B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren.
L-Aminosäuren finden in der Humanmedizin, in der phar- mazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebac- terium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z.B. die Zuckerkonzentration wäh- rend der Fermentation oder die Aufarbeitung zur Produktform durch z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mik- roorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet . Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L- Aminosäuren produzieren. So ist zum Beispiel in US Patent 5,521,074 ein Corynebacterium Stamm beschrieben, der resistent gegenüber L-Valin ist und sensitiv gegenüber Fluoropyruvat . Ferner ist in EP 0287123 beschrieben, dass Corynebacterien mit Resistenz gegenüber
Mycophenolsäuren vorteilhaft zur L-Valin Gewinnung benutzt werden können. Auch ist bekannt, dass Mutanten mit mutierter Valyl-tRNA Synthetase in Kombination mit weiteren Mutationen für die L-VaIinbildüng herangezogen werden können (EP 0519113A1, US 5,658,766).
Die rekombinante DNA-Technik wird zusätzlich zur Verbesserung der intrinsischen Eigenschaften von L-Amino- säure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt. So ist beschrieben, dass Verstärkung der Expres- sion der Biosynthesegene ilvBN, ilvC, ilvD vorteilhaft zur L-VaIinbildung eingesetzt werden (EP 1155139B1, EP 0356739B1) . Bekannt ist ferner, dass die Abschwächung oder Ausschaltung des Threonin-Dehydratase Gens ilvA und/oder von Genen der Pantothenat Synthese zur L-Valinbildung herangezogen werden können (EP 1155139B1) .
Eine Verbesserung der Leistungseigenschaften wird auch durch die Verringerung der Nebenproduktbildung erreicht. Dies gelingt teilweise durch geeignete Fermen- tationsführung. Es ist auch bekannt, dass durch Expression spezieller Gene die Nebenproduktbildung verringert werden kann. So führt z. B. die Expression von avtA zu erhöhter L-Leucin Bildung und verringerter Bildung der Begleitaminosäure L-Valin (WO 00171021 Al) . Ferner ist bekannt, dass oftmals sich aus Pyruvat bildende Nebenprodukte bilden können, wie z. B. Laktat und Alanin, die beide direkt aus Pyruvat entstehen (Uy D. et al . , J. Biotechnol. 2003 Sept. 4; 104 (1-3) : 173-184) . Andererseits wird Pyruvat aber auch als Baustein von Amino- säuren, wie z. B. L-Isoleucin, L-Valin und L-Lysin benötigt .
Bei den Verfahren nach, dem Stand der Technik kann es auf Grund der intrinsischen Eigenschaften der Mikroorganismen immer noch zur Bildung von Alanin als unerwünschtes Nebenprodukt kommen und es werden relativ niedrige Ausbeuten der Zielaminosäure, wie z. B. L-Valin, erreicht.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Amino- säuren, die vorzugsweise aus Pyruvat entstehen, bereitzustellen, welche mit höheren Produktausbeuten einhergehen. Insbesondere soll die Ausbeute bei der Herstellung von L-Valin, L-Isoleucin und L-Lysin erhöht werden.
Überraschenderweise wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass die Alanin-Transaminase in ihrer Aktivität gegenüber dem natürlich vorkommenden Stamm geschwächt oder vollkommen ausgeschaltet wird oder, dass die Alaninpro- duktion vermindert wird. Weiterhin wird die Aufgabe da- durch gelöst, dass eine Alanin-Transaminase identifiziert wird.
Unter der erfindungsgemäßen Alanin-Transaminase ist insbesondere die L-Alanin-Transaminase zu verstehen.
Überraschenderweise kann die Ausbeute für die Produktion der Aminosäuren, insbesondere L-Valin, L-Lysin und L-Isoleucin, erheblich gesteigert werden.
Im Folgenden soll die Erfindung erläutert werden:
Die Figuren zeigen Plasmide:
Fig.l. Plasmid zum Nachweis der Aktivität des Alanin- Transaminase-Gens gemäß Beispiel 3
Fig.2: Plasmid, welches für die Deletion des Alanin- Transaminase-Gens gemäß Beispiel 4 verwendet wird
Es zeigt weiterhin:
Sequenzprotokoll 1: Eine für die Alanin-Transaminase kodierende Gensequenz .
Sequenzprotokoll 2: Die Aminosäuresequenz der Alanin- Transaminase.
Sequenzprotokoll Nr.1 kodiert ab Nukleotid 101 bis 1414 für die Alanin-Transaminase.
Sequenzprotokoll 2 zeigt die Sequenz der Alanin- Transaminase, die durch die Nukleodide von 101 bis 1414 des Sequenzprotokolls 1 kodiert werden.
Erfindungsgemäß können beispielsweise folgende Maßnahmen ergriffen werden:
Die Ausschaltung des Alanin-Transaminase-Gens kann durch Deletion oder Disruption bewirkt werden.
Hierzu wurde überraschenderweise das in der öffentlich zugänglichen Datenbank des „National Institutes of Health" hinterlegte Gen mit der Nummer NCgl2747 als für die Alanin-Transaminase kodierend identifiziert, dessen Funktion bisher nicht bekannt war. Das Gen ist daher ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Sequenz ist im Sequenzprotokoll Nr. 1 angegeben (Nucleotid 101-1414) .
Von der Erfindung umfasst sind auch Genstrukturen, welche die Sequenz nach Sequenzprotokoll 1 enthalten.
Diese können Chromosomen, Plasmide, Vektoren, Phagen, Viren sein. Weiterhin ist die Gensequenz beziehungsweise Nucleotidsequenz selber von der Erfindung umfasst.
Die Sequenz nach Sequenzprotokoll 1 (Nucleotid 101- 1414) kodiert für die Alanin-Transaminase und kann daher auch zu deren Herstellung verwendet werden. Hierzu können dem Fachmann bekannten Methoden, wie beispielsweise Überexpression, Verstärkung von Promotoren oder Startkodons, eingesetzt werden. Beispielhaft können die in dieser Anmeldung offenbarten Organismen für die Produktion der Alanin-Transaminase eingesetzt werden.
Weiterhin kann jedes für die Alanin-Transaminase kodierende Gen deletiert oder einer Disruption unterzogen werden .
Bei der Verringerung der Alanin-Transaminaseaktivität können beispielsweise folgende Methoden eingesetzt werden:
- Mutation des für die Alanin-Transaminase-Gen kodierende Sequenz, und/oder
- Verminderung der Expression von Alanin- Transaminase und/oder
- Abschwächung oder Ausschaltung des der Alanin- Transaminase vorgeschalteten Promotors und/oder
- Mutation oder Deletion des dem Alanin- Transaminase-Gen vorgeschalteten Startkodons und/oder
- Blockade des katalytischen Zentrums der Alanin- Transaminase beispielsweise durch Zugabe von dieses Zentrum blockierenden Substraten oder chemi-
sehe Substitution, beispielsweise bedingt durch Mutation.
Erfindungsgemäß werden vorzugsweise coryneforme Bakterien, besonders bevorzugt Corynebakterium glutamicum, eingesetzt .
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Plasmid, welches zur Deletion oder Inaktivierung des für die Alanin- Transaminase kodierenden Gens eingesetzt wird. Das Plasmid enthält interne Sequenzen des Alanin-Transaminase-Gens, oder aber dem 3'- und 5"- Ende des Alanin-Transaminase-Gens benachbarte Sequenzen.
Es enthält zwingend Sequenzen des Alanin-Transaminase- Gens oder die dem Alanin-Transaminase-Gen benachbart sind, vorzugsweise die Bereiche, die dem 3'- und 5'- Ende des Gens unmittelbar benachbart sind und ist idealerweise das in Figur 2 dargestellte Plasmid.
Die Aminosäure L-Valin findet in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung .
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Mikroorganismus oder eine transformierte Zelle bzw. eine recombinante Zelle, bei dem die Produktion von Alanin gemindert oder vollständig ausgeschaltet ist oder bei dem die Alanin- Transaminaseaktivität vermindert oder vollkommen ausgeschaltet ist.
Die eingesetzten Stämme produzieren vorzugsweise be- reits vor der Deletion des Alanin-Transaminase-Gens L- Valin oder L-Isoleucin oder L-Lysin.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.
Der Begriff „Modifikation" beschreibt in diesem Zusammenhang die Reduktion der intrazellulären Aktivität ei- nes oder mehrerer Biosynthese-Enzyme für die Herstellung von Aminosäuren (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechen- des Enzym mit einer reduzierten Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen (Protein) verringert exprimiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert, oder indem man das Gen sogar vollständig deletiert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Valin oder auch andere L- Aminosäuren die aus Pyruvat entstehen, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebakterium. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Coryne- bacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Ausgangsstamme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, L-Aminosäuren überproduzierende Mutanten bzw. Stämme, die erfindungsgemäß modifi- ziert worden sind.
Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Reduktion oder Ausschaltung des für die Alanin-Transaminase kodierenden Gens in verbesserter Weise die L- Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin produzieren.
Die Nukleotidsequenz des Alanin-Transaminase-Gens ist zwangsläufig durch die Erstellung der kompletten Genomsequenz von C. glutamicum bekannt (Kalinowski et al . , 2003, J. Biotechnol., 104:5-25; Ikeda M., and Nakagawa S. 2003 Appl . Microbiol. Biotechnol. 62:99-109), ohne das aber die Zuordnung eines offenen Leserahmens zur
Alanin-Transaminase bekannt ist. Das wie nachfolgend im Beispiel beschriebene und identifizierte offene Leseraster, das für Alanin Transaminase kodiert, trägt die Nummer NCgl2747 und ist in der öffentlich zugängli- chen Datenbank des „National Institutes of Health" hinterlegt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), ebenso unter Cgl2844 in der öffentlich zugänglichen „DNA Data bank of Japan" (http://gib.genes.nig.ac.jp).
Das unter diesen Nummern beschriebene Alanin-Trans- aminase-Gen wird erfindungsgemäß bevorzugt als Ausgangspunkt der Erfindung eingesetzt. Weiterhin können Allele des Alanin-Transaminase-Gens verwendet werden, die sich beispielsweise aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmuta- tionen (sense mutations) oder durch Deletion oder Insertion von Nukleotiden ergeben.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des Alanin-Transaminase-Gens oder die kata- lytischen Eigenschaften des Enzymproteins verringert werden. Ebenfalls kann die katalytische Eigenschaft des Enzymproteins hinsichtlich ihrer Substratspezifität verändert werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
Die Abschwächung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Muta- tion) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (J. Bacteriol . 1988. 170: 5949), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Res . 1998 26: 3548, bei Jensen und Hammer (Biotechnol. Bioeng. 1998 58: 191), bei Pa- tek et al . (Microbiology 1996 142: 1297 und in bekann- ten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik",
8. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) .
Mutationen, die zu einer Veränderung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität , sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Yano et al . 1998 Proc . Natl . Acad. Sei. USA, 95:5511-5, Oue S. et al . J. Biol . Chem. 1999, 274:2344-
9. und Onuffer et al . Protein Sei. 1995 4:1750-7 genannt. Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Er-
zeugung derartiger Mutationen und Proteine gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers „Molekulare Genetik", 8. Auflage, 2001, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland) , oder Über- Sichtsartikeln (N. Pokala 2001, J. Struct . Biol .
134:269-81; A. Tramontano 2004, Angew. Chem. Int. Ed Engl. 43:3222-3; N. V. Dokholyan 2004, Proteins. 54:622-8; J. Pei 2003, Proc . Natl . Acad. Sei. USA. 100:11361-6; H. Lilie 2003, EMBO Rep . 4:346-51; R. Jae- nicke Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42:140-2) entnommen werden .
Die abgeschwächte Expression der Gene oder der mutierten Gene erfolgt nach gebräuchlichen Methoden des Gen- austauschs, indem das native chromosomale Gen durch das mutierte Gen ersetzt wird, wie es beispielsweise bei Morbach et al . beschrieben ist (Appl . Microbiol . Bio- technol . 1996, 45: 612-620). Die Deletion des Gens erfolgt wie bei Scharzer und Pühler (Biotechnology 1990, 9: 84-87), sowie bei Schäfer et al . (Appl. Environ. Microbio. 1994, 60: 756-759) beschrieben. Die Transformation des gewünschten Stammes mit dem Vektor zum Genaustausch oder zur Deletion erfolgt durch Konjugation oder Elektroporation des Ausgangsstammes . Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al . (Appl. Environ. Microbio. 1994, 60: 756-759) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Tauch et al . (FEMS Microbiological Letters (1994)123:343-347) beschrieben.
Auf diese Weise kann das Alanin Transaminase-Gen dele- tiert oder dessen Allel in C. glutamicum ausgetauscht werden .
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Valin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung oder Deleti-
on der Alanin Transaminase-Aktivität eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
• die für die Acetohydroxysäuresynthase kodierenden iIvBN-Gene,
• das für die Isomeroreduktase kodierende ilvC-Gen,
• das für die Dehydratase kodierende ilvD-Gen,
• das für die Transaminase C kodierende ilvE Gen
zu verstärken insbesondere zu überexprimieren, oder Allele dieser Gene, insbesondere
• die für feedback-resistente Acetohydroxysäuresynthase kodierenden ilvBN-Gene,
zu verstärken oder zu überexprimieren,
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Valin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Reduktion der Alanin - Transaminase-Aktivität eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
• die für die Pantothenatsynthese kodierenden panBCD- Gene,
• die für die Liponsäuresynthese kodierenden lipAB- Gene ,
• die für die Pyruvatdehydrogenase kodierenden aceE-, aceF, lpD-Gene,
• die für die Gene der ATP Synthase A Untereinheit, ATP Synthase B Untereinheit, ATP Synthase C Unter- einheit, ATP Synthase alpha Untereinheit, ATP
Synthase gamma Untereinheit, ATP Synthase Untereinheit, ATP Synthase epsilon Untereinheit, ATP Synthase delta Untereinheit
zu inaktivieren oder zu reduzieren.
Schließlich kann es für die Produktion von L-Valin vorteilhaft sein, neben der Abschwächung der Alanin Trans- aminase unerwünschte Nebenreaktionen, die beispielsweise zu Leucin führen, auszuschalten (Nakayama : „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms,, , in: Overpro- duction of Microbial Products, Krumphanzl , Sikyta, Va- nek (eds.)/ Academic Press, London, UK, 1982) .
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetiti- ves Zulaufverfahren) zum Zwecke der Valin-Produktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Ein- richtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mik- roorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for
General Bacteriology" der American Society for Bacteri- ology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten. Als Koh- lenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Me- lasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Li- nolsäure, Alkohole, wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, verwendet wer-
den. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle kön- nen Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogen- phosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzu gegeben oder in geeigneter Weise während der KuI- tivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwiσklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen auf- rechtzuerhalten werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie z. B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 200C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 400C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maxi-
raura an L-Valin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erreicht.
Beispiele
Beispiel 1 : Klonierung der Alanin Transaminase
Mit Hilfe der PCR Reaktion wurde ein DNA-Fragment amplifiziert, das das Alanin Transaminase-Gen enthält. Es wurden die folgenden Primer benutzt:
orf234-for:
5'- ATGGTA(GGTCTC)AAATGACTACAGACAAGCGCAAAACCT -3"
orf234rev:
5'- ATGGTA(GGTCTC)AGCGCTCTGCTTGTAAGTGGACAGGAAG -3"
Die angegebenen Primer wurden durch MWG Biotech AG (An- zinger Str. 7a, D-85560 Ebersberg) synthetisiert, und die PCR Reaktion entsprechend Standard Protokollen durchgeführt (Innis et al . PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. 1990. Academic Press). Mit den Primern wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,3 kb erhalten, das für die Alanin-Transaminase kodiert. Die Primer enthalten zusätzlich die Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bsal, die in obigen Nukleotidsequenzen in Klammer angegeben sind.
Das amplifizierte DNA-Fragment von etwa 1,3 kb wurde im 0.8%igen Agarosegel identifiziert und aus dem Gel nach bestehenden Methoden isoliert (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden) . Die Ligation des Fragments erfolgte mit dem SureCloning Kit (Amersham, UK) in den Expressionsvektor pASK-IBA-3C (IBA, Gδttingen) . Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli DH5 transformiert (Grant
et al . , 1990. Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87:4645-4649) . Die Selektion auf Plasmid enthaltende Stämme erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf 25 mg pro Liter Chloramphenicol enthaltenden LB Platten.
Nach Plasmidisolation wurden die erhaltenen Plasmide durch Restriktionsverdau und gelelektrophoretische Analyse charakterisiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pASK- IBA-3Corf234 bezeichnet. Es ist in Figur 1 angege- ben.
Beispiel 2 : Isolierung der Alanin Transaminase
E. coli DH5 mit pASK-IBA-3Corf234 wurde bei 300C in 100 ml LB mit 25 mg pro Liter Chloramphenicol bis zu einer optischen Dichte von 0,5 angezogen. Dann wurden 0,01 ml einer Anhydrotetracyclinlösung zugefügt, die 2 mg Anhydrotetracyclin pro Milliliter Dimethylformamid enthielt. Die Kultur wurde weiter für 3 Stunden bei 30 0C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 12 Mi- nuten bei 40C und 5000 Umdrehungen pro Minute durch
Zentrifugation geerntet. Danach wurde das Zellpellet in Waschpuffer (100 mM Trihydroxymethylaminomethan, 1 mM Äthylenediaminetetraessigsäure, pH 8) resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Der Zellauf- Schluss erfolgte bei 0 0C durch einen Ultraschalldesintegrator (Branson Sonifier W-250, Branson Sonic Power Company, Danbury, USA; Beschalldauer 10 min, Pulslänge 20 %, Beschallintensität 2) . Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation (30 min, 13000 Upm, 4 0C) abgetrennt und Rohextrakt als Überstand erhalten.
Zur Isolierung des Proteins wurden StrepTactin- Affinitätssäulen des Herstellers IBA (IBA, Göttingen, Deutschland) mit 1 ml Bettvolumen StrepTactin-Sepharose befüllt. Nach Äquilibrierung der Säulen mit Waschpuffer des Herstellers IBA wurde 1 ml des Rohextraktes auf die Sepharose gegeben. Nach Durchlauf des Extraktes wurde die Affinitätssäule fünfmal mit 1 ml Waschpuffer gewaschen. Die Elution des Alanin Transaminase-Proteins wurde mit Elutionspuffer, bestehend aus 100 mM Tris, 1 mM EDTA, 2 , 5 mM Desthiobiotin, pH 8, durchgeführt. Die Elutionsfraktionen wurden aliquotiert, bei -20 0C eingefroren und direkt im Enzymtest eingesetzt.
Beispiel 3 : Aktivitätsbestimmung der Alanin Transamina- se
Der Reaktionsansatz des Enzymtests enthielt in einem Gesamtvolumen von 1 ml: 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8, 0,005 ml Alanin Transaminase-Protein und 0,1 ml 2,5 mM Pyridoxalphosphat , sowie 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M L-Glutamat, oder 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M Aspartat, oder 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M α-Amino-butyrat , oder 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M L-Glutamat ohne Alanin Transaminase Protein. Der Enzymtest wurde bei 30 0C in einem Thermocycler 5436 der Firma Eppendorf (Hamburg) durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Proteins gestartet. Durch Zugabe von 30 μl eines Stoppreagenzes (6,7% (v/v) Perchlorsäure (70 %ig) , 40 % (v/v) Ethanol (95 %ig) in Wasser) zu jeweils 50 μl des Testansatzes wurde der En- zymtest gestoppt . Um die Proben für den Nachweis der gebildeten Aminosäuren über reversed phase HPLC vorzubereiten, wurden 20 μl eines Neutralisierunsgspuffers (20 mM Tris, 2,3 M Di-Kalium-carbonat , pH 8) zugegeben. Der durch die Neutralisierung der Perchlorsäure ausfal-
lende Niederschlag wurde abzentrifugiert (13000 Upm, 10 min) und der Überstand in verschiedenen Verdünnungen für die Quantifizierung mittels HPLC eingesetzt. Diese erfolgte nach automatischer Derivatisierung mit o- Phthaldialdehyd wie beschrieben (Hara et al . 1985, Ana- lytica Chimica Acta 172:167-173). Wie Tabelle 1 zeigt, katalysiert das isolierte Protein die L-Glutamat, L- Aspartat und ce-Aminobutyrat abhängige Aminierung von Pyruvat zu Alanin.
TABELLE 1
Die spezifische Aktivität (spez. Aktivität) ist in Micromol Produkt pro Minute und Milligramm Alanin Transaminase Protein angegeben.
Beispiel 4: Deletion des Alanin Transaminase-Gens
Mit Hilfe der PCR Reaktion wurden zwei DNA-Fragmente amplifiziert, die das Alanin Transaminase-Gen flankieren. Es wurden die folgenden Primer benutzt: Del234__l:
5 ' - CG (GGATCC) CATGCAACCGATCTGGTTTTGTG - 3 ' Del234_2 :
5 ' - CCCATCCACTAAACTTAAACAGCGCTTGTCTGTAGTCACCCG - 3 " Del234_3 :
S " - TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCGCCTGGGTAACTTCCTGTCC - 3 '
Del234_4 :
5"- CG(GGATCC)GATTGATCATGTCGAGGAAAGCC - 3'
Die angegebenen Primer wurden durch MWG Biotech AG (An- zinger Str. 7a , D-85560 Ebersberg) synthetisiert, und die PCR Reaktion entsprechend Standard Protokollen durchgeführt (Innis et al . PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. 1990. Academic Press) . Mit den Primern wurden zwei DNA-Fragmente von etwa 400 bp amplifiziert , die das Gen für die Alanin Transaminase flankieren. Die Primer Del234_l und Del234_4 enthalten zusätzlich die Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI , die in obigen Nukleotidsequenzen in Klammer an- gegeben ist. Die amplifizierten DNA-Fragmente von etwa 400 bp wurden im 0.8%igen Agarosegel identifiziert und aus dem Gel nach bestehenden Methoden isoliert (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden) . Mit Hilfe einer zweiten PCR Reaktion, in die die beiden zuvor amplifi- zierten DNA-Fragmente als template DNA eingesetzt wurden (Link et al . , 1997, J. Bacteriol . 179:6228-6237),
wurde ein etwa 800 bp großes Fragment amplifiziert . Dieses Fragment enthält beide, die Alanin Transaminase flankierenden DNA-Bereiche. Das amplifizierte DNA- Fragment von etwa 800 bp wurde im 0.8%igen Agarosegel identifiziert und aus dem Gel mit bestehenden Methoden isoliert (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden) .
Die Ligation des Fragments erfolgte mit dem SureCloning Kit (Amersham, UK) in den Deletionsvektor pK19mobsacB (Schäfer et al . , 1994, Gene 145:69-73). Mit dem Ligati- onsansatz wurde E. coli DH5 transformiert (Grant et al . , 1990. Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87:4645-4649). Die Selektion Plasmid enthaltender Stämme erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf 50 mg pro Liter Kanamycin enthaltenden LB Platten.
Nach Plasmidisolation wurden erhaltene Plasmide durch Restriktionsverdau und gelelektrophoretische Analyse charakterisiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pkl9mobsacB-orf234 bezeichnet. Es ist in Figur 2 ange- geben .
Das Plasmid pkl9mobsacB-orf234 wurde zur Transformation des Stammes 13032ΔpanBC auf Kanamycinresistenz benutzt. Der Stamm ist in EP1155139B1 beschrieben, und die Transformationstechnik bei Kirchner et al . J. Bio- technol. 2003, 104:287-99.
Die Deletion des Gens für die Alanin Transaminase wurde nach dem Protokoll zur Deletion von Genen in Corynebac- terium glutamicum nach Schäfer et al . , 1994, Gene 145:69-73, durch zwei aufeinanderfolgende homologe Re- kombinationen durchgeführt .
Mit Hilfe der PCR Reaktion wurde die Deletion des Gens für die Alanin Transaminase bestätigt. Es wurden die folgenden Primer benutzt:
Ko_delorf234_for :
5'- CTGGGTATTCGCCACGGACGT - 3'
Ko_delorf234_rev: 5"- TCGGCGGTGTCAAAAGCATTGC - 3'
Die angegebenen Primer wurden durch MWG Biotech synthetisiert, und die PCR Reaktion entsprechend Standard Protokollen durchgeführt (Innis et al . PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. 1990. Academic Press) . Die Amplifikation eines 1 kB großen DNA- Fragmentes bestätigte die Deletion des Gens für die Alanin Transaminase. Der erhaltene Stamm wurde als Stamm 13032ΔpanBCΔalaT bezeichnet.
Beispiel 5 : Reduktion der Alanin Bildung und Steigerung der L-Valin Bildung durch Deletion der Alanin Transaminase
Der Stamm 13032ΔpanBCΔalaT sowie der Kontroll-Stamm 13032ΔpanBC wurde in dem Medium CGIII (Menkel et al . 1989, Appl. Environ. Microbiol . 55:684-8) bei 3O0C angezogen. Damit wurde das Medium CGXII mit einer optischen Dichte von 1 beimpft. Das Medium CGXII enthält pro Liter: 20 g (NH4) 2SO4, 5 g Harnstoff, 1 g KH2PO4,
1 g K2HPO4, 0,25 g Mg2O4*7 H2O, 42 g 3-Morpholinopropan- sulfonsäure, 10 mg CaCl2, 10 mg FeSO4*7 H2O, 10 mg MnSO4* H2O, 1 mg ZnSO4*7 H2O, 0,2 mg CuSO4, 0,02 mg NiCl2*6 H2O, 0,2 mg Biotin, 40 g Glukose, 0,5 μM Pan- tothenat und 0,03 mg Protokatechusäure. Die Kultur wur-
de bei 3O0C und 120 Umdrehungen pro Minute inkubiert, und nach 56 Stunden wurde die Alanin- und L-Valin- akkumulation im Medium mittels HPLC bestimmt. Diese erfolgte mit o-Phthaldialdehyd wie beschrieben (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172:167-173). Die bestimmten Alanin- und L-Valinkonzentrationen sind in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2