DE102005019967A1

DE102005019967A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren

Info

Publication number: DE102005019967A1
Application number: DE102005019967A
Authority: DE
Inventors: Jan Marienhagen; Lothar Dr. Eggeling; Hermann Prof. Dr. Sahm
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2005-04-29
Filing date: 2005-04-29
Publication date: 2006-11-02
Also published as: JP5227789B2; WO2006116962A3; US20100151449A1; JP2008538899A; EP1874946A2; KR20080007263A; WO2006116962A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird die Aktivität der Alanintransaminase entweder reduziert oder ausgeschaltet, wodurch insbesondere die Aminosäuren L-Valin, L-Lysin und L-Isoleucin mit erhöhter Ausbeute produziert werden. DOLLAR A Weiterhin wurde die Nukleinsäure gemäß Seq. Nr. 1 von den Positionen 101 bis 1414 als die für das Alanin-Transaminase-Gen kodierende Sequenz identifiziert. Deren Verwendung ermöglicht die Herstellung von L-Alanin.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren.
L-Aminosäuren finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstell-verfahren gearbeitet. Verfahrensbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie z.B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z.B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation oder die Aufarbeitung zur Produktform durch z.B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L- Aminosäuren produzieren. So ist zum Beispiel in US Patent 5,521,074 ein Corynebacterium Stamm beschrieben, der resistent gegenüber L-Valin ist und sensitiv gegenüber Fluoropyruvat. Ferner ist in EP 0287123 beschrieben, dass Corynebacterien mit Resistenz gegenüber Mycophenolsäuren vorteilhaft zur L-Valin Gewinnung benutzt werden können. Auch ist bekannt, dass Mutanten mit mutierter Valyl-tRNA Synthetase in Kombination mit weiteren Mutationen für die L-Valinbildung herangezogen werden können ( EP0519113A1 , US5,658,766 ).

Die rekombinante DNA-Technik wird zusätzlich zur Verbesserung der intrinsischen Eigenschaften von L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt. So ist beschrieben, dass Verstärkung der Expression der Biosynthesegene i1vBN, ilvC, ilvD vorteilhaft zur L-Valinbildung eingesetzt werden ( EP1155139B1 , EP0356739B1 ). Bekannt ist ferner, dass die Abschwächung oder Ausschaltung des Threonin-Dehydratase Gens ilvA und/oder von Genen der Pantothenat Synthese zur L-Valinbildung herangezogen werden können ( EP1155139B1 ).

Eine Verbesserung der Leistungseigenschaften wird auch durch die Verringerung der Nebenproduktbildung erreicht. Dies gelingt teilweise durch geeignete Fermentationsführung. Es ist auch bekannt, dass durch Expression spezieller Gene die Nebenproduktbildung verringert werden kann. So führt z.B. die Expression von avtA zu erhöhter L-Leucin Bildung und verringerter Bildung der Begleitaminosäure L-Valin (WO_00171021_A1). Ferner ist bekannt, dass oftmals sich aus Pyruvat bildende Nebenprodukte bilden können, wie z.B. Laktat und Alanin, die beide direkt aus Pyruvat entstehen (Uy D et al., J Biotechnol. 2003 Sep 4;104(1-3):173-184). Andererseits wird Pyruvat aber auch als Baustein von Aminosäuren, wie z.B. L-Isoleucin, L-Valin, und L-Lysin benötigt.

Bei den Verfahren nach dem Stand der Technik kann es auf Grund der intrinsischen Eigenschaften der Mikroor ganismen immer noch zur Bildung von Alanin als unerwünschtes Nebenprodukt kommen, und es werden relativ niedrige Ausbeuten der Zielaminosäure, wie z.B. L-Valin erreicht.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, die vorzugsweise aus Pyruvat entstehen, bereitzustellen, welche mit höheren Produktausbeuten einhergehen. Insbesondere soll die Ausbeute bei der Herstellung von L-Valin, L-Isoleucin und L-Lysin erhöht werden.

Überraschenderweise wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass die Alanin-Transaminase in ihrer Aktivität gegenüber dem natürlich vorkommenden Stamm geschwächt oder vollkommen ausgeschaltet wird oder, dass die Alaninproduktion vermindert wird. Weiterhin wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass eine Alanin-Transaminase identifiziert wird.

Unter der erfindungsgemäßen Alanin-Transanminase ist insbesondere die L-Alanin-Transaminase zu verstehen.

Überraschenderweise kann die Ausbeute für die Produktion der Aminosäuren insbesondere L-Valin, L-Lysin und L-Isoleucin erheblich gesteigert werden.

Im Folgenden soll die Erfindung erläutert werden:
Die Figuren zeigen Plasmide:

1.Plasmid zum Nachweis der Aktivität des Alanin-Transaminase-Gens gemäß Beispiel 3

2:Plasmid, welches für die Deletion des Alanin-Transaminase-Gens gemäß Beispiel 4 verwendet wird.

Es zeigt weiterhin:

Sequenzprotokoll 1:	Eine für die Alanin-Transaminase kodierende Gensequenz.
Sequenzprotokoll 2:	Die Aminosäuresequenz der Alanin-Transaminase.

Sequenzprotokoll Nr.1 kodiert ab Nukleotid 101 bis 1414 für die Alanintransaminase.

Sequenzprotokoll 2 zeigt die Sequenz der Alanintransaminase, die durch die Nukleodide von 101 bis 1414 des Sequenzprotokolls 1 kodiert werden.

Erfindungsgemäß können beispielsweise folgende Maßnahmen ergriffen werden:
Die Ausschaltung des Alanin-Transaminase-Gens kann durch Deletion oder Disruption bewirkt werden.

Hierzu wurde überraschenderweise das in der öffentlich zugänglichen Datenbank des „National Institutes of Health" hinterlegte Gen mit der Nummer NCgl2747 als für die Alanin-Transaminase kodierend identifiziert, dessen Funktion bisher nicht bekannt war. Das Gen ist daher ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Sequenz ist im Sequenzprotokoll Nr. 1 angegeben (Nucleotid 101-1414).

Von der Erfindung umfasst sind auch Genstrukturen, welche die Sequenz nach Sequenzprotokoll 1 enthalten. Diese können Chromosomen, Plasmide, Vektoren, Phagen, Viren sein. Weiterhin ist die Gensequenz beziehungsweise Nucleotidsequenz selber von der Erfindung umfasst.

Die Sequenz nach Sequenzprotokoll 1 (Nucleotid 101-1414) kodiert für die Alanin-Transaminase und kann daher auch zu deren Herstellung verwendet werden. Hierzu können dem Fachmann bekannten Methoden, wie beispielsweise Überexpression, Verstärkung von Promotoren oder Startkodons eingesetzt werden. Beispielhaft können die in dieser Anmeldung offenbarten Organismen für die Produktion der Alanintransaminase eingesetzt werden.

Weiterhin kann jedes für die Alanin-Transaminase kodierende Gen deletiert oder einer Disruption unterzogen werden.

Bei der Verringerung der Alanin-Transaminaseaktivität können beispielsweise folgende Methoden eingesetzt werden:

– Mutation des für die Alanin-Transaminase-Gen kodierende Sequenz, und/oder
– Verminderung der Expression von Alanin-Transaminase und/oder
– Abschwächung oder Ausschaltung des der Alanin-Transaminase vorgeschalteten Promotors und/oder
– Mutation oder Deletion des dem Alanin-Transaminase-Gen vorgeschalteten Startkodons und/oder
– Blockade des katalytischen Zentrums der Alanin-Transaminase beispielsweise durch Zugabe von dieses Zentrum blockierenden Substraten oder chemische Substitution, beispielsweise bedingt durch Mutation.

Erfindungsgemäß werden vorzugsweise coryneforme Bakterien, besonders bevorzugt Corynebakterium glutamicum eingesetzt.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Plasmid, welches zur Deletion oder Inaktivierung des für die Alanin-Transaminase kodierenden Gens eingesetzt wird. Das Plasmid enthält interne Sequenzen des Alanin-Transaminase-Gens, oder aber dem 3'- und 5'- Ende des Alanin-Transaminase-Gens benachbarte Sequenzen.

Es enthält zwingend Sequenzen des Alanin-Transaminase-Gens oder die dem Alanin-Transaminase-Gen benachbart sind, vorzugsweise die Bereiche, die dem 3'- und 5'-Ende des Gens unmittelbar benachbart sind, und ist idealerweise das in 2 dargestellte Plasmid.

Die Aminosäure L-Valin, findet in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Mikroorganismus oder eine transformierte Zelle bzw. eine recombinante Zelle, bei dem die Produktion von Alanin gemindert oder vollständig ausgeschaltet ist oder bei dem die Alanin-Transaminaseaktivität vermindert oder vollkommen ausgeschaltet ist.

Die eingesetzten Stämme produzieren vorzugsweise bereits vor der Deletion des Alanin Transaminase-Gens L-Valin oder L-Isoleucin oder L-Lysin.

Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.

Der Begriff „Modifikation" beschreibt in diesem Zusammenhang die Reduktion der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Biosynthese-Enzyme für die Herstellung von Aminosäuren (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer reduzierten Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen (Protein) verringert exprimiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert, oder indem man das Gen sogar vollständig deletiert.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Valin oder auch andere L-Aminosäuren die aus Pyruvat entstehen, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebakterium. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Ausgangsstämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, L-Aminosäuren überproduzierende Mutanten bzw. Stämme die erfindungsgemäß modifiziert worden sind.

Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Reduktion oder Ausschaltung des für die Alanin Transaminase kodierenden Gens in verbesserter Weise die L-Aminosäuren Valin, Leucin und Isoleucin produzieren.

Die Nukleotidsequenz des Alanin Transaminase-Gens ist zwangsläufig durch die Erstellung der kompletten Genomsequenz von C. glutamicum bekannt (Kalinowski et al., 2003, J Biotechnol., 104:5-25; Ikeda M, and Nakagawa S. 2003 Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:99-109), ohne das aber die Zuordnung eines offenen Leserahmens zur Alanin Transaminase bekannt ist. Das wie nachfolgend im Beispiel beschriebene und identifizierte offene Leseraster das für Alanin Transaminase kodiert trägt die Nummer NCgl2747 und ist in der öffentlich zugänglichen Datenbank des „National Institutes of Health" hinterlegt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), ebenso unter Cgl2844 in der öffentlich zugänglichen „DNA Data bank of Japan" (http://gib.genes.nig.ac.jp).

Das unter diesen Nummern beschriebene Alanin Transaminase-Gen wird erfindungsgemäß bevorzugt als Ausgangspunkt der Erfindung eingesetzt. Weiterhin können Allele des Alanin Transaminase-Gens verwendet werden, die sich beispielsweise aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations), oder durch Deletion oder Insertion von Nukleotiden ergeben.

Zur Erzielung einer Abschwächung kann entweder die Expression des Alanin Transaminase-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins verringert werden. Ebenfalls kann die katalytische Eigenschaft des Enzymproteins hinsichtlich ihrer Substratspezifität verändert werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

Die Abschwächung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (J. Bacteriol. 1988. 170: 5949), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Res. 1998. 26: 3548, bei Jensen und Hammer (Biotechnol. Bioeng. 1998 58: 191), bei Patek et al. (Microbiology 1996. 142: 1297 und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 8. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Yano et al. 1998 Proc Natl Acad Sci U S A. 95:5511-5, Oue S. et al. J. Biol. Chem. 1999, 274:2344-9. und Onuffer et al. Protein Sci. 1995 4:1750-7 genannt. Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen und Proteine gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers „Molekulare Genetik", 8. Auflage, 2001, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland), oder Übersichtsartikeln (N. Pokala 2001, J. Struct. Biol. 134:269-81; A. Tramontano 2004, Angew. Chem. Int. Ed Engl. 43:3222-3; N. V. Dokholyan 2004, Proteins. 54:622-8; J. Pei 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100:11361-6; H. Lilie 2003, EMBO Rep. 4:346-51; R. Jaenicke Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42:140-2) entnommen werden.

Die abgeschwächte Expression der Gene oder der mutierten Gene erfolgt nach gebräuchlichen Methoden des Genaustauschs, indem das native chromosomale Gen durch das mutierte Gen ersetzt wird, wie es beispielsweise bei Morbach et al. beschrieben ist (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 45: 612-620). Die Deletion des Gens erfolgt wie bei Scharzer und Pühler (Biotechnology 1990, 9: 84-87), sowie bei Schäfer et al. (Appl. Environ. Microbio. 1994, 60: 756-759) beschrieben. Die Transformation des gewünschten Stammes mit dem Vektor zum Genaustausch oder zur Deletion erfolgt durch Konjugation oder Elektroporation des Ausgangsstammes. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Appl. Environ. Microbio. 1994, 60: 756-759) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters (1994)123:343-347) beschrieben.

Auf diese Weise kann das Alanin Transaminase-Gen deletiert oder dessen Allel in C. glutamicum ausgetauscht werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Valin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung oder Deletion der Alanin Transaminase-Aktivität eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

• die für die Acetohydroxysäuresynthase kodierenden ilvBN-Gene,
• das für die Isomeroreduktase kodierende ilvC-Gen,
• das für die Dehydratase kodierende ilvD-Gen,
• das für die Transaminase C kodierende ilvE Gen zu verstärken insbesondere zu überexprimieren, oder Allele dieser Gene, insbesondere
• die für feedback-resistente Acetohydroxysäuresynthase kodierenden ilvBN-Gene, zu verstärken oder zu überexprimieren,

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Valin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Reduktion der Alanin – Transaminase-Aktivität eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

• die für die Pantothenatsynthese kodierenden panBCD-Gene,
• die für die Liponsäuresynthese kodierenden lipAB-Gene,
• die für die Pyruvatdehydrogenase kodierenden aceE-, aceF, lpD-Gene,
• die für die Gene der ATP Synthase A Untereinheit, ATP Synthase B Untereinheit, ATP Synthase C Untereinheit, ATP Synthase alpha Untereinheit, ATP Synthase gamma Untereinheit, ATP Synthase Untereinheit, ATP Synthase epsilon Untereinheit, ATP Synthase delta Untereinheit zu inaktivieren oder zu reduzieren.

Schließlich kann es für die Produktion von L-Valin vorteilhaft sein, neben der Abschwächung der Alanin Transaminase unerwünschte Nebenreaktionen die beispielsweise zu Leucin führen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms„, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Valin-Produktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet wer den. Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzu gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH – Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Valin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Beispiel 1: Klonierung der Alanin Transaminase
Mit Hilfe der PCR Reaktion wurde ein DNA-Fragment amplifiziert, das das Alanin Transaminase-Gen enthält. Es wurden die folgenden Primer benutzt:
orf234-for:
5'- ATGGTA(GGTCTC)AAATGACTACAGACAAGCGCAAAACCT -3'
orf234rev:
5'- ATGGTA(GGTCTC)AGCGCTCTGCTTGTAAGTGGACAGGAAG -3'
Die angegebenen Primer wurden durch MWG Biotech AG (Anzinger Str. 7a, D-85560 Ebersberg) synthetisiert, und die PCR Reaktion entsprechend Standard Protokollen durchgeführt (Innis et al. PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. 1990. Academic Press). Mit den Primern wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,3 kb erhalten, das für die Alanin-Transaminase kodiert. Die Primer enthalten zusätzlich die Schnittstelle des Restriktionsenzyms BsaI, die in obigen Nukleotidsequenzen in Klammer angegeben sind.
Das amplifizierte DNA-Fragment von etwa 1,3 kb wurde im 0.8%igen Agarosegel identifiziert und aus dem Gel nach bestehenden Methoden isoliert (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden). Die Ligation des Fragments erfolgte mit dem SureCloning Kit (Amersham, UK) in den Expressionsvektor pASK-IBA-3C (IBA, Göttingen). Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli DH5 transformiert (Grant et al., 1990. Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87:4645-4649). Die Selektion auf Plasmid enthaltende Stämme erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf 25 mg pro Liter Chloramphenicol enthaltenden LB Platten.
Nach Plasmidisolation wurden die erhaltene Plasmide durch Restriktionsverdau und gelelektrophoretische Analyse charakterisiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pASK-IBA-3Corf234 bezeichnet. Es ist in 1 angegeben.
Beispiel 2: Isolierung der Alanin Transaminase
E. coli DH5 mit pASK-IBA-3Corf234 wurde bei 30°C in 100 ml LB mit 25 mg pro Liter Chloramphenicol bis zu einer optischen Dichte von 0,5 angezogen. Dann wurden 0,01 ml einer Anhydrotetracyclinlösung zugefügt, die 2 mg Anhydrotetracyclin pro Milliliter Dimethylformamid enthielt. Die Kultur wurde weiter für 3 Stunden bei 30°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 12 Minuten bei 4°C und 5000 Umdrehungen pro Minute durch Zentrifugation geerntet. Danach wurde das Zellpellet in Waschpuffer (100 mM Trihydroxymethylaminomethan, 1 mM Äthylenediaminetetraessigsäure, pH 8) resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Der Zellaufschluss erfolgte bei 0°C durch einen Ultraschalldesintegrator (Branson Sonifier W-250, Branson Sonic Power Company, Danbury, USA; Beschalldauer 10 min, Pulslänge 20 %, Beschallintensität 2). Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation (30 min, 13000 Upm, 4°C) abgetrennt und Rohextrakt als Überstand erhalten.
Zur Isolierung des Proteins wurden StrepTactin-Affinitätssäulen des Herstellers IBA (IBA, Göttingen, Deutschland) mit 1 ml Bettvolumen StrepTactin-Sepharose befüllt. Nach Äquilibrierung der Säulen mit Waschpuffer des Herstellers IBA wurde 1 ml des Rohextraktes auf die Sepharose gegeben. Nach Durchlauf des Extraktes wurde die Affinitätssäule fünfmal mit 1 ml Waschpuffer gewaschen. Die Elution des Alanin Transaminase-Proteins wurde mit Elutionspuffer, bestehend aus 100 mM Tris, 1 mM EDTA, 2,5 mM Desthiobiotin, pH 8, durchgeführt. Die Elutionsfraktionen wurden aliquotiert, bei -20°C eingefroren, und direkt im Enzymtest eingesetzt.
Beispiel 3: Aktivitätsbestimmung der Alanin Transaminase
Der Reaktionsansatz des Enzymtests enthielt in einem Gesamtvolumen von 1 ml: 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8, 0,005 ml Alanin Transaminase-Protein, und 0,1 ml 2,5 mM Pyridoxalphosphat, sowie 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M L-Glutamat, oder 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M Aspartat, oder 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M α-Amino-butyrat, oder 0,1 ml 40 mM Pyruvat und 0,1 ml 0,5 M L-Glutamat ohne Alanin Transaminase Protein. Der Enzymtest wurde bei 30°C in einem Thermocycler 5436 der Firma Eppendorf (Hamburg) durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Proteins gestartet. Durch Zugabe von 30 μl eines Stoppreagenzes (6,7% (v/v) Perchlorsäure (70 %ig), 40 % (v/v) Ethanol (95 %ig) in Wasser) zu jeweils 50 μl des Testansatzes wurde der Enzymtest gestoppt. Um die Proben für den Nachweis der gebildeten Aminosäuren über reversed phase HPLC vorzubereiten, wurden 20 μl eines Neutralisierunsgspuffers (20 mM Tris, 2,3 M Di-Kalium-carbonat, pH 8) zugegeben. Der durch die Neutralisierung der Perchlorsäure ausfallende Niederschlag wurde abzentrifugiert (13000 Upm, 10 min) und der Überstand in verschiedenen Verdünnungen für die Quantifizierung mittels HPLC eingesetzt. Diese erfolgte nach automatischer Derivatisierung mit o- Phthaldialdehyd wie beschrieben (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172:167-173). Wie Tabelle 1 zeigt, katalysiert das isolierte Protein die L-Glutamat, L-Aspartat und α-Aminobutyrat abhängige Aminierung von Pyruvat zu Alanin.
TABELLE 1
Die spezifische Aktivität (spez. Aktivität) ist in Micromol Produkt pro Minute und Milligramm Alanin Transaminase Protein angegeben.
Beispiel 4: Deletion des Alanin Transaminase-Gens
Mit Hilfe der PCR Reaktion wurden zwei DNA-Fragmente amplifiziert, die das Alanin Transaminase-Gen flankieren. Es wurden die folgenden Primer benutzt:
Del234 1:
5'- CG(GGATCC)CATGCAACCGATCTGGTTTTGTG -3'
Del234 2:
5'- CCCATCCACTAAACTTAAACAGCGCTTGTCTGTAGTCACCCG -3'
Del234 3:
5'- TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCGCCTGGGTAACTTCCTGTCC -3'
Del234 4:
5'- CG(GGATCC)GATTGATCATGTCGAGGAAAGCC -3'
Die angegebenen Primer wurden durch MWG Biotech AG (Anzinger Str. 7a, D-85560 Ebersberg) synthetisiert, und die PCR Reaktion entsprechend Standard Protokollen durchgeführt (Innis et al. PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. 1990. Academic Press). Mit den Primern wurden zwei DNA-Fragmente von etwa 400 bp amplifiziert, die das Gen für die Alanin Transaminase flankieren. Die Primer Del234 1 und Del234 4 enthalten zusätzlich die Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI, die in obigen Nukleotidsequenzen in Klammer angegeben ist. Die amplifizierten DNA-Fragmente von etwa 400 bp wurden im 0.8%igen Agarosegel identifiziert und aus dem Gel nach bestehenden Methoden isoliert (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden). Mit Hilfe einer zweiten PCR Reaktion, in die die beiden zuvor amplifizierten DNA-Fragmente als template DNA eingesetzt wurden (Link et al., 1997, J. Bacteriol 179:6228-6237), wurde ein etwa 800 bp großes Fragment amplifiziert. Dieses Fragment enthält beide, die Alanin Transaminase flankierenden DNA-Bereiche. Das amplifizierten DNA-Fragment von etwa 800 bp wurden im 0.8%igen Agarosegel identifiziert und aus dem Gel mit bestehenden Methoden isoliert (QIAquik Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden).
Die Ligation des Fragments erfolgte mit dem SureCloning Kit (Amersham, UK) in den Deletionsvektor pK19mobsacB (Schäfer et al., 1994, Gene 145:69-73). Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli DH5 transformiert (Grant et al., 1990. Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87:4645-4649). Die Selektion Plasmid enthaltender Stämme erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf 50 mg pro Liter Kanamycin enthaltenden LB Platten.
Nach Plasmidisolation wurden erhaltene Plasmide durch Restriktionsverdau und gelelektrophoretische Analyse charakterisiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pk19mobsacB-orf234 bezeichnet. Es ist in 2 angegeben.
Das Plasmid pk19mobsacB-orf234 wurde zur Transformation des Stammes13032ΔpanBC auf Kanamycinresistenz benutzt. Der Stamm ist in EP1155139B1 beschrieben, und die Transformationstechnik bei Kirchner et al. J. Biotechnol. 2003, 104:287-99.
Die Deletion des Gens für die Alanin Transaminase wurde nach dem Protokoll zur Deletion von Genen in Corynebacterium glutamicum nach Schäfer et al., 1994, Gene 145:69-73, durch zwei aufeinanderfolgende homologe Rekombinationen durchgeführt.
Mit Hilfe der PCR Reaktion wurde die Deletion des Gens für die Alanin Transaminase bestätigt. Es wurden die folgenden Primer benutzt:
Ko delorf234 for:
5'- CTGGGTATTCGCCACGGACGT -3'
Ko delorf234 rev:
5'- TCGGCGGTGTCAAAAGCATTGC -3'
Die angegebenen Primer wurden durch MWG Biotech synthetisiert, und die PCR Reaktion entsprechend Standard Protokollen durchgeführt (Innis et al. PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. 1990. Academic Press). Die Amplifikation eines 1 kB großen DNA-Fragmentes bestätigte die Deletion des Gens für die Alanin Transaminase. Der erhaltene Stamm wurde als Stamm 13032ΔpanBCΔalaT bezeichnet.
Beispiel 5: Reduktion der Alanin Bildung und Steigerung der L-Valin Bildung durch Deletion der Alanin Transaminase
Der Stamm 13032ΔpanBCΔalaT, sowie der Kontroll-Stamm 13032ΔpanBC wurde in dem Medium CGIII (Menkel et al. 1989, Appl. Environ. Microbiol. 55:684-8) bei 30°C angezogen. Damit wurde das Medium CGXII mit einer optischen Dichte von 1 beimpft. Das Medium CGXII enthält pro Liter: 20 g (NH₄)₂SO₄, 5 g Harnstoff, 1 g KH₂PO₄, 1 g K₂HPO₄, 0,25 g Mg₂O₄·7 H₂O, 42 g 3 – Morpholinopropansulfonsäure, 10 mg CaCl₂, 10 mg FeSO₄·7 H₂O, 10 mg MnSO₄·H₂O, 1 mg ZnSO₄·7 H₂O, 0,2 mg CuSO₄, 0,02 mg NiCl₂·6 H₂O, 0,2 mg Biotin, 40 g Glukose, 0,5 μM Pantothenat und 0,03 mg Protokatechusäure. Die Kultur wurde bei 30°C und 120 Umdrehungen pro Minute inkubiert, und nach 56 Stunden wurde die Alanin- und L-Valinakkumulation im Medium mittels HPLC bestimmt. Diese erfolgte mit o-Phthaldialdehyd wie beschrieben (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172:167-173). Die bestimmten Alanin- und L-Valinkonzentrationen sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2

Claims

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Aminosäuren dadurch gekennzeichnet, dass die Alanin-Transaminase-Aktivität vermindert oder ausgeschaltet wird oder dass die Alaninproduktion vermindert oder ausgeschaltet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Alanin-Transaminase-Gen deletiert oder einer Disruption unterzogen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die für die Alanin-Transaminase kodierende Sequenz mutiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Alanin-Transaminase vermindert oder ausgeschaltet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der dem Alanin-Transaminase-Gen vorgeschaltete Promotor abgeschwächt oder ausgeschaltet oder durch einen schwächeren Promotor ausgetauscht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das dem Alanin-Transaminase-Gen vorgeschaltete Start-Kodon in seiner Aktivität vermindert oder ausgeschaltet oder durch ein schwächeres Startkodon ausgetauscht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das katalytische Zentrum der Alanin-Transaminase blockiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Komponente aus der Gruppe der Gene die für die Acetohydroxysäure Synthase kodierenden ilvBN-Gene, das für die Isomeroreduktase kodierende ilvC-Gen, das für die Dehydratase kodierende ilvD-Gen, das für die Transaminase C kodierende ilvE-Gen die für feedback-resistente Acetohydroxysäure Synthase kodierenden ilvBN-Gene, verstärkt oder überexprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Komponente aus der Gruppe bestehend aus – die für die Pantothenatsynthese kodierenden panBCD-Gene, – die für die Liponsäuresynthese kodierenden lipAB-Gene, – die für die Pyruvatdehydrogenase kodierenden aceE-, aceF, lpD-Gene, – die für die Gene der ATP Synthase A Untereinheit, ATP Synthase B Untereinheit, ATP Synthase C Untereinheit, ATP Synthase alpha Untereinheit, ATP Synthase gamma Untereinheit, ATP Synthase Untereinheit, ATP Synthase epsilon Untereinheit, ATP Synthase delta Untereinheit inaktiviert oder in ihrer Aktivität vermindert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass coryneforme Bakterien eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterien der Gattung Corynebakterium glutamicum eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus aus der Gruppe Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020 eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass L-Valin, L-Isoleucin oder L-Lysin hergestellt wird.
Nucleotidsequenz gemäß Sequenz Nr.1, Nukleotide 101 bis 1414.
Genstruktur umfassend ein Alanin-Transaminasegen gemäß Sequenz Nr.1, Nukleotide 101 bis 1414.
Genstruktur nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie mutiert ist.
Genstruktur nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Insertion und/oder Deletion und/oder Austausch von Nucleinsäuren mutiert ist.
Vektor enthaltend eine Genstruktur nach einem der ansprüche 15 bis 17 oder eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 14.
Vektor nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Plasmid, ein Phage oder ein Virus ist.
Chromosom enthaltend eine Genstruktur nach einem der Ansprüche 15 bis 17 oder die Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 14.
Chromosom mach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Alanin-Transaminase-Gen teilweise oder vollständig deletiert ist.
Recombinante Zelle umfassend eine Genstruktur nach einem der Ansprüche 15 bis 17 und/oder einen Vektor nach Anspruch 18 oder 19 und/oder ein Chromosom nach Anspruch 20 oder 21 oder die Nucleotidsequenz nach Anspruch 14.
Recombinante Zelle nach Anspruch 22, dadurch gekenzeichnet, dass sie bereits vor den Veränderungen nach einem der Ansprüche 16 und 17 L-Lysin, L-Valin oder L-Isoleucin produziert hat.
Recombinante Zelle nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Corynebakterium ist.
Recombinante Zelle nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Corynebakterium glutamicum ist.
Recombinante Zelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Organismus aus der Gruppe Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020 ist.
Verwendung der Genstruktur nach Anspruch 15 oder der Nucleotidsequenz nach Anspruch 14 zur Herstellung von Alanin.
Plasmid enthaltend interne Sequenzen des Alanin-Transaminase-Gens oder die dem 3'- und 5'-Ende des Alanin-Transaminasegens benachbarte Sequenzen.
Alanintransaminase, gegennzeichnet, durch die Sequenz Nr.2