CN103232936A - 核酸扩增产物实时检测装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种核酸扩增产物实时检测装置，其能够有效地排除或降低装置方面的致误差因素，而无需使用用于修正的第2荧光信号。对多个孔(7A)实施温度循环，并实时检测来自各孔(7A)中的核酸扩增产物的荧光强度。检测得自孔(7A)的荧光测定值[DNA]raw、以及得自该孔(7A)邻近周边的连接壁的荧光测定值[DNA]bg，通过从荧光测定值[DNA]raw中减去荧光测定值[DNA]bg来确定该孔(7A)的荧光强度[DNA]real。

Description

核酸扩增产物实时检测装置

此案是申请日为2007年3月1日、中国申请号为200780008043.2、PCT申请号为PCT/JP2007/053949的发明名称为“核酸扩增产物实时检测装置”的发明申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及对聚合酶链反应(polymerase chain reactin：PCR)所得多核苷酸产物进行实时检测的装置。

背景技术

PCR是对DNA链进行复制的循环性酶反应，其出于以下原因能够对作为目标的目标序列分子进行指数函数式的扩增：将在先循环中复制的PCR产物(核酸扩增产物)用作在后循环的模板。在实时PCR中，例如使用相干的两种荧光染料标记的序列特异性探针(TaqMan探针)，用激发光照射PCR产物，激起荧光并测定荧光强度，从而对PCR产物的扩增进行实时监测。

而且，当用于定量时，对于已知样品扩增曲线的指数函数扩增范围设定阈值(图7的(6))，然后计算出该阈值与扩增曲线的交点(阈值循环数Ct，图7的(8))。当以Log值的形式来表示初期DNA量时，该阈值循环数Ct与检测样品的初期DNA量之间存在线性关系，可以制作出表示该线性关系的校正曲线。以该校正曲线为基准可以推知检测样品的初期DNA量。这样，就能够基于PCR的扩增速度理论进行准确的定量。

在这里，由于实际的PCR效率不是100%，扩增出的PCR产物的浓度可以以式(1)表示。

[DNA]=[DNA]₀(1+e)^c····(1)

[DNA]：PCR产物的浓度

[DNA]₀：目标模板的初期浓度

e：平均PCR效率

c：循环数

即，如果平均PCR效率e为100%(即，上式(1)中e=1)，则PCR产物的浓度[DNA]为2的循环数次方，呈指数函数式地扩增。然而，在循环的初期、中期和后期，效率e逐渐降低，扩增曲线为图7所示的状况。图7的横轴为循环数、纵轴为荧光强度，循环初期以指数函数的形式扩增(图7的(5))，循环中期以线性函数的形式扩增(图7的(6))，而循环后期则由于平台效应而不再扩增(图7的(7))。

而且，引起平台效应的化学反应方面的因素如下。

·dNTP和引物的水解

·DNA聚合酶(生产模板拷贝的DNA合成酶)的热失活

·单链PCR片段的复性引起的引物退火效率降低

·非特异性PCR产物的竞争因素

·焦磷酸酯等PCR抑制物的积累

·DNA聚合酶的外切酶活性引起的PCR产物水解

因此，实时PCR的前提条件是在上式(1)的关系成立的指数函数扩增范围内进行测定(专利文献1)。

专利文献1：特表2005-516630号公报

专利文献2：专利第2909216号公报

发明内容

发明所要解决的问题

此外，作为实时PCR中使用的反应容器，一般使用称作微孔板的具有多个孔(由凹陷构成的反应区，例如96个)的容器。虽然向各孔中分加了一定初期DNA浓度的反应溶液，但由于装置方面的下述误差因素，反应容器的各个孔的扩增曲线存在偏差。

·光学系统的误差

·校正溶液的浓度误差

·校正溶液的分加误差

·反应容器的盖或封口膜的光透过性误差

·反应容器的污染误差

·反应溶液的分加误差

这里，由于价格低廉的关系，下述方法成为给反应容器(微孔板)的孔加盖的主流方法：在反应容器的一面的整个区上粘贴带有粘合剂的前述封口膜。而且，激发光通过封口膜照射到各孔，PCR产物(反应产物)发出的荧光也是通过封口膜才被CCD相机等光检测部检测到(这些构成装置的光学系统)。这样，虽然封口膜、反应容器本体构成了荧光强度测定方面的光学系统的重要要素，但是，这些均属易耗品，很难指望它们具有均一且高精度的光学性能。

图4为光检测部所检测到的PCR前的反应容器的实际图像。从整体来看，反应容器的孔的周围是黑色的，但是，作为背景的该图像各像素的亮度(背景荧光强度)却并非一定，如该图的(1)中所示，由于光学系统的污染、杂散光(迷走光)等出现了斑点。如果开始PCR反应，则该斑点会如图5的(2)中所示那样，与孔部分的图像(图5中显示为圆形的96个图像)重叠，而被孔本体的荧光强度拉长。

因而，传统上，首先准备未装入DNA的空反应容器，对于各个孔，分别测定空孔状态的荧光强度，将其作为标准校正值进行存储。然后，通过进行如下的校正处理，进行这样的光学系统的校正，所述校正处理为：从实际荧光强度的测定值中减去存储的校正值。然而，归因于空反应容器污染的误差是各反应容器固有的，存在的问题是：当使用被认定为标准的来自其它空反应容器的校正值时，在测定值方面会产生误差。

此外，在专利文献2中，使用第2荧光信号对第1荧光信号进行修正，然而，除了本来必须测定的发出第1荧光的溶液之外，还必须再加上发出参照用的第2荧光的溶液，这样不但操作复杂，而且成本激增。此外，必须非常高精度地分注发出第2荧光的溶液并高精度地进行测定，才能有效果。此外，还存在的问题是：为测定第2荧光必须安装特殊的滤光器(光学フィルタ)，还有获取和处理数据需要相当长的时间，例如每次测定均需要交替使用发出第1荧光溶液用滤光器和发出第2荧光溶液用滤光器。

本发明是为了解决这些传统技术上的问题而完成的，其目的是提供一种核酸扩增产物实时检测装置，该核酸扩增产物实时检测装置能够有效地排除或降低装置上的误差因素，而不使用用于修正的第2荧光信号。

解决问题的方法

权利要求1的发明的装置对多个反应区实施温度循环，对各反应区中的来自核酸扩增产物的荧光强度进行实时检测，其中，通过检测得自反应区的荧光测定值[DNA]raw和得自该反应区附近的反应区外区域的荧光测定值[DNA]bg、并从荧光测定值[DNA]raw中减去荧光测定值[DNA]bg来确定该反应区的荧光强度[DNA]real。

权利要求2的发明的装置，其特征在于：在上述发明中，荧光测定值[DNA]bg为得自反应区附近的多个反应区外区域的荧光测定值的简单平均、或者经过指定加权后的平均值。

权利要求3的发明的装置，其特征在于：在上述各发明中，在每次检测荧光测定值[DNA]raw时，检测荧光测定值[DNA]bg，从该荧光测定值[DNA]raw中减去荧光测定值[DNA]bg，这样来确定荧光强度[DNA]real。

权利要求4的发明的装置对多个反应区实施温度循环，实时检测各反应区中的来自核酸扩增产物的荧光强度，其中，对于每个温度循环的从各反应区得到的荧光强度[DNA]n(第n个循环的荧光强度)，使用该荧光强度[DNA]n的最大值或与之相关的值[DNA]max进行标准化，对于使用该标准化的荧光强度[DNA]nN绘制的扩增曲线的指数函数扩增区设定阈值Th，由此来计算出阈值循环数Ct。

权利要求5的发明的装置，其特征在于：在上述发明中，通过用每个反应区的荧光强度[DNA]n除以下述值来计算出荧光强度[DNA]nN，其中，所述值为：最大值或与之相关的值[DNA]max、或者将[DNA]max加上作为比较对象的反应区共有的值而得的值。

权利要求6的发明的装置，其特征在于：在权利要求4或权利要求5中，从各反应区的荧光强度[DNA]n及最大值或与之相关的值[DNA]max中减去指数函数扩增区以前的荧光强度[DNA]base，这样来绘制扩增曲线。

发明的效果

本发明中，在对多个反应区实施温度循环、实时检测来自各反应区中的核酸扩增产物的荧光强度的核酸扩增产物实时检测装置中，检测得自反应区的荧光测定值[DNA]raw和得自该反应区附近的反应区外区域的荧光测定值[DNA]bg，从该荧光测定值[DNA]raw中减去荧光测定值[DNA]bg，由此来确定该反应区的荧光强度[DNA]real，因此，对于每个反应区，能够分别获得该反应区的核酸扩增产物固有的荧光强度[DNA]real，其中扣除了归因于该反应区及其周围的光透过性误差、污染、杂散光的背景荧光强度。这样一来，可以实现准确的扩增曲线的制作和定量化。这种情况下，不需要使用第2荧光信号，因此，不会造成成本增加或操作困难，数据的获取和处理所需的时间也会缩短。

在权利要求2的发明中，在上述发明的基础上，荧光测定值[DNA]bg为得自反应区附近的多个反应区外区域的荧光测定值的简单平均、或者进行了指定加权后的平均值，因此，可以更准确地计算出背景荧光强度，高精度地进行荧光强度[DNA]real的确定。

在权利要求3的发明中，在上述各发明的基础上，在每次检测荧光测定值[DNA]raw时，检测荧光测定值[DNA]bg，并且从该荧光测定值[DNA]raw中减去荧光测定值[DNA]bg，这样来确定荧光强度[DNA]real，因此，即使反应中背景荧光强度有变化，一般也可以实时且精度良好地获得核酸扩增产物固有的荧光强度[DNA]real。

权利要求4的发明中，在对多个反应区实施温度循环、实时检测来自各反应区中的核酸扩增产物的荧光强度的核酸扩增产物实时检测装置中，对于每次所述温度循环，测定从各反应区得到的荧光强度，第n次温度循环的从各反应区得到的荧光强度记作荧光强度[DNA]n，对于每一个荧光强度[DNA]n，使用这些荧光强度[DNA]n的最大值或与之相关的值[DNA]max进行标准化，对于使用该标准化的荧光强度[DNA]nN绘制的扩增曲线的指数函数扩增区设定阈值Th，由此计算出阈值循环数Ct，因此，可以校正光学系统的误差、校正溶液的浓度误差、校正溶液的分加误差、反应溶液的分加误差等装置方面的误差因素等引起的各反应区荧光强度的偏差，并使之降低，能够计算出高准确度的阈值循环数Ct。

权利要求5的发明中，在上述的基础上，通过用每个反应区的荧光强度[DNA]n除以下述值来计算出荧光强度[DNA]nN，其中，所述值为：最大值或与之相关的值[DNA]max、或者将其加上作为比较对象的对反应区而言共有的值而得的值，这样抑制了标准化的效果，充分确保了阈值处的校正效果，使循环中期至后期的扩增曲线与实际数据相近似，能够容易地对装置方面误差因素以外的因素引起的数据的行为进行把握。

在权利要求6的发明中，在权利要求4或权利要求5的基础上，从各反应区的荧光强度[DNA]n及最大值或与之相关的值[DNA]max中减去指数函数扩增区以前的荧光强度[DNA]base，来绘制扩增曲线，因此，能够把握来自反应区的核酸扩增产物本身的荧光强度状况，而排除反应区的反应溶液本身发出的荧光的强度。

附图说明

图1：本发明的实施方式的实时检测装置的结构图。

图2：构成图1的实时检测装置的反应检测装置的竖直剖面图。

图3：图2的反应检测装置的水平剖面图。

图4：显示反应容器的背景荧光强度状态的图。

图5：显示反应后的荧光强度状态的图。

图6：显示反应后的荧光强度状态的另一个图。

图7：某个孔的DNA扩增曲线。

图8：全部孔的DNA扩增曲线。

图9：对图8的数据进行了标准化时的DNA扩增曲线。

图10：对图8的数据进行了不完全标准化时的DNA扩增曲线。

图11：构成图1的实时检测装置的处理装置的功能区块图。

发明的具体实施方式

以下，基于附图对本发明的实施方式进行详述。

实施方式1

图1为本发明实施方式的实时检测装置R的结构图，图2为构成图1的实时检测装置R的反应检测装置1的竖直剖面图，图3为反应检测装置1的水平剖面图。本发明的实时检测装置R包括反应检测装置1和处理装置C，所述处理装置C包括对来自反应检测装置1的检测数据进行实时处理的计算机。

实施方式的反应检测装置1是这样的装置：其在对作为反应样品的染色体DNA进行扩增的同时，通过光学测定方法对与该扩增相关的反应状态进行检测。该反应检测装置1具备上面形成有反应室4的本体3、以及设置于该反应室4的后方、本体3的上面的反应检测部5。而且，该反应室4中设置有由铝等传热材料形成的反应区块(反応ブロック)6。该反应区块6中形成有用于保持反应容器7的多个保持穴8，所述反应容器7具有多个孔7A··，所述孔7A··的内部收纳有由DNA(目标模板：λDNA等)、各种试剂、作为基质的溶液等混合而成的反应溶液。

在本实施方式中使用的反应容器7是微孔板，其中，一体式地形成有纵向12个×横向8个共96个作为反应区的孔7A··，各孔7A··通过连接壁(孔7A(反应区)外的区域、即反应区外区域)连接。而且，作为反应容器，孔并非仅限于一体化成形的制品，其还可以由多根管构成。此外，该孔7A的个数并不限于此，除此之外，还可以由例如384个一体式地构成，其操作性好。此外，反应容器7的各孔7A，其上面形成有开口，该上面开口贴合有密封材料(シール)制的盖9，以阻止因温度处理而引起的反应溶液的蒸发。此外，在本实施方式中，荧光强度检测是透过该盖9进行检测的，因此使用光透过性的合成树脂材料。

而且，在该本体2内具有对反应区块6进行加热、冷却的佩尔捷元件10。而且，通过利用未图示的控制装置对该佩尔捷元件10进行温度控制，对反应区块6循环式地进行加热、冷却，这样，可以对反应容器7的各孔7A内的DNA(反应样品)进行培养(扩增)。

在从设置于本体2后端上面的反应检测部5到另一端(本实施方式中是形成有反应室4的本体2前端上方)的范围内设置暗室结构部12。该暗室结构部12的前面向前方开放，而且，在该前面开口形成向前下方倾斜的所述挡盖2，并使该挡盖2开闭自如。而且，该挡盖2的结构使其可以通过在暗室结构部12的前方即本体3上面前部到该暗室结构部12内后部的范围内形成的轨道部件13前后移动，当处于移动至后方的状态时，该挡盖2被收纳于暗室结构部12内。

而且，在该挡盖2内，在该挡盖2闭合的状态下，与反应室4的反应区块6相对地一体设置按压部件15，该按压部件15可以自由移动，其用于将反应容器7按在反应区块6。该按压部件15是由导热性良好的铝材等构成的板材，其上与各孔7A的上面相对应地形成多个透孔(透孔)。

而且，在该按压部件15的上面一侧(上側)设置有作为光学透镜的菲涅耳透镜21。该菲涅耳透镜21通常是在平面上形成有多个沟，以此来折射、放大(拡大)入射光。此时，菲涅耳透镜21在折射、放大入射光时，具有将入射光收敛为平行或接近平行的状态并使之透过的光学特性，由此，入射光在进行投射时，处于将各光路的离散加以修正后的状态。

另一方面，在反应区块6的上方，在构成封闭反应室4的前上方的挡盖2的反应室4一侧的面上，设置有反射板22。本实施方式中的反射板22由镜子等构成，所述镜子等由平板构成，具体而言，其将后述的光源灯23发出的光反射(屈曲)向菲涅耳透镜21。

其它方面，在反应检测部5内具备：光源灯23、具备多个带通滤光器(克里斯欣森滤光器，バンドパスフィルタ)的滤器装置35、反射板26、CCD相机27以及转动滤器装置35的滤器驱动装置28。

光源灯23是这样的灯，其根据反应液内的作为检测对象的DNA产物的量照射光，所述光包含用于从该反应溶液激发荧光的激发光，其通常使用卤素灯。反射板26将从光源灯23照射的指定波长的光反射成指定角度，使其射向反射板22(反射板22に偏光させる)。此外，该反射板26具有透过指定荧光的性质。在本实施方式中，从配置在反应检测部5侧部的光源灯23发出的光通过该反射板26被反射向前方，该光源灯23的光照射到反射板22。

滤器装置35是通过将多种带通滤光器呈轮状配置而构成的装置，其在滤器驱动装置28的驱动下转动，从而选择指定带通滤光器，使其处于光源灯23与反射板26之间或反射板22与相机27之间。而且，在图中，位于光源灯23与反射板26之间的是带通滤光器24，位于反射板22与相机27之间的是带通滤光器25。

带通滤光器24是具有如下性质的滤光器：在光源灯23发出的光成分中，其仅允许由反应溶液激发荧光所需波长的光透过；通过该滤器24的光为用于由反应溶液的特定成分激发出荧光的激发光。

带通滤光器25是具有如下性质的滤光器：通过反射板22而由反应容器7的各孔7A内的反应溶液激发出的荧光及反射光中，其只允许指定的所荧光成分透过；这里，该荧光以外的反射光被遮蔽。

相机27是对透过带通滤光器25的荧光进行检测的装置，用该相机27检测到的荧光图像被输入所述控制装置从而送达处理装置C，这样来分析各反应溶液的浓度即扩增量。而且，在带通滤光器24、25方面，根据作为检测对象的反应溶液以及与之对应使用的荧光染料的种类，可以任意地确定这些带通滤光器24、25的组合，并有选择地使用。

通过以上的结构，所述控制装置控制所述佩尔捷元件10，实施热变性步骤：将反应区块6的保持穴8所保持的反应容器7内的反应溶液加热到例如+95℃的热变性温度，使反应溶液热变性。接着，控制装置控制佩尔捷冷却元件10，将反应区块6冷却到例如+60℃，进行收纳于反应容器7内的热变性后的反应溶液中的DNA的退火步骤和延伸步骤。控制装置以该热变性步骤、退火步骤、延伸步骤为1个循环，反复多次例如40次，由此进行利用PCR法的DNA等的培养(扩增)。

在该培养过程中或该培养结束时，反应检测部5定期地(例如在一个循环结束后)实施检测行为，以检测反应容器7内的反应溶液中DNA的扩增状态。检测行为中，首先，光源灯23照射的光经由带通滤光器24到达反射板26。带通滤光器24仅允许光源灯23发出的光中的激发荧光所需波长的光、即激发光透过。该激发光由于反射板26而从暗室结构部12内通过，照射向反射板22方向，而且，由于反射板22，该激发光的照射方向朝向与反应区块6相对设置的菲涅耳透镜21，即，由上自下照射。

照射到该菲涅耳透镜21的激发光，由于该透镜21的光学特性而对光进行聚焦，使入射角度改变为与收纳于反应区块6的反应容器7的各孔7A平行或接近平行的角度。这样一来，透过该透镜21的激发光经由形成于按压部件15的各透孔，以平行或接近平行的入射角度入射到各孔7A。

以平行或接近平行的角度入射到各孔7A内的激发光，照射预先添加了指定荧光染料的孔7A内的DNA，由此，发出与PCR产物的量相应的荧光。产生的荧光以及来自其它PCR产物的反射光同样经由形成于按压部件15的各透孔及菲涅耳透镜21到达反射板22。

此后，到达反射板22的荧光及其它反射光，在该反射板22的作用下，在暗室结构部12内沿基本水平方向形成光路，同时经由与该反射板22对向设置的带通滤光器25到达相机27。而且，这种情况下，由于挡盖2的封闭，暗室结构部12内成为暗室，从而可以抑制荧光衰减等不良事件。

此时，由于反射板26由能够透过荧光的材料构成，因此透过该反射板26的反射光及荧光会照射到带通滤光器25。带通滤光器25方面，如上所述，根据该滤器25的种类，只有指定荧光能够透过，因此只有指定荧光会照射到设置于其后方的相机27。

而且，在相机27，对接受的荧光进行拍摄，由此来检测反应容器7的各孔7A内PCR产物的荧光状态。然后，该检测到的与各PCR产物的荧光状态相关的检测数据(图4～图6所示图像数据)被从控制装置输送至处理装置C，通过该处理装置C的分析，能够检测各样品的浓度，即DNA等的扩增量。由于各孔7A的位置与图像的位置的关系是事先已知的，因此，通过求出孔7A的图像的各像素的亮度，能够分别测定孔7A的荧光强度，能够由该荧光强度把握PCR产物的量。

如图11所示，处理装置C包括运算处理部(CPU)31、存储装置(存储手段)32、键盘(或鼠标等输入装置)33、显示器(输出装置)34、打印机(输出装置)36、外部存储装置37等，所述运算处理部(CPU)31对由反应检测装置1输送的检测数据进行处理，所述存储装置(存储手段)32与所述运算处理部31连接，所述外部存储装置37例如FD、CD、DVD、存储器等。由反应检测装置1输送的检测数据存储于存储装置32，由运算处理部31来进行后述的处理，从而在显示器34等上显示输出。

下面，对该处理装置C中的检测数据处理程序进行说明。图5、图6为由反应检测装置1输送至处理装置C的检测数据的图像。各图像中，显现白色的96个圆形图像分别为孔7A内的PCR产物发出的荧光。而且，在实施方式中，以SYBR Premix Ex Taq(注册商标)为基础，由PCR正向引物、PCR反向引物、模板(作为初期值投入的λDNA)和dH₂O来调制反应溶液。此外，图5、图6中，上半部分的48个孔7A内分加了0.2pg/μL浓度的反应溶液(X组)，下半部分的48个孔7A内分加了加倍浓度即0.4pg/μL的反应溶液(Y组)。而且，温度循环为40次。

反应开始后，随着温度循环次数的增加，荧光强度相应于DNA的扩增量增加。描绘该过程的就是前述图7的扩增曲线。该扩增曲线是分别对各孔7A得到的，其显示于显示器34(图8)。然后，如果使用键盘(鼠标)33对指数函数扩增区(图7的(5))设定阈值Th(图7的(11))，则在该图中可以读出此时的循环数Ct(阈值循环数Ct)为24.5。该阈值循环数Ct与检测样品的初期DNA量之间存在相关关系，能够制作出反映该线性关系的校正曲线。运算处理部31以该校正曲线为基础推算检测样品的初期DNA量。这样，可以基于PCR的扩增速度论进行准确的定量。

(A)排除装置方面的误差因素

如前述，在反应开始前反应检测装置1的相机27所拍摄的图像数据中，各像素的亮度并非一定，如图4的(1)所示，由于光学系统的污染、杂散光等会出现斑点。在反应进行中，则该斑点会如图5的(2)中所示那样，与孔7A的图像重叠，而被孔7A固有的荧光强度拉长。

因而，在处理装置C的运算处理部31中，为了求出孔固有的荧光强度，实施以下处理。即，例如，对于图6中右数第2二列上数第二行(B11)的孔7A，测定该B11的孔7A(图6的(4))的荧光测定值[DNA]rawB11，存储于存储装置32。接着，测定该B11的孔7A附近的连接壁部分中周围4点的荧光测定值[DNA]bg1、[DNA]bg2、[DNA]bg3、[DNA]bg4，求出这4点的荧光测定值的平均值(背景荧光测定值)，存储于存储装置32。然后，通过像式(2)那样从荧光测定值[DNA]rawB11中减去该平均值，计算出B11的孔7A固有的荧光强度[DNA]realB1。

[DNA]realB11=[DNA]rawB11-(([DNA]bg1+[DNA]bg2+[DNA]bg3+[DNA]bg4)/4) ····(2)

在每次进行荧光测定值[DNA]raw的检测时，对于全部96个孔分别实施该处理，确定全部的孔7A固有的荧光强度[DNA]real。这样一来，对于各孔7A(反应区)分别得到了该孔7A的DNA产物固有的荧光强度[DNA]real，其中已经扣除了由该孔7A及其周边的光透过性的误差或污染、以及杂散光等引起的背景荧光测定值[DNA]bg。

因此，可以实现准确的扩增曲线的制作与定量化。此时，没有必要使用在传统方案中说明的第2荧光信号，而仅依靠处理装置C中的运算处理即可完成，所以不会造成成本提高或操作性下降，能够缩短获取及处理数据所需的时间。

而且，在实施方式中，测定孔7A的周围4点的荧光测定值[DNA]bg1、[DNA]bg2、[DNA]bg3、[DNA]bg4，并将其平均值从荧光测定值[DNA]raw中扣除，但并不限于此，取1点，或者取2点或3点的平均均是可以的。只是像实施方式那样使用4点的平均值的话，能够更准确地计算出背景荧光强度，高精度地确定荧光强度[DNA]real。此外，实施方式中采用的是孔7A周围4点荧光测定值的简单平均，但并不限于此，也可以考虑污染状态的斑点，在对各点分别进行指定加权后，再进行平均。

此外，反应前和反应后，背景荧光强度的变化(漂移，ドリフト)并不明确。然而，在实施方式中，每次检测荧光测定值[DNA]raw时，检测荧光测定值[DNA]bg1～[DNA]bg4，从荧光测定值[DNA]raw中减去荧光测定值[DNA]bg1～[DNA]bg4的平均值，来确定荧光强度[DNA]real，因此，即使反应中背景荧光强度发生变化，通常也能够实时地、精度良好地得到DNA产物固有的荧光强度[DNA]real。

(B)标准化1

接着，图8显示了全部96个孔7A的扩增曲线。横轴为温度循环数，纵轴为荧光强度。如前述，在图5、图6上半部分的X组与下半部分的Y组中，分加的反应溶液存在浓度差异，由此看来，如果是固有的话，反应曲线应该出现2条线。此外，阈值循环数Ct也应该为2个点。然而，由于前述光学系统的误差、校正溶液的浓度误差、校正溶液的分注误差或反应溶液的分注误差等装置上的误差因素，各孔7A的扩增曲线出现离散(バラツキ)，阈值循环数Ct也像(8)、(9)那样出现了多个(离散)。

因而，运算处理部31基于从键盘(鼠标)33的指定选择指令，进行数据的标准化。即，运算处理部31使用按温度循环数n确定并存储于存储装置32中的荧光强度[DNA]n(第n个温度循环的固有荧光强度[DNA]real)、每个孔7A的荧光强度的最大值[DNA]max(到第n个温度循环为止的荧光强度[DNA]real中最大的一个，存储于存储装置32)、以及作为比较对象的孔7A(实施方式中是全部孔7A)共有的值Z，通过式(3)的运算，获得标准化的荧光强度[DNA]nN。

[DNA]nN=[DNA]n/([DNA]max+Z) ···(3)

通过该处理，将各孔7A的荧光强度标准化。图9为Z=0的情况。通过该标准化可以校正降低各孔7A的由装置上的误差因素引起的荧光强度离散，因此，与图8的情况相比，X组、Y组各自的阈值循环数Ct的离散有所降低。由此，可以高准确度地计算出阈值循环数。而且，在图9中，为了使整体尺度为合适的值，将[DNA]nN乘以一个全部孔共有的值来表示。

(C)标准化2

这里，作为在循环后期的平台区荧光强度出现离散的因素，除了上述装置上的误差因素之外，还会因化学反应的离散而发生。而且，关于该因素，可以认为其并非成比例地影响指数函数扩增区的荧光强度。即，有些情况下，使平台效应的区域的荧光强度不完全一致是比较好的。

这种情况下，使用键盘(鼠标)33使式(3)的Z的值增大。图10显示了Z=20000时的各个孔7A的扩增曲线。使Z的值增大会弱化标准化的效果。然而，在图10中可知：特别是从循环中期到后期的扩增曲线的行为与实际荧光强度的行为(图8)相近似。另一方面，可以充分确保了阈值处的校正效果。这样一来，抑制了标准化的效果，充分确保了阈值处的校正效果，而且使从循环中期到后期的扩增曲线与实际数据近似，可以容易地把握由装置误差因素以外的因素引起的数据的行为。

这里，在进行这样的不完全标准化时，可以如式(4)那样确定Z的值。

Z=α[DNA]max+β ···(4)

α、β为各孔7A共有的系数。

此外，运算处理部31使用荧光强度的移动平均数来计算前述的最大值[DNA]max。这是因为荧光强度[DNA]real实际上呈现锯齿(ノコギリ)状。然而，作为用于标准化的最大值，可以使用该锯齿的峰值，也可以使用该峰值的例如90%等数值(这些都是与最大值相关的值)。

(D)基线的校正

这里，图8的(10)为循环初期其反应结果的水平无法检测的区，但，由于孔7A内的反应溶液本身自始发出一定的荧光，所以该区中通常荧光强度也并非为0。因而，基于来自键盘(鼠标)33的指示，运算处理部31进行基线的校正。即，运算处理部31以循环初期的区(10)的各孔7A的荧光强度的平均值[DNA]base为基线，从前述[DNA]n及[DNA]max中减去该平均值后，进行上述标准化处理。图9、图10中，初期荧光强度为零0，这是因为进行了该处理([DNA]base可以使用[DNA]n的最小值)。

这样一来，能够把握来自PCR产物本身的荧光强度的状况，其中，排除了孔7A内的反应溶液本身发出的荧光的强度。

而且，不言自明的是，上述实施方式所示的物质、量、数并非仅限于此。

Claims (3)

1.一种核酸扩增产物实时检测装置，该装置对多个反应区实施温度循环，实时检测来自各反应区中的核酸扩增产物的荧光强度，其中，

检测从所述反应区得到的荧光测定值[DNA]raw、以及从该反应区附近的反应区外区域得到的荧光测定值[DNA]bg，并从所述荧光测定值[DNA]raw中减去所述荧光测定值[DNA]bg，由此来确定该反应区的荧光强度[DNA]real。

2.权利要求1的核酸扩增产物实时检测装置，其中，所述荧光测定值[DNA]bg为从所述反应区附近的多个反应区外区域得到的荧光测定值的简单平均、或者进行了指定加权后的平均值。

3.权利要求1或权利要求2的核酸扩增产物实时检测装置，其中，在每次检测所述荧光测定值[DNA]raw时，检测所述荧光测定值[DNA]bg，并从该荧光测定值[DNA]raw中减去荧光测定值[DNA]bg，由此来确定所述荧光强度[DNA]real。

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