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WO2005111121A2 - Verfahren zur herstellung von formkörpern auf basis von vernetzter gelatine - Google Patents

Verfahren zur herstellung von formkörpern auf basis von vernetzter gelatine Download PDF

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Publication number
WO2005111121A2
WO2005111121A2 PCT/EP2005/005174 EP2005005174W WO2005111121A2 WO 2005111121 A2 WO2005111121 A2 WO 2005111121A2 EP 2005005174 W EP2005005174 W EP 2005005174W WO 2005111121 A2 WO2005111121 A2 WO 2005111121A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
shaped body
gelatin
sheet material
crosslinking
cell structure
Prior art date
Application number
PCT/EP2005/005174
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English (en)
French (fr)
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WO2005111121A3 (de
Inventor
Michael Ahlers
Original Assignee
Gelita Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gelita Ag filed Critical Gelita Ag
Priority to EA200602031A priority Critical patent/EA200602031A1/ru
Priority to EP05745724A priority patent/EP1747247A2/de
Priority to AU2005243474A priority patent/AU2005243474A1/en
Priority to CA002558351A priority patent/CA2558351A1/en
Priority to BRPI0510782-2A priority patent/BRPI0510782A/pt
Priority to JP2007512103A priority patent/JP2007537314A/ja
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Publication of WO2005111121A3 publication Critical patent/WO2005111121A3/de
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    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of moldings based on crosslinked gelatin.
  • the invention further relates to moldings based on crosslinked gelatin, in particular sheet materials and hollow bodies.
  • the invention relates to implants which are produced using the aforementioned shaped bodies.
  • tissue implants can be used to treat damaged tissues and organs, which are constructs made from a carrier material and living cells (tissue engineering). Such implants are known in the prior art and are used, inter alia, for the regeneration of skin or cartilage.
  • the carrier material should be such that it supports the growth and proliferation of the cells. In addition, a certain strength is desirable in order to protect the cells from mechanical stress during growth in the body. At the same time, the material should be flexible enough to adapt to the shape of the body area to be treated. Finally, the carrier material should be able to be resorbed as completely as possible after the cells have grown sufficiently and have synthesized extracellular matrix. The materials used so far cannot meet these diverse requirements to the desired extent.
  • the prior art describes, inter alia, carriers based on chitosan, alginate, agarose and hyaluronic acid. The three last-mentioned materials in some cases have considerable defects in residue-free absorption.
  • collagen Another commonly used carrier is collagen. However, this is not available in a desirable reproducible composition and purity.
  • the collagen obtained from animal sources can contain immunogenic telopeptides, which can trigger the body's defense reactions.
  • the aforementioned materials have the disadvantage that the respective absorption time after which the material has been broken down cannot be set individually.
  • the optimal length of time may vary depending on the type of tissue being treated and the size of the defect. For example, for the regeneration of cartilage defects due to the slow growth of the chondrocytes, degradation times of 4 weeks and more are desirable.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method with which materials can be obtained which meet the requirements described above and in which the respective degradation time of the material can additionally be set in a targeted manner.
  • this object is achieved in that it comprises the following steps: a) preparing an aqueous gelatin solution; b) partial crosslinking of the dissolved gelatin; c) producing a shaped body starting from the gelatin solution with the partially crosslinked gelatin; and d) crosslinking the gelatin contained in the shaped body.
  • gelatin is a product with a defined composition that can also be produced in a very high purity level.
  • Gelatin materials are also optically clear, whereas collagen products usually appear milky cloudy. The latter can be disadvantageous in light microscopic analysis of cell growth.
  • crosslinked gelatin materials do not have the stability required for long-term applications.
  • the method according to the invention described above which is characterized by a two-stage crosslinking of the gelatin materials, not only makes it possible to produce correspondingly durable and dimensionally stable materials without having to give up the advantages of gelatin described above.
  • the method also allows the desired absorption time of the material to be set individually.
  • the moldings produced by the process according to the invention are self-supporting, i.e. they are sufficiently stable to be handled and used free of a carrier element. This is of great advantage in medical applications, since materials that are as uniform as possible are to be used here.
  • the gelatin concentration in solution (a) can be 5 to 45% by weight, preferably 10 to 30% by weight, depending on the embodiment of the invention.
  • the shaped body (c) formed after the first crosslinking (b) is preferably at least partially dried before the second crosslinking (d), preferably up to a residual moisture content of less than 20% by weight, in particular 15% by weight or less.
  • the second crosslinking can be carried out by the action of an aqueous solution of a crosslinking agent, but the action of a gaseous crosslinking agent is preferred.
  • crosslinking agent all compounds which bring about a chemical crosslinking of the gelatin can be used as the crosslinking agent.
  • Aldehydes, dialdehydes, isocyanates, diisocyanates, carbodiimides and alkyldihalides are preferred, the same or different compounds being able to be used for the two crosslinking steps.
  • formaldehyde is particularly preferred, in particular for the second crosslinking step in the gas phase, since the shaped body can be sterilized by formaldehyde at the same time.
  • the action of the formaldehyde on the molded body can be supported by a water vapor atmosphere.
  • the stability of the properties of the shaped articles produced by the process according to the invention can be improved even further if the shaped articles are subjected to a thermal aftertreatment at reduced pressure after the second crosslinking step.
  • This aftertreatment is preferably carried out at temperatures from 80 to 160 ° C, since below 80 ° C the observed effects are relatively weak and above 160 ° C an undesirable discoloration of the gelatin can occur. Values in the range from 90 to 120 ° C. are most preferred.
  • Reduced pressure is understood to mean pressures below atmospheric pressure, pressure values which are as low as possible, ideally a vacuum, being preferred.
  • the thermal aftertreatment has two advantages. On the one hand, a further, dehydrothermal crosslinking of the gelatin takes place under the above-mentioned temperature and pressure conditions, in that different amino acid side chains react with one another with elimination of water. This is favored by the fact that the water split off by. the low pressure is removed from the equilibrium.
  • the thermal aftertreatment can thus achieve a higher degree of crosslinking with the same amount of crosslinking agents or the amount of crosslinking agents can be reduced with a comparable degree of crosslinking.
  • thermal aftertreatment Another advantage of the thermal aftertreatment is that the residual content of unused crosslinking agent remaining in the molded body can be significantly reduced.
  • excess, unreacted crosslinking agent is preferably removed from the shaped body in the process according to the invention. This can be done, for example, by degassing the moldings for several days under normal pressure and / or by washing with a liquid medium, the latter also requiring a period of from one day to one week, depending on the concentration of the crosslinking agent, size of the moldings, etc.
  • this additional process step can already significantly reduce the residual content of crosslinking agent can be reached within about 4 to 10 hours.
  • Shaped bodies according to the invention which are preferably essentially free of excess crosslinking agent, can thus be produced in a relatively short amount of time by the thermal aftertreatment.
  • the shaped bodies according to the invention preferably have a crosslinking agent content of about 0.2% by weight or less, which is e.g. in the case of the crosslinking agent formaldehyde, represents a limit for the biocompatibility of carrier materials. A pure washing with liquid medium cannot achieve this value in the above-mentioned period of 4 to 10 hours.
  • thermal treatment at reduced pressure actually only leads to improved stability of the shaped bodies according to the invention if, as described above, this is carried out after the two crosslinking steps.
  • Pretreatment of the gelatin used under the appropriate temperature and pressure conditions does not lead to a noticeable increase in the service life of the shaped bodies, although the gelatin is also chemically modified in this case, which is reflected in an increase in the bloom strength, the viscosity and the average molecular weight .
  • a thermal pretreatment of the gelatin used which is preferably carried out under comparable conditions as the thermal aftertreatment of the moldings, has other advantages, which may be important depending on the application.
  • the thermal pretreatment leads to a higher tear resistance of the moldings according to the invention in the dry state, in particular in the case of the films described below.
  • the higher viscosity of the thermally pretreated gelatin means that the concentration of the gelatin solution to be used can be reduced, as a result of which moldings with a lower density and greater flexibility can be obtained. This primarily concerns molded articles with a cell structure, which are described in detail below.
  • a gelatin with a viscosity of 8 mPas or more is preferably used for the process according to the invention, this value relating to the viscosity of a 6.7% by weight aqueous gelatin solution at 60 ° C.
  • the desired strength, in particular tear strength, and stability or service life or degradation behavior of the material produced can be set very easily in the process according to the invention, preferably by the targeted selection of the production conditions.
  • Both strength and service life can generally be increased by a higher concentration of the crosslinking agent or by the thermal aftertreatment described above.
  • shaped bodies can be obtained which, on the one hand, remain stable under physiological conditions, for example for longer than one week, longer than two weeks or longer than four weeks, and on the other hand meet the requirements regarding cell compatibility and resorbability.
  • stability is to be understood here to mean that the material essentially maintains its original shape both when stored in the dry state and during the specified period of time under standard physiological conditions and is only then resorbed to a considerable extent.
  • Standard physiological conditions to which the material is exposed when it is used to manufacture implants are primarily characterized by temperature, pH and ionic strength.
  • Corresponding conditions can be defined in vitro by incubating the material in PBS buffer (pH 7.2, 0.09% by weight NaCl) at 37 ° C. in order to test and compare different materials with regard to their time-dependent stability behavior ,
  • the resistance of the shaped bodies to proteases which are mainly responsible for the degradation of the material, can also be increased in vitro by adding a protease, e.g. Pepsin, or when colonizing with protease-producing cells, e.g. Fibroblasts can be estimated very well. Quantitative information on this can be found in the exemplary embodiments listed below.
  • the molded articles produced can nevertheless have sufficient flexibility which meets the requirements for use as a tissue implant, such as, for example, suppleness and sewability.
  • the desired flexibility can preferably be set by adding plasticizers in the course of the manufacturing process. An increase in the plasticizer concentration usually leads to more flexible moldings. Examples of suitable plasticizers are glycerol, oligoglycerols, oligoglycols and sorbitol.
  • Various processes can be used in the production of the shaped bodies from the crosslinked gelatin solution, such as, for example, casting or extrusion, optionally combined with foaming, if cellular materials are desired.
  • the present invention further relates to shaped bodies made of crosslinked gelatin, in which the degree of crosslinking is selected so that the shaped bodies under physiological conditions for a predetermined time, e.g. remain stable for at least one, two or four weeks.
  • a preferred method for producing such shaped articles is that described above.
  • the shaped bodies are designed as surface materials.
  • Sheet materials are widely applicable as supports for tissue implants, e.g. in the regeneration of skin.
  • the sheet material can be cellular, i.e. have a cell structure, or be designed as a (non-cellular) film.
  • Cell structures such as sponges or foams, can be obtained by foaming the gelatin solution with a gas, in particular air.
  • Preferred cell structures are open-pored in order to allow cell ingrowth and the formation of a three-dimensional tissue structure when used for tissue implants.
  • the density of the shaped bodies with cell structure and the pore size can be set in a wide range, preferably by the intensity of the foaming.
  • the density can be reduced by using a thermally pretreated gelatin or a gelatin with high viscosity, as described above.
  • the properties of a molded body according to the invention with a cell structure can also be influenced in that the cell structure is modified by mechanical action on the molded body.
  • Mechanical action includes e.g. pressing or rolling the shaped body to such an extent that part of the cell walls or webs between the pores of the cell structure are broken.
  • the density of the shaped body is preferably increased by a factor of 2 to 10 as a result of the mechanical action.
  • the flexibility of the molded body in the dry state can be increased without the stability in time being noticeably influenced. This is advantageous since, in particular, flexible surface materials can be better adapted to the conditions of the body when used as a tissue implant.
  • the pores of the cell structure preferably have an average diameter of less than 300 ⁇ m. With larger average pore diameters, an insufficient degree of retention is often observed when cells are introduced into the cell structure. In most cases, the preferred lower limit of the pore size depends on the size of the cells used, which are to grow into the cell structure in all three dimensions.
  • a gelatin solution with a concentration of 5 to 25% by weight, preferably 10 to 20% by weight, can be used for the production of moldings with a cell structure. A higher gelatin concentration generally leads to a higher breaking strength of the shaped bodies. Surprisingly, this is largely independent of the degree of crosslinking, via which the life of the material can be adjusted.
  • Preferred molded bodies with a cell structure are reversibly compressible. This is especially true in a hydrated state, whereby the extent of compressibility includes depends on the gelatin concentration used and the pore size.
  • foil means thin sheet materials without a cell structure. They can be produced by casting from a preferably substantially degassed gelatin solution.
  • a preferred embodiment relates to flexible films, the flexibility of which e.g. can be adjusted by adding plasticizers.
  • the compounds already described in connection with the process according to the invention can be used as plasticizers.
  • the stability of the films under standard physiological conditions is essentially unaffected by the use of the plasticizers.
  • Films with a thickness of 20 to 500 ⁇ m are preferred, most preferably 50 to 100 ⁇ m.
  • Gelatin solutions with a concentration of 5 to 45% by weight, more preferably approximately 10 to 30% by weight, are preferably used for the production of the films.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a multilayer material which comprises a film and a surface material with a cell structure.
  • the two layers can be directly connected to each other, which e.g. can be brought about by the fact that the sheet material with cell structure is brought into contact with the film before it dries, if necessary pressed into it.
  • the layers can be connected to one another with an adhesive, wherein a gelatin-based adhesive can preferably be used as the adhesive.
  • the film and the surface material with cell structure are preferably connected to one another over the entire surface, in particular over the entire surface.
  • the shaped bodies can also be designed as hollow bodies, in particular as a hollow profile.
  • hollow profiles can be obtained, for example, by extrusion of the gelatin solution.
  • hollow profiles with a cell structure described above can be produced by simultaneous extrusion and foaming.
  • hollow profiles can also be formed from previously produced sheet materials, in particular foils, for example by rolling them up.
  • a preferred embodiment relates to cylindrical hollow profiles, for example small tubes. These can also be produced, inter alia, by rolling up the surface materials described above.
  • the moldings according to the invention can also have any other shape or structure.
  • shaped bodies which are spatially adapted to the tissue defect to be treated can be used for use as a tissue implant.
  • the invention further relates to the use of the moldings described for use in human and veterinary medicine and for the production of implants.
  • One use according to the invention relates to the production of wound dressings from the materials described above. These can be used in the treatment of wounds or internal or external bleeding e.g. in operations.
  • the material is resorbed after an individually adjustable time, preferably through the choice of the manufacturing condition.
  • the moldings according to the invention are outstandingly suitable for colonization with mammalian cells, ie with human or animal cells.
  • a shaped body can be treated with a suitable nutrient medium and the cells, for example fibroblasts or chondrocytes, can then be sown on it. Due to the stability of the material, the cells can grow and proliferate for several weeks in vitro.
  • the invention further relates to implants, in particular tissue implants, which comprise a shaped body according to the invention and cells cultured thereon, as described above.
  • the implants according to the invention are used for the treatment of tissue defects, for example skin or cartilage defects, the seeded cells e.g. can be removed from the patient beforehand.
  • the molded body provides the tissue that forms with protection against mechanical stress, and the formation of the cell's extracellular matrix is made possible.
  • the resorption time adjustable according to the invention proves to be a particular advantage. With the help of long-lasting materials according to the invention, which have a resorption time of more than four weeks, even large-area defects or defects in tissue types with slow cell growth can be treated.
  • Shaped bodies with a cell structure are particularly preferred for use in implants, since a three-dimensional tissue bond can develop here as the cells grow into the shaped body.
  • a reversible compression of the shaped body allows a cell suspension to be sucked up and the cells to be distributed homogeneously in the shaped body.
  • a sheet material with a cell structure can be used, e.g. for the treatment of large-scale injuries or burns to the skin.
  • any other form can also be advantageous, e.g. individual, three-dimensional moldings for the treatment of cartilage defects.
  • the implant comprises a multilayer surface material described above.
  • the surface material with cell structure serves as a carrier for the cells, while the film offers additional mechanical protection.
  • Such a construct can be advantageous, for example, for the regeneration of very slow-growing cartilage tissue.
  • the invention further relates to nerve guide rails.
  • the implantation of nerve guide rails serves to regenerate severed nerve strands.
  • the splint should be dimensioned so that a single nerve cell can grow in it. This is guaranteed with a preferred inner diameter of 1 mm.
  • the nerve guide should also be designed so that it can be penetrated laterally by blood vessels to enable the nerve cell to be supplied with nutrients.
  • Nerve guide rails that meet this requirement can be produced using the method according to the invention.
  • the nerve guide is produced by rolling up a sheet material according to the invention described above, in particular a film.
  • Fig. 1 tensile-strain diagram of films according to the invention
  • 2 tensile-strain diagram of further films according to the invention
  • 4 microscope images of shaped bodies according to the invention with cell structure
  • Example 1 Production and properties of films based on crosslinked gelatin
  • Pork rind gelatin (Bloom starch 300) was dissolved in four different batches in a mixture of water and glycerin in accordance with the amounts given in Table 1 at 60 ° C. After the solutions had been degassed by ultrasound, the amount of an aqueous formaldehyde solution (1.0% by weight, room temperature) indicated in Table 1 was added, the mixture was homogenized and at a thickness of 1 mm at about 60 ° C. a polyethylene underlay. Table 1
  • the films were removed from the PE base and dried for approximately 12 hours under the same conditions.
  • the dried films had a thickness of less than 100 ⁇ m and were exposed to the equilibrium vapor pressure of a 17% aqueous formaldehyde solution at room temperature for two hours in the desiccator for the second crosslinking step.
  • the second crosslinking step was the only one for the film produced according to approach 1-1.
  • FIG. 1 The mechanical properties of the various films (in the dry state) are shown in FIG. 1: While the film 1-2 has a higher tensile strength with less elongation at break due to the two-stage crosslinking compared to the film 1-1, the film 1-3 is through the increase in glycerin concentration is much more flexible. Due to the higher crosslinking agent concentration in film 1-4 compared to film 1-3 a somewhat higher strength can be achieved with less elongation at break.
  • Films were also produced in accordance with batches 1-1 and 1-2, but were subsequently not subjected to crosslinking in the gas phase (films 1-1 ', uncrosslinked and 1-2', simply crosslinked).
  • the elongation at break curves of these films end at approximately 140% / 10 N / nm 2 (1-1 ') or 115% / 15 N / nm 2 (1-2') and are not shown in FIG. 1 for reasons of clarity.
  • the example therefore shows that the flexibility of the films produced can be adjusted over a wide range in the process according to the invention, in that both the degree of crosslinking and the proportion of the plasticizer are varied accordingly.
  • the degradation behavior of the films was determined by placing 2 x 3 cm pieces of film in 500 ml PBS buffer (pH 7.2, 0.09% by weight NaCl) and photometric concentration determination of the gelatin dissolved in the buffer at a wavelength of 214 nm measured. While the non-cross-linked or single-cross-linked foils were completely dissolved after 15 minutes, no change was found on the double-cross-linked foils after one hour.
  • Example 2 Production and properties of films based on crosslinked gelatin
  • Curves 2-1 to 2-8 refer to the corresponding dry films, curves 2-2A to 2-8A to the hydrated films which were placed in PBS buffer for four hours (the uncrosslinked film 2-1 dissolves under these conditions to such an extent that no investigation of the tensile / strain behavior is possible).
  • the vertical markings mark the end points of the respective curves.
  • Example 3 Production and properties of moldings with a cell structure based on crosslinked gelatin
  • the foamed gelatin solutions which had a temperature of 26.5 ° C., were poured into molds with a dimension of 40 ⁇ 20 ⁇ 6 cm and dried for about four days at 26 ° C. and a relative atmospheric humidity of 10%.
  • the dried moldings with a sponge-like cell structure (hereinafter referred to as sponges) were cut into layers 2 mm thick and exposed to the equilibrium vapor pressure of a 17% aqueous formaldehyde solution at room temperature for 17 hours in a desiccator for the second crosslinking step.
  • the desiccator was evacuated two to three times and ventilated again.
  • the pore structure of the sponges was determined by light microscopy and could be confirmed by scanning electron microscopy. Table 3
  • FIG. 3 shows the dissolution behavior of the sponges 3-1 to 3-5 and the simply cross-linked reference sample (the sequence of the bars shown is in each case: reference, 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5 ).
  • the properties of the cell structure materials can also be significantly modified by changing the gelatin concentration in the starting solution.
  • FIG. 4 shows light micrographs of the cell structure of two moldings in thin sections of 150 ⁇ m, which are produced from a 12% by weight (Fig. A) or 18% by weight (Fig. B) gelatin solution, under otherwise identical conditions were.
  • the higher gelatin concentration leads to wider (thicker) cell walls or webs between the individual pores, which is reflected in an increased breaking strength of the corresponding sponges.
  • the three curves A, B and C each represent sponges with three different degrees of crosslinking.
  • the breaking strength steadily increases with an increase in the gelatin concentration of the starting solution from 10 to 18% by weight, covering a wide range from approximately 500 to almost 2000 Newtons. At the same time, the deformation changes only slightly until it breaks. Surprisingly, the correlation between breaking strength and gelatin concentration is largely independent of the degree of crosslinking.
  • FIG. 6 shows the resistance of various cell structure materials (sponges) to pepsin as a function of the amount of formaldehyde used in the first crosslinking step (% by weight based on gelatin).
  • the degradation was carried out at 37 ° C. in a 1.0% by weight pepsin solution in PBS buffer, the pH of which was adjusted to 1 using HCl. As the formaldehyde concentration increases from 500 to 1500 to 3000 ppm, the sponge degradation time increases from less than 5 minutes over 30 minutes to 75 minutes. The dry density of the materials is essentially independent of the degree of crosslinking.
  • the very drastic degradation conditions chosen here are not comparable to the much milder physiological conditions, so that considerably longer degradation times apply under the latter conditions.
  • Example 4 Production and properties of moldings with a cell structure based on crosslinked gelatin with thermal aftertreatment
  • a 12% by weight solution of pork rind gelatin (Bloom starch 300) was prepared as in Example 3, degassed using ultrasound, and the appropriate amount of an aqueous formaldehyde solution (1.0% by weight, room temperature) was added so that 1500 ppm of formaldehyde (based on the gelatin) were present.
  • the homogenized mixture was heated to 45 ° C. and foamed with air by machine for about 30 minutes.
  • the foamed gelatin solution was poured into molds and dried as described in Example 3, a shaped body having a sponge-like cell structure (sponge) with a wet density of 121 mg / cm 3 , a dry matter. density of 18 mg / cm 3 and an average pore size of 250 ⁇ m was obtained.
  • the molded body was cut-resistant after the first crosslinking step.
  • FIG. 7 shows the dissolution behavior of samples 4- 1 to 4-4 (the sequence of the bars shown is: 4-1, 4-2, 4-3, 4-4).
  • the thermal aftertreatment under vacuum also has the advantage that the residual amount of crosslinking agent remaining in the shaped body can be effectively reduced, as a result of which lengthy washing before use can be avoided or at least shortened. This applies in particular to mechanically relatively solid sponges that were produced from high gelatin concentrations.
  • the foamed gelatin solution was poured and dried as described above, as were the cutting into slices of 2 mm thickness and the second crosslinking step under the action of formaldehyde vapor.
  • the crosslinking time was 17 hours.
  • the samples were subjected to a thermal aftertreatment at 105 ° C. and a vacuum of approx. 14 mbar for a period of 4 hours (sample 4-5) or 10 hours (sample 4-6 ) subjected.
  • the residual free formaldehyde content was then determined again. The results are shown in Table 5.
  • Example 5 Production of molded articles from thermally pretreated gelatin
  • the gelatin was kept at 105 ° C. under a vacuum of approx. 14 mbar for a period of 6 hours.
  • the Bloom strength increased from 300 to 310, the viscosity rose from 5.92 mPas to 9.04 mPas (measured in a 6.7% strength by weight solution at 60 ° C.) and the average molecular weight from 172 kDa to 189 kDa.
  • Example 6 Four different films were produced from the untreated or the thermal pretreated gelatin analogously to the process described in Example 1. The quantitative data for the various batches are shown in Table 6. In deviation from Example 1, a 2.0% by weight aqueous formaldehyde solution was used for the first crosslinking step and the second crosslinking step was carried out 2 hours above the equilibrium vapor pressure of a 10% aqueous formaldehyde solution , Table 6
  • the mechanical properties of the films 5-1 to 5-4 in the dry state are shown in FIG. It can be seen that the tear strength of the films 5-2 and 5-4 produced from the thermally pretreated gelatin compared to the corresponding films produced from the untreated gelatin. Slides 5-1 or 5-3 is significantly increased. This improves the handling of the films in the context of a medical application. Alternatively, it is possible to produce thinner films with comparable tear strength from the thermally pretreated gelatin.
  • the films produced from pretreated gelatin have the same advantageous properties as the films made from untreated gelatin.
  • the thermally pretreated gelatin is also suitable for the production of moldings with a cell structure analogous to Example 3. In this case, too, comparable long-term stabilities are observed as when using the untreated gelatin. Due to the higher viscosity of the pretreated gelatin (in this case 9.04 mPas compared to 5.92 mPas) it is possible to significantly reduce the gelatin concentration of the solutions used for the production of the sponges. Since the viscosity of a gelatin solution increases linearly to quadratically with the concentration, a 5-8% by weight solution of the thermally pretreated gelatin can be used instead of a 12% by weight solution of untreated gelatin.
  • the molded articles with cell structure produced in this way are characterized by thinner webs between the pores and a lower density, which in turn increases the flexibility of the sponges.
  • a lower density also means that when used as a carrier material for tissue implants, a lower amount of gelatin has to be used overall.
  • a film was produced from 33 g of pork rind gelatin (Bloom starch 300), 53.25 g of water, 15.5 g of glycerol and 8.25 g of a 2.0% by weight formaldehyde solution, using the process described in Example 1, wherein the doctored film was kept at 40 ° C. for 2 hours before drying.
  • a 2 to 3 mm thick sponge was prepared according to Example 3, approach 3-2.
  • the two surface materials were glued together using a solution of bone gelatin (Bloom starch 160).
  • the multilayer sheet was then crosslinked, as described in Example 2, by exposure to formaldehyde vapor.
  • the film and the sponge can also be subjected to the second crosslinking step separately before being joined together.
  • connection between the two surface materials can also be produced in such a way that the dried sponge is partially pressed into the doctored, not yet dried film.
  • a preferably full-surface composite of the surface materials is obtained.
  • Example 7 Colonization of sponges with chondrocytes
  • Excess formaldehyde must be removed from the sponges before colonization, e.g. by washing the sponges with culture medium or ethanol.
  • the distribution of the cells within the sponges found after one hour is shown in FIG. 9.
  • the percentile indicates the percentage of all cells that are distributed in the material up to the respective settlement depth.
  • the cell distribution is largely uniform over the entire thickness of the sponges due to the open-pore structure and is not impaired by the higher degree of crosslinking of the sponges 3-1 to 3-3 compared to the reference sample R.
  • Example 8 Cultivation of fibroblasts on foils
  • the foils produced according to the approaches 2-3, 2-6 were used.
  • DMEM / 10% FCS / glutamine / pen / strep was used again as the culture medium.
  • the films must also be washed with cells to remove residual formaldehyde before colonization.
  • Human foreskin fibroblasts (0.5 million cells / cm 2 ) were sown on the foils and cultivated in the medium at 37 ° C. for 6 weeks.
  • the vitality of the cells was examined microscopically twice a week. It was shown that the fibroblasts were viable on all foils for at least four weeks.
  • FIG. 10 shows an optical micrograph of the fibroblasts on the film 2-5 after a cultivation time of 14 days. Since the material has not yet been resolved, the edge of the film is clearly visible.

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Abstract

Um ein Verfahren zur Herstellung von Formkörpern auf Basis von vernetzter Gelatine zur Verfügung zu stellen, welche als Trägermaterial für Gewebeim­plantate eingesetzt werden können und eine individuell einstellbare Abbauzeit aufweisen, wird vorgeschlagen, dass dieses Verfahren folgende Schritte um­fasst: a) Herstellen einer wässrigen Gelatinelösung; b) partielles Vernetzen der gelösten Gelatine; c) Herstellen eines Formkörpers ausgehend von der Gelatinelösung mit der partiell vernetzten Gelatine; und d) Vernetzen der im Formkörper enthaltenen Gelatine.

Description

Verfahren zur Herstellung von Formkörpern auf Basis von vernetzter Gelatine
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Formkörpern auf Basis von vernetzter Gelatine. Ferner betrifft die Erfindung Formkörper auf Basis von vernetzter Gelatine, insbesondere Flächenmaterialien und Hohlkörper. Weiterhin betrifft die Erfindung Implantate, die unter Verwendung vorgenannten Formkörpern hergestellt sind.
Zur Behandlung von geschädigten Geweben und Organen können so genannte Gewebeimplantate zum Einsatz kommen, bei denen es sich um Konstrukte aus einem Trägermaterial und lebenden Zellen handelt (Tissue Engineering). Solche Implantate sind im Stand der Technik bekannt und werden unter anderem zur Regeneration von Haut oder Knorpel eingesetzt.
Das Trägermaterial soll dabei so beschaffen sein, dass es das Wachstum und die Proliferation der Zellen unterstützt. Darüber hinaus ist eine gewisse Festigkeit wünschenswert, um die Zellen während des Anwachsens im Körper vor mechanischer Beanspruchung zu schützen. Gleichzeitig sollte das Material aber flexibel genug sein, um sich der Form der zu behandelnden Körperstelle anzupassen. Schließlich sollte das Trägermaterial vom Körper möglichst vollständig resorbiert werden können, nachdem die Zellen in ausreichendem Maße angewachsen sind und extrazelluläre Matrix synthetisiert haben. Die bisher verwendeten Materialien können diese vielfältigen Anforderungen nicht in gewünschtem Umfang erfüllen. Im Stand der Technik werden unter anderem Träger auf der Basis von Chitosan, Alginat, Agarose und Hyaluron- säure beschrieben. Die drei letztgenannten Materialien weisen dabei zum Teil erhebliche Mängel bei der rückstandsfreien Resorption auf.
Ein weiteres häufig verwendetes Trägermaterial ist Kollagen. Dieses ist jedoch nicht in einer wünschenswert reproduzierbaren Zusammensetzung und Reinheit erhältlich. Zudem kann das aus tierischen Quellen gewonnene Kollagen immunogene Telopeptide enthalten, die Abwehrreaktionen des Körpers auslösen können.
Alle vorgenannten Materialien weisen darüber hinaus den Nachteil auf, dass die jeweilige Resorptionszeit, nach der das Material abgebaut ist, nicht individuell eingestellt werden kann. Die optimale Zeitdauer kann je nach Art des zu behandelnden Gewebes und der Größe des Defekts unterschiedlich sein. So sind z.B. für die Regeneration von Knorpeldefekten aufgrund des langsamen Wachstums der Chondrozyten Abbauzeiten von 4 Wochen und mehr wünschenswert.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Materialien erhalten werden können, die die oben beschriebenen Anforderungen erfüllen und bei denen zusätzlich die jeweilige Abbauzeit des Materials gezielt eingestellt werden kann.
Diese Aufgabe wird bei dem eingangs genannten Verfahren erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer wässrigen Gelatinelösung; b) partielles Vernetzen der gelösten Gelatine; c) Herstellen eines Formkörpers ausgehend von der Gelatinelösung mit der partiell vernetzten Gelatine; und d) Vernetzen der im Formkörper enthaltenen Gelatine.
Die Verwendung von vernetzter Gelatine als Ausgangsmaterial für Wundauflagen und Gewebeimplantate wurde im Stand der Technik an sich bereits beschrieben. Im Gegensatz zu Kollagen handelt es sich bei Gelatine um ein Produkt mit definierter Zusammensetzung, das auch in sehr hoher Reinheitsstufe hergestellt werden kann. Materialien aus Gelatine sind zudem optisch klar, wohingegen Produkte aus Kollagen meist milchig trüb erscheinen. Letzteres kann bei einer lichtmikroskopischen Analyse des Zellwachstums von Nachteil sein.
Die bisher bekannten vernetzten Gelatine-Materialien weisen allerdings keine für Langzeitanwendungen erforderliche Stabilität auf. So ist beispielsweise eine bis zu 12-stündige Vernetzung mit 1,5-Pentandial, wie sie in der europäischen Patentschrift EP 1 053 757 beschrieben wird, nicht ausreichend, um ein für die Regeneration von Knorpeldefekten geeignetes Gelatine-Material zu erhalten. Auch Schwämme aus vernetzter Gelatine, wie sie zur Behandlung von Wunden und Blutungen bereits zum Einsatz kommen, sind ungeeignet, da sie in Gegenwart von Proteasen zum Teil innerhalb weniger Minuten abgebaut werden.
Es wurde gefunden, dass ein höherer Vernetzungsgrad der Gelatine mit einer erhöhten Stabilität einhergeht.
Eine Erhöhung der Stabilität mittels höherer Konzentration an Vernetzungsmitteln oder längerer Dauer der Vernetzungsreaktion ist dadurch limitiert, dass bei zu hoher Vernetzung einer Gelatinelösung diese nicht mehr verarbeitet und in Form gebracht werden kann.
Aber auch ein Vernetzen der Gelatine ausschließlich nach der Herstellung des Formkörpers führt nicht zu befriedigenden Ergebnissen, da hierbei die Gelatine an den von außen zugänglichen Grenzflächen stärker vernetzt als in den inneren Bereichen des Formkörpers. Dies kann z.B. bei Formkörpern mit einer Zellstruktur, auf die weiter unten noch ausführlich eingegangen wird, dazu führen, dass die Zellwände oder Stege zwischen den Poren im Inneren nur unzureichend vernetzt werden und sich beim späteren Einsatz der Formkörper zu schnell auflösen.
Erstaunlicherweise ermöglicht das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren, das sich durch eine zweistufige Vernetzung der Gelatine-Materialien auszeichnet, nicht nur entsprechend langlebige und formstabile Materialien herzustellen, ohne die oben beschriebenen Vorteile von Gelatine aufgeben zu müssen. Das Verfahren erlaubt auch die gewünschte Resorptionszeit des Materials individuell einzustellen.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Formkörper sind dabei selbsttragend, d.h. sie sind ausreichend stabil, um frei von einem Trägerelement gehandhabt und eingesetzt werden zu können. Dies ist in der medizinischen Anwendung von großem Vorteil, da hier möglichst einheitliche Materialien eingesetzt werden sollen.
Als Ausgangsmaterial für das Verfahren kann Gelatine verschiedener Herkunft und Qualität eingesetzt werden. Die Gelatinekonzentration in der Lösung (a) kann je nach Ausführungsform der Erfindung 5 bis 45 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 30 Gew.-% betragen. Der nach der ersten Vernetzung (b) gebildete Formkörper (c) wird vor der zweiten Vernetzung (d) bevorzugt zumindest teilweise getrocknet, vorzugsweise bis zu einem Restfeuchtegehalt von weniger als 20 Gew.-%, insbesondere 15 Gew.-% oder weniger.
Die zweite Vernetzung kann durch Einwirken einer wässrigen Lösung eines Vernetzungsmittels durchgeführt werden, bevorzugt ist jedoch das Einwirken eines gasförmigen Vernetzungsmittels.
Als Vernetzungsmittel können prinzipiell alle Verbindung eingesetzt werden, die eine chemische Vernetzung der Gelatine bewirken. Bevorzugt sind Aldehyde, Dialdehyde, Isocyanate, Diisocyanate, Carbodiimide und Alkyldihalogenide, wobei für die beiden Vernetzungsschritte gleiche oder verschiedene Verbindungen eingesetzt werden können.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Formaldehyd, insbesondere für den zweiten Vernetzungsschritt in der Gasphase, da der Formkörper durch Formaldehyd gleichzeitig sterilisiert werden kann. Dabei kann das Einwirken des Formaldehyds auf den Formkörper von einer Wasserdampfatmosphäre unterstützt erfolgen.
Die Eigenschaften der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Formkörper können in Bezug auf ihre Stabilität noch weiter verbessert werden, wenn die Formkörper nach dem zweiten Vernetzungsschritt einer thermischen Nachbehandlung bei vermindertem Druck ausgesetzt werden. Diese Nachbehandlung wird bevorzugt bei Temperaturen von 80 bis 160 °C durchgeführt, da unterhalb von 80 °C die beobachteten Effekte relativ schwach ausgeprägt sind und oberhalb von 160 °C eine unerwünschte Verfärbung der Gelatine auftreten kann. Am meisten bevorzugt sind Werte im Bereich von 90 bis 120 °C.
Unter vermindertem Druck sind dabei Drücke unterhalb des Atmosphärendrucks zu verstehen, wobei möglichst geringe Druckwerte, im Idealfall ein Vakuum, bevorzugt sind.
Die thermische Nachbehandlung wirkt sich in zweierlei Hinsicht vorteilhaft aus. Zum einen erfolgt unter den oben genannten Temperatur- und Druckbedingungen eine weitere, dehydrothermale Vernetzung der Gelatine, indem verschiedene Aminosäureseitenketten unter Wasserabspaltung miteinander reagieren. Dies wird dadurch begünstigt, dass das abgespaltene Wasser durch . den geringen Druck aus dem Gleichgewicht entfernt wird. Durch die thermische Nachbehandlung kann somit ein höherer Vernetzungsgrad bei gleicher Menge an Vernetzungsmitteln erzielt werden bzw. die Menge an Vernetzungsmitteln kann bei vergleichbarem Vernetzungsgrad reduziert werden.
Der weitere Vorteil der thermischen Nachbehandlung besteht darin, dass der im Formkörper verbleibenden Restgehalt an nicht verbrauchtem Vernetzungsmittel deutlich reduziert werden kann.
Um eine gute Bioverträglichkeit der Formkörper sicherzustellen, z.B. bei der Verwendung als Trägermaterial für Gewebeimplantate, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise überschüssiges, nicht reagiertes Vernetzungsmittel aus dem Formkörper entfernt. Dies kann z.B. durch mehrtägiges Entgasen der Formkörper unter Normaldruck und/oder durch Waschen mit einem flüssigen Medium erfolgen, wobei letzteres je nach Konzentration des Vernetzungsmittels, Größe des Formkörpers usw. ebenfalls einen Zeitraum von einem Tag bis zu einer Woche erfordert. Da durch die oben beschriebene thermische Nachbehandlung einerseits die Menge an eingesetztem Vernetzungsmittel reduziert werden kann und darüber hinaus überschüssiges Vernetzungsmittel durch die erhöhte Tempera-tur und den verminderten Druck aus dem Formkörper entfernt wird, kann durch diesen zusätzlichen Verfahrensschritt eine deutliche Verringerung des Restgehaltes an Vernetzungsmittel bereits innerhalb von ca. 4 bis 10 Stunden erreicht werden.
Erfindungsgemäße Formkörper, die vorzugsweise im Wesentlichen frei von überschüssigem Vernetzungsmittel sind, können somit durch die thermische Nachbehandlung mit einem relativ geringen Zeitaufwand hergestellt werden. Bevorzugt weisen die erfindungsgemäßen Formkörper einen Gehalt an Vernetzungsmittel von ca. 0,2 Gew.-% oder weniger auf, was z.B. im Falle des Vernetzungsmittels Formaldehyd einen Grenzwert für die Bioverträglichkeit von Trägermaterialien darstellt. Durch ein reines Waschen mit flüssigem Medium kann dieser Wert in dem oben genannten Zeitraum von 4 bis 10 Stunden nicht erreicht werden.
Erstaunlicherweise führt eine thermische Behandlung bei vermindertem Druck tatsächlich nur dann zu einer verbesserten Stabilität der erfindungsgemäßen Formkörper, wenn diese, wie oben beschrieben, nach den beiden Vernetzungsschritten durchgeführt wird. Eine Vorbehandlung der eingesetzten Gelatine unter den entsprechenden Temperatur- und Druckbedingungen führt zu keiner merklichen Erhöhung der Lebensdauer der Formkörper, obwohl die Gelatine auch in diesem Fall chemisch modifiziert wird, was sich in einer Erhöhung der Bloom-Stärke, der Viskosität und des mittleren Molekulargewichts niederschlägt. Eine thermische Vorbehandlung der eingesetzten Gelatine, die bevorzugt unter vergleichbaren Bedingungen durchgeführt wird wie die thermische Nachbehandlung der Formkörper, bringt allerdings anderweitige Vorteile mit sich, die ja nach Anwendungsfall von Bedeutung sein können. Zum einen führt die thermische Vorbehandlung zu einer höheren Reißfestigkeit der erfindungsgemäßen Formkörper in trockenem Zustand, insbesondere im Falle der weiter unten beschriebenen Folien. Des weiteren kann durch die höhere Viskosität der thermisch vorbehandelten Gelatine die Konzentration der einzusetzenden Gelatinelösung verringert werden, wodurch Formkörper mit einer niedrigeren Dichte und höheren Flexibilität erhältlich sind. Dies betrifft in erster Linie Formkörper mit einer Zellstruktur, die weiter unten im Detail beschrieben werden.
Bevorzugt wird für das erfindungsgemäße Verfahren eine Gelatine mit einer Viskosität von 8 mPas oder mehr eingesetzt, wobei sich dieser Wert auf die Viskosität einer 6,7 Gew.-%igen wässrigen Gelatinelösung bei 60 °C bezieht.
Die gewünschte Festigkeit, insbesondere Reißfestigkeit, und Stabilität bzw. Lebensdauer oder Abbauverhalten des hergestellten Materials können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sehr einfach eingestellt werden, bevorzugt durch die gezielte Wahl der Herstellungsbedingungen. Z.B. können durch eine höhere Konzentration des Vernetzungsmittels oder durch die oben beschriebene thermische Nachbehandlung in der Regel sowohl Festigkeit als auch Lebensdauer erhöht werden.
So können überraschenderweise Formkörper erhalten werden, die einerseits unter physiologischen Bedingungen gezielt beispielsweise länger als eine Woche, länger als zwei Wochen oder länger als vier Wochen stabil bleiben, und andererseits den Anforderungen bezüglich Zellverträglichkeit und Resorbier- barkeit genügen.
Der Begriff der Stabilität ist hier dahingehend zu verstehen, dass das Material seine ursprüngliche Form sowohl bei der Lagerung in trockenem Zustand als auch während der angegebenen Zeitdauer bei physiologischen Standardbedingungen im Wesentlichen erhält und erst anschließend in erheblichem Umfang resorbiert wird.
Physiologische Standardbedingungen, denen das Material bei seiner Verwendung zur Herstellung von Implantaten ausgesetzt ist, sind in erster Linie durch Temperatur, pH-Wert und Ionen-Stärke gekennzeichnet. Entsprechende Bedingungen können in vitro durch eine Inkubation des Materials in PBS-Puffer (pH 7,2, 0,09 Gew.-% NaCI) bei 37 °C definiert werden, um verschiedene Materialien im Hinblick auf ihr zeitabhängiges Stabilitätsverhalten zu testen und zu vergleichen.
Die Resistenz der Formkörper gegenüber Proteasen, die hauptsächlich für den Abbau des Materials verantwortlich sind, kann ebenfalls bereits in vitro durch Zugabe einer Protease, z.B. Pepsin, oder bei der Besiedlung mit Protease-pro- duzierenden Zellen, z.B. Fibroblasten, sehr gut abgeschätzt werden. Quantitative Angaben hierzu können aus den unten angeführten Ausführungsbeispielen entnommen werden.
Trotz des zum Teil sehr hohen Vernetzungsgrades, der mit dem beschriebenen Verfahren erreicht werden kann, können die hergestellten Formkörper dennoch eine ausreichende Flexibilität aufweisen, die den Anforderungen bei der Verwendung als Gewebeimplantat, wie z.B. Geschmeidigkeit und Vernähbar- keit, genügt. Die gewünschte Flexibilität kann vorzugsweise durch einen Zusatz von Weichmachern im Verlauf des Herstellungsverfahrens eingestellt werden. Dabei führt eine Erhöhung der Weichmacher-Konzentration in der Regel zu flexibleren Formkörpern. Als Weichmacher sind z.B. Glycerin, Oligoglycerine, Oligoglycole und Sorbit geeignet.
Bei der Herstellung der Formkörper aus der vernetzten Gelatinelösung können verschiedene Verfahren zum Einsatz kommen, wie beispielsweise Gießen oder Extrudieren, gegebenenfalls kombiniert mit einem Aufschäumen, wenn zelluläre Materialien angestrebt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Formkörper aus vernetzter Gelatine, bei denen der Vernetzungsgrad so gewählt ist, dass die Formkörper unter physiologischen Bedingungen für eine vorgegebene Zeit, z.B. mindestens eine, zwei oder vier Wochen, stabil bleiben. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung solcher Formkörper ist das oben beschriebene.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Formkörper als Flächenmaterialien ausgebildet. Flächenmaterialien sind als Träger für Gewebeimplantate vielfach anwendbar, z.B. bei der Regeneration von Haut. Das Flächenmaterial kann zellulär sein, d.h. eine Zellstruktur aufweisen, oder als (nicht zelluläre) Folie ausgestaltet sein.
Zellstrukturen, wie z.B. Schwämme oder Schäume, können durch Aufschäumen der Gelatinelösung mit einem Gas, insbesondere Luft, erhalten werden. Bevorzugte Zellstrukturen sind offenporig, um bei einer Verwendung für Gewebeimplantate ein Einwachsen von Zellen und die Ausbildung einer dreidimensionalen Gewebestruktur zu ermöglichen. Die Dichte der Formkörper mit Zellstruktur und die Porenweite können in einem weiten Bereich, bevorzugt durch die Intensität des Aufschäumens, eingestellt werden. Darüber hinaus kann die Dichte durch Verwendung einer thermisch vorbehandelten Gelatine bzw. einer Gelatine mit hoher Viskosität, wie oben beschrieben, gesenkt werden.
Die Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Formkörpers mit Zellstruktur können auch dadurch beeinflusst werden, dass die Zellstruktur durch mechanische Einwirkung auf den Formkörper modifiziert wird. Mechanisches Einwirken umfasst z.B. ein Pressen oder Walzen des Formkörpers in einem Ausmaß, dass ein Teil der Zellwände oder Stege zwischen den Poren der Zellstruktur gebrochen werden.
Vorzugsweise wird durch die mechanische Einwirkung die Dichte des Formkörpers um einen Faktor von 2 bis 10 erhöht.
Durch die mechanische Einwirkung kann die Flexibilität der Formkörper in trok- kenem Zustand erhöht werden, ohne dass das zeitliche Stabilitätsverhaiten merklich beeinflusst wird. Dies ist vorteilhaft, da insbesondere flexible Flächenmaterialien bei einer Verwendung als Gewebeimplat besser an die Gegebenheiten des Körpers angepasst werden können.
Die Poren der Zellstruktur weisen vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von weniger als 300 μm auf. Bei größeren mittleren Porendurchmessern wird beim Einbringen von Zellen in die Zellstruktur oft ein zu geringer Rückhaltegrad beobachtet. Die bevorzugte Untergrenze der Porenweite richtet sich in den meisten Fällen nach der Größe der verwendeten Zellen, die in allen drei Dimensionen in die Zellstruktur hineinwachsen sollen. Für die Herstellung von Formkörpern mit Zellstruktur kann eine Gelatinelösung mit einer Konzentration von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise von 10 bis 20 Gew.-%, eingesetzt werden. Dabei führt eine höhere Gelatine-Konzentration im Allgemeinen zu einer höheren Bruchfestigkeit der Formkörper. Dies gelingt überraschenderweise weitgehend unabhängig vom Vernetzungsgrad, über den die Lebensdauer des Materials eingestellt werden kann.
Bevorzugte Formkörper mit Zellstruktur sind reversibel komprimierbar. Dies gilt insbesondere in hydratisiertem Zustand, wobei das Ausmaß der Kompressibilität dabei u.a. von der eingesetzten Gelatinekonzentration und der Porenweite abhängig ist.
Unter dem Begriff "Folien" sind dünne Flächenmaterialien ohne Zellstruktur zu verstehen. Sie können durch Gießen aus einer bevorzugt im Wesentlichen entgasten Gelatinelösung hergestellt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft flexible Folien, deren Flexibilität z.B. durch einen Zusatz von Weichmachern eingestellt werden kann. Als Weichmacher können die bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beschriebenen Verbindungen zum Einsatz kommen. Die Stabilität der Folien bei physiologischen Standardbedingungen bleibt durch den Einsatz der Weichmacher im Wesentlichen unbeeinflusst.
Bevorzugt sind Folien mit einer Dicke von 20 bis 500 μm, am meisten bevorzugt von 50 bis 100 μm. Für die Herstellung der Folien werden bevorzugt Gelatinelösungen mit einer Konzentration von 5 bis 45 Gew.-%, weiter bevorzugt ungefähr von 10 bis 30 Gew.-%, verwendet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein mehrlagiges Material, das eine Folie und ein Flächenmaterial mit Zellstruktur umfasst. Dabei können die beiden Schichten unmittelbar miteinander verbunden sein, was z.B. dadurch bewirkt werden kann, dass das Flächenmaterial mit Zellstruktur vor dem Trocknen der Folie mit dieser in Kontakt gebracht, gegebenenfalls in diese eingedrückt wird.
Alternativ können die Schichten mit einem Kleber miteinander verbunden werden, wobei als Kleber vorzugsweise ein Gelatine basierender Kleber verwendet werden kann.
Bei dem erfindungsgemäßen mehrlagigen Flächenmaterial werden die Folie und das Flächenmaterial mit Zellstruktur vorzugsweise flächig, insbesondere vollflächig miteinander verbunden.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die Formkörper auch als Hohlkörper, insbesondere als Hohlprofil, ausgebildet sein. Solche Hohlprofile können beispielsweise durch Extrusion der Gelatinelösung erhalten werden. Alternativ können durch gleichzeitiges Extrudieren und Aufschäumen Hohlprofile mit einer oben beschriebenen Zellstruktur hergestellt werden.
Hohlprofile können aber auch aus zuvor hergestellten Flächenmaterialien, insbesondere Folien, gebildet werden, beispielsweise durch Aufrollen. Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft zylindrische Hohlprofile, beispielsweise kleine Röhrchen. Auch diese können u.a. durch Aufrollen der oben beschriebenen Flächenmaterialien hergestellt werden.
Neben den vorstehend beschriebenen Materialien können die erfindungsgemäßen Formkörper auch eine beliebige andere Form oder Struktur aufweisen. Insbesondere können für die Verwendung als Gewebeimplantat Formkörper zum Einsatz kommen, die dem zu behandelnden Gewebedefekt räumlich an- gepasst sind.
Die Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung der beschriebenen Formkörper für den Einsatz im human- und veterinärmedizinischen Bereich und für die Herstellung von Implantaten.
Eine erfindungsgemäße Verwendung betrifft die Herstellung von Wundauflagen aus den vorstehend beschriebenen Materialien. Diese können bei der Behandlung von Wunden oder von inneren oder äußeren Blutungen, z.B. bei Operationen, eingesetzt werden. Die Resorption des Materials erfolgt dabei nach einer individuell einstellbaren Zeit, bevorzugt durch die Wahl der Herstellungsbedingung.
Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Formkörper hervorragend für die Besiedlung mit Säugetierzellen, d.h. mit menschlichen oder tierischen Zellen, geeignet sind. Dabei kann ein Formkörper mit einem geeigneten Nährmedium behandelt und anschließend die Zellen, z.B. Fibroblasten oder Chondro- zyten, darauf ausgesät werden. Aufgrund der Stabilität des Materials können die Zellen in vitro mehrere Wochen wachsen und proliferieren. Die Erfindung betrifft weiterhin Implantate, insbesondere Gewebeimplantate, die einen erfindungsgemäßen Formkörper und hierauf kultivierten Zellen, wie oben beschrieben, umfassen.
Die erfindungsgemäßen Implantate werden für die Behandlung von Gewebedefekten, beispielsweise Haut- oder Knorpeldefekten, verwendet, wobei die ausgesäten Zellen z.B. zuvor dem Patienten entnommen werden können. Während der Wachstumsphase der Zellen vermittelt der Formkörper dem sich bildenden Gewebe Schutz vor mechanischer Beanspruchung, und die Ausbildung der zelleigenen extrazellulären Matrix wird ermöglicht. Die erfindungsgemäß einstellbare Resorptionszeit erweist sich dabei als besonderer Vorteil. Mit Hilfe langlebiger erfindungsgemäßer Materialien, die eine Resorptionszeit von mehr als vier Wochen aufweisen, können auch großflächige Defekte oder Defekte in Gewebetypen mit langsamem Zellwachstum behandelt werden.
Besonders bevorzugt für die Verwendung in Implantaten sind Formkörper mit einer Zellstruktur, da sich hier durch Einwachsen der Zellen in den Formkörper ein dreidimensionaler Gewebeverband entwickeln kann. Durch eine reversible Kompression des Formkörpers kann eine Zellsuspension aufgesaugt und die Zellen homogen im Formkörper verteilt werden.
Je nach Anwendungsgebiet kann ein Flächenmaterial mit Zellstruktur zur Anwendung kommen, wie z.B. zur Behandlung von großflächigen Verletzungen oder Verbrennungen der Haut. Aber auch jede andere Form kann vorteilhaft sein, z.B. individuelle, dreidimensionale Formkörper zur Behandlung von Knorpeldefekten.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Implantat ein oben beschriebenes mehrlagiges Flächenmaterial. Bei einem sol- chen Implantat dient das Flächenmaterial mit Zellstruktur als Träger für die Zellen, während die Folie zusätzlichen mechanischen Schutz bietet.
Ein solches Konstrukt kann beispielsweise bei der Regeneration von sehr langsam wachsendem Knorpelgewebe von Vorteil sein.
Ferner betrifft die Erfindung Nervenleitschienen. Die Implantation von Ner- venleitschienen dient der Regeneration durchtrennter Nervenstränge. Dabei sollte die Schiene so dimensioniert sein, dass eine einzelne Nervenzelle darin wachsen kann. Dies wird bei einem bevorzugten Innendurchmesser von 1 mm gewährleistet. Die Nervenleitschiene sollte zudem so beschaffen sein, dass sie seitlich von Blutgefäßen durchdrungen werden kann um die Versorgung der Nervenzelle mit Nährstoffen zu ermöglichen.
Nervenleitschienen, die diese Anforderung erfüllen, können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nervenleitschiene durch Aufrollen eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Flächenmaterials, insbesondere einer Folie, hergestellt.
Diese und weitere Vorteile der Erfindung werden durch die nachstehend aufgeführten Beispiele und Figuren näher erläutert. Es zeigen im Einzelnen:
Fig. 1 Zug-Dehnungs-Diagramm erfindungsgemäßer Folien; Fig. 2 Zug-Dehnungs-Diagramm weiterer erfindungsgemäßer Folien; Fig. 3 Zeitliches Abbauverhalten erfindungsgemäßer Formkörper mit Zellstruktur; Fig. 4: Mikroskopaufnahmen erfindungsgemäßer Formkörpern mit Zellstruktur;
Fig. 5: Bruchfestigkeits-Diagramm erfindungsgemäßer Formkörper mit Zellstruktur;
Fig. 6: Protease-Resistenz erfindungsgemäßer Formkörpern mit Zellstruktur;
Fig. 7: Zeitliches Abbauverhalten weiterer erfindungsgemäßer Formkörper mit Zellstruktur;
Fig. 8: Zug-Dehnungs-Diagramm weiterer erfindungsgemäßer Folien;
Fig. 9: Zellverteilung von Chondrozyten in erfindungsgemäßen Formkörpern; und
Fig. 10: Photographische Darstellung der Besiedlung einer erfindungsgemäßen Folie mit Fibroblasten.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung und Eigenschaften von Folien auf Basis von vernetzter Gelatine
Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300) wurde in vier verschiedenen Ansätzen in einer Mischung aus Wasser und Glycerin entsprechend den Mengenangaben in Tabelle 1 bei 60 °C gelöst. Nach dem Entgasen der Lösungen durch Ultraschall wurde die in Tabelle 1 bezeichnete Menge einer wässrigen Formaldehyd-Lösung (1,0 Gew.-%ig, Raumtemperatur) zugegeben, die Mischung homogenisiert und bei ca. 60 °C in einer Dicke von 1 mm auf eine Po- lyethylen-Unterlage geräkelt. Tabelle 1
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Nach Trocknen bei 30 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% für etwa einen Tag wurden die Folien von der PE-Unterlage abgezogen und ca. 12 h unter denselben Bedingungen nachgetrocknet.
Die getrockneten Folien wiesen eine Dicke von weniger als 100 μm auf und wurden für den zweiten Vernetzungs-Schritt zwei Stunden in einem Exsikkator dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 17%igen wässrigen Formaldehyd-Lösung bei Raumtemperatur ausgesetzt. Für die gemäß Ansatz 1-1 hergestellte Folie war der zweite Vernetzungsschritt der einzige.
Die mechanischen Eigenschaften der verschiedenen Folien (im trockenen Zustand) sind in der Figur 1 dargestellt: Während die Folie 1-2 durch die zweistufige Vernetzung im Vergleich zur Folie 1-1 eine höhere Reißfestigkeit bei geringerer Bruchdehnung aufweist, ist die Folie 1-3 durch die Erhöhung der Glycerin-Konzentration wesentlich dehnbarer (flexibler). Durch die höhere Vernetzungsmittel-Konzentration bei der Folie 1-4 im Vergleich zur Folie 1-3 kann wiederum eine etwas höhere Festigkeit bei geringerer Bruchdehnung erzielt werden.
Es wurden auch Folien gemäß den Ansätzen 1-1 und 1-2 hergestellt, die anschließend aber keiner Vernetzung in der Gasphase unterzogen wurden (Folien 1-1', unvernetzt und 1-2', einfach vernetzt). Die Bruchdehnungskurven dieser Folien enden bei etwa 140 % / 10 N/nm2 (1-1') bzw. 115 % / 15 N/nm2 (1-2') und sind aus Gründen der Übersichtlichkeit in der Figur 1 nicht dargestellt.
Es versteht sich von selbst, dass die jeweiligen Kurvenverläufe bei Herstellung im Labormaßstab nicht exakt reproduzierbar sind. Charakteristisch ist jedoch das Verhältnis der Kurven verschiedener Folien zueinander.
Das Beispiel zeigt daher, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Flexibilität der hergestellten Folien über einen weiten Bereich angepasst werden kann, indem sowohl der Vernetzungsgrad als auch der Anteil des Weichmachers entsprechend variiert werden.
Dabei zeichnen sich die zweifach vernetzten Folien dadurch aus, dass sie unter physiologischen Standardbedingungen wesentlich länger stabil bleiben:
Das Abbauverhalten der Folien wurde durch Einlegen von 2 x 3 cm großen Folienstücken in je 500 ml PBS-Puffer (pH 7,2, 0,09 Gew.-% NaCI) und photometrische Konzentrationsbestimmung der im Puffer gelösten Gelatine bei einer Wellenlänge von 214 nm gemessen. Während die nicht- bzw. einfach vernetzten Folien bereits nach 15 min vollständig aufgelöst waren, war an den zweifach vernetzten Folien nach einer Stunde noch keine Veränderung festzustellen.
Beispiel 2: Herstellung und Eigenschaften von Folien auf Basis von vernetzter Gelatine
Es wurden acht Ansätze einer 30 Gew.-%igen Lösung von Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300) in Wasser/Glycerin entsprechenden den Angaben in Tabelle 2 durch Lösen der Gelatine bei 60 °C hergestellt. Nach dem Entgasen der Lösungen durch Ultraschall wurden die entsprechenden Mengen einer wässrigen Formaldehyd-Lösung (1,0 Gew.-%ig, Raumtemperatur) zugegeben, so dass die Endkonzentration an Formaldehyd jeweils dem in Tabelle 2 angegebenen Wert entsprach. Aus den Mischungen wurden, wie im übrigen in Beispiel 1 beschrieben, Folien hergestellt, getrocknet und gegebenenfalls vernetzt (vgl. Tabelle 2).
Tabelle 2
Figure imgf000022_0001
In der Figur 2 ist das Zug-Dehnungs-Verhalten der acht Folien dargestellt.
Die Kurven 2-1 bis 2-8 beziehen sich auf die entsprechenden trockenen Folien, die Kurven 2-2A bis 2-8A auf die hydratisierten Folien, die für vier Stunden in PBS-Puffer eingelegt wurden (die unvernetzte Folie 2-1 löst sich unter diesen Bedingungen soweit auf, dass keine Untersuchung des Zug-Dehnungs-Verhaltens möglich ist). Die senkrechten Markierungen kennzeichnen die Endpunkte der jeweiligen Kurven.
Auch in diesem Beispiel wird deutlich, dass sich die Reißfestigkeit bzw. Flexibilität der Folien mittels der unterschiedlichen Herstellungsbedingungen über einen weiten Bereich variieren lässt.
Darüber hinaus zeigt sich, dass auch Folien, die in trockenem Zustand relativ steif sind (was bei der Verarbeitung einen Vorteil darstellen kann), nach ihrer Hydratisierung unter physiologischen Bedingungen z. T. sehr flexibel werden können: Die Folien 2-7 und 2-8, die in trockenem Zustand nahezu identische Eigenschaften aufweisen, ergeben nach ihrer Hydratisierung im einen Fall ein extrem flexibles Material (2-7A), wie es z.B. für den Einsatz im Gelenkbereich benötigt wird, im anderen Fall ein steiferes Material mit höherer Reißfestigkeit (2-8A), das z.B. im Knochenbereich zum Einsatz kommen kann.
Beispiel 3: Herstellung und Eigenschaften von Formkörpern mit Zellstruktur auf Basis von vernetzter Gelatine
Es wurden fünf Ansätze einer 12 Gew.-%igen Lösung von Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300) in Wasser durch Lösen der Gelatine bei 60 °C hergestellt, mittels Ultraschall entgast, und jeweils mit der entsprechenden Menge einer wässrigen Formaldehydlösung (1,0 Gew.-%ig, Raumtemperatur) versetzt, so dass 1500 ppm Formaldehyd (bezogen auf die Gelatine) vorlagen. Bei einer entsprechend hergestellten Referenzprobe erfolgte keine Zugabe von Formaldehyd.
Die homogenisierten Mischungen wurden nach einer Reaktionszeit von 10 min auf 45 °C temperiert und maschinell mit Luft aufgeschäumt. Der ca. 30minüti- ge Aufschäumvorgang wurde für die fünf Ansätze mit einem unterschiedlichen Verhältnis von Luft zu Gelatinelösung durchgeführt, wodurch Zellstrukturen mit unterschiedlichen Nassdichten und Porengrößen gemäß Tabelle 3 erhalten wurden.
Die aufgeschäumten Gelatinelösungen, die eine Temperatur von 26,5 °C aufwiesen, wurden in Formen mit einer Abmessung von 40 x 20 x 6 cm gegossen und ca. vier Tage bei 26 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 10% getrocknet.
Die getrockneten Formkörper mit einer schwammartigen Zellstruktur (im Folgenden als Schwämme bezeichnet), wurden in 2 mm dicke Schichten geschnitten und für den zweiten Vernetzungsschritt 17 Stunden in einem Exsikkator dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 17%igen wässrigen Formaldehyd- Lösung bei Raumtemperatur ausgesetzt. Um eine gleichmäßige Begasung des gesamten Volumens der Formkörper zu erreichen, wurde der Exsikkator dabei jeweils zwei- bis dreimal evakuiert und wieder belüftet.
Die Porenstruktur der Schwämme wurde lichtmikroskopisch ermittelt und konnte durch Rasterelektronenmikroskopie bestätigt werden. Tabelle 3
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Um die Stabilität der Schwämme zu bestimmen, wurden 30 x 30 x 2 mm große Stücke eingewogen, in je 75 ml PBS-Puffer gelegt und bei 37 °C gelagert. Nach der jeweiligen Lagerzeit wurden die Stücke 30 min in Wasser gewaschen, getrocknet und ausgewogen.
Die Figur 3 zeigt das Auflösungsverhalten der Schwämme 3-1 bis 3-5 sowie der einfach vernetzten Referenzprobe (die Abfolge der dargestellten Balken ist jeweils: Referenz, 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5).
Während die Referenz nach drei Tagen bereits vollständig aufgelöst ist, sind alle erfindungsgemäß hergestellten Schwämme auch nach 14 Tagen noch zu über 80 % erhalten. Es zeigen sich jedoch erhebliche Unterschiede im weiteren Abbauverhalten, die auf die unterschiedlichen Aufschäumdichten der Materialien zurückzuführen sind. So ist der Schwamm 3-1 nach 21 Tagen und der Schwamm 3-2 nach 28 vollständig aufgelöst, während die Schwämme 3-4 und 3-5 auch nach 35 Tagen noch weitgehend erhalten sind. Daraus ergibt sich die Möglichkeit das Abbauverhalten der Zellstrukturmaterialien unabhängig von anderen Parametern gezielt zu beeinflussen.
Die Eigenschaften der Zellstrukturmaterialien können aber auch über eine Änderung der Gelatinekonzentration in der Ausgangslösung deutlich modifiziert werden.
Die Figur 4 zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen der Zellstruktur zweier Formkörper in Dünnschnitten von 150 μm, die ausgehend von einer 12 Gew.-%igen (Bild A) bzw. 18 Gew.-%igen (Bild B) Gelatinelösung, unter ansonsten identischen Bedingungen, hergestellt wurden. Die höhere Gelatinekonzentration führt zu breiteren (dickeren) Zellwänden oder Stegen zwischen den einzelnen Poren, was sich in einer erhöhten Bruchfestigkeit der entsprechenden Schwämme niederschlägt.
Quantitativ ist dies in der Figur 5 dargestellt. Die drei Kurven A, B und C repräsentieren jeweils Schwämme mit drei unterschiedlichen Vernetzungsgraden. Die Bruchfestigkeit nimmt mit Erhöhung der Gelatinekonzentration der Ausgangslösung von 10 auf 18 Gew.-% stetig zu, wobei ein weiter Bereich von ca. 500 bis fast 2000 Newton abgedeckt wird. Gleichzeitig ändert sich die Verformung bis zum Bruch nur geringfügig. Überraschenderweise ist die Korrelation zwischen Bruchkraft und Gelatinekonzentration dabei weitgehend unabhängig vom Vernetzungsgrad.
Über den Vernetzungsgrad, d.h. durch die Wahl der Konzentration des Vernetzungsmittels, kann hingegen die Stabilität der Formkörper, insbesondere im Hinblick auf proteolytischen Abbau, beeinflusst werden. In der Figur 6 ist die Resistenz verschiedener Zellstrukturmaterialien (Schwämme) gegen Pepsin in Abhängigkeit von der im ersten Vernetzungsschritt verwendeten Formaldehydmenge(Gew.-% bezogen auf Gelatine) dargestellt.
Der Abbau wurde bei 37 °C in einer 1,0 Gew.-%igen Pepsin-Lösung in PBS- Puffer durchgeführt, dessen pH-Wert mit HCI auf 1 eingestellt wurde. Mit Erhöhung der Formaldehydkonzentration von 500 über 1500 auf 3000 ppm steigt die Abbauzeit der Schwämme von weniger als 5 min über 30 min auf 75 min. Die Trockendichte der Materialien ist dabei vom Vernetzungsgrad im Wesentlichen unabhängig. Die hier gewählten sehr drastischen Abbaubedingungen sind mit den wesentlich milderen physiologischen Bedingungen nicht vergleichbar, so dass unter letzteren Bedingungen erheblich längere Abbau- zeiten gelten.
Beispiel 4: Herstellung und Eigenschaften von Formkörpern mit Zellstruktur auf Basis von vernetzter Gelatine mit thermischer Nachbehandlung
Eine 12 Gew.-%ige Lösung von Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300) wurde wie in Beispiel 3 hergestellt, mittels Ultraschall entgast, und mit der entsprechenden Menge einer wässrigen Formaldehydlösung (1,0 Gew.- %ig, Raumtemperatur) versetzt, sodass 1500 ppm Formaldehyd (bezogen auf die Gelatine) vorlagen.
Die homogenisierte Mischung wurde nach einer Reaktionszeit von 5 min auf 45 °C temperiert und während ca. 30 min maschinell mit Luft aufgeschäumt. Die aufgeschäumte Gelatinelösung wurde in Formen gegossen und getrocknet wie in Beispiel 3 beschrieben, wobei ein Formkörper mit einer schwammartigen Zellstruktur (Schwamm) mit einer Nassdichte von 121 mg/cm3, einer Trocken- dichte von 18 mg/cm3 und einer mittleren Porengröße von 250 μm erhalten wurde.
Der Formkörper war nach dem ersten Vernetzungsschritt bereits schnittfest.
Von dem Schwamm wurden vier Proben mit den Abmessungen 30 x 30 x 2 mm geschnitten, welche jeweils einem zweiten Vernetzungsschritt in der Gasphase über dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 10%igen wässrigen Formal- dehydlösung analog dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unterworfen wurden. Im Unterschied zu Beispiel 3 war jedoch die Einwirkzeit des Formaldehyds in diesem Fall deutlich kürzer, nämlich 2 Stunden im Falle der Proben 4-1 und 4-3 sowie 5 Stunden um Falle der Proben 4-2 und 4-4.
Alle vier Proben wurden nach dem zweiten Vernetzungsschritt vakuumentgast, anschließend wurden die Proben 4-3 und 4-4 einer thermischen Nachbehandlung unterzogen. Dabei wurden die betreffenden Schwämme mit Hilfe eines Rotationsverdampfers für 6 Stunden bei 105 °C unter einem Vakuum von ca. 14 mbar gehalten.
Die Stabilität der verschiedenen Proben in PBS-Puffer wurde wie in Beispiel 3 beschrieben ermittelt. Die Figur 7 zeigt das Auflösungsverhalten der Proben 4- 1 bis 4-4 (die Abfolge der dargestellten Balken ist jeweils: 4-1, 4-2, 4-3, 4-4).
Es wird deutlich, dass durch die thermische Nachbehandlung die Lebensdauer der Schwämme unter physiologischen Bedingungen signifikant verlängert werden kann. Während die nicht nachbehandelte Probe 4-1 nach 14 Tagen bereits vollständig abgebaut ist, ist die thermisch nachbehandelte Probe 4-3 zu diesem Zeitpunkt noch zu fast 50 % erhalten. Ein entsprechender Unterschied zeigt sich auch zwischen den Proben 4-2 (nicht nachbehandelt) und 4-4 (thermisch nachbehandelt), die jeweils 5 Stunden in der Gasphase vernetzt wurden. Nach 35 Tagen ist die Probe 4-2 vollständig aufgelöst und die Probe 4-4 noch zu über 70 % erhalten.
Neben der Erhöhung des Vernetzungsgrades und der Stabilität der Schwämme hat die thermische Nachbehandlung unter Vakuum auch den Vorteil, dass die in dem Formkörper verbleibende Restmenge an Vernetzungsmittel effektiv reduziert werden kann, wodurch ein langwieriges Waschen vor der Verwendung vermieden oder zumindest verkürzt werden kann. Dies gilt insbesondere für mechanisch relativ feste Schwämme, die ausgehend von hohen Gelatinekonzentrationen hergestellt wurden.
Für die Messung dieses Effekts wurden zwei Ansätze einer 18 Gew.-%igen Lösung von Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300) in Wasser durch Lösen der Gelatine bei 60 °C hergestellt, mittels Ultraschall entgast, und jeweils mit der ensprechenden Menge einer wässrigen Formaldehydlösung (1,0 Gew.- %ig, Raumtemperatur) versetzt, sodass 2000 ppm Formaldehyd (bezogen auf die Gelatine) vorlagen.
Die homogenisierten Mischungen wurden nach einer Reaktionszeit von 5 min auf 45 °C temperiert und maschinell mit Luft aufgeschäumt. Durch ein unterschiedliches Verhältnis von Luft zu Gelatinelösung bei den zwei Ansätzen wurden Zellstrukturen mit unterschiedlichen Dichten und Porengrößen gemäß Tabelle 4 erhalten.
Das Gießen und Trocknen der aufgeschäumten Gelatinelösung erfolgten wie oben beschrieben, ebenso das Schneiden in Scheiben von 2 mm Dicke und der zweite Vernetzungsschritt unter Einwirkung von Formaldehyd-Dampf. Die Vernetzungszeit betrug 17 Stunden. Tabelle 4
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Nach der Bestimmung des Gehalts an überschüssigem Formaldehyd in den Schwämmen wurden die Proben einer thermischen Nachbehandlung bei 105 °C und einem Vakuum von ca. 14 mbar für eine Dauer von 4 Stunden (Probe 4-5) bzw. 10 Stunden (Probe 4-6) unterworfen. Danach wurde erneut der Restgehalt an freiem Formaldehyd ermittelt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5
Figure imgf000030_0002
Bei dem Schwamm 4-5 konnte der Formaldehydgehalt bereits nach 4 Stunden der thermischen Nachbehandlung um ca. 30 % gesenkt werden. Bei dem wesentlich dichteren Schwamm 4-6 führte eine 10-stündige Nachbehandlung zu einer Senkung des Restgehaltes um ca. 40 %. Ein Restgehalt von ca. 0,2 Gew.-% stellt bei vielen medizinischen Anwendungen die physiologische Obergrenze für Formaldehyd dar. Es zeigt sich, dass dieser Wert durch die thermische Nachbehandlung in vielen Fällen erreicht werden kann, sodass die für das Waschen der Schwämme aufzuwendende Zeit erheblich verkürzt werden kann.
Beispiel 5: Herstellung von Formkörpern aus thermisch vorbehandelter Gelatine
Zum Vergleich wurde die Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300), welche zur Herstellung der Formkörper in den Beispielen 1 bis 4 eingesetzt worden war, einer thermischen Vorbehandlung analog der thermischen Nachbehandlung der Formkörper in Beispiel 4 unterzogen.
Dabei wurde die Gelatine für einen Zeitraum von 6 Stunden bei 105 °C unter einem Vakuum von ca. 14 mbar gehalten. Hierdurch erhöhte sich die Bloom- Stärke von 300 auf 310, die Viskosität stieg von 5,92 mPas auf 9,04 mPas (gemessen in einer 6,7 Gew.-%igen Lösung bei 60 °C) und das mittlere Molekulargewicht von 172 kDa auf 189 kDa.
Aus der unbehandelten bzw. der thermischen vorbehandelten Gelatine wurden vier verschiedene Folien analog dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Mengenangaben für die verschiedenen Ansätze ergeben sich aus der Tabelle 6. Abweichend von Beispiel 1 wurde für den ersten Vernetzungschritt eine 2,0 Gew.-%ige wässrige Formaldehydlösung eingesetzt und der zweite Vernetzungsschritt erfolgte 2 Stunden über dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 10 %igen wässrigen Formaldehydlösung. Tabelle 6
Figure imgf000032_0001
Die mechanischen Eigenschaften der Folien 5-1 bis 5-4 in trockenem Zustand sind in der Figur 8 dargestellt. Es zeigt sich, dass die Reißfestigkeit der aus der thermisch vorbehandelten Gelatine hergestellten Folien 5-2 und 5-4 gegenüber den entsprechenden, aus der unbehandelten Gelatine hergestellten. Folien 5-1 bzw. 5-3 deutlich erhöht ist. Hierdurch wird die Handhabbarkeit der Folien im Rahmen einer medizinischen Anwendung verbessert. Alternativ ist es möglich, aus der thermisch vorbehandelten Gelatine dünnere Folien mit vergleichbarer Reißfestigkeit herzustellen.
Bezüglich ihrer Langzeitstabilität unter physiologischen Bedingungen weisen die aus vorbehandelter Gelatine hergestellten Folien dieselben vorteilhaften Eigenschaften auf wie die Folien aus unbehandelter Gelatine.
Die thermisch vorbehandelte Gelatine eignet sich auch zur Herstellung von Formkörpern mit Zellstruktur analog dem Beispiel 3. Auch in diesem Fall werden vergleichbare Langzeitstabilitäten beobachtet wie bei der Verwendung der unbehandelten Gelatine. Durch die höhere Viskosität der vorbehandelten Gelatine (in diesem Fall 9,04 mPas gegenüber 5,92 mPas) ist es möglich, die Gelatinekonzentration der für die Herstellung der Schwämme eingesetzten Lösungen deutlich herabzusetzen. Da die Viskosität einer Gelatinelösung linear bis quadratisch mit der Konzentration steigt, kann an Stelle einer 12 Gew.-%igen Lösung von unbehandelter Gelatine eine 5-8 Gew.-%ige Lösung der thermisch vorbehandelten Gelatine eingesetzt werden. Die auf diese Weise hergestellten Formkörper mit Zellstruktur zeichnen sich durch dünnere Stege zwischen den Poren und eine niedrigere Dichte aus, wodurch wiederum die Flexibilität der Schwämme erhöht wird. Eine geringere Dichte bedeutet zudem, dass bei der Verwendung als Trägermaterial für Gewebeimplantate insgesamt eine geringere Menge an Gelatine eingesetzt werden muss.
Beispiel 6: Herstellung von mehrlagigen Flächenmaterialien
Aus 33 g Schweineschwartengelatine (Bloom-Stärke 300), 53,25 g Wasser, 15,5 g Glycerin und 8,25 g einer 2,0 Gew.-%igen Formaldehydlösung wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren eine Folie hergestellt, wobei die gerakelte Folie vor dem Trocknen 2 h bei 40 °C gehalten wurde.
Ein 2 bis 3 mm dicker Schwamm wurde entsprechend Beispiel 3, Ansatz 3-2 hergestellt.
Vor der zweiten Vernetzung wurden die beiden Flächenmaterialien mittels einer Lösung aus Knochengelatine (Bloom-Stärke 160) miteinander verklebt. Das mehrlagige Flächenmaterial wurde anschließend, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch Einwirken von Formaldehyd-Dampf vernetzt. Alternativ zum hier beschriebenen Verfahren können die Folie und der Schwamm auch vor dem Zusammenfügen jeweils separat dem zweiten Vernetzungsschritt unterworfen werden.
Statt der Verwendung einer Gelatinelösung als Kleber kann die Verbindung zwischen den beiden Flächenmaterialien auch so hergestellt werden, dass der getrocknete Schwamm in die gerakelte, noch nicht getrocknete Folie partiell eingedrückt wird. Bei beiden alternativen Vorgehensweisen wird ein bevorzugt vollflächiger Verbund der Flächenmaterialien erhalten.
Beispiel 7: Besiedlung von Schwämmen mit Chondrozyten
Für die Besiedlung mit Chondrozyten wurden die entsprechend den Ansätzen 3-1 bis 3-3 hergestellten Schwämme sowie die einfach vernetzte Referenzprobe aus Beispiel 3, jeweils als Flächenmaterial mit einer Dicke von 2 mm, eingesetzt. Als Kulturmedium wurde DMEM/10%FCS/Glutamin/Pen/Strep verwendet, welches ein Standardmedium für die Kultivierung von Säugetierzellenist.
Vor der Besiedlung muss überschüssiges Formaldehyd aus den Schwämmen entfernt werden, z.B. durch Waschen der Schwämme mit Kulturmedium oder Ethanol.
Auf die Flächenmaterialien wurden pro cm2 eine Million Schweine-Chondrozy- ten, suspendiert in 150 μl Kulturmedium, ausgesät.
Die nach einer Stunde vorgefundene Verteilung der Zellen innerhalb der Schwämme ist in der Figur 9 dargestellt. Die Percentile gibt den Anteil aller Zellen in Prozent an, die bis zur jeweiligen Besiedlungstiefe im Material verteilt sind. Die Zellverteilung ist auf Grund der offenporigen Struktur über die gesamte Dicke der Schwämme weitgehend gleichmäßig und wird durch den höheren Vernetzungsgrad der Schwämme 3-1 bis 3-3 gegenüber der Referenzprobe R nicht beeinträchtigt.
Beispiel 8: Kultivierung von Fibroblasten auf Folien
Für die Besiedlung mit Fibroblasten wurden die entsprechend den Ansätzen 2- 3 bis 2-6 hergestellten Folien eingesetzt. Als Kulturmedium wurde wieder DMEM/10%FCS/Glutamin/Pen/Strep verwendet.
Auch die Folien müssen vor der Besiedlung mit Zellen zur Entfernung von restlichem Formaldehyd gewaschen werden.
Auf die Folien wurden humane Vorhaut-Fibroblasten (0,5 Mio. Zellen / cm2) ausgesät und 6 Wochen im Medium bei 37 °C kultiviert.
Die Vitalität der Zellen wurde zweimal wöchentlich mikroskopisch untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Fibroblasten auf allen Folien mindestens vier Wochen lebensfähig waren.
Weiterhin war nach vier Wochen trotz Protease-Produktion der Zellen noch keine der Folien abgebaut. Die stärker vernetzen Folien 2-5 und 2-6 waren sogar bis zu sechs Wochen stabil. Die Figur 10 zeigt eine lichtmikroskopisch Aufnahme der Fibroblasten auf der Folie 2-5 nach einer Kultivierungszeit von 14 Tagen. Da noch keine Auflösung des Materials eingesetzt hat, ist der Rand der Folie deutlich erkennbar.
Obwohl bei allen vorstehenden Beispielen Schweineschwartengelatine (Bloom 300) verwendet wurde, versteht es sich von selbst, dass vergleichbare Ergebnisse problemlos mit anderen Gelatinetypen und - Qualitäten erzielbar sind.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Formkörpern auf Basis von vernetzter Gelatine, umfassend folgende Schritte: a) Herstellen einer wässrigen Gelatinelösung; b) partielles Vernetzen der gelösten Gelatine; c) Herstellen eines Formkörpers ausgehend von der die partiell vernetzte Gelatine enthaltende Gelatinelösung; und d) Vernetzen der im Formkörper enthaltenen Gelatine.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Formkörper vor Schritt d) zumindest teilweise getrocknet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Vernetzung in Schritt d) durch das Einwirken eines Vernetzungsmittels in wässriger Lösung durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Vernetzung in Schritt d) durch das Einwirken eines Vernetzungsmittels in der Gasphase durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die in den Schritten b) und d) verwendeten Vernetzungsmittel gleich oder verschieden sind und jeweils ausgewählt sind aus Aldehyden, Dialdehyden, Isocyanaten, Diisocyanaten, Carbodiimiden und Alkyldihalogeniden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Vernetzungsmittel in den Schritten b) und/oder d) Formaldehyd ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei nach dem Vernetzen überschüssiges Vernetzungsmittel aus dem Formkörper entfernt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Formkörper in Anschluss an Schritt d) einer thermischen Nachbehandlung bei reduziertem Druck unterworfen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die thermische Nachbehandlung bei einer Temperatur von 80 bis 160 °C durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Schritt a) ausgehend von einer Gelatine durchgeführt wird, die zuvor einer thermischen Vorbehandlung bei reduziertem Druck unterworfen wurde.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die thermische Vorbehandlung bei einer Temperatur von 80 bis 160 °C durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 11, wobei Schritt a) ausgehend von einer Gelatine mit einer Viskosität von 8 mPas oder mehr, gemessen in einer 6,7 Gew.-%igen wässrigen Lösung bei 60 °C, durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Formkörper zusätzlich einen Weichmacher enthält.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Weichmacher ausgewählt ist aus Glycerin, Oligoglycerinen, Oligoglykolen und Sorbit.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Weichmacher ausgewählt ist aus Glycerin, Oligoglycerinen, Oligoglykolen und Sorbit.
15. Formkörper, hergestellt nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 14.
16. Formkörper nach Anspruch 15, im Wesentlichen frei von überschüssigem Vernetzungsmittel.
17. Formkörper nach Anspruch 16, wobei der Formkörper einen Gehalt an überschüssigem Vernetzungsmittel von ca. 0,2 Gew.-% oder weniger aufweist.
18. Formkörper auf Basis von vernetzter Gelatine, wobei der Grad der Vernetzung so gewählt ist, dass der Formkörper unter physiologischen Bedingungen mindestens 1 Woche stabil ist.
19. Formkörper nach Anspruch 18, wobei der Grad der Vernetzung so gewählt ist, dass der Formkörper unter physiologischen Bedingungen mindestens 2 Wochen stabil ist.
20. Formkörper nach Anspruch 18, wobei der Grad der Vernetzung so gewählt ist, dass der Formkörper unter physiologischen Bedingungen mindestens 4 Wochen stabil ist.
21. Formkörper nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei der Formkörper selbsttragend ist.
22. Formkörper nach einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei der Formkörper frei von einem Trägerelement ist.
23. Formkörper nach einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei der Formkörper flexibel ist.
24. Formkörper nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei der Formkörper zusätzlich einen Weichmacher enthält.
25. Formkörper nach Anspruch 24, wobei der Weichmacher ausgewählt ist aus Glycerin, Oligoglycerinen, Oligoglykolen und Sorbit.
26. Formkörper nach einem der Ansprüche 15 bis 25, wobei der Formkörper ein Flächenmaterial ist.
27. Flächenmaterial nach Anspruch 26, wobei das Flächenmaterial eine Zellstruktur aufweist.
28. Flächenmaterial nach Anspruch 27, wobei die Zellstruktur offenporig ist.
29. Flächenmaterial nach Anspruch 27 oder 28, wobei die Zellstruktur durch mechanische Einwirkung auf den Formkörper modifiziert ist.
30. Flächenmaterial nach Anspruch 29, wobei ein Teil der Zellwände zwischen den Poren der Zellstruktur gebrochen sind.
31. Flächenmaterial nach Anspruch 29 oder 30, wobei die Dichte des Formkörpers durch die mechanische Einwirkung um einen Faktor von 2 bis 10 erhöht ist.
32. Flächenmaterial nach einem der Ansprüche 27 bis 31, wobei die Poren einen mittleren Durchmesser von weniger als 300 μm aufweisen.
33. Flächenmaterial nach Anspruch 26, wobei das Flächenmaterial eine Folie ist.
34. Flächenmaterial nach Anspruch 33, wobei die Folie eine Dicke von 20 bis 500 μm, vorzugsweise von 50 bis 100 μm, aufweist.
35. Flächenmaterial nach Anspruch 26, wobei das Flächenmaterial eine mehrlagige Struktur aufweist, umfassend eine Folie nach Anspruch 33 oder 34 und ein Flächenmaterial mit Zellstruktur nach einem der Ansprüche 27 bis 32,
36. Flächenmaterial nach Anspruch 35, wobei das Flächenmaterial mit Zellstruktur unmittelbar mit der Folie verbunden ist.
37. Flächenmaterial nach Anspruch 36, wobei die Verbindung durch Eindrücken des Flächenmaterials mit Zeilstruktur in die Folie hergestellt ist.
38. Flächenmaterial nach Anspruch 35, wobei das Flächenmaterial mit Zellstruktur mittels eines Klebers mit der Folie verbunden ist.
39. Flächenmaterial nach Anspruch 38, wobei der Kleber Gelatine umfasst.
40. Formkörper nach einem der Ansprüche 15 bis 25, wobei der Formkörper ein Hohlkörper ist.
41. Hohlkörper nach Anspruch 40, wobei der Hohlkörper ein Hohlprofil ist.
42. Hohlprofii nach Anspruch 41, wobei das Hohlprofil ein Hohlzylinder ist.
43. Hohlkörper nach einem der Ansprüche 40 bis 42, wobei der Hohlkörper eine Zeilstruktur aufweist.
44. Hohlkörper nach einem der Ansprüche 40 bis 43, wobei der Hohlkörper durch Extrusion einer Gelatinelösung hergestellt ist.
45. Hohlprofil nach einem der Ansprüche 41 bis 43, wobei das Hohlprofil aus einem Flächenmaterial nach einem der Ansprüche 26 bis 39 hergestellt ist.
46. Verwendung eines Formkörpers nach einem der Ansprüche 15 bis 45 für die Herstellung eines resorbierbares Materials zur Abdeckung von Wunden oder von inneren oder äußeren Blutungen im human- oder veterinärmedizinischen Bereich.
47. Verwendung eines Formkörpers nach einem der Ansprüche 15 bis 42 als Träger für die Kultivierung von Säugetierzellen in vitro.
48. Verwendung gemäß Anspruch 47, wobei die Säugetierzellen Fibroblasten sind.
49. Verwendung gemäß Anspruch 47, wobei die Säugetierzellen Chondrozyten sind.
50. Implantat, umfassend einen Formkörper nach einem der Ansprüche 15 bis 42 sowie Säugetierzellen, die auf dem Formkörper kultiviert sind.
51. Implantat nach Anspruch 50, geeignet zur Behandlung von Schäden, Verletzungen und/oder Verbrennungen der menschlichen oder tierischen Haut.
52. Implantat nach Anspruch 50, geeignet zur Behandlung von Schäden und/oder Verletzungen des menschlichen oder tierischen Knorpelgewebes.
53. Nervenleitschiene, umfassend einen Hohlzylinder nach einem der Ansprüche 42 bis 45.
54. Nervenleitschiene nach Anspruch 53, wobei der Hohlzylinder einen Innendurchmesser von ungefähr 1 mm aufweist.
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