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WO2004024921A1 - ヒト抗ヒトｍｃｐ−１抗体及び該抗体フラグメント - Google Patents

ヒト抗ヒトｍｃｐ−１抗体及び該抗体フラグメント Download PDF

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WO2004024921A1
WO2004024921A1 PCT/JP2003/011560 JP0311560W WO2004024921A1 WO 2004024921 A1 WO2004024921 A1 WO 2004024921A1 JP 0311560 W JP0311560 W JP 0311560W WO 2004024921 A1 WO2004024921 A1 WO 2004024921A1
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WO
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human
antibody
chain
mcp
human mcp
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/011560
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuhisa Sugimura
Toshihiro Nakashima
Tsukasa Nishihara
Original Assignee
Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
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Publication date
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to a human anti-human MCP-1 antibody or an antibody fragment that binds to human Monocyte chemoattractanl: protein-1 (hereinafter referred to as human MCP-1) and inhibits its biological activity.
  • human MCP-1 human Monocyte chemoattractanl: protein-1
  • the antibodies and antibody fragments are expected to be used as therapeutic agents for inflammation and immunological disorders caused by MCP-1.
  • MCP-1 is involved in infiltration of inflammatory cells and induction of inflammation in chronic inflammatory diseases and arteriosclerosis. Therefore, the development of a specific monoclonal antibody that neutralizes the biological activity of MCP-1 is expected to be an effective treatment for diseases that are a major factor in macrophage infiltration. To date, several monoclonal antibodies derived from mice and rats that bind to MCP-1 have been obtained, and in fact, anti-MCP-1 monoclonal antibodies have been used to suppress the invasion of macula phage in rat Masugi-type nephritis.
  • a human anti-human MCP-1 antibody or an antibody fragment thereof in which the scFV and the VI-I and VL chains of the scFV are linked to a human constant region or a part thereof is a disease associated with human MCP-1.
  • these antibodies including those that bind to human MCP-1 but have not been shown to inhibit production, should be used to measure the blood concentration of human MCP-1 to monitor changes in pathological symptoms. You can also.
  • This library is reacted with human MCP-1 immobilized on a plastic tube, and the unreacted scFv-displaying phage is removed by washing. Then, the scFV phage clone binding to human MCP-1 is acidified. Elute at Prepare scFV DNA from the isolated phage clone, integrate it into an expression vector, and culture the host transformed by the expression vector according to a conventional method to obtain only the desired scFv protein. Can be.
  • the scFV protein obtained by the present invention was found to have a binding activity to human MCP-1.
  • Methods for measuring the antigen-binding activity of the anti-human MCP-1 antibody used in the present invention include methods such as ELISA and BIAcore.
  • ELISA a sample containing the desired anti-human MCP-1 antibody or antibody fragment, such as a culture supernatant of E. coli or a purified antibody, is added to a 96-well plate on which human MCP-1 is immobilized.
  • a secondary antibody labeled with an enzyme such as peroxidase is added, the plate is incubated and washed, and then the chromogenic substrate TMBZ is added and the absorbance is measured to evaluate the antigen binding activity.
  • a human MC P-1 susceptible cell suspension for example, a monocyte cell line THP-1 or human peripheral blood mononuclear cells (hereinafter sometimes abbreviated as PBMC) is placed in a chamber. Add to upper layer and leave at 37 ° C for a certain time. Since the migrating cells pass through the filter attached to the chamber and move to the lower layer, the cells attached to the filter may be stained with Giemsa staining solution or the like to count the number of cells. Alternatively, the number of cells that have moved to the lower layer may be counted using a coulter, a counter, or the like.
  • a disposable cell for chemotaxis access is commercially available, and it may be used. In this chemotaxis atsey system, the scFv protein of the present invention is a human MCP- It was found to inhibit the cell migration activity of 1.
  • the sc FV protein obtained by the present invention is capable of inhibiting the cell migration activity of human MCP-1 in a concentration-dependent manner, and is thus effective for preventing or treating diseases caused by the cell migration. Is expected.
  • amino acid sequences of the VH and VL chains of the scFV clone having the above-mentioned inhibitory activity and the nucleotide sequences encoding them are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 (VH chain) and SEQ ID NOs: 6 and 7 (VL chain), respectively. Show.
  • amino acid sequences of the VH chain and VL chain complementarity determining regions (CDR1 to 3) in the above sequence are shown below.
  • CDR 2 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thrlie Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly ⁇ SEQ ID NO: 4>
  • the VH chain and the Z or VL peptide of the human anti-human MCP-1 antibody disclosed in the present invention are obtained in the form of sc Fv using the phage antibody method, but the disclosed VH chain and / or VL Full-length human anti-human MCP-1 antibody whose chain is linked to the constant region of human immunoglobulin, or Fab, Fab, or F (ab,) combining with a part of the constant region of human immunoglobulin Other human anti-human MCP-1 antibody fragments, such as 2 ) human anti-human MCP-1 antibody fragment, and human anti-human MCP-1 single-chain antibody (sc Ab) in which sc FV is linked to the constant region of human immunoglobulin — 1 antibody fragment,
  • the present invention also encompasses gene fragments encoding these antibodies or antibody fragments.
  • the present invention also includes modified protein molecules obtained by binding a polymer modifier such as polyethylene glycol to these antibody and antibody fragment protein molecules.
  • lymphocytes from peripheral blood from 20 healthy subjects as starting materials.
  • lymphocytes were separated from peripheral blood from 20 healthy subjects by specific gravity centrifugation using Ficol, washed thoroughly with PBS, and treated with IS0GEN (Nippon Gene) to prepare total thighs.
  • This total RNA was divided into four parts, using primers specific for the constant regions of human IgG; IgM, / c chain, and ⁇ chain, using the first strand cDNA synthesis kit (Pharmacia biotech).
  • Each cDNA was prepared.
  • a combination of VH (or), JH and V, and JK was amplified using polymerase chain reaction (PCR).
  • VH ( ⁇ or ⁇ ) and VK, and VH ( ⁇ or VV) with linker DNA an assembly PCR method (McCafferty, J. et al .: Antibody Engineering-A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1996 ) To prepare single-stranded scFv DNA. The scFv DNA was further added with Notl and Sfil restriction enzyme sites by PCR, electrophoresed on agarose gel, and purified.
  • Fv DNA was digested with the restriction enzymes Sfil (Takara) and Not I (Takara) and then cloned into the phagemid pCANTAB5E (Pharmacia) .pCANTAB5E to which scFv DNA was bound was VH (y) _V ⁇ ;, VH ( y) -V VH (/ — V, VH () — Introduced into E. coli TG 1 by electroporation for each ⁇ .
  • Human MC P- 1 was dissolved in 0.1M NaHC0 3 1 mL, were immobilized 4 ° C De ⁇ reacted 35mm dish (Iwaki). After blocking with 0.5% gelatin ZPBS at 20 ° C for 2 hours, the plate was washed 6 times with 0.1% TVeen20-PBS. To this was added 0.9 mL (1 ⁇ 10 12 tu / raL) of an antibody phage library (single-chain antibody-displayed phage solution) derived from a healthy individual, and allowed to react.
  • an antibody phage library single-chain antibody-displayed phage solution
  • YT medium was added, and the cells were suspended and recovered using a scraper (Costar).
  • This TG 1 solution (50 / L) was inoculated into 3 OmL of 2XYTAG medium, and rescued using a helper phage to prepare a phage library after screening.
  • Healthy subjects from phage ripe Larry VH (y) -V K, VH (y) -Vl, VH (/ i) - VK, VH (/ i) - ⁇ , using the above-described human MCP l immobilized plate for each Four times in total.
  • clones were arbitrarily extracted from the SOB AG plate, and the expression of scFV was confirmed, the specificity was confirmed by human MCP-1 ELISA, and the nucleotide sequence was analyzed.
  • ELISA for screening of the isolated clones was performed as follows. Human MCP-1 and human MIP-1a (macrophage inflammatory protein 1a) were immobilized on an ELISA plate and used for screening. Place 2 g / inL of human MCP-1 or human MIP-1 ⁇ and 2.5 ⁇ g / mL of human serum albumin (HSA) in a 40 / zL / well ELISA plate (Nunc) and place at 4 ° C. For 16 hours and immobilized. The immobilized plate was blocked with 400 ⁇ L / well of a PBS solution containing 0.5% BSA, 0.5% gelatin and 5% skim milk, allowed to stand at 4 for 2 hours, and subjected to blocking.
  • HSA human serum albumin
  • Plasmid DNA was recovered from four types of scFv clones reacting with human MCP-1 isolated in Examples 2 and 3 above, MC8, MC15, MC32, and MC59, and subjected to a conventional method.
  • E. coli HB1251 was transformed. After pre-incubating these Escherichia coli overnight in 2X YT medium containing 2% glucose, partially transplanting the cells into glucose-free 2XYT medium, adding final concentration of ImM IPTG and further culturing overnight, induced scFv expression induction. went. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, suspended in PBS containing ImM EDTA, and left on ice for 30 minutes. Then, the mixture was centrifuged at 8,900 xg for 30 minutes, and the supernatant was collected, filtered through a 0.45 m filter, and used as a starting material for purifying scFV from the periplasm fraction.
  • the thus-prepared starting material for purification was purified by affinity chromatography using an anti-Etag antibody according to a conventional method. After dialysis with PBS, endotoxin was removed using an endotoxin removal column Detoxigel (PIERCE) according to the attached protocol. After concentration with Centricon (Araicon) having a molecular weight cut-off of 10,000, the solution was filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a purified sample.
  • PIERCE endotoxin removal column Detoxigel
  • the culture medium was added MO xL.
  • human MC P- 1 of sc FV and 2 X 10- 8 M was concentrations prepared (CHEMICON, Inc.) and equivalents mixed for 30 minutes incubation at room temperature, the medium was placed in the reaction solution 540 zL 60 / xL was added to a 24-well plate. &. Add 1%? 3—13 ⁇ 4? 1 ⁇ 1 IOOL and 1 ⁇ 10 6 cells / mL 200 of human monocyte cell line THP-1 to 33 ⁇ 43 ⁇ 411 and leave at 37 ° C for 4 hours did. Cells will be placed in the upper Transwell separated by the 8 ⁇ filter, and the antibody mixture will be placed in the lower 24-well plate.
  • FIG. 3 shows the results.
  • MC15 and MC32 were found to have the effect of inhibiting the cell migration activity of human MCP-1.
  • Example 8 Construction of anti-MCP-1 complete molecular type human antibody expression plasmid >> From the expression plasmid incorporating scFv DNA of scFV clone MC32 isolated in Example 3, the VH chain and VL domain were obtained by PCR. Was amplified. The PCR primers used for amplification are shown below.
  • the DNA of each of the amplified VH chain and VL chain was cloned downstream of the leader sequence of a plasmid DNA NpUC18 incorporating a leader sequence necessary for secretory expression in animal cells.
  • the plasmid DNA thus obtained was digested with Hindlll (Takara Bio)-BaraHI at 37 ° C for 2 hours, and 2% agarose gel (Takara Labaio) was used. By electrophoresis, DNA fragments of the VH and VL chains containing the signal sequence were recovered.
  • the expression plasmid p CAG-H incorporating the constant region (hinge-CH1-CH2-CH3) of the human antibody H chain gene IgG1 was digested with Hindll-BaraHI at 37 ° C for 2 hours to delete the DNA fragment of the vector. Prepared, and the VH chain
  • Hindlll-BaraHI fragment was introduced. Escherichia coli HB101 was transformed, a plasmid was prepared from a drug-resistant (ampicillin) -resistant colony, and it was confirmed that the VH chain had been inserted by restriction enzyme treatment.
  • VL chain was inserted into the expression plasmid pCAG-L into which the constant region (Cc) of the human antibody L chain gene ⁇ chain was incorporated.
  • BMT_10 cells were used for transient expression.
  • the BMT- 10 cells maintained in 8% FCS (Invitrogen) containing D 'MEM (Invitrogen), sterile small Petri dish; (diameter 6 cm Koyungu Co.) to prepare a cell concentration to 1.5 X 10 5 / mL And cultured at 37 ° C overnight during the incubation period of carbon dioxide gas.
  • the cells were washed twice with PBS (SIGMA) and replaced with 5 mL of low serum OPTI-MEM (Invitrogen).

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Abstract

　ＭＣＰ−１が関与する免疫異常性疾患の治療に有効な物質を提供する。ファージ抗体法を用いて、ヒトＭＣＰ−１に対して高い親和性を有するｓｃＦｖを得た。当該ｓｃＦｖより得られるＶＨ鎖及びＶＬ鎖情報を基に、ヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体及びヒト抗ヒトＭＣＰ−１抗体フラグメントが得られる。当該抗体及び抗体フラグメントは、ＭＣＰ−１が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。

Description

明 細 書
ヒト抗ヒト MCP— 1抗体及ぴ該抗体フラグメント
技術分野
本発明は、 ヒ ト Monocyte chemoattractanl: protein— 1 (以下、 ヒ ト MCP— 1とする） に結合し、 その生物活性を阻害するヒト抗ヒト MCP— 1抗体または 該抗体フラグメントに関する。 当該抗体及び抗体フラグメントは、 MC P— 1が 原因となって惹起される炎症、 免疫異常性疾患の治療薬として期待される。
背景技術
ケモカインは 8〜 1 OkDaのぺプチドタンパク質で、 白血球の遊走や活性化に おいて重要な役割を担っている。 ケモカインは N末端の 4つのシスティン （C) のうち最初の 2つのシスティンの並び方により、 Cケモカイン、 CCケモカイン、 CXCケモカイン、 CX 3 Cケモカインの 4つのサブグループに分けられる。 M C P— 1は CCケモカインサブフアミリーに属するケモカインで、 1989年にヒト のグリォーマ細胞株及び単球†生白血病細胞株からクローニングされた、 76アミ ノ酸残基からなる単球走化性因子である （例えば、 Yoshimura, T.ら、 "FEBS
Letter" 、 1 989年、 第 244卷、 p.487— 493参照） 。 MC P— 1は 単球、 血管内皮細胞、 锥芽細胞などから産生され、 単球、 T細胞及ぴ好塩基球 に作用し、 それらの遊走活性、 活性酸素' リソソーム酵素の産生放出、 サイトカ ィン産生誘導、 好塩基球の脱顆粒、 接着分子の発現誘導ヒスタミン'ロイコトリ ェンの産生放出などを促進する多機能な分子である。
慢性炎症を中心に疾患モデル動物を用いた解析が進められ、 いくつかの炎症性 疾患において MCP— 1の関与が示されている （例えば、 Schrier, DJ.ら、 "Journal of Leukocyte Biology" 、 1 998年、 第 63巻、 . 359 - 36 3参照） 。 更に、 これらの疾患モデル動物の MCP— 1の活性を阻害すると、 症 状が抑制されることが報告されている。 例えば、 ラットのコラーゲン誘導性関節 炎 （以下、 C I Aと省略することがある） やアジュバント関節炎モデレで、 抗 M CP- 1抗体を投与すると関節炎症状が軽減され、 関節炎の予防効果や治療効果 があることが報告されている （例えば、 Youssef, S.ら、 "Journal of Clinical Investigation" 、 2000年、 第 106巻、 . 36 1 -37 1 ；及び Ogata, H. ら、 "Journal of Pathology" 、 1997年、 第 182巻、 p. 106— 114 参照） 。 また、 関節炎を自然発症し生涯持続する MRL_lprマウスでは、 MCP— 1を投与すると関節炎が増悪するが、 MCP— 1のアンタゴニストを投与すると 関節炎が抑制されることが報告されている （例えば、 Gong, JH.ら、 "Journal of Experimental Medicine" 、 1997年、 第 186卷、 p.131— 137参 照） 。
また更に、 MCP— 1やそのレセプターである CCR 2の遺伝子欠損マウスを 用いた解析が進められ、 いくつかの炎症性疾患において、 病態形成に関わるマク 口ファージ浸潤に MCP— 1/CCR 2が必須であることが示されている。 例え ば、 自己免疫疾患マウスの MCP— 1を欠損させるとマクロファージゃ T細胞の 遊走が抑制され、 腎■肺 ·皮膚などの各臓器が保護されることにより生存率が改 善されることや、 CCR 2遺伝子を破壌したノックァゥトマウスでは実験的に腹 腔に誘発した炎症に対して、 マクロファージの浸潤が抑制されることが報告され て ヽる (例 は、 Kurihara, T.ら、 Journal of Experimental Medicine 、 1 997年、 第 186卷、 p.1757— 1762参照） 。 また、 動脈硬化モデル マウスの MCP_1、 あるいは CCR 2を欠損させると動脈壁のマクロファージ 遊走 ·硬化巣形成を抑制するという報告がある （例えば、 Gosling, J.ら、 "Journal of Clinical Investigation" 、 1999年、 第 103巻、 p.773 -778 ;及び Boring L.ら、 "Nature" 、 1998年、 第 394卷、 p .894 - 897参照） 。
ヒ トの疾患との関連においては、 変形性関節炎と比較して慢性関節リゥマチ (以下、 RAと省略することもある） 患者では滑膜液中の MCP—1の濃度が高 く、 炎症性細胞浸潤ならびに炎症の誘発 ·増強に中心的な役割を果たしているこ と力 S示唆されてレヽる （例えば、、 Akahoshi, T.ら、 "Arthritis and Rheumatism" ヽ 1993年、 第 36卷、 p.762— 771 ;及び Koch, AE.ら、 "Journal of
Clinical Investigation" 、 1992年、 第 90卷、 ： .772— 779参照） 。 また、 疫学的な調査から、 心筋梗塞や動脈硬化症の発症に MCP— 1が関与し、 MCP- 1の細胞遊走活性がリスクファクターとなることが明らかにされている ことから、 MC P— 1抗体を用いて細胞遊走活性を抑えることができれば、 心筋 梗塞や動脈硬化の予防及び治療に寄与することが期待される。
以上のように MC P- 1は慢性の炎症性疾患や動脈硬化症において、 炎症性細 胞の浸潤や炎症の誘発に関わっていることが明らかとなってきた。 よって、 MC P— 1の生物活性を中和する特異的なモノクローナノレ抗体を開発すれば、 マクロ ファージ浸潤の主要な因子である疾患において有効な治療手段になることが期待 される。 これまでに、 MCP— 1に結合するマウスやラット由来のモノクローナ ル抗体はいくつか取得されており、実際に抗 MC P— 1モノクローナル抗体よる ラット馬杉型腎炎におけるマク口ファージの浸潤抑制、 ラット肺高血圧モデ レに おけるマクロファージの浸潤抑制 ·右心室圧上昇抑制 ·肺細動脈内膜肥厚の抑制 等が報告されている （例えば、 Wada, T.ら、 "FASEB Journal"、 1996年、 第 10卷、 p. 1418— 1425 ;及び Kimura, H.ら、 "Lab. Invest. "、 1 998年、 第 78卷、 p.571— 581参照） 。
発明の開示
(発明が解決しようとする技術的課題）
しかしながら、 上記抗 M CP— 1モノクローナル抗体は異種動物由来のモノク ローナノレ抗体であるため、 ヒトに対して投与した場合は異物として認識■排除さ れ、 薬剤として利用することは困難である。 とりわけ R Aのような慢性の自己免 疫性疾患の治療では、 長期間の継続投与が行われるので、 投与抗体に対する抗体 の出現が問題となる。 この問題点を解決する方策として、 ヒト由来の抗ヒト MC P—1モノクローナル抗体の取得法が知られている （例えば、 特開平 9 _ 673
99号公報参照） 。 すなわち、 抗ヒト MCP— 1抗体を産生するヒトリンパ球を ェプスタイン.パー 'ウィルス （以下、 EBVと省略することがある） で形質転 換し、 得られた形質転換細胞とヒトミエロ一マ細胞とを細胞融合したハイプリ ド 一マからヒト抗ヒト MC P_ 1モノクローナル抗体が得られている。 しかしなが らここで得られた抗体は I g M抗体であるので、 I g G抗体と比較して高い親和 性は得にくく、 また取り扱いも不便である。 また EBV形質転換細胞では抗体産 生量が少なく、 実用的に応用する上でも問題が多い。 更に、 特開平 9— 6739 9号公報に記載のヒ ト MCP—1に対する I gM抗体は、 ヒ ト MCP— 1との結 合性は明記されているが、 中和活性は明らかにされていない。 上記の方法以外にヒト MC P— 1に対するマウスモノクローナル抗体を、 遺伝 子工学的手法を用いてヒト型化することも可能である。 しかしながら、 ヒト型化 抗体でも、 慢性疾患患者に対する繰り返し投与や長期投与した際に、 抗ヒト MC P— 1抗体の活性を阻害するような抗体 （阻止抗体） が作り出される可能性も否 定できなかった。
(その解決方法）
このような状況を鑑み、 本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、 健常人の末梢血 Bリンパ球より調製した免疫グロプリン遺伝子の VH鎖、 V L鎖を材料として構 築したファージ提示ライブラリーから取得した、 完全ヒト抗ヒト MCP— 1一本 鎖 Fv (s c Fv) 分子を取得し、 その VH鎖及び VL鎖を明らかにした。 当該 ヒト抗体の配列情報を用いて作製される完全ヒト抗ヒト MCP— 1抗体及び該抗 体フラグメントは、 ヒト MC P— 1に結合してその生物活性を阻害し、 炎症 '性疾 患の予防■治療用として提供されるものである。
(従来技術より有効な効果）
このように、 本発明のヒト MCP— 1に対するヒト由来 s c F Vは、 ヒト MC
P— 1と特異的に結合し、 ヒト MCP— 1の細胞遊走活性を阻害するものである ことが示された。 従って、 当該 s c F V及び s c F Vの VI- I鎖及び V L鎖をヒト 定常領域またはその一部と結合させたヒト抗ヒト MCP— 1抗体またはその抗体 フラグメントは、 ヒト MC P— 1の関与する疾患、 例えば慢性炎症性疾患や動脈 硬化症等の治療への適用が期待される。 また、 ヒ ト MCP— 1とは結合するが抑 制作用を示さなかった抗体を含めてこれらの抗体で、 ヒト MC P— 1の血中濃度 を測定し、 病態の症状の変動をモニターすることもできる。
図面の簡単な説明
図 1は、 分離クローンの s c Fvのヒト MC P— 1への特異性を評価した E L I S Aの結果を示すグラフである。
図 2は、 精製したヒト由来 s cFvのヒト MCP— 1との結合性を EL I SA で測定した結果を示すグラフである。
図 3は、 ヒト MCP— 1によるヒト単球系細胞株 THP— 1の細胞遊走を s c F Vが阻害することを示すグラフである。 図 4は、 精製完全分子型 MC 32の H PLCパターンを示す （流速： 0. 5m L/分；開始バッファー： 10 OmM ΡΒ、 ρΗ7. 2 + 0. 5Μ Na C 1 ) 。 図 5は、 精製完全分子型 MC 32の M CP— 1との結合性を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明のヒト MC P— 1と結合するヒト抗体及び該抗体フラグメントは、 例え ば以下のようにして作製することができる。
健常人の末梢血 Bリンパ球より mRNAを抽出し、 免疫グロプリン遺伝子の V H鎖、 VL鎖を、 その両端を規定するプライマー対を用いて RT— PC R法によ り増幅し、 多様な配列を有する H鎖、 L鎖の V領域集団を得る。 次に更にぺプチ ドリンカ一部分をコードする DNA、 及びその両端を各々 H鎖、 L鎖と連結され るように規定するプライマー対を組み合わせて増幅して、 H鎖、 L鎖の V領域の ランダムな組み合わせによる多様な s c Fv DNA集団を調製する。 得られた s c F V DNAをファージミドベクター pCANTAB5Eに組込み、 s c F v提示ファ ージライブラリ一を作製する。 このライブラリ一をプラスチックチューブに固相 化したヒ ト MCP— 1と反応させ、 洗浄により未反応の s c Fv提示ファージを 除去した後に、 ヒ ト MCP— 1と結合している s c F Vファージクローンを酸で 溶出する。 分離したファージクローンから s c F V DNAを調製し、 これを発 現ベクターに組み込み、 該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従つ て培養して目的の s c Fv蛋白のみを得ることができる。
s c F V DN Aの発現方法としては、 例えば、 大腸菌で発現させることがで きる。 大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーターを用い、 抗体分泌のための シグナル配列等を、 発現させる s c F Vを機能的に結合させて発現させることが できる。 例えばプロモーターとしては、 lacZプロモーター、 araBプロモーター等 を挙げることができる。 s c Fvの分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌 のペリプラズムに発現させる場合、 pelBシグナル配列 (Lei, SP.ら、 J.
Bacteriol. , 1987， 169 ： 4379-4383) を用いるとよい。 培養上清中に分泌させ るには Ml 3ファージの g 3蛋白のシグナル配列を用いることもできる。
前記のように発現された s c F Vは細胞内外、 宿主から分離し均一にまで精製 することができる。 本発明で発現される s c F Vは、 その C末端に E t a g配 列が付加されているので、 抗 E t a g抗体を用いたァフィ二ティークロマトグ ラフィーを用いて、 容易に短時間で精製することができる。 その他、 通常のタン パク質で使用されている分離、 精製方法を組み合わせて精製することも可能であ る。 例えば、 限 «過、 塩析、 ゲル濾過 Zイオン交換 Z疎水クロマト等のカラム クロマトグラフィ一を組み合わせれば抗体を分離■精製することができる。
本発明により得られた s c F V蛋白は、 ヒト MC P— 1に対する結合活性を有 することが明らかになった。 本発明で使用される抗ヒト MC P—1抗体の抗原結 合活性を測定する方法として、 E L I S A、 BIAcore等の方法がある。 例えば E L I S Aを用いる場合、 ヒト MC P— 1を固相化した 9 6穴プレートに目的の抗 ヒト MC P— 1抗体や抗体フラグメントを含む試料、 例えば大腸菌の培養上清や 精製抗体を加える。 次にパーォキシダーゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、 プレートをインキュベーション、 洗浄した後、 発色基質 TMBZを加えて吸光度を測 定することで抗原結合活性を評価することができる。
さらにまた、 本楽明により得られた s c F V蛋白は、 ヒ ト MC P— 1の有する 細胞遊走活性を阻害することが明らかとなった。 ヒ ト MC P— 1による感受性細 胞の遊走 （ケモタキシス） は、 通常用いられるケモタキシスアツセィ、 例えば Grobらの方法 (Grob. PM.ら、 J. Biol. Chem.， 1990， 265 ： 8311-8316) を用い て調べることができる。 具体的には市販されているケモタキシスチャンパ一を用 い、 抗ヒト MC P— 1抗体とヒト MC P— 1を培養液、 例えば、 RPMI 1640で 各々希釈して混合し、 室温で一定時間インキュベーションを行い、 この混合液を フィルターで仕切られたチャンバ一の下層に添加する。 次いでヒト MC P— 1感 受性細胞懸濁液、 例えば、 単球系の細胞株 T H P— 1、 あるいはヒ ト末梢血単核 球 （以下、 P B MCと省略することがある） をチャンバ一の上層に添加して 3 7 °Cで一定時間放置する。 遊走する細胞はチヤンバーに装着されたフィルターを 通過して下層に移動するので、 フィルターに付着した細胞をギムザ染色液等で染 色して細胞数をカウントすればよい。 あるいは下層に移動した細胞数をコールタ 一カウンタ一等でカウントしてもよい。 また、 チャンバ一に代わり、 デイスポー ザブルのケモタキシスアツセィ用のセルが市販されているので、 それを使用して もよい。 このケモタキシスアツセィ系で、 本発明の s c F v蛋白はヒト MC P— 1の細胞遊走活性を阻害することが明らかとなつた。
このように、 本発明により得られる s c F V蛋白は、 ヒ ト MCP—1の細胞遊 走活性を濃度依存的に阻害すること力ゝら、 当該細胞遊走により惹起される疾患の 予防または治療に有効であると期待される。
上記阻害活性を有する s c F Vクローンの V H鎖及び V L鎖のアミノ酸配列及 びそれをコードする塩基配列を、 配列番号 1及び 2 (VH鎖） 、 及び配列番号 6 及ぴ 7 (VL鎖） にそれぞれ示す。
さらに、 上記配列中、 VH鎖及び VL鎖の相補性決定領域 （CDR1〜3) の アミノ酸配列を下記に示す。
[VH鎖]
CDR 1 ： Ser Tyr Ala lie Ser く配列番号 3 >
CDR 2 ： Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly <配列番号 4〉
CDR 3 ： Asp Leu Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val く配列番号 5>
[VL鎖]
CDR 1 ： Arg Ser Ser Gin Ser lie Asn Thr Tyr Leu His く配列番号 8 > CDR 2 ： Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser <配列番号 9 >
CDR 3 ： Gin Gin Ser Phe Thr Thr Pro Leu Thr く配歹 lj番号 10 >
また、 本発明の VH鎖または VL鎖は、 上記のァミノ酸配列において 1もしく は数個のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列を有するものを も包含する。
本発明で開示されるヒト抗ヒト MCP—1抗体の VH鎖及び Zまたは VL鎮は、 ファージ抗体法を用いて s c Fvの形で得られたものであるが、 開示した VH鎖 及び/または VL鎖をヒト免疫グロブリンの定常部と連結した完全分子型ヒト抗 ヒト MCP— 1抗体、 またヒト免疫グロプリンの定常部の一部と糸且み合わせた F a b、 F a b，または F(a b，）2等のヒト抗ヒト MC P— 1抗体フラグメント、 さらに s c F Vをヒト免疫グロブリンの定常部と結合させたヒト抗ヒト MCP— 1一本鎖抗体 (s c Ab) などの他のヒ ト抗ヒト MCP— 1抗体フラグメント、 並びにこれら抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子断片をも本宪明は 包含する。 また、 これらの抗体及び抗体フラグメント蛋白分子に、 ポリエチレン グリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子も本発明に包含される。
H鎖と L鎖の F Vを適当なリンカーで連結させた s c F Vを調製する場合、 ぺプ チドリンカーとしては、 例えばァミノ酸 1 0〜 2 5残基からなる任意の一本鎖ぺ プチドが用いられる。
産業上の利用の可能性
以上より、 本発明のヒト抗ヒト MC P—1抗体及び該抗体フラグメント分子は、 ヒト由来抗ヒト MC P— 1抗体の可変領域を有し、 ヒト MC P—1と強く反応し て、 ヒト MC P— 1とヒ ト MC P— 1受容体間の結合に阻害作用を示す。 さらに、 本発明のヒト抗ヒト MC P— 1抗体及ぴ該抗体フラグメント分子は、 ヒト MC P
- 1によって惹起される種々の免疫応答を阻害することができ、 当該免疫応答に より惹起される炎症及び免疫異常性疾患の予防または治療薬、 例えば抗炎症剤あ るいは自己免疫疾患の治療及び予防のための薬剤として使用することができる。 さらに、 本発明の抗体及び抗体フラグメントは心筋梗塞や動脈硬化の予防及び治 療に寄与することが期待される。
以下、 本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、 本発明は何らこれらに限定 されるものではない。
《実施例 1 ：健常者からのファージライブラリ一の構築》
ファージライプラリーの構築は、 J. D. Marksら （J. Mol. Biol. , 222： 581-
597， 1991} により報告されている方法を参考に、 健常者 2 0名由来末梢血由来 リンパ球を出発材料に、 構築した。
すなわち、 健常者 2 0名由来末梢血より Ficolを用いた比重遠心法にてリンパ 球を分離し、 P B Sで充分に洗浄後、 IS0GEN (日本ジーン） で処理して、 total 腿を調製した。 この total RNAを 4つに分割し、 ヒ ト I g G; I g M、 /c鎖、 λ 鎖の定常領域に特異的なプライマーを使用し、 first strand cDNA synthesis kit (Pharmacia biotech) にて、 それぞれの c D N Aを作製した。 この c D NA をテンプレートにして、 Marksらが報告したのと同様に VH ( または ） と J H及ぴ Vにと J K；、 と の組合せで各ジーンファミリ一に特異的なプライ マーを用いて、 それぞれの抗体 V領域遺伝子をポリメラーゼチェインリァクショ ン （PCR) 法にて増幅した。
更に、 VH (γまたは〃） と V K、 及び VH (γまたは と V をリンカ一 DNAを用いて、 アッセンプリ一 PCR法 （McCafferty, J.ら： Antibody Engineering - A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1996) により結合 させ、 一本鎖 s c F v DNAを作製した。 s c F v DNAは更に PCRを用い て、 Notl及び Sfil制限酵素部位を付加し、 ァガロースゲノレで電気泳動後、 精製し た。 精製した s c F v DNAは制限酵素 Sfil (Takara) と Not I (Takara) で消 化後、 ファージミド pCANTAB5E (Pharmacia) にクローユングした。 s c Fv D NAを結合させた pCANTAB5Eは VH(y)_V κ；、 VH(y)-V VH(/ — V 、 VH( )— νλ毎にエレクトロポレイシヨンにより大腸菌 TG 1に導入した。 形質転換した TG 1の数から、 VH(y)— V K；、 VH(y)-Vl VH(/i)— V に、 VH ）一 の各サプライブラリーはそれぞれ 1.1 X 108、 2.1 X 108、 8.4 X 107、 5.3 X 107クローンの多様性を有すると評価された。 この形質転換し た TG 1から、 Ml 3 ΚΟ 7ヘルパーファージを用いてファージ抗体を発現し、 健常人由来 s c F v提示ファージライブラリーを調製した。
《実施例 2 ：パンユング》
ヒト MC P— 1は 0.1M NaHC031 mLに溶解し、 35mmのディッシュ （岩城） に 4 °Cでー晚反応させて固定化した。 0.5%ゼラチン ZPB Sを用いて 20°Cで 2 時間ブロッキングした後、 0.1% TVeen20- PBSで 6回洗浄した。 これに健常人由 来の抗体ファージライブラリ一 （一本鎖抗体提示ファージ液） を 0.9mL (1 X 1012 tu/raL) 加え、 反応させた。
0.1% Tween20-PBSで 10回洗浄した後、 1. OmLのグリシン緩衝液 (pH2.2) を 加え、 ヒ ト MCP— 1と結合する一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。 溶出し たファージは IM Tris (hydroxymethyl) aminomethane-HCl, pH9.1を加えて pHを 調整した後、 対数増殖期の大腸菌 TG 1に感染させた。 感染後の TG 1は
3000xg, 10分で遠心分離して、 上清を除き、 200/ Lの 2 XYT培地で懸濁し、 SOBAGプレート （2。/。グルコース、 100 ig/mlのアンピシリン含有 S0Bプレー ト） に播き、 30°Cのふ卵器中でー晚培養した。 生じたコロニーは適量の 2 X TJP200雇 1560
10
YT培地を加えスクレイパー （Costar) を使って懸濁、 回収した。
この TG 1液 50 / Lを、 3 OmLの 2 XYTAG培地に植え、 ヘルパーファー ジを用いてレスキューし、 スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。 健常人由来ファージライプラリー VH(y)—V K、 VH(y)-Vl, VH(/i)— V K、 VH(/i)— νλ、 それぞれについて前述のヒト MCP— l固定化プレート を用いてパンエングを計 4回行った。 4回目のパンエング後に、 SOB AGプレ ートから任意にクローンを抽出し、 s c F Vの発現の確認及びヒト MCP— 1 EL I S Aによる特異性の確認と塩基配列の解析を行った。
《実施例 3 ：スクリーニング ヒ ト MC P— 1 E L I S A》
分離したクローンのスクリーニングのための E L I S Aは以下のように行った。 ヒト MC P— 1及びヒ ト M I P— 1 a (macrophage inflammatory protein 1一 a) を EL I S Aプレートに固定ィ匕してスクリーニングに用いた。 2 g/inLのヒ ト MCP— 1或いはヒ ト M I P— 1 α、 2.5 μ g/mLのヒ ト血清アルブミン （H S A) を 40 /zL/well EL I SAプレート （Nunc) に入れ、 4 °Cで 16時間静置 し、 固定化した。 固定化プレートは、 0.5%B SA、 0.5%ゼラチン及ぴ 5%スキ ムミルクを含む P B S溶液 400 μ L/wellを入れて 4 で 2時間静置し、 ブロッキ ングを行った。
s c F V提示ファージを含む試料液 40 μ L/wellを入れて反応させた後、 試料 液を捨て洗浄液で 5回洗つた。 ビォチン標識した抗 M 1 3モノクローナル抗体 (Pharmacia biotech) と反応させ、 アルカリフォスファターゼ （AP) 標識し た抗マウス IgG抗体と反応させた。 洗浄液で 5回洗った後、 発色基質液 （lg/mL p-nitrophenyl phosphate (Wako) 、 10%ジエタノールァミン （Wako) を含む P B S溶液） を 50 μ L/well入れ、 遮光し、 室温〜 37°Cで、 5〜 10分発色させ た。 マルチプレートォートリーダー NJ- 2001 (Inter Med) で 405nmの吸光度を測 定した結果、 評価したクローン全てが、 ヒト MCP— 1に特異的であることが確 認できた （図 1) 。
《実施例 4 ：クローンの配列分析》
単離したクローンの s c F V遺伝子の VH及び VLの DNA塩基配列を Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit (Applied Biosystems を用いて決定した （配列番号 1及び配列番号 6) 。 E L I S A及び配列分析の結 果、 単離したクローンは 4種に分類された。
《実施例 5 ：ヒト由来抗ヒト MCP— 1 s c Fvの発現と精製》
前記実施例 2、 3で単離したヒト MC P— 1に反応する 4種の s cFvクロー ン、 MC 8、 MC 15、 MC 32、 MC 59からプラスミド DNAを回収して、 常法に従つて大腸菌 H B 1251を形質転換した。 2 %グルコースを含む 2 X YT培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、 グルコースフリ一の 2 XYT培地 に一部移植し、 終濃度 ImM IPTGを加えて更に一夜培養して s c Fvの発現誘導 を行った。 培養終了後菌体を遠心回収し、 ImM EDTAを含む PBSに懸濁し て氷中に 30分菌体を放置した。 次いで 8， 900xgで 30分間遠心し、 上清を回収 して 0.45 mフィルタ一濾過後、 ペリプラズム画分からの s c F Vの精製出発材 料とした。
このようにして調製した精製の出発材料を、 抗 E t a g抗体を用いたァフィ エティ一クロマトグラフィーで常法に従って精製した。 PBSで透析後、 エンド トキシン除去カラム Detoxi- gel (PIERCE社) で添付のプロトコルに従いェンドト キシンを除去した。 分子量カット 10， 000の Centricon (Araicon社） で濃縮後、 0.45 μ mフィルタ一濾過して精製標品とした。
《実施例 6 ：精製 s c F Vのヒト MCP— 1との結合性》
次に精製 s c Fvのヒ ト MCP— 1との結合性を E L I S A法で測定した。 P BSで 0.5/ig/mLに調製したヒト MCP— 1を固相化した 96穴プレート （画
MAXIS0RP) に、 精製抗体を 100 /xL加えて 37 °Cで 1時間反応させた。 0.05% Tween-PBS (以下 P B S Tと省略することもある） で 5回洗浄後、 パーォキシダ ーゼ標識抗 E tag抗体と更に 37でで 1時間反応させた。 PBSTで 5回洗浄後、 発 色基質液を加えて呈色させ、 450nmの吸光度を測定して結合性を評価した。 結果 を図 2に示す。 4種の抗体は全て濃度依存的にヒ ト MC P— 1と結合した。 《実施例 7 ： ヒト MCP— 1の細胞遊走活性に対する作用》
ヒト MCP— 1の単球に対する遊走活性の阻害効果をケモタキシスアツセィ法 にて調べた。 24穴プレートの各穴にポアサイズ 8 /imの Transwell (Costar社） をセットする。 この 24穴プレートに 1%FCSを含む RPMI 1640 (以下 1%F 0
12
CS-RPMIと省略することもある） 培地を MO xL加えた。 次に、 濃度調製し た s c F Vと 2 X 10— 8Mのヒト MC P— 1 (CHEMICON社） を当量混合して室温で 30分インキュベーションを行い、 この反応液を 540 zLの培地を入れた 24穴プ レートに 60 /xL加えた。 &。3¾¾11の方に1 %?〇3— 1¾?1^1 IOO Lとヒト 単球系の細胞株 THP— 1の 1 X 106 cells/mL 200 を添加して、 3 7°Cで 4 時間放置した。 8 μηιのフィルターで仕切られた上方の Transwellに細胞が、 下方 の 24穴プレートに抗体の混合液が設置されることになる。 フィルターを通過し て 24穴に遊走してくる細胞をコールターカウンター （コールター社） で計測し た。 アツセィ結果を図 3に示す。 4種の抗体の中で MC 15及ぴ MC 32にはヒ ト MC P— 1の細胞遊走活性を阻害する効果が認められた。
《実施例 8 ：抗 MCP—1完全分子型ヒト抗体発現プラスミドの構築》 実施例 3で分離した s c F Vクローン MC32の s c F v DNAを組み込ん だ発現プラスミドより PCR法にて VH鎖および VL鎮領域を各々増幅した。 増 幅に用いた PC Rプライマーを以下に示す。
[VHセンス鎖]
5' -CGT GGC TCC TGG GCC CAC AGC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA- 3， く配列番号 1 1〉
[VHアンチセンス鎖]
5' -TGA GGA TAC GGT GAC CGT GG - 3' く配列番号 12 >
[VLセンス鎖]
5， -CGT GGC TCC TGG GCC CAC AGC GAC ATC CAG TTG ACC CAG TCT - 3' く配列番号 13 >
5' - ACG TTT GAT CTC CAC CTT GG- 3' く配列番号 14 >
増幅されてきた V H鎖、 V L鎖の各々の D N Aは動物細胞での分泌発現に必要 なリーダー配列を組み込んだブラスミド D N A p U C 18のリーダー配列の下 流にクローニングした。
このようにして得られたプラスミド DNAを Hindlll (タカラバイオ社） - BaraHIで 37 °Cにて 2時間消化し、 2 %ァガ口ースゲル （タ力ラバイォ社） 電気 泳動を行ってシグナル配列を含む VH鎖、 V L鎖の D N A断片を回収した。
ヒ ト抗体 H鎖遺伝子 I gGlの定常領域 （ヒンジ一 CH1— CH2— CH3) を組み込んだ発現プラスミド p CAG— Hを Hindll- BaraHIで 37°Cにて 2時間消 化してベクターの DN A断片を調製し、 この部位に先に調製した VH鎖の
Hindlll- BaraHI断片を揷入した。 大腸菌 HB 101を形質転換し、 薬剤 （アンピ シリン） 耐性のコ口ニーからプラスミドを調製して、 制限酵素処理により VH鎖 が挿入されていることを確認した。
同様に、 ヒト抗体 L鎖遺伝子 κ鎖の定常領域 (C c) を組み込んだ発現プラス ミド pCAG— Lに、 VL鎖を揷入した。
《実施例 9 ：抗 MCP— 1完全分子型ヒト抗体 MC32の動物細胞での一過性発 現と精製》
一過性発現には BMT_ 10細胞を用いた。
8 % F C S (インビトロジェン社） 入り D ' MEM (インビトロジェン社） で 維持した BMT— 10細胞を、 滅菌済み小シャーレ （直径 6 cm；コーユング 社） に、 細胞濃度を 1.5 X 105/mLに調製して 5mLずつ分注し、 炭酸ガス孵卵期で 37 °Cで一夜培養した。 PBS (SIGMA社） で細胞を 2回洗浄後、 低血清の OPT I一 MEM (インビトロジェン社） 5mLに置換した。 ポリスチレン製のディスポ 遠心管 （FALCON製） を 2本 し、 1本に 10 μ Lのリボフェクトアミン試薬 （ィン ビトロジェン社） と 90 /zLの OPT I— MEM培地を混合した （以下、 リポフエ クトァミン液） 。 もう 1本に先に調製した H鎖、 L鎖の発現プラスミド DNAを 各々 3/zg加え、 更に lOO/zLの OPT I— MEMを加えて混合した （以下、 DNA 液） 。 DNA液をリポフエクトァミン液に 1滴ずつ加えて混合し、 室温で 30分間 反応させた。 反応後の溶液を 1滴ずつ全量 (200 μ シャーレに添加し、 炭酸ガ ス孵卵期で 37°C、 6時間培養した。 6時間後に培地を吸引除去し、 8%FCS 入り D ' MEMを静かに加えて 37 °Cで 4日間培養した。 4日後に上清を回収し、 0.22 μηιフィルター濾過して精製用の出発材料とした。
Biologic Duo Flowの精製システム （BIO RAD社） 、 およびプロテイン Gカラム (フアルマシァ社） を用いて定法に従って精製した。
すなわち、 プロティン G力ラムを PBSで平後 Ϊ化後、 上記の培養上清 50mLを流速 3011560
14
ImL/分でアプライした。 ゲルべッドの 50倍量の PBSで洗浄後、 0.1Mグリシン- HC1 ρΗ2·7で溶出させた。 ΕΤフリーのデイスポーザプルチューブ （FALCON 2063等） に、 中和用としてあらかじめ 50μ1の 1M Tris-HCl pH9.0を加えておき、 これに ImLず つ溶出液を回収した。 すぐに分光光度計で各フラタションの 280nraの吸光度を測 定し、 主要なフラクションをプーノレして （通常 2mL) PBSにて 4°Cで一夜透析 した。 精製抗体の純度検定は G30◦ 0 SWカラム （トーソ一社） を用いた HP LC、 並びに SD S— PAGEで行った。 HP L Cの結果の一例を図 4に示す
(流速： 0. 5mL/分；開始バッファー： 10 OmM PB、 pH7.2 + 0. 5 M N a C 1 ) 。
《実施例 10 ：精製完全分子型 MC 32抗体の MC P— 1との結合性》
EL I S A法により精製完全分子型 MC 32抗体の MC P— 1との結合性を評 価した。 P B Sで 0.5 g/mLに調製したヒト MC P— 1 (Chemicon社） を固定化 した 96穴プレート （Maxisorp； Nunc社） を 1 %B S A/P B Sでプロッキング後 に、 精製した抗 MC P— 1完全分子型 MC 32を 5ug/mLから 1°/。BSA- 0.05%TVeen/PBSで 2倍段階希釈して用いた。 37でで 1時間反応後、
0.05%Tween/PBSで 5回洗浄して、 パーォキシダーゼ標識抗ヒト I gG抗体と更に 37 で 1時間反応させた。 P B S Tで 5回洗浄後、 発色基質 TMB Zを加えて 呈色させ、 450 nmの吸光度を測定して結合性を評価した。 結果を図 5に示す。 精製完全分子型 MC 32抗体は s c F Vと同様に濃度依存性に MC P— 1と結合 した。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ヒ卜 Monocyte chemoattractant protein— 1 (以下ヽ ヒト MCP— 1とす る） に結合し、 その生物活性を阻害するヒ ト抗ヒト MCP— 1抗体の VH鎮また はその一部をコードする遺伝子断片。
2. 当該 VH鎖の相補性決定領域 （CDR 1〜3) が下記のアミノ酸配列を有す る請求項 1に記載の遺伝子断片。
CDR 1 ： Ser Tyr Ala lie Ser く配列番号 3〉
CDR 2 ： Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly <配列番号 4>
CDR 3 : Asp Leu Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val く酉 S列番号
5 >
3. 当該 VH鎖が、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列、 または当該アミノ酸配列 において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配 列を有する請求項 1または 2に記載の遺伝子断片。
4. 当該 VH鎖が、 配列番号 2に記載のァミノ酸配列を有する請求項 3に記載の 遺伝子断片。
5. ヒト MCP—1に結合し、 その生物活性を阻害するヒト抗ヒト MCP— 1抗 体の V L鎖またはその一部をコードする遺伝子断片。
6. 当該 V L鎖の相補性決定領域 （ C D R 1〜 3 ) が下記のァミノ酸配列を有す る請求項 5に記載の遺伝子断片。
CDR 1 ： Arg Ser Ser Gin Ser He Asn Thr Tyr Leu His く配列番号 8 > CDR 2 ： Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser <配列番号 9 >
CDR 3 ： Gin Gin Ser Phe Thr Thr Pro Leu Thr く配列番号 10 >
7. 当該 V L鎖が、 配列番号 7に記載のァミノ酸配列、 または当該ァミノ酸配列 にお 、て 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配 列を有する請求項 5または 6に記載の遺伝子断片。
8. 当該 VL鎖が、 配歹【潘号 7に記載のアミノ酸配列を有する請求項 7に記載の 遺伝子断片。
9. 請求項 1から 4のいずれかに記載の VH鎖をコードする遺伝子断片及び請求 項 5から 8のいずれかに記載の VL鎖をコードする遺伝子断片を結合してなる、 ヒト MCP— 1に結合し、 その生物活性を阻害するヒト抗ヒト MCP— 1抗体の 一本鎖 Fv (以下、 s c Fvと省略する） をコードする遺伝子断片。
10. 請求項 1力 ら 4のいずれかに記載の VH鎖をコードする遺伝子断片及び請 求項 5から 8のいずれかに記載の VL鎖をコードする遺伝子断片を、 それぞれヒ ト抗体 CH鎖遺伝子及ぴヒト抗体 CL鎖遺伝子と結合してなる、 ヒト MCP— 1 に結合し、 その生物活性を阻害するヒト抗ヒト MCP—1抗体をコードする遺伝 子断片。
11. 請求項 1から 4のいずれかに記載の VH鎖をコードする遺伝子断片及び請 求項 5から 8のいずれかに記載の VL鎖をコードする遺伝子断片を、 それぞれヒ ト抗体 C H鎖遺伝子の一部及びヒト抗体 C L鎖遺伝子の一部と結合してなる、 ヒ ト MCP— 1に結合し、 その生物活性を阻害するヒト抗ヒト MCP— 1抗体フラ グメントをコ一ドする遺伝子断片。
12. 当該抗体フラグメントが、 F a b、 F a b's または F ( a b ' ) 2から選ば れる請求項 11に記載の遺伝子断片。
13. 請求項 9に記載の s c F V遺伝子断片を、 ヒト抗体 CH鎖遺伝子の一部、 またはヒト抗体 CL鎖遺伝子の一部と結合してなる、 ヒト MCP— 1に結合し、 その生物活性を阻害するヒト抗ヒト MCP— 1抗体フラグメントをコードする遺 伝子断片。
14. 請求項 1力、ら 13のいずれかに記載の遺伝子断片を発現ベクターに組込み、 遺伝子組換え法により発現される、 ヒト MC P— 1に結合し、 その生物活性を阻 害するヒト抗ヒト] ICP— 1抗体または該抗体フラグメント。
15. 請求項 14に記載のヒト抗ヒト MC P— 1抗体または該抗体フラグメント に高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子。
16. 請求項 14に記載のヒト抗ヒト MCP— 1抗体または該抗体フラグメント、 または請求項 15に記載の修飾蛋白分子を有効成分として含有するヒト MCP— 1活性阻害剤。
17. 請求項 16に記載のヒ ト MC P— 1活性阻害剤を用いるヒ ト MC P— 1に より惹起される炎症及び免疫異常性疾患の予防または治療薬。
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