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WO2007091387A1 - Ｈｌａ結合性ペプチド、その前駆体、それをコードするｄｎａ断片および組み換えベクター - Google Patents

Ｈｌａ結合性ペプチド、その前駆体、それをコードするｄｎａ断片および組み換えベクター Download PDF

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WO2007091387A1
WO2007091387A1 PCT/JP2007/000058 JP2007000058W WO2007091387A1 WO 2007091387 A1 WO2007091387 A1 WO 2007091387A1 JP 2007000058 W JP2007000058 W JP 2007000058W WO 2007091387 A1 WO2007091387 A1 WO 2007091387A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hla
binding
peptide
amino acid
binding peptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/000058
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tomoya Miyakawa
Keiko Udaka
Original Assignee
Nec Corporation
Kochi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nec Corporation, Kochi University filed Critical Nec Corporation
Priority to EP07706306A priority Critical patent/EP1982992B1/en
Priority to US12/278,348 priority patent/US20090023895A1/en
Priority to JP2007557758A priority patent/JP5067624B2/ja
Publication of WO2007091387A1 publication Critical patent/WO2007091387A1/ja
Priority to US12/947,624 priority patent/US9045531B2/en

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    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • H L A binding peptide, its precursor, its DNA fragment and recombinant vector
  • the present invention relates to an HLA-binding peptide, a precursor thereof, a DNA fragment encoding the same, and a recombinant vector.
  • CTL cytotoxic T cells
  • Patent Document 1 There is a technique described in Patent Document 1 as this kind of technology.
  • Patent Document 1 describes that an oligopeptide having a specific amino acid sequence has HLA binding properties.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 8_1 5 1 3 96
  • HLA-binding peptide described in the above document binds effectively to an HLA molecule, and there was room for further improvement in terms of HLA binding properties. .
  • HLA-binding peptide described in the above-mentioned document has a binding property to HLA-DQ4.
  • HLA-A2 molecules products such as HL AA * 0201 gene or HL AA * 0206 gene
  • HLA-A 24 molecules products such as HLA-A * 2402 gene
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an HLA binding peptide having excellent binding properties to a specific type of HLA molecule.
  • an HLA-binding peptide that binds to an HLA-A-type molecule comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 52, An HLA-binding peptide consisting of 11 or less amino acid residues is provided.
  • HLA-binding peptides comprising one or more amino acid sequences are provided.
  • an HLA-binding peptide that binds to an HLA-A type molecule, wherein one or two of the amino acid sequences contained in the above-mentioned HLA-binding peptide.
  • An HLA-binding peptide comprising an amino acid sequence in which amino acid residues are deleted, substituted or added, and comprising 8 or more and 11 or less amino acid residues is provided.
  • the amino acid sequence comprising one or several amino acid residues deleted, substituted or added in the specific amino acid sequence having the binding property to the HLA-A molecule is included. Even when configured, the same effect as the above-mentioned HLA-binding peptide is achieved.
  • a DNA fragment comprising a DN A sequence encoding the above HLA-binding peptide.
  • a recombinant vector comprising a DN A sequence encoding the above-mentioned HLA-binding peptide is provided.
  • an HLA-binding peptide precursor characterized by being converted to the above-mentioned HLA-binding peptide in a mammal.
  • an HLA binding peptide having excellent binding properties to an HLA-A type molecule can be obtained.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining an active learning experiment plan used in an example.
  • the connectivity with the HLA molecule predicted by the hypothesis obtained by using the active learning experiment method is converted into one log Kd value.
  • a peptide comprising the amino acid sequence as described above and consisting of 8 or more and 11 or less amino acid residues was determined as an HLA-binding peptide candidate. As a result of binding experiments, it was confirmed that these peptides were actually HLA binding peptides.
  • the HLA-binding peptide according to the present embodiment is an HLA-binding peptide that binds to an HLA-A type molecule, and is described later in SEQ ID NOs: 1 to 52.
  • An HLA-binding peptide comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of 8 to 11 amino acid residues.
  • sequences are all sequences consisting of 9 amino acid residues contained in a predetermined genomic protein of avian influenza virus.
  • sequences of SEQ ID NOs: 1 to 20 are representative of the following three strains of avian influenza virus serotypes (H7, H9, H5) described below: M22344 (H7) strain or AF 508607 (H9) strain or This sequence consists of 9 amino acid residues contained in the nucleoprotein of AY 676037 (H 5) strain.
  • sequences of SEQ ID NOs: 1 to 20 were predicted by the method described above, The sequence with the highest binding to HLA-A24 molecule (product of HLA-A * 2402 gene). Sequence numbers 1 to 20 are arranged in the order of excellent binding. That is, SEQ ID NO: 1 is the sequence predicted to have the best binding.
  • Each unit of the predicted score of the binding of each sequence to the HLA-A24 molecule and the unit of the binding experiment data item is indicated by one I og Kd value.
  • sequences of SEQ ID NOs: 21 to 36 are representative of the following three types of avian influenza virus serotypes (H7, H9, H5) described below: M22344 (H7) strain or AF 508607 (H 9) A sequence consisting of 9 amino acid residues contained in the nucleoprotein of the strain or AY 676037 (H 5) strain.
  • sequences of SEQ ID NOs: 21 to 36 are sequences with the highest binding properties with the HLA-A2 molecule (product of the HLA-A * 0201 gene) predicted by the method described above. Sequence numbers 21 to 36 are arranged in the order of excellent binding. That is, SEQ ID NO: 21 is the sequence that is predicted to have the best binding. Is a column.
  • the unit of the prediction score for the binding of each sequence to the HLA-A 2 molecule and the item of the binding experiment data is the sequence of SEQ ID NOs: 37 to 52, each represented by one I o gKd value. It is shown in Table 3 below.
  • sequences of SEQ ID NOs: 37 to 52 are representative of the following three types of avian influenza virus serotypes (H7, H9, H5) described below, M22344 (H7) strain or AF 508607 (H9) strain: Alternatively, it is a sequence consisting of 9 amino acid residues contained in the nucleoprotein of the AY 676037 (H 5) strain.
  • sequences of SEQ ID NOs: 37 to 52 are sequences with the highest binding properties with the HLA-A2 molecule (product of HLA-A * 0206 gene) predicted by the above-described method. Sequence numbers 37 to 52 are arranged in the order of excellent binding. That is, SEQ ID NO: 37 is the sequence predicted to have the best binding.
  • the unit of the prediction score for the binding of each sequence to the HLA-A 2 molecule and the item of the binding experiment data are all expressed as one I o gKd value.
  • the technique for finding the HLA-binding peptide by using the experimental design as described above is adopted, and thus, a large number of HLA-binding peptides as many as 52 sequences as described above are found. I was able to.
  • any of the sequences in which the experiments were conducted had excellent binding properties with HLA equivalent to or higher than expected. Was confirmed.
  • HLA-binding peptides containing one or more amino acid sequences selected from the group consisting of 47, 48, 49, 50, 5 1 and 52 have been confirmed to bind to HLA-A type molecules in experiments. The For this reason, it can be said that it is an HLA-binding peptide with excellent binding properties to human HLA-A type molecules.
  • the binding property of the HLA-binding peptide according to the present embodiment to the HLA molecule can be 3 or more in terms of one Iog Kd value, particularly preferably. It is 5 or more, more preferably 5.4 or more.
  • HLA-A 24 molecule if the binding property to HLA-A 24 molecule is 5 or more in terms of I og K d value, the binding property to HLA molecule is Since excellent peptides can be obtained, it can be suitably used for the development of effective therapeutic and preventive drugs for immune diseases.
  • the binding property to HLA-A 24 molecule is 5.4 or more in terms of one I og K d value, a peptide having particularly excellent binding property to HLA molecule can be obtained. It can be suitably used to develop more effective therapeutic and preventive drugs for diseases.
  • the HLA-binding peptide according to this embodiment may be composed of 8 or more and 11 or less amino acid residues.
  • a peptide consisting of 8 or more and 11 or less amino acid residues is excellent in binding to the HLA molecule.
  • Cytotoxic T cells CTLs
  • CTL epitopes CD34+, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD
  • CTL epitope consisting of 8 to 11 amino acids specific to such viruses and the like when creating vaccines for the treatment or prevention of viruses and the like.
  • the above HLA-binding peptide may be a peptide consisting only of amino acid residues, but is not particularly limited.
  • it may be an HLA-binding peptide precursor that has been modified with a sugar chain or a fatty acid group as long as it does not inhibit the effects of the present invention.
  • Such precursors are digested by digestive enzymes in the body of mammals such as the digestive organs of the human body.
  • the same effect as the binding peptide can be obtained in the above-mentioned HLA-binding peptide also by becoming an HLA-binding peptide in response to changes such as the above.
  • the HLA-binding peptide may be a peptide that binds to human HLA-A24 molecule.
  • H L A-binding peptide may be a peptide that binds to a human HLA-A2 molecule.
  • a peptide that binds to the HLA-A24 molecule which is often found in Asian species including Japanese species, is obtained, and thus is particularly effective for Asian species including Japanese species. It can be used to develop new therapeutic and preventive drugs.
  • peptides that bind to HLA_A2 molecules which are common in Western species in addition to Japanese species, are obtained, so that treatment that is particularly effective for Western species in addition to Japanese species. It can be used to develop drugs and preventive drugs.
  • the amino acid sequence contained in the above-mentioned HLA binding peptide may be an amino acid sequence derived from a predetermined genomic protein of avian influenza virus, but is not particularly limited. For example, it may be an amino acid sequence derived from an HIV protein or an amino acid sequence derived from a cedar pollen protein. Further, it may contain an amino acid sequence derived from other pathogenic or allergenic proteins.
  • an HLA binding peptide that can be used for the prevention and treatment of diseases caused by avian influenza virus can be obtained.
  • an HLA-binding peptide that binds to an HLA_A type molecule, wherein one or two amino acid residues are deleted from the amino acid sequence contained in the above-mentioned HLA-binding peptide.
  • An HLA-binding peptide comprising an amino acid sequence that is substituted or added, and comprising 8 or more and 11 or less amino acid residues Provided.
  • amino acid sequences of the nuc I eoprotein of the above-mentioned avian influenza virus strains M 2 2 3 4 4 or AF 5 0 8 6 0 7 or AY 6 7 6 0 3 7 are partially different from each other
  • there is a high correlation between the predicted data and the experimental data at one I og K d value that is, a sequence that is determined to have connectivity in the predicted data has a good I og K d value even in the experimental data. From these results, it is predicted that even amino acid sequences in which one or two amino acid residues are substituted in the amino acid sequence exhibiting binding properties will exhibit excellent HLA binding properties as well.
  • amino acid sequence in which one or two amino acid residues are substituted, deleted, or added in the amino acid sequence having excellent binding properties to the HLA-A molecule shown in SEQ ID NOS: 1 to 52 it can be predicted that the same excellent HLA binding property is exhibited.
  • amino acid residues in the amino acid sequence predicted by the above-described method and excellent in binding to the HLA-A molecule are substituted, deleted, or added. It can be predicted that the same amino acid sequence shows excellent HLA binding properties.
  • the amino acid residues to be substituted are preferably amino acid residues having similar properties such as hydrophobic amino acid residues.
  • any of the HLA-binding peptides described in Embodiments 1 and 2 can be produced using techniques known to those skilled in the art. For example, it may be artificially synthesized by a solid phase method or a liquid phase method. Alternatively, these HLA-binding peptides may be produced by expressing from a DNA fragment encoding these HLA-binding peptides or a recombinant vector. The H obtained in this way Any LA-binding peptide can be identified using techniques known to those skilled in the art. For example, identification can be performed using Edman decomposition or mass spectrometry.
  • a DNA fragment containing a DNA sequence encoding the above-mentioned H L A binding peptide is provided. Since the DNA fragment according to this embodiment contains a specific DNA sequence, it can express the above-mentioned H L A-binding peptide.
  • this DNA fragment may be introduced into a cell and expressed, or a commercially available artificial DNA It may be expressed using a typical protein expression kit.
  • the above-mentioned DNA fragment can be continuously expressed, for example, by introducing it into chick cells. Therefore, the introduction of a DNA fragment that encodes an HLA-binding peptide into the cell is more sustainable than the introduction of an HLA-binding peptide into the cell. Sex peptides can be present. In the case of using an HLA binding peptide as a vaccine, such a continuous expression is advantageous for increasing the effectiveness of the vaccine.
  • the DNA fragment according to the present embodiment can be produced using a technique known to those skilled in the art. For example, it may be synthesized artificially with a commercially available DNA synthesizer. Alternatively, it may be excised from the HCV genome using a restriction enzyme or the like. Alternatively, it may be obtained by amplifying the HCV genome by PCR using primers. In addition, any of the thus obtained DNA fragments can be identified using a technique known to those skilled in the art. For example, it can be identified by a commercially available DNA sequencer.
  • a recombinant vector containing a DNA sequence encoding the above HLA-binding peptide can be obtained. Since the recombinant vector according to this embodiment contains a specific DNA sequence, it can express the above HLA-binding peptide. [0056] When the above-mentioned HLA-binding peptide is expressed using the recombinant vector according to the present embodiment, the recombinant vector may be introduced into a cell for expression, or a commercially available artificial vector. It may be expressed using a protein expression kit.
  • the above-described recombinant vector can be continuously expressed, for example, by introducing it into a chick cell. Therefore, the introduction of a recombinant vector that encodes an HLA-binding peptide into the cell is more sustainable than the introduction of the HLA-binding peptide itself into the cell. Can exist. In the case of using an HLA binding peptide as a vaccine, such a continuous expression is advantageous for enhancing the effectiveness of the vaccine.
  • the regulatory region for transcription and expression such as the promoter region upstream of the DNA sequence encoding the above HLA-binding peptide is used as an arbitrary sequence, so The expression level of the peptide can be controlled with high accuracy.
  • the regulatory region for replication such as the origin region of the recombinant vector an arbitrary sequence, the number of copies in the cell of the recombinant vector can be accurately controlled.
  • the above recombinant vector can contain any sequence other than the DNA sequence encoding the above HLA binding peptide.
  • it may contain a sequence of a marker gene such as a drug resistance gene.
  • the recombinant vector according to the present embodiment can be produced using techniques known to those skilled in the art.
  • a multi-cloning site of a commercially available vector such as pBR 3 2 2 or p UC 19 is cleaved with an arbitrary restriction enzyme site, and the above DNA fragment is inserted into the site for ligation. Is obtained.
  • any of the recombinant vectors thus obtained can be identified using techniques known to those skilled in the art.
  • the length of the DNA fragment cleaved by any restriction enzyme corresponds to the cleavage map of a commercially available vector such as pBR 3 2 2 or p UC 1 9 is confirmed by agarose gel electrophoresis, and further, multiclonin Whether the DNA sequence is included in the DNA sequence cut out from the grouse can be identified with a DNA sequencer or the like.
  • an HLA-binding peptide containing an amino acid sequence derived from a predetermined genomic protein of avian influenza virus is used, but an amino acid sequence derived from another protein of avian influenza virus is used. It may be an HLA-binding peptide containing. Even in such a case, it can be used for the treatment of various immune diseases related to the proteins derived from them.
  • HLA-binding peptide against pathogens such as HIV viruses other than avian influenza virus, and as an HLA-binding peptide containing an amino acid sequence derived from an allergen such as cedar pollen or a protein such as cancer cell. Also good.
  • HLA-binding peptides are mainly infectious diseases (influenza, SARS, HIV, HCV, etc.), cancer immunotherapy, allergic diseases (hay fever, rheumatism, atopy, asthma, etc.), autoimmune diseases It can be suitably used for the treatment or prevention.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the active learning experiment plan used here.
  • the actual binding ability is measured by an experiment described later and added to the accumulated data.
  • a supervised learning algorithm of a hidden Markov model is used as a lower learning algorithm, and it is stared from the initial data of 2 2 3 types of peptides, and 2 0 to 3 0 types per experiment.
  • the peptide was predicted and selected, and the above procedure was repeated four times to obtain a total of 3 4 1 data.
  • the design of a peptide consisting of an amino acid sequence consisting of 20 amino acids of 9 types is synthesized in a single experiment. ⁇ 30 kinds were done. And we measured the strength (binding ability) of these HLA molecules. As a result of the experiment, binding ability (K d value) was obtained. If the binding ability was high, it was selected as a candidate for an HLA binding peptide that can be used as a vaccine material.
  • the obtained results were input to a learning system including a learning machine using a hidden Markov model as a mathematical algorithm, and a rule was created.
  • a learning machine sampled different results and created rules. It should be noted that the rules that are expressed differ depending on the learning machine.
  • the obtained rules and experimental data are stored as accumulated data as needed.
  • different rules were applied to the experimental candidates, and candidates that could break the prediction of the experimental results were applied to the experiment. In this way, the final prediction accuracy is improved because candidates for the prediction of the experimental result are subjected to the next experiment.
  • the accuracy of predicting the binding ability of peptides to HLA by the rules obtained by the active learning method thus reached 70 to 80%.
  • the hit rate by other known techniques such as the anchor method is only about 30%.
  • Peptides were synthesized manually using Fmoc amino acid by the solid phase method of M r r i f i e I d. After deprotection, reverse phase HPLC purification was performed using a C18 column to a purity of 95% or higher. Peptide identification and purity were confirmed by MA L D I—TO F mass spectrometry (V o y ager D E RP, Per Sep tiv e). Peptides were quantified by Miccro BCA Atsey (Pierce) using BS A as a standard protein.
  • the binding ability of the peptide to the HLA—A 24 molecule was measured using C 1 R—A24 cells expressing the H LA—A24 molecule (Kumamoto University, Professor Masafumi Takiguchi) The work was done with permission.)
  • C 1 R—A24 cells were exposed to acidic conditions of pH 3.3 for 30 seconds and shared with endogenous peptides originally bound to HLA-A * 2402 molecules and HLA class I molecules.
  • the associated light chain (S2m) was dissociated and removed.
  • C 2 R_A 24 cells were purified) S 2 m was added, added to the peptide dilution column, and incubated on ice for 4 hours. During this period, staining was performed using a fluorescently labeled monoclonal antibody 17A12 that recognizes the three-membered assembly (MHC_pep) of HLA-A * 2402 molecule, peptide, and S 2 m that reassociates.
  • MHC_pep three-membered assembly
  • the dissociation constant Kd was calculated by the method published in (Udakaetal, Immunogenetocs, 5 8, 8 16-828, 2000).
  • RA 2.6 cells (a cell line newly created at Kochi University) in which cDNA of HL AA * 020 6 gene was expressed were used. [0084] First, RA2.6 cells were cultured overnight at 26 ° C, and a dilution series of peptides was added to the HLA-A * 0206-molecule-bound peptide that had not been bound to the cell surface, and 30 minutes at room temperature. Combined.
  • the dissociation constant K d value was calculated by the method published in (U da k a et al., I mmuno gnet et c s, 5 ⁇ , 81 6-828, 2000).
  • sequences of SEQ ID NOS: 1 to 20 in Table 1 are composed of 9 amino acid residues contained in the full-length nucleoprotein sequence of M22344 strain, AF 508607 strain or AY676037 strain of avian influenza virus registered in GEN BANK Is an array.
  • sequences of SEQ ID NOs: 1 to 20 have the highest binding to the HLA-A24 molecule (product of HLA-A * 2402 gene) predicted by the hypothesis obtained by the experimental design described in Embodiment 1.
  • Is an array of Sequence numbers 1 to 20 are arranged in the order of excellent binding. That is, SEQ ID NO: 1 is the sequence predicted to have the best binding.
  • the full-length amino acid sequence of the n uc I e o p r o t e i n of avian influenza virus strain M 22344 is represented by SEQ ID NO: 53 (MASQGTKRSYEQM ETGGERQNATE I RAS VGRMVGG I GRFY I QMCTEL KLSDYEGRL I QNS I T I ERMVLSAFDERRNKY LEE
  • sequences of SEQ ID NOs: 21 to 36 in Table 2 are sequences consisting of 9 amino acid residues contained in the above-mentioned avian influenza virus strain M 22344, A F 508607 strain or AY 676037 nucleoportein.
  • sequences of SEQ ID NOs: 21 to 36 have binding properties with H LA—A2 molecules (product of H LA—A * 0201 gene) predicted by the hypothesis obtained by the experimental planning method described in Embodiment 1. Is the upper sequence. Sequence numbers 21 to 36 are arranged in the order of excellent binding. That is, SEQ ID NO: 21 is the sequence predicted to have the best binding.
  • sequences of SEQ ID NOs: 37 to 52 in Table 3 are sequences consisting of 9 amino acid residues contained in the nucleoprotein of the aforementioned avian influenza virus M 22344 strain, AF 508607 strain or AY 676037 strain.
  • sequences of SEQ ID NOs: 37 to 52 were predicted based on the hypothesis obtained by the experimental design method described in Embodiment 1, and the H LA—A2 molecule (H LA—A * 0206 gene product).
  • Sequence numbers 37 to 52 are arranged in the order of excellent binding. That is, SEQ ID NO: 37 is the sequence predicted to have the best binding.
  • Tables 1 to 3 also show the amino acid corresponding to the highest score of the prediction result using the above-mentioned prediction program for each of the nucleoproteins of the avian influenza virus M22344 strain, AF 508607 strain or AY 676037 strain. The sequence, the predicted score, and the corresponding binding experiment data are listed. All binding experiments were performed by artificially synthesizing 9 amino acid peptides using the synthesis method described above.
  • nuc Ieoprotein of avian influenza virus M22344 strain AF 50860 7 strain or AY 676037 strain is registered in Gen Bank, but it is an HLA-binding peptide in it.
  • the sequence consisting of 9 amino acid residues is not currently registered.
  • M22344 strain H7 type
  • AY 676037 strain H type 5
  • H type 5 is a type of influenza that is currently spreading mainly in Asia and also in Europe.
  • an HLA-binding peptide was found in the influenza virus epidemic strain nucIeoprotein that is prevalent in Europe and Asia. This HLA binding peptide can be suitably used for the development of a preventive and therapeutic vaccine for avian influenza in Europe and Asia.
  • amino acid sequences of the nucleoprotein of the above-mentioned avian influenza virus strains M22344, AF5 08607 or AY 676037 are partially different from each other, but one or several of the amino acid sequences are mutually different. Even an amino acid sequence in which a single amino acid residue is substituted can be predicted to exhibit excellent HLA binding properties as described above.
  • the third from the left of the peptide of SEQ ID NO: 7 of M 2 2 3 4 4 strain is AF
  • the first from the left of the peptide of SEQ ID NO: 8 of the M 2 2 3 4 4 strain is S instead of N in the peptide of SEQ ID NO: 1 1 of the AF 5 0 8 6 0 7 strain. ing.
  • the fourth from the left of the peptide of SEQ ID NO: 14 of M 2 2 3 4 4 strain is the peptide of SEQ ID NO: 15 of AY 6 7 60 3 7 It is.
  • the third from the left of the peptide of SEQ ID NO: 16 of the M 2 2 3 4 4 strain is N, not S in the peptide of SEQ ID NO: 1 8 of the AY 6 7 60 3 7 strain. It is.
  • the sixth from the left of the peptide of SEQ ID NO: 17 of M 2 2 3 4 4 strain is E instead of D in the peptide of SEQ ID NO: 13 of AF 5 0 8 0 6 strain.
  • the third from the left of the peptide of SEQ ID NO: 17 of M 2 2 3 4 4 strain is AY 6 7 6 0
  • the fifth from the left of the peptide of SEQ ID NO: 2 3 of M 2 2 3 4 4 strain is I instead of V in the peptide of SEQ ID NO: 2 7 of AF 5 0 8 0 7 strain ing.
  • the binding experiment value of the peptide of SEQ ID NO: 7 of 4 strains was 7.8 0 7 8 1
  • the binding experimental value of the peptide of SEQ ID NO: 9 of the AF 508607 strain is 7.80 229.
  • the fifth from the left of the peptide of SEQ ID NO: 7 of M22344 strain is I instead of V in the peptide of SEQ ID NO: 9 of AF 508607 strain and SEQ ID NO: 6 of AY676037 strain, and the sequence number of M22344 strain
  • the binding experiment value of peptide No. 7 is 7.80781
  • the binding experiment value of peptide No. 9 of AF5086 07 strain is 7. 80229
  • the binding experiment value of peptide No. 6 of AY 676 037 strain is Is 7. 56449, and it can be confirmed that both are well coupled.
  • the first from the left of the peptide of SEQ ID NO: 8 of the M22344 strain is SEQ ID NO: 1 of the AF 508607 strain.
  • S is not N
  • the binding experiment value of the peptide of SEQ ID NO: 8 of the M22344 strain is 7.76375
  • that of the peptide of SEQ ID NO: 11 of the AF 508607 strain is The binding experimental value is 7.7 1 879, and it can be confirmed that both bind well.
  • the peptide of SEQ ID NO: 15 of Y 676037 is S instead of G, and the binding experiment value of the peptide of SEQ ID NO: 14 of M22344 is 7.554336, whereas that of AY 676037 is The experimental binding value of the peptide of SEQ ID NO: 15 is 7.43594, and it can be confirmed that both bind well.
  • the peptide of SEQ ID NO: 18 of Y 676037 is N instead of S, and the binding experiment value of the peptide of SEQ ID NO: 16 of M22344 strain is 5.7441 5, whereas AY 676037 strain The experimental binding value of the peptide of SEQ ID NO: 18 is 5.37438, and it can be confirmed that both bind well.
  • the sixth from the left of the peptide of SEQ ID NO: 17 of the M22344 strain is A
  • the binding experiment value of the peptide of SEQ ID NO: 1 ⁇ of M 2 2 3 4 4 strain is 7.3 2
  • the binding test value of the peptide of SEQ ID NO: 13 of the AF 5 0 8 60 7 strain is 7.2 5 0 15.
  • the third from the left of the peptide of SEQ ID NO: 17 of M 2 2 3 4 4 strain is R instead of K in the peptide of SEQ ID NO: 10 of AY 6760 600 strain.
  • the binding experiment value of the peptide of SEQ ID NO: 17 of M 2 2 3 4 4 strain is 7.3 2 5 98, whereas that of the peptide of SEQ ID NO: 10 of strain AY 6 7 60 3 7
  • the binding experimental value is 7.4 9 6 5 3, and it can be confirmed that all bind well.
  • the fifth from the left of the peptide of SEQ ID NO: 2 1 of the M 2 2 3 4 strain is AF 50
  • the peptide of SEQ ID NO: 2 6 of strain 8 6 0 7 is N instead of H
  • the binding experimental value of the peptide of SEQ ID NO: 2 1 of strain M 2 2 3 4 4 is 5.0 8 4 8 3
  • the binding test value of the peptide of SEQ ID NO: 26 of AF5 086 07 strain is 4.9 0 3 5 3, and it can be confirmed that both bind well.
  • the fifth from the left of the peptide of SEQ ID NO: 2 3 of M 2 2 3 4 4 strain is AF 5 0 8
  • the peptide of SEQ ID NO: 2 7 of strain 6 07 is I instead of V
  • the binding experiment value of peptide of SEQ ID NO: 2 3 of strain M 2 2 3 4 4 is 5.5 7 8 5 7
  • the binding test value of the peptide of SEQ ID NO: 27 of AF5 086 07 strain is 4.8 0 8 5, and it can be confirmed that both bind well.
  • the temporary design obtained by the experimental design described in the first embodiment is an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, or added in the amino acid sequence excellent in binding to the HLA_A molecule predicted by the theory It can be said that it exhibits excellent HLA binding properties.
  • the amino acid residues to be substituted are preferably amino acid residues having similar properties such as hydrophobic amino acid residues.
  • the avian influenza virus M 2 2 3 4 4 strain or AF 5 0 8 6 0 7 strain or AY 6 7 6 0 3 7 strain nuc I eoprotein was used.
  • Other proteins of the virus or other strains may be used.
  • HLA connectivity can be accurately predicted.

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Abstract

　ＨＬＡ－Ａ型分子に結合するＨＬＡ結合性ペプチドであって、配列番号１から５２からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含み、８以上１１以下のアミノ酸残基からなるＨＬＡ結合性ペプチドを提供する。なお、これらのアミノ酸配列は、いずれも図１に示した能動学習法を利用した予測プログラムを用いて、ヒトＨＬＡ－Ａ分子との結合性が予測されたアミノ酸配列である。

Description

明 細 書
H L A結合性ペプチド、 その前駆体、 それをコードする D N A断片 および組み換えべクタ一
技術分野
[0001] 本発明は、 H L A結合性ペプチド、 その前駆体、 それをコードする D N A 断片および組み換えベクターに関する。
背景技術
[0002] インフルエンザウイルスなどのウィルスに感染すると、 自然免疫によるゥ ィルス排除反応が起こり、 次いで、 特異的免疫応答が誘導され、 ウィルスの 排除反応が起こる。
[0003] 特異的免疫応答では、 体液中のウィルスが中和抗体により排除され、 細胞 内のウィルスが細胞傷害性 T細胞 （C T L ) により排除される。 すなわち、 C T Lは、 感染細胞表面の H L Aクラス I分子に提示された、 8〜 1 1のァ ミノ酸からなるウィルス抗原 （C T Lェピトープ） を特異的に認識し、 感染 細胞を傷害することによりウィルスを排除する。 したがって、 このようなゥ ィルスに特異的な C T Lェピトープを同定することは、 ウィルスに対する予 防および治療ワクチンを作成する上で重要である。
[0004] この種の技術として、 特許文献 1記載のものがある。 特許文献 1には、 特 定のアミノ酸配列からなるオリゴぺプチドは、 H L A結合性を有する旨が記 載されている。
特許文献 1 ：特開平 8 _ 1 5 1 3 9 6号公報
発明の開示
[0005] しかしながら、 上記文献記載の従来技術は、 以下の点で改善の余地を有し ていた。
[0006] 第一に、 上記文献記載の H L A結合性ペプチドは、 H L A分子と有効に結 合するか否かは不明であり、 H L Aとの結合性の面でさらなる改善の余地を 有していた。 [0007] 第二に、 上記文献記載の H LA結合性ペプチドは、 H LA— DQ4と結合 性がある旨記載されている。 しかし、 欧米人種に多い H LA— A2分子 （H L A-A * 0201遺伝子あるいは H L A-A * 0206遺伝子などの産物 ) および日本人種に多い H L A— A 24分子 （H L A— A * 2402遺伝子 などの産物） に対して結合するか否かは不明である。
[0008] 本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、 特定の型の H L A分子と の結合性に優れる H L A結合性べプチドを提供する。
[0009] 本発明によれば、 H LA— A型分子に結合する H LA結合性ペプチドであ つて、 配列番号 1から 52からなる群よリ選ばれる 1種以上のァミノ酸配列 を含み、 8以上 1 1以下のアミノ酸残基からなる H L A結合性ペプチドが提 供される。
[0010] また、 本発明によれば、 上記の H L A結合性ペプチドにおいて、 配列番号
1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 4、 1 5、 1 6、 1 7、 1 8、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28 、 30、 31、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 45、 47、 48、 49、 50、 51および 52からなる群より選ばれる 1種以上 のアミノ酸配列を含む H L A結合性べプチドが提供される。
[0011] また、 本発明によれば、 H LA— A型分子に結合する H LA結合性べプチ ドであって、 上記の H L A結合性べプチドに含まれるアミノ酸配列のうち 1 若しくは 2個のアミノ酸残基が欠失、 置換若しくは付加されてなるアミノ酸 配列を含み、 8以上 1 1以下のアミノ酸残基からなる H L A結合性ペプチド が提供される。
[0012] このように、 H LA— A型分子との結合性を有する特定のアミノ酸配列の うち 1若しくは数個のァミノ酸残基が欠失、 置換若しくは付加されてなるァ ミノ酸配列を含む構成であっても、 上述の H L A結合性べプチドと同様の作 用を奏する。
[0013] また、 本発明によれば、 上記の H L A結合性ペプチドをコードする DN A 配列を含む D N A断片が提供される。 [0014] また、 本発明によれば、 上記の H L A結合性ペプチドをコードする DN A 配列を含む組み換えベクターが提供される。
[0015] また、 本発明によれば、 ほ乳類の生体内において、 上記の H L A結合性べ プチドに変化することを特徴とする H L A結合性べプチド前駆体が提供され る。
[0016] 本発明によれば、 特定のアミノ酸配列を含むため、 H LA— A型分子との 結合性に優れる H L A結合性べプチドが得られる。
図面の簡単な説明
[0017] 上述した目的、 およびその他の目的、 特徴および利点は、 以下に述べる好 適な実施の形態、 およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかに なる。
[図 1]実施例で用いた能動学習実験計画を説明する模式図である。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 以下、 本発明の実施の形態について、 図面を用いて説明する。 尚、 すべて の図面において、 同様な構成要素には同様の符号を付し、 適宜説明を省略す る。
[0019] <実施形態 1 >
本実施形態では、 能動学習実験法 （特開平 1 1一 3 1 6754号公報） を 用いて得られる仮説により予測された、 H LA分子との結合性が、 一 l o g Kd値に換算して 3以上であるアミノ酸配列を含み、 8以上 1 1以下のアミ ノ酸残基からなるペプチドを、 H L A結合性ペプチド候補とした。 そして結 合実験を行った結果、 実際にこれらのぺプチドが H L A結合性べプチドであ ることを確認した。
[0020] その結果、 H L A分子との結合性が、 ― I o g Kd値に換算して 3以上で あるアミノ酸配列を含むため、 H LA_ A型分子との結合性に優れる、 多数 の H LA結合性べプチドを効率よく得ることができた。
[0021] 具体的には、 本実施形態に係る H L A結合性ペプチドは、 H LA— A型分 子に結合する H L A結合性べプチドであって、 後述する配列番号 1から 52 からなる群より選ばれる 1種以上のアミノ酸配列を含み、 8以上 1 1以下の アミノ酸残基からなる H L A結合性べプチドである。
[0022] ヒト H LA— A型のうち、 日本人種の約 50%が H L A— A 24型をもつ
。 また、 ドイツ人などの欧米人は、 H LA— A2型が多い。
[0023] なお、 これらの配列は、 いずれも鳥インフルエンザウイルスの所定のゲノ ムタンパク質に含まれる 9ァミノ酸残基からなる配列である。
[0024] 配列番号 1から 20の配列を、 下記の表 1に示す。
(表 1 )
表 1 HLA— A24型結合性ペプチド
Figure imgf000006_0001
配列番号 1から 20の配列は、 後述する鳥インフルエンザウイルスの血清 型 3種 （H7、 H9、 H 5) について代表的な以下の株、 M22344 (H 7) 株または A F 508607 ( H 9 ) 株または A Y 676037 (H 5) 株の n u c l e o p r o t e i nに含まれる 9アミノ酸残基からなる配列で ある。 また、 配列番号 1から 20の配列は、 上述の方法により予測された、 H LA— A24分子 （H LA— A * 2402遺伝子の産物） との結合性が上 位の配列である。 なお、 配列番号 1から 20まで結合性の優れる順に並んで いる。 すなわち、 配列番号 1が、 最も結合性が優れると予測される配列であ る。 なお、 各配列の H LA— A 24分子との結合性の予測スコアおよび結合 実験データの項目の単位は、 いずれも一 I o g Kd値にて示されている。
[0026] 配列番号 21から 36の配列を、 下記の表 2に示す。
(表 2)
表 2 HLA— A2型結合性ペプチド
Figure imgf000007_0001
[0027] 配列番号 21から 36の配列は、 後述する鳥インフルエンザウイルスの血 清型 3種 （H7、 H9、 H 5) について代表的な以下の株、 M22344 ( H 7) 株または A F 508607 ( H 9 ) 株または A Y 676037 (H 5 ) 株の n u c l e o p r o t e i nに含まれる 9アミノ酸残基からなる配列 である。 また、 配列番号 21から 36の配列は、 上述の方法により予測され た、 H LA— A2分子 （H L A— A * 0201遺伝子の産物） との結合性が 上位の配列である。 なお、 配列番号 21から 36まで結合性の優れる順に並 んでいる。 すなわち、 配列番号 21が、 最も結合性が優れると予測される配 列である。 なお、 各配列の H LA— A 2分子との結合性の予測スコアおよび 結合実験データの項目の単位は、 いずれも一 I o gKd値にて示されている 配列番号 37から 52の配列を、 下記の表 3に示す。
(表 3)
表 3 HLA— A2型結合性ペプチド
Figure imgf000008_0001
配列番号 37から 52の配列は、 後述する鳥インフルエンザウイルスの血 清型 3種 （H7、 H9、 H 5) について代表的な以下の株、 M22344 ( H 7) 株または A F 508607 ( H 9 ) 株または A Y 676037 (H 5 ) 株の n u c l e o p r o t e i nに含まれる 9アミノ酸残基からなる配列 である。 また、 配列番号 37から 52の配列は、 上述の方法により予測され た、 H LA— A2分子 （H L A— A * 0206遺伝子の産物） との結合性が 上位の配列である。 なお、 配列番号 37から 52まで結合性の優れる順に並 んでいる。 すなわち、 配列番号 37が、 最も結合性が優れると予測される配 列である。 なお、 各配列の H LA— A 2分子との結合性の予測スコアおよび 結合実験データの項目の単位は、 いずれも一 I o gKd値にて示されている [0030] なお、 詳しくは、 後述するが、 表 1〜表 3のいずれにおいても、 予測スコ ァと結合実験データとの間に関連性が存在していることが明らかである。 す なわち、 多少の誤差はあるが、 上述の方法により予測された、 H LA— A分 子との結合性が高いぺプチドは、 実験的に確認しても H LA— A分子との結 合性が高いといえる。
[0031] 従来は、 このように実験計画法を活用して H L A結合性ペプチドを見出す 手法は採られていなかったために、 実験的に H L A結合性が確認された極少 数の H L A結合性ペプチドが知られていたに過ぎなかった。 そのため、 従来 の手法で全くランダムに 9ァミノ酸残基からなるペプチドを合成し、 H L A 分子との結合実験を行っても、 結合性が一 I o g Kd値に換算して 6を超え るものは、 確率的には約 1 00個に 1個しかなかった。
[0032] 本実施形態においては、 このように実験計画法を活用して H L A結合性べ プチドを見出す手法を採用したため、 上記のような、 52配列にも及ぶ多数 の H L A結合性ペプチドを見出すことができた。 また、 得られた H L A結合 性べプチドの一部について H LA結合性を実験的に確認したところ、 実験を 行った配列のいずれにおいても予測と同等かそれ以上の H L Aとの優れた結 合性が確認された。
[0033] なお、 これらの配列の中でも、 配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 4、 1 5、 1 6、 1 7、 1 8、 2 1、 2 2、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 30、 3 1、 34、 35、 36 、 37、 38、 40、 4 1、 43、 45、 47、 48、 49、 50、 5 1 よび 52からなる群より選ばれる 1種以上のアミノ酸配列を含む H L A結合 性ペプチドは、 実験にょリヒ卜 H LA— A型分子との結合性が確認されてい る。 このため、 確実にヒト H LA— A型分子との結合性に優れる H LA結合 性べプチドであると言える。
[0034] ここで、 本実施形態に係る H L A結合性ペプチドの、 H L A分子との結合 性は、 一 I o g Kd値に換算して 3以上とすることができ、 特に好ましくは 5以上であり、 さらに好ましくは 5 . 4以上である。
[0035] 生化学の分野では、 ― I o g K d値に換算しておおよそ結合能の 3前後が 、 実際にべプチドが H L Aをはじめとする M H Cに結合するかしないかのし きい値として知られている。 よって、 H L A分子との結合性が _ I o g K d 値に換算して 3以上であれば、 H L A結合性べプチドであると言える。
[0036] また、 H L A— A 2 4分子の場合であれば、 H L A— A 2 4分子との結合 性が— I o g K d値に換算して 5以上であれば、 H L A分子に対する結合性 が優れるぺプチドが得られるため、 免疫疾患などに対する効果的な治療薬、 予防薬などの開発に好適に利用できる。
[0037] また、 H L A— A 2 4分子との結合性が一 I o g K d値に換算して 5 . 4 以上であれば、 H L A分子に対する結合性が特に優れるぺプチドが得られる ため、 免疫疾患などに対してさらに効果的な治療薬、 予防薬などの開発に好 適に利用できる。
[0038] また、 本実施形態に係る H L A結合性ペプチドは、 8以上 1 1以下のアミ ノ酸残基からなる構成とすることができる。
[0039] このように、 8以上 1 1以下のアミノ酸残基からなるペプチドであれば、 H L A分子との結合性に優れる。 また、 細胞傷害性 T細胞 （C T L ) は、 ゥ ィルスなどに感染した細胞表面の H L Aクラス I分子に提示された、 8〜 1 1のアミノ酸からなるウィルス抗原 （C T Lェピトープ） を特異的に認識し 、 感染細胞を傷害することによりウィルスを排除する。
そして、 このようなウィルスなどに特異的な 8〜 1 1のアミノ酸からなる C T Lェピトープを作ることは、 ウィルスなどに対する治療または予防のため のワクチンを作成する上で重要である。
[0040] 例えば、 上記の H L A結合性ペプチドは、 アミノ酸残基のみからなるぺプ チドであってもよいが、 特に限定するものではない。 例えば、 必要に応じて 本発明の作用効果を阻害しない範囲で糖鎖または脂肪酸基などの修飾を受け ている H L A結合性べプチド前駆体であってもよい。 このような前駆体が、 人体の消化器官などのほ乳類の生体内において、 消化酵素などによリ消化さ れるなどの変化を受けて、 H L A結合性ペプチドとなることによっても、 上 記の H L A結合性べプチドにおいて結合性べプチドと同様の作用効果が得ら れる。
[0041] また、 上記の H L A結合性ペプチドは、 ヒト H LA— A24分子に結合す るぺプチドであってもよい。
さらに、 上記の H L A結合性ペプチドは、 ヒト H LA— A2分子に結合す るぺプチドであってもよい。
[0042] この構成によれば、 日本人種を含むアジア人種に多い H LA— A 24分子 に対して結合するべプチドが得られるため、 日本人種を含むアジア人種に特 に効果的な治療薬、 予防薬などの開発に利用できる。
さらにこの構成によれば、 日本人種に加えて欧米人種に多い H LA_ A 2 分子に対して結合するべプチドが得られるため、 日本人種に加えて欧米人種 に特に効果的な治療薬、 予防薬などの開発に利用できる。
[0043] また、 上記の H L A結合性ペプチドに含まれるアミノ酸配列は、 鳥インフ ルェンザウィルスの所定のゲノムタンパク質由来のアミノ酸配列としてもよ いが、 特に限定するわけではない。 例えば、 H I Vのタンパク質由来のアミ ノ酸配列や、 杉花粉のタンパク質由来のアミノ酸配列などであってもよい。 また、 その他の病原性またはアレルゲン性を有するタンパク質由来のァミノ 酸配列を含んでいてもよい。
[0044] 例えば後述する鳥インフルエンザウイルスの n u c l e o p r o t e i n 由来のアミノ酸配列を含む場合には、 鳥インフルエンザウイルスによりもた らされる疾病の予防、 治療などに利用可能な H L A結合性べプチドが得られ る。
[0045] <実施形態 2>
本実施形態によれば、 H L A_A型分子に結合する H L A結合性べプチド であって、 上記の H L A結合性べプチドに含まれるアミノ酸配列のうち 1若 しくは 2個のアミノ酸残基が欠失、 置換若しくは付加されてなるアミノ酸配 列を含み、 8以上 1 1以下のアミノ酸残基からなる H L A結合性ペプチドが 提供される。
[0046] 後述するように、 H L A— A型分子との結合性を有する特定のアミノ酸配 列のうち 1若しくは数個のァミノ酸残基が欠失、 置換若しくは付加されてな るアミノ酸配列を含む構成であっても、 上述の実施形態 1に係る H L A結合 性べプチドと同様の作用を奏する。
[0047] 上記の鳥インフルエンザウイルスの M 2 2 3 4 4株または A F 5 0 8 6 0 7株または A Y 6 7 6 0 3 7株の n u c I e o p r o t e i nのアミノ酸配 列は、 互いに一部異なっているが、 一 I o g K d値における予測データと実 験データとの相関性が高いこと、 すなわち予測データで結合性ありと判断さ れた配列は実験データにおいても良好な一 I o g K d値を示すことから、 結 合性を示すアミノ酸配列のうち 1若しくは 2個のアミノ酸残基が置換されて なるアミノ酸配列であっても、 同様に優れた H L A結合性を示すことが予測 される。
[0048] また、 配列番号 1から 5 2に示した H L A— A分子との結合性が優れるァ ミノ酸配列のうち 1若しくは 2個のアミノ酸残基が置換、 欠失、 付加されて なるアミノ酸配列であっても、 同様に優れた H L A結合性を示すものと予測 することができる。
[0049] 別の観点から言えば、 上述の方法により予測された、 H L A— A分子との 結合性が優れるアミノ酸配列のうち 1若しくは数個のァミノ酸残基が置換、 欠失、 付加されてなるアミノ酸配列であっても、 同様に優れた H L A結合性 を示すものと予測することができる。 なお、 置換されるアミノ酸残基同士は 、 ともに疎水性ァミノ酸残基などの互いに特性の類似するアミノ酸残基同士 とする方がよい。
[0050] また、 実施形態 1および実施形態 2に記載の H L A結合性べプチドは、 い ずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。 例えば、 固相法または 液相法により人工合成してもよい。 また、 これらの H L A結合性ペプチドを コードする D N A断片または組み換えべクタ一から発現することにより、 こ れらの H L A結合性ペプチドを製造してもよい。 また、 こうして得られた H LA結合性べプチドは、 いずれも当業者に公知の手法を用いて同定可能であ る。 例えば、 エドマン分解法や質量分析法などを用いて同定可能である。
[0051] <実施形態 3>
本実施形態によれば、 上記の H L A結合性べプチドをコードする DN A配 列を含む DN A断片が提供される。 本実施形態に係る DN A断片は、 特定の DN A配列を含むため、 上記の H L A結合性べプチドを発現可能である。
[0052] また、 本実施形態に係る DN A断片を用いて上記の H L A結合性べプチド を発現する場合には、 この DN A断片を細胞内に導入して発現させてもよく 、 市販の人工的なタンパク質発現キッ卜を用いて発現してもよい。
[0053] さらに、 上記の DNA断片は、 例えばヒ卜の細胞内に導入することにより 、 持続的な発現を行うことができる。 そのため、 細胞内に H L A結合性ぺプ チドそのものを導入する場合よりも、 細胞内に H LA結合性べプチドをコ一 ドする DN A断片を導入する方が、 持続的に細胞内に H L A結合性べプチド を存在させることができる。 H L A結合性べプチドをワクチンとして用いる 場合には、 このように持続的に発現可能であることは、 ワクチンの有効性を 高める上で有利である。
[0054] また、 本実施形態に係る DN A断片は、 当業者に公知の手法を用いて製造 可能である。 例えば、 市販の DN Aシンセサイザーなどにより、 人工的に合 成してもよい。 あるいは、 HCVのゲノムより制限酵素などを用いて切り出 してきても良い。 あるいは、 プライマーを用いて HCVのゲノムより PCR 法で増幅して得てもよい。 また、 こうして得られた DN A断片は、 いずれも 当業者に公知の手法を用いて同定可能である。 例えば、 市販の DN Aシーク ェンサ一などにより同定可能である。
[0055] <実施形態 4>
本実施形態によれば、 上記の H L A結合性べプチドをコードする DN A配 列を含む組み換えベクターが得られる。 本実施形態に係る組み換えベクター は、 特定の DN A配列を含むため、 上記の H L A結合性ペプチドを発現可能 である。 [0056] また、 本実施形態に係る組み換えベクターを用いて上記の H L A結合性べ プチドを発現する場合には、 この組み換えベクターを細胞内に導入して発現 させてもよく、 市販の人工的なタンパク質発現キッ卜を用いて発現してもよ い。
[0057] さらに、 上記の組み換えベクターは、 例えばヒ卜の細胞内に導入すること により、 持続的な発現を行うことができる。 そのため、 細胞内に H L A結合 性べプチドそのものを導入する場合よりも、 細胞内に H L A結合性べプチド をコードする組み換えベクターを導入する方が、 持続的に細胞内に H L A結 合性べプチドを存在させることができる。 H L A結合性べプチドをワクチン として用いる場合には、 このように持続的に発現可能であることは、 ヮクチ ンの有効性を高める上で有利である。
[0058] また、 上記の組み換えベクターにおいては、 上記の H L A結合性ペプチド をコードする D N A配列の上流のプロモーター領域などの転写■発現に関す る調節領域を任意の配列とすることにより、 H L A結合性べプチドの発現量 を精度よく制御可能である。 また、 組み換えベクターのオリジン領域などの 複製に関する調節領域を任意の配列とすることにより、 組み換えべクタ一の 細胞内でのコピー数を精度よく制御可能である。
[0059] また、 上記の組み換えベクターは、 上記の H L A結合性べプチドをコ一ド する D N A配列以外にも任意の配列を含むことができる。 例えば、 薬剤耐性 遺伝子などのマーカー遺伝子の配列を含んでいてもよい。
[0060] また、 本実施形態に係る組み換えベクターは、 当業者に公知の手法を用い て製造可能である。 例えば、 p B R 3 2 2や p U C 1 9などの市販のベクタ 一のマルチクローニングサイ卜を任意の制限酵素サイ卜にて開裂し、 そのサ ィ卜に上記 D N A断片を挿入してライゲーシヨンすることにより得られる。 また、 こうして得られた組み換えベクターは、 いずれも当業者に公知の手法 を用いて同定可能である。 例えば、 任意の制限酵素により切断した D N A断 片の長さが p B R 3 2 2や p U C 1 9などの市販のベクターの開裂地図と対 応するか、 ァガロースゲル電気泳動により確認し、 さらにマルチクローニン グサイ卜から切リ出した D N A配列中に上記 D N A配列が含まれているか、 D N Aシークェンサ一などによリ同定可能である。
[0061 ] 以上、 本発明の実施形態について述べたが、 これらは本発明の例示であり 、 上記以外の様々な構成を採用することもできる。
[0062] 例えば、 上記実施の形態では鳥インフルエンザウイルスの所定のゲノムタ ンパク質由来のアミノ酸配列を含む H L A結合性べプチドとしたが、 鳥イン フルェンザウィルスの他のタンパク質由来のァミノ酸配列を含む H L A結合 性ペプチドとしてもよい。 このような場合にも、 それぞれの由来するタンパ ク質に関連する各種の免疫疾患の治療に利用することが可能である。
[0063] また、 鳥インフルエンザウイルス以外の H I Vウィルスなどの病原体に対 する H L A結合性ペプチドとしてもよく、 杉花粉などのアレルゲン、 または ガン細胞などのタンパク質由来のアミノ酸配列を含む H L A結合性べプチド としてもよい。
[0064] なお、 このようにしても、 上述の方法を用いて H L A結合性に優れると予 測されたァミノ配列を含むのであれば、 実験的に確認しても同様に優れた H L A結合性を示すと考えられる。 このため、 これらの H L A結合性ペプチド は、 感染症 （インフルエンザ、 S A R S、 H I V、 H C Vなど） を中心にし て、 ガン免疫療法、 アレルギー疾患 （花粉症、 リウマチ、 アトピー、 喘息な ど） 、 自己免疫疾患などの治療または予防に好適に用い得る。
(実施例）
[0065] 以下、 本発明を実施例によりさらに説明するが、 本発明はこれらに限定さ れるものではない。
[0066] 具体的に、 本実施例における予測■実験■評価の手順は、 能動学習実験計 画に基づいて行い、 全体として次のステップを繰り返した。 ここで用いた能 動学習実験計画の模式図を図 1に示す。
[0067] ( 1 ) 後述する下位学習アルゴリズムの試行 1回分を行う。 すなわち、 蓄 積データのランダムリサンプリングから複数の仮説を発現し、 ランダムに発 現された質問候補点 （ぺプチド） に対する予測値の分散が最も大きい点を、 実験すべき質問点として選ぶ。
[0068] ( 2 ) 選ばれた質問点のぺプチドを、 後述する合成■精製法により製造し
、 実際の結合能を後述する実験により測定して蓄積データに加える。
[0069] 本実施例では、 下位学習アルゴリズムとして、 隠れマルコフモデルの教師 付き学習アルゴリズムを用い、 2 2 3種のぺプチドの初期データからスター 卜し、 1回の実験あたり 2 0〜 3 0種のペプチドを予測、 選択し、 上記手順 を 4回繰り返し、 合計 3 4 1件のデータを得た。
[0070] より具体的には、 本実施例の能動学習法では、 2 0種類あるアミノ酸を 9 個ならベたアミノ酸配列からなるぺプチドの設計■合成を、 1回の実験あた リ 2 0〜 3 0種類分行った。 そして、 それらの H L A分子との結合の強さ （ 結合能） の計測を行った。 そして、 実験結果として、 結合能 （K d値） を得 た。 結合能が高ければ、 ワクチンの材料として利用可能な H L A結合性ぺプ チドの候補とした。
[0071 ] そして、 得られた結果を、 数学的アルゴリズムとして隠れマルコフモデル を利用する学習機械を備える学習システムに入力し、 ルールを作成した。 こ こで、 学習機械は、 それぞれ異なる結果をサンプリングし、 ルールを作った 。 なお、 学習機械により、 発現されるルールも異なる構成とした。 なお、 得 られたルールや、 実験データは、 蓄積データとして随時格納される。
[0072] そして、 そのルールにより、 2 0 9 = 5 0 0 0億以上のペプチド配列の中 から、 次回の実験候補を選び出し、 上記のプロセスを繰り返した。 この際、 異なるルールを実験候補に適用し、 実験結果の予測が割れる候補を実験にか けた。 このように、 実験結果の予測が割れる候補を次回の実験にかけるため 、 最終的な予測精度が向上した。
[0073] このように、 複数の学習機械が、 異なる予測をするサンプルを実験候補に 選ぶ選択的サンプリングを行うことで、 効率的に情報を獲得し、 精度の高い 仮説 （ルール） を得た。 上記のプロセスを、 4回繰り返せば、 後述する実施 例のように優れた結果を得られた。 また、 7回以上繰り返せば、 さらに優れ た結果が得られる。 [0074] このような能動学習法を行うことにより、 本来ならば、 9アミノ酸残基か らなるぺプチドについて、 H L A結合性べプチドの全候補物質 5000億通 リ以上について行う必要のある結合実験の数を削減できた。 能動学習法にお いては、 実験からルールを作成し、 ルールを適用して予測した数十の候補配 列について実験を行うことを繰り返した。 このため、 実験の回数を削減して 初期スクリ一二ングの時間 Zコストを大きく低減できた。
[0075] また、 このようにして能動学習法により得られるルールによる、 ペプチド の H L Aとの結合性の予測の的中率は、 70〜80%にも達した。 一方、 ァ ンカ一法などの他の公知の技術による的中率は 30%程度に過ぎない。
[0076] <ぺプチド合成と精製 >
ぺプチドは、 Fmo cアミノ酸を用い、 M e r r i f i e I dの固相法に て、 マニュアル合成をした。 脱保護の後、 C 1 8カラムを用いて逆相 H P L C精製をし、 95%以上の純度にした。 ペプチドの同定と純度の確認は、 M A L D I—TO F質量分析にて行った （V o y a g e r D E RP、 P e r S e p t i v e) 。 ぺプチドの定量は、 BS Aを標準蛋白質として M i c r o BCAアツセィ （P i e r c e社） にて行った。
[0077] <ペプチドの H LA— A 2402分子への結合実験 >
H LA— A * 2402遺伝子の産物である H LA— A 24分子へのぺプチ ドの結合能の測定は、 H LA— A24分子を発現する C 1 R— A24細胞 （ 熊本大学、 滝口雅文教授作成のものを、 許可を得て供与いただいた。 ） を用 いて行った。
[0078] まず、 C 1 R— A24細胞を p H 3. 3の酸性条件に 30秒曝し、 H L A -A * 2402分子に元来結合している内因性ぺプチドと、 H L Aクラス I 分子に共通して会合している軽鎖 )S 2mを解離、 除去した。 中和後、 C 1 R _A 24細胞に精製 )S 2 mを添加し、 ペプチドの希釈列に加えて、 氷上 4時 間インキュベートした。 この間に再会合した H L A— A * 2402分子、 ぺ プチド、 S 2 mの 3者の会合体 （MHC_p e p) を認識する蛍光標識モノ クローナル抗体 1 7A 1 2を用いて染色した。 [0079] その後、 個々の C 1 R— A 24細胞当たりの MH C— p e p数 （上記蛍光 抗体の蛍光強度に比例する） を、 蛍光細胞解析装置 F A C S c a n (B e e t o n—D i c k i n s o n社） を用いて定量測定した。 1細胞当たりの平 虽光強度か1:)、 論文 ( U d a k a e t a に ， I mm u n o g e n e t i c s, 5 1、 8 1 6— 828、 2000 ) に発表した方法にて 、 H LA— A 24分子とぺプチド間の結合解離定数 K d値を算出した。
[0080] <ペプチドの H L A— A O 20 1分子への結合実験 >
H L A-A * 020 1遺伝子の産物である H LA— A 2分子へのぺプチド の結合能の測定は、 H L A— A * 020 1を発現する細胞株 J Y (AT CC
(Am e r i c a n Γ y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n) より入手） を用いて行った。
[0081] まず J Y細胞を p H 3. 8の酸性条件に 30秒曝し、 H LA— A * 020
1分子にそれまで非共有結合的に会合していた内因性べプチドと軽鎖 )8 2 m を解離、 除去した。 中和後、 再会合実験を行った。
結合能を測定したいぺプチドの段階希釈列に上記 J Y細胞と精製 )S 2mを 加えたのち、 氷上で 4時間インキュベートした。 この時点までに再会合した H LA-A * 020 1分子を、 会合型特異的な蛍光標識モノクローナル抗体 B B 7. 2を用いて染色した。
[0082] その後、 1細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、 論文
( U d a k a e t a l . ， I mm u n o g e n e t ι c s, 5 Ί、 8 1 6— 828、 2000) に発表した方法にて、 解離定数 K d値を算 出した。
[0083] <ペプチドの H L A— A 0206分子への結合実験 >
H L A-A * 0206遺伝子の産物である H LA— A 2分子へのぺプチド の結合能の測定は、 H L A— A * 0206を発現する、 マウスの TA Pぺプ チドトランスポーター欠損細胞である RAMS細胞に、 H L A-A * 020 6遺伝子の c D N Aを発現させた、 RA 2. 6細胞 （高知大学にて新たに作 成した細胞株） を用いて行った。 [0084] まず RA2. 6細胞を 26°Cで一晩培養し、 細胞表面にペプチドを結合し ていない H L A— A * 0206分子が蓄積したところへぺプチドの希釈列を 加え、 室温で 30分結合させた。
その後 37°Cで 3. 5時間培養することにより、 ペプチドを結合していな い空の H L A_A * 0206分子が変性し、 立体構造が失われる。
そこへ、 ぺプチド結合型 H L A— A * 0206分子を特異的に認識する蛍 光標識モノクローナル抗体 1 7A 1 0もしくは 1 7A 1 2を加え、 氷上で 2 0分インキュベートし、 細胞を染色した。
[0085] その後、 1細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、 論文
( U d a k a e t a l . ， I mmu n o g e n e t ι c s, 5 Ί、 81 6— 828、 2000) に発表した方法にて、 解離定数 K d値を算 出した。
[0086] ぐ評価結果 >
その結果、 上記表 1〜表 3に示した予測結果および実験結果が得られた。
[0087] 表 1の配列番号 1から 20の配列は、 GEN BANKに登録されている鳥 インフルエンザウイルスの M 22344株または A F 508607株または AY676037株の n u c l e o p r o t e i nの全長配列に含まれる 9 アミノ酸残基からなる配列である。 また、 配列番号 1から 20の配列は、 実 施形態 1で説明した実験計画法により得られる仮説により予測された、 H L A— A24分子 （H L A— A * 2402遺伝子の産物） との結合性が上位の 配列である。 なお、 配列番号 1から 20まで結合性の優れる順に並んでいる 。 すなわち、 配列番号 1が、 最も結合性が優れると予測される配列である。 なお、 鳥インフルエンザウイルスの M 22344株の n u c I e o p r o t e i nの全長アミノ酸配列を、 配列番号 53 (MASQGTKRSYEQM ETGGERQNATE I RAS VGRMVGG I GRFY I QMCTEL KLSDYEGRL I QNS I T I ERMVLSAFDERRNKY LEE
HPSAGKDPKKTGGP I Y KRRDG KWM R
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8S0000/.00Zdf/X3d 81· .8CT60/.00Z OAV 5 (MASQGTKRSYEQMETGGERQNATE I RAS VGRM VS G I G R F Y I QMCTELKLSDYEGRL I QNS I T I E RM VLSAFDERRNRY LEEHPSAGKDPKKTGGP I Y RRR DGKWVRE L I L YDKEE I RR IWRQANNGEDATAGLT H LM IWHSN LNDATYQRTRALVRTGMDPRMCS LMQ GST LPRRSGAAGAAVKGVGTMVMEL I RM I KRG I N DRN FWRGENGRRTR I AYERMCN I LKGKFQTAAQR AMMDQVRESRNPGNAE I EDL I F LARSAL I L RGS V AHKSCLPACVYGLAVASGYD FEREGYS LVG I DP F RL LQNSQV FS L I RPN EN P A H K S Q L VWM A C H S A A F EDLRVSS F I RGTRVVPRGQLSTRGVQ I ASNENME AMDS N T L E L RS R YWA I RTRSGGNTNQQRASAGQ I SVQPT FSVQRN LP FERAT I MAAFTGNTEGRTSDM RT E I I RMMESARPEDVS FQGRGVFELSDEKATNP I VPS FDMNNEGSY F FGDNAEEYDN) に示す。
[0088] また、 表 2の配列番号 21から 36の配列は、 上述の鳥インフルエンザゥ ィルスの M 22344株または A F 508607株または AY 676037 株の n u c l e o p r o t e i nに含まれる 9アミノ酸残基からなる配列で ある。 また、 配列番号 21から 36の配列は、 実施形態 1で説明した実験計 画法により得られる仮説により予測された、 H LA— A2分子 （H LA— A * 0201遺伝子の産物） との結合性が上位の配列である。 なお、 配列番号 21から 36まで結合性の優れる順に並んでいる。 すなわち、 配列番号 21 が、 最も結合性が優れると予測される配列である。
[0089] また、 表 3の配列番号 37から 52の配列は、 上述の鳥インフルエンザゥ ィルスの M 22344株または A F 508607株または AY 676037 株の n u c l e o p r o t e i nに含まれる 9アミノ酸残基からなる配列で ある。 また、 配列番号 37から 52の配列は、 実施形態 1で説明した実験計 画法により得られる仮説により予測された、 H LA— A2分子 （H LA— A * 0206遺伝子の産物） との結合性が上位の配列である。 なお、 配列番号 37から 52まで結合性の優れる順に並んでいる。 すなわち、 配列番号 37 が、 最も結合性が優れると予測される配列である。
[0090] また、 表 1〜表 3には、 鳥インフルエンザウイルスの M22344株また は A F 508607株または A Y 676037株の n u c l e o p r o t e i nのそれぞれについて、 上述の予測プログラムを用いた予測結果のスコア 上位に相当するアミノ酸配列、 予測スコア、 それに対応する結合実験データ が記載されている。 なお、 結合実験はすべて、 9アミノ酸ペプチドを上述の 合成方法によリ人工合成して行った。
[0091] なお、 鳥インフルエンザウイルスの M22344株または A F 50860 7株または AY 676037株の n u c I e o p r o t e i nのアミノ酸配 列は G e n B a n kに登録されているが、 その中の H L A結合性べプチドと なる 9ァミノ酸残基からなる配列については現時点では登録されていない。
[0092] 鳥インフルエンザウイルスにはヒ卜に感染する可能性のある複数の血清型 が存在するが、 その中でも M22344株 （H 7型） は、 現在 （2005年 1 1月時点） 、 主に欧州地域などを中心として流行しているインフルエンザ の型であり、 AY 676037株 （H 5型） は、 現在、 主にアジア地域を中 心として、 欧州地域へも流行が広がっているインフルエンザの型である。 本 実施例では、 このように欧州地域あるいはアジア地域を中心として流行して いるインフルエンザウイルス流行株の n u c I e o p r o t e i nに含まれ る H LA結合性ペプチドを見出した。 この H L A結合性ペプチドは、 欧州地 域およびアジア地域における鳥インフルエンザ用予防■治療ワクチンの開発 に好適に利用できる。
[0093] ここで、 上記の鳥インフルエンザウイルスの M22344株または A F 5 08607株または A Y 676037株の n u c l e o p r o t e i nのァ ミノ酸配列は、 互いに一部異なっているが、 互いにアミノ酸配列のうち 1若 しくは数個のァミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であっても、 前述 したように同様に優れた H L A結合性を示すことを予測することができる。 [0094] 例えば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 7のべプチドの左から 3番目が、 A F
5 0 8 6 0 7株の配列番号 9のぺプチドでは Nではなく Sとなり、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 7のぺプチドの左から 5番目が、 A F 5 0 8 6 0 7株の配 列番号 9と A Y 6 7 6 0 3 7株の配列番号 6のペプチドでは、 Vではなく I となっている。
[0095] また例えば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 8のべプチドの左から 1番目が、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 1 1のぺプチドでは Nではなく Sとなってい る。
[0096] また例えば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 1 4のべプチドの左から 4番目が 、 A Y 6 7 6 0 3 7株の配列番号 1 5のぺプチドでは Gではなく Sとなって いる。
[0097] また例えば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 1 6のべプチドの左から 3番目が 、 A Y 6 7 6 0 3 7株の配列番号 1 8のぺプチドでは Sではなく Nとなって いる。
[0098] また例えば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 1 7のべプチドの左から 6番目が 、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 1 3のぺプチドでは Dではなく Eとなり、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 1 7のぺプチドの左から 3番目が、 A Y 6 7 6 0
3 7株の配列番号 1 0のペプチドでは、 Kではなく Rとなっている。
[0099] また例えば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 2 1のべプチドの左から 5番目が
、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 2 6のぺプチドでは Hではなく Nとなって いる。
[0100] また例えば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 2 3のべプチドの左から 5番目が 、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 2 7のペプチドでは Vではなく Iとなって いる。
[0101 ] 上記の互いに 1アミノ酸残基が置換されてなるぺプチド配列のうち、 例え ば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 7のペプチドの左から 3番目が、 A F 5 0 8
6 0 7株の配列番号 9のぺプチドでは Nではなく Sとなっており、 M 2 2 3
4 4株の配列番号 7のぺプチドの結合実験値が 7 . 8 0 7 8 1であるのに対 して、 A F 508607株の配列番号 9のペプチドの結合実験値は 7. 80 229である。 また、 M22344株の配列番号 7のペプチドの左から 5番 目が、 A F 508607株の配列番号 9と AY676037株の配列番号 6 のペプチドでは、 Vではなく Iとなっており、 M22344株の配列番号 7 のペプチドの結合実験値が 7. 80781であるのに対して、 AF5086 07株の配列番号 9のペプチドの結合実験値は 7. 80229、 A Y 676 037株の配列番号 6のペプチドの結合実験値は 7. 56449であり、 い ずれもよく結合することを確認できる。
[0102] また、 上記の互いに 1アミノ酸残基が置換されてなるぺプチド配列のうち 、 例えば、 M 22344株の配列番号 8のぺプチドの左から 1番目が、 A F 508607株の配列番号 1 1のぺプチドでは Nではなく Sとなっており、 M22344株の配列番号 8のぺプチドの結合実験値が 7. 76375であ るのに対して、 A F 508607株の配列番号 1 1のぺプチドの結合実験値 は 7. 7 1 879であり、 いずれもよく結合することを確認できる。
[0103] また、 上記の互いに 1アミノ酸残基が置換されてなるぺプチド配列のうち 、 例えば、 M 22344株の配列番号 1 4のぺプチドの左から 4番目が、 A
Y 676037株の配列番号 1 5のぺプチドでは Gではなく Sとなっており 、 M22344株の配列番号 1 4のぺプチドの結合実験値が 7. 54336 であるのに対して、 A Y 676037株の配列番号 1 5のぺプチドの結合実 験値は 7. 43594であり、 いずれもよく結合することを確認できる。
[0104] また、 上記の互いに 1アミノ酸残基が置換されてなるぺプチド配列のうち 、 例えば、 M22344株の配列番号 1 6のペプチドの左から 3番目が、 A
Y 676037株の配列番号 1 8のぺプチドでは Sではなく Nとなっており 、 M22344株の配列番号 1 6のぺプチドの結合実験値が 5. 7441 5 であるのに対して、 A Y 676037株の配列番号 1 8のぺプチドの結合実 験値は 5. 37438であり、 いずれもよく結合することを確認できる。
[0105] また、 上記の互いに 1アミノ酸残基が置換されてなるぺプチド配列のうち 、 例えば、 M22344株の配列番号 1 7のペプチドの左から 6番目が、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 1 3のぺプチドでは Dではなく Eとなっており 、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 1 Ίのぺプチドの結合実験値が 7 . 3 2 5 9 8 であるのに対して、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 1 3のぺプチドの結合実 験値は 7 . 2 5 0 1 5である。 また、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 1 7のぺプ チドの左から 3番目が、 A Y 6 7 6 0 3 7株の配列番号 1 0のペプチドでは 、 Kではなく Rとなっており、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 1 7のペプチドの 結合実験値が 7 . 3 2 5 9 8であるのに対して、 A Y 6 7 6 0 3 7株の配列 番号 1 0のペプチドの結合実験値は 7 . 4 9 6 5 3であり、 いずれもよく結 合することを確認できる。
[0106] また、 上記の互いに 1アミノ酸残基が置換されてなるぺプチド配列のうち 、 例えば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 2 1のぺプチドの左から 5番目が、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 2 6のぺプチドでは Hではなく Nとなっており 、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 2 1のぺプチドの結合実験値が 5 . 0 8 4 8 3 であるのに対して、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 2 6のぺプチドの結合実 験値は 4 . 9 0 3 5 3であり、 いずれもよく結合することを確認できる。
[0107] また、 上記の互いに 1アミノ酸残基が置換されてなるぺプチド配列のうち 、 例えば、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 2 3のペプチドの左から 5番目が、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 2 7のぺプチドでは Vではなく Iとなっており 、 M 2 2 3 4 4株の配列番号 2 3のぺプチドの結合実験値が 5 . 5 7 8 5 7 であるのに対して、 A F 5 0 8 6 0 7株の配列番号 2 7のぺプチドの結合実 験値は 4 . 8 0 8 5であり、 いずれもよく結合することを確認できる。
[0108] したがって、 上記の互いに 1または 2アミノ酸残基が置換されてなるぺプ チド配列は、 いずれも同様に優れた H L A— A分子との結合性を示すことが 予測される。 よって、 配列番号 1から 5 2に示した H L A _ A分子との結合 性が優れるアミノ酸配列のうち 1若しくは数個のァミノ酸残基が置換、 欠失 、 付加されてなるアミノ酸配列であっても、 同様に優れた H L A結合性を示 すものと予測することができる。
[0109] 別の観点から言えば、 実施形態 1で説明した実験計画法によリ得られる仮 説によリ予測された、 H L A _ A分子との結合性が優れるアミノ酸配列のう ち 1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、 欠失、 付加されてなるアミノ酸配 列であっても、 同様に優れた H L A結合性を示すものと言える。 なお、 置換 されるァミノ酸残基同士は、 ともに疎水性ァミノ酸残基などの互いに特性の 類似するアミノ酸残基同士とする方がよい。
[0110] 以上、 本発明を実施例に基づいて説明した。 この実施例はあくまで例示で あり、 種々の変形例が可能なこと、 またそうした変形例も本発明の範囲にあ ることは当業者に理解されるところである。
[0111 ] たとえば、 上記実施例では、 鳥インフルエンザウイルスの M 2 2 3 4 4株 または A F 5 0 8 6 0 7株または A Y 6 7 6 0 3 7株の n u c I e o p r o t e i nを用いたが、 鳥インフルエンザウイルスの他のたんぱく質、 あるい は他の株を用いてもよい。 この場合も、 本発明に用いる予測プログラムによ れば、 H L A結合性を精度よく予測可能である。

Claims

請求の範囲
[1] H L A_A型分子に結合する H L A結合性べプチドであって、
配列番号 1から 52からなる群よリ選ばれる 1種以上のァミノ酸配列を含 み、
8以上 1 1以下のアミノ酸残基からなることを特徴とする H L A結合性べ プチド。
[2] 請求項 1に記載の H L A結合性べプチドにおいて、
配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3 、 1 4、 1 5、 1 6、 1 7、 1 8、 2 1、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 30、 3 1、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 4 1、 4 3、 45、 47、 48、 49、 50、 5 1および 52からなる群より選ばれ る 1種以上のアミノ酸配列を含むことを特徴とする H L A結合性べプチド。
[3] H L A— A型分子に結合する H L A結合性べプチドであって、
請求項 1または 2に記載の H L A結合性べプチドに含まれる前記アミノ酸 配列のうち 1若しくは 2個のアミノ酸残基が欠失、 置換若しくは付加されて なるアミノ酸配列を含み、 8以上 1 1以下のアミノ酸残基からなることを特 徴とする H L A結合性ペプチド。
[4] 請求項 1乃至 3いずれかに記載の H L A結合性べプチドにおいて、
前記 H L A結合性べプチドは、
ヒト H LA_A * 2402分子に結合することを特徴とする H L A結合性 ぺプチド。
[5] 請求項 1乃至 3いずれかに記載の H L A結合性べプチドにおいて、
前記 H L A結合性べプチドは、
ヒト H LA_A * 020 1分子に結合することを特徴とする H L A結合性 ぺプチド。
[6] 請求項 1乃至 3いずれかに記載の H L A結合性べプチドにおいて、
前記 H L A結合性べプチドは、
ヒト H LA_A * 0206分子に結合することを特徴とする H LA結合性 ぺプチド。
[7] 請求項 1乃至 6いずれかに記載の H L A結合性べプチドをコ一ドする D N
A配列を含むことを特徴とする D N A断片。
[8] 請求項 1乃至 6いずれかに記載の H L A結合性べプチドをコ一ドする D N
A配列を含むことを特徴とする組み換えベクター。
[9] ほ乳類の生体内において、 請求項 1乃至 6いずれかに記載の H L A結合性 ぺプチドに変化することを特徴とする H L A結合性べプチド前駆体。
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