[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR20190129032A - 인플루엔자 백신 - Google Patents

인플루엔자 백신 Download PDF

Info

Publication number
KR20190129032A
KR20190129032A KR1020197021716A KR20197021716A KR20190129032A KR 20190129032 A KR20190129032 A KR 20190129032A KR 1020197021716 A KR1020197021716 A KR 1020197021716A KR 20197021716 A KR20197021716 A KR 20197021716A KR 20190129032 A KR20190129032 A KR 20190129032A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
seq
amino acids
virus
polypeptide
Prior art date
Application number
KR1020197021716A
Other languages
English (en)
Inventor
아서 영
렌 선
니콜라스 씨 우
Original Assignee
인벡스, 인크.
더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인벡스, 인크., 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 filed Critical 인벡스, 인크.
Publication of KR20190129032A publication Critical patent/KR20190129032A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/075—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16311—Influenzavirus C, i.e. influenza C virus
    • C12N2760/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 출원에서, 펩티드 기반 백신, 핵산 기반 백신, 재조합 바이러스 기반 백신, 항체 기반 백신, 및 바이러스 기반 백신을 포함하는, 백신, 예를 들어 인플루엔자 백신에 관한 조성물이 제공된다. 또한, 본 출원에서 백신을 위한 에피토프를 확인하는 방법, 백신의 제조 방법, 백신의 제형화 방법, 및 백신의 투여 방법을 포함하는, 백신, 예를 들어 인플루엔자 백신에 관한 방법이 제공된다.

Description

인플루엔자 백신
상호 참조
본 출원은, 본 출원에 전적으로 참고로 인용된 2016년 12월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 62/439,865, 및 2017년 8월 25일에 출원된 미국 가출원 번호 62/550,167을 우선권 주장의 기초로 한다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 본 출원에 전적으로 참고로 인용된다. 2017년 12월 27일에 생성된 ASCII 사본은 그 명칭이 46690-708_601_SL.txt이며, 크기는 152,030 바이트이다.
배경
백신은 특정 질병에 대한 능동적 획득 면역성을 제공함으로써 인류 건강을 크게 촉진시킨다. 개선된 백신, 예를 들어 인플루엔자 백신에 대한 요구가 존재한다. 개선된 백신은 더 높은 안전성, 증가된 면역원성, 더 광범위한 범위의 병원체에 대한 커버리지, 또는 이들의 조합을 나타낼 수 있다.
개요
본 개시의 하나의 관점은 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 51, 52, 58, 59, 61, 62, 84, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 제1 서열; 및 서열번호 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 32, 33, 34, 44, 45, 49, 53, 60, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 개시의 다른 관점은 서열번호 2, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 52, 58, 59, 61, 62, 84, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 제1 서열; 및 서열번호 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 44, 45, 49, 53, 60, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 개시의 다른 관점은 (a) 서열번호 8, 11, 12, 40, 41, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 3, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 43, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 60, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (b) 서열번호 2 또는 43의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 8, 11, 12, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 41, 44, 45, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (c) 서열번호 21, 22, 24, 26, 30, 32, 49, 53, 60, 70, 85, 86, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 51, 52, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (d) 서열번호 17, 20, 29, 31, 33, 34, 44, 45, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 87, 88, 89, 90, 또는 91의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (e) 서열번호 2 또는 43의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 8, 11, 12, 21, 22, 24, 26, 30, 32, 40, 41, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 84, 85, 86, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (f) 서열번호 3, 51, 또는 52의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 8, 11, 12, 21, 22, 24, 26, 30, 32, 40, 41, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 84, 85, 86, 92, 93, 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (g) 서열번호 2, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 21, 22, 24, 26, 30, 32, 49, 53, 60, 70, 85, 86, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (h) 서열번호 2, 8, 11, 12, 21, 22, 24, 26, 30, 32, 40, 41, 43, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 84, 85, 86, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 41, 43, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 상이한 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 제1 서열 및 제2 상이한 서열을 포함하는 연속 서열은 PB1, PA, 또는 NP에서 발견되지 않는 폴리펩티드를 제공한다.
본 개시의 다른 관점은 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 이때 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열 각각은 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 40, 41, 43-45, 49, 51-53, 58-62, 70, 73-78, 및 82-94로 구성되는 군으로부터 선택된 상이한 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 포함하고, 이때 폴리펩티드는 자연 발생하지 않는 폴리펩티드를 제공한다.
몇몇 경우에, 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열 중 적어도 하나는 서열번호 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 44, 45, 49, 53, 60, 70, 72-78, 82, 83, 85-91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 보유할 수 있다. 몇몇 경우에, 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열 중 적어도 하나는 서열번호 2, 3, 43, 51, 및 52로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 보유할 수 있다. 몇몇 경우에, 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열 중 적어도 하나는 서열번호 8, 11, 12, 40, 41, 58, 59, 61, 62, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 보유할 수 있다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드는 인플루엔자 B의 NP 단백질의 아미노산 서열의 적어도 10%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 보유하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 서열번호 116, 117, 또는 118의 아미노산 서열의 적어도 10%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 보유하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 각각의 서열은 길이가 최대 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 아미노산일 수 있다. 몇몇 경우에, 제1 서열 및 제2 서열은 직접 연결될 수 있다. 몇몇 경우에, 제1 서열 및 제2 서열은 링커에 의해 연결될 수 있다. 몇몇 경우에, 링커는 복수의 글리신, 알라닌, 아르기닌, 발린, 또는 라이신을 포함할 수 있다. 링커는 서열 RVKR(서열번호 110)을 포함할 수 있다. 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 서열 GALNNRFQIKGVELKSK(서열번호 103)를 추가로 포함할 수 있다. 서열번호 103은 폴리펩티드의 아미노 말단 부분에 연결될 수 있다. 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 41, 43, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 및 94를 포함할 수 있다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드일 수 있다.
본 개시의 다른 관점은 본 출원에 제공된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시의 다른 관점은 본 출원에 제공된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 출원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 단리될 수 있다.
본 개시의 다른 관점은 본 출원에 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시의 다른 관점은 본 출원에 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 출원에 제공된 벡터는 비-인간 영장류 벡터일 수 있다. 본 출원에 제공된 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 본 출원에 제공된 벡터는 침팬지 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 침팬지 아데노바이러스 벡터는 C68(AdC68)(서열번호 104), C7(AdC7), C6(AdC6)(서열번호 105), Pan7, 또는 Pan9의 서열의 적어도 50%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다.
본 출원에 제공된 벡터는 단리될 수 있다.
본 개시의 다른 관점은 본 출원에 제공된 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시의 다른 관점은 본 출원에 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스를 제공한다.
본 개시의 다른 관점은 본 출원에 제공된 벡터를 포함하는 바이러스를 제공한다.
본 출원에 제공된 바이러스는 단리될 수 있다. 상기 바이러스는 아데노바이러스일 수 있다.
본 개시의 다른 관점은 본 출원에 제공된 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시의 다른 관점은 적어도 5개의 상이한 펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이때 적어도 5개의 상이한 펩티드 각각은 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 40, 41, 43-45, 49, 51-53, 58-62, 70, 73-78, 및 82-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성된다. 상기 조성물의 몇몇 경우에서, 각각의 펩티드는 길이가 최대 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 아미노산이다. 본 출원에 제공된 조성물은 인플루엔자 B의 NP 단백질의 아미노산 서열의 적어도 10%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에 제공된 조성물은 서열번호 116, 117, 또는 118의 아미노산 서열의 적어도 10%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에 제공된 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에 제공된 조성물은 피하, 비내, 또는 근육내 투여를 위해 제형화될 수 있다.
본 개시의 다른 관점은 본 출원에 제공된 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 몇몇 경우에, 상기 투여는 피하 투여일 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 투여는 비내 투여일 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 투여는 근육내 투여일 수 있다. 본 출원에 제공된 방법은 상기 조성물을 개체에게 재차 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 면역 반응은 상기 투여 후에 유도될 수 있다. 상기 면역 반응은 전신성 면역 반응일 수 있다. 몇몇 경우에, 개체는 인간일 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 개체는 바이러스에 감염될 수 있다. 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 또는 인플루엔자 C 바이러스일 수 있다. 몇몇 경우에, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 조성물은, 투여되는 경우, 개체에서 인플루엔자 균주의 하나 이상의 아형에 대해 교차-보호를 유도할 수 있다.
참조 인용
본 명세서에 언급된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별적인 문헌, 특허, 또는 특허 출원이 참조 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 언급되는 바와 같이 동일한 정도로 참조 인용된 것이다
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 특허청구범위 내에 구체적으로 기술되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 좋은 이해는 본 발명의 원리를 이용하는 예시적인 실시양태를 기술하는 후술하는 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 이루어질 것이다:
도 1은 백신 에피토프를 발견하기 위한 방법을 나타낸다.
도 2는 백신화된 마우스의 인플루엔자 챌린지의 결과를 나타낸다.
도 3A는 백신화된 마우스의 초기 체중의 퍼센트를 나타낸다.
도 3B는 백신화되지 않은 마우스의 초기 체중의 퍼센트를 나타낸다.
도 3C는 그룹 1(AdCre-주사된) 마우스의 초기 체중의 퍼센트를 나타낸다.
도 3D는 그룹 2 백신화된 마우스의 초기 체중의 퍼센트를 나타낸다.
도 4는 도 3A 및 도 3B의 백신화된 및 백신화되지 않은 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 5는 본 출원에 제공된 아데노바이러스 기반 백신을 제조하는 방법을 나타낸다.
상세한 설명
본 출원에서 백신, 예를 들어 인플루엔자 백신을 형성하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 상기 방법은 하나 이상의 인플루엔자 에피토프, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 A 에피토프, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 A 펩티드 에피토프를 코딩하는 서열을 이용하는, 예를 들어 재조합 바이러스 백신, 예를 들어 재조합 아데노바이러스 백신을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 에피토프는 "불변" 서열, 예를 들어 돌연변이에 대해 낮은 용인을 가진 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 에피토프는 실험적으로 입증된 인간 CD8 T 세포 인플루엔자 A 바이러스 에피토프를 포함할 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 적어도 1, 5, 8, 10, 25, 50, 100, 또는 1000개의 펩티드 에피토프를 발현할 수 있다. 몇몇 경우에, 발현된 에피토프는 예를 들어, 공유 결합을 통해, 예를 들어 단일 폴리펩티드 내에서 연결된다. 몇몇 경우에, 발현된 에피토프는 연결되지 않는데, 예를 들어 각각의 에피토프는 별개의 프로모터, 별개의 핵산, 또는 별개의 바이러스로부터 발현될 수 있다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 에피토프는 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 리소스(worldwideweb.iedb.org)에 기재된다. 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단일 폴리펩티드는 예를 들어, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C로부터의 전장 바이러스 단백질(또는 전장 바이러스 단백질의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%, 또는 그러한 단백질에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유하는 서열)의 하나, 두 개, 또는 그 초과의 사본에 연결될 수 있다.
정의
본 출원에 사용된 용어는 단지 구체적인 실시양태를 기재하기 위한 목적으로 사용된 것이고, 임의의 실시양태를 제한하는 것은 아니다. 본 출원에 사용된 바와 같은 단수형 "a", "an" 및 "the"는 명백하게 달리 언급하지 않는다면, 복수형도 포함하는 의도이다. 용어 "함유하다", "함유하는", "포함하는", "포함하다", "보유하는", "보유한다", "갖는", 또는 이의 변형어가 본 명세서의 발명의 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 정도에서, 상기 용어들은 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포괄적일 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 측정되는 바와 같이 특정 값에 대해 허용 가능한 에러 범위 내를 의미할 수 있는데, 이는 그 값이 어떻게 측정 또는 결정되었는지, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 따라 부분적으로 달라질 수 있다. 예를 들어, "약"은 주어진 값의 실시 당 1 이내 또는 1 초과 표준 편차를 의미할 수 있다. 특정 값이 본 출원 및 청구범위에 기재되는 경우, 달리 언급하지 않는 한, 용어 "약"은 용어 "약"에 의해 변형된 값의 ±10%와 같은 특정 값에 대한 허용 가능한 에러 범위를 의미할 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드" 및 그의 문법적인 등가물은, 한 아미노산의 카르복실기가 다른 아미노산의 아미노기와 반응하는 경우, 형성된 공유 화학 결합일 수 있는, 펩티드(아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 연속적인 및 분지되지 않은 사슬을 의미한다. 달리 언급하지 않으면, 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본 출원에서 사용된 바와 같이 상호 교환 가능하다. 가장 짧은 폴리펩티드는 단일 펩티드 결합에 의해 연결된 단지 2개의 아미노산을 가진 디펩티드일 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 이들 용어는 더 긴 길이에 관한 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 또한, 상기 용어들은 천연 아미노산뿐만 아니라 측쇄, 키랄성, 또는 특성에서 개질된 아미노산의 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", "폴리핵산", 및 "올리고뉴클레오티드" 및 그들의 문법적인 등가물은 상호 교환 가능하게 사용될 수 있고, 및 선형 또는 환형의 형태, 및 단일- 또는 이중-스트랜드 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 폴리머를 의미할 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 이들 용어는 더 긴 길이에 관한 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 또한, 용어는 천연 뉴클레오티드뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티(예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)에서 변형된 뉴클레오티드의 유사체를 포함할 수 있다. 또한, 용어의 변형은 탈메틸화, CpG 메틸화의 첨가, 박테리아 메틸화의 제거, 및/또는 포유류 메틸화의 첨가를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 형성 특이성을 보유할 수 있는, 즉 A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같이 용어 "항원" 및 그의 문법적인 등가물은 하나 이상의 수용체에 의해 결합될 수 있는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 분자를 의미할 수 있다. 예를 들어, 항원은, 상기 항원이 제시되는 경우, 세포성 항원-특이적인 면역 반응, 또는 체액성 항체 반응을 수행하기 위한 숙주의 면역 시스템을 자극할 수 있다. 또한, 항원은 스스로 또는 다른 분자와 함께 제시되는 경우, 세포성 및/또는 체액성 반응을 유발할 수 있는 능력을 보유할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 단백질은 TCR에 의해 인식될 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같이 용어 "에피토프" 및 그의 문법적인 등가물은 항체, B 세포, T 세포 또는 조작된 세포에 의해 인식될 수 있는 항원의 부분을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 TCR에 의해 인식되는 인플루엔자 A 바이러스 에피토프일 수 있다. 또한, 항원 내의 다수의 에피토프가 인식될 수 있다. 또한, 에피토프는 돌연변이될 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같이 용어 "돌연변이" 및 그의 문법적인 등가물은 당해 기술분야에서 통상적으로 이해되는 바와 같이, 오픈 리딩 프레임 제거(ablating) 돌연변이를 포함하는, 결실, 이종 핵산의 삽입, 역전 또는 치환을 의미할 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같이 용어 "유전자" 및 그의 문법적인 등가물은 개별적인 폴리펩티드, 즉 단백질을 코딩하는 핵산의 세그먼트, 또는 경우에 따라 코딩 서열의 상류 또는 하류에 위치될 수 있는 프로모터, 오퍼레이터, 터미네이터 등과 같은 관련 조절 영역과 함께, RNA(또한, "코딩 서열" 또는 "코딩 영역"으로도 언급됨)를 의미할 수 있다.
바이러스를 참조하여 본 출원에 사용된 바와 같이 용어 "자연 발생하는" 및 그의 문법적인 등가물은, 바이러스가 자연에서 발견될 수 있거나, 즉 자연의 소스로부터 단리될 수 있고 의도적으로 변형되지 않는 것을 나타낼 수 있다.
본 출원에서 언급된 용어 "억제하는", "감소하는", 또는 "예방" 또는 이들 용어의 임의의 변형은 원하는 결과를 달성하기 위한 임의의 측정 가능한 감소 또는 완전한 억제를 포함할 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같이 "프로모터" 및 그의 문법적인 등가물은 전사의 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 제어 서열일 수 있다. 프로모터는 조절 단백질 및 분자, 예를 들어 RNA 폴리머라아제 및 다른 전사 인자가 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 용어 "작동 가능하게 위치된", "작동 가능하게 연결된", "제어 하에" 및 "전사 제어 하에"는, 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하기 위해 그 핵산 서열에 대해 올바른 작용 위치 및/또는 배향인 것을 의미할 수 있다. 몇몇 경우에, 프로모터는, 핵산 서열의 전사 활성화와 관련된 시스-작용성 조절 서열을 의미할 수 있는 인핸서와 함께 사용되거나, 또는 사용되지 않을 수 있다.
용어 "개체" 및 그의 문법적인 등가물은 영장류(예를 들어, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 래빗, 래트, 또는 마우스를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 동물을 의미할 수 있다. 용어 "개체" 및 "환자"는 참고로 본 출원에서, 예를 들어 인간 개체와 같은 포유류 개체에 대해 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
백신에서 사용하기 위한 에피토프를 확인하는 방법
본 개시의 하나의 관점은 백신에서 사용하기 위한 에피토프를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 병원체, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 RNA 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 바이러스의 에피토프 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, 본 출원에 제공된 방법은 백신에서 사용하기 위한 병원체, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 RNA 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 바이러스의 에피토프 서열의 확인과 관련되어 사용된다. 상기 에피토프 서열은 PB1, PB1-F2, PB2, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS1, 또는 NEP/NS2 중 하나 이상으로부터 유래할 수 있거나, 또는 그들에 대한 상동성을 보유할 수 있다.
불변성(invariance), 또는 불변(invariant) 펩티드 영역은, 예를 들어 본 출원에 전적으로 참고로 인용된, 2015년 4월 6일에 출원된 국제 PCT 출원 공보 WO/2015/157189에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 불변성은 병원체의 적합성(fitness)의 관점에서 아미노산 잔기의 기능적인 중요성을 표현할 수 있다. 변이성은 병원체의 적합성의 측정일 수 있다. 아미노산 잔기 레벨에서, 변이성은 아미노산 잔기가 돌연변이에 대해 어떻게 용인성인지 및 이러한 돌연변이가 번식할 수 있는 병원체의 능력에 대해 어떻게 부정적인지, 즉 병원체의 적합성과 관련될 수 있다. 변이성은 병원체의 생존에서 아미노산 잔기의 역할과 상관관계가 있을 수 있다. 예를 들어, 병원체의 증식에 대해 유해한 영향을 미치는 병원체의 돌연변이는 파괴적인 돌연변이로 간주될 수 있고, 병원체 집단 내에서 번식되지 않는다. 유해한 돌연변이와 상관관계가 있는 관련된 아미노산 위치는 그의 돌연변이가 용인되지 않는 것과 같이 불변으로서 특징지어질 수 있다.
상기 방법은 핵산 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 핵산 라이브러리는 예를 들어, 돌연변이체 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스의 풀을 생성함으로써 특정 병원체 균주에서 발생할 수 있는 모든 가능한 돌연변이의 모의를 가능하게 할 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 방법은 병원체, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스의 풀의 생성을 지원하기 위해 상기 라이브러리를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 종종, 상기 방법은 다수의 라운드(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 라운드) 동안 병원체의 풀을 이용하여 세포를 감염시키는 단계, 병원체, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스의 생성된 풀을 수득하는 단계, 및 제2 서열결정 라이브러리를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 제2 서열결정 라이브러리의 핵산 서열을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 방법은 불변 서열 영역, 예를 들어 불변 펩티드 영역을 수득하기 위해 상기 서열을 비교(예를 들어, 상기 라이브러리 유래의 서열과 제2 라이브러리 유래의 서열, 또는 감염의 최종 라운드 유래의 라이브러리 유래의 서열과 비교)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 불변 서열 영역은 스트레치 내의 모든 가능한 돌연변이 중에서 <0.05, <0.08, <0.1, <0.2, <0.3, 또는 <0.4의 평균 불변성 비율(최종 집단 내의 돌연변이체의 빈도/초기 집단 내의 빈도)을 보유할 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 방법은 불변 서열 영역의 HLA 친화성 결합 분석, 백신 개발 및 환자의 치료를 위한 몇몇 추가의 면역원성 분석, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "면역원성"은 면역 반응을 유도하는 특정 물질, 예를 들어 항원 또는 에피토프의 능력을 의미할 수 있다. 몇몇 경우에, 백신에서 사용하기 위한 에피토프 서열의 제1 스크린은 면역원성 펩티드 서열을 확인하는 단계 및 이어서 서열 불변성에 대해 상기 에피토프 서열을 평가하는 단계를 포함한다.
HLA 친화성 결합 분석은 덴마크 기술 대학의 생물학적 서열 분석 센터(CBS) 유래의 NetMHCpan4.0, NIH 유래의 HLA 결합 예측 서버, 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB) 유래의 MHC-1 결합 예측 서버 등과 같은 분석 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다.
몇몇 경우에, 본 출원에 제공된 방법에 의해 확인된 후보 불변 서열은 추가로 분석될 수 있다. 예를 들어, 후보 불변 서열은, 예를 들어 인플루엔자 리서치 데이터베이스(https://www.fludb.org)와 같은 여러 가지 데이터베이스에서 인플루엔자 바이러스 에피토프의 실험적으로 테스트된 면역원성 데이터에 대해 비교될 수 있다. 비교 시, 실험적으로 입증된 면역원성을 보유하는 후보 불변 서열(예를 들어, https://fludb.org에 기탁된)은 확인될 수 있고, 및 추가 분석, 또는 백신 개발이 추가로 수행될 수 있다. 예를 들어, 그러한 후보 불변 서열, 또는 이의 변이체는 본 출원에 기재된 바와 같은 트랜스유전자로부터 발현될 수 있는, 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 구성적 에피토프 서열의 하나로 선택될 수 있고, 및 상기 트랜스유전자는 바이러스 기반 백신, 예를 들어 아데노바이러스 기반 백신을 제조하기 위한 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터의 일부일 수 있다.
추가 분석
추가 분석은 백신 개발을 위해, 및 질환, 예를 들어 인플루엔자의 치료 또는 예방을 위해 상기 백신을 환자에게 투여하기 위해, 후보 불변 서열 또는 펩티드를 선택하기 위해 수행될 수 있다. 이들 추가 분석 또는 스크리닝은 면역학적 분석에 기초한 면역 반응의 분석을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 테스트 동물은 제1 면역화(프라임)되고, 프라임되고 수 주 후 제2 면역화(부스트)되거나 또는 되지 않고, 및 예를 들어 최종 면역화되고 2 내지 4주 후에 혈액 또는 조직 샘플이 수집된다. 이들 연구는 보호성 면역, 예를 들어 특이적인 항체(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM)의 유도 및 특이적인 T 림프구 반응의 유도, 아울러 항원 또는 항원의 풀이 보호성 면역을 제공하는지 여부의 결정과 상관관계가 있는 면역 파라미터의 측정을 가능하게 할 수 있다.
비장 세포, 폐 세포, 종격동 림프절 유래의 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포는 면역화된 테스트 동물로부터 단리되고, 및 항원-특이적 T 세포의 존재 및 사이토카인 합성의 유도에 대해 측정된다. 단독으로 또는 흐름 세포분석법과 병용하는 ELISA, ELISPOT, 또는 세포질 사이토카인 염색은 단일 세포 레벨에서 그러한 정보를 제공할 수 있다.
면역화의 효능을 확인하기 위해 사용될 수 있는 면역학적 테스트는 항체 측정, 중화 분석 및 활성화 레벨 또는 항원 제시 세포 또는 항원 또는 병원체에 특이적인 림프구의 빈도를 포함한다. 그러한 연구에 사용될 수 있는 테스트 동물은 마우스, 래트, 기니 피그, 햄스터, 래빗, 고양이, 개, 돼지, 원숭이, 또는 인간을 포함한다.
원숭이는, 예를 들어 원숭이와 인간 사이의 MHC 분자의 유사성으로 인해 유용한 테스트 동물일 수 있다. 바이러스 중화 분석은 병원체에 대해 특이적으로 결합할 뿐만 아니라 병원체(예를 들어, 바이러스)의 기능을 중화하는 항체의 검출을 위해 유용할 수 있다. 이들은 면역화된 동물의 혈청 내에서 항체의 검출 및 조직 배양 세포 내에서 병원체(예를 들어, 바이러스) 성장을 억제할 수 있는 그들의 능력에 대한 이들 항체의 분석에 기초할 수 있다. 그러한 분석은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 또한, 바이러스 중화 분석은 보호성 면역을 제공하는 항원을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
폴리펩티드
본 개시의 하나의 관점은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 에피토프 서열, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 특정된 서열 또는 화학식에 따른 서열을 "포함하는" 펩티드 또는 폴리펩티드는 그의 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에 추가의 아미노산 잔기, 아미노산 이성질체, 및/또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 추가의 잔기는 그의 활성 또는 기능을 변화시키거나, 또는 변화시키지 않을 수 있는데, 예를 들어 단지 특정된 서열 또는 화학식으로 구성되는 펩티드의 활성과 비교하여 펩티드의 활성을 증가시키거나 또는 감소시킬 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 특정된 서열 또는 화학식으로 "실질적으로 구성되는" 펩티드는, 추가의 잔기가 그의 활성 또는 기능을 실질적으로 변화시키지 않는 한, 예를 들어 단지 특정된 서열 또는 화학식으로 구성되는 펩티드의 활성과 비교하여 펩티드의 활성을 증가시키거나 또는 감소시키지 않는 한, 상기 펩티드가 그의 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에 추가의 아미노산 잔기, 아미노산 이성질체, 및/또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있는 것을 의미할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 특정된 서열 또는 화학식으로 "구성되는" 펩티드는, 펩티드가 그의 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에 추가의 아미노산 잔기, 아미노산 이성질체, 및/또는 아미노산 유사체를 포함하지 않는다는 것을 의미할 수 있다.
폴리펩티드는 본 개시에 의해 제공된 예시적인 방법에 의해 확인된 에피토프 서열을 포함하거나, 상기 에피토프 서열로 구성되거나, 또는 이로 실질적으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프 서열, 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택되는 하나 이상의 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 하기 표 1, 2, 및 3은 에피토프 서열, 및 바이러스 단백질을 목록화하는데, 상기 에피토프 서열은 이로부터 유도되거나, 또는 이의 변형이다. 본 출원에 기재된 각각의 폴리펩티드는 화학적으로 합성되거나 또는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 발현될 수 있다. 폴리펩티드는 핵산에 의해 코딩될 수 있고, 및 상기 핵산은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터 내에 존재할 수 있다. 상기 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터는 재조합 바이러스, 예를 들어 재조합 아데노바이러스를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 출원의 임의의 폴리펩티드는 전장 바이러스 단백질과 상이할 수 있다. 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 비-천연 발생일 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "비-천연 발생 폴리펩티드"는 일차 서열이 자연에서 발생하지 않고, 예를 들어 자연에서 단일 분자로서 확인될 수 없는 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 하나 이상의 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 종종, 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 하나 이상의 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 이때 상기 에피토프 서열 중 일부의 에피토프는 동일한 반면, 상기 에피토프 서열의 다른 에피토프는 상이하거나, 또는 모든 에피토프 서열은 동일하거나, 또는 모든 에피토프 서열은 상이하다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 에피토프 서열은 폴리펩티드 내에서 반복되는데, 예를 들어 대략, 적어도, 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20회 반복된다. 종종, 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 폴리펩티드는 단지 하나의 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있고, 및 상기 하나의 에피토프 서열은 폴리펩티드 내에 대략, 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20회 존재할 수 있다.
몇몇 경우에, 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 하나 이상의 상이한 에피토프 서열 각각은 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다. 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 하나 이상의 상이한 에피토프 서열 각각은 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 하나 이상의 상이한 에피토프 서열 각각은 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24, 또는 적어도 25개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 하나 이상의 상이한 에피토프 서열 각각은 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24, 또는 적어도 25개의 연속 아미노산에 대해 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다.
몇몇 경우에, 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 하나 이상의 상이한 에피토프 서열 각각은 표 1, 표 2, 표 3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다. 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 하나 이상의 상이한 에피토프 서열 각각은 표 1, 표 2, 표 3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 하나 이상의 상이한 에피토프 서열 각각은 표 1, 표 2, 표 3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 서열의 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24, 또는 적어도 25개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 하나 이상의 상이한 에피토프 서열 각각은 표 1, 표 2, 표 3, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 서열의 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24, 또는 적어도 25개의 연속 아미노산에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다.
폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 적어도 2개의 상이한 에피토프 서열 각각은 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 적어도 3개의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 적어도 3개의 상이한 에피토프 서열 각각은 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 적어도 4개의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 적어도 4개의 상이한 에피토프 서열 각각은 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 적어도 5개의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 적어도 5개의 상이한 에피토프 서열 각각은 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다. 폴리펩티드는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 50, 또는 적어도 51개의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 상기 상이한 에피토프 서열 각각은 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다.
하나의 비제한적인 예는 적어도 51개의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성되는 폴리펩티드에 관한 것인데, 51개의 상이한 에피토프 서열 각각은 표 3으로부터 선택된 상이한 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 포함한다. 종종, 폴리펩티드는 적어도 51개의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성되는데, 51개의 상이한 에피토프 서열 각각은 표 3으로부터 선택된 상이한 서열의 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24, 또는 적어도 25개의 연속 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드는 표 3의 각각의 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성된다.
몇몇 경우에, 폴리펩티드는 적어도 8개의 아미노산을 포함한다. 폴리펩티드는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 1500, 적어도 2000, 적어도 2500, 적어도 3000, 적어도 4000, 적어도 5000개, 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드는 최대 20, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 최대 60, 최대 70, 최대 80, 최대 90, 최대 100, 최대 150, 최대 200, 최대 250, 최대 300, 최대 500, 최대 800, 최대 1000, 최대 1500, 최대 2000, 최대 2500, 최대 3000, 최대 4000, 또는 최대 5000개의 아미노산을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 폴리펩티드는 약 8 내지 약 5000개의 아미노산, 약 8 내지 약 4000개의 아미노산, 약 8 내지 약 3000개의 아미노산, 약 8 내지 약 2000개의 아미노산, 약 8 내지 약 1000개의 아미노산, 약 8 내지 약 500개의 아미노산, 약 100 내지 약 5000개의 아미노산, 약 100 내지 약 2500개의 아미노산, 약 100 내지 약 1000개의 아미노산, 약 1500 내지 약 3000개의 아미노산, 약 1000 내지 약 3000개의 아미노산, 또는 약 1000 내지 약 2500개의 아미노산을 포함하거나, 그 아미노산으로 구성되거나, 또는 그 아미노산으로 실질적으로 구성될 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들어 세포 내에서, 예를 들어 합성되거나 또는 초기 발현되는 경우, 5000, 4000, 3000, 2900, 2800, 2700, 2600, 2500, 2400, 2300, 2200, 2100, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 750, 500, 250개, 또는 100개 미만의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 출원에서, 바이러스 단백질, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 단백질, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스 단백질로부터, 또는 이의 변이체로부터, 또는 이의 단편으로부터, 이의 적어도 일부분으로부터 유도될 수 있는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성되는 조작된 폴리펩티드가 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 인플루엔자 A 바이러스 단백질은 PB1, PB1-F2, PB2, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS1, 또는 NEP/NS2일 수 있다. PB2는 전사를 개시하기 위해 숙주 프리-mRNA 분자로부터 "캡-탈취(cap-snatching)"를 용이하게 할 수 있고, 및 복제에 도움이 될 수 있는, RNA-의존성 RNA 폴리머라아제 복합체의 부분일 수 있다. 특정 상황에서, PB1은 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제일 수 있고, 이는 전사 및 복제의 개시를 위해 vRNA 및 cRNA의 말단 단부에 결합될 수 있고, 및 RNA 사슬 신장 중에 뉴클레오티드의 순차적인 첨가를 촉매할 수 있다. PA는 바이러스 전사 및 복제를 위해 사용될 수 있고, 엔도뉴클레아제 활성을 보유할 수 있다. 몇몇 경우에, PA는 폴리머라아제 활성과는 상관관계가 없다. HA는 부착을 위해 세포 표면 상에 시알산을 결합할 수 있고, 및 바이러스 RNP가 세포질 내로 방출될 수 있는 공극을 형성하는 엔도좀 막과 상호작용할 수 있는 융합 펩티드를 노출하는 낮은 pH를 이용하여 형태 변화를 수행할 수 있다. NP는 바이러스 리보뉴클레오단백질(vRNP) 복합체를 형성하는 바이러스 RNA를 코팅할 수 있는데, 이는 핵 내로의 vRNP의 트래피킹(trafficking)을 위해 중요할 수 있다. NA는 세포막에 대해 바이러스를 고정할 수 있는 HA-시알산 결합의 절단을 통해 바이러스의 최종적인 방출을 위해 필요할 수 있다. 또한, NA는 바이러스 입자의 응집을 방지할 수 있다. M1은 비리온의 중간 코어를 형성하고, 및 NP w/vRNP를 고정할 수 있으며, 및 세포막으로부터 바이러스의 출아(budding)를 구동할 수 있다. M2는 이온 채널 활성을 보유할 수 있고, 및 산성화된 엔도좀으로부터 바이러스 입자 내로 양자를 전도할 수 있는데, 이는 바이러스 성분의 잔류물로부터 vRNP의 pH 의존성 해리를 초래한다. NS1은 세포성 항바이러스 유형 1 인터페론 반응을 억제할 수 있고, 및 dsRNA에 대한 결합에 의존할 수 있다. NEP/NS2는 세포성 수송 기구의 동원을 통해 vRNP의 핵 방출을 위해 필요할 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스 단백질은 NP, PB1, 또는 PA일 수 있다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 하나의 비제한적인 예는 서열번호 1-7, 43, 51, 52, 및 63-66으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열, 또는 서열번호 2, 3, 43, 51, 및 52로 구성되는 군으로부터 선택된 서열과 같으나, 이로 제한되지 않는 PB1 단백질로부터 또는 이의 변이체로부터 유도된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성된다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드는 서열번호 8-42, 44-50, 53-62, 67-80, 및 82-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프를 추가로 포함한다. 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 40, 41, 43-45, 49, 51-53, 58-62, 70, 73-78, 및 82-94를 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드는 전장 PB1 서열을 포함하지 않는다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 다른 비제한적인 예는 서열번호 8-12, 40, 41, 58, 59, 61, 62, 84, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 서열, 또는 서열번호 8, 11, 12, 40, 41, 58, 59, 61, 62, 84, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 서열과 같으나, 이로 제한되지 않는 PA 단백질 또는 이의 유도체로부터 유도되는 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성된다. 종종, 폴리펩티드는 서열번호 1-7, 13-39, 42-57, 60, 63-80, 82, 83, 85-91, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 40, 41, 43-45, 49, 51-53, 58-62, 70, 73-78, 및 82-94를 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드 전장 PA 서열을 포함하지 않는다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 다른 비제한적인 예는 서열번호 13-34, 37, 39, 42, 44-50, 53-57, 60, 67-80, 82, 83, 85-91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열, 또는 서열번호 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 44, 45, 49, 53, 60, 70, 73-78, 82, 83, 85-91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열과 같으나, 이로 제한되지 않는 NP 단백질 또는 이의 유도체로부터 유도되는 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성된다. 종종, 폴리펩티드는 서열번호 1-12, 35, 36, 38, 43, 51, 52, 58, 59, 61-66, 84, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 40, 41, 43-45, 49, 51-53, 58-62, 70, 73-78, 및 82-94를 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드 전장 NP 서열을 포함하지 않는다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 다른 비제한적인 예는 서열번호 35 및 38로 구성되는 군으로부터 선택된 서열과 같으나, 이로 제한되지 않는 NA 단백질 또는 이의 유도체로부터 유도되는 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성된다. 종종, 폴리펩티드는 서열번호 1-34, 36, 37, 39-80, 및 82-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 40, 41, 43-45, 49, 51-53, 58-62, 70, 73-78, 및 82-94를 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드 전장 NA 서열을 포함하지 않는다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 다른 비제한적인 예는 서열번호 36과 같으나, 이로 제한되지 않는 M1 단백질 또는 이의 유도체로부터 유도되는 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성된다. 종종, 폴리펩티드는 서열번호 1-35, 37-80, 및 82-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유하는 하나 이상의 상이한 에피토프 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 40, 41, 43-45, 49, 51-53, 58-62, 70, 73-78, 및 82-94를 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드 전장 M1서열을 포함하지 않는다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 하나의 비제한적인 예는 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 51, 52, 58, 59, 61, 62, 84, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 제1 서열; 및 서열번호 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 32, 33, 34, 44, 45, 49, 53, 60, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 제2 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 다른 비제한적인 예는 서열번호 2, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 52, 58, 59, 61, 62, 84, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 제1 서열; 및 서열번호 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 44, 45, 49, 53, 60, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 제2 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 다른 비제한적인 예는 하기를 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다: (a) 서열번호 8, 11, 12, 40, 41, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 3, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 43, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 60, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (b) 서열번호 2 또는 43의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 8, 11, 12, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 41, 44, 45, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (c) 서열번호 21, 22, 24, 26, 30, 32, 49, 53, 60, 70, 85, 86, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 51, 52, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (d) 서열번호 17, 20, 29, 31, 33, 34, 44, 45, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 87, 88, 89, 90, 또는 91의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (e) 서열번호 2 또는 43의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 8, 11, 12, 21, 22, 24, 26, 30, 32, 40, 41, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 84, 85, 86, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (f) 서열번호 3, 51, 또는 52의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 8, 11, 12, 21, 22, 24, 26, 30, 32, 40, 41, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 84, 85, 86, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (g) 서열번호 2, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 21, 22, 24, 26, 30, 32, 49, 53, 60, 70, 85, 86, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는 (h) 서열번호 2, 8, 11, 12, 21, 22, 24, 26, 30, 32, 40, 41, 43, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 84, 85, 86, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 41, 43, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는데, 이때 제1 서열 및 제2 상이한 서열을 포함하는 연속되는 서열은 연속 서열은 PB1, PA, 또는 NP에서 확인되지 않는다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 다른 비제한적인 예는 하기 그룹의 적어도 2개로부터 선택되는 서열을 포함하거나, 이루 구성되거나, 또는 이로 실질적으로 구성될 수 있다: (a) 서열번호 8, 40, 41, 또는 84의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (b) 서열번호 11, 58, 또는 59의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (c) 서열번호 12, 61, 62, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (d) 서열번호 2 또는 43의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (e) 서열번호 3, 51, 또는 52의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (f) 서열번호 32, 93, 94, 또는 70의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (g) 서열번호 21, 22, 또는 85의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (h) 서열번호 24, 49, 또는 86의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (i) 서열번호 26, 53, 30, 또는 60의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (j) 서열번호 17, 82, 또는 83의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (k) 서열번호 20, 44, 또는 45의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (l) 서열번호 29, 87, 88, 89, 90, 또는 91의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (m) 서열번호 31의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; 및 (n) 서열번호 33, 34, 73, 74, 75, 76, 77, 또는 78의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; 이때, 적어도 하나의 서열은 그룹 (a)-(d)로부터 선택되고, 및 적어도 하나의 서열은 그룹 (f)-(n)으로부터 선택된다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 다른 비제한적인 예는 하기를 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성된다: (o) 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 서열로서, 각각은 서열번호 8, 40, 41, 또는 84 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 서열로서, 각각은 서열번호 8, 40, 41, 또는 84 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 55%, 적어도 66%, 적어도 77%, 적어도 88%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (p) 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 11, 58, 또는 59 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 11, 58, 또는 59 중 임의의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개의 연속 아미노산에 대해 적어도 52%, 적어도 58%, 적어도 64%, 적어도 70%, 및 적어도 76%, 적어도 82%, 적어도 88%, 적어도 94%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (q) 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 서열로서, 각각은 서열번호 12, 61, 62, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 서열로서, 각각은 서열번호 12, 61, 62, 또는 92 중 임의의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개의 연속 아미노산에 대해 적어도 52%, 적어도 58%, 적어도 64%, 적어도 70%, 및 적어도 76%, 적어도 82%, 적어도 88%, 적어도 94%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (r) 적어도 1 또는 2개의 서열로서, 각각은 서열번호 2 또는 43 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1 또는 2개 서열로서, 각각은 서열번호 2 또는 43 중 임의의 적어도 9 또는 10개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한 서열; (s) 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 3, 51, 또는 52 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 3, 51, 또는 52 중 임의의 적어도 9 또는 10개의 연속 아미노산에 대한 적어도 55%, 적어도 66%, 적어도 77%, 적어도 88%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (t) 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 서열로서, 각각은 서열번호 32, 93, 94, 또는 70 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 서열로서, 각각은 서열번호 32, 93, 94, 또는 70 중 임의의 9 또는 10개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (u) 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 21, 22, 또는 85 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 서열로서, 각각은 서열번호 21, 22, 또는 85 중 임의의 9개의 연속 아미노산에 대해 적어도 55%, 적어도 66%, 적어도 77%, 적어도 88%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (v) 적어도 1, 2 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 24, 49, 또는 86 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 서열번호 24, 49, 또는 86 중 임의의 적어도 9개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (w) 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 서열로서, 각각은 서열번호 26, 53, 30, 또는 60 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 서열로서, 각각은 서열번호 26, 53, 30, 또는 60 중 임의의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 연속 아미노산에 대해 또는 서열번호 30 또는 60 중 임의의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개의 연속 아미노산에 대해 적어도 50%, 적어도 56%, 적어도 62%, 적어도 68%, 적어도 75%, 적어도 81%, 적어도 87%, 적어도 93%, 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (x) 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 17, 82, 또는 83 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 17, 82, 또는 83 중 임의의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 연속 아미노산에 대해 적어도 50%, 적어도 57%, 적어도 60%, 적어도 71%, 적어도 78%, 적어도 85%, 적어도 92%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (y) 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 20, 44, 또는 45 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열로서, 각각은 서열번호 20, 44, 또는 45 중 임의의 9개의 연속 아미노산에 대해 적어도 55%, 적어도 66%, 적어도 77%, 적어도 88%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (z) 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 서열로서, 각각은 서열번호 29, 87, 88, 89, 90, 또는 91 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 서열로서, 각각 서열번호 29, 87, 88, 89, 90, 또는 91 중 임의의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개의 연속 아미노산에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 61%, 적어도 66%, 적어도 72%, 적어도 83%, 적어도 88%, 적어도 94%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (aa) 서열번호 31의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 서열번호 31의 9개의 연속 아미노산에 대해 적어도 55%, 적어도 66%, 적어도 77%, 적어도 88%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; (bb) 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 서열로서, 각각은 서열번호 33, 34, 73, 74, 75, 76, 77, 또는 78 중 임의의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 서열로서, 각각은 서열번호 33, 34, 73, 74, 75, 76, 77, 또는 78 중 임의의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 연속 아미노산에 대해 적어도 52%, 적어도 56%, 적어도 60%, 적어도 64%, 적어도 68%, 적어도 72%, 적어도 76%, 적어도 80%, 적어도 84%, 적어도 88%, 적어도 92%, 적어도 96%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 서열; 또는 (o)-(bb)의 임의의 조합.
본 출원에 제공된 폴리펩티드의 다른 비제한적인 예는 하기 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성된다: (cc) 서열번호 8, 40, 41, 및 84로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (dd) 서열번호 11, 58, 및 59로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (ee) 서열번호 12, 61, 62, 및 92로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (ff) 서열번호 2 및 43으로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (gg) 서열번호 3, 51, 및 52로 구성되는 군으로부터의 적어도 3개의 서열; (hh) 서열번호 32, 93, 94, 및 70으로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (ii) 서열번호 21, 22, 및 85로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (jj) 서열번호 24, 49, 및 86으로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (kk) 서열번호 26, 53, 30, 및 60으로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (ll) 서열번호 17, 82, 및 83으로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (mm) 서열번호 20, 44, 및 45로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; (nn) 서열번호 29, 87, 88, 89, 90, 및 91로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열; 또는 (oo) 서열번호 33, 34, 73, 74, 75, 76, 77, 및 78로 구성되는 군으로부터의 적어도 2개의 서열.
몇몇 경우에, 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 바이러스 단백질, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 단백질, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 바이러스 단백질, 예를 들어 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 유래의 PB1, PB1-F2, PB2, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS1, 또는 NEP/NS2의 전장 아미노산 서열(또는 전장 서열의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 본 출원에 제공된 백신은, 예를 들어 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 바이러스 단백질, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 단백질, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 바이러스 단백질, 예를 들어 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 유래의 PB1, PB1-F2, PB2, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS1, 또는 NEP/NS2의 전장 아미노산 서열(또는 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 폴리펩티드는 백신 내의 별개의 핵산 또는 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스로부터 발현된다. 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 바이러스 단백질의 전장 아미노산 서열(또는 전장 서열의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%) 중 임의 서열의 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 그 초과의 사본을 포함할 수 있다. 상기 전장 아미노산 서열(또는 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)은 폴리펩티드의 N-말단, 폴리펩티드의 C-말단, 폴리펩티드의 내부에 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어, 다수의 사본이 존재하는 경우, 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 존재할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터의 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 51개의 서열(예를 들어, 각각의 서열은 표 1, 표 2, 또는 표 3 중 하나로부터 유래함)을 포함할 수 있는데, 각각의 서열은 링커에 의해 분리되거나 또는 분리되지 않고, 및 폴리펩티드는 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 바이러스 단백질, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 단백질, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 바이러스 단백질, 예를 들어 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 유래의 PB1, PB1-F2, PB2, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS1, 또는 NEP/NS2의 전장 아미노산 서열(또는 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)의 1, 2, 또는 3개의 사본을 포함할 수 있다.
몇몇 경우에, 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 인플루엔자, 예를 들어 인플루엔자 A, 또는 인플루엔자 B, 인플루엔자 C의 NP 단백질의 전장 아미노산 서열(또는 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, NP 단백질 서열(또는 NP의 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)은 인플루엔자 B의 임의의 적합한 균주 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 서열은 인플루엔자 시즌에 대한 우세 균주(prevalent strain), 또는 예상되는 우세 균주에 기초하여 선택될 수 있다. NP 서열이 선택되는 인플루엔자 B의 균주는 무작위로 선택될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 인플루엔자 B의 특정 균주, 예를 들어 B/빅토리아 계통에 속하는 B/브리스베인/60/2008-유사 또는 B/야마가타 계통에 속하는 B/푸켓/3073/2013-유사 또는 B/펜실베니아/49/2015 유래의 NP 단백질 서열(또는 NP의 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)의 아미노산 서열을 포함한다. 인플루엔자 B의 NP 단백질의 전장 아미노산 서열의 유도체(또는 단편)는 인플루엔자 B의 NP 단백질(또는 NP의 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)의 전장 아미노산 서열에 대해 적어도 60%의 동일성, 적어도 75%의 동일성, 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 96%의 동일성, 적어도 97%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 적어도 99%의 동일성, 적어도 99.5%의 동일성, 적어도 99.8%의 동일성, 적어도 99.9%의 동일성, 적어도 99.99%의 동일성을 포함할 수 있다. 인플루엔자 B의 NP 단백질의 전장 아미노산 서열의 유도체(또는 단편)는 인플루엔자 B의 NP 단백질의 전장 아미노산 서열과 상이한 최대 100개의 아미노산, 최대 80개의 아미노산, 최대 60개의 아미노산, 최대 50개의 아미노산, 최대 40개의 아미노산, 최대 30개의 아미노산, 최대 20개의 아미노산, 최대 15개의 아미노산, 최대 10개의 아미노산, 최대 9개의 아미노산, 최대 8개의 아미노산, 최대 7개의 아미노산, 최대 6개의 아미노산, 최대 5개의 아미노산, 최대 4개의 아미노산, 최대 3개의 아미노산, 최대 2개의 아미노산, 또는 단지 1개의 아미노산을 포함하거나, 또는 그 아미노산으로 구성될 수 있다. 폴리펩티드는 각각의 서열 사이에 링커를 갖거나 갖지 않는 표 1의 모든 서열, 및 전장 단백질(상기 단백질의 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%), 예를 들어 인플루엔자 B 균주 유래의 NP 단백질의 하나 이상의 사본을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 각각의 서열 사이에 링커를 갖거나 갖지 않는 표 2의 모든 서열, 및 전장 단백질(상기 단백질의 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%), 예를 들어 인플루엔자 B 균주 유래의 NP 단백질을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 각각의 서열 사이에 링커를 갖거나 갖지 않는 표 3의 모든 서열, 및 전장 단백질(상기 단백질의 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%), 예를 들어 인플루엔자 B 균주 유래의 NP 단백질을 포함할 수 있다.
몇몇 경우에, 폴리펩티드는 B/빅토리아 계통에 속하는 바이러스 유래의 NP 단백질의 아미노산 서열(전장 또는 단편)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 인플루엔자 B/브리스베인/60/2008 유래의 NP 단백질(수탁번호: AGK63064.1, 서열번호 116)의, 예를 들어 아미노산 1 내지 560, 38-557, 50 내지 500, 100 내지 500, 200 내지 400, 1 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 또는 500 내지 560을 포함하는 전장 또는 단편에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드는 B/야마가타 계통에 속하는 바이러스 유래의 NP 단백질의 아미노산 서열(전장 또는 단편)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 인플루엔자 B/야마가타/16/1988 유래의 NP 단백질(수탁번호: ABL77260.1, 서열번호 117) 또는 인플루엔자 B/펜실베니아/49/2015 유래의 NP 단백질(수탁번호: AOZ82278.1, 서열번호 118)의, 예를 들어 아미노산 1 내지 560, 2 내지 560, 50 내지 500, 100 내지 500, 200 내지 400, 1 내지 100, 2 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 또는 500 내지 560을 포함하는 전장 또는 단편에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 폴리펩티드는 B/빅토리아 계통에 속하는 바이러스 유래의 NP 단백질의 아미노산 서열(전장 또는 단편) 또는 이의 유도체 및 B/야마가타 계통에 속하는 바이러스 유래의 NP 단백질의 아미노산 서열(전장 또는 단편) 또는 이의 유도체 둘 다를 포함할 수 있다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드는 순서대로 배열된 하나 이상의 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 몇몇 경우에, 에피토프 서열은 면역원성의 촉진, 발현 증가, 폴리펩티드 안정성의 실현, 폴리펩티드 가용성 증가, 폴리펩티드 사슬의 생체내 절단의 실현, 또는 백신 성능에 영향을 미칠 수 있는 임의의 다른 요인, 또는 이들의 임의의 조합을 고려하여 특정 순서로 배열된다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 달성할 수 있는 바와 같이, 하나 이상의 특정 파라미터를 상향조절 또는 하향 조절하는 백신의 특정 관점을 미세 조정하기 위해 폴리펩티드 내의 에피토프 서열의 순서를 조작할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 서로 직접 연결된, 예를 들어 "백-투-백"으로 연결된 하나 이상의 에피토프 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 하나 이상의 에피토프 서열, 그 중에서도 링커 서열을 이용하여 연결된 적어도 2개의 이웃하는 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 폴리펩티드는 전체적으로 단일 타입의 링커 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 타입의 링커 서열을 포함할 수 있다. 링커 서열의 선택은 펩티드 서열의 선택, 다수의 상이한 파라미터에 대한 특정 요구, 예를 들어 발현 수준, 폴딩 및 안정성, 가용성, 세포성 및 아세포성 타겟팅, 면역원성, 시험관내 및 생체내 반감기(이들로 제한되지 않음)에 따라 달라질 수 있다.
링커는 단일 폴리펩티드 내에서 다중 도메인을 분리하기 위한 짧은 아미노산 서열일 수 있다. 몇몇 경우에, 링커 서열은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 아미노산을 포함할 수 있다. 링커 서열은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 또는 적어도 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 링커 서열은 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 15, 최대 20, 최대 30, 최대 40, 최대 50, 또는 최대 100개의 아미노산을 포함할 수 있다.
링커 서열은 내부의 도메인을 연결하는 천연 다중-도메인 단백질에서 발생하는 서열을 포함할 수 있다. 링커 서열은 인공적으로 만들어진 링커를 포함할 수 있다. 또한, 링커는 천연 링커 단백질 및 인공적으로 만들어진 서열 둘 다의 연결된 생성물일 수 있다. 몇몇 경우에, 특정 링커 서열은 폴리펩티드의 생체내 절단성을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 특정 에피토프 서열 사이를 절단하여 폴리펩티드의 2개 이상의 분리된 부분이 개별적으로 항원 제시 세포에 제시되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 링커는 다수의 글리신, 알라닌, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 링커는 다수의 아르기닌, 발린, 라이신, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 그러한 예시적인 환경 하에서, 링커 서열, 예를 들어 LEAGCKNFFPRSFTSCGSLE(서열번호 95), CRRRRRREAEAC(서열번호 96)가 선택될 수 있다. 종종, 가요성 링커 서열을 사용하는 것이 바람직할 수 있는데, 이의 예로는 (GGGGS)n(n = 1 내지 10)(서열번호 107)와 같은 Gly 및 Ser 잔기("GS" 링커), (Gly)8(서열번호 97), GSAGSAAGSGEF(서열번호 98), (GGGGS)4(서열번호 99)의 스트레치를 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 경우에, 강성 링커 서열을 사용하는 것이 바람직할 수 있는데, 이의 예로는 (EAAAK)n(서열번호 108), (XP)n(서열번호 109)와 같은 Pro-풍부 서열을 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니고, 이때 임의의 아미노산을 지정하는 X가 사용될 수 있다(n= 1 내지 20). 몇몇 경우에, 링커 서열 RVKR(서열번호 110)이 선택될 수 있다. 링커 서열 RVKR(서열번호 110)은 몇몇 상황에서 면역자극성일 수 있다. 폴리펩티드는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터의 각각의 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 이때 각각의 서열은 링커에 의해 분리된다. 폴리펩티드는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터의 각각의 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 이때 각각의 서열은 링커에 의해 분리되지 않는다. 폴리펩티드는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터의 각각의 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있는데, 이때 상기 서열 중 몇몇은 링커에 의해 분리되고, 몇몇은 링커에 의해 분리되지 않는다.
본 개시의 특정 관점에서, 본 출원에 제공된 폴리펩티드는 상기한 에피토프 서열의 하나 이상에 연결된 CD4+(헬퍼) T 세포 에피토프를 추가로 포함한다. "연결(connection)"은, 예를 들어 직접 또는 간접 공유 결합, 또는 직접 또는 간접 비공유 결합일 수 있다. CD4+(헬퍼) T 세포 에피토프는 ISQAVHAAHAEINEAGR(서열번호 100)일 수 있다. 몇몇 경우에, CD4+(헬퍼) T 세포 에피토프는 AKFVAAWTLKAAA(HLA DR-결합 에피토프, PADRE)(서열번호 101), 또는 PADRE 서열의 비천연 아미노산 유도체, AKXVAAWTLKAAAZC(서열번호 102)일 수 있는데, 이때 X는 L-시클로헥실알라닌이고, 및 Z는 아미노카프로산이다. 몇몇 경우에, CD4+(헬퍼) T 세포 에피토프는 GALNNRFQIKGVELKSK(서열번호 103)일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 출원에 제공된 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 1-94로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드의 C-말단은 라이신에 부착되고, 및 라이신은 CD4+ T 세포 에피토프의 N-말단에 부착된다. CD4+(헬퍼) T 세포 에피토프의 C-말단은 라이신에 부착될 수 있고, 및 라이신은 서열번호 1-94로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드의 N-말단에 부착될 수 있다.
폴리펩티드는 전장 바이러스 단백질, 예를 들어 전장 PB1, PB1-F2, PB2, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS1, 또는 NEP/NS2 단백질에 연결될 수 있거나, 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 유래의 이들 단백질의 전장 서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 가진 단백질에 연결될 수 있는데, 예를 들어 본 출원에 기재된 링커에 의해 연결될 수 있거나, 또는 링커 없이 연결될 수 있다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드는 하나 이상의 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 아미노산 잔기는 아미노기 및 카르복실기 둘 다를 함유하는 분자일 수 있다. 기재된 펩티드에서 사용하기에 적합한 아미노산은 자연 발생하는 아미노산의 D- 및 L-이성질체(아미노산 이성질체)뿐만 아니라 유기합성 또는 다른 대사 경로에 의해 제조된 자연발생하지 않는 아미노산을 포함하는데, 이들로 제한되는 것은 아니다. 아미노산은 알파-아미노산, 베타-아미노산, 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 아미노산 유사체일 수 있다. 알파-아미노산은 알파-탄소로 지정된 탄소에 결합된 아미노기 및 카르복실기 둘 다를 함유하는 분자일 수 있다. 베타-아미노산은 베타 배치로 아미노기 및 카르복실기 둘 다를 함유하는 분자일 수 있다. 자연 발생하는 아미노산은 자연적으로 합성된 펩티드에서 통상적으로 확인되는 20개의 아미노산 중 하나일 수 있고, 단문자 약어 A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로 공지되어 있다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드는 하나 이상의 친수성, 극성, 또는 하전된 아미노산을 포함할 수 있다. 소수성 아미노산은 소형 소수성 아미노산 및 대형 소수성 아미노산을 포함할 수 있다. 소형 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 및 이의 유사체 및 이성질체일 수 있다. 대형 소수성 아미노산은 발린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 및 이의 유사체 및 이성질체일 수 있다. 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 아스파리긴, 글루타민, 시스테인, 타이로신, 및 이의 유사체 및 이성질체일 수 있다. 하전된 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트, 또는 이의 유사체일 수 있다.
본 출원에 제공된 바와 같은 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 아미노산 유사체는 아미노산이 구조적으로 유사하고 및 펩티드모방성 마크로사이클의 형성에서 아미노산을 대체할 수 있는 분자일 수 있다. 아미노산 유사체는 베타-아미노산 및 아미노기 또는 카르복실기가 유사하게 반응성인 기에 의해 치환되는 아미노산을 포함한다(예를 들어, 2차 또는 3차 아민에 의한 1차 아민의 치환, 또는 에스테르에 의한 카르복실기의 치환).
본 출원에 제공된 폴리펩티드는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 비-천연 아미노산은 자연에서 합성된 펩티드에서 통상적으로 확인되고, 단문자 약어 A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로 공지된 20개의 아미노산 중 하나가 아닌 아미노산일 수 있다.
아미노산 유사체는 β-아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 아미노산 유사체는 알라닌, 발린, 글리신, 루신, 아르기닌, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 및/또는 트립토판의 유사체를 포함할 수 있다.
아미노산 유사체는 라세미체일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 아미노산 유사체의 D 이성질체가 사용된다. 몇몇 경우에, 아미노산 유사체의 L 이성질체가 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 아미노산 유사체는 R 또는 S 배치로 존재하는 키랄 중심을 포함한다. 종종, β-아미노산 유사체의 아미노기는 보호기, 예를 들어 tert-부틸옥시카르보닐(BOC기), 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(FMOC), 토실 등으로 치환된다. 몇몇 경우에, 아미노산 유사체의 염이 사용된다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드는 비-필수 아미노산을 포함할 수 있다. 비-필수 아미노산 잔기는 그의 필수적인 생물학적 또는 생화학적 활성(예를 들어, 수용체 결합 또는 활성)을 상실시키거나 또는 실질적으로 변경시키지 않고 펩티드의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기일 수 있다. 본 출원에 제공된 펩티드는 필수 아미노산을 포함할 수 있다. 필수 아미노산 잔기는, 펩티드의 야생형 서열로부터 변경되는 경우, 펩티드의 필수적인 생물학적 또는 생화학적 활성의 상실 또는 실질적인 상실을 초래한다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기로 치환되는 것일 수 있다. 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산의 패밀리는 당해 기술분야에 규정되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, K, R, H), 산성 측쇄(예를 들어, D, E), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, G, N, Q, S, T, Y, C), 비극성 측쇄(예를 들어, A, V, L, I, P, F, M, W), 베타-분지된 측쇄(예를 들어, T, V, I) 및 방향족 측쇄(예를 들어, Y, F, W, H)를 가진 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 펩티드 내에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는, 예를 들어 동일한 측쇄 패밀리 유래의 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 허용 가능한 치환의 다른 예는 아이소스테릭 고려에 기초한 치환(예를 들어, 메티오닌을 노르루신으로 치환) 또는 다른 특성에 기초한 치환(예를 들어, 페닐알라닌을 2-티에닐알라닌으로 치환, 또는 트립토판을 6-Cl-트립토판으로 치환)일 수 있다.
백신 조성물
본 출원에 제공된 개별적인 에피토프 서열, 개별적인 에피토프 서열이 본 출원에 제공된 바와 같이 연결된 폴리펩티드, 본 출원에 제공된 개별적인 에피토프 서열 또는 폴리펩티드를 발현하는 핵산, 본 출원에 제공된 개별적인 에피토프 서열 또는 폴리펩티드를 발현하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 그러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 바이러스는 백신으로서 제형화될 수 있다. 본 출원에 제공된 백신은 항체의 생성을 자극하고 및 하나 이상의 질병, 예를 들어 인플루엔자에 대한 면역성을 제공하기 위해 사용된 임의의 물질일 수 있다. 상기 백신은 살아 있는 병원체, 살아 있는 약독화된 병원체, 또는 불활성화된 병원체, 예를 들어 화학물질, 열, 또는 방사선에 의해 불활성화된 병원체로부터 제조될 수 있다. 상기 백신은 병원체의 서브유닛 또는 일부분을 함유할 수 있는데, 이때 이들 서브유닛은 경우에 따라 컨쥬케이트될 수 있다. 또한, 백신은 펩티드 기반 백신, 핵산 기반 백신, 바이러스 벡터 기반 백신, 항체 기반 백신, 또는 항원 제시 세포 기반 백신으로서 제조될 수 있다.
상기 백신은 예를 들어 병원체에 대해 보호할 수 있다. 병원체는 박테리아, 균류, 바이러스, 원생동물 및 기타를 포함하는 임의의 감염성 유기체일 수 있다. 또한, 백신은 종양 또는 암 백신을 포함할 수 있다. 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은, 개체의 체내, 예를 들어 인체에 투여되는 경우, 전신성 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은, 개체의 체내, 예를 들어 인체에 투여되는 경우, 전신성 면역 반응 이외에 예를 들어 호흡기에서 점막 면역 반응을 유도할 수 있다.
상기 백신은 전통적인 백신 또는 범용 백신일 수 있다. 전통적인 백신은 특정 병원체를 타겟팅할 수 있는 백신일 수 있다. 홍역 백신은 전통적인 백신의 한 예이다. 이는 50년 이상 보존 유지되어온 홍역 바이러스의 헤마글루티닌(H) 단백질 상에 존재하는 에피토프를 타겟팅할 수 있다.
계절성 백신은 전통적인 백신의 다른 유형일 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 백신은 매년 변경될 수 있고, 및 당해 년도에 존재하는 인플루엔자 바이러스의 집단에 맞춰진다. 몇몇 경우에, 인플루엔자 백신은 3가 백신으로서 생성되는데, 이는 인플루엔자 A 바이러스의 2개의 아형, 즉 H1N1 및 H3N2, 및 인플루엔자 B 바이러스의 한 균주를 포함할 수 있다. 종종, 인플루엔자 백신은 4가 백신으로서 생성되는데, 이는 인플루엔자 A 바이러스의 2개의 아형 및 인플루엔자 B 바이러스의 두 균주를 포함할 수 있다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 특정 균주는 매년 순환하는 균주의 병원성을 예측할 수 있고 및 국가마다 상이할 수 있는 감시 기반 예측에 기초하여 선택될 수 있다.
범용 백신은 병원체의 다수의 균주 및/또는 동일한 패밀리 내의 다수의 균주에 대한 광범위한 보호를 제공하는 백신일 수 있다. 예시적인 범용 백신은 이노비오 파마슈티컬스의 SynCon® 인플루엔자 백신, 비온드백스의 M-001, 및 이뮨 타겟팅 시스템즈의 FP-01을 포함한다. 이들 범용 백신은 인플루엔자 바이러스 단백질 내에 존재하는 보존된 영역 또는 에피토프를 타겟팅할 수 있다. 보존된 영역 또는 에피토프는 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
백신 조성물은 하나 이상의 활성제, 예를 들어 본 출원에 기재된 하나 이상의 펩티드, 핵산, 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편), APC, 또는 바이러스를 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하게 할 수 있는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적으로 허용 가능한 담체를 이용하여 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
몇몇 경우에, 백신 조성물은 펩티드 기반 백신, 핵산 기반 백신, 항체 기반 백신, 세포 기반 백신, 또는 바이러스 기반 백신으로서 제형화된다. 예를 들어, 백신 조성물은 양이온성 지질 제형 내의 네이키드 cDNA; 예를 들어, 폴리(DL-락티드-코-글리콜라이드)("PLG") 미소구(참조: 예를 들어, Eldridge, et al, Molec. Immunol. 28:287- 294, 1991 : Alonso et al, vaccines 12:299-306, 1994; Jones et al, vaccines 13:675-681, 1995) 내에 캡슐화된 리포펩티드(참조: 예를 들어, Vitiello, A. et al, J. Clin. Invest. 95:341, 1995), 네이키드 cDNA 또는 펩티드; 면역 자극 복합체 펩티드(ISCOMS) 내에 함유된 조성물(참조　: 예를 들어 Takahashi et al, Nature 344:873-875, 1990; Hu et al, Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998); 또는 다중 항원 펩티드 시스템(MAP)(참조　: 예를 들어, Tarn, J. P., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tarn, J.P., J. Immunol. Methods 196: 17-32, 1996)을 포함할 수 있다. 종종, 백신은 펩티드 기반 백신, 또는 핵산이 펩티드를 코딩하는 핵산 기반 백신으로서 제형화된다. 종종, 백신은 항체 기반 백신으로서 제형화된다. 종종, 백신은 세포 기반 백신으로서 제형화된다.
백신 조성물은 하나 이상의 활성제, 예를 들어 본 출원에 기재된 하나 이상의 펩티드, 핵산, 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편), APC, 또는 바이러스를 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하게 할 수 있는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적으로 허용 가능한 담체를 이용하여 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
펩티드 기반 백신
본 출원에서 본 출원에 기재된 하나 이상의 에피토프 서열 또는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 펩티드 기반 백신이 제공된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프 서열, 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 하나 이상의 에피토프 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성될 수 있다. 펩티드 기반 백신은 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 펩티드 기반 백신은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51개, 또는 그 초과의 상이한 펩티드 서열을 포함할 수 있는데, 예를 들어 각각의 펩티드는 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 41, 43, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94의 적어도 8, 9, 10, 14, 16, 17, 18, 또는 25개의 아미노산에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 보유할 수 있다. 펩티드 기반 백신은 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조성물은 정제된 펩티드 또는 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있는, 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 실질적으로 구성된다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 본 출원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 "포함하는" 조성물은 본 출원에 기재되지 않은 하나 이상의 단백질을 포함하는, 다른 화합물을 함유할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드로 "실질적으로 구성되는" 조성물은 추가의 화합물이 상기 조성물 내에 함유된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변화시키지 않는 한, 본 출원에 기재된 펩티드 또는 폴리펩티드 이외에 다른 화합물을 상기 조성물이 포함할 수 있음을 의미할 수 있다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 본 출원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드로 "구성되는" 조성물은, 상기 조성물이 본 출원에 기재된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드 이외에 다른 단백질을 함유하지 않음을 의미할 수 있다. 본 출원에 기재된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드로 구성되는 조성물은 단백질 이외의 성분, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 담체, 계면활성제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드로 구성되는 조성물은 미량의 오염물질을 함유할 수 있는데, 이는 펩티드 또는 폴리펩티드 오염물질, 예를 들어 본 출원에 기재된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드의 더 작은 단편을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어 본 출원에 기재된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드의 합성, 후속 처리, 저장 조건, 및/또는 분해로부터 초래될 수 있다.
펩티드 기반 백신은 적합한 기법, 담체, 및 부형제를 이용하여 제형화될 수 있다. 펩티드 기반 백신은 그들의 생물학적 반감기, 안정성, 효능, 생체이용률, 생활성, 또는 이들의 조합을 개선하기 위해 제형화될 수 있다.
종종, 백신은 본 출원에 기재된 동일한 서열, 또는 상이한 폴리펩티드의 다수 사본의 칵테일을 함유하는 본 출원에 기재된 다수의 폴리펩티드의 칵테일을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 변형될 수 있는데, 예를 들어 지질화, 또는 담체 단백질에 대한 부착에 의해 변형될 수 있다. 지질화는 폴리펩티드에 대한 지질 기의 공유 부착일 수 있다. 지질화된 폴리펩티드는 구조를 안정화시킬 수 있고, 및 백신 치료의 효능을 증강시킬 수 있다.
지질화는 N-미리스토일화, 팔미토일화, GPI-앵커 첨가, 프레닐화, 및 몇몇 추가 유형의 변형과 같은 몇몇 상이한 유형으로 분류될 수 있다. N-미리스토일화는 글리신 잔기에 대한 미리스테이트, 즉 C14 포화 산의 공유 부착일 수 있다. 팔미토일화는 시스테인 잔기에 대한 장쇄 지방산(C16)의 티오에스테르 연결일 수 있다. GPI-앵커 첨가는 아미드 결합에 의한 글리코실-포스파티딜이노시톨(GPI) 연결일 수 있다. 프레닐화는 시스테인 잔기에 대한 이소프레노이드 지질(예를 들어, 파르네실(C-15), 게라닐게라닐(C-20))의 티오에테르 연결일 수 있다. 추가 유형의 변형은 시스테인의 황 원자에 의한 S-디아실글리세롤의 부착, 세린 또는 트레오닌 잔기에 의한 O-옥타노일 컨쥬게이션, 시스테인 잔기에 대한 S-아카에올 컨쥬게이션, 및 콜레스테롤 부착을 포함할 수 있다.
지질화된 폴리펩티드를 생성하기 위한 지방산은 C2 내지 C30 포화, 단일불포화, 또는 다중불포화 지방 아실기를 포함할 수 있다. 예시적인 지방산은 팔미토일, 미리스토일, 스테아로일, 및 데카노일기를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 면역증강제 특성을 보유하는 지질 모이어티는 외인성 면역증강제의 부재 하에서 면역원성을 유발 또는 증가시키기 위해 관심 있는 펩티드에 부착된다. 지질화된 펩티드 또는 리포펩티드는 자가-면역증강제 리포펩티드로 언급될 수 있다.
상기한 및 본 출원의 다른 곳에 기재된 임의의 지방산은 관심 있는 펩티드의 면역원성을 유발 또는 증강시킬 수 있다. 면역원성을 유발 또는 증강시킬 수 있는 지방산은 팔미토일, 미리스토일, 스테아로일, 라우로일, 옥타노일, 및 테카노일기를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 면역원성을 유발 또는 증강시킬 수 있는 지방산은 팔미토일기를 포함할 수 있다. 팔미토일기의 비제한적인 예는 Pam2Cys, Pam3Cys, 또는 Pam3OH를 포함한다.
디팔미토일-S-글리세릴-시스테인 또는 S-[2,3-비스(팔미토일옥시)프로필]시스테인으로도 공지된 Pam2Cys는 MALP-2, 마이코플라즘 퍼멘탄스(Mycoplasm fermentans)로부터 단리된 대식세포-활성화 리포펩티드인 MALP-2의 지질 모이어티에 상응한다.
Pam3OH 또는 N-팔미토일-S-[2,3-비스(팔미토일옥시)프로필]시스테인으로도 공지된 Pam3Cys는 그람 음성 박테리아의 내막 및 외막에 걸치는 브라운 지단백질(Braun's lipoprotein)의 N-말단 모이어티의 합성 버젼이다.
사용을 위해 고려된 다른 지방산 기는 Set2Cys(또한, S-(2,3-비스(스테아로일옥시)프로필)시스테인 또는 디스테아로일-5-글리세릴-시스테인으로 공지됨), Lau2Cys(또한, S-[2,3-비스(라우로일옥시)프로필]시스테인 또는 디라우로일-S-글리세릴-시스테인으로 공지됨); 및 Oct2Cys(또한, S-[2,3-비스(옥타노일옥시)프로필]시스테인 또는 디옥타노일-S-글리세릴-시스테인으로 공지됨)을 포함한다.
추가의 적합한 지방산 기는 합성 트리아실화된 및 디아실화된 리포펩티드, FSL-I(마이코플라즘 살리바리움 I으로부터 유도된 합성 지단백질), Pam3Cys(트리팔미토일-S-글리세릴시스테인) 및 S-[2,3-비스(팔미토일옥시)-(2RS)-프로필]-N-팔미토일-(R)-시스테인을 포함하는데, 이때 "Pam3"는 "트리팔미토일-S-글리세릴"이다. 또한, Pam3Cys의 유도체가 사용을 위해 적합한데, 이 유도체는 S-[2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-R,S)-프로필]-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys)4-히드록시트리히드로클로라이드(서열번호 111로 개시된 바와 같은 "(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys)4"); Pam3Cys-Ser-Ser-Asn-Ala(서열번호 112); PaM3Cys-Ser-(Lys)4(서열번호 113); Pam3Cys-Ala-Gly; PamsCys-Ser-Gly; Pam3Cys-Ser; PaM3CyS-OMe; Pam3Cys-OH; PamCAG, 팔미토일-Cys((RS)-2,3-디(팔미토일옥시)-프로필)-Ala-Gly-OH 등을 포함한다. 다른 비제한적인 예는 Pam2CSK4(서열번호 114)(디팔미토일-S-글리세릴 시스테인-세린-(라이신)4; 또는 Pam2Cys-Ser-(Lys)4(서열번호 114))를 포함한다.
펩티드, 예를 들어 네이키드 펩티드 또는 지질화된 펩티드는 리포좀 내에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 지질화된 펩티드의 지질 부분은 리포좀의 지질 이중층 내에 자연적으로 혼입될 수 있다. 따라서, 리포펩티드는 리포좀의 "표면" 상에 존재할 수 있다. 지질화된 펩티드는 리포좀 내에 캡슐화된 펩티드일 수 있다.
제제 내의 혼입을 위해 적합한 예시적인 리포좀은 다중박막층 소낭(MLV), 올리고박막층 소낭(OLV), 단일박막층 소낭(UV), 소형 단일박막층 소낭(SUV), 중간 크기의 단일박막층 소낭(MUV), 대형 단일박막층 소낭(LUV), 거대한 단일박막층 소낭(GUV), 다소포성 소낭(MVV), 역상 증발법으로 제조된 단일 또는 올리고박막층 소낭(REV), 역상 증발법으로 제조된 다중박막층 소낭(MLV-REV), 안정한 다수박막층 소낭(SPLV), 냉동 및 해동된 MLV(FATMLV), 압출법으로 제조된 소낭(VET), 프렌치 프레스에 의해 제조된 소낭(FPV), 융합에 의해 제조된 소낭(FUV), 탈수-재수화 소낭(DRV), 및 버블섬(bubblesome)(BSV)을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
제제 방법에 따라, 리포좀은 단일박막층 또는 다중박막층일 수 있고, 및 약 0.02 μm 내지 약 10 μm 초과 범위의 직경을 갖는 크기에서 변화될 수 있다. 종종, 리포좀은 소형 단일박막층 소낭(25-50 nm), 대형 단일박막층 소낭(100-200 nm), 거대한 단일박막층 소낭(1-2 μm), 및 다중박막층 소낭(MLV; 1 μm-2 μm)일 수 있다. 전달되는 펩티드는 리포좀 내에 캡슐화되거나, 또는 표면 상에 흡착될 수 있다. 리포좀의 크기 및 표면 특성은 원하는 결과를 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 단일박막층 및 다중박막층 리포좀은 맥관내 투여 수 시간 내지 수일 후 지속 방출을 제공한다. 연장된 약물 방출은 DepoFoam® 기술로도 공지된 다소포성 리포좀에 의해 달성될 수 있다. ULV 및 MLV와는 달리, 다소포성 리포좀은 증가된 레벨의 안정성 및 약물 방출의 더 긴 지속기간을 부여하는 지질 층의 네트워크에 의해 둘러싸인 비동심 다중 수성 챔버로 구성된다. 리포좀은 원하는 결과를 달성하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 리포좀은 세망내피계에 의한 인식 및 흡수를 방해하고 및 증가된 순환 시간을 방해하기 위해 페길화(PEGylation)될 수 있거나, 또는 다른 표면 변형을 보유할 수 있다.
리포좀은 다수 유형의 세포를 흡착할 수 있고, 및 이어서 혼입된 제제(예를 들어, 본 출원에 기재된 폴리펩티드)를 방출할 수 있다. 몇몇 경우에, 리포좀은 타겟 세포와 융합되어, 리포좀의 내용물을 타겟 세포로 흐르게 한다. 리포좀은 식포성인 세포에 의해 세포내 도입될 수 있다. 세포내 도입은 리포좀 지질의 라이소좀내 분해 및 캡슐화된 제제의 방출을 동반할 수 있다.
또한, 본 출원에 제공된 리포좀은 담체 지질을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 담체 지질은 인지질이다. 리포좀을 형성할 수 있는 담체 지질은 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 포스파티딜콜린(PC; 레시틴), 포스파티드산(PA), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS)을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 적합한 인지질은 추가로 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티드산(DPPA); 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디스테아로일포스파티드산(DSPA), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 등, 또는 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 리포좀은 리포좀 형성을 조절하는 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)을 추가로 포함한다. 담체 지질은 임의의 공지된 비-포스페이트 극성 지질일 수 있다.
또한, 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 백신으로서 전달을 위해 담체 단백질에 부착될 수 있다. 담체 단백질은 면역원성 담체 요소일 수 있고, 및 임의의 재조합 기술에 의해 부착될 수 있다. 예시적인 담체 단백질은 바다양식 키홀 림펫 해모시아닌(mcKLH), 페길화된 mcKLH, 블루 캐리어* 단백질, 소 혈청 알부민(BSA), 양이온화된 BSA, 난알부민, 및 박테리아 단백질, 예를 들어 파상풍 독소(TT)를 포함한다.
또한, 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 다중 항원성 펩티드(MAP)로서 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 작은 비-면역원성 코어에 N-말단 또는 C-말단에서 부착될 수 있다. 이러한 코어 상에 형성된 폴리펩티드는 고도로 국부화된 펩티드 밀도를 제공할 수 있다. 상기 코어는 수지상 코어 잔기 또는 이작용성 유닛으로 구성된 매트릭스일 수 있다. MAP를 구성하기 위해 적합한 코어 분자는 암모니아, 에틸렌디아민, 아스파르트산, 글루탐산, 및 라이신을 포함할 수 있다. 예를 들어, 라이신 코어 분자는 2개의 추가 라이신에 대해 그의 아미노기 각각을 통해 펩티드 결합에 의해 부착될 수 있다. 이러한 2세대 분자는 4개의 유리 아미노기를 보유하고, 이들 각각은 8개의 유리 아미노기를 갖는 3세대 분자를 형성하기 위해 추가의 라이신에 공유적으로 연결될 수 있다. 폴리펩티드는 8가의 다중 항원성 펩티드(또한, "MAP8" 구조로도 언급됨)를 형성하기 위해, 이들 유리기 각각에 대해 그의 C-말단에 의해 부착될 수 있다. 4개의 유리 아미노기를 보유하는 2세대 분자는 4가 또는 4량체 MAP, 예를 들어 코어에 공유적으로 연결된 4개의 펩티드를 보유하는 MAP(또한, "MAP4" 구조로도 언급됨)를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 첫 번째 라이신 잔기의 카르복실기는 자유롭게 남겨지거나, 아미드화되거나, 또는 β-알라닌 또는 다른 차단 화합물에 커플링될 수 있다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, MAP 시스템 구조의 "선형 부분 또는 분자"는 코어 매트릭스에 연결된 항원성 펩티드를 의미할 수 있다. 따라서, 항원성 에피토프의 클러스터는 MAP의 표면을 형성할 수 있고, 및 소형 매트릭스는 그의 코어를 형성한다. 수지상 코어, 및 전체 MAP는 고전적인 메리필드 합성 절차를 이용하여 고체 수지 상에서 합성될 수 있다.
MAP 제제를 위해 사용된 폴리펩티드는 동일할 수 있고, 및 다수의 상이한 서열 및 길이를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 박테리아, 바이러스, 또는 진균으로부터 유도될 수 있다. 펩티드는 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 또는 HIV로부터 유도될 수 있다.
종종, 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 단백질 분해효소적 분해에 대해 저항성인 환형 펩티드를 생성하기 위해 고리화될 수 있다. 고리화는 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 이황화 결합, 란티오닌, 디카르바, 히드라진, 또는 락탐 브리지를 통해 측쇄 사이에 또는 펩티드의 단부에서 수행될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 분자, 예를 들어 비타민 B12, 지질, 또는 에틸렌 옥사이드 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO), 및 폴리옥시에틸렌(POE), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(MPEG), 모노-메톡시PEG(mPEG) 등에 컨쥬게이트된다. 에틸렌 옥사이드 화합물은, 예를 들어 아민 결합 말단 작용기, 예를 들어 N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시숙신이미드 카르보네이트, 및 지방족 알데히드, 또는 티올 결합기, 예를 들어 말레이미드, 피리딜 디설파이드, 및 비닐 술포네?로 추가로 작용화될 수 있다. 아미노기(a-아미노 및 ε-라이신 아미노) 및 시스테인 잔기는 컨쥬게이션에 적합하기 때문에, 본 출원에 제공된 펩티드는 당해 기술분야에 공지된 에틸렌옥사이드 분자 또는 담체 화합물에 대한 컨쥬게이션을 위한 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 컨쥬게이트된 펩티드의 약동학 및 약력학 특성은 특정 링커의 사용에 의해 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 프로필 및 아밀 링커는 느슨한 형태를 보유하는 컨쥬게이트를 제공하기 위해 사용될 수 있는 반면, 페닐 링커는 더 조밀한 형태를 제공할 뿐만 아니라 C-말단에 인접한 도메인을 차폐하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 예에서, 조밀한 형태는 생활성의 유지, 혈장 반감기 연장, 단백질 분해 민감성의 저하, 및 느슨한 형태에 비해 면역원성에 더 효과적일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 계내 화학 반응 또는 위치 지정 돌연변이유발을 이용하여 과글리코실화될 수 있다. 과글리코실화는 N-연결된 또는 O-연결된 단백질 글리코실화를 초래할 수 있다. 주어진 펩티드의 클리어런스 속도는 특정 당류의 선택에 의해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 폴리시알산(PSA)은 상이한 크기로 이용할 수 있고, 및 그의 클리어런스는 상기 중합체의 유형 및 분자 크기에 따라 달라진다. 따라서, 예를 들어 고 분자량을 보유하는 PSA는 저 분자량 펩티드의 전달을 위해 적합할 수 있고, 및 저 분자량을 보유하는 PSA는 고 분자량을 보유하는 펩티드의 전달을 위해 적합할 수 있다. 상기 유형의 당류는 특정 조직 또는 세포에 대해 펩티드를 타겟팅하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 만노오스와 컨쥬케이트된 폴리펩티드는 만노오스-특이성 렉틴, 예를 들어 만노오스 수용체 및 만노오스 결합 단백질에 의해 인식될 수 있고, 및 간에 의해 흡수된다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 상이한 환경 조건 하에서 그들의 물리적 및 화학적 안정성을 개선하기 위해, 예를 들어 스트레스 조건 하에서 불활성화를 억제하고, 및 제조 및 저장 조건에 기인하는 응집을 감소시키기 위해 과글리코실화될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 약물 전달 시스템, 예를 들어 마이크로입자, 나노입자(10 내지 1000 nm 범위를 크기를 보유하는 입자), 나노에멀젼, 리포좀 등은 민감성 단백질의 보호를 제공하고, 방출을 연장하고, 투여 빈도를 감소시키고, 환자 순응도를 증가시키고, 및 혈장 레벨을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 생분해성 및/또는 생체적합성 중합체일 수 있는 여러 가지 천연 또는 합성 마이크로입자 및 나노입자가 사용될 수 있다. 마이크로입자 및 나노입자는 지질, 중합체, 및/또는 금속으로부터 구성될 수 있다. 마이크로입자 및 나노입자는 천연 또는 합성 중합체, 예를 들어 전분, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA) 등으로부터 구성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 나노입자는 고체 액체 나노입자(SLN), 탄소나노튜브, 나노구, 나노캡슐 등이다. 몇몇 실시양태에서, 중합체는 친수성이다. 몇몇 실시양태에서, 중합체는 티올화된 중합체이다.
마이크로입자 및 나노입자로부터의 약물 방출의 속도 및 정도는 중합체의 조성 및 구성 방법에 따라 달라질 수 있기 때문에, 원하는 약물 방출 프로필을 부여하기 위해 주어진 조성 및 구성 방법, 예를 들어 분무 건조, 동결건조, 및 이중 에멀젼을 선택할 수 있다. 마이크로입자 또는 나노입자 내에 또는 상에 혼입된 펩티드는 제형화 및 개발 중에 수성-유기 계면에서 변성되는 경향이 있을 수 있기 때문에, 상이한 안정화 부형제 및 조성물이 응집 및 변성을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, PEG 및 당, 예를 들어 PEG(MW 5000) 및 말토오스는 a-키모트립신과 함께 응집 및 변성을 감소시키기 위해 상기 조성물에 첨가될 수 있다. 추가로, 본 출원에 기재된, 화학적으로 변형된 펩티드, 예를 들어 컨쥬케이트된 펩티드 및 과글리코실화된 펩티드가 사용될 수 있다.
또한, 단백질 안정성은 선택된 구성(fabrication) 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 수성-유기 계면에서 분해를 방지하기 위해, 비수성 방법, 소위 ProLease® 기술이 사용될 수 있다. 또한, 고체 상태의 펩티드는 수중유 중 고체(solid-in-oil-in-water(s/o/w)) 방법을 이용하여 캡슐화될 수 있는데, 예를 들어 분무- 또는 분무-동결-건조 펩티드 또는 펩티드-로딩된 고체 나노입자는 s/o/w 방법을 이용하여 미구구 내에 캡슐화될 수 있다.
소수성 이온-쌍 형성(HIP) 복합체화는 단백질의 안정성을 증강시키고, 및 미소구와 나노입자 내로의 캡슐화 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 소수성 이온-쌍 형성(HIP) 복합체화에서, 펩티드의 이온화 가능한 작용기는 소수성 복합체 내에 존재하는 친수성 단백질 분자가 형성하는 HIP 복합체의 형성을 유도하는 반대로 하전된 작용기를 함유하는 이온-쌍 형성제(예를 들어, 계면활성제 또는 중합체)를 이용하여 복합체화된다.
본 출원에 기재된 폴리펩티드는 화학적으로 합성되거나, 또는 세포 시스템 또는 무세포 시스템 내에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들어 액체 상 합성, 고체 상 합성, 또는 마이크로웨이브 지원 펩티드 합성에 의해 합성될 수 있다. 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는, 예를 들어 아실화, 알킬화, 아미드화, 아르기닐화, 폴리글루타밀화, 폴리글리실화, 부티릴화, 감마-카르복실화, 글리코실화, 말로닐화, 히드록실화, 요오드화, 뉴클레오티드 첨가(예를 들어, ADP-리보실화), 산화, 인산화, 아데닐릴화, 프로피오닐화, S-글루타치온화, S-니트로실화, 숙시닐화, 황화, 당화(glycation), 팔미토일화, 미리스토일화, 이소프레닐화 또는 프레닐화(예를 들어, 파르네실화 또는 게라닐게라닐화), 글리피화, 리포일화, 플라빈 모이어티(예를 들어, FMN 또는 FAD)의 부착, 헴 C의 부착, 포스포판테테이닐화, 레티닐리덴 시프 염기 형성, 디프트아미드 형성, 에탄올아민 포스포글리세롤 부착, 하이푸신 형성, 비오티닐화, 페길화, ISG화(ISGylation), SUMO화(SUMOylation), 유비퀴틴화, 네딜화, 푸필화, 시트룰린화, 탈아미드화, 엘리미닐화, 카르바밀화, 또는 이들의 조합에 의해 변형될 수 있다.
폴리펩티드의 생성 후, 폴리펩티드는 불순물을 제거하기 위해 1회 이상의 라운드의 정제 단계를 수행할 수 있다. 정제 단계는 친화성 기반, 크기 배제 기반, 이온 교환 기반 등과 같은 분리 방법을 이용하는 크로마토그래피 단계일 수 있다. 몇몇 경우에, 펩티드는 최대 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 또는 100% 순수하거나, 또는 불순물이 존재하지 않는다. 몇몇 경우에, 펩티드는 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 또는 100% 순수하거나, 또는 불순물이 존재하지 않는다. 몇몇 경우에, 펩티드 조성물 내 펩티드의 양은 중량 기준으로 총 조성물의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 또는 100%이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 "정제된" 펩티드는 펩티드와 자연적으로 연관된 거대분자 성분의 상당량이 펩티드로부터 제거된 것을 의미할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 하나 이상의 정제된 펩티드를 포함하거나, 그 펩티드로 구성되거나, 또는 그 펩티드로 실질적으로 구성되는 조성물은, 상기 조성물이 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성하기 위해 사용된 시약과 자연적으로 연관된 거대분자 성분의 상당량을 함유하지 않음을 의미할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 조성물은 본 출원에 기재된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 고체 형태 또는 결정형의 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드로 전적으로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 단리될 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "단리된" 화합물(예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산 분자)은 그의 천연 환경으로부터 단리되는 화합물을 의미할 수 있다. 예를 들어, 단리된 펩티드 또는 폴리펩티드는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에 인접하는 전장 폴리펩티드에 상응하는 그의 천연 아미노산을 보유하지 않는 것일 수 있다. 다른 예로서, 단리된 펩티드는 펩티드가 자연적으로 관련되지 않는 기판에 대해 고정화된 것일 수 있다. 추가의 예로서, 단리된 펩티드 또는 폴리펩티드는, 펩티드가 자연적으로 관련되지 않는 다른 분자, 예를 들어 PEG 화합물에 연결된 것일 수 있다. 유사하게, "단리된" 핵산 분자는 그의 5' 단부, 3' 단부 또는 둘 다에 인접하는 전장 핵산 분자에 상응하는 그의 천연 핵산 염기를 보유하지 않는 것일 수 있다. 다른 예로서, 단리된 핵산 분자는, 핵산 분자가 자연적으로 관련되지 않는 기판 또는 화합물, 예를 들어 형광 태그와 같은 라벨에 결합된 것일 수 있다. 추가의 예로서, 핵산 분자와 관련하여, 용어 "단리된"은, 핵산 분자가 자연적으로 발생하는 세포 및 핵산으로부터 분리된다는 것을 의미할 수 있다.
펩티드 기반 백신은 대략, 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 55, 60, 65, 70, 또는 75개의 상이한 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 상이한 펩티드 서열은 본 출원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
핵산 기반 백신
본 출원에서, 대략, 적어도, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 55, 60, 65, 70, 또는 75개의 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 기반 백신이 제공된다. 상기 핵산 기반 백신은 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
핵산 기반 백신은 적합한 기법, 담체, 및 부형제를 이용하여 제형화될 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘 다, RNA, 또는 하이브리드일 수 있는데, 이때 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다. 백신은 DNA 기반 백신, RNA 기반 백신, 하이브리드 DNA/RNA 기반 백신, 또는 하이브리드 핵산/펩티드 기반 백신일 수 있다. 펩티드는 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 펩티드 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 보유하는 폴리펩티드일 수 있다. 펩티드는 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 펩티드 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열에 대해 최대 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 보유하는 폴리펩티드일 수 있다.
핵산 분자는 서로 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 개략적으로 후술하는 바와 같이(예를 들어, 프라이머 및 프로브, 예를 들어 라벨 프로브의 구성에서), 몇몇 경우에, 예를 들어 포스포로아미드, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포스포로아미다이트 연결, 및 펩티드 핵산(본 출원에서 "PNA"로도 언급됨) 백본 및 연결을 포함하는 대안적인 백본을 보유할 수 있는 핵산 유사체가 포함될 수 있음에도 불구하고, 본 출원에 기재된 핵산은, 포스포다이에스테르 결합을 함유할 수 있다. 다른 유사체 핵산은 락킹된 핵산(Locked Nucleic Acid, 본 출원에서 "LNA"로도 언급됨); 포지티브 백본; 비이온성 백본 및 비-리보오스 백본을 포함하는 바이시클릭 구조를 가진 것을 포함한다. 또한, 하나 이상의 카르보시클릭 당을 함유하는 핵산은 핵산의 정의 내에 포함된다(참조: 예를 들어, Jenkins et al, Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169 176). 몇몇 핵산 유사체는, 예를 들어 문헌(Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35)에 기재되어 있다. 또한, "락킹된 핵산"은 핵산 유사체의 정의 내에 포함된다. LNA는, 리보오스 고리가 2'-O 원자와 4'-C 원자를 연결하는 메틸렌 브리지에 의해 "락킹된"핵산 유사체의 부류이다. 이들 모든 참고문헌은 본 출원에 전적으로 참고로 기재된 것이다. 리보오스-포스페이트 백본의 이들 변형은 생리학적 환경에서 그러한 분자들의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, PNA:DNA 및 LNA-DNA 하이브리드는 더 높은 안정성을 나타낼 수 있고, 및 따라서 몇몇 실시양태에서 사용될 수 있다. 타겟 핵산은 지정되는 바와 같이 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드일 수 있거나, 또는 이중 스트랜드 또는 단일 스트랜드 둘 다의 일부분을 함유할 수 있다. 적용에 따라, 핵산은 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 및 cDNA를 포함), RNA(예를 들어, mRNA 및 rRNA를 포함) 또는 하이브리드일 수 있는데, 이때 상기 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 임의의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌 등을 포함하는 염기의 임의의 조합을 함유한다.
본 출원에서, 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 몇몇 경우에, 상기 벡터는 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 벡터는 본 출원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 출원에 제공된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 타겟 개체, 예를 들어 인간, 마우스, 돼지, 또는 개를 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 전임상 동물 실험을 위한 마우스에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 사상은 농업을 위한 인플루엔자의 예방, 예를 들어 돼지 인플루엔자 또는 조류 인플루엔자의 예방을 위한 사용에서 그 용도를 발견할 수 있다. 이러한 유형의 최적화는, 동일한 단백질을 코딩하면서 의도된 숙주 유기체 또는 세포의 코돈 선호를 모방하기 위해 외래-유래(예를 들어, 재조합) DNA의 돌연변이를 수반할 수 있다.
상기 벡터는 환형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 환형 플라스미드 또는 선형 핵산은 적합한 개체 세포 내에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있다. 벡터는, 종결 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있는 펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 또한, 벡터는 뉴클레오티드 서열의 적합한 번역을 위해 필요한 서열을 함유할 수 있다. 관심 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 키메릭일 수 있는데, 이는 그의 성분 중 적어도 하나가 그의 다른 성분 중 적어도 하나에 대해 이종성임을 의미한다. 발현 카세트 내의 뉴클레오티드 서열의 발현은, 구성적 프로모터, 또는, 단지 숙주 세포가 몇몇 특정 외부 자극에 대해 노출되는 경우, 전사를 개시할 수 있는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 펩티드를 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염하기 위해 유용할 수 있는데, 형질전환된 숙주 세포는 펩티드의 발현이 일어나는 조건 하에서 배양 및 유지될 수 있다.
상기 플라스미드는 본 출원에 개시된 여러 가지 폴리펩티드 중 하나 이상을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 단일 플라스미드는 단일 폴리펩티드를 위한 코딩 서열, 또는 하나 이상의 폴리펩티드를 위한 코딩 서열을 함유할 수 있다. 종종, 플라스미드는 면역증강제, 예를 들어 면역 자극 분자, 예를 들어 사이토카인을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다.
플라스미드는 코딩 서열의 상류에 존재할 수 있는 개시 코돈, 및 코딩 서열의 하류에 존재할 수 있는 종결 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 코딩 서열과 함께 프레임 내에 존재할 수 있다. 또한, 플라스미드는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 및 코딩 서열의 상류의 인핸서를 포함할 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 바이러스 인핸서, 예를 들어 CMV, FMDV, RSV, 또는 EBV 중 하나일 수 있다.
또한, 상기 플라스미드는 염색체 외적으로 플라스미드를 유지하기 위해, 및 세포 내에서 플라스미드의 다수의 사본을 생성하기 위해 포유류 복제 원점을 포함할 수 있다. 플라스미드는 인비트로겐(San Diego, CA)의 pVAXI, pCEP4, 또는 pREP4일 수 있다.
또한, 플라스미드는 플라스미드가 도입되는 세포 내에서 유전자 발현을 위해 최적화될 수 있는 조절 서열을 포함할 수 있다. 코딩 서열은 숙주 세포 내에서 코딩 서열의 더 효과적인 전사를 가능하게 할 수 있는 코돈을 포함할 수 있다.
상기 플라스미드는 pSE420(인비트로겐, San Diego, CA), pYES2(인비트로겐, San Diego, CA), MAXBACTM 완전 바쿨로바이러스 발현 시스템(인비트로겐, San Diego, CA), pcDNA I 또는 pcDNA3(인비트로겐, San Diego, CA)일 수 있다.
상기 벡터는 환형 플라스미드일 수 있는데, 이는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 또는 염색체 외적으로 존재(예를 들어, 복제 원점을 보유한 자가 복제 플라스미드)함으로써 타겟 세포를 형질전환시킬 수 있다. 예시적인 벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 프로박스, 또는 항원을 코딩하는 DNA를 발현할 수 있고, 세포가 면역계에 의해 인식되는 항원에 대한 서열을 번역하도록 할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터를 포함할 수 있다.
또한, 핵신 기반 백신은 선형 핵산 백신 또는 선형 발현 카세트("LEC")일 수 있는데, 이는 전기천공법에 의해 개체 내로 효율적으로 전달될 수 있고, 본 출원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드를 발현한다. LEC는 임의의 포스페이트 백본이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. 상기 DNA는 본 출원에 개시된 하나 이상의 펩티드를 코딩할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 펩티드의 발현은 프로모터에 의해 조절될 수 있다. LEC는 폴리펩티드 발현과는 무관한 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수 있다.
상기 LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래할 수 있다. 상기 플라스미드는 펩티드를 발현할 수 있다. 예시적인 플라스미드는 pNP(푸에르토리코/34), pM2(뉴칼레도니아/99), WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 프로박스, 또는 항원을 코딩하는 DNA를 발현시킬 수 있고, 및 세포가 면역계에 의해 인식되는 항원에 대한 서열을 번역하도록 할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터를 포함한다.
상기 핵산 기반 백신은 비경구 전달 방법을 통해 개체에 전달될 수 있다. 비경구 전달은 정맥내, 경피, 경구, 담관내, 뇌실질내, 간동맥내, 간문맥내, 종양내, 또는 경정맥 전달을 포함할 수 있다. 종종, 비경구 전달은 핵산 기반 백신의 전달을 위한 바늘(예를 들어, 피하주사 바늘)을 이용할 수 있다. 핵산 기반 백신은 수용액, 예를 들어 염수 중에서 제형화될 수 있다. 전달은 전기천공법에 의해 추가로 지원될 수 있다. 종종, 비경구 전달은 전달 방법으로서 유전자 총을 이용할 수 있다. 핵산 기반 백신은 DNA-코팅된 마이크로입자, 예를 들어 DNA-코팅된 금 또는 텅스텐 비드로서 제형화될 수 있다. 유전자 총 전달 방법은 타겟 세포 내로 핵산을 가속하기 위해 탄도 전달 방법을 이용할 수 있다. 종종, 비경구 전달은 전달 방법으로서 공압 주사를 이용할 수 있다. 핵산 기반 백신은 수용액으로서 제형화될 수 있다.
또한, 핵산 기반 백신은 국소 전달 방법을 통해 개체에게 전달될 수 있다. 국소 핵산 기반 백신은 점막 표면, 예를 들어 코 및 폐 점막, 눈 투여, 또는 질 점막 상에 전달되는 네이키드 DNA의 에어로졸 점적으로서 제형화될 수 있다.
상기 핵산 기반 백신은 지질 매개된 전달 방법을 통해 개체에게 추가로 전달될 수 있다. 종종, 지질 매개된 전달 방법은 사이토펙틴 매개된 전달 방법일 수 있다. 사이토펙틴은 세포막을 가로질러 핵산 분자를 결합 및 수송할 수 있는 양이온성 지질일 수 있다. 핵산은 사이토펙틴 기반 리포좀에 의해 혼입될 수 있다. 종종, 지질 매개된 전달 방법은 중성 지질 매개된 전달 방법일 수 있다.
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 또는 1000개의 상이한 핵산을 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 기반 백신
본 출원에서 재조합 바이러스 기반 백신이 제공된다.
상기한 바와 같은 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 재조합 바이러스 벡터일 수 있다. 몇몇 경우에, 상기한 바와 같은 핵산 기반 백신은 재조합 바이러스 형태일 수 있다. 재조합 바이러스는, 전형적으로 바이러스 벡터로부터 유도된, 및 인플루엔자 바이러스 이외의 다른 바이러스 기원으로부터 유도된 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된 본 출원에 기재된 바와 같은 재조합 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터는 여러 가지 상이한 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 알파바이러스, 바쿨로바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 폭스바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 5(PIV5), 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 기초할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 경우에, 벡터는 본 출원에 기재된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인플루엔자 바이러스 이외의 바이러스 유래의 바이러스 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다. 백신은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 상이한 바이러스 벡터를 포함할 수 있는데, 각각의 벡터는 상이한 서열을 가진 폴리펩티드를 발현한다.
아데노바이러스 기반 백신은 광범위한 숙주를 감염시킬 수 있다. 몇몇 경우에, 아데노바이러스 백신은, 바이러스 유전자가 숙주 게놈 내로 통합될 가능성 없이, 높은 수준의 바이러스 트랜스유전자 발현을 유도할 수 있다. 세포 배양에서 높은 역가로 성장할 수 있는 그들의 능력 때문에, 본 출원에 기재된 아네노바이러스 백신은 안전하고, 저렴하게 제조될 수 있다. 몇몇 경우에, 본 출원의 백신에 사용되는 아데노바이러스 벡터는 톨 유사 수용체 의존성 및 톨 유사 수용체 비의존성 경로에 의해 선천 면역 반응을 내재적으로 자극할 수 있다. 몇몇 경우에, 또한, 에데노바이러스 백신은 수지상 세포(DC)를 감염시킴으로써, 예를 들어 보조 자극성 분자의 상향 조절, 증가된 사이토카인 및 감염된 DC에 의한 케모카인 생성, 또는 둘 다를 통해 면역 세포에 대한 더 효과적인 항원 제시를 유도한다.
본 출원에 기재된 아데노바이러스 벡터는 2개의 상이한 형태로 생성될 수 있다: 복제-결함성(replication-defective) 또는 복제-가능성(replication-competent). 복제-결함성 아데노바이러스 벡터는 복제를 위해 필수적일 수 있는 E1 유전자의 결실에 의해 생성될 수 있다. 종종, 복제-결함성 아데노바이러스 벡터는 외래 유전자 인서트를 위한 더 충분한 공간을 생성하기 위해 E3 유전자를 결실시켜 생성될 수도 있다. 원하는 트랜스유전자, 예를 들어 본 출원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 보유하는 발현 카세트가 삽입될 수 있다. 복제-가능성 아데노바이러스 벡터는 E3 유전자의 결실을 이용하여 생성될 수 있다. 종종, 복제-가능성 Ad-벡터는 자연적인 바이러스 감염을 모방함으로써, 선천 및 획득 면역성의 여러 가지 요소의 내재적인 자극으로 인해 강력한 면역 증강 효과를 발휘할 수 있다.
본 개시의 몇몇 실시양태에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 몇몇 예에서, 벡터는 비인간 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 몇몇 경우에, 벡터는 비인간 영장류 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 몇몇 경우에, 벡터는 침팬지 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
특정 실시양태에서, 침팬지 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드, 예를 들어 C68(AdC68)(서열번호 104), 예를 들어 미국 특허 6,083,716에 기재된 것, C7(AdC7), 예를 들어 문헌[참조: Tatsis, et al., "Chimpanzee-origin adenovirus vectors as vaccine carriers", Gene Therapy 13: 421-429 (2006)]에 기재된 것, 문헌[참조: Haut et al., "Partial E3 Deletion in Replication-Defective Adenovirus vectors Allows for Stable Expression of Potentially Toxic Transgene Products", 인간 유전자 치료 방법 DOI: 10.1089/hgtb.2016.044 (2016)]에 개시된 C6(AdC6)(서열번호 105), 문헌[참조: Roy, et al., "Rescue of chimeric adenovirus vectors to expand the serotype repertoire", J Virol Methods 141(a): 14-21 (2007)]에 개시된 Pan7 및 Pan9를 발현하기 위해 사용될 수 있다.
대안적으로, 상기 벡터는 AAV에 기초할 수 있다. 재조합 AAV는 여러 가지 숙주, 조직, 및 증식성 및 비증식성 세포 유형을 감염시키는 광범위한 굴성을 보유할 수 있다. 본 개시와 함께 사용될 수 있는 AAV는 AAV 혈청형 2(AAV2), AAV5, AAV7, AAV1, 및 AAV6을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
또한, 벡터는 바쿨로바이러스에 기초할 수 있다. 본 출원에서 제공된 백신, 예를 들어 인플루엔자 백신을 위한 벡터로서 사용될 수 있는 바쿨로바이러스는 알파바쿨로바이러스, 베타바쿨로바이러스, 감마바쿨로바이러스, 및 델타바쿨로바이러스를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
대안적으로, 상기 벡터는 폭스바이러스에 기초할 수 있다. 폭스바이러스는 이중 스트랜드 DNA 바이러스일 수 있다. 폭스바이러스 게놈은 매우 클 수 있는데; 포유류 폭스바이러스는 대략 130 kb의 게놈을 보유할 수 있고, 및 조류 폭스바이러스 게놈은 대략 300 kb로 훨씬 더 크다. 그러한 대형 게놈 크기는 감염성 또는 다른 필수적인 바이러스 기능과 타협하지 않고 10 kb 초과의 외래 DNA의 삽입을 가능하게 할 수 있다. 폭스바이러스는 그들 자신의 전사 기구, 바이러스 DNA-의존성 RNA 폴리머라아제 및 번역후 변형 효소를 보유함으로써, 자가-충분성 세포질 복제를 가능하게 할 수 있다. 결과적으로, 삽입된 트랜스유전자 생성물은 높은 레벨로 발현될 수 있고, 강력한 세포성 면역 반응을 초래할 수 있다.
재조합 백시니아 바이러스는 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 발현하기 위해 생성될 수 있다. 본 개시와 함께 사용될 수 있는 비-복제성 폭스바이러스 벡터는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA), NYVAC, 및 ALVAC 균주를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. MVA는 병아리 배 섬유아세포에서 반복적인 계대를 통해 그의 원래 게놈의 대략 15%의 상실에 의해 복제-결함성으로 되었다. 백시니아의 코펜하겐 균주로부터 유래된 NYVAC 균주는 원래 바이러스 게놈으로부터 18개의 상이한 오픈 리딩 프레임의 결실에 의해 복제-결함성으로 되었다. ALVAC는 병아리 배 섬유아세포에서 200회 이상의 계대에 의해 유도된 추가의 약독화를 보유하는 인간 세포에서 복제하지 않는 카나리아 폭스바이러스 벡터이다.
대안적으로, 상기 벡터는 알파바이러스에 기초할 수 있다. 알파바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 복제할 수 있는 단일 스트랜드 포지티스-센스 RNA 바이러스일 수 있다. 본 개시와 함께 사용될 수 있는 알파바이러스는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE), 신드비스 바이러스(SIN), 셈리키 삼림열 바이러스(SFV), 및 VEE-SIN 키메라를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
알파바이러스 벡터는 구조 단백질을 암호화하는 유전자의 결실을 갖도록 디자인될 수 있다. 그러한 알파바이러스 벡터는 "레플리콘"으로 공지되어 있다. 알파바이러스 벡터는 항원-특이성 면역 반응의 효율적인 생성을 유도할 수 있는 드레이닝 림프절에서 항원 제시 세포, 예를 들어 수지상 세포를 잠재적으로 타겟팅할 수 있다. 또한, 알파 바이러스 벡터는 일부 세포에서 아폽토시스를 유도함으로써 백신 항원의 교차-프라이밍을 위한 적합한 환경을 생성할 수 있다. 또한, 백신 면역성은 알파바이러스 벡터 자체에 의해 추가로 증강될 수 있다.
VEE는 인간에서 병원성이지만, SIN은 아니다. VEE/SIN 키메라는, 인간이 백신화 개체인 경우, 안전성에 대한 우려를 회피하기 위해 사용될 수 있다. VEE/SIN 키메라에서, VEE는 레플리콘 성분으로서 작용할 수 있고, 및 SIN은 구조 및 팩케이징 성분으로서 작용할 수 있다.
본 출원에 기재된 바와 같은 백신을 생성하기 위한 벡터로서 사용될 수 있는 다른 RNA 바이러스는 NDV, PIV5, 및 VSV를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 출원에 기재된 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 기반 백신은 본 출원에 기재된 방법, 예를 들어 도 5에 기재된 절차에 따라 생성될 수 있다.
아데노바이러스 기반 백신을 생성하는 방법은 플라스미드 DNA의 제조 및 정제를 포함할 수 있다. 본 출원에서 플라스미드 DNA는 본 출원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 에피토프 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터 DNA일 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 재조합 아데노바이러스 벡터는 E 영역 유전자, 예를 들어 E1, E3, E5, 또는 이들의 조합이 결여될 수 있다. 내인성 바이러스 유전자의 결실은 관심 있는 유전자, 예를 들어 본 출원에 기재된 폴리펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 게놈 공간을 제공할 수 있다. 한 예로서, E1-결실된 재조합 아데노바이러스 벡터는 시험관내 연결 방법 또는 상동성 재조합 방법에 의해 구성될 수 있다.
시험관내 연결 방법은 우측 역전된 말단 반복부(ITR), 팩케이징 신호 및 E1 인핸서 서열을 가진 Ad의 좌측 단부를 함유하는 플라스미드 및 전체 아데노바이러스 DNA 게놈을 이용할 수 있다. 관심 있는 유전자, 예를 들어 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 플라스미드의 바이러스 서열의 하류 내에 삽입될 수 있는 후, 관심 있는 유전자 및 바이러스 서열을 함유하는 단편은 잘라내 지고, 및 제한 부위에 연결되고, 바이러스 E1 영역의 일부분을 대체함으로써 재조합 아데노바이러스 DNA 벡터를 생성할 수 있다.
또한, 대안적으로, 재조합 아데노바이러스 벡터는 상동성 재조합 방법을 이용하여 제조될 수도 있다. 생체 내에서 재조합하는 중첩 단편을 가진 2개 이상의 플라스미드가 사용될 수 있다. 예시적인 제1 플라스미드는 DNA 팩케이징 영역 및 E1 영역이 결실된 전체 아데노바이러스 게놈을 함유할 수 있다. 예시적인 제2 플라스미드(셔틀 벡터)는 우측 ITR, 팩케이징 신호, 제1 플라스미드와의 중첩 서열을 함유할 수 있다. 관심 있는 유전자, 예를 들어 본 출원에 기재된 폴리펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드가 제2 플라스미드 내로 도입될 수 있는데, 그 후, 2개의 플라스미드는 재조합 세포 내로 동시 형질감염될 수 있다. 세포 내에서, 상동성 재조합은 제1 및 제2 플라스미드 사이에서 일어남으로써, 재조합 아데노바이러스 벡터를 생성할 수 있다. 상동성 재조합에 대한 세포의 비제한적인 예는 효모, 박테리아, 및 포유류 세포주, 예를 들어 293 세포, 293T 세포, 헤라 세포를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 재조합 세포로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 재조합 과정은 시험관 내에서 수행될 수 있다.
아데노바이러스 기반 백신을 생성하는 방법은 정제된 플라스미드 DNA를 이용하는 숙주 세포의 형질감염을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, DNA 플라스미드, 예를 들어 재조합 아데노바이러스 벡터는 형질감염 전에 선형화된다. 몇몇 경우에, 형질감염은 아데노바이러스 플라크를 생성할 수 있다.
몇몇 경우에, 재조합 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스의 복제를 매개할 수 있는 E1 유전자가 결여되어 있다. 따라서, 몇몇 경우에, 재조합 아데노바이러스가 복제하도록 하기 위해 E1 유전자를 보충할 필요가 있다. 몇몇 경우에, 아데노바이러스 감염을 이용하여 생성되고, 및 게놈 내에 E1 유전자를 보유하는 293 세포주가 사용될 수 있다. 또한, E1 유전자 생성물을 생성하도록 조작된 다른 세포주가 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 또한, 몇몇 경우에, 다른 바이러스 게놈 요소를 함유하는 DNA 단편 또는 하나 이상의 헬퍼 바이러스가 재조합 아데노바이러스의 생성을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 헬퍼 바이러스는 바이러스 팩케이징을 위한 팩케이징 신호를 제공할 수 있고, 한편 재조합 바이러스 벡터는 팩케이징 신호가 결여될 수 있다. 대안적으로, 팩케이징 신호를 함유하는 DNA 단편은 재조합 아데노바이러스의 생성을 위해 숙주 세포 내로 동시 형질감염될 수 있다. 재조합 아데노바이러스 벡터의 생성을 위한 게놈 물질을 부여하는 본 출원에 기재된 하나 이상의 플라스미드 벡터 또는 헬퍼 바이러스는 리포터 유전자, 선택 마커, 또는 바이러스의 생성을 위해 유용할 수 있는 임의의 다른 유전자를 포함할 수 있다.
세포 형질감염은 당해 기술분야의 통상의 기술자가 이용할 수 있는 임의의 형질감염 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 형질감염 방법은 전기천공법, 미세주입, 인산칼슘 침전, 양이온성 중합체, 덴드리머, 리포좀, 미세투사물 충격, 퓨진(fuGene), 직접 초음파 로딩, 세포 스퀴징, 광학적 형질감염, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 뉴클레오펙션(nucleofection), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
아데노바이러스 기반 백신을 생성하는 방법은 바이러스의 단리 및 증폭을 추가로 포함할 수 있다. 바이러스의 단리는 아데노바이러스 플라크를 단리하는 것을 포함하는데, 이는 플라크의 스크리닝을 수반할 수 있다. 몇몇 경우에, 스크리닝은 바이러스 핵산의 서열결정에 의해 수행될 수 있다. 몇몇 경우에, 플라크는 완전하고 변경되지 않은 트랜스유전자 서열에 대해 스크리닝될 수 있다. 올바른 플라크는 연속적으로 더 많은 수의 세포의 감염에 의해 추가로 증폭될 수 있다. 상기 방법은 감염된 세포를 단리하는 것, 및 경우에 따라 감염된 세포를 용해시키는 것을 추가로 포함할 수 있는데, 바이러스 입자의 정제가 수반될 수 있다. 정제는 여러 가지 방법, 예를 들어 한외원심분리 및 투석에 의해 수행될 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 상기 방법은, 예를 들어 플라크 어세이에 의해 감염성 역가를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어 자외선 흡수 측정에 의해 바이러스 입자 농도를 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 기반 백신은 비경구 전달 방법을 통해 개체에 전달될 수 있다. 비경구 전달은 정맥내, 경피, 경구, 담관내, 뇌실질내, 간동맥내, 간문맥내, 종양내, 또는 경정맥 전달을 포함할 수 있다. 종종, 비경구 전달은 재조합 바이러스 기반 백신의 전달을 위한 바늘(예를 들어, 피하주사 바늘)을 이용할 수 있다. 재조합 바이러스 기반 백신은 수용액, 예를 들어 염수 중에서 제형화될 수 있다. 종종, 비경구 전달은 전달 방법으로서 공압 주사를 이용할 수 있다. 상기 재조합 바이러스 기반 백신은 수용액으로서 제형화될 수 있다.
또한, 재조합 바이러스 기반 백신은 국소 전달 방법에 의해 개체에게 전달될 수 있다. 백신은 감염된 부위, 예를 들어 비강에 직접 도포될 수 있다.
항체 기반 백신
본 출원에서, 본 출원에 기재된 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 결합하는 실체(entity)를 포함할 수 있는 항체 기반 백신이 제공된다. 항체 기반 백신은 인플루엔자 감염에 대해 사용될 수 있다. 상기 실체는 항체일 수 있다.
항체 기반 백신은 적합한 임의의 기법, 담체, 및 부형제를 이용하여 제형화될 수 있다. 항체는 천연 항체, 키메라 항체, 인간화 항체일 수 있거나, 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 서열번호 1-94로부터 선택된 하나 이상의 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열을 인식할 수 있다. 항체는 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열에 대해 최대 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 상동성 또는 동일성을 보유하는 서열을 인식할 수 있다. 항체는 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 상동성 또는 동일성을 보유하는 서열을 인식할 수 있다. 항체는 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열의 서열 길이의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%, 또는 그 초과의 서열 길이를 인식할 수 있다. 항체는 서열번호 1-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열 또는 표 1, 표 2, 또는 표 3으로부터 선택된 서열의 서열 길이의 최대 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%, 또는 그 초과의 서열 길이를 인식할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스의 다수의 균주 유래의 에피토프를 인식한다.
항체는 완전히 어셈블링된 항체, 항원을 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 단일 사슬 항체, 디아바디, 항체 키메라, 하이브리드 항체, 이중특이성 항체, 인간화 항체 등), 및 상기를 포함하는 재조합 펩티드를 포함할 수 있다.
항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체의 제조는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 및 공지된 기법에 따라 흑색종 세포와 항원에 감작된 숙주 유래의 비장 세포를 융합하거나, 또는 상기 비장 세포를 불멸화하기 위해 적합한 형질전환 벡터로 형질전환함으로써 수행할 수 있다. 상기 세포는 선택 배지에서 배양되고, 클로닝되고, 및 스크리닝되어 지정된 항원을 결합하는 모노클로날 항체를 선택할 수 있다. 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체의 제조에 대한 다수의 참고문헌을 참조할 수 있다.
천연 항체(천연 면역글로불린)는 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질일 수 있고, 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성될 수 있다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결될 수 있고, 이황화 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 중에서 달라질 수 있다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 브리지를 보유할 수 있다. 각각의 중쇄는 하나의 단부 가변 도메인(VH), 잇달아 다수의 불변 도메인을 보유한다. 각각의 경쇄는 단부에 가변 도메인(VL) 및 그의 다른 단부에 불변 도메인을 보유할 수 있고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬될 수 있고, 및 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 불변 도메인과 정렬될 수 있다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 인터페이스를 형성할 수 있다.
가변 영역은 항원-결합 특이성을 부여할 수 있다. 몇몇 경우에, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 둘 다 내의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라 칭하는 3개의 세그먼트에 집중될 수 있다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 프레임웍(FR) 영역 내에 위치될 수 있다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 4개의 FR 영역을 포함할 수 있는데, 이들은 거의 루프 연결을 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된 β-병풍-시트 배치를 채용하고, 및 몇몇 경우에 β-병풍-시트 배치의 부분을 형성한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 영역과 근접하여 서로 유지될 수 있고, 및 다른 사슬 유래의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여할 수 있다. 몇몇 경우에, 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관련되지 않지만, 여러 가지 효과기 작용, 예를 들어 Fc 수용체(FcR) 결합, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여, 보체 의존성 세포독성의 개시, 및 비만 세포 탈과립화를 나타낼 수 있다.
초가변 영역은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미할 수 있다. 초가변 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDR 유래의 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프" 유래의 그들 잔기를 포함할 수 있다. 프레임웍 또는 FR 잔기는 본 출원에 고려되는 바와 같이 초가변 영역 잔기 이외의 그들 가변 도메인 잔기일 수 있다.
항체 단편은 무손상 항체의 일부분, 예를 들어 항원-결합 부분 또는 무손상 항체의 가변부를 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab, F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 미니바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다. 항체의 파파인 분해는 Fab 단편이라 칭하는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성할 수 있는데, 각각은 단일 항원-결합 부위, 및 잔여 Fc 단편을 보유하는데, 그들의 명칭은 용이하게 결정화할 수 있는 그들의 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 보유하는 F(ab')2 단편을 생성하는데, 이는 여전히 항원을 가교결합할 수 있다.
Fv는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편일 수 있다. 이 영역은 견고한 비공유 결합되는 하나의 중쇄- 및 하나의 경쇄-가변 도메인의 이량체로 구성될 수 있다. 이러한 배치에서 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 규정하기 위해 상호 작용할 수 있다. 종합적으로, 6개의 CDR은 항체에게 항원-결합 특이성을 부여할 수 있다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)은, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화성에도 불구하고, 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 보유할 수 있다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CHI)을 함유할 수 있다. Fab 단편은, 항체 힌지 영역 유래의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CHI 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기의 첨가에 의해 Fab' 단편과 상이할 수 있다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'을 위해 본 출원에서 사용될 수 있다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편의 중쇄 이황화 브리지를 환원시킴으로써 생성될 수 있다. 또한, 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종 유래의 항체(면역글로불린)의 경쇄는 2개의 명확하게 구분되는 2개의 유형 중 하나에 할당되는데, 상기 2개의 유형은 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭한다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 할당될 수 있다. 인간 면역글로불린의 5개의 중요한 부류는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM을 포함하고, 및 이들 중 몇 개는 하위부류(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 칭한다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배치는 널리 알려져 있다. 상이한 이소타입은 상이한 효과기 기능을 보유할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgGl 및 IgG3 이소타입은 ADCC(항체 의존성 세포-매개 세포독성) 활성을 보유할 수 있다.
모노클로날 항체는 임의의 적합한 종, 예를 들어 뮤린, 래빗, 양, 염소, 또는 인간 모노클로날 항체로부터 수득될 수 있다.
조성물, 예를 들어 백신은 대략 또는 적어도 또는 최대 5, 10, 25, 50 또는 100개의 상이한 항체를 포함할 수 있다.
항원 제시 세포(APC) 기반 백신
본 출원에 기재된 폴리펩티드를 제시하는 APC 기반 백신이 본 출원에서 제공된다. APC 기반 백신은 인플루엔자 감염에 대해 사용될 수 있다. APC 기반 백신은 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이 및 적합한 것으로 공지된 임의의 기법, 담체, 및 부형제를 이용하여 제형화될 수 있다. APC는 단핵구, 단핵구-유래 세포, 대식세포, 및 수지상 세포를 포함할 수 있다. 종종, APC 기반 백신은 수지상 세포 기반 세포일 수 있다.
수지상 세포(DC) 기반 백신은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 경우에, 수지상 세포 기반 백신은 생체외 또는 생체내 방법을 통해 제조될 수 있다. 생체외 방법은 환자에게 투여 이전에 DC를 활성화하거나 또는 로딩하기 위해, 본 출원에 기재된 폴리펩티드를 이용하여 생체 외에서 펄스된 자가 DC의 이용을 포함할 수 있다. 생체내 방법은 본 출원에 기재된 펩티드와 커플링된 항체를 이용하여 특정 DC 수용체를 타겟팅하는 것을 포함할 수 있다. DC 기반 백신은 DC 활성화제, 예를 들어 TLR3, TLR-7-8, 및 CD40 작용제를 추가로 포함할 수 있다. DC 기반 백신은 면역증강제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
바이러스 기반 백신
바이러스 기반 백신은 생 바이러스 또는 불활성화된 바이러스에 기초하여 생성될 수 있다. 바이러스는 본 출원에 기재된 임의의 서열을 포함하는 하나 이상의 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 생 바이러스에 기초한 백신은 약독화된 바이러스, 또는 저온 적응될 수 있는 바이러스를 이용할 수 있다. 불활성화된 바이러스에 기초한 백신은 전체 비리온, 분할 비리온, 또는 정제된 표면 항원(예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 유래의 HA 및/또는 N)을 포함할 수 있다. 바이러스를 불활성화시키기 위한 화학적 수단은 하기 제제 중 하나 이상의 유효량으로 처리하는 것을 포함할 수 있다: 세정제, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 메틸렌블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌(C60), 바이너리 에틸아민, 아세틸에틸렌이민, 또는 이들의 조합. 바이러스 불활성화의 비화학적 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 그 예로는 UV 광, 열 불활성화 또는 감마선 조사를 들 수 있다.
비리온은 여러 가지 방법에 의해 바이러스-함유 유체로부터 수확될 수 있다. 예를 들어, 정제 방법은 비리온을 파쇄하기 위한 세정제를 포함하는 선형 수크로오스 구배 용액을 이용하는 띠(zonal) 원심분리를 포함할 수 있다. 항원은, 투석여과에 의한 경우에 따른 희석 후, 정제될 수 있다.
분할 비리온은 "트윈-에테르" 분할 공정을 포함하는, 서브비리온을 제조하기 위해, 세정제(예를 들어, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, 트리톤 X-100, 트리톤 N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 테르기톨 NP9 등)를 이용하여 정제된 비리온을 처리함으로써 수득될 수 있다. 인플루엔자 바이러스를 분할하는 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 바이러스의 분할은 파쇄 농도의 분할제를 이용하여 감염성 또는 비감염성의 전체 바이러스를 파쇄하거나, 또는 단편화함으로써 수행될 수 있다. 파쇄는 바이러스 단백질의 완전한 또는 부분적인 가용화를 초래하여, 바이러스의 완전성을 변경시킬 수 있다. 분할제는 비이온성 또는 이온성(예를 들어, 양이온성) 계면활성제, 예를 들어 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실 당, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-클루카미드, 헤카멕(Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올에탄올, 4급 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 포스페이트, 세타블론(Cetavlon), 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시폴리옥시에탄올(예를 들어, 트리톤 계면활성제, 예를 들어 트리톤 X-100 또는 트리톤 N101), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(트윈 계면활성제), 폴리옥시에틸렌에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 등일 수 있다. 하나의 예시적인 분할 절차는 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데히드의 연속적인 효과를 이용할 수 있고, 및 분할은 초기 비리온 정제(예를 들어, 수크로오스 밀도 구배 용액 내에서) 중에 일어날 수 있다. 따라서, 분할 공정은 비리온-함유 물질의 정화(비-비리온 물질의 제거를 위해), 수확된 비리온의 농축(예를 들어, 흡착법, 예를 들어 CaHP04 흡착의 이용), 비-비리온 물질로부터 전체 비리온의 분리, 밀도 구배 원심분리 단계에서 분할제를 이용하는 비리온의 분할(예를 들어, 분할제, 예를 들어 나트륨 데옥시콜레이트를 함유하는 수크로오스 구배의 이용), 및 이어서 원하지 않는 물질을 제거하게 위한 여과(예를 들어, 한외여과)를 포함할 수 있다. 분할 비리온은 인산나트륨 완충처리된 염화나트륨 용액에 유용하게 재현될 수 있다. BEGRIVACTM, FLUARIXTM, FLUZONETM, 및 FLUSHIELDTM 제품은 분할 백신이다.
정제된 표면 항원 백신은 인플루엔자 표면 항원 해마글루티틴 및 또한 전형적으로 뉴라미니다아제를 포함할 수 있다. 이들 단백질을 정제된 형태로 제조하기 위한 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. FLUVIRINTM, AGRIPPALTM, 및 INFLUVACTM 제품이 그 예이다.
불활성화된 바이러스 기반 백신은 비로좀(무핵산 바이러스 유사 리포좀 입자)을 포함할 수 있다. 비로좀은 인플루엔자 바이러스를 세정제로 가용화한 후, 뉴클레오캡시드의 제거 및 바이러스 당단백질을 함유하는 막의 재구성에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비로좀은 그들의 막 내의 바이러스 단백질을 가진 리포좀을 수득하기 위해, 과량의 인지질에 바이러스 막 당단백질을 첨가함으로써 제거될 수 있다.
약학 조성물 및 투여
본 출원에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 제공하기 위해 사용될 수 있는 약학 조성물이 제공된다. 본 개시의 특정 관점에서, 약학 조성물은 백신일 수 있다.
조성물은 본 출원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드, 핵산, 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편), APC, 또는 바이러스 또는 이들의 조합, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터를 위한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 조성물은 염 농도, 삼투압, pH, 소수성/친수성, 및 용해도를 들 수 있으나 이들로 제한되지 않는 적절한 물리적 또는 화학적 특성을 유지하기 위한 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 증강된 전달을 위한 적합한 투과 증강제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터의 면역원성을 증강시킬 수 있는 적합한 면역증강제(들)를 추가로 포함할 수 있다.
제형
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 조성물의 의도된 투여 경로에 부분적으로 기초하여 제형화될 수 있다. 조성물, 예를 들어 백신은 본 출원에 기재된 하나 이상의 펩티드, 핵산, 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편), APC, 바이러스, 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다. 하나 이상의 면역증강제와 함께 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 이용하여 종래의 방법으로 제형화될 수 있는데, 상기 담체는, 예를 들어 투여될 수 있는 제제로 하나 이상의 활성제의 가공을 가능하게 하는 부형제, 희석제, 및/또는 보조제를 포함한다. 본 출원에 기재된 하나 이상의 활성제는 본 출원에 기재된 다수의 투여 경로 또는 투여 모드, 예를 들어 경구, 설하, 국소, 직장, 경피, 경점막, 피하, 정맥내, 및 근육내 적용뿐만 아니라 흡입을 이용하여 개체에게 전달될 수 있다.
본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 현탁액, 시럽, 또는 엘릭시르와 같은 액상 제제일 수 있다. 또한, 조성물, 예를 들어 백신은 멸균 현탁액 또는 에멀젼과 같은 비경구, 피하, 피부내, 근육내, 또는 정맥내 투여(예를 들어, 주사 가능한 투여)를 위한 제제일 수 있다. 몇몇 경우에, 수성 용액은 현상태 사용을 위해 포장되거나, 또는 동결건조될 수 있고, 및 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다. 조성물, 예를 들어 백신은 용액 또는 현탁액으로서 전달될 수 있다. 일반적으로, 젤리, 크림, 로션, 좌약 및 연고와 같은 제형은 하나 이상의 활성제에 대해 더 연장된 노출을 가진 부분을 제공할 수 있는 반면, 용액, 예를 들어 스프레이 제형은 더 즉시적이고, 단기간의 노출을 제공할 수 있다.
흡입(예를 들어, 코 투여 또는 경구 흡입)을 위한 제형
본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 환자의 비강에 의해 투여될 수 있다. 담체가 고체인, 코 투여를 위해 적합한 제형은 코로 들이마시는 방식, 예를 들어 코에 가까이 유지된 분말 용기로부터 비강을 통한 신속한 흡입에 의해 투여될 수 있는 입자 크기, 예를 들어 약 10 내지 약 500 미크론을 보유하는 조분말을 포함할 수 있다. 상기 제형은 코 스프레이, 코 드롭이거나, 또는 분무기에 의한 에어로졸 투여에 의해 투여될 수 있다. 제형은 백신의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 에어로졸 제제로서 제형화될 수 있다. 에어로졸 제제는, 예를 들어 에어로졸 용액, 현탁액 또는 건조 분말일 수 있다. 에어로졸은 호흡계 또는 비강을 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 적합한 담체, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 추진체 내에 현탁되거나 또는 용해될 수 있고, 및 비강 스프레이 또는 흡입체를 이용하여 폐 내로 직접 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 활성제를 포함하는 에어로졸 제제는, 예를 들어 코 스프레이 또는 흡입체로서 투여하기 위해 추진체 또는 용매와 추진체의 혼합물 내에 용해되거나, 현탁되거나, 또는 유화될 수 있다. 에어로졸 제제는 화장용으로 또는 피부학적으로 또는 약학적으로 허용 가능한 추진체와 같은 압축된 임의의 허용 가능한 추진체를 함유할 수 있다.
코 투여를 위한 에어로졸 제제는 드롭 또는 스프레이로 비강으로 투여되도록 디자인된 수용액일 수 있다. 코 용액은, 등장성이고 및 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 유지하기 위해 약간 완충처리될 수 있다는 점에서 코 분비물과 유사하다. 몇몇 경우에, 이러한 범위 밖의 pH 값이 사용될 수 있다. 또한, 항균제 또는 보존제가 상기 제형에 포함될 수 있다.
흡입을 위한 에어로졸 제제는, 하나 이상의 활성제가, 코 또는 경구 호흡기 경로에 의해 투여되는 경우, 개체의 호흡기로 전달되도록 디자인될 수 있다. 흡입 용액은 예를 들어 분무기에 의해 투여될 수 있다. 미세 분말 또는 액상 약물을 포함하는 흡입제 또는 취입제는, 예를 들어 분출(disbursement)을 보조하기 위한 추진체 내의 제제 또는 제제의 조합의 용액 또는 현탁액의 약학적 에어로졸로서 호흡기에 전달될 수 있다. 추진체는, 할로카본, 플루오로탄소, 예를 들어 불화 염화 탄화수소, 하이드로클로로플루오로타소, 및 하이드로클로로탄소뿐만 아니라 탄화수소 및 탄화수소 에테르를 포함하는 액화 가스일 수 있다.
할로카본 추진체는, 모든 수소가 불소로 대체된 플루오로탄소 추진체, 모든 수소가 염소 및 적어도 하나의 불소로 대체된 클로로플루오로탄소 추진체, 수소-함유 플루오로탄소 추진체, 및 수소-함유 클로로플루오로탄소 추진체를 포함할 수 있다. 탄화수소 추진체는 예를 들어 프로판, 이소부탄, n-부탄, 펜탄, 이소펜탄, 및 네오펜탄을 포함할 수 있다. 또한, 탄화수소의 블렌드가 추진체로서 사용될 수 있다. 에테르 추진체는, 예를 들어 디메틸에테르뿐만 아니라 에테르를 포함한다. 또한, 에어로졸 제제는 하나 이상의 추진체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 에어로졸 제제는 2개 이상의 플루오로탄소와 같은 동일한 클래스 유래의 하나 이상의 추진체; 또는 플루오로탄화수소 및 탄화수소와 같은 상이한 클래스 유래의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상의 추진체를 포함할 수 있다. 또한, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 압축 가스, 예를 들어 불활성 가스, 예를 들어 이산화탄소, 아산화질소, 또는 질소를 이용하여 조제될 수 있다.
또한, 에어로졸 제형은 다른 성분, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜뿐만 아니라 계면활성제 또는 다른 성분, 예를 들어 오일 및 세정제를 포함할 수 있다. 이들 성분은 제형을 안정화시키고/거나 밸브 성분을 윤활하는 작용을 할 수 있다.
에어로졸 제형은 압축하여 포장될 수 있고, 및 용액, 현탁액, 에멀젼, 분말, 및 반고체 제제를 이용하는 에어로졸로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 용액 에어로졸 제형은 (실질적으로) 순수한 추진체 또는 추진체와 용매의 혼합물 내의 활성제의 용액을 포함할 수 있다. 용매는 하나 이상의 활성제를 용해시키고/거나 추진체의 증발을 지연시키기 위해 사용될 수 있다. 용매는 예를 들어 물, 에탄올, 및 글리콜을 포함할 수 있다. 적합한 용매의 임의의 조합이 사용될 수 있고, 경우에 따라 보존제, 항산환제 및/또는 다른 에어로졸 성분과 조합될 수 있다.
에어로졸 제형은 분산액 또는 현탁액일 수 있다. 현탁액 에어로졸 제형은 하나 이상의 활성제, 예를 들어 펩티드 및 분산제의 현탁액을 포함할 수 있다. 분산제는, 예를 들어 소르비탄 트리올리에이트, 올레일 알코올, 올레산, 레시틴, 및 옥수수유를 포함할 수 있다. 또한, 현탁액 에어로졸 제형은 윤활제, 보존제, 항산화제, 및/또는 다른 에어로졸 성분을 포함할 수 있다.
에어로졸 제형은 유사하게 에멀젼으로서 제형화될 수 있다. 에멀젼 에어로졸 제형은, 예를 들어 알코올, 예를 들어 에탄올, 계면활성제, 물, 및 추진체뿐만 아니라 활성제 또는 활성제, 예를 들어 하나 이상의 펩티드의 조합을 포함할 수 있다. 사용된 계면활성제는 비이온성, 음이온성, 또는 양이온성일 수 있다. 에멀젼 에어로졸 제제의 한 예는 예를 들어 에탄올, 계면활성제, 물, 및 추진체를 포함한다. 에멀젼 에어로졸 제형의 다른 예는 예를 들어 식물성 오일, 글리세릴 모노스테아레이트 및 프로판을 포함한다.
비경구 투여를 위한 제형
하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물, 예를 들어 백신은 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있고, 및 앰플, 미리 충전된 주사기, 소량 부피의 주입제의 단위 투여 형태로, 또는 첨가된 보존제와 함께 다중투여 용기로 제시될 수 있다. 상기 조성물은 그러한 형태를 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼으로서, 예를 들어 수성 폴리에틸렌글리콜 내의 용액으로서 투여될 수 있다.
주사 가능한 제형의 경우, 비히클은 적합한 것으로 당해 기술분야에 공지된 것들, 예를 들어 수용액 또는 오일 현탁액, 또는 참깨유, 옥수수유, 면실유, 또는 땅콩유뿐만 아니라 엘릭시르, 만니톨, 덱스트로오스와의 에멀젼, 또는 멸균 수용액, 및 유사한 약학적 비히클로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 제제는 생체적합성, 생분해성인 중합체 조성물, 예를 들어 폴리(락트-코-글리콜)산을 포함할 수 있다. 이들 물질은 약물이 로딩되고, 및 추가로 코팅되거나, 또는 뛰어나 지속 방출 성능을 제공하기 위해 유도체화된 마이크로 또는 나노구로 제조될 수 있다. 눈 주위 또는 안내 주사에 적합한 비히클은 예를 들어 주사 등급수, 리포좀, 및 친유성 물질에 적합한 비히클 및 당해 기술분야에 공지된 것 내의 활성제의 현탁액을 포함한다.
비경구 주사는 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 및 심장내 투여를 포함할 수 있다. 피하 투여는 피하조직 내로의 볼루스로서 투여될 수 있다. 인간 개체 상에서 피하 주사 부위는 상완, 복부, 허벅지 앞부분, 등 상부, 엉덩이 상부를 포함할 수 있다. 근육내 투여는 근육 내로의 직접적인 주사일 수 있다. 근육내 주사 부위는 삼각근, 배둔근, 대퇴직근, 외측광근, 및 복부둔근을 포함할 수 있다. 정맥내 투여는 액체 제제의 정맥 내로의 직접 전달일 수 있다. 정맥내 투여는 말초 정맥(예를 들어, 팔, 손, 다리 및 발의 정맥) 또는 중앙 정맥(예를 들어, 상대정맥, 하대정맥, 및 심장의 우심방)에 적용될 수 있다. 복강내 투여는 복강 내로의 주사일 수 있다. 심장내 투여는 심근 또는 심실 내로의 직접 주사일 수 있다.
종종, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 인간과 같은 포유류 개체에게 정맥내 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 정맥내 투여를 위한 조성물, 예를 들어 백신은 멸균 등장성 수성 완충제 내의 용액일 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 경감하기 위한 국부 마취제, 예를 들어 리도카인을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 별개로 또는 함께 혼합된 단위 투여 형태, 예를 들어 기밀하게 밀봉된 용기, 예를 들어 앰플 또는 샤체트(sachette) 내의 무수 동결건조 분말 또는 물을 함유하지 않는 농축물로서 공급될 수 있는데, 상기 앰플 또는 샤체트에는 활성제의 양이 표시되어 있다. 상기 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 약학적 등급수를 함유하는 주입 병으로 이용하여 분배될 수 있다, 상기 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사를 위한 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공되어, 상기 성분들은 투여 이전에 혼합될 수 있도록 한다.
주사에 의해 투여되는 경우, 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물, 예를 들어 백신은 수용액, 구체적으로 생리학적으로 상용성인 완충제, 예를 들어 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적 염수 완충제 내에서 제형화된다. 상기 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁제, 안정화제, 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 활성제는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 발열원을 함유하지 않는 멸균수를 이용하는 구성을 위한 분말 형태일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 면역증강제 또는 활성제에 의해 자극된 면역 반응을 증강시키기 위해 첨가된 임의의 다른 물질을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 활성제에 대한 면역 반응을 억제하는 물질을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 활성제는 데포(depot) 제제로서 제형화될 수 있다. 그러한 장기 작용 제제는 이식 또는 경피 전달(예를 들어, 피하로 또는 근육내로), 근육내 주사 또는 경피 패치의 이용에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 하나 이상의 활성제는 적합한 중합성 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용 가능한 오일 내의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지를 이용하여, 또는 약간 가용성의 유도체, 예를 들어 약간 가용성 염으로서 제형화될 수 있다.
국소 투여를 위한 제형
본 개시의 특정 관점에서, 본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은, 국소적으로 투여되는 경우, 또는 특정 감염 부위에 또는 그 주위에 주입되는 경우, 국부 및 영역 효과를 나타내는 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 점성 액체, 용액, 현탁액, 디메틸설폭사이드(DMSO)계 용액, 리포좀 제제, 겔, 젤리, 크림, 로션, 연고, 좌약, 폼, 또는 에어로졸 스프레이의 직접적인 국소 적용은 예를 들어 국부 및/또는 영역 효과를 생성하기 위해, 국부 투여를 위해 사용될 수 있다. 그러한 제형을 위한 약학적으로 적합한 비히클은 예를 들어 저급 지방족 알코올, 폴리글리콜(예를 들어, 글리세롤 또는 폴리에틸렌글리콜), 지방산의 에스테르, 오일, 지방, 실리콘 등을 포함한다. 또한, 그러한 제제는 보존제(예를 들어, p-히드록시벤조산 에스테르) 및/또는 항산화제(예를 들어, 아스코르브산 및 토코페롤)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 활성제를 포함하는 국부/국소 제제는 상피 또는 점막 바이러스 감염을 치료하기 위해 사용된다.
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 피부학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다. 그러한 담체는 피부, 손톱, 점막, 조직, 및/또는 모발과 상용성이고, 및 이들 요구조건을 충족하는 임의의 피부학적 담체를 포함할 수 있다. 그러한 담체는 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 피부 연고의 제형화에 있어서, 하나 이상의 제제는 유지성 탄화수소 기제, 무수 흡수 기제, 유중수 흡수 기제, 수중유 수-제거성 기재 및/또는 수용성 기제 내에서 제형화될 수 있다. 그러한 담체 및 부형제의 예는 습윤제(예를 들어, 우레아), 글리콜(예를 들어, 프로필렌글리콜), 알코올(예를 들어, 에탄올), 지방산(예를 들어, 올레산), 계면활성제(예를 들어, 이소프로필 미리스테이트 및 나트륨 라우릴 설페이트), 피롤리돈, 글리세롤 모노라우레이트, 설폭사이드, 테르펜(예를 들어, 멘톨), 아민, 아미드, 알칸, 알칸올, 물, 탄산칼슘, 인산칼슘, 여러 가지 당류, 전분, 셀룰로오스 유도체, 겔라틴, 및 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.
연고 및 크림은 예를 들어 적합한 증점제 및/또는 겔화제의 첨가와 함께 수성 또는 유성 기제를 이용하여 제형화될 수 있다. 로션은 수성 또는 유성 기제를 이용하여 제형화될 수 있고, 및 또한 일반적으로 하나 이상의 유화제, 안정화제, 분산제, 현탁제, 증점제, 또는 착색제를 함유할 것이다. 약학적 제제의 전달을 위한 경피 패치의 구성 및 용도는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 그러한 패치는 약학적 제제의 연속적인, 박동의, 또는 맞춤형 전달을 위해 구성될 수 있다.
조성물 및 투여 형태를 형성하기 위해 사용될 수 있는 활택제는 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 광유, 경질 광유, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌글리콜, 다른 글리콜, 스테아르산, 나트륨 라우릴 설페이트, 탈크, 수소화된 식물성 오일(예를 들어, 땅콩유, 면실유, 해바라기씨유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유, 및 대두유), 스테아르산아연, 에틸 올리에이트, 에틸 라우레이트, 한천, 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가의 활택제는, 예를 들어 실로이드 실리카겔, 합성 실리카의 응고된 에어로졸, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 활택제는 경우에 따라 상기 조성물의 약 1 중량% 미만의 양으로 첨가될 수 있다.
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 국소 적용을 위해 적합한 임의의 형태일 수 있는데, 그 예로는 수성, 수성-알코올성 또는 유성 용액, 로션, 또는 혈청 분산액, 수성, 무수 또는 유성 겔, 수성 상 내의 지방 상의 분산(O/W 또는 수중유) 또는 역으로 (W/O 또는 유중수)에 의해 수득된 에멀젼, 마이크로에멀젼 또는 대안으로 이온성 및/또는 비이온성 유형의 마이크로캡슐, 마이크로입자 또는 지질 소낭 분산액을 포함한다. 하나 이상의 활성제 이외에, 본 출원에 제공된 조성물의 여러 가지 성분들의 양은 당해 기술분야에서 사용된 것일 수 있다. 이들 조성물은 얼굴을 위한, 손을 위한, 신체를 위한 및/또는 점막을 위한, 또는 피부 세정을 위한 보호, 치료 또는 케어 크림, 밀크, 로션, 겔, 또는 폼을 구성할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비누 또는 세정 바를 구성하는 고체 제제를 구성할 수 있다.
국부/국소 적용을 위한 본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 항균 보존제, 예를 들어 4급 암모늄 화합물, 유기 수은 함유 화합물, p-히드록시 벤조에이트, 방향족 알코올, 클로로부탄올 등을 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 제제
종종, 본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다.
경구 투여를 위해, 본 출원에 제공된 바와 같은 조성물은 하나 이상의 활성제를 당해 기술분야에 공지된 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 그러한 담체는 활성제를 치료하려는 환자에 의한 경구 흡수를 위해 츄어블 정제를 포함하는 정제, 알약, 당제, 캡슐, 로젠지, 경질 캔디, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 분말, 현탁액, 엘릭시르, 웨이퍼 등으로 제형화될 수 있도록 한다. 그러한 제형은 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매체 및 여러 가지 비독성 유기 용매를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 고형 담체는 희석제, 향미제, 가용화제, 활택제, 현탁제, 결합제, 보존제, 정제 붕해제, 또는 캡슐화 물질로서 작용할 수도 있는 하나 이상의 물질일 수 있다. 분말에서, 담체는 미분 활성 성분과 혼합물인 미분 고체일 수 있다. 정제에서, 활성 성분은 일반적으로 적합한 비율로 원하는 결합 능력을 보유하는 담체와 혼합되고, 및 원하는 형상 및 크기로 압축된다. 분말 및 정제는 약 일(1) 내지 약 칠십(70)%의 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다. 적합한 담체는 탄산마그네슘, 스테아르산마그네슘, 탈크, 당, 락토오스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 겔라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 저 용융 왁스, 코코아 버터 등을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 하나 이상의 활성제는 원하는 단위의 투여량을 제공하기에 충분한 양으로, 경구 투여 형태의 총 조성물의 중량을 기준으로 약 0.5%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 또는 약 30% 내지 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 범위의 농도 레벨로 포함될 수 있다.
경구 사용을 위한 수성 현탁액은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예를 들어 현탁제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), 습윤제(예를 들어, 레시틴, 리소레시틴 및/또는 장쇄 지방 알코올)뿐만 아니라 착색제, 보존제, 향미제 등과 함께 하나 이상의 활성제를 함유할 수 있다.
오일 또는 비수성 용매는, 예를 들어 대형 친유성 모이어티의 존재로 인해 하나 이상의 활성제를 용액 내로 운반하기 위해 필요할 수 있다. 대안적으로, 에멀젼, 현탁액, 또는 다른 제제, 예를 들어 리포좀 제제가 사용될 수 있다. 리포좀 제제와 관련하여, 질환 치료용 리포좀을 제조하기 위한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 또한, 리간드는 특정 작용 부위에 이들 조성물을 유도하기 위해 리포좀에 부착될 수 있다.
경구용 약학 제제는 고체 부형제로서 수득될 수 있는데, 경우에 따라 생성되는 혼합물을 그라인딩하고, 과립의 혼합물을 가공하고, 필요에 따라 적합한 보조제를 첨가한 후 정제 또는 당제 코어를 수득할 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충전제, 예를 들어 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는 당; 향미제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸스 검, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PCP)과 같은 셀룰로오스 제제이다. 필요에 따라 붕해제가 첨가될 수 있는데, 그 예로는 가교된 폴리비닐피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 이의 염, 예를 들어 알긴산나트륨이다. 또한, 상기 제제는 지속 방출 제제로 제형화될 수 있다.
당제 코어는 적합한 코팅을 구비할 수 있다. 이 목적을 위해, 농축된 당 용액이 사용될 수 있는데, 이는 경우에 따라 아라비아검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌글리콜, 및/또는 이산화티탄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 색소는 정제 또는 당제 코팅에 첨가될 수 있는데, 이는 식별을 위해 또는 활성제의 상이한 조합을 특성화하기 위한 것이다.
경구적으로 사용될 수 있는 약학 제제는 겔라틴으로 제조된 푸시-핏 캡슐뿐만 아니라 겔라틴으로 제조된 연질의 밀봉된 캡슐 및 가소제, 예를 들어 글리세롤 또는 소르비톨을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 충전제, 예를 들어 락토오스, 결합제, 예를 들어 전분, 및/또는 활택제, 예를 들어 탈크 또는 스테아르산마그네슘, 및 경우에 따라 가소제와 함께 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성제는 적합한 액체, 예를 들어 지방 오일, 액상 파라핀, 또는 액상 폴리에틸렌글리콜 내에 용해 또는 현탁될 수 있다. 아울러, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 투여에 적합한 투여량일 수 있다.
경구 투여에 적합한 다른 형태는 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 수용액, 수성 현탁액을 포함하는 액체 형태의 제제, 또는 사용 직전에 액체 형태의 제제로 전환되도록 의도된 고체 형태 제제를 포함한다. 에멀젼은 용액, 예를 들어 수성 프로필렌 글리콜 용액으로 제조될 수 있거나, 또는 예를 들어, 유화제, 예를 들어 레시틴, 소르비탄 모노올리에이트, 또는 아카시아를 함유할 수 있다. 수용액은 활성 성분을 물에 용해시키고, 및 적합한 착색제, 향미제, 안정화제, 및 증점제를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 미분 활성 성분을 점성 물질, 예를 들어 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 및 다른 널리 알려진 현탁제와 함께 물에 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물과 함께 투여될 수 있는 적합한 충전제 또는 담체는 한천, 알코올, 지방, 락토오스, 전분, 셀룰로오스 유도체, 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 실리카, 멸균 염수 등, 또는 적합한 양으로 사용된 이의 혼합물을 포함한다. 고체 형태 제제는 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함하고, 및 활성 성분 이외에 착색제, 향미제, 안정화제, 완충제, 인공 및 천연 감미제, 분산제, 증점제, 가용화제 등을 함유할 수 있다.
시럽 또는 현탁액은 활성 화합물을 임의의 보조적인 성분에 투여될 수 있는 당, 예를 들어 수크로오스의 농축된 수용액에 첨가하여 제조될 수 있다. 그러한 보조적인 성분은 향미제, 당의 결정화를 지연시키기 위한 제제, 또는 임의의 다른 성분의 용해도를 증가시키기 위한 제제, 예를 들어 다가 알코올, 예를 들어 글리세롤 또는 소르비톨을 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해 화합물을 제형화하는 경우, 위장(GI)관으로부터 흡수를 증강시키기 위해 위유지성(gastroretentive) 제제를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 수 시간 동안 위 내에서 유지되는 제형은 활성제를 서서히 방출할 수 있고, 및 본 출원에서 사용될 수 있는 지속 방출을 제공할 수 있다. 팽창할 수 있고, 부유성이고, 및 생접착제 기법은 활성제의 흡수를 최대화하기 위해 이용될 수 있다.
눈 투여를 위한 제형
몇몇 예에서, 본 출원에 제공된 조성물은 눈을 통해 투여될 수 있는데, 예를 들어 안약으로 전달될 수 있다. 안약은 하나 이상의 활성제를 멸균 수용액, 예를 들어 생리적 염수, 완충 용액 등에 용해시키거나, 사용 전에 용해되어야 하는 분말 조성물을 조합함으로써 제조될 수 있다. 다른 비히클이 선택될 수 있는데, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 상기 비히클은 밸런스 염 용액, 염수 용액, 수용성 폴리에테르, 예를 들어 폴리에티렌 글리콜, 폴리비닐, 예를 들어 폴리비닐 알코올 및 포비돈, 셀룰로오스 유도체, 예를 들어 메틸셀룰로오스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 석유 유도체, 예를 들어 광유 및 백색 바셀린, 동물성 지방, 예를 들어 라놀린, 아크릴산의 중합체, 예를 들어 카르복시폴리메틸렌 겔, 식물성 지방, 예를 들어 땅콩유 및 다당류, 예를 들어 덱스트란, 및 글리코사미노글리칸, 예를 들어 나트륨 히알루로네이트를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 필요에 따라, 안약에 통상적으로 사용되는 첨가제가 첨가될 수 있다. 그러한 첨가제는 등장화제(예를 들어, 염화나트륨 등), 완충제(예를 들어, 붕산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨 등), 보존제(예를 들어, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 클로로부탄올 등), 증점제(예를 들어, 당류, 예를 들어 락토오스, 만니톨, 말토오스 등; 예를 들어 히알루론산 또는 그의 염, 예를 들어 히알루론산나트륨, 히알루론산칼륨 등; 예를 들어, 뮤코다당류, 예를 들어 황산콘트로이친 등; 예를 들어, 나트륨 폴리아크릴레이트, 카르복시비닐 중합체, 가교된 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸셀룰로오스, 히드록시 프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 또는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 제제)를 포함한다.
기타 제형
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 제공된 조성물은 귀 용액, 현탁액, 연고, 또는 삽입제로 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 좌약으로 투여하기 위해 제형화된다. 예를 들어, 저 용융 왁스, 예를 들어 트리글리세라이드, 지방산 글리세라이드, Witepsol S55(독일 소재의 다이나마이트 노벨 케미칼의 상표명)의 혼합물, 또는 코코아 버터는 제일 먼저 용융될 수 있고, 및 활성 성분은 예를 들어 교반에 의해 균질하게 분산될 수 있다. 이어서, 용융된 균질한 혼합물은 편리한 크기의 주형에 쏟아 붇고, 냉각하고, 및 고형화되도록 한다. 몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 질 투여를 위해 제형화된다. 몇몇 경우에, 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼, 또는 스프레이는 본 출원에 기재된 하나 또는 조성물, 예를 들어 백신을 함유한다.
성분, 예를 들어 담체, 부형제
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 담체 및 부형제(완충제, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 펩티드 또는 아미노산, 예를 들어 글리신, 항산화제, 박테리아 발육 저지제, 킬레이트제, 현탁제, 증점제 및/또는 보존제를 포함하나, 이들로 제한되지 않음), 물, 석유 오일, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등, 염수 용액, 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액, 향미제, 착색제, 탈점착 부여제 및 다른 적합한 첨가제, 면역증강제, 또는 결합제, 필요에 따라 생리적 조건을 유사하게 하기 위해 필요한 다른 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 pH 완충제, 긴장성 조정제, 유화제, 습윤제 등을 포함할 수 있다. 부형제의 예는 전분, 글루코오스, 락토오스, 겔라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 다른 예에서, 상기 조성물은 보존제를 실질적으로 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 적어도 하나의 보존제를 함유한다. 약학적 투여 형태에 대한 일반적인 방법론은 문헌[참조: Ansel et ah, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999))]에서 확인할 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 담체는 본 출원에 기재된 약학 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있지만, 담체의 유형은 투여 모드에 따라 달라질 수 있음이 인식될 것이다. 적합한 제형 및 추가의 담체는 본 출원에 전적으로 참고로 인용된 문헌[참조: Remington "The Science 및 Practice of Pharmacy"(20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore Md.)]에 기재되어 있다.
리포좀 및 미소구
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다. 또한, 생분해성 미소구는 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다.
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 리포좀 또는 미소구(또는 마이크로입자)로 투여될 수 있다. 환자에게 투여하기 위한 리포좀 및 미소구를 제조하기 위한 방법은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본 출원에 전적으로 참고로 인용된 미국 특허 번호 4,789,734는 리포좀 내에 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 방법을 기재한다. 상기 물질은 수용액에 용해되고, 필요에 따라 계면활성제와 함께 적합한 인지질 및 지질이 첨가되고, 경우에 따라 상기 물질은 투석 또는 초음파처리될 수 있다. 중합체 또는 단백질로 형성된 미소구는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 및 위장관을 통해 혈류 내로 직접 통과하기 위해 가공될 수 있다. 대안적으로, 상기 화합물은 혼입될 수 있고, 및 미소구 또는 미소구의 복합체는 수 일 내지 수 개월 범위의 시간에 걸친 느린 방출을 위해 이식될 수 있다.
보존제/멸균성
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 단일 투여(예를 들어, 면역화)를 위한 물질을 포함할 수 있거나, 또는 다중 투여(예를 들어, 면역화) (예를 들어, "다중투여" 키트)를 위한 물질을 포함할 수 있다. 상기 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 보존제, 예를 들어 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 백신은 수은이 함유된 물질을 실질적으로 포함하지 않는데(예를 들어, <10 μg/ml), 예를 들어 티오메르살을 포함하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, α-토코페롤 숙시네이트는 수은을 함유하는 물질의 대안으로서 사용된다. 보존제는 사용 중에 미생물 오염을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 보존제는 염화벤잘코늄, 티오메르살, 클로로부탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 페닐에틸 알코올, 에데테이트 이나트륨, 소르브산, 오나메르(Onamer) M, 또는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안과용 제품에서, 그러한 보존제는 0.004% 내지 0.02%의 레벨로 사용될 수 있다. 본 출원의 조성물에서, 보존제, 예를 들어 염화벤잘코늄은 0.001% 내지 0.01% 미만, 예를 들어 0.001% 내지 0.008%, 바람직하게는 약 0.005 중량%의 레벨로 사용될 수 있다. 0.005%의 염화벤잘코늄 농도는 미생물의 공격으로부터 본 출원에 제공된 조성물을 보존하기에 충분할 수 있다.
다중투여 조성물에 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로서(또는 아울러), 상기 조성물, 예를 들어 백신은 물질의 제거를 위한 무균 어댑터를 보유하는 용기 내에 함유될 수 있다.
몇몇 경우에, 본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 멸균성일 수 있다. 상기 조성물, 예를 들어 백신은 비-발열성일 수 있는데, 예를 들어 투여당 <1 EU(내독소 단위, 표준 측정)를 함유할 수 있고, 및 투여당 <0.1 EU일 수 있다. 상기 조성물, 예를 들어 백신은 당해 기술분야에 공지된 적합한 비히클 중의 멸균 용액 또는 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 상기 조성물, 예를 들어 백신은 종래의 공지된 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있는데, 예를 들어 상기 조성물은 여과 멸균될 수 있다.
염/삼투압
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 염을 포함한다. 긴장성을 제어하기 위해, 생리학적 염, 예를 들어 나트륨 염이 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신에 사용될 수 있다. 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산이나트륨, 및/또는 염화마그네슘 등을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 염과 함께 제형화된다. 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 염은 무기 이온, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 이온 등의 염을 포함할 수 있다. 그러한 염은 무기산 또는 유기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산, 메탄술폰산, p-톨렌설폰산, 아세트산, 푸마르산, 숙신산, 락트산, 만델산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 또는 말레산과의 염을 포함할 수 있다. 활성제(예를 들어, 폴리펩티드)가 카르복시기 또는 다른 산성 기를 함유하는 경우, 이는 무기 또는 유기 염기와의 약학적으로 허용 가능한 부가 염으로 전환될 수 있다. 적합한 염기의 예는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 시클로헥실아민, 디시클로헥실-아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있다.
조성물, 예를 들어 백신은 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 240-360 mOsm/kg, 또는 290-310 mOsm/kg 범위 내의 삼투압을 보유할 수 있다.
완충제/pH
본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 완충제, 예를 들어 트리스 완충제; 보레이트 완충제; 숙시네이트 완충제; 히스티딘 완충제(예를 들어, 수산화암모늄 면역증강제와 함께); 또는 시트레이트 완충제를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 완충제는 5-20 mM 범위로 포함된다.
본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 약 5.0 내지 약 8.5 사이, 약 6.0 내지 약 8.0 사이, 약 6.5 내지 약 7.5 사이, 또는 약 7.0 내지 약 7.8 사이의 pH를 보유한다.
세정제/계면활성제
본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 세정제 및/또는 계면활성제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(통상 "트윈(Tween)"이라 칭함), 예를 들어 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAXTM 상표명으로 시판되는 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO), 및/또는 부틸린 옥사이드(BO)의 공중합체, 예를 들어 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복하는 에톡시(옥시-l,2-에탄디일) 기의 수가 변할 수 있는 옥톡시놀, 예를 들어 옥톡시놀-9(트리톤 X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예를 들어 포스파티딜코린(레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예를 들어 TergitolTM NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제로 공지됨), 예를 들어 트리에틸렌그리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 및 소르비탄 에스테르(통상 "스팬(SPAN)"으로 공지됨), 예를 들어 소르비탄 트리올리에이트(스팬 85) 및 소르비탄 모노라루레이트, 옥톡시놀(예를 들어, 옥톡시놀-9(트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드("CTAB"), 또는 스플릿 또는 표면 항원 백신을 위한 나트륨 데옥시콜레이트를 포함한다. 하나 이상의 세정제 및/또는 계면활성제는 단지 미량으로 존재할 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 각각 1 mg/ml 미만의 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 비이온성 계면활성제가 본 출원에서 사용될 수 있다. 계면활성제는 그들의 "HLB"(친수성/친유성 밸런스)에 의해 분류될 수 있다. 몇몇 경우에, 계면활성제는 적어도 10, 적어도 15, 및/또는 적어도 16의 HLB를 보유한다.
몇몇 실시양태에서, 계면활성제의 혼합물, 예를 들어 트윈 80/스팬 85 혼합물이 조성물, 예를 들어 백신에 사용될 수 있다. 또한, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 옥톡시놀의 조합이 적합할 수 있다. 다른 조합은 라우레스 9 플러스 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함할 수 있다. 계면활성제의 양(중량%)은 0.01 내지 1%, 구체적으로 약 0.1%의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예를 들어, 트윈 80); 0.001 내지 0.1%, 구체적으로 0.005 내지 0.02%의 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예를 들어, 트리톤 X―100, 또는 다른 트리톤 계열의 세정제); 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10% 및 구체적으로 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%의 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들어, 라우레스 9)일 수 있다.
면역증강제
본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 면역증강제를 포함할 수 있다. 면역증강제는 백신을 수용하는 개체 내에서 유발된 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 종종, 면역증강제는 Th1-타입 반응을 유발시킬 수 있다. 몇몇 경우에, 면역증강제는 Th2-타입 반응을 유발시킬 수 있다. Th1-타입 반응은 IFN-γ와 같은 사이토카인의 생성을 특징으로 할 수 있는 반면, Th2-타입 반응은 IL-4, IL-5, 및 IL-10과 같은 사이토카인의 생성을 특징으로 한 수 있다.
지질 기반 면역증강제, 예를 들어 MPL 및 MDP는 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A(MPL)는 특이적인 T 림프구에 대한 리포좀 항원의 증가된 제시를 야기할 수 있는 면역증강제이다. 아울러, 또한 무마릴 디펩티드(MDP)도 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신과 조합되는 적합한 면역증강제로서 사용될 수 있다.
또한, 면역증강제는 자극성 분자, 예를 들어 사이토카인을 포함할 수 있다. 사이토카인의 비제한적인 예는 CCL20, α-인터페론(IFN-α), β-인터페론(IFN-β), γ- 인터페론, 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, 상피세포 성장 인자(EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선-발현된 케모카인(TECK), 점막-연관 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, IL-8, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, 돌연변이체 형태의 IL-18, CD40, CD40L, 맥관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 맥관 내피세포 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파아제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC 5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, 및 TAP2를 포함한다.
추가의 면역증강제는 MCP-1, MIPS-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, 돌연변이체 형태의 IL-18, CD40, CD40L, 맥관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 맥관 내피세포 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파아제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2 및 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
몇몇 경우에, 하나 이상의 면역증강제는 톨 유사 수용체의 조절자일 수 있다. 톨 유사 수용체의 조절자의 예는 TLR-9 작용제 및 TLR-2 작용제를 포함하고, 및 톨 유사 수용체의 소분자 조절자, 예를 들어 이미퀴모드(R837)로 제한되지 않는다. 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신에 사용될 수 있는 면역증강제의 다른 예는 사포닌, CpG ODN 등을 포함한다.
몇몇 경우에, 하나 이상의 면역증강제는 박테리아 톡소이드, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체, 알루미늄 염, 리포좀, CpG 중합체, 수중유 에멀젼, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
종종, 하나 이상의 면역증강제는 알루미늄 염(백반) 또는 이의 유도체에 기초할 수 있다. 예시적인 백반은 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 칼륨 황산알루미늄, 나트륨 황산알루미늄, 암모늄 황산알루미늄, 세슘 황산알루미늄, 또는 알루니늄과 수산화마그네슘의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 백반은 결정성 알루미늄 옥시히드록사이드(AIOOH)를 포함할 수 있다. 종종 AIOOH 면역증강제는 응집체를 형성하는 나노길이 스케일의 플레이트 유사 일차 입자로 구성될 수 있는데, 이는 상기 물질의 기능성 서브유닛을 나타낸다. 이들 응집체는 다공성일 수 있고, 직경이 약 1 내지 약 20 μm 범위인 불규칙한 형상을 보유할 수 있다. 항원과 혼합 시, 상기 응집체는 백신 전체에 흡수된 항원을 분포하기 위해 재응집할 수 있는 더 작은 단편으로 분해될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 면역증강제는 질서 정연한 막대 유사 AIO(OH) 나노입자를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 면역증강제는 수중유 에멀젼이다. 수중유 에멀젼은 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함할 수 있는데, 오일(들) 및 계면활성제(들)는 생분해성 및 생체적합성일 수 있다. 에멀젼 내의 오일 액적은 직경이 5 μm 미만일 수 있고, 및 심지어 미크론 이하의 직경을 보유할 수 있는데, 이들 작은 크기는 안정한 에멀젼을 제공하기 위한 미세유동화기를 이용하여 달성된다. 220 nm 미만의 크기를 가진 액적이 적합할 수 있는데, 그 이유는 여과 멸균을 수행할 수 있기 때문이다.
사용된 오일은 예를 들어, 동물(예를 들어, 어류) 유래의 오일 또는 식물 기원의 오일을 포함할 수 있다. 식물성 오일의 기원은 견과, 종자 및 곡물을 포함할 수 있다. 가장 통상적으로 이용할 수 있는 땅콩유, 대두유, 코코넛유 및 올리브유는 너트 오일을 예시한다. 예를 들어, 호호바 오일은 호호바 콩으로부터 얻을 수 있다. 종자유는 홍화유, 면실유, 해라바기씨유, 참깨유 등을 포함한다. 곡물 군은 옥수수유 및 다른 곡물 낟알, 예를 들어 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프, 라이밀 등을 포함할 수 있다. 종자유에 자연적으로 나타나지 않지만, 글리세롤의 6-10개의 탄소 지방산 및 1,2-프로판디올은 견과 및 종자유로부터 출발하여 적합한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유류 젖 유래의 지방 및 오일은 대사 가능할 수 있고, 및 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신에 사용될 수 있다. 동물 기원으로부터 순수한 오일을 수득하기 위한, 분리, 정제, 비누화 및 다른 수단을 위한 절차는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 어류는 용이하게 회수될 수 있는 대사 가능한 오일을 함유할 수 있다. 예를 들어, 대구간유, 상어간유, 및 고래 오일, 예를 들어 경랍은 본 출원에 사용될 수 있는 몇몇 어유를 예시할 수 있다. 다수의 분지된 오일은 5-탄소 이소프렌 단위에서 생화학적으로 합성될 수 있고, 일반적으로 테르페노이드로서 언급될 수 있다. 상어간유는 분지된, 불포화 테르페노이드를 함유하는데, 이는 스쿠알렌으로 공지된 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔이다. 또한, 스쿠알렌에 대한 포화된 유사체인 스쿠알란도 사용될 수 있다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하는 어유는 상업적인 소스로부터 용이하게 구할 수 있거나, 또는 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다.
다른 유용한 오일은 고령(예를 들어, 60대 또는 그 이상) 환자에서 사용하기 위해 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신에 포함될 수 있는 토코페롤을 포함하는데, 그 이유는 비타민 E가 그러한 개체 그룹에서 면역 반응에 대한 긍정적인 효과를 보유할 수 있기 때문이다. 추가로, 토코페롤은 에멀젼을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있는 항산화 특성을 보유할 수 있다. 여러 가지 토코페롤(α, β, γ, δ, ε 또는 ξ )이 존재하며; 몇몇 경우에, 사용된다. α-토코페롤의 예는 DL-α토코페롤이다. α-토코페롤 숙시네이트는 본 출원에 개시된 조성물, 예를 들어 인플루엔자 백신과 상용성일 수 있고, 및 수은이 함유된 화합물에 대한 대안으로서 유용한 보존제일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 오일의 혼합물, 예를 들어 스쿠알렌 및 α-토코페롤의 혼합물이 사용될 수 있다. 2-20%의(부피 기준) 범위의 오일 함량이 사용될 수 있다.
특정의 수중유 에멀젼 면역증강제는, 예를 들어 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80, 및 소르비탄 트리올리에이트의 미크론 이하의 에멀젼을 포함한다. 부피 기준으로 에멀젼의 조성은 약 5%의 스쿠알렌, 약 0.5%의 폴리소르베이트 80 및 약 0.5%의 스팬 85. 4.3%의 스쿠알렌, 0.5%의 폴리소르베이트 80 및 0.48%의 스팬 85일 수 있다. 중량 기준으로, 이들 비율은 4.3%의 스쿠알렌, 0.5%의 폴리소르베이트 80 및 0.48%의 스팬 85이다. 이러한 면역증강제는 "MF59"로 공지되어 있다. MF59 에멀젼은 유리하게 시트레이트 이온, 예를 들어 10 mM 시트르산나트륨 완충제를 포함한다.
수중유 에멀젼은 스쿠알렌, 토코페롤, 및 폴리소르베이트 80의 미크론 이하의 에멀젼일 수 있다. 이들 에멀젼은 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 토코페롤 및 0.3 내지 3%의 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있고, 및 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 바람직하게는 약 1(예를 들어, 0.90)일 수 있는데, 그 이유는 이 비율이 더 안정한 에멀젼을 제공할 수 있기 때문이다. 스쿠알렌 및 폴리소르베이트 80은 약 5:2의 부피 비 또는 약 11:5의 중량 비로 존재할 수 있다. 하나의 이러한 에멀젼은 PBS 중에 트윈 80을 용해시켜 2% 용액을 만들고, 이어서 이 용액 90 ml와 (5 g의 DL-α토코페롤 및 5 ml의 스쿠알렌)의 혼합물을 혼합하고, 이어서 상기 혼합물을 미세유동화하여 제조할 수 있다. 생성되는 에멀젼은 미크론이하, 예를 들어 평균 직경이 100 내지 250 nm, 바람직하게는 약 180 nm인 오일 액적을 보유한다. 또한, 상기 에멀젼은 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3d-MPL)를 포함할 수 있다. 이러한 유형의 다른 유용한 에멀젼은 인간 투여량당 0.5-10 mg의 스쿠알렌, 0.5-11 mg의 토코페롤, 및 0.1-4 mg의 폴리소르베이트 80를 포함할 수 있다.
수중유 에멀젼은 스쿠알렌, 토코페롤, 및 트리톤 세정제(예를 들어, 트리톤 X-100)의 에멀젼일 수 있다. 또한, 상기 에멀젼은 3d-MPL(하기 참조)을 포함할 수 있다. 상기 에멀젼은 포스페이트 완충제를 함유할 수 있다.
수중유 에멀젼은 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 80), 트리톤 세정제(예를 들어, 트리톤 X-100) 및 토코페롤(예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)을 포함하는 에멀젼일 수 있다. 상기 에멀젼은 이들 3가지 성분을 약 75:11:10의 질량비(예를 들어, 750 μ/ml의 폴리소르베이트 80, 110 μ /ml의 트리톤 X-100 및 100 μ/ml의 α-토코페롤 숙시네이트)로 포함할 수 있고, 및 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 임의의 기여를 포함하여야 한다. 또한, 상기 에멀젼은 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 또한, 상기 에멀젼은 3d-MPL을 포함할 수 있다. 수성 상은 포스페이트 완충제를 함유할 수 있다.
수중유 에멀젼은 스쿠알란, 폴리소르베이트 80, 및 폴록사머 401("PluronicTM L121")의 에멀젼일 수 있다. 상기 에멀젼은 포스페이트 완충처리된 염수 pH 7.4에서 제형화될 수 있다. 이러한 에멀젼은 무라밀 디펩티드를 위한 유용한 전달 비히클일 수 있고, 및 "SAF-1" 면역증강제(0.05-1%의 Thr-MDP, 5%의 스쿠알란, 2.5%의 Pluronic L121 및 0.2%의 폴리소르베이트 80) 내에서 트레오닐-MDP와 함께 사용될 수 있다. 또한, 이는 "AF" 면역증강제(5%의 스쿠알란, 1.25%의 Pluronic L121 및 0.2%의 폴리소르베이트 80)에서와 같이 Thr-MDP없이 사용될 수 있다.
수중유 에멀젼은 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리옥시에틸렌(12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만나이드 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노올리에이트 또는 "스팬 80")를 포함하는 에멀젼일 수 있다. 상기 에멀젼의 열가역적일 수 있고/있거나, 200 nm 미만의 크기를 가진 오일 액적의 적어도 90%(부피 기준)를 보유할 수 있다. 또한, 상기 에멀젼은 알디톨; 동결보호제(예를 들어, 당, 예를 들어 도데실말토시드 및/또는 수크로오스); 및/또는 알킬폴리글리코시드를 포함할 수 있다. 상기 에멀젼은 TLR4 작용제를 포함할 수 있다. 그러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다.
수중유 에멀젼은 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 아빌-케어의 에멀젼일 수 있다. 면역증강제 처리된 백신 중에서 이들 성분들의 최종 농도(중량)는 5%의 스쿠알렌, 4%의 폴록사머 105(플루로닉 폴리올) 및 2%의 아빌-케어 85(비스-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드)일 수 있다.
수중유 에멀젼은 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 보유하는 에멀젼일 수 있다. 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린, 및 카르디오리핀을 포함할 수 있다. 미크론 이하 액적 크기가 유리할 수 있다.
수중유 에멀젼은 비-대사 가능한 오일(예를 들어, 경질 광유) 및 적어도 하나의 계면활성제(예를 들어, 레시틴, 트윈 80 또는 스팬 80)의 미크론 이하의 수중유 에멀젼일 수 있다. 첨가제는 퀼 A 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성 컨쥬제이트(예를 들어, 지방족 아민을 데사실사포닌에 글루쿠론산의 카브록실기에 의해 첨가함으로써 제조된 GPI-OlOO), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스(2-히드록시에틸)프로판디아민을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 면역증강제, 예를 들어 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 향료, 충전제, 자외선 차단제, 악취 흡수제, 및 염료를 함유한다. 이들 여러 가지 면역증강제의 양은 관련 분야에서 사용되는 양일 수 있고, 및 예를 들어 조성물의 총 중량의 약 0.01%의 내지 약 20%이다. 그들의 특성에 따라, 이들 면역증강제는 지방 상 중에, 수성 상 중에, 및/또는 지질 소낭 중에 도입될 수 있다.
하나 이상의 활성제, 예를 들어 본 출원에 기재된 펩티드, 핵산 분자, 항체 또는 이의 단편, APC, 및/또는 바이러스를 하나 이상의 면역증강제와 함께 포함하는 본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 특정 몰 비를 포함하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 면역증강제와 함께 활성제의 약 99:1 내지 약 1:99의 몰 비가 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태, 하나 이상의 면역증강제와 함께 활성제의 몰 비의 범위는 약 80:20 내지 약 20:80; 약 75:25 내지 약 25:75, 약 70:30 내지 약 30:70, 약 66:33 내지 약 33:66, 약 60:40 내지 약 40:60; 약 50:50; 및 약 90:10 내지 약 10:90으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 면역증강제와 함께 활성제의 몰 비는 약 1:9일 수 있고, 및 몇몇 경우에, 약 1:1일 수 있다. 하나 이상의 면역증강제와 함께 활성제, 예를 들어 본 출원에 기재된 펩티드, 핵산 분자, 항체 또는 이의 단편, APC, 및/또는 바이러스는 동일한 투여 단위, 예를 들어 하나의 바이알, 좌약, 정제, 캡슐, 에어로졸 스프레이로 함께 제형화되거나; 또는 각각의 제제, 형태, 및/또는 화합물은 별개의 단위, 예를 들어 2개의 바이알, 좌약, 정제, 2개의 캡슐, 정제 및 바이알, 에어로졸 스프레이 등으로 제형화될 수 있다.
본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 백반, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 이미퀴모드(R837)(소형 합성 항바이러스 분자-TLR7 리간드), Pam2Cys, 및 질서 정연한 막대-유사 AIO(OH) 나노입자(Rod)로부터 선택된 하나 이상의 면역증강제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 백반을 포함한다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 Rod를 포함한다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 Rod, MPL, 및 R837을 포함한다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 MPL 및 R837을 포함한다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 백반, MPL, 및 R837을 포함한다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 Pam2Cys를 포함한다.
추가 제제
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 추가의 활성제와 함께 투여될 수 있다. 추가의 활성제의 선택은 적어도 부분적으로 치료하려는 질환의 상태에 의존할 수 있다. 추가의 활성제는, 예를 들어 병원체 감염(예를 들어, 바이러스 감염)에 대한 치료 효과를 보유하는 임의의 활성제를 포함할 수 있는데, 이들은 예를 들어 염증성 질환을 치료하기 위해 사용되는 약물, 예를 들어 NSAID, 예를 들어 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 케토프로펜, 또는 아스피린을 포함한다. 몇몇 실시양태, 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하기 위한 제제는 하나 이상의 종래의 인플루엔자 항바이러스제, 예를 들어 비타민 D, 아만타딘, 아르비돌, 라니나미비르, 리만타딘, 자나미비르, 페라미비르, 및 오셀타미비르를 함유할 수 있다. 레트로바이러스 감염, 예를 들어 HIV에 대한 치료에서, 제제는 하나 이상의 종래의 항바이러스 약물, 예르 들어 프로테아제 억제제(로피나비르/리토나비르(Kaletra®), 인디나비르(Crixivan®), 리토나비르(Norvir®), 넬프마비르(Viracept®), 사퀴나비르 경질 겔 캡슐(Invirase®), 아타자나비르(Reyataz®), 암프레나비르(Agenerase®), 포삼프레나비르(Telzir®), 티프라나비르(Aptivus®)), 역전사효소 억제제, 예를 들어 비-뉴클레오시드 및 뉴클레오시드/뉴클레오티드 억제제(AZT(지도부딘, Retrovir®), ddl(디다노신, Videx®), 3TC(라미부딘, Epivir®), d4T(스타부딘, Zerit®), 아바카비르(Ziagen®), FTC(엠트리시타빈, Emtriva®), 테노포비르(Viread®), 에파비렌즈(Sustiva®) 및 네비라핀(Viramune®)), 융합 억제제 T20(엔푸비르티드, Fuzeon®), 인테그라아제 억제제(MK-0518 및 GS-9137), 및 성숙 억제제(PA-457(Bevirimat®))를 함유할 수 있다. 다른 예로서, 제제는 하나 이상의 보충제, 예를 들어 비타민 C, 비타민 E, 및 다른 비타민 및 항산호ㅘ제를 추가로 함유할 수 있다.
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 항생제(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B)를 함유할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 글루텐을 함유하지 않을 수 있다.
공용매
본 출원에 제공된 조성물의 성분의 용해도는 상기 조성물 내에서 공용매에 의해 증강될 수 있다. 그러한 공용매는 폴리소르베이트 20, 60, 및 80, 플루로닉 F68, F-84 및 P-103, 시클로덱스티린, 또는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 제제를 포함한다. 그러한 공용매는 약 0.01 중량% 내지 2 중량%의 레벨로 사용될 수 있다.
투과 증강제
몇몇 실시양태에서, 본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 투과 증강제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 투과를 증가시키거나, 또는 투과성 배리어, 예를 들어 피부를 가로질러 제제 또는 제제의 조합의 전달을 돕는 적합한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 투과 증강 화합물의 예는, 예를 들어 물, 알코올(메탄올, 에탄올, 2-프로판올과 같은 테르펜), 설폭사이드(예를 들어, 디메틸 설폭사이드, 데실메틸 설폭사이드, 테트라데실메틸 설폭사이드), 피롤리돈(예를 들어, 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈, N-(2-히드록시에틸)피롤리돈), 라우로카프람, 아세톤, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 테트라히드로푸르푸릴 알콜 , L-a-아미노산, 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성 계면활성제(예를 들어, 이소프로필 미리스테이트 및 나트륨 라우릴 설페이트), 지방산, 지방 알콜(예를 들어, 올레산), 아민, 아미드, 클로피브르산 아미드, 헥사메틸렌 라우라미드, 단백질분해 효소, a-비스아볼롤, d-리모넨, 우레아 및 N,N-디에틸-m-톨루아미드 등을 포함한다. 추가의 예는 습윤제(예를 들어, 우레아), 글리콜(예를 들어, 프로필렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜), 글리세롤 모노라우레이트, 알칼, 알칸올, 또는 오르겔라아제, 탄산칼슘, 인산칼슘, 여러 가지 당, 전분, 셀룰로오스 유도체, 겔라틴, 및/또는 다른 중합체를 포함한다. 몇몇 실시양태, 상기 조성물은 하나 이상의 이러한 투과 중강제를 포함할 것이다.
지속 방출 제형을 위한 첨가제
몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 활성제는 국소 투여, 안내 투여, 눈 주위 투여 또는 전신 투여를 위해 삽입제 상에서, 내에서 또는 그에 부착된 지속 방출 제형에 사용하기 위한 생체적합성 중합체에 방출 가능하게 부착될 수 있다. 생체적합성 중합체로부터의 제어된 방출은 점적 가능한 제형을 형성하기 위해 수용성 중합체와 함께 이용될 수 있다. 생체적합성 중합체, 예를 들어 PLG 미소구 또는 나노구로부터의 제어된 방출은 안내 이식 또는 지속 방출 투여를 위한 주사를 위해 적합한 제형에 사용될 수 있다. 임의의 적합한 생분해성 및 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다.
투여 경로
본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 개체, 예를 들어 인간에서 여러 가지 경로에 의해 전달될 수 있다. 전달 경로는 경구(구강 및 설하 포함), 직장, 코, 국소, 경피, 경점막, 폐, 질, 좌약, 또는 비경구(근육내, 동맥내, 척추강내, 피부내, 복강내, 피하 및 정맥내 포함) 투여 또는 에어로졸화, 흡입 또는 취입에 의한 투여에 적합한 형태를 포함할 수 있다. 상기 조성물, 예를 들어 백신은 근육에 투여될 수 있거나, 또는 피부내 또는 피하 주사, 또는 경피적으로, 예를 들어 이온도입법에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물, 예를 들어 백신은 상피 투여에 의해 개체에게 전달될 수 있다.
치료 레지먼
본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 약 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mL, 또는 그 초과의 투여량 부피로 개체에게 투여될 수 있다. 반 투여량, 예를 들어 약 0.25 mL는 아동에게 투여될 수 있다. 종종, 백신은 더 높은 투여량, 예를 들어 약 1 mL로 투여될 수 있다.
상기 조성물, 예를 들어 백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과의 투여-코스 레지먼으로서 투여될 수 있다. 종종, 상기 백신은 2, 3, 또는 4 투여-코스 레지먼으로서 투여될 수 있다. 종종 상기 백신은 2 투여-코스 레지먼으로서 투여될 수 있다.
2 투여-코스 레지먼의 제1 투여량 및 제2 투여량의 투여 사이의 간격은 약 0일, 1일, 2일, 5일, 7일, 14일, 21일, 30일, 2개월, 4개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년, 20년, 또는 그 초과일 수 있다. 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 1년에 1회, 1년에 2회, 1년에 3회, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년, 또는 그 초과의 년마다 투여될 수 있다. 종종, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 매 2, 3, 4, 5, 6, 7년, 또는 그 초과의 년마다 개체에게 투여될 수 있다. 종종, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 매 4, 5, 6, 7년, 또는 그 초과의 년마다 투여될 수 있다. 종종, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 개체에게 1회 투여될 수 있다. 종종, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 일정 기간에 걸쳐 다중 투여 백신으로서 환자에게 투여될 수 있고, 예를 들어 2-투여 백신의 경우, 제2 투여는 제1 투여하고 4~5년 후에 이루어진다. 몇몇 경우에, 상기 조성물, 예를 들어 백신은, 예를 들어 북반구의 경우 9월부터 2월까지, 10월부터 1월까지, 11월부터 12월까지의 시기에 투여된다. 몇몇 경우에, 상기 조성물, 예를 들어 백신은, 예를 들어 남반구의 경우, 3월부터 10월까지, 4월부터 9월까지, 5월부터 8월까지, 6월부터 7월까지의 시기에 투여된다.
투여 예는 제한적이지 않고, 및 단지 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신을 투여하기 위한 특정 투여 레지먼을 예시하기 위해 사용된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 인간에서 사용하기 위한 "치료 유효량"은 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간을 위한 투여량은 동물에서 치료적으로 효과적이라고 확인된 순환, 간, 국소, 및/또는 위장관 농도를 달성하기 위해 결정될 수 있다. 동물 데이터 및 다른 타입의 유사한 데이터에 기초하여, 당해 기술분야의 통상의 기술자는 인간에게 투여하기에 적합한, 조성물, 예를 들어 백신의 치료 유효량을 결정할 수 있다.
본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 계절성 인플루엔자 또는 유행성 인플루엔자를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 방법 및 조성물은 인플루엔자 바이러스 아형을 타겟팅할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 바이러스 협막의 표면 상에서 발현되는 2개의 단백질, 즉 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(N)에 기초하여 아형으로 분류될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 약 18개의 H 아형, 즉 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, 및 H18; 및 약 11개의 N 아형, 즉 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10, 및 N11을 나타낼 수 있다. H 및 N 아형은 함께 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 관찰되어 온 H 및 N 아형 조합의 비제한적인 예는 H1N1, H1N2, H1N7, H2N2, H3N2, H3N8, H4N8, H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, H6N5, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H7N9, H8N4, H9N2, H10N7, H11N6, H12N5, H13N6, 및 H14N5를 포함한다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 기재된 백신은 본 출원에 개시된 H 및 N 아형의 조합을 보유하는 인플루엔자 바이러스를 타겟팅할 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 조합은 HxNy로 나타낼 수 있는데, 이때 x는 임의의 H1-H18 아형을 나타내고, 및 y는 임의의 N1-N11 아형을 나타낸다. 예를 들어, 몇몇 실시양태, 본 출원에 개시된 백신은 H1Ny로 나타내어지는 아형을 타겟팅할 수 있는데(또는 H2Ny로 나타내어지는 아형 등을 타겟팅할 수도 있음), 이때 H1은 본 출원에 기재된 임의의 N 아형과 조합된다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 기재된 백신은 H 및 N 아형 조합 H1N1, H1N2, H1N7, H2N2, H3N2, H3N8, H4N8, H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, H6N5, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H7N9, H8N4, H9N2, H10N7, H11N6, H12N5, H13N6, 또는 H14N5을 보유하는 인플루엔자 바이러스를 타겟팅할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 인플루엔자 B 바이러스를 타겟팅할 수 있다. 인플루엔자 B 바이러스는 계통 및 균주로 분류될 수 있다. 인플루엔자 B 바이러스는 B/야마가타 또는 B/빅토리아 계통에 속할 수 있다. 예시적인 인플루엔자 B 바이러스 균주는 브리스베인/60/2008, 메사추세츠/2/2012, 및 위스콘신/1/2010을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 B 바이러스, 및/또는 인플루엔자 C 바이러스를 타겟팅할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 또는 이들의 조합의 균주를 타겟팅할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 인플루엔자 감염, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스 감염, 인플루엔자 B 바이러스 감염, 또는 인플루엔자 C 바이러스 감염을 보유하는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 종종, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 또는 인플루엔자 C 바이러스의 감염에 대한 백신화 방법으로서 사용될 수 있다. 종종, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 및/또는 인플루엔자 C 바이러스와 연관된 상이한 균주에 대한 교차-보호를 제공한다.
본 출원에서 사용된 바와 같이 용어 "치료 유효량"은 치료하려는 질병 또는 질환의 증상 또는 징후를 완화, 경감, 또는 예방하기 위해 효과적인 양을 의미할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 치료 유효량은 바이러스 감염, 예를 들어 인플루엔자 감염, 예를 들어 인플루엔자 A 감염의 징후 및/또는 증상을 보유하는 개체에서 유익한 효과를 보유하는 양일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 치료 유효량은 대조군과 비교하는 경우, 바이러스 감염, 예를 들어 인플루엔자 감염, 예를 들어 인플루엔자 A 감염의 징후 및/또는 증상을 억제 또는 감소하는 양일 수 있다. 인플루엔자 감염, 예를 들어 인플루엔자 A 감염의 징후 및 증상은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 및 발열, 기침, 인후통, 콧물, 코막힘, 두통, 근육통, 오한, 피로(피곤), 욕지기, 구토, 설사, 통증(예를 들어, 복통), 결막염, 숨가쁨, 호흡곤란, 폐렴, 급성 호흡 장애, 바이러스성 폐렴, 호흡 부전, 신경학적 변화(예를 들어, 변경된 정신 상태, 발작), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태, 치료 유효량은 대조군과 비교하는 경우 개체에서 대략, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 만큼 임의의 징후 및/또는 증상을 감소시키기 위해 충분한 양일 수 있다.
하나 이상의 활성제와 관련되는 경우, 치료 유효량은 의학 또는 약학 분야의 임의의 여러 허가 기관 또는 자문 기구(예를 들어, FDA, AMA) 또는 제조사 또는 공급업자에 의해 추천되거나 또는 승인된 투여량 범위, 투여 모도, 제형 등일 수 있다.
본 개시의 몇몇 관점에서, 상기 조성물은 펩티드 기반 제제를 포함할 수 있다. 본 출원에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 약 1 nmol/투여 내지 약 1000 μmol/투여의 투여량으로 개체에게 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조성물은 개체에게 약 1 nmol/투여, 약 5 nmol/투여, 약 10 nmol/투여, 약 20 nmol/투여, 약 30 nmol/투여, 약 40 nmol/투여, 약 50 nmol/투여, 약 60 nmol/투여, 약 70 nmol/투여, 약 80 nmol/투여, 약 90 nmol/투여, 약 100 nmol/투여, 약 200 nmol/투여, 약 300 nmol/투여, 약 400 nmol/투여, 약 500 nmol/투여, 약 600 nmol/투여, 약 700 nmol/투여, 약 800 nmol/투여, 약 900 nmol/투여, 약 1 μmol/투여, 약 1 μmol/투여, 약 2 μmol/투여, 약 3 μmol/투여, 약 4 μmol/투여, 약 5 μmol/투여, 약 6 μmol/투여, 약 7 μmol/투여, 약 8 μmol/투여, 약 9 μmol/투여, 약 10 μmol/투여, 약 20 μmol/투여, 약 50 μmol/투여, 약 100 μmol/투여, 약 200 μmol/투여, 약 300 μmol/투여, 약 400 μmol/투여, 약 500 μmol/투여, 약 750 μmol/투여, 약 1000 μmol/투여의 투여량, 또는 이들 중 임의의 2개 사이의 임의의 투여량으로 투여될 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 조성물은 개체에게 약 50 nmol/투여의 투여량으로 투여될 수 있다.
본 개시의 몇몇 관점에서, 상기 조성물은 본 출원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 개체에게 투여된 조성물은 약 1 pmol/투여 내지 약 1000 μmol/투여의 투여량으로 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태, 개체에게 투여된 조성물은 약 1 pmol/투여, 약 5 pmol/투여, 약 10 pmol/투여, 약 20 pmol/투여, 약 30 pmol/투여, 약 40 pmol/투여, 약 50 pmol/투여, 약 60 pmol/투여, 약 70 pmol/투여, 약 80 pmol/투여, 약 90 pmol/투여, 약 100 pmol/투여, 약 200 pmol/투여, 약 300 pmol/투여, 약 400 pmol/투여, 약 500 pmol/투여, 약 600 pmol/투여, 약 700 pmol/투여, 약 800 pmol/투여, 약 900 pmol/투여, 1 nmol/투여, 약 5 nmol/투여, 약 10 nmol/투여, 약 20 nmol/투여, 약 30 nmol/투여, 약 40 nmol/투여, 약 50 nmol/투여, 약 60 nmol/투여, 약 70 nmol/투여, 약 80 nmol/투여, 약 90 nmol/투여, 약 100 nmol/투여, 약 200 nmol/투여, 약 300 nmol/투여, 약 400 nmol/투여, 약 500 nmol/투여, 약 600 nmol/투여, 약 700 nmol/투여, 약 800 nmol/투여, 약 900 nmol/투여, 약 1 μmol/투여, 약 1 μmol/투여, 약 2 μmol/투여, 약 3 μmol/투여, 약 4 μmol/투여, 약 5 μmol/투여, 약 6 μmol/투여, 약 7 μmol/투여, 약 8 μmol/투여, 약 9 μmol/투여, 약 10 μmol/투여, 약 20 μmol/투여, 약 50 μmol/투여, 약 100 μmol/투여, 약 200 μmol/투여, 약 300 μmol/투여, 약 400 μmol/투여, 약 500 μmol/투여, 약 750 μmol/투여, 약 1000 μmol/투여의 투여량, 또는 이들 중 임의의 2개 사이의 임의의 투여량의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 개시의 몇몇 관점에서, 상기 조성물은 본 출원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 바이러스를 포함할 수 있다. 재조합 바이러스를 포함하는 조성물은 개체에게 약 103 내지 1012 바이러스 입자 또는 플라크 형성 유닛(PFU), 또는 약 105 내지 1010 PFU, 또는 약 105 내지 108 PFU, 또는 약 108 내지 1010 PFU로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태, 개체에게 투여된 본 개시의 바이러스 백신의 양은 약 103 내지 1012 바이러스 입자 또는 플라크 형성 유닛(PFU), 또는 약 105 내지 1010 PFU, 또는 약 105 내지 108 PFU, 또는 약 108 내지 1010 PFU일 수 있다. 종종, 개체에게 투여된 본 개시의 바이러스 백신은 약 103 PFU/투여 내지 약 104 PFU/투여, 약 104 PFU/투여 내지 약 105 PFU/투여, 약 105 PFU/투여 내지 약 106 PFU/투여, 약 107 PFU/투여 내지 약 108 PFU/투여, 약 109 PFU/투여 내지 약 1010 PFU/투여, 약 1010 PFU/투여 내지 약 1011 PFU/투여, 약 1011 PFU/투여 내지 약 1012 PFU/투여, 약 1012 PFU/투여 내지 약 1013 PFU/투여, 약 1013 PFU/투여 내지 약 1014 PFU/투여, 또는 약 1014 PFU/투여 내지 약 1015 PFU/투여의 투여량으로 투여될 수 있다. 개체에게 투여된 본 개시의 바이러스 백신은 약 2 x 103 PFU/투여, 3 x 103 PFU/투여, 4 x 103 PFU/투여, 5 x 103 PFU/투여, 6 x 103 PFU/투여, 7 x 103 PFU/투여, 8 x 103 PFU/투여, 9 x 103 PFU/투여, 약 104 PFU/투여, 약 2 x 104 PFU/투여, 약 3 x 104 PFU/투여, 약 4 x 104 PFU/투여, 약 5 x 104 PFU/투여, 약 6 x 104 PFU/투여, 약 7 x 104 PFU/투여, 약 8 x 104 PFU/투여, 약 9 x 104 PFU/투여, 약 105 PFU/투여, 2 x 105 PFU/투여, 3 x 105 PFU/투여, 4 x 105 PFU/투여, 5 x 105 PFU/투여, 6 x 105 PFU/투여, 7 x 105 PFU/투여, 8 x 105 PFU/투여, 9 x 105 PFU/투여, 약 106 PFU/투여, 약 2 x 106 PFU/투여, 약 3 x 106 PFU/투여, 약 4 x 106 PFU/투여, 약 5 x 106 PFU/투여, 약 6 x 106 PFU/투여, 약 7 x 106 PFU/투여, 약 8 x 106 PFU/투여, 약 9 x 106 PFU/투여, 약 107 PFU/투여, 약 2 x 107 PFU/투여, 약 3 x 107 PFU/투여, 약 4 x 107 PFU/투여, 약 5 x 107 PFU/투여, 약 6 x 107 PFU/투여, 약 7 x 107 PFU/투여, 약 8 x 107 PFU/투여, 약 9 x 107 PFU/투여, 약 108 PFU/투여, 약 2 x 108 PFU/투여, 약 3 x 108 PFU/투여, 약 4 x 108 PFU/투여, 약 5 x 108 PFU/투여, 약 6 x 108 PFU/투여, 약 7 x 108 PFU/투여, 약 8 x 108 PFU/투여, 약 9 x 108 PFU/투여, 약 109 PFU/투여, 약 2 x 109 PFU/투여, 약 3 x 109 PFU/투여, 약 4 x 109 PFU/투여, 약 5 x 109 PFU/투여, 약 6 x 109 PFU/투여, 약 7 x 109 PFU/투여, 약 8 x 109 PFU/투여, 약 9 x 109 PFU/투여, 약 1010 PFU/투여, 약 2 x 1010 PFU/투여, 약 3 x 1010 PFU/투여, 약 4 x 1010 PFU/투여, 약 5 x 1010 PFU/투여, 약 6 x 1010 PFU/투여, 약 7 x 1010 PFU/투여, 약 8 x 1010 PFU/투여, 약 9 x 1010 PFU/투여, 약 1010 PFU/투여, 약 2 x 1010 PFU/투여, 약 3 x 1010 PFU/투여, 약 4 x 1010 PFU/투여, 약 5 x 1010 PFU/투여, 약 6 x 1010 PFU/투여, 약 7 x 1010 PFU/투여, 약 8 x 1010 PFU/투여, 약 9 x 1010 PFU/투여, 약 1011 PFU/투여, 약 2 x 1011 PFU/투여, 약 3 x 1011 PFU/투여, 약 4 x 1011 PFU/투여, 약 5 x 1011 PFU/투여, 약 6 x 1011 PFU/투여, 약 7 x 1011 PFU/투여, 약 8 x 1011 PFU/투여, 약 9 x 1011 PFU/투여, 또는 약 1012 PFU/투여, 약 1012 PFU/투여 내지 약 1013 PFU/투여, 약 1013 PFU/투여 내지 약 1014 PFU/투여, 또는 약 1014 PFU/투여 내지 약 1015 PFU/투여, 또는 이들 중 임의의 2개 사이의 임의의 투여량을 포함할 수 있다.
종종, 개체에게 투여된 본 개시의 바이러스 백신은 약 104 바이러스 입자/투여, 약 104 바이러스 입자/투여 내지 약 105 바이러스 입자/투여, 약 105 바이러스 입자/투여 내지 약 106 바이러스 입자/투여, 약 107 바이러스 입자/투여 내지 약 108 바이러스 입자/투여, 약 109 바이러스 입자/투여 내지 약 1010 바이러스 입자/투여, 약 1010 바이러스 입자/투여 내지 약 1011 바이러스 입자/투여, 약 1011 바이러스 입자/투여 내지 약 1012 바이러스 입자/투여, 약 1012 바이러스 입자/투여 내지 약 1013 바이러스 입자/투여, 약 1013 바이러스 입자/투여 내지 약 1014 바이러스 입자/투여, 또는 약 1014 바이러스 입자/투여 내지 약 1015 바이러스 입자/투여의 투여량으로 개체에게 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태, 개체에게 투여된 본 개시의 바이러스 백신은 약 1 x 109 바이러스 입자/투여, 약 1.5 x 109 바이러스 입자/투여, 약 2 x 109 바이러스 입자/투여, 약 2.5 x 109 바이러스 입자/투여, 약 3 x 109 바이러스 입자/투여, 약 3.5 x 109 바이러스 입자/투여, 약 4 x 109 바이러스 입자/투여, 약 4.5 x 109 바이러스 입자/투여, 약 5 x 109 바이러스 입자/투여, 약 5.5 x 109 바이러스 입자/투여, 약 6 x 109 바이러스 입자/투여, 약 6.5 x 109 바이러스 입자/투여, 약 7 x 109 바이러스 입자/투여, 약 7.5 x 109 바이러스 입자/투여, 약 8 x 109 바이러스 입자/투여, 약 8.5 x 109 바이러스 입자/투여, 약 9 x 109 바이러스 입자/투여, 약 1 x 1010 바이러스 입자/투여, 약 2 x 1010 바이러스 입자/투여, 약 3 x 1010 바이러스 입자/투여, 약 4 x 1010 바이러스 입자/투여, 약 5 x 1010 바이러스 입자/투여, 약 6 x 1010 바이러스 입자/투여, 약 7 x 1010 바이러스 입자/투여, 약 8 x 1010 바이러스 입자/투여, 약 9 x 1010 바이러스 입자/투여, 또는 이들 중 임의의 2개 사이의 임의의 투여량으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태, 개체에게 투여된 본 개시의 바이러스 백신은 약 7.5 x 109 바이러스 입자/투여의 투여량으로 투여될 수 있다.
본 출원에 제공된 조성물, 예를 들어 백신은 병원체 감염, 예를 들어 인플루엔자 감염과 관련된 증상의 개시 이전, 도중, 또는 이후에 투여될 수 있다. 예시적인 징후는 발열, 기침, 인후통, 콧물, 코막힘, 두통, 근육통, 오한, 피로(피곤), 욕지기, 구토, 설사, 통증(예를 들어, 복통), 결막염, 숨가쁨, 호흡곤란, 폐렴, 급성 호흡 장애, 바이러스성 폐렴, 호흡 부전, 신경학적 변화(예를 들어, 변경된 정신 상태, 발작), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 병원체 감염, 예를 들어 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스를 치료하기 위해 개체에게 투여될 수 있다. 종종, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 예방적 목적, 예를 들어 병원체 감염, 예를 들어 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스의 예방적 치료를 위해 개체에게 투여될 수 있다. 상기 조성물, 예를 들어 백신은 개체로부터 면역 반응을 유발하기 위해 개체에게 투여될 수 있다. 상기 조성물, 예를 들어 백신은 병원체 감염 이전에, 병원체 감염 도중에, 또는 병원체 감염에 대한 예방적 조치로서 개체로부터 면역 반응을 유발하기 위해 개체에게 투여될 수 있다. 본 출원에서 제공된 조성물, 예를 들어 백신의 투여 후, 병원체와 관련된 증상은 대략, 적어도, 또는 최대 1일, 5약, 1주, 2주, 3주, 또는 1개월에 대략, 적어도, 또는 최대 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소될 수 있다.
인플루엔자 감염, 예를 들어 인플루엔자 A 감염 유래의 합병증은, 예를 들어 폐렴, 기관지염, 부비강 감염, 또는 귀 감염일 수 있다. 몇몇 경우에, 인플루엔자 감염, 예를 들어 인플루엔자 A 감염은 만성적인 건강 문제를 악화시킬 수 있는데, 예를 들어 천식 환자는 인플루엔자 감염 중에 천식 발작을 경험할 수 있거나, 또는 만성 울혈성 심부전 환자는 인플루엔자 감염 중에 증상의 악화를 경험할 수 있다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신의 치료 유효량은 인플루엔자 감염 유래의 합병증을 앓은 개체에게 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태, 본 출원에 기재된 조성물, 예를 들어 백신의 치료 유효량은 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스) 및 하나 이상의 만성적인 건강 문제가 있는 개체에게 투여될 수 있다.
본 출원에서 제공된 조성물 예를 들어 백신 또는 본 출원에 기재된 키트는 2℃ 및 8℃에서 저장될 수 있다. 종종, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 실온에서 저장될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 냉동 저장되지 않을 수 있다. 몇몇 실시양태, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 -20℃ 또는 -80℃와 같은 온도에서 저장될 수 있다. 몇몇 실시양태, 상기 조성물, 예를 들어 백신은 햇빛을 피해 저장될 수 있다.
실시예
후술하는 실시예는 제한의 의미는 없고, 예시를 위해 제공된다.
실시예 1
1) www.fludb.org에서 실험적으로 입증된 BALB/C 인플루엔자 A 바이러스 CD8 T-세포 에피토프에 기초하고, 및 2) 스트레치 내의 모든 가능한 돌연변이(일반적으로 각각의 잔기는 코돈 내의 단일 뉴클레오티드 변화 유래의 6-7개의 가능한 돌연변이를 보유한다) 중 <0.08의 평균 불변 비율(최종 집단 내의 돌연변이체의 빈도/최초 집단 내의 빈도)을 보유하는 펩티드 서열 TYQRTRALV(서열번호 37)가 선택되었다. 펩티드는 Pam2Cys(TLR2를 활성화시키고, 및 펩티드에 공유적으로 연결된 리포좀 면역증강제) 및 HA 유래의 CD4 T 세포 에피토프(GALNNRFQIKGVELKS(서열번호 115))(중앙 라이신에 의해 연결된 에피토프, 및 2개의 세린에 의해 중앙 라이신에 컨쥬게이트된 Pam2Cys)에 컨쥬게이트되었다. (미국 캘리포니아 멘로 파크에 소재하는 CS 바이오가 리포펩티드를 합성하였다) 제형은 20 μL의 인산염 완충 염수(PBS)(2.5 μM) 당 서열 TYQRTRALV(서열번호 37)를 보유하는 50 nmol의 Pam2Cys-펩티드를 이용하여 제조되었다. 20 μL 부피의 제형은 각각 10 마리의 BALB/C 마우스("그룹 2")에 비내 투여되었다. 20 μL 부피의 PBS는 각각 10 마리의 대조군 BALB/C 마우스("그룹 1")에 비내 투여되었다. 상기 투여 4주 후에, 두 그룹의 마우스는 100 TCID50 PR8 인플루엔자 A 바이러스를 이용하여 챌린지되었다. 대조군 그룹(그룹 1)에서의 0%(10 마리 중 0 마리)와 비교하여 백신 그룹(그룹 2) 내의 마우스의 60%(10 마리 중 6 마리)는 인플루엔자 A 바이러스의 치명적인 챌린지를 수행하고 9일 후에도 생존하였는데, 이는 백신에 의한 통계학적으로 유의미한 보호를 나타낸다(참조: 도 2).
실시예 2
본 실시예는 4 가지의 인플루엔자 바이러스 에피토프를 포함하는 백신을 이용하는 백신화를 기재한다. 4 가지의 인플루엔자 바이러스 에피토프, 즉 ELRSRYWAIRTRSG(NP)(서열번호 17), FYIQMCTEL(NP)(서열번호 79), TYNAELLVLL(HA)(서열번호 80), 및 TYQRTRALV(NP)(서열번호 37)를 보유하는 재조합 아데노바이러스가 생성되었다. 재조합 아데노바이러스는 나란히 코딩되고 및 링커 RVKR(서열번호 110)에 의해 분리된 4개의 펩티드를 갖는 단일 트랜스유전자를 함유하였다. 트랜스유전자 생성물의 서열은 다음과 같다: GALNNRFQIKGVELKSKTYQRTRALVRVKRELRSRYWAIRTRSGRVKRFYIQMCTELRVKRTYNAELLVLL(서열번호 81). 재조합 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위해, 트랜스유전자는 마우스 세포 내에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 재조합 아데노바이러스는 20 μl(7.5 x 109 바이러스 입자, 각각 s.c. 및 i.n.) 내의 2 x 107 pfu(플라크 형성 유닛)의 투여량으로 그룹 1 마우스(10 마리의 BALB/C 마우스)에 피하로 및 비내로 동시에 투여되었다. 마우스는 H1N1 플루의 5-10 LD50의 치사 투여량(치사 투여량 50)(∼100 TCID50 또는 조직 배양 감염성 투여량 50)으로 28일 후에 챌린지되었다. 이 그룹 내의 모두 10 마리의 마우스는 생존하였다. 10 마리의 마우스 중 9 마리는 초기에 체중이 감소되었으나, 챌린지 후 12일째에 그들의 체중은 대부분 다시 증가하였다. 참조 도 3A 및 도 4.
대조군 그룹(그룹 2, 백신화되지 않고, 염수가 s.c. 및 i.n.으로 주사됨)에서, 10 마리의 BALB/C 마우스는 H1N1 플루의 5-10 LD50의 치사 투여량(치사 투여량 50)(∼100 TCID50 또는 조직 배양 감염성 투여량 50)으로 챌린지되었다. 10 마리의 마우스 중 0 마리가 생존하였고, 챌린지 후 9일째에 모든 마우스는 사망하였다. 도 3B 및 4.
다른 세트의 실험에서, AdCre-주사된 마우스는 Ad 벡터에 대한 대조군 그룹(도 3C의 그룹 1)으로 사용되었다. AdCre는 재조합 아데노바이러스 백신과 동일한 아데노바이러스 벡터를 이용하여 생성된 아데노바이러스이나, 4 가지의 에피토프를 발현하는 뉴클레오티드 서열 대신에 Cre 리컴비나아제 유전자가 삽입된 것이다. 도 3C에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군 그룹 내의 5 마리의 마우스 중 3 마리는 사망하였고, 및 5 마리의 마우스 중 다른 2 마리는 체중이 실질적으로 감소되었다. 대조적으로, 백신화된 그룹(도 3D의 그룹 2)에서, 5 마리의 마우스 중 0 마리는>10%의 체중이 감소되었다. AdCre 내의 모두 5 마리의 마우스는 3 또는 그 초과의 징후 스코어를 보유한 반면(나타내지 않음), 백신 그룹 내의 모두 5 마리의 마우스는 1 이하였다.
실시예 3
본 실시예는 9 가지의 인플루엔자 바이러스 에피토프를 포함하는 백신을 이용하는 백신화를 기재한다. 9 가지의 인플루엔자 바이러스 에피토프를 보유하는 재조합 아데노바이러스가 생성된다. 또한, 9 가지의 인플루엔자 바이러스 에피토프를 포함하는 펩티드의 백신 칵테일이 사용될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 에피토프는 표 1에 목록화된 에피토프의 임의의 조합을 포함할 수 있다
백신화는 HLA-B44-트랜스제닉 마우스를 이용하여 수행될 수 있다. 프라임-부스트 레지먼(prime-boost regimen)이 이용될 수 있다. 프라이밍은 9개의 Pam2Cys-면역증강된(adjuvanted) 펩티드를 이용할 수 있다. 부스팅은 9 가지의 인플루엔자 바이러스 에피토프를 보유하는 재조합 아데노바이러스 또는 범용 헬퍼 T 세포 에피토프를 이용할 수 있다. 백신화 후, 마우스는 인플루엔자 바이러스의 PR8 균주를 이용하여 챌린지된다. 마우스는 백신화에 의해 부여된 보호를 평가하기 위해 건강, 체중, 및 생존에 대해 모니터링된다.
실시예 4
본 실시예는 인플루엔자 바이러스의 이종아형 보호 테스트를 위한 실험 절차 및 재료를 기재한다.
사멸 곡선
사멸 곡선 실험(치사 투여량 곡선)은 LD50(개체 동물의 50%가 사망하는 투여량)을 결정하기 위해 수행되어, 5-10 LD50의 챌린지 투여량이 보호 실험을 위해 사용될 수 있도록 한다.
1일: 각 그룹 내의 3 마리의 마우스, i.n. 25 ㎕
Vict 1d는 H3N2이고, 및 3.2 x 107 TCID50/ml이다
1) 그룹 A: 10 TCID50 Vict 1d(H3N2)(이를 5번째로 만듦: 희석액 #5: 50 ㎕의 희석액 #4 + 450 ㎕의 PBS)
2) 그룹 B: 100 TCID50 Vict 1d(이를 4번째로 만듦: 희석액 #4: 50 ㎕의 희석액 #3 + 450 ㎕의 PBS)
3) 그룹 C: 1,000 TCID50 Vict 1d(이를 3번째로 만듦: 희석액 #3: 50 ㎕의 희석액 #2 + 450 ㎕의 PBS)
4) 그룹 D: 10,000 TCID50 Vict 1d(이를 2번째로 만듦: 희석액 #2: 50 ㎕의 희석액 #1 + 450 ㎕의 PBS)
5) 그룹 E: 100,000 TCID50 Vict 1d(이를 1번째로 만듦: 희석액 #1: 100 ㎕의 바이러스 스탁 + 700 ㎕의 PBS)
이종아형 보호
1일: 마우스를 면역화한다:
1) 그룹 1: 20 ㎕의 염수 i.n.(비내) 및 20 ㎕의 염수 s.c.(피하)를 이용하여 10 마리의 마우스
2) 그룹 2: 20 ㎕의 AdBALB 내의 2 x 107 pfu i.n. 및 동량 s.c.를 이용하여 10 마리의 마우스
2 x 10 7 pfu AdBALAB의 경우: 3개의 바이알에 AdBALB, 각각에 115 ㎕의 PBS 첨가한다. 바이알을 함께 혼합하고(총 420 ㎕가 되도록 하면 충분하다; 또한, 그룹 6 내의 바이알로부터 몇몇을 이용할 수 있다), 및 상기와 같이 투여한다.
3) 그룹 3: 20 ㎕의 AdBALB5-pep 내의 2 x 107 pfu i.n. 및 동량 s.c.를 이용하여 5 마리의 마우스
2 x 10 7 pfu AdBALAB5-pep에 대해: 1개의 바이알에 AdBALB5-pep, 230 ㎕의 PBS를 첨가하고, 및 상기와 같이 투여한다.
4) 그룹 4: 20 ㎕ 내의 7.5 x 109 바이러스 입자 i.n. 및 동량 s.c.를 이용하여 5 마리의 마우스
10 x 10 9 pfu AdBALAB5-pep의 경우: 1개의 바이알에 AdBALB5-pep, 722 ㎕의 PBS를 첨가하고, 및 상기와 같이 투여한다.
5) 그룹 5: 20 ㎕의 AdCre i.m.(근육내)을 이용하여 5 마리의 마우스
20 ㎕의 AdCre의 경우: 1개의 바이알에 AdCre, 653 ㎕의 PBS를 첨가하고, 및 상기와 같이 투여한다.
6) 그룹 6: 20 ㎕의 AdBALB i.m.을 이용하여 5 마리의 마우스
20 ㎕의 AdBALB의 경우: 1개의 바이알에 AdBALB, 115 ㎕의 PBS를 첨가하고, 및 상기와 같이 투여한다.
일 2-15: 체중, 생존, 및 임상 스코어를 모니터링한다
일 29: 마우스를 챌린지한다: 모두 i.n. 20 ㎕로.
1) 그룹 1-4: 5-10 LD50(사멸 곡선의 기준에 대해 선택됨) Vict 1d
2) 그룹 5-6: 100 TCID50 PR8(바이러스 스탁을 1/10,000로 희석: 10 ㎕의 바이러스 스탁 + 990 ㎕의 PBS; 10 ㎕의 이 희석액 + 990 ㎕의 워킹 스탁용 PBS)
일 30-43: 체중, 생존, 및 임상 스코어를 모니터링한다
시약
총 55 마리의 BALB/C 6-12 주령 암컷 마우스.
아데노바이러스: AdBALB(에피토프 서열을 보유하지 않는 대조군 바이러스); AdBALB5-pep(5 가지의 상이한 인플루엔자 에피토프 서열을 보유하는 백신); AdCre(에피토프 서열은 보유하지 않으나 Cre 트랜스유전자를 보유하는 대조군 바이러스). 인플루엔자 바이러스: PR8; Vict 1d(H3N2).
실시예 5
본 실시예는 51 가지의 상이한 인플루엔자 바이러스 에피토프를 보유하는 재조합 아데노바이러스 기반 백신(AdFlu51pep)을 기재한다. 재조합 아데노바이러스는 나란히 코딩되고 및 링커 RVKR(서열번호 110)에 의해 분리되는, 표 3의 모두 51 가지의 에피토프 서열을 발현하는 단일 트랜스유전자를 이용하여 조작된다. 51 가지의 에피토프 서열의 순서는 무작위일 수 있어서 여러 가지의 상이한 트랜스유전자 서열의 생성을 가능하게 한다. 트랜스유전자 생성물 또는 트랜스유전자 생성물의 일부분의 하나의 예의 서열은 표 4에 목록화된 바와 같다.
Figure pct00010
트랜스유전자는 인플루엔자 B 바이러스 NP 단백질, 예를 들어 서열번호 116, 117 또는 118, 또는 인플루엔자 B 바이러스 NP 단백질의 단편(예를 들어, 서열번호 116, 117 또는 118의 아미노산 2-560)의 하나 이상의 사본(예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5)에 연결된 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 몇몇 경우에, 백신은 인플루엔자 B 바이러스 NP 단백질, 예를 들어 서열번호 116, 117 또는 118, 또는 인플루엔자 B 바이러스 NP 단백질의 단편의 하나 이상의 사본(예를 들어, 2, 3, 4, 5)을 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 제2 트랜스유전자를 보유하는 제2 아데노바이러스를 포함한다. 몇몇 경우에, 아데노바이러스는 서열번호 106을 포함하는 폴리펩티드 및 인플루엔자 B 바이러스 NP 단백질, 예를 들어 서열번호 116, 117 또는 118, 또는 인플루엔자 B 바이러스 NP 단백질의 단편의 하나 이상의 사본(예를 들어, 2, 3, 4, 5)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 발현할 수 있는 트랜스유전자를 포함할 수 있다.
실시예 6
본 실시예는 실시예 5에 기재된 바와 같은 아데노바이러스 기반 인플루엔자 백신의 제조를 기재한다.
먼저, 서열번호 106을 암호화하는 트랜스유전자를 함유하는 셔틀 벡터(Add2)는 종래의 분자 클로닝 기법을 이용하여 구성될 수 있다. 트랜스유전자는 CMV 프로모터에 의해 구동된다. 트랜스유전자의 발현은 이때 293T 세포 내로의 형질감염에 의해 확인될 수 있다. 벡터 구성체는, 형질감염된 293T 세포 내에서 폴리펩티드 발현이 관찰될 수 없는 경우, 최적화될 것이다.
이어서, Maxiprep pAdFlu51pep는 선형화될 것이고, 및 아데노바이러스 플라크의 생성을 위해 293 세포 내로 형질감염될 것이다. 복제 결함성 C68 헬퍼 바이러스 또는 C6 바이러스는 아데노바이러스 팩케이징을 위해 형질감염된 293 세포에 보충될 것이다. 바이러스 플라크는 플레이팅 후 7-10일에 형성될 것이다. 이어서, 플라크는 피킹될 수 있고, 향후 사용을 위해 동결될 수 있거나, 또는 바이러스의 팽창을 가능하게 할 수 있다. pAdFlu51pep 바이러스의 실험실 규모의 팽창은 T25, T75, 또는 심지어 T150과 같은 상이한 크기의 세포 배양 플라스크를 통해 하위융합성 293 세포의 일련의 계대배양에 의해 수행될 수 있다.
세포 배양 배지 및 용해된 세포는 바이러스 스탁을 위해 원심분리될 것이다. 역가 측정은 통상적인 바이러스 역가 측정 절차에 따라 수행될 것이다.
실시예 7
본 실시예는 인간 개체에서 실시예 5에 기재된 바와 같은 아데노바이러스 기반 백신에 대한 임상 연구를 기재한다.
건강한 성인에서 표 3의 51 가지의 상이한 에피토프 서열을 함유하는 아데노바이러스 기반 백신(AdFlu51pep 백신)을 평가하기 위해 오픈-라벨의 비통제 1상 연구가 수행된다.
목적: 18세 내지 55세 사이의 건강한 남성 및 여성 지원자에서 AdFlu51pep 백신의 안전성, 용인성 및 면역원성을 평가.
투여량
AdFlu51pep 백신의 출발 투여량은 3 x 105 PFU, 3 x 106 PFU, 3 x 107 PFU, 3 x 108 PFU, 및 1 x 109 PFU에서 투여량 레벨을 포함하는, 삼각근에 1회 근육내 주사에 의해 3 x 105 내지 1 x109 PFU 범위이다.
각각의 투여량 레벨은 6 내지 12명의 평가할 수 있는 건강한 성인에서 등록한다.
안전성 모니터링
주사 부위 및 전신 반응원성 및 약물 사용은 주사 후 7일 동안 및 추적 과정(14일째 및 28일째)에 기록될 수 있다. 임상 및 실험실 평가는 각각의 연구 방문 중에 수행될 수 있다. 실험실 분석은 총 혈구 분석 검사 및 크레아틴, C-반응성 단백질, 및 간 기능의 측정을 포함할 수 있다. 유해 사상은 각각의 참가자에 대해 목록화될 것이다.
면역원성
면역원성은 참가자의 혈청 샘플을 분석함으로써 평가될 수 있다. T 세포 면역원성을 분석하기 위한 IFN-γ ELISPOT는 베이스라인(백신화 이전) 및 주사 후 28일 및 180일에 수집된 참가자의 혈청 샘플을 이용하여 수행될 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 본 출원에 나타내고 기재하였지만, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 점을 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 현재 다수의 변화, 변경 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않고 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 발생할 것이다. 본 출원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 후술하는 특허청구범위는 본 발명의 범위를 한정하고, 이들 특허청구범위 내의 방법 및 구조체 및 이들의 등가물은 이들에 의해 커버되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> INVVAX, INC. <120> INFLUENZA VACCINES <130> 46690-708.601 <140> <141> <150> 62/550,167 <151> 2017-08-25 <150> 62/439,865 <151> 2016-12-28 <160> 118 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Pro Ala Thr Ala Gln Met Ala Leu 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Tyr Ser His Gly Thr Gly Thr Gly Tyr 1 5 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Leu Pro Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val 1 5 10 15 Val Arg <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser Thr Val Leu Gly Val 1 5 10 15 Ser <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg Cys His Arg 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Arg Arg Ala Ile Ala Thr Pro Gly Met 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Phe Met Tyr Ser Asp Phe His Phe Ile 1 5 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Met Arg Arg Asn Tyr Phe Thr Ala Glu Val Ser His Cys Arg Ala Thr 1 5 10 15 Glu Tyr <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Gln Leu Met Trp Ala Leu Gly Glu Asn Met Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr Asp Pro Arg 1 5 10 15 Leu <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Lys Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln 1 5 10 15 Ile <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Ala Glu Ile Glu Asp Leu Ile Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Cys Thr Glu Leu Lys Leu Thr Asp Gln 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Cys Thr Glu Leu Lys Leu Thr Asp Tyr 1 5 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Glu Leu Lys Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Gly Met Asp Pro Arg Met Cys Ser Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Ile Leu Arg Gly Ser Ile Ala His Lys 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Leu Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile 1 5 10 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp 1 5 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys 1 5 10 15 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Thr Leu Glu Leu Arg Ser Gly Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly 1 5 10 15 Gly Asn <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr 1 5 10 15 Ala Ala <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys 1 5 10 15 Ser <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe Glu Leu 1 5 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met 20 25 <210> 34 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met 20 25 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val 1 5 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys 1 5 10 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Cys Val Asn Gly Ser Cys Tyr Thr Val 1 5 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Glu Leu Lys Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly 1 5 10 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Phe Met Tyr Ser Asp Leu His Phe Ile 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Phe Met Tyr Thr Asp Phe His Phe Ile 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gly Arg Asp Pro Arg Met Cys Ser Leu 1 5 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Tyr Phe Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Ile Ile Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Ile Ala 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys 1 5 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Leu Gln Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Leu Glu Leu Arg Ser Arg His Trp Ala Ile 1 5 10 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Leu Val Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Arg Trp Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Tyr Ser His Trp Thr Gly Thr Gly Tyr 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Tyr Ser His Gly Ser Gly Thr Gly Tyr 1 5 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys 1 5 10 15 <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Ile Lys Gly Lys Phe Gln Thr 1 5 10 15 Ala Ala <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Val Lys Phe Gln Thr 1 5 10 15 Ala Ala <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Lys Thr 1 5 10 15 Ala Ala <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Ile 1 5 10 15 Ala Ala <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr Tyr Pro Arg 1 5 10 15 Leu <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr Asp Gln Arg 1 5 10 15 Leu <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys 1 5 10 15 Ser <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Lys Leu Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln 1 5 10 15 Ile <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Lys Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln 1 5 10 15 Val <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Phe Arg Tyr Thr Tyr Arg Cys His Arg 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg Cys Leu Arg 1 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg Cys Pro Arg 1 5 10 15 Gly <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg Cys His Arg 1 5 10 15 Val <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Phe Gln Gly Pro Gly Val Phe Glu Leu 1 5 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Ser Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser 1 5 10 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Gly Gln Val Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser 1 5 10 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Gly Gln Asn Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser 1 5 10 <210> 72 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met 20 25 <210> 73 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ser Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met 20 25 <210> 74 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Lys Arg Ala Leu 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met 20 25 <210> 75 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ser Leu 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met 20 25 <210> 76 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Ile 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met 20 25 <210> 77 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Gly Met Asp Pro Arg Met 20 25 <210> 78 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu 1 5 10 15 Val Arg Thr Gly Arg Asp Pro Arg Met 20 25 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu 1 5 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu 1 5 10 <210> 81 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Gly Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Val Lys Arg Glu Leu 20 25 30 Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Arg Val Lys Arg 35 40 45 Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Arg Val Lys Arg Thr Tyr Asn 50 55 60 Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu 65 70 <210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Glu Leu Arg Ser Arg His Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly 1 5 10 <210> 83 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ser Arg Thr Arg Ser Gly 1 5 10 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Phe Met Phe Ser Asp Phe His Phe Ile 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Val Leu Arg Gly Ser Ile Ala His Lys 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Leu Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu 1 5 <210> 87 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr 1 5 10 15 Ala Ala <210> 88 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Ile Lys Gly Lys Phe Gln Thr 1 5 10 15 Ala Ala <210> 89 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Lys Thr 1 5 10 15 Ala Ala <210> 90 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Ile 1 5 10 15 Ala Ala <210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr 1 5 10 15 Ala Val <210> 92 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Lys Trp Gly Met Glu Leu Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln 1 5 10 15 Ile <210> 93 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Ser Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Gly Gln Val Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser 1 5 10 <210> 95 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Leu Glu Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Pro Arg Ser Phe Thr Ser Cys 1 5 10 15 Gly Ser Leu Glu 20 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys 1 5 10 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 99 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 100 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg <210> 101 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> L-cyclohexylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Aminocaproic acid <400> 102 Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 103 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Gly Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser 1 5 10 15 Lys <210> 104 <211> 36519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 104 ccatcttcaa taatatacct caaacttttt gtgcgcgtta atatgcaaat gaggcgtttg 60 aatttgggga ggaagggcgg tgattggtcg agggatgagc gaccgttagg ggcggggcga 120 gtgacgtttt gatgacgtgg ttgcgaggag gagccagttt gcaagttctc gtgggaaaag 180 tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccgc gctctctgac 240 aggaaatgag gtgtttctgg gcggatgcaa gtgaaaacgg gccattttcg cgcgaaaact 300 gaatgaggaa gtgaaaatct gagtaatttc gcgtttatgg cagggaggag tatttgccga 360 gggccgagta gactttgacc gattacgtgg gggtttcgat taccgtgttt ttcacctaaa 420 tttccgcgta cggtgtcaaa gtccggtgtt tttacgtagg tgtcagctga tcgccagggt 480 atttaaacct gcgctctcca gtcaagaggc cactcttgag tgccagcgag aagagttttc 540 tcctccgcgc cgcgagtcag atctacactt tgaaagatga ggcacctgag agacctgccc 600 gatgagaaaa tcatcatcgc ttccgggaac gagattctgg aactggtggt aaatgccatg 660 atgggcgacg accctccgga gccccccacc ccatttgaga caccttcgct gcacgatttg 720 tatgatctgg aggtggatgt gcccgaggac gatcccaatg aggaggcggt aaatgatttt 780 tttagcgatg ccgcgctgct agctgccgag gaggcttcga gctctagctc agacagcgac 840 tcttcactgc atacccctag acccggcaga ggtgagaaaa agatccccga gcttaaaggg 900 gaagagatgg acttgcgctg ctatgaggaa tgcttgcccc cgagcgatga tgaggacgag 960 caggcgatcc agaacgcagc gagccaggga gtgcaagccg ccagcgagag ctttgcgctg 1020 gactgcccgc ctctgcccgg acacggctgt aagtcttgtg aatttcatcg catgaatact 1080 ggagataaag ctgtgttgtg tgcactttgc tatatgagag cttacaacca ttgtgtttac 1140 agtaagtgtg attaagttga actttagagg gaggcagaga gcagggtgac tgggcgatga 1200 ctggtttatt tatgtatata tgttctttat ataggtcccg tctctgacgc agatgatgag 1260 acccccacta caaagtccac ttcgtcaccc ccagaaattg gcacatctcc acctgagaat 1320 attgttagac cagttcctgt tagagccact gggaggagag cagctgtgga atgtttggat 1380 gacttgctac agggtggggt tgaacctttg gacttgtgta cccggaaacg ccccaggcac 1440 taagtgccac acatgtgtgt ttacttgagg tgatgtcagt atttataggg tgtggagtgc 1500 aataaaaaat gtgttgactt taagtgcgtg gtttatgact caggggtggg gactgtgagt 1560 atataagcag gtgcagacct gtgtggttag ctcagagcgg catggagatt tggacggtct 1620 tggaagactt tcacaagact agacagctgc tagagaacgc ctcgaacgga gtctcttacc 1680 tgtggagatt ctgcttcggt ggcgacctag ctaggctagt ctacagggcc aaacaggatt 1740 atagtgaaca atttgaggtt attttgagag agtgttctgg tctttttgac gctcttaact 1800 tgggccatca gtctcacttt aaccagagga tttcgagagc ccttgatttt actactcctg 1860 gcagaaccac tgcagcagta gccttttttg cttttattct tgacaaatgg agtcaagaaa 1920 cccatttcag cagggattac cagctggatt tcttagcagt agctttgtgg agaacatgga 1980 agtgccagcg cctgaatgca atctccggct acttgccggt acagccgcta gacactctga 2040 ggatcctgaa tctccaggag agtcccaggg cacgccaacg tcgccagcag cagcagcagg 2100 aggaggatca agaagagaac ccgagagccg gcctggaccc tccggcggag gaggaggagt 2160 agctgacctg tttcctgaac tgcgccgggt gctgactagg tcttcgagtg gtcgggagag 2220 ggggattaag cgggagaggc atgatgagac taatcacaga actgaactga ctgtgggtct 2280 gatgagtcgc aagcgcccag aaacagtgtg gtggcatgag gtgcagtcga ctggcacaga 2340 tgaggtgtcg gtgatgcatg agaggttttc tctagaacaa gtcaagactt gttggttaga 2400 gcctgaggat gattgggagg tagccatcag gaattatgcc aagctggctc tgaggccaga 2460 caagaagtac aagattacta agctgataaa tatcagaaat gcctgctaca tctcagggaa 2520 tggggctgaa gtggagatct gtctccagga aagggtggct ttcagatgct gcatgatgaa 2580 tatgtacccg ggagtggtgg gcatggatgg ggttaccttt atgaacatga ggttcagggg 2640 agatgggtat aatggcacgg tctttatggc caataccaag ctgacagtcc atggctgctc 2700 cttctttggg tttaataaca cctgcatcga ggcctggggt caggtcggtg tgaggggctg 2760 cagtttttca gccaactgga tgggggtcgt gggcaggacc aagagtatgc tgtccgtgaa 2820 gaaatgcttg tttgagaggt gccacctggg ggtgatgagc gagggcgaag ccagaatccg 2880 ccactgcgcc tctaccgaga cgggctgctt tgtgctgtgc aagggcaatg ctaagatcaa 2940 gcataatatg atctgtggag cctcggacga gcgcggctac cagatgctga cctgcgccgg 3000 cgggaacagc catatgctgg ccaccgtaca tgtggcttcc catgctcgca agccctggcc 3060 cgagttcgag cacaatgtca tgaccaggtg caatatgcat ctggggtccc gccgaggcat 3120 gttcatgccc taccagtgca acctgaatta tgtgaaggtg ctgctggagc ccgatgccat 3180 gtccagagtg agcctgacgg gggtgtttga catgaatgtg gaggtgtgga agattctgag 3240 atatgatgaa tccaagacca ggtgccgagc ctgcgagtgc ggagggaagc atgccaggtt 3300 ccagcccgtg tgtgtggatg tgacggagga cctgcgaccc gatcatttgg tgttgccctg 3360 caccgggacg gagttcggtt ccagcgggga agaatctgac tagagtgagt agtgttctgg 3420 ggcgggggag gacctgcatg agggccagaa taactgaaat ctgtgctttt ctgtgtgttg 3480 cagcagcatg agcggaagcg gctcctttga gggaggggta ttcagccctt atctgacggg 3540 gcgtctcccc tcctgggcgg gagtgcgtca gaatgtgatg ggatccacgg tggacggccg 3600 gcccgtgcag cccgcgaact cttcaaccct gacctatgca accctgagct cttcgtcgtt 3660 ggacgcagct gccgccgcag ctgctgcatc tgccgccagc gccgtgcgcg gaatggccat 3720 gggcgccggc tactacggca ctctggtggc caactcgagt tccaccaata atcccgccag 3780 cctgaacgag gagaagctgt tgctgctgat ggcccagctc gaggccttga cccagcgcct 3840 gggcgagctg acccagcagg tggctcagct gcaggagcag acgcgggccg cggttgccac 3900 ggtgaaatcc aaataaaaaa tgaatcaata aataaacgga gacggttgtt gattttaaca 3960 cagagtctga atctttattt gatttttcgc gcgcggtagg ccctggacca ccggtctcga 4020 tcattgagca cccggtggat cttttccagg acccggtaga ggtgggcttg gatgttgagg 4080 tacatgggca tgagcccgtc ccgggggtgg aggtagctcc attgcagggc ctcgtgctcg 4140 ggggtggtgt tgtaaatcac ccagtcatag caggggcgca gggcatggtg ttgcacaata 4200 tctttgagga ggagactgat ggccacgggc agccctttgg tgtaggtgtt tacaaatctg 4260 ttgagctggg agggatgcat gcggggggag atgaggtgca tcttggcctg gatcttgaga 4320 ttggcgatgt taccgcccag atcccgcctg gggttcatgt tgtgcaggac caccagcacg 4380 gtgtatccgg tgcacttggg gaatttatca tgcaacttgg aagggaaggc gtgaaagaat 4440 ttggcgacgc ctttgtgccc gcccaggttt tccatgcact catccatgat gatggcgatg 4500 ggcccgtggg cggcggcctg ggcaaagacg tttcgggggt cggacacatc atagttgtgg 4560 tcctgggtga ggtcatcata ggccatttta atgaatttgg ggcggagggt gccggactgg 4620 gggacaaagg taccctcgat cccgggggcg tagttcccct cacagatctg catctcccag 4680 gctttgagct cggagggggg gatcatgtcc acctgcgggg cgataaagaa cacggtttcc 4740 ggggcggggg agatgagctg ggccgaaagc aagttccgga gcagctggga cttgccgcag 4800 ccggtggggc cgtagatgac cccgatgacc ggctgcaggt ggtagttgag ggagagacag 4860 ctgccgtcct cccggaggag gggggccacc tcgttcatca tctcgcgcac gtgcatgttc 4920 tcgcgcacca gttccgccag gaggcgctct ccccccaggg ataggagctc ctggagcgag 4980 gcgaagtttt tcagcggctt gagtccgtcg gccatgggca ttttggagag ggtttgttgc 5040 aagagttcca ggcggtccca gagctcggtg atgtgctcta cggcatctcg atccagcaga 5100 cctcctcgtt tcgcgggttg ggacggctgc gggagtaggg caccagacga tgggcgtcca 5160 gcgcagccag ggtccggtcc ttccagggtc gcagcgtccg cgtcagggtg gtctccgtca 5220 cggtgaaggg gtgcgcgccg ggctgggcgc ttgcgagggt gcgcttcagg ctcatccggc 5280 tggtcgaaaa ccgctcccga tcggcgccct gcgcgtcggc caggtagcaa ttgaccatga 5340 gttcgtagtt gagcgcctcg gccgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagtct 5400 gcccgcaggc gggacagagg agggacttga gggcgtagag cttgggggcg aggaagacgg 5460 actcgggggc gtaggcgtcc gcgccgcagt gggcgcagac ggtctcgcac tccacgagcc 5520 aggtgaggtc gggctggtcg gggtcaaaaa ccagtttccc gccgttcttt ttgatgcgtt 5580 tcttaccttt ggtctccatg agctcgtgtc cccgctgggt gacaaagagg ctgtccgtgt 5640 ccccgtagac cgactttatg ggccggtcct cgagcggtgt gccgcggtcc tcctcgtaga 5700 ggaaccccgc ccactccgag acgaaagccc gggtccaggc cagcacgaag gaggccacgt 5760 gggacgggta gcggtcgttg tccaccagcg ggtccacctt ttccagggta tgcaaacaca 5820 tgtccccctc gtccacatcc aggaaggtga ttggcttgta agtgtaggcc acgtgaccgg 5880 gggtcccggc cgggggggta taaaagggtg cgggtccctg ctcgtcctca ctgtcttccg 5940 gatcgctgtc caggagcgcc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga 6000 cctcggcact caggttgtca gtttctagaa acgaggagga tttgatattg acggtgccgg 6060 cggagatgcc tttcaagagc ccctcgtcca tctggtcaga aaagacgatc tttttgttgt 6120 cgagcttggt ggcgaaggag ccgtagaggg cgttggagag gagcttggcg atggagcgca 6180 tggtctggtt tttttccttg tcggcgcgct ccttggcggc gatgttgagc tgcacgtact 6240 cgcgcgccac gcacttccat tcggggaaga cggtggtcag ctcgtcgggc acgattctga 6300 cctgccagcc ccgattatgc agggtgatga ggtccacact ggtggccacc tcgccgcgca 6360 ggggctcatt agtccagcag aggcgtccgc ccttgcgcga gcagaagggg ggcagggggt 6420 ccagcatgac ctcgtcgggg gggtcggcat cgatggtgaa gatgccgggc aggaggtcgg 6480 ggtcaaagta gctgatggaa gtggccagat cgtccagggc agcttgccat tcgcgcacgg 6540 ccagcgcgcg ctcgtaggga ctgaggggcg tgccccaggg catgggatgg gtaagcgcgg 6600 aggcgtacat gccgcagatg tcgtagacgt agaggggctc ctcgaggatg ccgatgtagg 6660 tggggtagca gcgccccccg cggatgctgg cgcgcacgta gtcatacagc tcgtgcgagg 6720 gggcgaggag ccccgggccc aggttggtgc gactgggctt ttcggcgcgg tagacgatct 6780 ggcggaaaat ggcatgcgag ttggaggaga tggtgggcct ttggaagatg ttgaagtggg 6840 cgtggggcag tccgaccgag tcgcggatga agtgggcgta ggagtcttgc agcttggcga 6900 cgagctcggc ggtgactagg acgtccagag cgcagtagtc gagggtctcc tggatgatgt 6960 catacttgag ctgtcccttt tgtttccaca gctcgcggtt gagaaggaac tcttcgcggt 7020 ccttccagta ctcttcgagg gggaacccgt cctgatctgc acggtaagag cctagcatgt 7080 agaactggtt gacggccttg taggcgcagc agcccttctc cacggggagg gcgtaggcct 7140 gggcggcctt gcgcagggag gtgtgcgtga gggcgaaagt gtccctgacc atgaccttga 7200 ggaactggtg cttgaagtcg atatcgtcgc agcccccctg ctcccagagc tggaagtccg 7260 tgcgcttctt gtaggcgggg ttgggcaaag cgaaagtaac atcgttgaag aggatcttgc 7320 ccgcgcgggg cataaagttg cgagtgatgc ggaaaggttg gggcacctcg gcccggttgt 7380 tgatgacctg ggcggcgagc acgatctcgt cgaagccgtt gatgttgtgg cccacgatgt 7440 agagttccac gaatcgcgga cggcccttga cgtggggcag tttcttgagc tcctcgtagg 7500 tgagctcgtc ggggtcgctg agcccgtgct gctcgagcgc ccagtcggcg agatgggggt 7560 tggcgcggag gaaggaagtc cagagatcca cggccagggc ggtttgcaga cggtcccggt 7620 actgacggaa ctgctgcccg acggccattt tttcgggggt gacgcagtag aaggtgcggg 7680 ggtccccgtg ccagcgatcc catttgagct ggagggcgag atcgagggcg agctcgacga 7740 gccggtcgtc cccggagagt ttcatgacca gcatgaaggg gacgagctgc ttgccgaagg 7800 accccatcca ggtgtaggtt tccacatcgt aggtgaggaa gagcctttcg gtgcgaggat 7860 gcgagccgat ggggaagaac tggatctcct gccaccaatt ggaggaatgg ctgttgatgt 7920 gatggaagta gaaatgccga cggcgcgccg aacactcgtg cttgtgttta tacaagcggc 7980 cacagtgctc gcaacgctgc acgggatgca cgtgctgcac gagctgtacc tgagttcctt 8040 tgacgaggaa tttcagtggg aagtggagtc gtggcgcctg catctcgtgc tgtactacgt 8100 cgtggtggtc ggcctggccc tcttctgcct cgatggtggt catgctgacg agcccgcgcg 8160 ggaggcaggt ccagacctcg gcgcgagcgg gtcggagagc gaggacgagg gcgcgcaggc 8220 cggagctgtc cagggtcctg agacgctgcg gagtcaggtc agtgggcagc ggcggcgcgc 8280 ggttgacttg caggagtttt tccagggcgc gcgggaggtc cagatggtac ttgatctcca 8340 ccgcgccatt ggtggcgacg tcgatggctt gcagggtccc gtgcccctgg ggtgtgacca 8400 ccgtcccccg tttcttcttg ggcggctggg gcgacggggg cggtgcctct tccatggtta 8460 gaagcggcgg cgaggacgcg cgccgggcgg caggggcggc tcggggcccg gaggcagggg 8520 cggcaggggc acgtcggcgc cgcgcgcggg taggttctgg tactgcgccc ggagaagact 8580 ggcgtgagcg acgacgcgac ggttgacgtc ctggatctga cgcctctggg tgaaggccac 8640 gggacccgtg agtttgaacc tgaaagagag ttcgacagaa tcaatctcgg tatcgttgac 8700 ggcggcctgc cgcaggatct cttgcacgtc gcccgagttg tcctggtagg cgatctcggt 8760 catgaactgc tcgatctcct cctcttgaag gtctccgcgg ccggcgcgct ccacggtggc 8820 cgcgaggtcg ttggagatgc ggcccatgag ctgcgagaag gcgttcatgc ccgcctcgtt 8880 ccagacgcgg ctgtagacca cgacgccctc gggatcgccg gcgcgcatga ccacctgggc 8940 gaggttgagc tccacgtggc gcgtgaagac cgcgtagttg cagaggcgct ggtagaggta 9000 gttgagcgtg gtggcgatgt gctcggtgac gaagaaatac atgatccagc ggcggagcgg 9060 catctcgctg acgtcgccca gcgcctccaa acgttccatg gcctcgtaaa agtccacggc 9120 gaagttgaaa aactgggagt tgcgcgccga gacggtcaac tcctcctcca gaagacggat 9180 gagctcggcg atggtggcgc gcacctcgcg ctcgaaggcc cccgggagtt cctccacttc 9240 ctcttcttcc tcctccacta acatctcttc tacttcctcc tcaggcggca gtggtggcgg 9300 gggagggggc ctgcgtcgcc ggcggcgcac gggcagacgg tcgatgaagc gctcgatggt 9360 ctcgccgcgc cggcgtcgca tggtctcggt gacggcgcgc ccgtcctcgc ggggccgcag 9420 cgtgaagacg ccgccgcgca tctccaggtg gccggggggg tccccgttgg gcagggagag 9480 ggcgctgacg atgcatctta tcaattgccc cgtagggact ccgcgcaagg acctgagcgt 9540 ctcgagatcc acgggatctg aaaaccgctg aacgaaggct tcgagccagt cgcagtcgca 9600 aggtaggctg agcacggttt cttctggcgg gtcatgttgg ttgggagcgg ggcgggcgat 9660 gctgctggtg atgaagttga aataggcggt tctgagacgg cggatggtgg cgaggagcac 9720 caggtctttg ggcccggctt gctggatgcg cagacggtcg gccatgcccc aggcgtggtc 9780 ctgacacctg gccaggtcct tgtagtagtc ctgcatgagc cgctccacgg gcacctcctc 9840 ctcgcccgcg cggccgtgca tgcgcgtgag cccgaagccg cgctggggct ggacgagcgc 9900 caggtcggcg acgacgcgct cggcgaggat ggcttgctgg atctgggtga gggtggtctg 9960 gaagtcatca aagtcgacga agcggtggta ggctccggtg ttgatggtgt aggagcagtt 10020 ggccatgacg gaccagttga cggtctggtg gcccggacgc acgagctcgt ggtacttgag 10080 gcgcgagtag gcgcgcgtgt cgaagatgta gtcgttgcag gtgcgcacca ggtactggta 10140 gccgatgagg aagtgcggcg gcggctggcg gtagagcggc catcgctcgg tggcgggggc 10200 gccgggcgcg aggtcctcga gcatggtgcg gtggtagccg tagatgtacc tggacatcca 10260 ggtgatgccg gcggcggtgg tggaggcgcg cgggaactcg cggacgcggt tccagatgtt 10320 gcgcagcggc aggaagtagt tcatggtggg cacggtctgg cccgtgaggc gcgcgcagtc 10380 gtggatgctc tatacgggca aaaacgaaag cggtcagcgg ctcgactccg tggcctggag 10440 gctaagcgaa cgggttgggc tgcgcgtgta ccccggttcg aatctcgaat caggctggag 10500 ccgcagctaa cgtggtattg gcactcccgt ctcgacccaa gcctgcacca accctccagg 10560 atacggaggc gggtcgtttt gcaacttttt tttggaggcc ggatgagact agtaagcgcg 10620 gaaagcggcc gaccgcgatg gctcgctgcc gtagtctgga gaagaatcgc cagggttgcg 10680 ttgcggtgtg ccccggttcg aggccggccg gattccgcgg ctaacgaggg cgtggctgcc 10740 ccgtcgtttc caagacccca tagccagccg acttctccag ttacggagcg agcccctctt 10800 ttgttttgtt tgtttttgcc agatgcatcc cgtactgcgg cagatgcgcc cccaccaccc 10860 tccaccgcaa caacagcccc ctccacagcc ggcgcttctg cccccgcccc agcagcaact 10920 tccagccacg accgccgcgg ccgccgtgag cggggctgga cagagttatg atcaccagct 10980 ggccttggaa gagggcgagg ggctggcgcg cctgggggcg tcgtcgccgg agcggcaccc 11040 gcgcgtgcag atgaaaaggg acgctcgcga ggcctacgtg cccaagcaga acctgttcag 11100 agacaggagc ggcgaggagc ccgaggagat gcgcgcggcc cggttccacg cggggcggga 11160 gctgcggcgc ggcctggacc gaaagagggt gctgagggac gaggatttcg aggcggacga 11220 gctgacgggg atcagccccg cgcgcgcgca cgtggccgcg gccaacctgg tcacggcgta 11280 cgagcagacc gtgaaggagg agagcaactt ccaaaaatcc ttcaacaacc acgtgcgcac 11340 cctgatcgcg cgcgaggagg tgaccctggg cctgatgcac ctgtgggacc tgctggaggc 11400 catcgtgcag aaccccacca gcaagccgct gacggcgcag ctgttcctgg tggtgcagca 11460 tagtcgggac aacgaagcgt tcagggaggc gctgctgaat atcaccgagc ccgagggccg 11520 ctggctcctg gacctggtga acattctgca gagcatcgtg gtgcaggagc gcgggctgcc 11580 gctgtccgag aagctggcgg ccatcaactt ctcggtgctg agtttgggca agtactacgc 11640 taggaagatc tacaagaccc cgtacgtgcc catagacaag gaggtgaaga tcgacgggtt 11700 ttacatgcgc atgaccctga aagtgctgac cctgagcgac gatctggggg tgtaccgcaa 11760 cgacaggatg caccgtgcgg tgagcgccag caggcggcgc gagctgagcg accaggagct 11820 gatgcatagt ctgcagcggg ccctgaccgg ggccgggacc gagggggaga gctactttga 11880 catgggcgcg gacctgcact ggcagcccag ccgccgggcc ttggaggcgg cggcaggacc 11940 ctacgtagaa gaggtggacg atgaggtgga cgaggagggc gagtacctgg aagactgatg 12000 gcgcgaccgt atttttgcta gatgcaacaa caacagccac ctcctgatcc cgcgatgcgg 12060 gcggcgctgc agagccagcc gtccggcatt aactcctcgg acgattggac ccaggccatg 12120 caacgcatca tggcgctgac gacccgcaac cccgaagcct ttagacagca gccccaggcc 12180 aaccggctct cggccatcct ggaggccgtg gtgccctcgc gctccaaccc cacgcacgag 12240 aaggtcctgg ccatcgtgaa cgcgctggtg gagaacaagg ccatccgcgg cgacgaggcc 12300 ggcctggtgt acaacgcgct gctggagcgc gtggcccgct acaacagcac caacgtgcag 12360 accaacctgg accgcatggt gaccgacgtg cgcgaggccg tggcccagcg cgagcggttc 12420 caccgcgagt ccaacctggg atccatggtg gcgctgaacg ccttcctcag cacccagccc 12480 gccaacgtgc cccggggcca ggaggactac accaacttca tcagcgccct gcgcctgatg 12540 gtgaccgagg tgccccagag cgaggtgtac cagtccgggc cggactactt cttccagacc 12600 agtcgccagg gcttgcagac cgtgaacctg agccaggctt tcaagaactt gcagggcctg 12660 tggggcgtgc aggccccggt cggggaccgc gcgacggtgt cgagcctgct gacgccgaac 12720 tcgcgcctgc tgctgctgct ggtggccccc ttcacggaca gcggcagcat caaccgcaac 12780 tcgtacctgg gctacctgat taacctgtac cgcgaggcca tcggccaggc gcacgtggac 12840 gagcagacct accaggagat cacccacgtg agccgcgccc tgggccagga cgacccgggc 12900 aacctggaag ccaccctgaa ctttttgctg accaaccggt cgcagaagat cccgccccag 12960 tacgcgctca gcaccgagga ggagcgcatc ctgcgttacg tgcagcagag cgtgggcctg 13020 ttcctgatgc aggagggggc cacccccagc gccgcgctcg acatgaccgc gcgcaacatg 13080 gagcccagca tgtacgccag caaccgcccg ttcatcaata aactgatgga ctacttgcat 13140 cgggcggccg ccatgaactc tgactatttc accaacgcca tcctgaatcc ccactggctc 13200 ccgccgccgg ggttctacac gggcgagtac gacatgcccg accccaatga cgggttcctg 13260 tgggacgatg tggacagcag cgtgttctcc ccccgaccgg gtgctaacga gcgccccttg 13320 tggaagaagg aaggcagcga ccgacgcccg tcctcggcgc tgtccggccg cgagggtgct 13380 gccgcggcgg tgcccgaggc cgccagtcct ttcccgagct tgcccttctc gctgaacagt 13440 atccgcagca gcgagctggg caggatcacg cgcccgcgct tgctgggcga agaggagtac 13500 ttgaatgact cgctgttgag acccgagcgg gagaagaact tccccaataa cgggatagaa 13560 agcctggtgg acaagatgag ccgctggaag acgtatgcgc aggagcacag ggacgatccc 13620 cgggcgtcgc agggggccac gagccggggc agcgccgccc gtaaacgccg gtggcacgac 13680 aggcagcggg gacagatgtg ggacgatgag gactccgccg acgacagcag cgtgttggac 13740 ttgggtggga gtggtaaccc gttcgctcac ctgcgccccc gtatcgggcg catgatgtaa 13800 gagaaaccga aaataaatga tactcaccaa ggccatggcg accagcgtgc gttcgtttct 13860 tctctgttgt tgttgtatct agtatgatga ggcgtgcgta cccggagggt cctcctccct 13920 cgtacgagag cgtgatgcag caggcgatgg cggcggcggc gatgcagccc ccgctggagg 13980 ctccttacgt gcccccgcgg tacctggcgc ctacggaggg gcggaacagc attcgttact 14040 cggagctggc acccttgtac gataccaccc ggttgtacct ggtggacaac aagtcggcgg 14100 acatcgcctc gctgaactac cagaacgacc acagcaactt cctgaccacc gtggtgcaga 14160 acaatgactt cacccccacg gaggccagca cccagaccat caactttgac gagcgctcgc 14220 ggtggggcgg ccagctgaaa accatcatgc acaccaacat gcccaacgtg aacgagttca 14280 tgtacagcaa caagttcaag gcgcgggtga tggtctcccg caagaccccc aatggggtga 14340 cagtgacaga ggattatgat ggtagtcagg atgagctgaa gtatgaatgg gtggaatttg 14400 agctgcccga aggcaacttc tcggtgacca tgaccatcga cctgatgaac aacgccatca 14460 tcgacaatta cttggcggtg gggcggcaga acggggtgct ggagagcgac atcggcgtga 14520 agttcgacac taggaacttc aggctgggct gggaccccgt gaccgagctg gtcatgcccg 14580 gggtgtacac caacgaggct ttccatcccg atattgtctt gctgcccggc tgcggggtgg 14640 acttcaccga gagccgcctc agcaacctgc tgggcattcg caagaggcag cccttccagg 14700 aaggcttcca gatcatgtac gaggatctgg aggggggcaa catccccgcg ctcctggatg 14760 tcgacgccta tgagaaaagc aaggaggatg cagcagctga agcaactgca gccgtagcta 14820 ccgcctctac cgaggtcagg ggcgataatt ttgcaagcgc cgcagcagtg gcagcggccg 14880 aggcggctga aaccgaaagt aagatagtca ttcagccggt ggagaaggat agcaagaaca 14940 ggagctacaa cgtactaccg gacaagataa acaccgccta ccgcagctgg tacctagcct 15000 acaactatgg cgaccccgag aagggcgtgc gctcctggac gctgctcacc acctcggacg 15060 tcacctgcgg cgtggagcaa gtctactggt cgctgcccga catgatgcaa gacccggtca 15120 ccttccgctc cacgcgtcaa gttagcaact acccggtggt gggcgccgag ctcctgcccg 15180 tctactccaa gagcttcttc aacgagcagg ccgtctactc gcagcagctg cgcgccttca 15240 cctcgcttac gcacgtcttc aaccgcttcc ccgagaacca gatcctcgtc cgcccgcccg 15300 cgcccaccat taccaccgtc agtgaaaacg ttcctgctct cacagatcac gggaccctgc 15360 cgctgcgcag cagtatccgg ggagtccagc gcgtgaccgt tactgacgcc agacgccgca 15420 cctgccccta cgtctacaag gccctgggca tagtcgcgcc gcgcgtcctc tcgagccgca 15480 ccttctaaat gtccattctc atctcgccca gtaataacac cggttggggc ctgcgcgcgc 15540 ccagcaagat gtacggaggc gctcgccaac gctccacgca acaccccgtg cgcgtgcgcg 15600 ggcacttccg cgctccctgg ggcgccctca agggccgcgt gcggtcgcgc accaccgtcg 15660 acgacgtgat cgaccaggtg gtggccgacg cgcgcaacta cacccccgcc gccgcgcccg 15720 tctccaccgt ggacgccgtc atcgacagcg tggtggcgga cgcgcgccgg tacgcccgcg 15780 ccaagagccg gcggcggcgc atcgcccggc ggcaccggag cacccccgcc atgcgcgcgg 15840 cgcgagcctt gctgcgcagg gccaggcgca cgggacgcag ggccatgctc agggcggcca 15900 gacgcgcggc ttcaggcgcc agcgccggca ggacccggag acgcgcggcc acggcggcgg 15960 cagcggccat cgccagcatg tcccgcccgc ggcgagggaa cgtgtactgg gtgcgcgacg 16020 ccgccaccgg tgtgcgcgtg cccgtgcgca cccgcccccc tcgcacttga agatgttcac 16080 ttcgcgatgt tgatgtgtcc cagcggcgag gaggatgtcc aagcgcaaat tcaaggaaga 16140 gatgctccag gtcatcgcgc ctgagatcta cggccctgcg gtggtgaagg aggaaagaaa 16200 gccccgcaaa atcaagcggg tcaaaaagga caaaaaggaa gaagaaagtg atgtggacgg 16260 attggtggag tttgtgcgcg agttcgcccc ccggcggcgc gtgcagtggc gcgggcggaa 16320 ggtgcaaccg gtgctgagac ccggcaccac cgtggtcttc acgcccggcg agcgctccgg 16380 caccgcttcc aagcgctcct acgacgaggt gtacggggat gatgatattc tggagcaggc 16440 ggccgagcgc ctgggcgagt ttgcttacgg caagcgcagc cgttccgcac cgaaggaaga 16500 ggcggtgtcc atcccgctgg accacggcaa ccccacgccg agcctcaagc ccgtgacctt 16560 gcagcaggtg ctgccgaccg cggcgccgcg ccgggggttc aagcgcgagg gcgaggatct 16620 gtaccccacc atgcagctga tggtgcccaa gcgccagaag ctggaagacg tgctggagac 16680 catgaaggtg gacccggacg tgcagcccga ggtcaaggtg cggcccatca agcaggtggc 16740 cccgggcctg ggcgtgcaga ccgtggacat caagattccc acggagccca tggaaacgca 16800 gaccgagccc atgatcaagc ccagcaccag caccatggag gtgcagacgg atccctggat 16860 gccatcggct cctagtcgaa gaccccggcg caagtacggc gcggccagcc tgctgatgcc 16920 caactacgcg ctgcatcctt ccatcatccc cacgccgggc taccgcggca cgcgcttcta 16980 ccgcggtcat accagcagcc gccgccgcaa gaccaccact cgccgccgcc gtcgccgcac 17040 cgccgctgca accacccctg ccgccctggt gcggagagtg taccgccgcg gccgcgcacc 17100 tctgaccctg ccgcgcgcgc gctaccaccc gagcatcgcc atttaaactt tcgccagctt 17160 tgcagatcaa tggccctcac atgccgcctt cgcgttccca ttacgggcta ccgaggaaga 17220 aaaccgcgcc gtagaaggct ggcggggaac gggatgcgtc gccaccacca ccggcggcgg 17280 cgcgccatca gcaagcggtt ggggggaggc ttcctgcccg cgctgatccc catcatcgcc 17340 gcggcgatcg gggcgatccc cggcattgct tccgtggcgg tgcaggcctc tcagcgccac 17400 tgagacacac ttggaaacat cttgtaataa acccatggac tctgacgctc ctggtcctgt 17460 gatgtgtttt cgtagacaga tggaagacat caatttttcg tccctggctc cgcgacacgg 17520 cacgcggccg ttcatgggca cctggagcga catcggcacc agccaactga acgggggcgc 17580 cttcaattgg agcagtctct ggagcgggct taagaatttc gggtccacgc ttaaaaccta 17640 tggcagcaag gcgtggaaca gcaccacagg gcaggcgctg agggataagc tgaaagagca 17700 gaacttccag cagaaggtgg tcgatgggct cgcctcgggc atcaacgggg tggtggacct 17760 ggccaaccag gccgtgcagc ggcagatcaa cagccgcctg gacccggtgc cgcccgccgg 17820 ctccgtggag atgccgcagg tggaggagga gctgcctccc ctggacaagc ggggcgagaa 17880 gcgaccccgc cccgatgcgg aggagacgct gctgacgcac acggacgagc cgcccccgta 17940 cgaggaggcg gtgaaactgg gtctgcccac cacgcggccc atcgcgcccc tggccaccgg 18000 ggtgctgaaa cccgaaaagc ccgcgaccct ggacttgcct cctccccagc cttcccgccc 18060 ctctacagtg gctaagcccc tgccgccggt ggccgtggcc cgcgcgcgac ccgggggcac 18120 cgcccgccct catgcgaact ggcagagcac tctgaacagc atcgtgggtc tgggagtgca 18180 gagtgtgaag cgccgccgct gctattaaac ctaccgtagc gcttaacttg cttgtctgtg 18240 tgtgtatgta ttatgtcgcc gccgccgctg tccaccagaa ggaggagtga agaggcgcgt 18300 cgccgagttg caagatggcc accccatcga tgctgcccca gtgggcgtac atgcacatcg 18360 ccggacagga cgcttcggag tacctgagtc cgggtctggt gcagtttgcc cgcgccacag 18420 acacctactt cagtctgggg aacaagttta ggaaccccac ggtggcgccc acgcacgatg 18480 tgaccaccga ccgcagccag cggctgacgc tgcgcttcgt gcccgtggac cgcgaggaca 18540 acacctactc gtacaaagtg cgctacacgc tggccgtggg cgacaaccgc gtgctggaca 18600 tggccagcac ctactttgac atccgcggcg tgctggatcg gggccctagc ttcaaaccct 18660 actccggcac cgcctacaac agtctggccc ccaagggagc acccaacact tgtcagtgga 18720 catataaagc cgatggtgaa actgccacag aaaaaaccta tacatatgga aatgcacccg 18780 tgcagggcat taacatcaca aaagatggta ttcaacttgg aactgacacc gatgatcagc 18840 caatctacgc agataaaacc tatcagcctg aacctcaagt gggtgatgct gaatggcatg 18900 acatcactgg tactgatgaa aagtatggag gcagagctct taagcctgat accaaaatga 18960 agccttgtta tggttctttt gccaagccta ctaataaaga aggaggtcag gcaaatgtga 19020 aaacaggaac aggcactact aaagaatatg acatagacat ggctttcttt gacaacagaa 19080 gtgcggctgc tgctggccta gctccagaaa ttgttttgta tactgaaaat gtggatttgg 19140 aaactccaga tacccatatt gtatacaaag caggcacaga tgacagcagc tcttctatta 19200 atttgggtca gcaagccatg cccaacagac ctaactacat tggtttcaga gacaacttta 19260 tcgggctcat gtactacaac agcactggca atatgggggt gctggccggt caggcttctc 19320 agctgaatgc tgtggttgac ttgcaagaca gaaacaccga gctgtcctac cagctcttgc 19380 ttgactctct gggtgacaga acccggtatt tcagtatgtg gaatcaggcg gtggacagct 19440 atgatcctga tgtgcgcatt attgaaaatc atggtgtgga ggatgaactt cccaactatt 19500 gtttccctct ggatgctgtt ggcagaacag atacttatca gggaattaag gctaatggaa 19560 ctgatcaaac cacatggacc aaagatgaca gtgtcaatga tgctaatgag ataggcaagg 19620 gtaatccatt cgccatggaa atcaacatcc aagccaacct gtggaggaac ttcctctacg 19680 ccaacgtggc cctgtacctg cccgactctt acaagtacac gccggccaat gttaccctgc 19740 ccaccaacac caacacctac gattacatga acggccgggt ggtggcgccc tcgctggtgg 19800 actcctacat caacatcggg gcgcgctggt cgctggatcc catggacaac gtgaacccct 19860 tcaaccacca ccgcaatgcg gggctgcgct accgctccat gctcctgggc aacgggcgct 19920 acgtgccctt ccacatccag gtgccccaga aatttttcgc catcaagagc ctcctgctcc 19980 tgcccgggtc ctacacctac gagtggaact tccgcaagga cgtcaacatg atcctgcaga 20040 gctccctcgg caacgacctg cgcacggacg gggcctccat ctccttcacc agcatcaacc 20100 tctacgccac cttcttcccc atggcgcaca acacggcctc cacgctcgag gccatgctgc 20160 gcaacgacac caacgaccag tccttcaacg actacctctc ggcggccaac atgctctacc 20220 ccatcccggc caacgccacc aacgtgccca tctccatccc ctcgcgcaac tgggccgcct 20280 tccgcggctg gtccttcacg cgtctcaaga ccaaggagac gccctcgctg ggctccgggt 20340 tcgaccccta cttcgtctac tcgggctcca tcccctacct cgacggcacc ttctacctca 20400 accacacctt caagaaggtc tccatcacct tcgactcctc cgtcagctgg cccggcaacg 20460 accggctcct gacgcccaac gagttcgaaa tcaagcgcac cgtcgacggc gagggctaca 20520 acgtggccca gtgcaacatg accaaggact ggttcctggt ccagatgctg gcccactaca 20580 acatcggcta ccagggcttc tacgtgcccg agggctacaa ggaccgcatg tactccttct 20640 tccgcaactt ccagcccatg agccgccagg tggtggacga ggtcaactac aaggactacc 20700 aggccgtcac cctggcctac cagcacaaca actcgggctt cgtcggctac ctcgcgccca 20760 ccatgcgcca gggccagccc taccccgcca actaccccta cccgctcatc ggcaagagcg 20820 ccgtcaccag cgtcacccag aaaaagttcc tctgcgacag ggtcatgtgg cgcatcccct 20880 tctccagcaa cttcatgtcc atgggcgcgc tcaccgacct cggccagaac atgctctatg 20940 ccaactccgc ccacgcgcta gacatgaatt tcgaagtcga ccccatggat gagtccaccc 21000 ttctctatgt tgtcttcgaa gtcttcgacg tcgtccgagt gcaccagccc caccgcggcg 21060 tcatcgaggc cgtctacctg cgcaccccct tctcggccgg taacgccacc acctaagctc 21120 ttgcttcttg caagccatgg ccgcgggctc cggcgagcag gagctcaggg ccatcatccg 21180 cgacctgggc tgcgggccct acttcctggg caccttcgat aagcgcttcc cgggattcat 21240 ggccccgcac aagctggcct gcgccatcgt caacacggcc ggccgcgaga ccgggggcga 21300 gcactggctg gccttcgcct ggaacccgcg ctcgaacacc tgctacctct tcgacccctt 21360 cgggttctcg gacgagcgcc tcaagcagat ctaccagttc gagtacgagg gcctgctgcg 21420 ccgcagcgcc ctggccaccg aggaccgctg cgtcaccctg gaaaagtcca cccagaccgt 21480 gcagggtccg cgctcggccg cctgcgggct cttctgctgc atgttcctgc acgccttcgt 21540 gcactggccc gaccgcccca tggacaagaa ccccaccatg aacttgctga cgggggtgcc 21600 caacggcatg ctccagtcgc cccaggtgga acccaccctg cgccgcaacc aggaggcgct 21660 ctaccgcttc ctcaactccc actccgccta ctttcgctcc caccgcgcgc gcatcgagaa 21720 ggccaccgcc ttcgaccgca tgaatcaaga catgtaaacc gtgtgtgtat gttaaatgtc 21780 tttaataaac agcactttca tgttacacat gcatctgaga tgatttattt agaaatcgaa 21840 agggttctgc cgggtctcgg catggcccgc gggcagggac acgttgcgga actggtactt 21900 ggccagccac ttgaactcgg ggatcagcag tttgggcagc ggggtgtcgg ggaaggagtc 21960 ggtccacagc ttccgcgtca gttgcagggc gcccagcagg tcgggcgcgg agatcttgaa 22020 atcgcagttg ggacccgcgt tctgcgcgcg ggagttgcgg tacacggggt tgcagcactg 22080 gaacaccatc agggccgggt gcttcacgct cgccagcacc gtcgcgtcgg tgatgctctc 22140 cacgtcgagg tcctcggcgt tggccatccc gaagggggtc atcttgcagg tctgccttcc 22200 catggtgggc acgcacccgg gcttgtggtt gcaatcgcag tgcaggggga tcagcatcat 22260 ctgggcctgg tcggcgttca tccccgggta catggccttc atgaaagcct ccaattgcct 22320 gaacgcctgc tgggccttgg ctccctcggt gaagaagacc ccgcaggact tgctagagaa 22380 ctggttggtg gcgcacccgg cgtcgtgcac gcagcagcgc gcgtcgttgt tggccagctg 22440 caccacgctg cgcccccagc ggttctgggt gatcttggcc cggtcggggt tctccttcag 22500 cgcgcgctgc ccgttctcgc tcgccacatc catctcgatc atgtgctcct tctggatcat 22560 ggtggtcccg tgcaggcacc gcagcttgcc ctcggcctcg gtgcacccgt gcagccacag 22620 cgcgcacccg gtgcactccc agttcttgtg ggcgatctgg gaatgcgcgt gcacgaagcc 22680 ctgcaggaag cggcccatca tggtggtcag ggtcttgttg ctagtgaagg tcagcggaat 22740 gccgcggtgc tcctcgttga tgtacaggtg gcagatgcgg cggtacacct cgccctgctc 22800 gggcatcagc tggaagttgg ctttcaggtc ggtctccacg cggtagcggt ccatcagcat 22860 agtcatgatt tccataccct tctcccaggc cgagacgatg ggcaggctca tagggttctt 22920 caccatcatc ttagcgctag cagccgcggc cagggggtcg ctctcgtcca gggtctcaaa 22980 gctccgcttg ccgtccttct cggtgatccg caccgggggg tagctgaagc ccacggccgc 23040 cagctcctcc tcggcctgtc tttcgtcctc gctgtcctgg ctgacgtcct gcaggaccac 23100 atgcttggtc ttgcggggtt tcttcttggg cggcagcggc ggcggagatg ttggagatgg 23160 cgagggggag cgcgagttct cgctcaccac tactatctct tcctcttctt ggtccgaggc 23220 cacgcggcgg taggtatgtc tcttcggggg cagaggcgga ggcgacgggc tctcgccgcc 23280 gcgacttggc ggatggctgg cagagcccct tccgcgttcg ggggtgcgct cccggcggcg 23340 ctctgactga cttcctccgc ggccggccat tgtgttctcc tagggaggaa caacaagcat 23400 ggagactcag ccatcgccaa cctcgccatc tgcccccacc gccgacgaga agcagcagca 23460 gcagaatgaa agcttaaccg ccccgccgcc cagccccgcc acctccgacg cggccgtccc 23520 agacatgcaa gagatggagg aatccatcga gattgacctg ggctatgtga cgcccgcgga 23580 gcacgaggag gagctggcag tgcgcttttc acaagaagag atacaccaag aacagccaga 23640 gcaggaagca gagaatgagc agagtcaggc tgggctcgag catgacggcg actacctcca 23700 cctgagcggg ggggaggacg cgctcatcaa gcatctggcc cggcaggcca ccatcgtcaa 23760 ggatgcgctg ctcgaccgca ccgaggtgcc cctcagcgtg gaggagctca gccgcgccta 23820 cgagttgaac ctcttctcgc cgcgcgtgcc ccccaagcgc cagcccaatg gcacctgcga 23880 gcccaacccg cgcctcaact tctacccggt cttcgcggtg cccgaggccc tggccaccta 23940 ccacatcttt ttcaagaacc aaaagatccc cgtctcctgc cgcgccaacc gcacccgcgc 24000 cgacgccctt ttcaacctgg gtcccggcgc ccgcctacct gatatcgcct ccttggaaga 24060 ggttcccaag atcttcgagg gtctgggcag cgacgagact cgggccgcga acgctctgca 24120 aggagaagga ggagagcatg agcaccacag cgccctggtc gagttggaag gcgacaacgc 24180 gcggctggcg gtgctcaaac gcacggtcga gctgacccat ttcgcctacc cggctctgaa 24240 cctgcccccc aaagtcatga gcgcggtcat ggaccaggtg ctcatcaagc gcgcgtcgcc 24300 catctccgag gacgagggca tgcaagactc cgaggagggc aagcccgtgg tcagcgacga 24360 gcagctggcc cggtggctgg gtcctaatgc tagtccccag agtttggaag agcggcgcaa 24420 actcatgatg gccgtggtcc tggtgaccgt ggagctggag tgcctgcgcc gcttcttcgc 24480 cgacgcggag accctgcgca aggtcgagga gaacctgcac tacctcttca ggcacgggtt 24540 cgtgcgccag gcctgcaaga tctccaacgt ggagctgacc aacctggtct cctacatggg 24600 catcttgcac gagaaccgcc tggggcagaa cgtgctgcac accaccctgc gcggggaggc 24660 ccggcgcgac tacatccgcg actgcgtcta cctctacctc tgccacacct ggcagacggg 24720 catgggcgtg tggcagcagt gtctggagga gcagaacctg aaagagctct gcaagctcct 24780 gcagaagaac ctcaagggtc tgtggaccgg gttcgacgag cgcaccaccg cctcggacct 24840 ggccgacctc attttccccg agcgcctcag gctgacgctg cgcaacggcc tgcccgactt 24900 tatgagccaa agcatgttgc aaaactttcg ctctttcatc ctcgaacgct ccggaatcct 24960 gcccgccacc tgctccgcgc tgccctcgga cttcgtgccg ctgaccttcc gcgagtgccc 25020 cccgccgctg tggagccact gctacctgct gcgcctggcc aactacctgg cctaccactc 25080 ggacgtgatc gaggacgtca gcggcgaggg cctgctcgag tgccactgcc gctgcaacct 25140 ctgcacgccg caccgctccc tggcctgcaa cccccagctg ctgagcgaga cccagatcat 25200 cggcaccttc gagttgcaag ggcccagcga aggcgagggt tcagccgcca aggggggtct 25260 gaaactcacc ccggggctgt ggacctcggc ctacttgcgc aagttcgtgc ccgaggacta 25320 ccatcccttc gagatcaggt tctacgagga ccaatcccat ccgcccaagg ccgagctgtc 25380 ggcctgcgtc atcacccagg gggcgatcct ggcccaattg caagccatcc agaaatcccg 25440 ccaagaattc ttgctgaaaa agggccgcgg ggtctacctc gacccccaga ccggtgagga 25500 gctcaacccc ggcttccccc aggatgcccc gaggaaacaa gaagctgaaa gtggagctgc 25560 cgcccgtgga ggatttggag gaagactggg agaacagcag tcaggcagag gaggaggaga 25620 tggaggaaga ctgggacagc actcaggcag aggaggacag cctgcaagac agtctggagg 25680 aagacgagga ggaggcagag gaggaggtgg aagaagcagc cgccgccaga ccgtcgtcct 25740 cggcggggga gaaagcaagc agcacggata ccatctccgc tccgggtcgg ggtcccgctc 25800 gaccacacag tagatgggac gagaccggac gattcccgaa ccccaccacc cagaccggta 25860 agaaggagcg gcagggatac aagtcctggc gggggcacaa aaacgccatc gtctcctgct 25920 tgcaggcctg cgggggcaac atctccttca cccggcgcta cctgctcttc caccgcgggg 25980 tgaactttcc ccgcaacatc ttgcattact accgtcacct ccacagcccc tactacttcc 26040 aagaagaggc agcagcagca gaaaaagacc agcagaaaac cagcagctag aaaatccaca 26100 gcggcggcag caggtggact gaggatcgcg gcgaacgagc cggcgcaaac ccgggagctg 26160 aggaaccgga tctttcccac cctctatgcc atcttccagc agagtcgggg gcaggagcag 26220 gaactgaaag tcaagaaccg ttctctgcgc tcgctcaccc gcagttgtct gtatcacaag 26280 agcgaagacc aacttcagcg cactctcgag gacgccgagg ctctcttcaa caagtactgc 26340 gcgctcactc ttaaagagta gcccgcgccc gcccagtcgc agaaaaaggc gggaattacg 26400 tcacctgtgc ccttcgccct agccgcctcc acccatcatc atgagcaaag agattcccac 26460 gccttacatg tggagctacc agccccagat gggcctggcc gccggtgccg cccaggacta 26520 ctccacccgc atgaattggc tcagcgccgg gcccgcgatg atctcacggg tgaatgacat 26580 ccgcgcccac cgaaaccaga tactcctaga acagtcagcg ctcaccgcca cgccccgcaa 26640 tcacctcaat ccgcgtaatt ggcccgccgc cctggtgtac caggaaattc cccagcccac 26700 gaccgtacta cttccgcgag acgcccaggc cgaagtccag ctgactaact caggtgtcca 26760 gctggcgggc ggcgccaccc tgtgtcgtca ccgccccgct cagggtataa agcggctggt 26820 gatccggggc agaggcacac agctcaacga cgaggtggtg agctcttcgc tgggtctgcg 26880 acctgacgga gtcttccaac tcgccggatc ggggagatct tccttcacgc ctcgtcaggc 26940 cgtcctgact ttggagagtt cgtcctcgca gccccgctcg ggtggcatcg gcactctcca 27000 gttcgtggag gagttcactc cctcggtcta cttcaacccc ttctccggct cccccggcca 27060 ctacccggac gagttcatcc cgaacttcga cgccatcagc gagtcggtgg acggctacga 27120 ttgaatgtcc catggtggcg cagctgacct agctcggctt cgacacctgg accactgccg 27180 ccgcttccgc tgcttcgctc gggatctcgc cgagtttgcc tactttgagc tgcccgagga 27240 gcaccctcag ggcccggccc acggagtgcg gatcgtcgtc gaagggggcc tcgactccca 27300 cctgcttcgg atcttcagcc agcgtccgat cctggtcgag cgcgagcaag gacagaccct 27360 tctgactctg tactgcatct gcaaccaccc cggcctgcat gaaagtcttt gttgtctgct 27420 gtgtactgag tataataaaa gctgagatca gcgactactc cggacttccg tgtgttcctg 27480 aatccatcaa ccagtctttg ttcttcaccg ggaacgagac cgagctccag ctccagtgta 27540 agccccacaa gaagtacctc acctggctgt tccagggctc cccgatcgcc gttgtcaacc 27600 actgcgacaa cgacggagtc ctgctgagcg gccctgccaa ccttactttt tccacccgca 27660 gaagcaagct ccagctcttc caacccttcc tccccgggac ctatcagtgc gtctcgggac 27720 cctgccatca caccttccac ctgatcccga ataccacagc gtcgctcccc gctactaaca 27780 accaaactaa cctccaccaa cgccaccgtc gcgacctttc tgaatctaat actaccaccc 27840 acaccggagg tgagctccga ggtcaaccaa cctctgggat ttactacggc ccctgggagg 27900 tggttgggtt aatagcgcta ggcctagttg cgggtgggct tttggttctc tgctacctat 27960 acctcccttg ctgttcgtac ttagtggtgc tgtgttgctg gtttaagaaa tggggaagat 28020 caccctagtg agctgcggtg cgctggtggc ggtgttgctt tcgattgtgg gactgggcgg 28080 tgcggctgta gtgaaggaga aggccgatcc ctgcttgcat ttcaatccca acaaatgcca 28140 gctgagtttt cagcccgatg gcaatcggtg cgcggtactg atcaagtgcg gatgggaatg 28200 cgagaacgtg agaatcgagt acaataacaa gactcggaac aatactctcg cgtccgtgtg 28260 gcagcccggg gaccccgagt ggtacaccgt ctctgtcccc ggtgctgacg gctccccgcg 28320 caccgtgaat aatactttca tttttgcgca catgtgcgac acggtcatgt ggatgagcaa 28380 gcagtacgat atgtggcccc ccacgaagga gaacatcgtg gtcttctcca tcgcttacag 28440 cctgtgcacg gcgctaatca ccgctatcgt gtgcctgagc attcacatgc tcatcgctat 28500 tcgccccaga aataatgccg aaaaagaaaa acagccataa cgtttttttt cacacctttt 28560 tcagaccatg gcctctgtta aatttttgct tttatttgcc agtctcattg ccgtcattca 28620 tggaatgagt aatgagaaaa ttactattta cactggcact aatcacacat tgaaaggtcc 28680 agaaaaagcc acagaagttt catggtattg ttattttaat gaatcagatg tatctactga 28740 actctgtgga aacaataaca aaaaaaatga gagcattact ctcatcaagt ttcaatgtgg 28800 atctgactta accctaatta acatcactag agactatgta ggtatgtatt atggaactac 28860 agcaggcatt tcggacatgg aattttatca agtttctgtg tctgaaccca ccacgcctag 28920 aatgaccaca accacaaaaa ctacacctgt taccactatg cagctcacta ccaataacat 28980 ttttgccatg cgtcaaatgg tcaacaatag cactcaaccc accccaccca gtgaggaaat 29040 tcccaaatcc atgattggca ttattgttgc tgtagtggtg tgcatgttga tcatcgcctt 29100 gtgcatggtg tactatgcct tctgctacag aaagcacaga ctgaacgaca agctggaaca 29160 cttactaagt gttgaatttt aattttttag aaccatgaag atcctaggcc ttttaatttt 29220 ttctatcatt acctctgctc tatgcaattc tgacaatgag gacgttactg tcgttgtcgg 29280 atcaaattat acactgaaag gtccagcgaa gggtatgctt tcgtggtatt gctattttgg 29340 atctgacact acagaaactg aattatgcaa tcttaagaat ggcaaaattc aaaattctaa 29400 aattaacaat tatatatgca atggtactga tctgatactc ctcaatatca cgaaatcata 29460 tgctggcagt tacacctgcc ctggagatga tgctgacagt atgatttttt acaaagtaac 29520 tgttgttgat cccactactc cacctccacc caccacaact actcacacca cacacacaga 29580 tcaaaccgca gcagaggagg cagcaaagtt agccttgcag gtccaagaca gttcatttgt 29640 tggcattacc cctacacctg atcagcggtg tccggggctg ctagtcagcg gcattgtcgg 29700 tgtgctttcg ggattagcag tcataatcat ctgcatgttc atttttgctt gctgctatag 29760 aaggctttac cgacaaaaat cagacccact gctgaacctc tatgtttaat tttttccaga 29820 gtcatgaagg cagttagcgc tctagttttt tgttctttga ttggcattgt tttttgcaat 29880 cctattccta aagttagctt tattaaagat gtgaatgtta ctgagggggg caatgtgaca 29940 ctggtaggtg tagagggtgc tgaaaacacc acctggacaa aataccacct caatgggtgg 30000 aaagatattt gcaattggag tgtattagtt tatacatgtg agggagttaa tcttaccatt 30060 gtcaatgcca cctcagctca aaatggtaga attcaaggac aaagtgtcag tgtatctaat 30120 gggtatttta cccaacatac ttttatctat gacgttaaag tcataccact gcctacgcct 30180 agcccaccta gcactaccac acagacaacc cacactacac agacaaccac atacagtaca 30240 ttaaatcagc ctaccaccac tacagcagca gaggttgcca gctcgtctgg ggtccgagtg 30300 gcatttttga tgtgggcccc atctagcagt cccactgcta gtaccaatga gcagactact 30360 gaatttttgt ccactgtcga gagccacacc acagctacct ccagtgcctt ctctagcacc 30420 gccaatctct cctcgctttc ctctacacca atcagtcccg ctactactcc tagccccgct 30480 cctcttccca ctcccctgaa gcaaacagac ggcggcatgc aatggcagat caccctgctc 30540 attgtgatcg ggttggtcat cctggccgtg ttgctctact acatcttctg ccgccgcatt 30600 cccaacgcgc accgcaagcc ggtctacaag cccatcattg tcgggcagcc ggagccgctt 30660 caggtggaag ggggtctaag gaatcttctc ttctctttta cagtatggtg attgaactat 30720 gattcctaga caattcttga tcactattct tatctgcctc ctccaagtct gtgccaccct 30780 cgctctggtg gccaacgcca gtccagactg tattgggccc ttcgcctcct acgtgctctt 30840 tgccttcacc acctgcatct gctgctgtag catagtctgc ctgcttatca ccttcttcca 30900 gttcattgac tggatctttg tgcgcatcgc ctacctgcgc caccaccccc agtaccgcga 30960 ccagcgagtg gcgcggctgc tcaggctcct ctgataagca tgcgggctct gctacttctc 31020 gcgcttctgc tgttagtgct cccccgtccc gtcgaccccc ggtcccccac ccagtccccc 31080 gaggaggtcc gcaaatgcaa attccaagaa ccctggaaat tcctcaaatg ctaccgccaa 31140 aaatcagaca tgcatcccag ctggatcatg atcattggga tcgtgaacat tctggcctgc 31200 accctcatct cctttgtgat ttacccctgc tttgactttg gttggaactc gccagaggcg 31260 ctctatctcc cgcctgaacc tgacacacca ccacagcaac ctcaggcaca cgcactacca 31320 ccactacagc ctaggccaca atacatgccc atattagact atgaggccga gccacagcga 31380 cccatgctcc ccgctattag ttacttcaat ctaaccggcg gagatgactg acccactggc 31440 caacaacaac gtcaacgacc ttctcctgga catggacggc cgcgcctcgg agcagcgact 31500 cgcccaactt cgcattcgcc agcagcagga gagagccgtc aaggagctgc aggatgcggt 31560 ggccatccac cagtgcaaga gaggcatctt ctgcctggtg aaacaggcca agatctccta 31620 cgaggtcact ccaaacgacc atcgcctctc ctacgagctc ctgcagcagc gccagaagtt 31680 cacctgcctg gtcggagtca accccatcgt catcacccag cagtctggcg ataccaaggg 31740 gtgcatccac tgctcctgcg actcccccga ctgcgtccac actctgatca agaccctctg 31800 cggcctccgc gacctcctcc ccatgaacta atcaccccct tatccagtga aataaagatc 31860 atattgatga tgattttaca gaaataaaaa ataatcattt gatttgaaat aaagatacaa 31920 tcatattgat gatttgagtt taacaaaaaa ataaagaatc acttacttga aatctgatac 31980 caggtctctg tccatgtttt ctgccaacac cacttcactc ccctcttccc agctctggta 32040 ctgcaggccc cggcgggctg caaacttcct ccacacgctg aaggggatgt caaattcctc 32100 ctgtccctca atcttcattt tatcttctat cagatgtcca aaaagcgcgt ccgggtggat 32160 gatgacttcg accccgtcta cccctacgat gcagacaacg caccgaccgt gcccttcatc 32220 aaccccccct tcgtctcttc agatggattc caagagaagc ccctgggggt gttgtccctg 32280 cgactggccg accccgtcac caccaagaac ggggaaatca ccctcaagct gggagagggg 32340 gtggacctcg attcctcggg aaaactcatc tccaacacgg ccaccaaggc cgccgcccct 32400 ctcagttttt ccaacaacac catttccctt aacatggatc acccctttta cactaaagat 32460 ggaaaattat ccttacaagt ttctccacca ttaaatatac tgagaacaag cattctaaac 32520 acactagctt taggttttgg atcaggttta ggactccgtg gctctgcctt ggcagtacag 32580 ttagtctctc cacttacatt tgatactgat ggaaacataa agcttacctt agacagaggt 32640 ttgcatgtta caacaggaga tgcaattgaa agcaacataa gctgggctaa aggtttaaaa 32700 tttgaagatg gagccatagc aaccaacatt ggaaatgggt tagagtttgg aagcagtagt 32760 acagaaacag gtgttgatga tgcttaccca atccaagtta aacttggatc tggccttagc 32820 tttgacagta caggagccat aatggctggt aacaaagaag acgataaact cactttgtgg 32880 acaacacctg atccatcacc aaactgtcaa atactcgcag aaaatgatgc aaaactaaca 32940 ctttgcttga ctaaatgtgg tagtcaaata ctggccactg tgtcagtctt agttgtagga 33000 agtggaaacc taaaccccat tactggcacc gtaagcagtg ctcaggtgtt tctacgtttt 33060 gatgcaaacg gtgttctttt aacagaacat tctacactaa aaaaatactg ggggtatagg 33120 cagggagata gcatagatgg cactccatat accaatgctg taggattcat gcccaattta 33180 aaagcttatc caaagtcaca aagttctact actaaaaata atatagtagg gcaagtatac 33240 atgaatggag atgtttcaaa acctatgctt ctcactataa ccctcaatgg tactgatgac 33300 agcaacagta catattcaat gtcattttca tacacctgga ctaatggaag ctatgttgga 33360 gcaacatttg gggctaactc ttataccttc tcatacatcg cccaagaatg aacactgtat 33420 cccaccctgc atgccaaccc ttcccacccc actctgtgga acaaactctg aaacacaaaa 33480 taaaataaag ttcaagtgtt ttattgattc aacagtttta caggattcga gcagttattt 33540 ttcctccacc ctcccaggac atggaataca ccaccctctc cccccgcaca gccttgaaca 33600 tctgaatgcc attggtgatg gacatgcttt tggtctccac gttccacaca gtttcagagc 33660 gagccagtct cgggtcggtc agggagatga aaccctccgg gcactcccgc atctgcacct 33720 cacagctcaa cagctgagga ttgtcctcgg tggtcgggat cacggttatc tggaagaagc 33780 agaagagcgg cggtgggaat catagtccgc gaacgggatc ggccggtggt gtcgcatcag 33840 gccccgcagc agtcgctgcc gccgccgctc cgtcaagctg ctgctcaggg ggtccgggtc 33900 cagggactcc ctcagcatga tgcccacggc cctcagcatc agtcgtctgg tgcggcgggc 33960 gcagcagcgc atgcggatct cgctcaggtc gctgcagtac gtgcaacaca gaaccaccag 34020 gttgttcaac agtccatagt tcaacacgct ccagccgaaa ctcatcgcgg gaaggatgct 34080 acccacgtgg ccgtcgtacc agatcctcag gtaaatcaag tggtgccccc tccagaacac 34140 gctgcccacg tacatgatct ccttgggcat gtggcggttc accacctccc ggtaccacat 34200 caccctctgg ttgaacatgc agccccggat gatcctgcgg aaccacaggg ccagcaccgc 34260 cccgcccgcc atgcagcgaa gagaccccgg gtcccggcaa tggcaatgga ggacccaccg 34320 ctcgtacccg tggatcatct gggagctgaa caagtctatg ttggcacagc acaggcatat 34380 gctcatgcat ctcttcagca ctctcaactc ctcgggggtc aaaaccatat cccagggcac 34440 ggggaactct tgcaggacag cgaaccccgc agaacagggc aatcctcgca cagaacttac 34500 attgtgcatg gacagggtat cgcaatcagg cagcaccggg tgatcctcca ccagagaagc 34560 gcgggtctcg gtctcctcac agcgtggtaa gggggccggc cgatacgggt gatggcggga 34620 cgcggctgat cgtgttcgcg accgtgtcat gatgcagttg ctttcggaca ttttcgtact 34680 tgctgtagca gaacctggtc cgggcgctgc acaccgatcg ccggcggcgg tctcggcgct 34740 tggaacgctc ggtgttgaaa ttgtaaaaca gccactctct cagaccgtgc agcagatcta 34800 gggcctcagg agtgatgaag atcccatcat gcctgatggc tctgatcaca tcgaccaccg 34860 tggaatgggc cagacccagc cagatgatgc aattttgttg ggtttcggtg acggcggggg 34920 agggaagaac aggaagaacc atgattaact tttaatccaa acggtctcgg agtacttcaa 34980 aatgaagatc gcggagatgg cacctctcgc ccccgctgtg ttggtggaaa ataacagcca 35040 ggtcaaaggt gatacggttc tcgagatgtt ccacggtggc ttccagcaaa gcctccacgc 35100 gcacatccag aaacaagaca atagcgaaag cgggagggtt ctctaattcc tcaatcatca 35160 tgttacactc ctgcaccatc cccagataat tttcattttt ccagccttga atgattcgaa 35220 ctagttcgtg aggtaaatcc aagccagcca tgataaagag ctcgcgcaga gcgccctcca 35280 ccggcattct taagcacacc ctcataattc caagatattc tgctcctggt tcacctgcag 35340 cagattgaca agcggaatat caaaatctct gccgcgatcc ctgagctcct ccctcagcaa 35400 taactgtaag tactctttca tatcctctcc gaaattttta gccataggac caccaggaat 35460 aagattaggg caagccacag tacagataaa ccgaagtcct ccccagtgag cattgccaaa 35520 tgcaagactg ctataagcat gctggctaga cccggtgata tcttccagat aactggacag 35580 aaaatcgccc aggcaatttt taagaaaatc aacaaaagaa aaatcctcca ggtggacgtt 35640 tagagcctcg ggaacaacga tgaagtaaat gcaagcggtg cgttccagca tggttagtta 35700 gctgatctgt agaaaaaaca aaaatgaaca ttaaaccatg ctagcctggc gaacaggtgg 35760 gtaaatcgtt ctctccagca ccaggcaggc cacggggtct ccggcgcgac cctcgtaaaa 35820 attgtcgcta tgattgaaaa ccatcacaga gagacgttcc cggtggccgg cgtgaatgat 35880 tcgacaagat gaatacaccc ccggaacatt ggcgtccgcg agtgaaaaaa agcgcccgag 35940 gaagcaataa ggcactacaa tgctcagtct caagtccagc aaagcgatgc catgcggatg 36000 aagcacaaaa ttctcaggtg cgtacaaaat gtaattactc ccctcctgca caggcagcaa 36060 agcccccgat ccctccaggt acacatacaa agcctcagcg tccatagctt accgagcagc 36120 agcacacaac aggcgcaaga gtcagagaaa ggctgagctc taacctgtcc acccgctctc 36180 tgctcaatat atagcccaga tctacactga cgtaaaggcc aaagtctaaa aatacccgcc 36240 aaataatcac acacgcccag cacacgccca gaaaccggtg acacactcaa aaaaatacgc 36300 gcacttcctc aaacgcccaa aactgccgtc atttccgggt tcccacgcta cgtcatcaaa 36360 acacgacttt caaattccgt cgaccgttaa aaacgtcacc cgccccgccc ctaacggtcg 36420 cccgtctctc agccaatcag cgccccgcat ccccaaattc aaacacctca tttgcatatt 36480 aacgcgcaca aaaagtttga ggtatattat tgatgatgg 36519 <210> 105 <211> 36604 <212> DNA <213> Simian adenovirus 23 <400> 105 catcatcaat aatatacctc aaacttttgg tgcgcgttaa tatgcaaatg agctgtttga 60 atttggggag ggaggaaggt gattggctgc gggagcggcg accgttaggg gcggggcggg 120 tgacgttttg atgacgtggc tatgaggcgg agccggtttg caagttctcg tgggaaaagt 180 gacgtcaaac gaggtgtggt ttgaacacgg aaatactcaa ttttcccgcg ctctctgaca 240 ggaaatgagg tgtttctggg cggatgcaag tgaaaacggg ccattttcgc gcgaaaactg 300 aatgaggaag tgaaaatctg agtaatttcg cgtttatggc agggaggagt atttgccgag 360 ggccgagtag actttgaccg attacgtggg ggtttcgatt accgtatttt tcacctaaat 420 ttccgcgtac ggtgtcaaag tccggtgttt ttacgtaggc gtcagctgat cgccagggta 480 tttaaacctg cgctctctag tcaagaggcc actcttgagt gccagcgagt agagttttct 540 cctccgcgcc gcgagtcaga tctacacttt gaaagatgag gcacctgaga gacctgcccg 600 gtaatgtttt cctggctact gggaacgaga ttctggaatt ggtggtggac gccatgatgg 660 gtgacgaccc tccagagccc cctaccccat ttgaggcgcc ttcgctgtac gatttgtatg 720 atctggaggt ggatgtgccc gagagcgacc ctaacgagga ggcggtgaat gatttgttta 780 gcgatgccgc gctgctggct gccgagcagg ctaatacgga ctctggctca gacagcgatt 840 cctctctcca taccccgaga cccggcagag gtgagaaaaa gatccccgag cttaaagggg 900 aagagctcga cctgcgctgc tatgaggaat gcttgcctcc gagcgatgat gaggaggacg 960 aggaggcgat tcgagctgcg gtgaaccagg gagtgaaaac tgcgggcgag agctttagcc 1020 tggactgtcc tactctgccc ggacacggct gtaagtcttg tgaatttcat cgcatgaata 1080 ctggagataa gaatgtgatg tgtgccctgt gctatatgag agcttacaac cattgtgttt 1140 acagtaagtg tgattaactt tagttgggaa ggcagagggt gactgggtgc tgactggttt 1200 atttatgtat atgttttttt atgtgtaggt cccgtctctg acgtagatga gacccccact 1260 tcagagtgca tttcatcacc cccagaaatt ggcgaggaac cgcccgaaga tattattcat 1320 agaccagttg cagtgagagt caccgggcgg agagcagctg tggagagttt ggatgacttg 1380 ctacagggtg gggatgaacc tttggacttg tgtacccgga aacgccccag gcactaagtg 1440 ccacacatgt gtgtttactt aaggtgatgt cagtatttat agggtgtgga gtgcaataaa 1500 atccgtgttg actttaagtg cgtgttttat gactcagggg tggggactgt gggtatataa 1560 gcaggtgcag acctgtgtgg tcagttcaga gcaggactca tggagatctg gactgtcttg 1620 gaagactttc accagactag acagttgcta gagaactcat cggagggagt ctcttacctg 1680 tggagattct gcttcggtgg gcctctagct aagctagtct atagggccaa acaggattat 1740 aaggaacaat ttgaggatat tttgagagag tgtcctggta tttttgactc tctcaacttg 1800 ggccatcagt ctcactttaa ccagagtatt ctgagagccc ttgacttttc tactcctggc 1860 agaactaccg ccgcggtagc cttttttgcc tttattcttg acaaatggag tcaagaaacc 1920 catttcagca gggattaccg tctggactgc ttagcagtag ctttgtggag aacatggagg 1980 tgccagcgcc tgaatgcaat ctccggctac ttgccagtac agccggtaga cacgctgagg 2040 atcctgagtc tccagtcacc ccaggaacac caacgccgcc agcagccgca gcaggagcag 2100 cagcaagagg aggaccgaga agagaacccg agagccggtc tggaccctcc ggtggcggag 2160 gaggaggagt agctgacttg tttcccgagc tgcgccgggt gctgactagg tcttccagtg 2220 gacgggagag ggggattaag cgggagaggc atgaggagac tagccacaga actgaactga 2280 ctgtcagtct gatgagccgc aggcgcccag aatcggtgtg gtggcatgag gtgcagtcgc 2340 aggggataga tgaggtctcg gtgatgcatg agaaatattc cctagaacaa gtcaagactt 2400 gttggttgga gcccgaggat gattgggagg tagccatcag gaattatgcc aagctggctc 2460 tgaagccaga caagaagtac aagattacca aactgattaa tatcagaaat tcctgctaca 2520 tttcagggaa tggggccgag gtggagatca gtacccagga gagggtggcc ttcagatgtt 2580 gtatgatgaa tatgtacccg ggggtggtgg gcatggaggg agtcaccttt atgaacacga 2640 ggttcagggg tgatgggtat aatggggtgg tctttatggc caacaccaag ctgacagtgc 2700 acggatgctc cttctttggc ttcaataaca tgtgcatcga ggcctggggc agtgtttcag 2760 tgaggggatg cagcttttca gccaactgga tgggggtcgt gggcagaacc aagagcaagg 2820 tgtcagtgaa gaaatgcctg ttcgagaggt gccacctggg ggtgatgagc gagggcgaag 2880 ccaaagtcaa acactgcgcc tctaccgaga cgggctgctt tgtgctgatc aagggcaatg 2940 cccaagtcaa gcataacatg atctgtgggg cctcggatga gcgcggctac cagatgctga 3000 cctgcgccgg tgggaacagc catatgctgg ccaccgtgca tgtggcctcg cacccccgca 3060 agacatggcc cgagttcgag cacaacgtca tgacccgctg caatgtgcac ctgggctccc 3120 gccgaggcat gttcatgccc taccagtgca acatgcaatt tgtgaaggtg ctgctggagc 3180 ccgatgccat gtccagagtg agcctgacgg gggtgtttga catgaatgtg gagctgtgga 3240 aaattctgag atatgatgaa tccaagacca ggtgccgggc ctgcgaatgc ggaggcaagc 3300 acgccaggct tcagcccgtg tgtgtggagg tgacggagga cctgcgaccc gatcatttgg 3360 tgttgtcctg caacgggacg gagttcggct ccagcgggga agaatctgac tagagtgagt 3420 agtgtttggg gctgggtgtg agcctgcatg aggggcagaa tgactaaaat ctgtggtttt 3480 ctgtgtgttg cagcagcatg agcggaagcg cctcctttga gggaggggta ttcagccctt 3540 atctgacggg gcgtctcccc tcctgggcgg gagtgcgtca gaatgtgatg ggatccacgg 3600 tggacggccg gcccgtgcag cccgcgaact cttcaaccct gacctacgcg accctgagct 3660 cctcgtccgt ggacgcagct gccgccgcag ctgctgcttc cgccgccagc gccgtgcgcg 3720 gaatggccct gggcgccggc tactacagct ctctggtggc caactcgagt tccaccaata 3780 atcccgccag cctgaacgag gagaagctgc tgctgctgat ggcccagctc gaggccctga 3840 cccagcgcct gggcgagctg acccagcagg tggctcagct gcaggcggag acgcgggccg 3900 cggttgccac ggtgaaaacc aaataaaaaa tgaatcaata aataaacgga gacggttgtt 3960 gattttaaca cagagtcttg aatctttatt tgatttttcg cgcgcggtag gccctggacc 4020 accggtctcg atcattgagc acccggtgga tcttttccag gacccggtag aggtgggctt 4080 ggatgttgag gtacatgggc atgagcccgt cccgggggtg gaggtagctc cattgcaggg 4140 cctcgtgctc ggggatggtg ttgtaaatca cccagtcata gcaggggcgc agggcgtggt 4200 gctgcacgat gtccttgagg aggagactga tggccacggg cagccccttg gtgtaggtgt 4260 tgacgaacct gttgagctgg gagggatgca tgcgggggga gatgagatgc atcttggcct 4320 ggatcttgag attggcgatg ttcccgccca gatcccgccg ggggttcatg ttgtgcagga 4380 ccaccagcac ggtgtatccg gtgcacttgg ggaatttgtc atgcaacttg gaagggaagg 4440 cgtgaaagaa tttggagacg cccttgtgac cgcccaggtt ttccatgcac tcatccatga 4500 tgatggcgat gggcccgtgg gcggcggcct gggcaaagac gtttcggggg tcggacacat 4560 cgtagttgtg gtcctgggtg agctcgtcat aggccatttt aatgaatttg gggcggaggg 4620 tgcccgactg ggggacgaag gtgccctcga tcccgggggc gtagttgccc tcgcagatct 4680 gcatctccca ggccttgagc tcggaggggg ggatcatgtc cacctgcggg gcgatgaaaa 4740 aaacggtttc cggggcgggg gagatgagct gggccgaaag caggttccgg agcagctggg 4800 acttgccgca accggtgggg ccgtagatga ccccgatgac cggctgcagg tggtagttga 4860 gggagagaca gctgccgtcc tcgcggagga ggggggccac ctcgttcatc atctcgcgca 4920 catgcatgtt ctcgcgcacg agttccgcca ggaggcgctc gccccccagc gagaggagct 4980 cttgcagcga ggcgaagttt ttcagcggct tgagtccgtc ggccatgggc attttggaga 5040 gggtctgttg caagagttcc agacggtccc agagctcggt gatgtgctct agggcatctc 5100 gatccagcag acctcctcgt ttcgcgggtt ggggcgactg cgggagtagg gcaccaggcg 5160 atgggcgtcc agcgaggcca gggtccggtc cttccagggc cgcagggtcc gcgtcagcgt 5220 ggtctccgtc acggtgaagg ggtgcgcgcc gggctgggcg cttgcgaggg tgcgcttcag 5280 gctcatccgg ctggtcgaga accgctcccg gtcggcgccc tgcgcgtcgg ccaggtagca 5340 attgagcatg agttcgtagt tgagcgcctc ggccgcgtgg cccttggcgc ggagcttacc 5400 tttggaagtg tgtccgcaga cgggacagag gagggacttg agggcgtaga gcttgggggc 5460 gaggaagacg gactcggggg cgtaggcgtc cgcgccgcag ctggcgcaga cggtctcgca 5520 ctccacgagc caggtgaggt cggggcggtt ggggtcaaaa acgaggtttc ctccgtgctt 5580 tttgatgcgt ttcttacctc tggtctccat gagctcgtgt ccccgctggg tgacaaagag 5640 gctgtccgtg tccccgtaga ccgactttat gggccggtcc tcgagcgggg tgccgcggtc 5700 ctcgtcgtag aggaaccccg cccactccga gacgaaggcc cgggtccagg ccagcacgaa 5760 ggaggccacg tgggaggggt agcggtcgtt gtccaccagc gggtccacct tctccagggt 5820 atgcaagcac atgtccccct cgtccacatc caggaaggtg attggcttgt aagtgtaggc 5880 cacgtgaccg ggggtcccgg ccgggggggt ataaaagggg gcgggcccct gctcgtcctc 5940 actgtcttcc ggatcgctgt ccaggagcgc cagctgttgg ggtaggtatt ccctctcgaa 6000 ggcgggcatg acctcggcac tcaggttgtc agtttctaga aacgaggagg atttgatatt 6060 gacggtgccg ttggagacgc ctttcatgag cccctcgtcc atttggtcag aaaagacgat 6120 ctttttgttg tcgagcttgg tggcgaagga gccgtagagg gcgttggaga gcagcttggc 6180 gatggagcgc atggtctggt tcttttcctt gtcggcgcgc tccttggcgg cgatgttgag 6240 ctgcacgtac tcgcgcgcca cgcacttcca ttcggggaag acggtggtga gctcgtcggg 6300 cacgattctg acccgccagc cgcggttgtg cagggtgatg aggtccacgc tggtggccac 6360 ctcgccgcgc aggggctcgt tggtccagca gaggcgcccg cccttgcgcg agcagaaggg 6420 gggcagcggg tccagcatga gctcgtcggg ggggtcggcg tccacggtga agatgccggg 6480 caggagctcg gggtcgaagt agctgatgca ggtgcccaga ttgtccagcg ccgcttgcca 6540 gtcgcgcacg gccagcgcgc gctcgtaggg gctgaggggc gtgccccagg gcatggggtg 6600 cgtgagcgcg gaggcgtaca tgccgcagat gtcgtagacg tagaggggct cctcgaggac 6660 gccgatgtag gtggggtagc agcgcccccc gcggatgctg gcgcgcacgt agtcgtacag 6720 ctcgtgcgag ggcgcgagga gccccgtgcc gaggttggag cgttgcggct tttcggcgcg 6780 gtagacgatc tggcggaaga tggcgtggga gttggaggag atggtgggcc tttggaagat 6840 gttgaagtgg gcgtggggca ggccgaccga gtccctgatg aagtgggcgt aggagtcctg 6900 cagcttggcg acgagctcgg cggtgacgag gacgtccagg gcgcagtagt cgagggtctc 6960 ttggatgatg tcatacttga gctggccctt ctgcttccac agctcgcggt tgagaaggaa 7020 ctcttcgcgg tccttccagt actcttcgag ggggaacccg tcctgatcgg cacggtaaga 7080 gcccaccatg tagaactggt tgacggcctt gtaggcgcag cagcccttct ccacggggag 7140 ggcgtaagct tgcgcggcct tgcgcaggga ggtgtgggtg agggcgaagg tgtcgcgcac 7200 catgaccttg aggaactggt gcttgaagtc gaggtcgtcg cagccgccct gctcccagag 7260 ttggaagtcc gtgcgcttct tgtaggcggg gttaggcaaa gcgaaagtaa catcgttgaa 7320 gaggatcttg cccgcgcggg gcatgaagtt gcgagtgatg cggaaaggct ggggcacctc 7380 ggcccggttg ttgatgacct gggcggcgag gacgatctcg tcgaagccgt tgatgttgtg 7440 cccgacgatg tagagttcca cgaatcgcgg gcggcccttg acgtggggca gcttcttgag 7500 ctcgtcgtag gtgagctcgg cggggtcgct gagcccgtgc tgctcgaggg cccagtcggc 7560 gacgtggggg ttggcgctga ggaaggaagt ccagagatcc acggccaggg cggtctgcaa 7620 gcggtcccgg tactgacgga actgttggcc cacggccatt ttttcggggg tgacgcagta 7680 gaaggtgcgg gggtcgccgt gccagcggtc ccacttgagc tggagggcga ggtcgtgggc 7740 gagctcgacg agcggcgggt ccccggagag tttcatgacc agcatgaagg ggacgagctg 7800 cttgccgaag gaccccatcc aggtgtaggt ttccacatcg taggtgagga agagcctttc 7860 ggtgcgagga tgcgagccga tggggaagaa ctggatctcc tgccaccagt tggaggaatg 7920 gctgttgatg tgatggaagt agaaatgccg acggcgcgcc gagcactcgt gcttgtgttt 7980 atacaagcgt ccgcagtgct cgcaacgctg cacgggatgc acgtgctgca cgagctgtac 8040 ctgggttcct ttggcgagga atttcagtgg gcagtggagc gctggcggct gcatctcgtg 8100 ctgtactacg tcttggccat cggcgtggcc atcgtctgcc tcgatggtgg tcatgctgac 8160 gagcccgcgc gggaggcagg tccagacctc ggctcggacg ggtcggagag cgaggacgag 8220 ggcgcgcagg ccggagctgt ccagggtcct gagacgctgc ggagtcaggt cagtgggcag 8280 cggcggcgcg cggttgactt gcaggagctt ttccagggcg cgcgggaggt ccagatggta 8340 cttgatctcc acggcgccgt tggtggctac gtccacggct tgcagggtgc cgtgcccctg 8400 gggcgccacc accgtgcccc gtttcttctt gggcgctgct tccatgtcgg tcagaagcgg 8460 cggcgaggac gcgcgccggg cggcaggggc ggctcggggc ccggaggcag gggcggcagg 8520 ggcacgtcgg cgccgcgcgc gggcaggttc tggtactgcg cccggagaag actggcgtga 8580 gcgacgacgc gacggttgac gtcctggatc tgacgcctct gggtgaaggc cacgggaccc 8640 gtgagtttga acctgaaaga gagttcgaca gaatcaatct cggtatcgtt gacggcggcc 8700 tgccgcagga tctcttgcac gtcgcccgag ttgtcctggt aggcgatctc ggtcatgaac 8760 tgctcgatct cctcctcctg aaggtctccg cggccggcgc gctcgacggt ggccgcgagg 8820 tcgttggaga tgcggcccat gagctgcgag aaggcgttca tgccggcctc gttccagacg 8880 cggctgtaga ccacggctcc gtcggggtcg cgcgcgcgca tgaccacctg ggcgaggttg 8940 agctcgacgt ggcgcgtgaa gaccgcgtag ttgcagaggc gctggtagag gtagttgagc 9000 gtggtggcga tgtgctcggt gacgaagaag tacatgatcc agcggcggag cggcatctcg 9060 ctgacgtcgc ccagggcttc caagcgttcc atggcctcgt agaagtccac ggcgaagttg 9120 aaaaactggg agttgcgcgc cgagacggtc aactcctcct ccagaagacg gatgagctcg 9180 gcgatggtgg cgcgcacctc gcgctcgaag gccccggggg gctcctcttc catctcctcc 9240 tcttcctcct ccactaacat ctcttctact tcctcctcag gaggcggtgg cgggggaggg 9300 gccctgcgtc gccggcggcg cacgggcaga cggtcgatga agcgctcgat ggtctccccg 9360 cgccggcgac gcatggtctc ggtgacggcg cgcccgtcct cgcggggccg cagcatgaag 9420 acgccgccgc gcatctccag gtggccgccg ggggggtctc cgttgggcag ggagagggcg 9480 ctgacgatgc atcttatcaa ttgacccgta gggactccgc gcaaggacct gagcgtctcg 9540 agatccacgg gatccgaaaa ccgctgaacg aaggcttcga gccagtcgca gtcgcaaggt 9600 aggctgagcc cggtttcttg ttcttcgggt atttggtcgg gaggcgggcg ggcgatgctg 9660 ctggtgatga agttgaagta ggcggtcctg agacggcgga tggtggcgag gagcaccagg 9720 tccttgggcc cggcttgctg gatgcgcaga cggtcggcca tgccccaggc gtggtcctga 9780 cacctggcga ggtccttgta gtagtcctgc atgagccgct ccacgggcac ctcctcctcg 9840 cccgcgcggc cgtgcatgcg cgtgagcccg aacccgcgct gcggctggac gagcgccagg 9900 tcggcgacga cgcgctcggt gaggatggcc tgctggatct gggtgagggt ggtctggaag 9960 tcgtcgaagt cgacgaagcg gtggtaggct ccggtgttga tggtgtagga gcagttggcc 10020 atgacggacc agttgacggt ctggtggccg ggtcgcacga gctcgtggta cttgaggcgc 10080 gagtaggcgc gcgtgtcgaa gatgtagtcg ttgcaggcgc gcacgaggta ctggtatccg 10140 acgaggaagt gcggcggcgg ctggcggtag agcggccatc gctcggtggc gggggcgccg 10200 ggcgcgaggt cctcgagcat gaggcggtgg tagccgtaga tgtacctgga catccaggtg 10260 atgccggcgg cggtggtgga ggcgcgcggg aactcgcgga cgcggttcca gatgttgcgc 10320 agcggcagga agtagttcat ggtggccgcg gtctggcccg tgaggcgcgc gcagtcgtgg 10380 atgctctaga catacgggca aaaacgaaag cggtcagcgg ctcgactccg tggcctggag 10440 gctaagcgaa cgggttgggc tgcgcgtgta ccccggttcg aatctcgaat caggctggag 10500 ccgcagctaa cgtggtactg gcactcccgt ctcgacccaa gcctgctaac gaaacctcca 10560 ggatacggag gcgggtcgtt ttttggcctt ggtcgctggt catgaaaaac tagtaagcgc 10620 ggaaagcggc cgcccgcgat ggctcgctgc cgtagtctgg agaaagaatc gccagggttg 10680 cgttgcggtg tgccccggtt cgagcctcag cgctcggcgc cggccggatt ccgcggctaa 10740 cgtgggcgtg gctgccccgt cgtttccaag accccttagc cagccgactt ctccagttac 10800 ggagcgagcc cctctttttt tttcttgtgt ttttgccaga tgcatcccgt actgcggcag 10860 atgcgccccc accctccacc acaaccgccc ctaccgcagc agcagcaaca gccggcgctt 10920 ctgcccccgc cccagcagca gccagccact accgcggcgg ccgccgtgag cggagccggc 10980 gttcagtatg acctggcctt ggaagagggc gaggggctgg cgcggctggg ggcgtcgtcg 11040 ccggagcggc acccgcgcgt gcagatgaaa agggacgctc gcgaggccta cgtgcccaag 11100 cagaacctgt tcagagacag gagcggcgag gagcccgagg agatgcgcgc ctcccgcttc 11160 cacgcggggc gggagctgcg gcgcggcctg gaccgaaagc gggtgctgag ggacgaggat 11220 ttcgaggcgg acgagctgac ggggatcagc cccgcgcgcg cgcacgtggc cgcggccaac 11280 ctggtcacgg cgtacgagca gaccgtgaag gaggagagca acttccaaaa atccttcaac 11340 aaccacgtgc gcacgctgat cgcgcgcgag gaggtgaccc tgggcctgat gcacctgtgg 11400 gacctgctgg aggccatcgt gcagaacccc acgagcaagc cgctgacggc gcagctgttt 11460 ctggtggtgc agcacagtcg ggacaacgag acgttcaggg aggcgctgct gaatatcacc 11520 gagcccgagg gccgctggct cctggacctg gtgaacattt tgcagagcat cgtggtgcag 11580 gagcgcgggc tgccgctgtc cgagaagctg gcggccatca acttctcggt gctgagtctg 11640 ggcaagtact acgctaggaa gatctacaag accccgtacg tgcccataga caaggaggtg 11700 aagatcgacg ggttttacat gcgcatgacc ctgaaagtgc tgaccctgag cgacgatctg 11760 ggggtgtacc gcaacgacag gatgcaccgc gcggtgagcg ccagccgccg gcgcgagctg 11820 agcgaccagg agctgatgca cagcctgcag cgggccctga ccggggccgg gaccgagggg 11880 gagagctact ttgacatggg cgcggacctg cgctggcagc ccagccgccg ggccttggaa 11940 gctgccggcg gttcccccta cgtggaggag gtggacgatg aggaggagga gggcgagtac 12000 ctggaagact gatggcgcga ccgtattttt gctagatgca gcaacagcca ccgccgccgc 12060 ctcctgatcc cgcgatgcgg gcggcgctgc agagccagcc gtccggcatt aactcctcgg 12120 acgattggac ccaggccatg caacgcatca tggcgctgac gacccgcaat cccgaagcct 12180 ttagacagca gcctcaggcc aaccggctct cggccatcct ggaggccgtg gtgccctcgc 12240 gctcgaaccc cacgcacgag aaggtgctgg ccatcgtgaa cgcgctggtg gagaacaagg 12300 ccatccgcgg tgacgaggcc gggctggtgt acaacgcgct gctggagcgc gtggcccgct 12360 acaacagcac caacgtgcag acgaacctgg accgcatggt gaccgacgtg cgcgaggcgg 12420 tgtcgcagcg cgagcggttc caccgcgagt cgaacctggg ctccatggtg gcgctgaacg 12480 ccttcctgag cacgcagccc gccaacgtgc cccggggcca ggaggactac accaacttca 12540 tcagcgcgct gcggctgatg gtggccgagg tgccccagag cgaggtgtac cagtcggggc 12600 cggactactt cttccagacc agtcgccagg gcttgcagac cgtgaacctg agccaggctt 12660 tcaagaactt gcagggactg tggggcgtgc aggccccggt cggggaccgc gcgacggtgt 12720 cgagcctgct gacgccgaac tcgcgcctgc tgctgctgct ggtggcgccc ttcacggaca 12780 gcggcagcgt gagccgcgac tcgtacctgg gctacctgct taacctgtac cgcgaggcca 12840 tcggacaggc gcacgtggac gagcagacct accaggagat cacccacgtg agccgcgcgc 12900 tgggccagga ggacccgggc aacctggagg ccaccctgaa cttcctgctg accaaccggt 12960 cgcagaagat cccgccccag tacgcgctga gcaccgagga ggagcgcatc ctgcgctacg 13020 tgcagcagag cgtggggctg ttcctgatgc aggagggggc cacgcccagc gcggcgctcg 13080 acatgaccgc gcgcaacatg gagcccagca tgtacgcccg caaccgcccg ttcatcaata 13140 agctgatgga ctacttgcat cgggcggccg ccatgaactc ggactacttt accaacgcca 13200 tcttgaaccc gcactggctc ccgccgcccg ggttctacac gggcgagtac gacatgcccg 13260 accccaacga cgggttcctg tgggacgacg tggacagcag cgtgttctcg ccgcgtccag 13320 gaaccaatgc cgtgtggaag aaagagggcg gggaccggcg gccgtcctcg gcgctgtccg 13380 gtcgcgcggg tgctgccgcg gcggtgcccg aggccgccag ccccttcccg agcctgccct 13440 tttcgctgaa cagcgtgcgc agcagcgagc tgggtcggct gacgcgaccg cgcctgctgg 13500 gcgaggagga gtacctgaac gactccttgt tgaggcccga gcgcgagaag aacttcccca 13560 ataacgggat agagagcctg gtggacaaga tgagccgctg gaagacgtac gcgcacgagc 13620 acagggacga gccccgagct agcagcgcag gcacccgtag acgccagcgg cacgacaggc 13680 agcggggact ggtgtgggac gatgaggatt ccgccgacga cagcagcgtg ttggacttgg 13740 gtgggagtgg tggtaacccg ttcgctcacc tgcgcccccg tatcgggcgc ctgatgtaag 13800 aatctgaaaa aataaaagac ggtactcacc aaggccatgg cgaccagcgt gcgttcttct 13860 ctgttgtttg tagtagtatg atgaggcgcg tgtacccgga gggtcctcct ccctcgtacg 13920 agagcgtgat gcagcaggcg gtggcggcgg cgatgcagcc cccgctggag gcgccttacg 13980 tgcccccgcg gtacctggcg cctacggagg ggcggaacag cattcgttac tcggagctgg 14040 cacccttgta cgataccacc cggttgtacc tggtggacaa caagtcggca gacatcgcct 14100 cgctgaacta ccagaacgac cacagcaact tcctgaccac cgtggtgcag aacaacgatt 14160 tcacccccac ggaggccagc acccagacca tcaactttga cgagcgctcg cggtggggcg 14220 gccagctgaa aaccatcatg cacaccaaca tgcccaacgt gaacgagttc atgtacagca 14280 acaagttcaa ggcgcgggtg atggtctcgc gcaagacccc caacggggtg gatgatgatt 14340 atgatggtag tcaggacgag ctgacctacg agtgggtgga gtttgagctg cccgagggca 14400 acttctcggt gaccatgacc atcgatctga tgaacaacgc catcatcgac aactacttgg 14460 cggtggggcg gcagaacggg gtgctggaga gcgacatcgg cgtgaagttc gacacgcgca 14520 acttccggct gggctgggac cccgtgaccg agctggtgat gccgggcgtg tacaccaacg 14580 aggccttcca ccccgacatc gtcctgctgc ccggctgcgg cgtggacttc accgagagcc 14640 gcctcagcaa cctgctgggc atccgcaagc ggcagccctt ccaggagggc ttccagatcc 14700 tgtacgagga cctggagggg ggcaacatcc ccgcgctctt ggatgtcgaa gcctacgaga 14760 aaagcaagga ggatagcacc gccgcggcga ccgcagccgt ggccaccgcc tctaccgagg 14820 tgcggggcga taattttgct agcgctgcgg cagcggccga ggcggctgaa accgaaagta 14880 agatagtcat ccagccggtg gagaaggaca gcaaggacag gagctacaac gtgctcgcgg 14940 acaagaaaaa caccgcctac cgcagctggt acctggccta caactacggc gaccccgaga 15000 agggcgtgcg ctcctggacg ctgctcacca cctcggacgt cacctgcggc gtggagcaag 15060 tctactggtc gctgcccgac atgatgcaag acccggtcac cttccgctcc acgcgtcaag 15120 ttagcaacta cccggtggtg ggcgccgagc tcctgcccgt ctactccaag agcttcttca 15180 acgagcaggc cgtctactcg cagcagctgc gcgccttcac ctcgctcacg cacgtcttca 15240 accgcttccc cgagaaccag atcctcgtcc gcccgcccgc gcccaccatt accaccgtca 15300 gtgaaaacgt tcctgctctc acagatcacg ggaccctgcc gctgcgcagc agtatccggg 15360 gagtccagcg cgtgaccgtc actgacgcca gacgccgcac ctgcccctac gtctacaagg 15420 ccctgggcgt agtcgcgccg cgcgtcctct cgagccgcac cttctaaaaa atgtccattc 15480 tcatctcgcc cagtaataac accggttggg gcctgcgcgc gcccagcaag atgtacggag 15540 gcgctcgcca acgctccacg caacaccccg tgcgcgtgcg cgggcacttc cgcgctccct 15600 ggggcgccct caagggccgc gtgcgctcgc gcaccaccgt cgacgacgtg atcgaccagg 15660 tggtggccga cgcgcgcaac tacacgcccg ccgccgcgcc cgtctccacc gtggacgccg 15720 tcatcgacag cgtggtggcc gacgcgcgcc ggtacgcccg caccaagagc cggcggcggc 15780 gcatcgcccg gcggcaccgg agcacccccg ccatgcgcgc ggcgcgagcc ttgctgcgca 15840 gggccaggcg cacgggacgc agggccatgc tcagggcggc cagacgcgcg gcctccggca 15900 gcagcagcgc cggcaggacc cgcagacgcg cggccacggc ggcggcggcg gccatcgcca 15960 gcatgtcccg cccgcggcgc ggcaacgtgt actgggtgcg cgacgccgcc accggtgtgc 16020 gcgtgcccgt gcgcacccgc ccccctcgca cttgaagatg ctgacttcgc gatgttgatg 16080 tgtcccagcg gcgaggagga tgtccaagcg caaatacaag gaagagatgc tccaggtcat 16140 cgcgcctgag atctacggcc ccgcggcggc ggtgaaggag gaaagaaagc cccgcaaact 16200 gaagcgggtc aaaaaggaca aaaaggagga ggaagatgac ggactggtgg agtttgtgcg 16260 cgagttcgcc ccccggcggc gcgtgcagtg gcgcgggcgg aaagtgaaac cggtgctgcg 16320 gcccggcacc acggtggtct tcacgcccgg cgagcgttcc ggctccgcct ccaagcgctc 16380 ctacgacgag gtgtacgggg acgaggacat cctcgagcag gcggtcgagc gtctgggcga 16440 gtttgcgtac ggcaagcgca gccgccccgc gcccttgaaa gaggaggcgg tgtccatccc 16500 gctggaccac ggcaacccca cgccgagcct gaagccggtg accctgcagc aggtgctacc 16560 gagcgcggcg ccgcgccggg gcttcaagcg cgagggcggc gaggatctgt acccgaccat 16620 gcagctgatg gtgcccaagc gccagaagct ggaggacgtg ctggagcaca tgaaggtgga 16680 ccccgaggtg cagcccgagg tcaaggtgcg gcccatcaag caggtggccc cgggcctggg 16740 cgtgcagacc gtggacatca agatccccac ggagcccatg gaaacgcaga ccgagcccgt 16800 gaagcccagc accagcacca tggaggtgca gacggatccc tggatgccag caccagcttc 16860 caccagcact cgccgaagac gcaagtacgg cgcggccagc ctgctgatgc ccaactacgc 16920 gctgcatcct tccatcatcc ccacgccggg ctaccgcggc acgcgcttct accgcggcta 16980 caccagcagc cgccgccgca agaccaccac ccgccgccgt cgtcgcagcc gccgcagcag 17040 caccgcgact tccgccttgg tgcggagagt gtatcgcagc gggcgcgagc ctctgaccct 17100 gccgcgcgcg cgctaccacc cgagcatcgc catttaacta ccgcctccta cttgcagata 17160 tggccctcac atgccgcctc cgcgtcccca ttacgggcta ccgaggaaga aagccgcgcc 17220 gtagaaggct gacggggaac gggctgcgtc gccatcacca ccggcggcgg cgcgccatca 17280 gcaagcggtt ggggggaggc ttcctgcccg cgctgatccc catcatcgcc gcggcgatcg 17340 gggcgatccc cggcatagct tccgtggcgg tgcaggcctc tcagcgccac tgagacacaa 17400 aaaagcatgg atttgtaata aaaaaaaaaa tggactgacg ctcctggtcc tgtgatgtgt 17460 gtttttagat ggaagacatc aatttttcgt ccctggcacc gcgacacggc acgcggccgt 17520 ttatgggcac ctggagcgac atcggcaaca gccaactgaa cgggggcgcc ttcaattgga 17580 gcagtctctg gagcgggctt aagaatttcg ggtccacgct caaaacctat ggcaacaagg 17640 cgtggaacag cagcacaggg caggcgctga gggaaaagct gaaagaacag aacttccagc 17700 agaaggtggt tgatggcctg gcctcaggca tcaacggggt ggttgacctg gccaaccagg 17760 ccgtgcagaa acagatcaac agccgcctgg acgcggtccc gcccgcgggg tccgtggaga 17820 tgccccaggt ggaggaggag ctgcctcccc tggacaagcg cggcgacaag cgaccgcgtc 17880 ccgacgcgga ggagacgctg ctgacgcaca cggacgagcc gcccccgtac gaggaggcgg 17940 tgaaactggg cctgcccacc acgcggcccg tggcgcctct ggccaccgga gtgctgaaac 18000 ccagcagcag ccagcccgcg accctggact tgcctccgcc tcgcccctcc acagtggcta 18060 agcccctgcc gccggtggcc gtcgcgtcgc gcgccccccg aggccgcccc caggcgaact 18120 ggcagagcac tctgaacagc atcgtgggtc tgggagtgca gagtgtgaag cgccgccgct 18180 gctattaaaa gacactgtag cgcttaactt gcttgtctgt gtgtatatgt atgtccgccg 18240 accagaagga ggagtgtgaa gaggcgcgtc gccgagttgc aagatggcca ccccatcgat 18300 gctgccccag tgggcgtaca tgcacatcgc cggacaggac gcttcggagt acctgagtcc 18360 gggtctggtg cagttcgccc gcgccacaga cacctacttc agtctgggga acaagtttag 18420 gaaccccacg gtggcgccca cgcacgatgt gaccaccgac cgcagccagc ggctgacgct 18480 gcgcttcgtg cccgtggacc gcgaggacaa cacctactcg tacaaagtgc gctacacgct 18540 ggccgtgggc gacaaccgcg tgctggacat ggccagcacc tactttgaca tccgcggcgt 18600 gctggaccgg ggccctagct tcaaacccta ctctggcacc gcctacaaca gcctagctcc 18660 caagggagct cccaattcca gccagtggga gcaagcaaaa acaggcaatg ggggaactat 18720 ggaaacacac acatatggtg tggccccaat gggcggagag aatattacaa aagatggtct 18780 tcaaattgga actgacgtta cagcgaatca gaataaacca atttatgccg acaaaacatt 18840 tcaaccagaa ccgcaagtag gagaagaaaa ttggcaagaa actgaaaact tttatggcgg 18900 tagagctctt aaaaaagaca caaacatgaa accttgctat ggctcctatg ctagacccac 18960 caatgaaaaa ggaggtcaag ctaaacttaa agttggagat gatggagttc caaccaaaga 19020 attcgacata gacctggctt tctttgatac tcccggtggc accgtgaacg gtcaagacga 19080 gtataaagca gacattgtca tgtataccga aaacacgtat ttggaaactc cagacacgca 19140 tgtggtatac aaaccaggca aggatgatgc aagttctgaa attaacctgg ttcagcagtc 19200 tatgcccaac agacccaact acattgggtt cagggacaac tttatcggtc ttatgtacta 19260 caacagcact ggcaatatgg gtgtgcttgc tggtcaggcc tcccagctga atgctgtggt 19320 tgatttgcaa gacagaaaca ccgagctgtc ctaccagctc ttgcttgact ctttgggtga 19380 cagaacccgg tatttcagta tgtggaacca ggcggtggac agttatgacc ccgatgtgcg 19440 catcatcgaa aaccatggtg tggaggatga attgccaaac tattgcttcc ccttggacgg 19500 ctctggcact aacgccgcat accaaggtgt gaaagtaaaa gatggtcaag atggtgatgt 19560 tgagagtgaa tgggaaaatg acgatactgt tgcagctcga aatcaattat gtaaaggtaa 19620 cattttcgcc atggagatta atctccaggc taacctgtgg agaagtttcc tctactcgaa 19680 cgtggccctg tacctgcccg actcctacaa gtacacgccg accaacgtca cgctgccgac 19740 caacaccaac acctacgatt acatgaatgg cagagtgaca cctccctcgc tggtagacgc 19800 ctacctcaac atcggggcgc gctggtcgct ggaccccatg gacaacgtca accccttcaa 19860 ccaccaccgc aacgcgggcc tgcgctaccg ctccatgctc ctgggcaacg ggcgctacgt 19920 gcccttccac atccaggtgc cccaaaagtt tttcgccatc aagagcctcc tgctcctgcc 19980 cgggtcctac acctacgagt ggaacttccg caaggacgtc aacatgatcc tgcagagctc 20040 cctaggcaac gacctgcgca cggacggggc ctccatcgcc ttcaccagca tcaacctcta 20100 cgccaccttc ttccccatgg cgcacaacac cgcctccacg ctcgaggcca tgctgcgcaa 20160 cgacaccaac gaccagtcct tcaacgacta cctctcggcg gccaacatgc tctaccccat 20220 cccggccaac gccaccaacg tgcccatctc catcccctcg cgcaactggg ccgccttccg 20280 cggatggtcc ttcacgcgcc tgaagacccg cgagacgccc tcgctcggct ccgggttcga 20340 cccctacttc gtctactcgg gctccatccc ctacctagac ggcaccttct acctcaacca 20400 caccttcaag aaggtctcca tcaccttcga ctcctccgtc agctggcccg gcaacgaccg 20460 cctcctgacg cccaacgagt tcgaaatcaa gcgcaccgtc gacggagagg gatacaacgt 20520 ggcccagtgc aacatgacca aggactggtt cctggtccag atgctggccc actacaacat 20580 cggctaccag ggcttctacg tgcccgaggg ctacaaggac cgcatgtact ccttcttccg 20640 caacttccag cccatgagcc gccaggtcgt ggacgaggtc aactacaagg actaccaggc 20700 cgtcaccctg gcctaccagc acaacaactc gggcttcgtc ggctacctcg cgcccaccat 20760 gcgccagggc cagccctacc ccgccaacta cccctacccg ctcatcggca agagcgccgt 20820 cgccagcgtc acccagaaaa agttcctctg cgaccgggtc atgtggcgca tccccttctc 20880 cagcaacttc atgtccatgg gcgcgctcac cgacctcggc cagaacatgc tctacgccaa 20940 ctccgcccac gcgctagaca tgaatttcga agtcgacccc atggatgagt ccacccttct 21000 ctatgttgtc ttcgaagtct tcgacgtcgt ccgagtgcac cagccccacc gcggcgtcat 21060 cgaagccgtc tacctgcgca cgcccttctc ggccggcaac gccaccacct aagccgctct 21120 tgcttcttgc aagatgacgg cgggctccgg cgagcaggag ctcagggcca tcctccgcga 21180 cctgggctgc gggccctgct tcctgggcac cttcgacaag cgcttccctg gattcatggc 21240 cccgcacaag ctggcctgcg ccatcgtgaa cacggccggc cgcgagaccg ggggcgagca 21300 ctggctggcc ttcgcctgga acccgcgctc ccacacatgc tacctcttcg accccttcgg 21360 gttctcggac gagcgcctca agcagatcta ccagttcgag tacgagggcc tgctgcgtcg 21420 cagcgccctg gccaccgagg accgctgcgt caccctggaa aagtccaccc agaccgtgca 21480 gggtccgcgc tcggccgcct gcgggctctt ctgctgcatg ttcctgcacg ccttcgtgca 21540 ctggcccgac cgccccatgg acaagaaccc caccatgaac ttactgacgg gggtgcccaa 21600 cggcatgctc cagtcgcccc aggtggaacc caccctgcgc cgcaaccagg aagcgctcta 21660 ccgcttcctc aatgcccact ccgcctactt tcgctcccac cgcgcgcgca tcgagaaggc 21720 caccgccttc gaccgcatga atcaagacat gtaaaaaacc ggtgtgtgta tgtgaatgct 21780 ttattcataa taaacagcac atgtttatgc caccttctct gaggctctga ctttatttag 21840 aaatcgaagg ggttctgccg gctctcggca tggcccgcgg gcagggatac gttgcggaac 21900 tggtacttgg gcagccactt gaactcgggg atcagcagct tgggcacggg gaggtcgggg 21960 aacgagtcgc tccacagctt gcgcgtgagt tgcagggcgc ccagcaggtc gggcgcggag 22020 atcttgaaat cgcagttggg acccgcgttc tgcgcgcgag agttgcggta cacggggttg 22080 cagcactgga acaccatcag ggccgggtgc ttcacgcttg ccagcaccgt cgcgtcggtg 22140 atgccctcca cgtccagatc ctcggcgttg gccatcccga agggggtcat cttgcaggtc 22200 tgccgcccca tgctgggcac gcagccgggc ttgtggttgc aatcgcagtg cagggggatc 22260 agcatcatct gggcctgctc ggagctcatg cccgggtaca tggccttcat gaaagcctcc 22320 agctggcgga aggcctgctg cgccttgccg ccctcggtga agaagacccc gcaggacttg 22380 ctagagaact ggttggtggc gcagccggcg tcgtgcacgc agcagcgcgc gtcgttgttg 22440 gccagctgca ccacgctgcg cccccagcgg ttctgggtga tcttggcccg gttggggttc 22500 tccttcagcg cgcgctgccc gttctcgctc gccacatcca tctcgatagt gtgctccttc 22560 tggatcatca cggtcccgtg caggcaccgc agcttgccct cggcttcggt gcagccgtgc 22620 agccacagcg cgcagccggt gcactcccag ttcttgtggg cgatctggga gtgcgagtgc 22680 acgaagccct gcaggaagcg gcccatcatc gcggtcaggg tcttgttgct ggtgaaggtc 22740 agcgggatgc cgcggtgctc ctcgttcaca tacaggtggc agatgcggcg gtacacctcg 22800 ccctgctcgg gcatcagctg gaaggcggac ttcaggtcgc tctccacgcg gtaccggtcc 22860 atcagcagcg tcatcacttc catgcccttc tcccaggccg aaacgatcgg caggctcagg 22920 gggttcttca ccgccattgt catcttagtc gccgccgccg aggtcagggg gtcgttctcg 22980 tccagggtct caaacactcg cttgccgtcc ttctcgatga tgcgcacggg gggaaagctg 23040 aagcccacgg ccgccagctc ctcctcggcc tgcctttcgt cctcgctgtc ctggctgatg 23100 tcttgcaaag gcacatgctt ggtcttgcgg ggtttctttt tgggcggcag aggcggcggc 23160 gatgtgctgg gagagcgcga gttctcgttc accacgacta tttcttcttc ttggccgtcg 23220 tccgagacca cgcggcggta ggcatgcctc ttctggggca gaggcggagg cgacgggctc 23280 tcgcggttcg gcgggcggct ggcagagccc cttccgcgtt cgggggtgcg ctcctggcgg 23340 cgctgctctg actgacttcc tccgcggccg gccattgtgt tctcctaggg agcaacaaca 23400 agcatggaga ctcagccatc gtcgccaaca tcgccatctg cccccgccgc caccgccgac 23460 gagaaccagc agcagaatga aagcttaacc gccccgccgc ccagccccac ctccgacgcc 23520 gcggccccag acatgcaaga gatggaggaa tccatcgaga ttgacctggg ctacgtgacg 23580 cccgcggagc acgaggagga gctggcagcg cgcttttcag ccccggaaga gaaccaccaa 23640 gagcagccag agcaggaagc agagaacgag cagaaccagg ctgggcacga gcatggcgac 23700 tacctgagcg gggcagagga cgtgctcatc aagcatctgg cccgccaatg catcatcgtc 23760 aaggacgcgc tgctcgaccg cgccgaggtg cccctcagcg tggcggagct cagccgcgcc 23820 tacgagcgca acctcttctc gccgcgcgtg ccccccaagc gccagcccaa cggcacctgt 23880 gagcccaacc cgcgcctcaa cttctacccg gtcttcgcgg tgcccgaggc cctggccacc 23940 taccacctct ttttcaagaa ccaaaggatc cccgtctcct gccgcgccaa ccgcacccgc 24000 gccgacgccc tgctcaacct gggccccggc gcccgcctac ctgatatcac ctccttggaa 24060 gaggttccca agatcttcga gggtctgggc agcgacgaga ctcgggccgc gaacgctctg 24120 caaggaagcg gagaggagca tgagcaccac agcgccctgg tggagttgga aggcgacaac 24180 gcgcgcctgg cggtcctcaa gcgcacggtc gagctgaccc acttcgccta cccggcgctc 24240 aacctgcccc ccaaggtcat gagcgccgtc atggaccagg tgctcatcaa gcgcgcctcg 24300 cccctctcgg aggaggagat gcaggacccc gagagttcgg acgagggcaa gcccgtggtc 24360 agcgacgagc agctggcgcg ctggctggga gcgagtagca ccccccagag cctggaagag 24420 cggcgcaagc tcatgatggc cgtggtcctg gtgaccgtgg agctggagtg tctgcgccgc 24480 ttctttgccg acgcggagac cctgcgcaag gtcgaggaga acctgcacta cctcttcagg 24540 cacgggttcg tgcgccaggc ctgcaagatc tccaacgtgg agctgaccaa cctggtctcc 24600 tacatgggca tcctgcacga gaaccgcctg gggcaaaacg tgctgcacac caccctgcgc 24660 ggggaggccc gccgcgacta catccgcgac tgcgtctacc tgtacctctg ccacacctgg 24720 cagacgggca tgggcgtgtg gcagcagtgc ctggaggagc agaacctgaa agagctctgc 24780 aagctcctgc agaagaacct caaggccctg tggaccgggt tcgacgagcg taccaccgcc 24840 tcggacctgg ccgacctcat cttccccgag cgcctgcggc tgacgctgcg caacgggctg 24900 cccgacttta tgagccaaag catgttgcaa aactttcgct ctttcatcct cgaacgctcc 24960 gggatcctgc ccgccacctg ctccgcgctg ccctcggact tcgtgccgct gaccttccgc 25020 gagtgccccc cgccgctctg gagccactgc tacttgctgc gcctggccaa ctacctggcc 25080 taccactcgg acgtgatcga ggacgtcagc ggcgagggtc tgctggagtg ccactgccgc 25140 tgcaacctct gcacgccgca ccgctccctg gcctgcaacc cccagctgct gagcgagacc 25200 cagatcatcg gcaccttcga gttgcaaggc cccggcgacg gcgagggcaa ggggggtctg 25260 aaactcaccc cggggctgtg gacctcggcc tacttgcgca agttcgtgcc cgaggactac 25320 catcccttcg agatcaggtt ctacgaggac caatcccagc cgcccaaggc cgagctgtcg 25380 gcctgcgtca tcacccaggg ggccatcctg gcccaattgc aagccatcca gaaatcccgc 25440 caagaatttc tgctgaaaaa gggccacggg gtctacttgg acccccagac cggagaggag 25500 ctcaacccca gcttccccca ggatgccccg aggaagcagc aagaagctga aagtggagct 25560 gccgccgccg gaggatttgg aggaagactg ggagagcagt caggcagagg aggaggagat 25620 ggaagactgg gacagcactc aggcagagga ggacagcctg caagacagtc tggaggagga 25680 agacgaggtg gaggaggcag aggaagaagc agccgccgcc agaccgtcgt cctcggcgga 25740 gaaagcaagc agcacggata ccatctccgc tccgggtcgg ggtcgcggcg gccgggccca 25800 cagtaggtgg gacgagaccg ggcgcttccc gaaccccacc acccagaccg gtaagaagga 25860 gcggcaggga tacaagtcct ggcgggggca caaaaacgcc atcgtctcct gcttgcaagc 25920 ctgcgggggc aacatctcct tcacccggcg ctacctgctc ttccaccgcg gggtgaactt 25980 cccccgcaac atcttgcatt actaccgtca cctccacagc ccctactact gtttccaaga 26040 agaggcagaa acccagcagc agcagaaaac cagcggcagc agcagctaga aaatccacag 26100 cggcggcagg tggactgagg atcgcggcga acgagccggc gcagacccgg gagctgagga 26160 accggatctt tcccaccctc tatgccatct tccagcagag tcgggggcag gagcaggaac 26220 tgaaagtcaa gaaccgttct ctgcgctcgc tcacccgcag ttgtctgtat cacaagagcg 26280 aagaccaact tcagcgcact ctcgaggacg ccgaggctct cttcaacaag tactgcgcgc 26340 tcactcttaa agagtagccc gcgcccgccc acacacggaa aaaggcggga attacgtcac 26400 cacctgcgcc cttcgcccga ccatcatgag caaagagatt cccacgcctt acatgtggag 26460 ctaccagccc cagatgggcc tggccgccgg cgccgcccag gactactcca cccgcatgaa 26520 ctggctcagt gccgggcccg cgatgatctc acgggtgaat gacatccgcg cccaccgaaa 26580 ccagatactc ctagaacagt cagcgatcac cgccacgccc cgccatcacc ttaatccgcg 26640 taattggccc gccgccctgg tgtaccagga aattccccag cccacgaccg tactacttcc 26700 gcgagacgcc caggccgaag tccagctgac taactcaggt gtccagctgg ccggcggcgc 26760 cgccctgtgt cgtcaccgcc ccgctcaggg tataaagcgg ctggtgatcc gaggcagagg 26820 cacacagctc aacgacgagg tggtgagctc ttcgctgggt ctgcgacctg acggagtctt 26880 ccaactcgcc ggatcgggga gatcttcctt cacgcctcgt caggccgtcc tgactttgga 26940 gagttcgtcc tcgcagcccc gctcgggcgg catcggcact ctccagttcg tggaggagtt 27000 cactccctcg gtctacttca accccttctc cggctccccc ggccactacc cggacgagtt 27060 catcccgaac ttcgacgcca tcagcgagtc ggtggacggc tacgattgaa tgtcccatgg 27120 tggcgcagct gacctagctc ggcttcgaca cctggaccac tgccgccgct tccgctgctt 27180 cgctcgggat ctcgccgagt ttgcctactt tgagctgccc gaggagcacc ctcagggccc 27240 agcccacgga gtgcggatca tcgtcgaagg gggcctcgac tcccacctgc ttcggatctt 27300 cagccagcga ccgatcctgg tcgagcgcga acaaggacag acccttctta ctttgtactg 27360 catctgcaac caccccggcc tgcatgaaag tctttgttgt ctgctgtgta ctgagtataa 27420 taaaagctga gatcagcgac tactccggac tcgattgtgg tgttcctgct atcaaccggt 27480 ccctgttctt caccgggaac gagaccgagc tccagctcca gtgtaagccc cacaagaagt 27540 acctcacctg gctgttccag ggctccccga tcgccgttgt caaccactgc gacaacgacg 27600 gagtcctgct gagcggccct gccaacctta ctttttccac ccgcagaagc aagctccagc 27660 tcttccaacc cttcctcccc gggacctatc agtgcgtctc aggaccctgc catcacacct 27720 tccacctgat cccgaatacc acagcgccgc tccccgctac taacaaccaa actacccacc 27780 aacgccaccg tcgcgacctt tcctctgaat ctaataccac taccggaggt gagctccgag 27840 gtcgaccaac ctctgggatt tactacggcc cctgggaggt ggtggggtta atagcgctag 27900 gcctagttgc gggtgggctt ttggttctct gctacctata cctcccttgc tgttcgtact 27960 tagtggtgct gtgttgctgg tttaagaaat ggggaagatc accctagtga gctgcggtgc 28020 gctggtggcg gtgttgcttt cgattgtggg actgggcggc gcggctgtag tgaaggagaa 28080 ggccgatccc tgcttgcatt tcaatcccaa caaatgccag ctgagttttc agcccgatgg 28140 caatcggtgc gcggtactga tcaagtgcgg atgggaatgc gagaacgtga gaatcgagta 28200 caataacaag actcggaaca atactctcgc gtccgtgtgg cagcccgggg accccgagtg 28260 gtacaccgtc tctgtccccg gtgctgacgg ctccccgcgc accgtgaata atactttcat 28320 ttttgcgcac atgtgcaaca cggtcatgtg gatgagcaag cagtacgata tgtggccccc 28380 cacgaaggag aacatcgtgg tcttctccat cgcttacagc ctgtgcacgg cgctaatcac 28440 cgctatcgtg tgcctgagca ttcacatgct catcgctatt cgccccagaa ataatgccga 28500 gaaagagaaa cagccataac acgttttttc acacaccttg tttttacaga caatgcgtct 28560 gttaaatttt ttaaacattg tgctcagtat tgcttatgcc tctggttatg caaacataca 28620 gaaaaccctt tatgtaggat ctgatggtac actagagggt acccaatcac aagccaaggt 28680 tgcatggtat ttttatagaa ccaacactga tccagttaaa ctttgtaagg gtgaattgcc 28740 gcgtacacat aaaactccac ttacatttag ttgcagcaat aataatctta cacttttttc 28800 aattacaaaa caatatactg gtacttatta cagtacaaac tttcatacag gacaagataa 28860 atattatact gttaaggtag aaaatcctac cactcctaga actaccacca ccaccactac 28920 tgcaaagccc actgtgaaaa ctacaactag gaccaccaca actacagaaa ccaccaccag 28980 cacaacactt gctgcaacta cacacacaca cactaagcta accttacaga ccactaatga 29040 tttgatcgcc ctgctgcaaa agggggataa cagcaccact tccaatgagg agatacccaa 29100 atccatgatt ggcattattg ttgctgtagt ggtgtgcatg ttgatcatcg ccttgtgcat 29160 ggtgtactat gccttctgct acagaaagca cagactgaac gacaagctgg aacacttact 29220 aagtgttgaa ttttaatttt ttagaaccat gaagatccta ggccttttta gtttttctat 29280 cattacctct gctctttgtg aatcagtgga tagagatgtt actattacca ctggttctaa 29340 ttatacactg aaagggccac cctcaggtat gctttcgtgg tattgctatt ttggaactga 29400 cactgatcaa actgaattat gcaattttca aaaaggcaaa acctcaaact ctaaaatctc 29460 taattatcaa tgcaatggca ctgatctgat actactcaat gtcacgaaag catatggtgg 29520 cagttattat tgccctggac aaaacactga agaaatgatt ttttacaaag tggaagtggt 29580 tgatcccact acaccaccca ccaccacaac tattcatacc acacacacag aacaaacacc 29640 agaggcaaca gaagcagagt tggccttcca ggttcacgga gattcctttg ctgtcaatac 29700 ccctacaccc gatcagcggt gtccggggcc gctagtcagc ggcattgtcg gtgtgctttc 29760 gggattagca gtcataatca tctgcatgtt catttttgct tgctgctata gaaggcttta 29820 ccgacaaaaa tcagacccac tgctgaacct ctatgtttaa ttttttccag agccatgaag 29880 gcagttagcg ctctagtttt ttgttctttg attggcattg tttttaatag taaaattacc 29940 agagttagct ttattaaaca tgttaatgta actgaaggag ataacatcac actagcaggt 30000 gtagaaggtg ctcaaaacac cacctggaca aaataccatc taggatggag agatatttgc 30060 acctggaatg taacttatta ttgcatagga gttaatctta ccattgttaa cgctaaccaa 30120 tctcagaatg ggttaattaa aggacagagt gttagtgtga ccagtgatgg gtactatacc 30180 cagcatagtt ttaactacaa cattactgtc ataccactgc ctacgcctag cccacctagc 30240 actaccacac agacaaccac atacagtaca tcaaatcagc ctaccaccac tacagcagca 30300 gaggttgcca gctcgtctgg ggtccgagtg gcatttttga tgttggcccc atctagcagt 30360 cccactgcta gtaccaatga gcagactact gaatttttgt ccactgtcga gagccacacc 30420 acagctacct ccagtgcctt ctctagcacc gccaatctct cctcgctttc ctctacacca 30480 atcagccccg ctactactcc tagccccgct cctcttccca ctcccctgaa gcaaacagac 30540 ggcggcatgc aatggcagat caccctgctc attgtgatcg ggttggtcat cctggccgtg 30600 ttgctctact acatcttctg ccgccgcatt cccaacgcgc accgcaagcc ggcctacaag 30660 cccatcgtta tcgggcagcc ggagccgctt caggtggaag ggggtctaag gaatcttctc 30720 ttctctttta cagtatggtg attgaactat gattcctaga caattcttga tcactattct 30780 tatctgcctc ctccaagtct gtgccaccct cgctctggtg gccaacgcca gtccagactg 30840 tattgggccc ttcgcctcct acgtgctctt tgccttcgtc acctgcatct gctgctgtag 30900 catagtctgc ctgcttatca ccttcttcca gttcattgac tggatctttg tgcgcatcgc 30960 ctacctgcgc caccaccccc agtaccgcga ccagcgagtg gcgcagctgc tcaggctcct 31020 ctgataagca tgcgggctct gctacttctc gcgcttctgc tgttagtgct cccccgtccc 31080 gtcgaccccc ggtcccccac tcagtccccc gaggaggttc gcaaatgcaa attccaagaa 31140 ccctggaaat tcctcaaatg ctaccgccaa aaatcagaca tgcatcccag ctggatcatg 31200 atcattggga tcgtgaacat tctggcctgc accctcatct cctttgtgat ttacccctgc 31260 tttgactttg gttggaactc gccagaggcg ctctatctcc cgcctgaacc tgacacacca 31320 ccacagcagc aacctcaggc acacgcacta ccaccaccac agcctaggcc acaatacatg 31380 cccatattag actatgaggc cgagccacag cgacccatgc tccccgctat tagttacttc 31440 aatctaaccg gcggagatga ctgacccact ggccaataac aacgtcaacg accttctcct 31500 ggacatggac ggccgcgcct cggagcagcg actcgcccaa cttcgcattc gtcagcagca 31560 ggagagagcc gtcaaggagc tgcaggacgg catagccatc caccagtgca agagaggcat 31620 cttctgcctg gtgaaacagg ccaagatctc ctacgaggtc acccagaccg accatcgcct 31680 ctcctacgag ctcctgcagc agcgccagaa gttcacctgc ctggtcggag tcaaccccat 31740 cgtcatcacc cagcagtcgg gcgataccaa ggggtgcatc cactgctcct gcgactcccc 31800 cgactgcgtc cacactctga tcaagaccct ctgcggcctc cgcgacctcc tccccatgaa 31860 ctaatcaccc ccttatccag tgaaataaag atcatattga tgatgattta aataaaaaaa 31920 ataatcattt gatttgaaat aaagatacaa tcatattgat gatttgagtt taacaaaaat 31980 aaagaatcac ttacttgaaa tctgatacca ggtctctgtc catgttttct gccaacacca 32040 cctcactccc ctcttcccag ctctggtact gcaggccccg gcgggctgca aacttcctcc 32100 acacgctgaa ggggatgtca aattcctcct gtccctcaat cttcatttta tcttctatca 32160 gatgtccaaa aagcgcgtcc gggtggatga tgacttcgac cccgtctacc cctacgatgc 32220 agacaacgca ccgaccgtgc ccttcatcaa cccccccttc gtctcttcag atggattcca 32280 agagaagccc ctgggggtgt tgtccctgcg actggctgac cccgtcacca ccaagaacgg 32340 ggaaatcacc ctcaagctgg gagagggggt ggacctcgac tcgtcgggaa aactcatctc 32400 caacacggcc accaaggccg ccgcccctct cagtatttca aacaacacca tttcccttaa 32460 aactgctgcc cctttctaca acaacaatgg aactttaagc ctcaatgtct ccacaccatt 32520 agcagtattt cccacattta acactttagg cataagtctt ggaaacggtc ttcagacttc 32580 aaataagttg ttgactgtac aactaactca tcctcttaca ttcagctcaa atagcatcac 32640 agtaaaaaca gacaaagggc tatatattaa ctccagtgga aacagaggac ttgaggctaa 32700 tataagccta aaaagaggac tagtttttga cggtaatgct attgcaacat atattggaaa 32760 tggcttagac tatggatctt atgatagtga tggaaaaaca agacccgtaa ttaccaaaat 32820 tggagcagga ttaaattttg atgctaacaa agcaatagct gtcaaactag gcacaggttt 32880 aagttttgac tccgctggtg ccttgacagc tggaaacaaa caggatgaca agctaacact 32940 ttggactacc cctgacccaa gccctaattg tcaattactt tcagacagag atgccaaatt 33000 tactctctgt cttacaaaat gcggtagtca aatactaggc actgtggcag tggcggctgt 33060 tactgtagga tcagcactaa atccaattaa tgacacagtc aaaagcgcca tagttttcct 33120 tagatttgat tccgatggtg tactcatgtc aaactcatca atggtaggtg attactggaa 33180 ctttagggag ggacagacca ctcaaagtgt agcctataca aatgctgtgg gattcatgcc 33240 aaatataggt gcatatccaa aaacccaaag taaaacacct aaaaatagca tagtcagtca 33300 ggtatattta actggagaaa ctactatgcc aatgacacta accataactt tcaatggcac 33360 tgatgaaaaa gacacaaccc cagttagcac ctactctatg acttttacat ggcagtggac 33420 tggagactat aaggacaaaa atattacctt tgctaccaac tcattctctt tttcctacat 33480 cgcccaggaa taatcccacc cagcaagcca accccttttc ccaccacctt tgtctatatg 33540 gaaactctga aacagaaaaa taaagttcaa gtgttttatt gaatcaacag ttttacagga 33600 ctcgagcagt tatttttcct ccaccctccc aggacatgga atacaccacc ctctcccccc 33660 gcacagcctt gaacatctga atgccattgg tgatggacat gcttttggtc tccacgttcc 33720 acacagtttc agagcgagcc agtctcggat cggtcaggga gatgaaaccc tccgggcact 33780 cccgcatctg cacctcacag ctcaacagct gaggattgtc ctcggtggtc gggatcacgg 33840 ttatctggaa gaagcagaag agcggcggtg ggaatcatag tccgcgaacg ggatcggccg 33900 gtggtgtcgc atcaggcccc gcagcagtcg ctgccgccgc cgctccgtca agctgctgct 33960 cagggggttc gggtccaggg actccctcag catgatgccc acggccctca gcatcagtcg 34020 tctggtgcgg cgggcgcagc agcgcatgcg aatctcgctc aggtcactgc agtacgtgca 34080 acacaggacc accaggttgt tcaacagtcc atagttcaac acgctccagc cgaaactcat 34140 cgcgggaagg atgctaccca cgtggccgtc gtaccagatc ctcaggtaaa tcaagtggcg 34200 ctccctccag aagacgctgc ccatgtacat gatctccttg ggcatgtggc ggttcaccac 34260 ctcccggtac cacatcaccc tctggttgaa catgcagccc cggatgatcc tgcggaacca 34320 cagggccagc accgccccgc ccgccatgca gcgaagagac cccggatccc ggcaatgaca 34380 atggaggacc caccgctcgt acccgtggat catctgggag ctgaacaagt ctatgttggc 34440 acagcacagg catatgctca tgcatctctt cagcactctc agctcctcgg gggtcaaaac 34500 catatcccag ggcacgggga actcttgcag gacagcgaac cccgcagaac agggcaatcc 34560 tcgcacataa cttacattgt gcatggacag ggtatcgcaa tcaggcagca ccgggtgatc 34620 ctccaccaga gaagcgcggg tctcggtctc ctcacagcgt ggtaaggggg ccggccgata 34680 cgggtgatgg cgggacgcgg ctgatcgtgt tctcgaccgt gtcatgatgc agttgctttc 34740 ggacattttc gtacttgctg tagcagaacc tggtccgggc gctgcacacc gatcgccggc 34800 ggcggtctcg gcgcttggaa cgctcggtgt taaagttgta aaacagccac tctctcagac 34860 cgtgcagcag atctagggcc tcaggagtga tgaagatccc atcatgcctg atagctctga 34920 tcacatcgac caccgtggaa tgggccaggc ccagccagat gatgcaattt tgttgggttt 34980 cggtgacggc gggggaggga agaacaggaa gaaccatgat taacttttaa tccaaacggt 35040 ctcggagcac ttcaaaatga aggtcacgga gatggcacct ctcgcccccg ctgtgttggt 35100 ggaaaataac agccaggtca aaggtgatac ggttctcgag atgttccacg gtggcttcca 35160 gcaaagcctc cacgcgcaca tccagaaaca agacaatagc gaaagcggga gggttctcta 35220 attcctcaac catcatgtta cactcctgca ccatccccag ataattttca tttttccagc 35280 cttgaatgat tcgaactagt tcctgaggta aatccaagcc agccatgata aaaagctcgc 35340 gcagagcacc ctccaccggc attcttaagc acaccctcat aattccaaga tattctgctc 35400 ctggttcacc tgcagcagat tgacaagcgg aatatcaaaa tctctgccgc gatccctgag 35460 ctcctccctc agcaataact gtaagtactc tttcatatcg tctccgaaat ttttagccat 35520 aggaccccca ggaataagag aagggcaagc cacattacag ataaaccgaa gtccccccca 35580 gtgagcattg ccaaatgtaa gattgaaata agcatgctgg ctagacccgg tgatatcttc 35640 cagataactg gacagaaaat cgggtaagca atttttaaga aaatcaacaa aagaaaaatc 35700 ttccaggtgc acgtttaggg cctcgggaac aacgatggag taagtgcaag gggtgcgttc 35760 cagcatggtt agttagctga tctgtaaaaa aacaaaaaat aaaacattaa accatgctag 35820 cctggcgaac aggtgggtaa atcgttctct ccagcaccag gcaggccacg gggtctccgg 35880 cgcgaccctc gtaaaaattg tcgctatgat tgaaaaccat cacagagaga cgttcccggt 35940 ggccggcgtg aatgattcga gaagaagcat acacccccgg aacattggag tccgtgagtg 36000 aaaaaaagcg gccgaggaag caatgaggca ctacaacgct cactctcaag tccagcaaag 36060 cgatgccatg cggatgaagc acaaaatttt caggtgcgta aaaaatgtaa ttactcccct 36120 cctgcacagg cagcgaagct cccgatccct ccagatacac atacaaagcc tcagcgtcca 36180 tagcttaccg agcggcagca gcagcggcac acaacaggcg caagagtcag agaaaagact 36240 gagctctaac ctgtccgccc gctctctgct caatatatag ccccagatct acactgacgt 36300 aaaggccaaa gtctaaaaat acccgccaaa taatcacaca cgcccagcac acgcccagaa 36360 accggtgaca cactcagaaa aatacgcgca cttcctcaaa cggccaaact gccgtcattt 36420 ccgggttccc acgctacgtc atcaaaacac gactttcaaa ttccgtcgac cgttaaaaac 36480 atcacccgcc ccgcccctaa cggtcgccgc tcccgcagcc aatcaccttc ctccctcccc 36540 aaattcaaac agctcatttg catattaacg cgcaccaaaa gtttgaggta tattattgat 36600 gatg 36604 <210> 106 <211> 948 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 106 Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Arg Val 1 5 10 15 Lys Arg Glu Leu Arg Ser Arg His Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly 20 25 30 Arg Val Lys Arg Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ser Arg Thr Arg 35 40 45 Ser Gly Arg Val Lys Arg Phe Met Tyr Ser Asp Phe His Phe Ile Arg 50 55 60 Val Lys Arg Phe Met Tyr Ser Asp Leu His Phe Ile Arg Val Lys Arg 65 70 75 80 Phe Met Tyr Thr Asp Phe His Phe Ile Arg Val Lys Arg Phe Met Phe 85 90 95 Ser Asp Phe His Phe Ile Arg Val Lys Arg Gly Thr Phe Glu Phe Thr 100 105 110 Ser Phe Phe Tyr Arg Val Lys Arg Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Tyr 115 120 125 Phe Tyr Arg Val Lys Arg Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Arg 130 135 140 Val Lys Arg Ile Ile Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Arg Val Lys Arg 145 150 155 160 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Ile Ala Arg Val Lys Arg Ile Leu Arg 165 170 175 Gly Ser Ile Ala His Lys Arg Val Lys Arg Ile Leu Arg Gly Ser Val 180 185 190 Ala His Lys Arg Val Lys Arg Val Leu Arg Gly Ser Ile Ala His Lys 195 200 205 Arg Val Lys Arg Leu Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Arg Val Lys 210 215 220 Arg Leu Val Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Arg Val Lys Arg Leu Thr 225 230 235 240 Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Arg Val Lys Arg Tyr Ser His Gly Thr 245 250 255 Gly Thr Gly Tyr Arg Val Lys Arg Tyr Ser His Trp Thr Gly Thr Gly 260 265 270 Tyr Arg Val Lys Arg Tyr Ser His Gly Ser Gly Thr Gly Tyr Arg Val 275 280 285 Lys Arg Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala 290 295 300 His Lys Arg Val Lys Arg Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg 305 310 315 320 Gly Ser Val Ala His Lys Arg Val Lys Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met 325 330 335 Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Arg Val Lys Arg 340 345 350 Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr 355 360 365 Ala Ala Arg Val Lys Arg Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Ile 370 375 380 Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Arg Val Lys Arg Val Ala Tyr Glu 385 390 395 400 Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe Lys Thr Ala Ala Arg Val 405 410 415 Lys Arg Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys Phe 420 425 430 Gln Ile Ala Ala Arg Val Lys Arg Val Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 435 440 445 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Val Arg Val Lys Arg Asp Val 450 455 460 Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr Asp Pro Arg Leu Arg 465 470 475 480 Val Lys Arg Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr 485 490 495 Tyr Pro Arg Leu Arg Val Lys Arg Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met 500 505 510 Glu Phe Ser Leu Thr Asp Gln Arg Leu Arg Val Lys Arg Phe Leu Ala 515 520 525 Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys Ser Arg Val 530 535 540 Lys Arg Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Val Leu Arg Gly Ser Val Ala 545 550 555 560 His Lys Ser Arg Val Lys Arg Lys Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys 565 570 575 Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile Arg Val Lys Arg Lys Leu Gly Met 580 585 590 Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile Arg Val Lys 595 600 605 Arg Lys Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln 610 615 620 Gln Val Arg Val Lys Arg Lys Trp Gly Met Glu Leu Arg Arg Cys Leu 625 630 635 640 Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile Arg Val Lys Arg Phe Gln Gly Arg Gly 645 650 655 Val Phe Glu Leu Arg Val Lys Arg Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr 660 665 670 Phe Ser Arg Val Lys Arg Ser Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser 675 680 685 Arg Val Lys Arg Gly Gln Val Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Arg Val 690 695 700 Lys Arg Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Arg Val Lys Arg 705 710 715 720 Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu 725 730 735 Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His Ser 740 745 750 Asn Leu Asn Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr 755 760 765 Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His Ser Asn Leu Asn 770 775 780 Asp Ser Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 785 790 795 800 Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr 805 810 815 Tyr Gln Arg Lys Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met 820 825 830 Arg Val Lys Arg Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg 835 840 845 Thr Arg Ser Leu Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys 850 855 860 Arg Trp His Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala 865 870 875 880 Ile Val Arg Thr Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His 885 890 895 Ser Asn Leu Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg 900 905 910 Ser Gly Met Asp Pro Arg Met Arg Val Lys Arg Trp His Ser Asn Leu 915 920 925 Asn Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Arg 930 935 940 Asp Pro Arg Met 945 <210> 107 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(50) <223> This sequence may encompass 1-10 'Gly Gly Gly Gly Ser' repeating units <400> 107 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 108 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(100) <223> This sequence may encompass 1-20 'Glu Ala Ala Ala Lys' repeating units <400> 108 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala 35 40 45 Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala 50 55 60 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 65 70 75 80 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 85 90 95 Ala Ala Ala Lys 100 <210> 109 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> This sequence may encompass 1-20 'Xaa Pro' repeating units <400> 109 Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro 1 5 10 15 Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro 20 25 30 Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro 35 40 <210> 110 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Arg Val Lys Arg 1 <210> 111 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2-R,S)-propyl]-N-palmitoyl -(R)-cysteine <400> 111 Cys Ser Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 112 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteine <400> 112 Cys Ser Ser Asn Ala 1 5 <210> 113 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteine <400> 113 Cys Ser Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 114 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dipalmitoyl-S-glyceryl-cysteine <400> 114 Cys Ser Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 115 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 115 Gly Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 116 <211> 560 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 116 Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn Thr Gly Thr Ile Asp Lys 1 5 10 15 Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Thr Thr Arg Pro Ile 20 25 30 Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn 35 40 45 Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Asp Asp Val Gly Arg 50 55 60 Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr 65 70 75 80 Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys 85 90 95 Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala His 100 105 110 Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu 115 120 125 Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu 130 135 140 Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp 145 150 155 160 Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu 165 170 175 Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met Asn Asp Val Cys 195 200 205 Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu 210 215 220 Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Val Pro Arg Arg Ser Gly Ala Thr 225 230 235 240 Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg 245 250 255 Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Lys 260 265 270 Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys 275 280 285 Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg 290 295 300 Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser 305 310 315 320 Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile 325 330 335 Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr 340 345 350 Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro 355 360 365 Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala Lys Asp Lys Ser Gln Leu 370 375 380 Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu 385 390 395 400 Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys 405 410 415 Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala 420 425 430 Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser 435 440 445 Gly Gly Asn Glu Val Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gln Ile Ser Cys 450 455 460 Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala 465 470 475 480 Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu Gly Arg Asp Ala Asp Val 485 490 495 Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp Ser Met Ala Lys Lys Thr 500 505 510 Ser Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met Phe Gln Ile Ser Asp Lys 515 520 525 Asn Lys Thr Asn Pro Ile Glu Ile Pro Ile Lys Gln Thr Ile Pro Asn 530 535 540 Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr 545 550 555 560 <210> 117 <211> 560 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 117 Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn Thr Gly Thr Ile Asp Lys 1 5 10 15 Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Thr Thr Arg Pro Ile 20 25 30 Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn 35 40 45 Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Ala Asp Val Gly Arg 50 55 60 Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr 65 70 75 80 Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys 85 90 95 Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala His 100 105 110 Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu 115 120 125 Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu 130 135 140 Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp 145 150 155 160 Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu 165 170 175 Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met Asn Asp Val Cys 195 200 205 Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu 210 215 220 Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser Gly Ala Thr 225 230 235 240 Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg 245 250 255 Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Lys 260 265 270 Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys 275 280 285 Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg 290 295 300 Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser 305 310 315 320 Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile 325 330 335 Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr 340 345 350 Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro 355 360 365 Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala Lys Asp Lys Ser Gln Leu 370 375 380 Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu 385 390 395 400 Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys 405 410 415 Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala 420 425 430 Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser 435 440 445 Gly Gly Asn Glu Val Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gln Ile Ser Cys 450 455 460 Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala 465 470 475 480 Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu Gly Arg Asp Ala Asp Val 485 490 495 Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp Ser Met Ala Lys Lys Thr 500 505 510 Asn Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met Phe Gln Ile Ser Asp Lys 515 520 525 Asn Lys Thr Asn Pro Val Glu Ile Pro Ile Lys Gln Thr Ile Pro Asn 530 535 540 Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr 545 550 555 560 <210> 118 <211> 560 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 118 Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn Thr Gly Thr Ile Asp Lys 1 5 10 15 Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Thr Thr Arg Pro Ile 20 25 30 Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn 35 40 45 Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Asp Asp Val Gly Arg 50 55 60 Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr 65 70 75 80 Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys 85 90 95 Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala Tyr 100 105 110 Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu 115 120 125 Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu 130 135 140 Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp 145 150 155 160 Asp Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu 165 170 175 Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Met Asn Asp Val Cys 195 200 205 Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu 210 215 220 Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Val Pro Arg Arg Ser Gly Ala Thr 225 230 235 240 Gly Val Ala Ile Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg 245 250 255 Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Lys 260 265 270 Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys 275 280 285 Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg 290 295 300 Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser 305 310 315 320 Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile 325 330 335 Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr 340 345 350 Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro 355 360 365 Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala Lys Asp Lys Ser Gln Leu 370 375 380 Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu 385 390 395 400 Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys 405 410 415 Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala 420 425 430 Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser 435 440 445 Gly Gly Asn Glu Ala Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gln Ile Ser Cys 450 455 460 Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala 465 470 475 480 Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu Gly Arg Asp Ala Asp Val 485 490 495 Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp Ser Met Ala Lys Lys Thr 500 505 510 Ser Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met Phe Gln Ile Ser Asp Lys 515 520 525 Asn Lys Thr Asn Pro Ile Glu Ile Pro Ile Lys Gln Thr Ile Pro Asn 530 535 540 Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr 545 550 555 560

Claims (53)

  1. 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 51, 52, 58, 59, 61, 62, 84, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 제1 서열; 및 서열번호 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 32, 33, 34, 44, 45, 49, 53, 60, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 서열번호 2, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 52, 58, 59, 61, 62, 84, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 제1 서열; 및 서열번호 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 44, 45, 49, 53, 60, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  3. a. 서열번호 8, 11, 12, 40, 41, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 3, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 43, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 60, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는
    b. 서열번호 2 또는 43의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 8, 11, 12, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 41, 44, 45, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는
    c. 서열번호 21, 22, 24, 26, 30, 32, 49, 53, 60, 70, 85, 86, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 51, 52, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는
    d. 서열번호 17, 20, 29, 31, 33, 34, 44, 45, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 87, 88, 89, 90, 또는 91의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는
    e. 서열번호 2 또는 43의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 8, 11, 12, 21, 22, 24, 26, 30, 32, 40, 41, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 84, 85, 86, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는
    f. 서열번호 3, 51, 또는 52의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 8, 11, 12, 21, 22, 24, 26, 30, 32, 40, 41, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 84, 85, 86, 92, 93, 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는
    g. 서열번호 2, 8, 11, 12, 40, 41, 43, 58, 59, 61, 62, 84, 또는 92의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 21, 22, 24, 26, 30, 32, 49, 53, 60, 70, 85, 86, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 서열; 또는
    h. 서열번호 2, 8, 11, 12, 21, 22, 24, 26, 30, 32, 40, 41, 43, 49, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 84, 85, 86, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제1 서열, 및 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 41, 43, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94의 적어도 8개의 연속 아미노산에 대해 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 제2 상이한 서열로서, 제1 서열 및 제2 상이한 서열을 포함하는 연속 서열은 PB1, PA, 또는 NP에서 발견되지 않는 것인 서열
    을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열 각각은 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 40, 41, 43-45, 49, 51-53, 58-62, 70, 73-78, 및 82-94로 구성되는 군으로부터 선택된 상이한 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 포함하고, 폴리펩티드는 자연 발생하지 않는 것인 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열 중 적어도 하나는 서열번호 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 44, 45, 49, 53, 60, 70, 72-78, 82, 83, 85-91, 93, 및 94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열 중 적어도 하나는 서열번호 2, 3, 43, 51, 및 52로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 서열, 제2 서열, 제3 서열, 제4 서열, 및 제5 서열 중 적어도 하나는 서열번호 8, 11, 12, 40, 41, 58, 59, 61, 62, 및 92로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 B의 NP 단백질의 아미노산 서열의 적어도 10%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 가진 서열을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 116, 117, 또는 118의 아미노산 서열의 적어도 10%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 가진 서열을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 서열은 길이가 최대 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 아미노산인 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 서열 및 제2 서열은 직접 연결되는 것인 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 서열 및 제2 서열은 링커에 의해 연결되는 것인 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 링커는 복수의 글리신, 알라닌, 아르기닌, 발린, 또는 라이신을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  14. 제12항에 있어서, 링커는 서열 RVKR(서열번호 110)을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 GALNNRFQIKGVELKSK(서열번호 103)를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 서열번호 103은 폴리펩티드의 아미노 말단 부분에 연결되는 것인 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 41, 43, 44, 45, 49, 51, 52, 53, 58, 59, 60, 61, 62, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 및 94를 포함하는 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  21. 제19항에 있어서, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  22. 제20항 또는 제21항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  23. 제20항 또는 제21항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 비인간 영장류 벡터인 벡터.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 아데노바이러스 벡터인 벡터.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 침팬지 아데노바이러스 벡터인 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 침팬지 아데노바이러스 벡터는 C68(AdC68)(서열번호 104), C7(AdC7), C6(AdC6)(서열번호 105), Pan7, 또는 Pan9의 서열의 적어도 50%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 포함하는 것인 벡터.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 벡터.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
  30. 제20항 또는 제21항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스.
  31. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 바이러스.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 단리된 바이러스.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스인 바이러스.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항의 바이러스를 포함하는 조성물.
  35. 적어도 5개의 상이한 펩티드를 포함하는 조성물로서, 적어도 5개의 상이한 펩티드 각각은 서열번호 2, 3, 8, 11, 12, 17, 20-22, 24, 26, 29-34, 40, 41, 43-45, 49, 51-53, 58-62, 70, 73-78, 및 82-94로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 75%의 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함하거나, 그 서열로 구성되거나, 또는 그 서열로 실질적으로 구성되는 것인 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 각각의 펩티드는 길이가 최대 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 아미노산인 조성물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 인플루엔자 B의 NP 단백질의 아미노산 서열의 적어도 10%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 펩티드를 추가로 포함하는 조성물.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 116, 117, 또는 118의 아미노산 서열의 적어도 10%에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 펩티드를 추가로 포함하는 조성물.
  39. 제19항, 제22항, 제29항, 제34항, 또는 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 피하, 비내, 또는 근육내 투여를 위해 제형화되는 조성물.
  41. 제19항, 제22항, 제29항, 제34항, 또는 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 이어서, 투여는 피하 투여인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 투여는 비내 투여인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 투여는 근육내 투여인 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 개체에게 재차 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응은 투여 후 유도되는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 면역 반응은 전신성 면역 반응인 방법.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 개체는 바이러스에 감염된 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 또는 인플루엔자 C 바이러스인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 조성물은, 투여되는 경우, 개체에서 인플루엔자 A 균주의 하나 이상의 아형에 대해 교차-보호를 유도하는 것인 방법.
KR1020197021716A 2016-12-28 2017-12-28 인플루엔자 백신 KR20190129032A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662439865P 2016-12-28 2016-12-28
US62/439,865 2016-12-28
US201762550167P 2017-08-25 2017-08-25
US62/550,167 2017-08-25
PCT/US2017/068800 WO2018126060A1 (en) 2016-12-28 2017-12-28 Influenza vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190129032A true KR20190129032A (ko) 2019-11-19

Family

ID=62710906

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197021716A KR20190129032A (ko) 2016-12-28 2017-12-28 인플루엔자 백신

Country Status (10)

Country Link
US (3) US11111277B2 (ko)
EP (1) EP3562498A4 (ko)
JP (1) JP2020515283A (ko)
KR (1) KR20190129032A (ko)
CN (1) CN111148528A (ko)
AU (1) AU2017386682A1 (ko)
BR (1) BR112019013402A2 (ko)
CA (1) CA3048448A1 (ko)
MX (1) MX2019007924A (ko)
WO (1) WO2018126060A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019007924A (es) 2016-12-28 2020-01-27 Invvax Inc Vacunas contra la influenza.
CA3148026A1 (en) * 2019-08-13 2021-02-18 Vyjayanthi Krishnan Therapeutic agent effectiveness and its route of administration
CN110772635B (zh) * 2019-11-11 2023-01-31 扬州大学 流感病毒小体包被的仿生纳米疫苗及其制备方法

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1040001A (en) 1909-03-23 1912-10-01 Bofors Gullspaang Ab Breech-loading mechanism for artillery-guns.
US1017917A (en) 1910-12-17 1912-02-20 Joseph E Runner Combination block and tile machine.
US1023874A (en) 1911-10-12 1912-04-23 Thomas J Price Drinking-fountain.
US1042682A (en) 1912-04-17 1912-10-29 Okey J Jackson Toy cycle.
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6238884B1 (en) 1995-12-07 2001-05-29 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6713279B1 (en) 1995-12-07 2004-03-30 Diversa Corporation Non-stochastic generation of genetic vaccines and enzymes
US6083716A (en) 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US6596539B1 (en) 1997-10-31 2003-07-22 Maxygen, Inc. Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
WO1999045954A1 (en) 1998-03-13 1999-09-16 Epimmune, Inc. Hla-binding peptides and their uses
JP2002517995A (ja) 1998-06-17 2002-06-25 マキシジェン， インコーポレイテッド 所望の特性を有するポリヌクレオチドを生成するための方法
IL127331A0 (en) * 1998-11-30 1999-09-22 Yeda Res & Dev Peptide-based vaccine for influenza
EP1917970B1 (en) 1999-06-29 2011-06-15 Epimmune Inc. Hla binding peptides and their uses
WO2001019408A1 (en) * 1999-09-16 2001-03-22 Zycos Inc. Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides
CN100412190C (zh) 2001-03-15 2008-08-20 复旦大学 乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体的组建方法和应用
EP1421203A4 (en) 2001-05-17 2005-06-01 Diversa Corp NEW ANTIGEN-BINDING MOLECULES FOR THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, PROPHYLACTIC, ENZYMATIC, INDUSTRIAL AND AGRICULTURAL APPLICATIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND SCREENING THEREOF
EP1434859A2 (en) 2001-07-25 2004-07-07 New York University Use of glycosylceramides as adjuvants for vaccines against infections and cancer
WO2004014956A1 (en) * 2002-08-12 2004-02-19 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Novel immunogenic lipopeptides comprising t-helper and b-cell epitopes
US20060079453A1 (en) 2002-10-03 2006-04-13 John Sidney Hla binding peptides and their uses
DE602004011546T2 (de) 2003-10-02 2008-05-29 Basf Se Verfahren zur sequenz-saturations-mutagenese (sesam)
GB0716992D0 (en) 2007-08-31 2007-10-10 Immune Targeting Systems Its L Influenza antigen delivery vectors and constructs
AU2005248361B2 (en) 2004-05-18 2010-03-11 Vical Incorporated Influenza virus vaccine composition and methods of use
JP2008522621A (ja) 2004-12-09 2008-07-03 ユニヴァーシティ オヴ ピッツバーグ オヴ ザ コモンウェルス システム オヴ ハイアー エデュケーション 世界的に流行するトリインフルエンザに対して迅速に応答するためのワクチン
EP1877088B1 (en) 2005-04-11 2014-12-17 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Vaccine against pandemic strains of influenza viruses
US20070116717A1 (en) 2005-08-01 2007-05-24 Shneider Alexander M Influenza vaccine compositions and methods
CA2627105A1 (en) 2005-10-26 2007-05-03 Protelix, Inc. Influenza combinatorial antigen vaccine
EP1968632B1 (en) 2005-12-06 2012-04-11 Yeda Research And Development Co., Ltd. Improved influenza vaccine
US20090023895A1 (en) 2006-02-07 2009-01-22 Nec Corporation Hla-binding peptide, precursor thereof, and dna fragment and recombinant vector coding for said hla-binding peptide
GB0613977D0 (en) 2006-02-07 2006-08-23 Peptcell Ltd Peptide sequences and compositions
CA2658559A1 (en) 2006-07-21 2008-04-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to influenza virus using peptide and nucleic acid compositions
US8084594B2 (en) * 2007-07-13 2011-12-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture H2N3 influenza A viruses and methods of use
US8747861B2 (en) 2007-08-02 2014-06-10 Biondvax Pharmaceuticals Ltd. Multimeric multiepitope influenza vaccines
AU2008293504B2 (en) 2007-08-27 2012-04-12 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Immunogenic compositions and methods
WO2009117134A2 (en) 2008-03-21 2009-09-24 National Institutes Of Health Aerosolized genetic vaccines and methods of use
CN101575608A (zh) * 2008-05-07 2009-11-11 中国科学院上海生命科学研究院 针对禽流感病毒的重组联合dna疫苗
CN102123724B (zh) 2008-06-19 2018-05-01 变异生技公司 治疗流行性感冒的组合物和方法
CA2787099A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Anice C. Lowen Influenza virus hemagglutinin polypeptides containing stem domains, vaccines and uses thereof
EP2459716B1 (en) * 2009-07-31 2016-08-17 Paxvax, Inc. Adenoviral-based vectors
US9265822B2 (en) 2009-09-30 2016-02-23 Saint Louis University Peptides for inducing heterosubtypic influenza T cell responses
WO2012082803A2 (en) 2010-12-13 2012-06-21 Cel-Sci Corporation Method for inducing an immune response against avian, swine, spanish, h1n1, h5n9 influenza viruses and formulations thereof
CN103517713A (zh) 2011-02-22 2014-01-15 彼昂德瓦克斯医药有限公司 在改善的季节性和大流行性流感疫苗中的多聚体多表位多肽
WO2012162564A1 (en) 2011-05-25 2012-11-29 Cel-Sci Corporation Method for inducing an immune response and formulations thereof
US9205144B2 (en) * 2011-06-03 2015-12-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Identification of conserved peptide blocks in homologous polypeptides
EP2795321A2 (en) 2011-12-23 2014-10-29 Retroscreen Virology Ltd Vaccine - screening method
KR101382244B1 (ko) 2012-03-30 2014-04-08 재단법인 목암생명공학연구소 광범위한 인플루엔자 바이러스의 감염을 방어할 수 있는 ｔ―세포 기반 유니버설 플루 백신
US20140274806A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Synthetic Genomics Vaccines Influenza virus reassortment
EP3125931A4 (en) * 2014-04-03 2017-09-20 Biondvax Pharmaceuticals Ltd. Compositions of multimeric-multiepitope influenza polypeptides and their production
WO2015157189A1 (en) 2014-04-07 2015-10-15 The Regents Of The University Of California Vaccines and uses thereof
GB201603568D0 (en) 2016-03-01 2016-04-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Efficient treatment options including peptides and combination of peptide and cell based medicaments for use in immunotherapy against urinary bladder cancer
WO2017192671A1 (en) 2016-05-03 2017-11-09 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Yeast vaccine vector including immunostimulatory and antigenic polypeptides and methods of using the same
MX2019007924A (es) 2016-12-28 2020-01-27 Invvax Inc Vacunas contra la influenza.
WO2019046901A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 The University Of Melbourne METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREVENTING INFLUENZA INFECTION

Also Published As

Publication number Publication date
CA3048448A1 (en) 2018-07-05
CN111148528A (zh) 2020-05-12
US11739127B2 (en) 2023-08-29
EP3562498A1 (en) 2019-11-06
US20230416311A1 (en) 2023-12-28
JP2020515283A (ja) 2020-05-28
WO2018126060A1 (en) 2018-07-05
MX2019007924A (es) 2020-01-27
US11111277B2 (en) 2021-09-07
US20220002352A1 (en) 2022-01-06
AU2017386682A1 (en) 2019-07-25
BR112019013402A2 (pt) 2020-03-03
EP3562498A4 (en) 2020-10-28
US20180230187A1 (en) 2018-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7384512B2 (ja) 広域インフルエンザウイルスワクチン
BE1023087B1 (fr) Antigenes du cytomegalovirus et leurs utilisations
JP4588296B2 (ja) キメラワクチン
BE1023916B1 (fr) Nouvel adenovirus
EP2268816B1 (fr) Polynucléotides et polypeptides chimériques permettant la sécrétion d&#39;un polypeptide d&#39;intérêt en association avec des exosomes et leur utilisation pour la production de compositions immunogènes
JP7078620B2 (ja) アレルギーの治療のための核酸
EP2961846B1 (en) Crimean-congo haemorrhagic fever virus antigenic composition
KR20210005046A (ko) T-세포 유도 백신 조성물의 조합물 및 이의 용도
US20100068226A1 (en) Polynucleotides and Uses Thereof
US20230416311A1 (en) Influenza vaccines
US20230174588A1 (en) A vaccine against sars-cov-2 and preparation thereof
CN117177763A (zh) 用于增强疫苗接种期间的t细胞启动的病毒构建体
WO2021207730A1 (en) Vaccines for coronavirus and methods of using the same
CN116549627A (zh) 基于腺病毒载体的广谱新冠疫苗及其应用
US20210261647A1 (en) Lamp constructs comprising allergens
JP2002501369A (ja) Ｆｉｖワクチン
US20040131598A1 (en) Cancer therapy
RU2808567C2 (ru) Противораковая вакцина с инвариантной цепью из костистых рыб
CN117412769A (zh) 具有复制能力的4型腺病毒sars-cov-2疫苗及其用途
Murashev et al. Immunogenicity of candidate DNA vaccine based on subtype A of human immunodeficiency virus type 1 predominant in Russia
JP2023547656A (ja) がんの腫瘍溶解性ウイルス免疫療法のための免疫チェックポイントを調節するｖｓｖ－ｎｄｖハイブリッドウイルス
CN112135908A (zh) 选择性cd8阳性t细胞诱导疫苗抗原
US20030118601A1 (en) FIV vaccine