 종래의 기술적 과제를 해결하기 위해 이루어진 것이며, 수정을 위해 사용하는 제2 형광 신호를 사용하는 일 없이 장치상의 오차 요인을 효과적으로 배제 또는 저감시킬 수 있는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

청구항 1의 발명의 장치는, 복수의 반응 영역에 온도 사이클을 부여하여, 각 반응 영역에 있어서의 핵산 증폭 생성물로부터의 형광 강도를 실시간으로 검출하는 것이며, 반응 영역으로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]raw와, 이 반응 영역 근방에 있어서의 반응 영역 외 영역으로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]bg를 검출하고, 형광 측정값 [DNA]raw로부터 형광 측정값 [DNA]bg를 뺌으로써, 당해 반응 영역의 형광 강도 [DNA]real을 결정하는 것을 특징으로 한다.

청구항 2의 발명의 장치는, 상기에 있어서 형광 측정값 [DNA]bg는 반응 영역 근방에 있어서의 복수의 반응 영역 외 영역으로부터 얻어지는 형광 측정값의 단순 평균, 혹은 소정의 가중치를 부여한 후의 평균값인 것을 특징으로 한다.

청구항 3의 발명의 장치는, 상기 각 발명에 있어서 형광 측정값 [DNA]raw의 검출시마다 형광 측정값 [DNA]bg를 검출하고, 당해 형광 측정값 [DNA]raw로부터 형광 측정값 [DNA]bg를 뺌으로써 형광 강도 [DNA]real의 결정을 행하는 것을 특징으로 한다.

청구항 4의 발명의 장치는, 복수의 반응 영역에 온도 사이클을 부여하여, 각 반응 영역에 있어서의 핵산 증폭 생성물로부터의 형광 강도를 실시간으로 검출하는 것이며, 온도 사이클 n회마다 각 반응 영역으로부터 얻어지는 형광 강도 [DNA]n을, 당해 형광 강도 [DNA]n의 최대값 혹은 그에 관련되는 값 [DNA]max를 사용하여 정규화하고, 당해 정규화된 형광 강도 [DNA]nN을 사용하여 그려지는 증폭 곡선의 지수 함수적 증폭 영역에 임계값 Th를 설정함으로써, 임계값 사이클 수 Ct를 산출하는 것을 특징으로 한다.

청구항 5의 발명의 장치는, 상기에 있어서 반응 영역마다의 형광 강도 [DNA]n을 최대값 혹은 그에 관련되는 값 [DNA]max, 혹은 그것에 비교 대상으로 되는 반응 영역에 대해 공통되는 값을 더한 값으로 나눔으로써 형광 강도 [DNA]nN을 산출하는 것을 특징으로 한다.

청구항 6의 발명의 장치는, 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서 지수 함수적 증폭 영역 이전의 형광 강도 [DNA]base를, 각 반응 영역마다의 형광 강도 [DNA]n 및 최대값 혹은 그에 관련되는 값 [DNA]max로부터 빼고 증폭 곡선을 그리는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 복수의 반응 영역에 온도 사이클을 부여하여, 각 반응 영역에 있어서의 핵산 증폭 생성물로의 형광 강도를 실시간으로 검출하는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치에 있어서, 반응 영역으로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]raw와, 이 반응 영역 근방에 있어서의 반응 영역 외 영역으로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]bg를 검출하고, 형광 측정값 [DNA]raw로부터 형광 측정값 [DNA]bg를 뺌으로써, 당해 반응 영역의 형광 강도 [DNA]real을 결정하므로, 각 반응 영역마다 당해 반응 영역 및 그 주변의 광 투과성의 오차나 오염, 미주광에 의한 배경의 형광 강도를 제외한 당해 반응 영역의 핵산 증폭 생성물 본래의 형광 강도 [DNA]real을 얻을 수 있게 된다. 이에 의해, 정확한 증폭 곡선의 작성과 정량화를 실현하는 것이 가능해진다. 이 경우, 제2 형광 신호를 사용할 필요도 없으므로, 비용의 상승이나 작업성의 악화도 발생하지 않고 데이터의 취득과 처리에 필요로 하는 시간을 단축할 수 있게 되는 것이다.

청구항 2의 발명에서는, 상기에 부가하여 형광 측정값 [DNA]bg를 반응 영역 근방에 있어서의 복수의 반응 영역 외 영역으로부터 얻어지는 형광 측정값의 단순평균, 혹은 소정의 가중치를 부여한 후의 평균치로 하였으므로, 보다 정확한 배경의 형광 강도를 산출하여 정밀도가 높은 형광 강도 [DNA]real의 결정을 행할 수 있게 된다.

청구항 3의 발명에서는, 상기 각 발명에 부가하여 형광 측정값 [DNA]raw의 검출시마다 형광 측정값 [DNA]bg를 검출하고, 당해 형광 측정값 [DNA]raw로부터 형광 측정값 [DNA]bg를 뺌으로써 형광 강도 [DNA]real의 결정을 행하도록 하였으므로, 반응 중에 배경의 형광 강도가 변동해도 항시 핵산 증폭 생성물 본래의 형광 강도 [DNA]real을 실시간으로 정밀도 좋게 얻을 수 있게 된다.

청구항 4의 발명에서는, 복수의 반응 영역에 온도 사이클을 부여하고, 각 반응 영역에 있어서의 핵산 증폭 생성물로부터의 형광 강도를 실시간으로 검출하는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치에 있어서, 온도 사이클 n회마다 각 반응 영역으로부터 얻어지는 형광 강도 [DNA]n을, 당해 형광 강도 [DNA]n의 최대값 혹은 그에 관련되는 값 [DNA]max를 사용하여 정규화하고, 당해 정규화된 형광 강도 [DNA]nN을 사용하여 그려지는 증폭 곡선의 지수 함수적 증폭 영역에 임계값 Th를 설정함으로써 임계값 사이클 수 Ct를 산출하도록 하였으므로, 광학계의 오차, 교정 용액의 농도 오차, 교정 용액의 분주 오차나 반응 용액의 분주 오차 등의 장치상의 오차 요인에 수반되는 각 반응 영역의 형광 강도의 편차를 보정하여 저감하고, 정확도가 높은 임계값 사이클 수 Ct의 산출이 가능해진다.

청구항 5의 발명에서는, 상기에 부가하여 반응 영역마다의 형광 강도 [DNA]n을, 최대값 혹은 그에 관련되는 값 [DNA]max, 혹은 그것에 비교 대상으로 되는 반응 영역에 대해 공통되는 값을 더한 값으로 나눔으로써 형광 강도 [DNA]nN을 산출하도록 하였으므로 정규화의 효과를 억제하여 임계값에서의 보정 효과를 충분히 확보하면서 사이클 중기로부터 후기의 증폭 곡선을 실제의 데이터에 근사시키고, 장치상의 오차 요인 이외의 요인에 수반되는 데이터의 거동 파악을 용이하게 할 수 있게 된다.

청구항 6의 발명에서는, 청구항 4 또는 청구항 5에 부가하여 지수 함수적 증폭 영역 이전의 형광 강도 [DNA]base를 각 반응 영역마다의 형광 강도 [DNA]n 및 최대값 혹은 그에 관련되는 값 [DNA]max로부터 빼고 증폭 곡선을 그리도록 하였으므로, 반응 영역의 반응 용액 자체로부터 발생하는 형광의 강도를 배제한 핵산 증폭 생성물 자체로부터의 형광 강도의 상황을 파악할 수 있게 된다.

도1은 본 발명의 실시예의 실시간 검출 장치의 구성도이다.

도2는 도1의 실시간 검출 장치를 구성하는 반응 검출 장치의 종단 측면도이다.

도3은 도2의 반응 검출 장치의 평단면도이다.

도4는 반응 용기의 배경의 형광 강도의 상태를 도시하는 도면이다.

도5는 반응 후의 형광 강도의 상태를 도시하는 도면이다.

도6은 반응 후의 형광 강도의 상태를 도시하는 다른 하나의 도면이다.

도7은 임의의 웰의 DNA 증폭 곡선이다.

도8은 전체 웰의 DNA 증폭 곡선이다.

도9는 도8의 데이터를 정규화한 경우의 DNA 증폭 곡선이다.

도10은 도8의 데이터의 불완전한 정규화를 행한 경우의 DNA 증폭 곡선이다.

도11은 도1의 실시간 검출 장치를 구성하는 처리 장치의 기능 블록도이다.

이하, 도면을 기초로 하여 본 발명의 실시 형태를 상세하게 서술한다.

<제1 실시예>

도1은 본 발명의 실시예의 실시간 검출 장치(R)의 구성도, 도2는 도1의 실시간 검출 장치(R)를 구성하는 반응 검출 장치(1)의 종단 측면도, 도3은 반응 검출 장치(1)의 평단면도이다. 본 발명의 실시간 검출 장치(R)는 반응 검출 장치(1)와 이 반응 검출 장치(1)로부터의 검출 데이터를 실시간으로 처리하는 컴퓨터로 이루어지는 처리 장치(C)로 구성된다.

실시예의 반응 검출 장치(1)는 반응 시료로서의 염색체 DNA의 증식을 행하는 동시에, 당해 증식에 관한 반응 상태를 광학적 측정 방법에 의해 검출을 행하는 장치이다. 이 반응 검출 장치(1)는 상면에 반응실(4)을 형성한 본체(3)와, 당해 반응실(4)의 후방이며 본체(3)의 상면에 배치된 반응 검출부(5)를 구비하고 있다. 그리고 이 반응실(4)에는 알루미늄 등의 열전도성 재료로 형성된 반응 블록(6)이 설치되어 있다. 이 반응 블록(6)에는 내부에 DNA(표적 템플릿 : λDNA 등)나 각종 시약, 배지(培地)가 되는 용액 등을 혼합한 반응 용액을 수용한 복수의 웰(7A ‥)을 갖는 반응 용기(7)를 보유 지지하기 위한 복수의 보유 지지 구멍(8)이 형성되어 있다.

본 실시예에 있어서 사용되는 반응 용기(7)는, 세로로 12개, 가로로 8개, 합계 96개의 반응 영역으로서의 웰(7A ‥)이 일체로 형성되고, 각 웰(7A ‥)이 연결벽[웰(7A)(반응 영역) 외의 영역, 즉 반응 영역 외 영역]으로 연결된 마이크로 플 레이트이다. 또한, 반응 용기로서는 웰이 일체 성형된 것에 한정되지 않고, 복수개의 튜브로 구성되는 것이라도 좋다. 또한, 당해 웰(7A)의 개수는 이에 한정되는 것은 아니며, 이 이외에도 예를 들어 384개를 일체로 구성한 것이 취급성이 좋다. 또한, 반응 용기(7)의 각 웰(7A)은 상면에 개구되어 형성되어 있고, 당해 상면 개구는 반응 용액의 온도 처리에 의한 증발을 저지하기 위해 밀봉제의 덮개(9)가 부착되어 있다. 또한, 본 실시예에 있어서 형광 강도의 검출에는 당해 덮개(9)를 투과하여 검출이 행해지므로 광 투과성의 합성 수지 재료가 사용된다.

그리고 이 본체(2) 내에는 반응 블록(6)을 가열, 냉각하는 펠티에 소자(10)를 구비하고 있다. 또한, 이 펠티에 소자(10)는 도시하지 않은 제어 장치에 의해 온도 제어됨으로써, 반응 블록(6)을 사이클적으로 가열·냉각하고, 이에 의해 반응 용기(7)의 각 웰(7A) 내의 DNA(반응 시료)의 배양(증폭)이 행해진다.

이 본체(2)의 후단부 상면에 설치된 반응 검출부(5)로부터 타단부, 본 실시예에서는 반응실(4)이 형성되는 본체(2) 전단부 상방에 걸쳐 암실 구성부(12)가 설치된다. 이 암실 구성부(12)의 전방면은 전방을 향해 개방되어 형성되어 있는 동시에, 이 전방면 개구에는 전방을 향해 낮게 경사져 형성되는 상기 커버(2)가 개폐 가능하게 설치된다. 그리고 이 커버(2)는 암실 구성부(12)의 전방, 즉 본체(3) 상면 전방부로부터 상기 암실 구성부(12) 내 후방부에 걸쳐 구성되는 레일 부재(13)에 의해 전후로 이동 가능하게 구성되고, 후방으로 이동한 상태에서 상기 커버(2)는 암실 구성부(12) 내에 수용된다.

그리고 이 커버(2) 내에는, 상기 커버(2)가 폐색된 상태에서 반응실(4)의 반 응 블록(6)에 면하여 반응 용기(7)를 반응 블록(6)에 압박하기 위한 압박 부재(15)가 일체로 이동 가능하게 설치되어 있다. 이 압박 부재(15)는 열전도성이 좋은 알루미늄재 등에 의해 구성되는 판재이며, 각 웰(7A)의 상면에 대응하여 복수의 투과 구멍이 형성되어 있다.

또한, 이 압박 부재(15)의 상측에는 광학 렌즈로서의 프레넬 렌즈(21)가 배치된다. 이 프레넬 렌즈(21)는 일반적으로 평면 상에 복수의 홈이 형성되어 있고, 이에 의해 입사한 광을 굴절시켜 확대하는 것이다. 이때, 프레넬 렌즈(21)는 입사한 광을 굴절시켜 확대할 때에 입사광을 평행 혹은 평행에 가까운 상태에 수렴시켜 투과하는 광학 특성을 갖고 있고, 이에 의해 입사광은 각 광로의 왜곡이 수정된 상태에서 투광되는 것으로 된다.

한편, 반응 블록(6)의 상방에 있어서 반응실(4)의 전방 상방을 폐색하는 커버(2)의 반응실(4)측을 구성하는 면에는 반사판(22)이 배치된다. 본 실시예에 있어서의 반사판(22)은 평판으로 구성되는 미러 등으로 구성되어 있고, 상세한 것은 후술하는 광원 램프(23)로부터의 광을 프레넬 렌즈(21) 향해 굴곡시키는 것이다.

한편, 반응 검출부(5) 내에는 광원 램프(23)와, 복수의 밴드 패스 필터를 구비한 필터 장치(35)와, 반사판(26), CCD 카메라(27)와, 필터 장치(35)를 회전시키는 필터 구동 장치(28)를 구비하고 있다.

광원 램프(23)는 반응액 내의 검출 대상으로 되는 DNA 프로덕트의 양에 따라서 당해 반응 용액으로부터 형광을 여기시키기 위한 여기광을 포함하는 광을 조사하는 램프이며, 일반적으로 할로겐 램프가 사용된다. 반사판(26)은 광원 램프(23) 로부터 조사된 소정의 파장의 광을 소정의 각도로 굴곡시킴으로써, 반사판(22)에 편광시키는 것이다. 또한, 이 반사판(26)은 소정의 형광을 투과하는 성질을 갖고 있다. 본 실시예에서는 반응 검출부(5)의 측부에 배치되는 광원 램프(23)로부터의 광을 당해 반사판(26)에 의해 전방으로 굴곡시킴으로써 당해 광원 램프(23)의 광이 반사판(22)에 조사된다.

필터 장치(35)는 수 종류의 밴드 패스 필터를 고리 형상으로 배치함으로써 구성되는 장치이며, 필터 구동 장치(28)에 의해 회전함으로써 광원 램프(23)와 반사판(26)의 사이나 반사판(22)과 카메라(27)의 사이에 소정의 밴드 패스 필터를 선택하여 위치시키는 것이다. 또한, 도면 중 광원 램프(23)와 반사판(26)의 사이에 위치시키는 것을 밴드 패스 필터(24)라 하고, 반사판(22)과 카메라(27)의 사이에 위치시키는 것을 밴드 패스 필터(25)라 한다.

밴드 패스 필터(24)는 광원 램프(23)로부터의 광의 성분 중, 반응 용액으로부터 형광을 여기하는 데 필요한 파장의 광만을 투과하는 성질을 갖는 광학 필터이며, 당해 필터(24)를 통과한 광은 반응 용액의 특정 성분으로부터 형광을 여기시키기 위한 여기광이 된다.

밴드 패스 필터(25)는 반사판(22)을 통해 반응 용기(7)의 각 웰(7A) 내의 반응 용액으로부터 발하는 형광 및 반사광으로부터 소정의 형광 성분만을 투과하는 성질을 갖는 광학 필터이며, 여기서 당해 형광 이외의 반사광은 차단된다.

카메라(27)는 밴드 패스 필터(25)를 투과한 형광을 검출하는 장치이며, 당해 카메라(27)에서 검출된 형광 화상이 상기 제어 장치에 취입되고 처리 장치(C)로 송 신되어 각 반응 용액의 농도, 즉 증폭량이 분석된다. 또한, 이들 밴드 패스 필터(24, 25)는 검출 대상으로 되는 반응 용액, 또는 이에 대응하여 사용되는 형광 염료의 종류를 기초로 하여 이들 밴드 패스 필터(24, 25)의 조합이 임의로 결정되어 선택적으로 사용되는 것으로 한다.

이상의 구성에 의해, 상기 제어 장치는 상기 펠티에 소자(10)를 제어하고, 반응 블록(6)의 보유 지지 구멍(8)에 보유 지지된 반응 용기(7) 내의 반응 용액을 예를 들어 +95 ℃에서의 열변성 온도로 하여, 반응 용액을 열변성시키는 열변성 공정을 행한다. 계속해서, 제어 장치는 펠티에 냉각 소자(10)를 제어하고, 반응 블록(6)을 예를 들어 +60 ℃로 냉각하여, 반응 용기(7) 내에 수용되어 열변성된 반응 용액 중의 DNA의 어닐링 공정과 신장 공정을 행한다. 제어 장치는 이 열변성 공정과, 어닐링 공정과, 신장 공정을 1사이클로 하여 복수회, 예를 들어 40회 반복함으로써 PCR법에 의한 DNA 등의 배양(증폭)을 행한다.

이 배양의 과정 또는 종료시에 있어서, 반응 검출부(5)는 반응 용기(7) 내의 반응 용액의 DNA의 증폭 상태를 검출하기 위해 1사이클 종료 후 등, 정기적으로 검출 동작을 실행한다. 검출 동작은, 우선 광원 램프(23)로부터 조사된 광이 밴드 패스 필터(24)를 통해 반사판(26)에 도달한다. 밴드 패스 필터(24)는 광원 램프(23)로부터의 광 중, 형광을 여기시키는 데 필요한 파장의 광, 즉 여기광만을 투과시킨다. 당해 여기광은 반사판(26)에 의해 암실 구성부(12) 내를 통과하여 반사판(22) 방향으로 조사되고, 또한 반사판(22)에 의해 당해 여기광은 반응 블록(6)에 면하여 설치되는 프레넬 렌즈(21)를 향해, 즉 상부로부터 하방을 향해 조사된다.

당해 프레넬 렌즈(21)에 조사된 여기광은 당해 렌즈(21)의 광학 특성에 의해 광을 수렴하고, 반응 블록(6)에 수용되는 반응 용기(7)의 각 웰(7A)에 대해 평행, 혹은 평행에 가까운 각도로 입사 각도가 변경된다. 이에 의해, 당해 렌즈(21)를 투과한 여기광은 압박 부재(15)에 형성된 각 투과 구멍을 통해 평행 혹은 평행에 가까운 각도의 입사 각도로 각 웰(7A)에 입사된다.

각 웰(7A) 내에 평행 혹은 평행에 가까운 각도로 입사된 여기광은 미리 소정의 형광 염료가 첨가된 웰(7A) 내의 DNA에 조사됨으로써 PCR 프로덕트의 양에 따른 형광을 발한다. 이 발생한 형광 및 그 밖의 PCR 프로덕트로부터의 반사광은, 마찬가지로 압박 부재(15)에 형성된 각 투과 구멍 및 프레넬 렌즈(21)를 통해 반사판(22)에 도달한다.

그 후, 반사판(22)에 도달한 형광 및 그 밖의 반사광은 상기 반사판(22)의 작용에 의해 암실 구성부(12) 내를 대략 수평 방향으로 광로를 형성하면서 당해 반사판(22)에 대향하여 설치되는 밴드 패스 필터(25)를 통해 카메라(27)에 도달한다. 또한, 이 경우에 있어서 암실 구성부(12) 내는 커버(2)가 폐색되어 있는 것에 의해 암실로 되어 있으므로, 형광이 쇠퇴되는 등의 문제를 억제할 수 있다.

이때, 반사판(26)은 형광을 투과 가능하게 하는 재료로 구성되어 있으므로, 당해 반사판(26)을 투과한 반사광 및 형광은 밴드 패스 필터(25)에 조사되게 된다. 밴드 패스 필터(25)에서는, 상술한 바와 같이 당해 필터(25)의 종류에 따라서 소정의 형광만이 투과 가능하게 되어 있으므로, 그 후방에 배치되는 카메라(27)에는 소정의 형광만이 조사되게 된다.

그리고 카메라(27)에서는 수광된 형광을 촬영함으로써 반응 용기(7)의 각 웰(7A) 내의 PCR 프로덕트의 형광 상태를 검출한다. 그리고 이 검출된 각 PCR 프로덕트의 형광 상태에 관한 검출 데이터(도4 내지 도6에 나타내는 화상 데이터)는 제어 장치로부터 처리 장치(C)로 송출되고, 이 처리 장치(C)에서 분석됨으로써 각 시료의 농도, 즉 DNA 등의 증폭량을 검출할 수 있다. 각 웰(7A)의 위치와 화상의 위치 관계는 미리 알고 있으므로, 웰(7A)의 화상의 각 픽셀의 휘도를 구함으로써 웰(7A) 각각의 형광 강도를 측정할 수 있어, 이 형광 강도로부터 PCR 프로덕트의 양을 파악할 수 있다.

처리 장치(C)는 도11에 나타내는 바와 같이 반응 검출 장치(1)로부터 송신되는 검출 데이터의 처리를 행하는 연산 처리부(CPU)(31)와, 이 연산 처리부(31)에 접속된 기억 장치(기억 수단)(32), 키보드(혹은 마우스 등의 입력 수단)(33), 디스플레이(출력 수단)(34), 프린터(출력 수단)(36), FD, CD, DVD, 메모리 등의 외부 기억 장치(37) 등으로 구성되어 있다. 반응 검출 장치(1)로부터 송신된 검출 데이터는 기억 장치(32)에 기억되고, 연산 처리부(31)에 의해 후술하는 처리가 행해져 디스플레이(34) 등에 표시 출력된다.

다음에, 이 처리 장치(C)에 있어서의 검출 데이터의 처리 순서에 대해 설명한다. 도5 및 도6은 반응 검출 장치(1)로부터 처리 장치(C)로 보내져 오는 검출 데이터의 화상이다. 각 화상에서 백색으로 찍혀 있는 96개의 둥근 화상이 각각의 웰(7A) 내의 PCR 프로덕트로부터 발생된 형광이다. 또한, 실시예에서는 SYBR Premix Ex Taq(등록상표)를 베이스로 하고, PCR Forward Primer와, PCR Reverse Primer와, Template(초기값으로서 부여하는 λDNA)과, dH₂O로부터 반응 용액을 조정한다. 또한, 도5 및 도6에서는 상반부의 48개의 웰(7A) 내에 0.2 pg/μL의 농도의 반응 용액이 분주되어 있고(X그룹), 하반부의 48개의 웰(7A) 내에는 그 배의 농도의 0.4 pg/μL의 반응 용액이 분주되어 있다(Y그룹). 그리고 온도 사이클은 40회이다.

반응 개시로부터 온도 사이클의 횟수가 진행되면, DNA의 증폭량에 따라서 형광 강도가 증가한다. 이 과정을 플롯한 것이 전술한 도7의 증폭 곡선이다. 이 증폭 곡선은 각 웰(7A)마다 얻어지고, 디스플레이(34)에 표시된다(도8). 그리고 키보드(마우스)(33)를 사용하여 지수 함수적 증폭 영역[도7의 (5)]에 임계값 Th[도7의 (11)]를 설정하면, 그때의 사이클 수 Ct(임계값 사이클 수 Ct)는 이 도면에서는 24.5로 판독된다. 이 임계값 사이클 수 Ct와 검사 시료의 초기 DNA량의 사이에는 상관 관계가 있고, 이 직선 관계를 나타내는 검량선을 작성할 수 있다. 연산 처리부(31)는 이 검량선을 바탕으로 검사 시료의 초기 DNA량을 추정한다. 이에 의해, PCR의 증폭 속도론을 기초로 한 정확한 정량이 가능해진다.

(A) 장치상의 오차 요인의 제거

전술한 바와 같이 반응 개시 전에 있어서, 반응 검출 장치(1)의 카메라(27)에서 촬영된 화상 데이터에서는 각 픽셀의 휘도는 반드시 일정한 것은 아니며, 도4의 (1)에 나타내는 바와 같이 광학계의 오염이나 미주광 등에 의해 불균일이 발생한다. 반응이 진행되면 이 불균일은 도5의 (2)에 나타내는 바와 같이 웰(7A)의 화 상에 겹쳐 웰(7A) 본래의 형광 강도로 쓸데없이 길어져 버린다.

그래서, 처리 장치(C)의 연산 처리부(31)에서는 웰 본래의 형광 강도를 구하기 위해 다음 처리를 실행한다. 즉, 예를 들어 도6의 우측으로부터 2번째이고 또한 위에서 2단째(B11)인 웰(7A)의 경우, 당해 B11의 웰(7A)[도6의 (4)]의 형광 측정값 [DNA]rawB11을 측정하여 기억 장치(32)에 기억한다. 다음에, 당해 B11의 웰(7A)의 근방의 연결벽 부분에 있어서의 주위 4점의 형광 측정값 [DNA]bg1, [DNA]bg2, [DNA]bg3, [DNA]bg4를 측정하고, 이들 4점의 형광 측정값의 평균치(배경의 형광 측정값)를 구하여 기억 장치(32)에 기억한다. 그리고 식 (2)와 같이 형광 측정값 [DNA]rawB11로부터 이 평균치를 뺌으로써 B11의 웰(7A) 본래의 형광 강도 [DNA]realB1을 산출한다.

[DNA]realB11 = [DNA]rawB11 - (([DNA]bg1 + [DNA]bg2 + [DNA]bg3 + [DNA]bg4)/4) …… (2)

이 처리를 형광 측정값 [DNA]raw의 검출시마다, 96개 모든 웰에 대해 각각 실행하고, 모든 웰(7A) 본래의 형광 강도 [DNA]real을 결정한다. 이에 의해, 각 웰(7A)(반응 영역)마다 당해 웰(7A) 및 그 주변의 광 투과성의 오차나 오염, 미주광에 의한 배경의 형광 측정값 [DNA]bg를 제외한 당해 웰(7A)의 DNA 프로덕트 본래의 형광 강도 [DNA]real이 얻어진다.

따라서, 정확한 증폭 곡선의 작성과 정량화를 실현하는 것이 가능해진다. 이 경우, 종래예에서 설명한 제2 형광 신호를 사용할 필요도 없고, 처리 장치(C)에 있어서의 연산 처리만으로 충분하므로 비용의 상승이나 작업성의 악화도 발생하지 않고 데이터의 취득과 처리에 필요로 하는 시간을 단축시킬 수 있게 된다.

또한, 실시예에서는 웰(7A)의 주위 4점의 형광 측정값 [DNA]bg1, [DNA]bg2, [DNA]bg3, [DNA]bg4를 측정하여 그 평균치를 형광 측정값 [DNA]raw로부터 뺐지만, 그것에 한정되지 않고 1점 혹은 2점 혹은 3점의 평균이라도 좋다. 단, 실시예와 같이 4점의 평균값을 사용하면, 보다 정확한 배경의 형광 강도를 산출하여 정밀도가 높은 형광 강도 [DNA]real의 결정을 행할 수 있게 된다. 또한, 실시예에서는 웰(7A) 주위 4점의 형광 측정값의 단순 평균을 사용하였지만, 그것에 한정되지 않고 오염 상태의 불균일도 고려하여, 각 점마다 소정의 가중치를 부여한 후에 평균해도 좋다.

또한, 반응 전과 반응 후에서 배경의 형광 강도의 변동(드리프트)은 명확하지 않다. 그러나 실시예에서는 형광 측정값 [DNA]raw의 검출시마다 형광 측정값 [DNA]bg1 내지 [DNA]bg4를 검출하고, 형광 측정값 [DNA]raw로부터 형광 측정값 [DNA]bg1 내지 [DNA]bg4의 평균치를 빼고 형광 강도[DNA]real을 결정하고 있으므로, 반응 중에 배경의 형광 강도가 변동해도 항상 DNA 프로덕트 본래의 형광 강도 [DNA]real을 실시간으로 정밀도 좋게 얻을 수 있다.

(B) 정규화 1

다음에, 도8은 96개의 모든 웰(7A)의 증폭 곡선을 나타내고 있다. 횡축은 온도 사이클 수, 종축은 형광 강도이다. 전술한 바와 같이 도5 및 도6의 상반부의 X그룹과 하반부의 Y그룹에서 농도가 상이한 반응 용액이 분주되어 있는 관계상, 본래라면 반응 곡선은 2개의 선으로 보여져야 한다. 또한, 임계값 사이클 수 Ct도 2 점으로 될 것이다. 그러나 전술한 광학계의 오차, 교정 용액의 농도 오차, 교정 용액의 분주 오차나 반응 용액의 분주 오차 등의 장치상의 오차 요인에 의해 각 웰(7A)의 증폭 곡선은 변동, 임계값 사이클 수 Ct도 (8), (9)와 같이 복수 발생된다(변동).

그래서, 연산 처리부(31)는 키보드(마우스)(33)로부터의 소정의 선택 지령을 기초로 하여 데이터의 정규화를 행한다. 즉, 연산 처리부(31)는 온도 사이클 수 n마다 결정하여 기억 장치(32)에 기억하고 있는 형광 강도 [DNA]n(온도 사이클 수 n회째의 본래의 형광 강도 [DNA]real)과, 각 웰(7A)마다의 형광 강도의 최대값 [DNA]max[온도 사이클 수 n회째까지의 형광 강도 [DNA]real 중에서 최대인 것. 기억 장치(32)에 기억되어 있음]와, 비교 대상으로 되는 웰(7A)[실시예에서는 전체 웰(7A)]에 공통되는 값 Z를 사용하여, 식 (3)의 연산에 의해 정규화된 형광 강도 [DNA]nN을 얻는다.

[DNA]nN = [DNA]n/([DNA]max + Z) … (3)

이 처리에 의해 각 웰(7A)의 형광 강도는 정규화된다. 도9는 Z = 0인 경우이다. 이 정규화에 의해 각 웰(7A)의 장치상의 오차 요인에 수반되는 형광 강도의 변동이 보정 저감되므로, X그룹, Y그룹 각각에서 임계값 사이클 수 Ct의 변동이 도8의 경우에 비해 저감된다. 이에 의해, 정확도가 높은 임계값 사이클 수의 산출이 가능해진다. 또한, 도9에서는 전체의 스케일을 적당한 값으로 하기 위해 [DNA]nN에 전체 웰 공통의 값을 승산하여 표시하고 있다.

(C) 정규화 2

여기서, 사이클 후기의 플래토 영역에서 형광 강도가 변동되는 요인으로서는, 상술한 장치상의 오차 요인뿐만 아니라, 화학적인 반응의 변동에 의해서도 발생한다. 그리고 그 요인에 관해서는 지수 함수적 증폭 영역의 형광 강도에 비례적으로 영향을 미치지 않는 것이 고려된다. 즉, 플래토 효과의 영역에서의 형광 강도를 완전히 일치시키지 않는 쪽이 좋은 경우도 있다.

그 경우는, 키보드(마우스)(33)를 사용하여 식 (3)의 Z의 값을 크게 한다. 도10은 Z = 20000으로 한 경우의 각 웰(7A)마다의 증폭 곡선을 나타내고 있다. Z의 값을 크게 한다고 하는 것은, 정규화의 효과를 약하게 하고 있는 것으로 된다. 그러나 도10에서는 특히 사이클 중기로부터 후기의 증폭 곡선의 거동이 실제의 형광 강도의 움직임(도8)에 근사한 것을 알 수 있다. 한편, 임계값에서의 보정 효과는 충분 확보되어 있는 것을 알 수 있다. 이에 의해, 정규화의 효과를 억제하여 임계값에서의 보정 효과를 충분히 확보하면서 사이클 중기로부터 후기의 증폭 곡선을 실제의 데이터에 근사시켜, 장치상의 오차 요인 이외의 요인에 수반되는 데이터의 거동 파악을 용이하게 할 수 있게 된다.

여기서, 이와 같은 불완전한 정규화를 행할 때에는 식 (4)와 같이 Z의 값을 결정해도 좋다.

Z = α[DNA]max + β … (4)

α, β는 각 웰(7A)에 공통되는 계수.

또한, 연산 처리부(31)는 전술한 최대값 [DNA]max를 형광 강도의 이동 평균으로 산출하고 있다. 왜냐하면 형광 강도 [DNA]real은 실제로는 톱 형상을 나타내 기 때문이다. 그러나 정규화에 사용하는 최대값으로서는 이 톱의 피크값이라도 좋고, 당해 피크값의 예를 들어 90 ％ 등의 수치(모두 최대값에 관련되는 값)를 사용해도 지장 없다.

(D) 베이스 라인의 보정

여기서, 도8의 (10)은 사이클 초기에서 반응 결과를 검출할 수 없는 레벨의 영역이지만, 웰(7A) 내의 반응 용액 자체가 처음부터 일정한 형광을 발생하고 있으므로, 이 영역에서도 일반적으로는 형광 강도는 0이 아니다. 그래서, 키보드(마우스)(33)로부터의 지시를 기초로 하여 연산 처리부(31)는 베이스 라인의 보정을 행한다. 즉, 연산 처리부(31)는 사이클 초기의 영역(10)에서의 각 웰(7A)의 형광 강도의 평균치 [DNA]base를 베이스 라인으로 하고, 이 평균치를 전술한 [DNA]n 및 [DNA]max로부터 뺀 후 상술한 정규화의 처리를 행하고 있다. 도9 및 도10에서 초기의 형광 강도가 0으로 되어 있는 것은, 이 처리를 행하고 있기 때문이다([DNA]base는 [DNA]n의 최소값을 이용해도 지장 없음).

이에 의해, 웰(7A) 내의 반응 용액 자체로부터 발생하는 형광의 강도를 배제한 PCR 프로덕트 자체로부터의 형광 강도의 상황을 파악할 수 있게 된다.

또한, 상기 실시예에서 나타낸 물질, 양, 개수는 그것에 한정되는 것이 아닌 것은 물론이다.

Claims

복수의 반응 영역에 온도 사이클을 부여하여, 각 반응 영역에 있어서의 핵산 증폭 생성물로부터의 형광 강도를 실시간으로 검출하는 장치이며,

상기 반응 영역으로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]raw와, 상기 반응 영역 근방에 있어서의 반응 영역 외 영역으로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]bg를 검출하고, 상기 형광 측정값 [DNA]raw로부터 상기 형광 측정값 [DNA]bg를 뺌으로써 당해 반응 영역의 형광 강도 [DNA]real을 결정하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치.
제1항에 있어서, 상기 형광 측정값 [DNA]bg는 상기 반응 영역 근방에 있어서의 복수의 반응 영역 외 영역으로부터 얻어지는 형광 측정값의 단순 평균, 혹은 소정의 가중치를 부여한 후의 평균치인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 형광 측정값 [DNA]raw의 검출시마다 상기 형광 측정값 [DNA]bg를 검출하고, 당해 형광 측정값 [DNA]raw로부터 형광 측정값 [DNA]bg를 뺌으로써 상기 형광 강도 [DNA]real의 결정을 행하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치.
복수의 반응 영역에 온도 사이클을 부여하여, 각 반응 영역에 있어서의 핵산 증폭 생성물로부터의 형광 강도를 실시간으로 검출하는 장치이며,

상기 온도 사이클 n회마다 각 반응 영역으로부터 얻어지는 형광 강도 [DNA]n을, 당해 형광 강도 [DNA]n의 최대값 혹은 그에 관련되는 값 [DNA]max를 사용하여 정규화하고, 당해 정규화된 형광 강도 [DNA]nN을 사용하여 그려지는 증폭 곡선의 지수 함수적 증폭 영역에 임계값 Th를 설정함으로써 임계값 사이클 수 Ct를 산출하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치.
제4항에 있어서, 상기 반응 영역마다의 형광 강도 [DNA]n을, 상기 최대값 혹은 그에 관련되는 값 [DNA]max, 혹은 그것에 비교 대상으로 되는 상기 반응 영역에 대해 공통되는 값을 더한 값으로 나눔으로써 상기 형광 강도 [DNA]nN을 산출하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 지수 함수적 증폭 영역 이전의 상기 형광 강도 [DNA]base를, 상기 각 반응 영역마다의 형광 강도 [DNA]n 및 최대값 혹은 그에 관련되는 값 [DNA]max로부터 빼고 상기 증폭 곡선을 그리는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치.