WO2004020990A1 - Silikon-dichtung für mikrosonden - Google Patents
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Definitions
- the qualitative and quantitative detection of gases as well as gases and ions dissolved in liquids play an important role in science and technology.
- the currently implemented probes and sensors allow the determination of gases, ions or ions formed from gaseous substances, for example in combustion plants, in the control of exhaust gases and in numerous biological systems.
- Various measurement methods are used for substance determination, the use of a specific analysis method depending on the character and expected concentration of the substance to be determined and the place of use or measurement (macro or micro scale).
- Suitable for detection are those physical and / or chemical properties of the analyte which allow clear conclusions to be drawn about its nature and which change in proportion to its concentration.
- the measuring methods used include potentiometric and amperometric methods as well as measurements of conductivity, temperature, pressure or partial pressure, resonance frequency and magnetic susceptibility.
- the change in the properties of the analyte can be determined directly, or the analyte is converted into a secondary substance, which is then measured. In the latter case, the primary and secondary substances must have a defined mathematical relationship to one another.
- measuring devices are often used in which the actual measuring range is separated from the mixture to be examined by a semipermeable membrane.
- this membrane can only be passed by one or a few of the substances to be analyzed.
- This membrane can consist, for example, of glass, plastics / polymers or metallic compounds. Silicone membranes have long been used in measuring probes for carbon dioxide and oxygen. When used in conductive media, the high electrical resistance of silicones ensures that the electrical potential of the measurement solution does not affect the sensor circuit.
- DE 19602861 C2 describes an oxygen sensor which consists of a dialysis membrane, a silver-silver chloride anode and a cathode made of silver or platinum.
- the membrane is made from a gel that contains both a salt and an enzyme. In contrast to the present invention, it is not an electrically insulating polymer.
- DE 4013665 C2 describes oscillating quartz sensors whose resonance frequency depends on the analyte concentration in the sample liquid, whereby disturbances in the metabolism of biological samples cannot be ruled out.
- DE 69415644 T2 describes a chloride-sensitive electrode with a silicone membrane for measuring chloride ions. A micro-probe containing bacteria for determining nitrate is explained in WO 99/45376.
- DE 3813709 AI and DE 69514427 T2 describe electrodes for measuring substances in body fluids that contain a polymer layer with active enzymes.
- DE 10018750 AI describes an electrode which consists of an intrinsically conductive, polymeric contact layer and an ion-selective glass membrane.
- the measuring principle of many sensors is based on the stoichiometric conversion of a primary analyte into a secondary analyte.
- the measuring arrangement contains a circuit which is based on the concentration or activity of the Secondary analytes react and deliver a measurement signal depending on their concentration.
- the sensor circuit In the case of potentiometric probes, which must recognize measurement signals of the order of 50 ⁇ V due to the required sensitivity, the sensor circuit must be electrically isolated from the sample so that the electrical potential of the sample liquid does not falsify the measurement result. It is also advantageous to prevent the dilution of the secondary analyte by diffusion from the sensor through suitable membranes. Silicones can be chemically designed to combine electrically insulating and (gas) permeable properties.
- Another technical approach is to build up the phase boundary at the opening of the microcapillary by immersing a microcapillary that is already filled with water in a suitable silicone oil and creating a negative pressure inside the capillary.
- a suitable silicone oil According to the prior art, however, no silicone formulations which crosslink at room temperature are known, the flowability of which is large enough for a sufficient period of time that suctioning into very fine water-filled microcapillaries is successful.
- a gas microsensor with a silicone seal based on a commercially available silicone elastomer, has already been described by Hanstein et al. published (S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle, Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114).
- the probe presented there has a seal made of silicone material for dispersion coatings, which was produced in a one-step process.
- a seal made of silicone material for dispersion coatings which was produced in a one-step process.
- the previously published seal is disadvantageous because the crosslinking reaction of the silicone mixture used begins when it comes into contact with the aqueous phase and thus increases the viscosity of the silicone in such a way that only one out of four sensor tips can be successfully sealed. Further miniaturization of the probe is impossible with the previously published method.
- the manufacturing process according to the invention makes it much easier to draw in the phase boundary between the aqueous and hydrophobic phase in narrow microcapillaries or only makes it possible for very narrow microcapillaries.
- too rapid polymerisation of the liquid silicone mass is avoided.
- the length of the silicone phase in the probe tip can be reduced later if necessary.
- the decisive advantages of the manufacturing method according to the invention lie in the fact that it is associated with a manufacturing scrap that is significantly reduced compared to the prior art.
- the seal according to the invention has a higher measuring sensitivity in that a small thickness of the silicone seal can be achieved more efficiently.
- the increased measurement sensitivity results in more reproducible measurement results at lower analyte concentrations.
- the novel silicone seal according to the invention fulfills the requirements that the internal circuit of the sensor is electrically isolated from the analysis liquid or the analysis object and, at the same time, a high permeability for the one to be analyzed
- the object of the invention is to provide seals for micro probes, these seals eliminating the known disadvantages of the prior art. According to the invention, this object is achieved by seals which have a high permeability for the analyte to be measured, have electrically insulating properties and can be implemented in micro-probes. These seals preferably consist of a non-crosslinking silicone of low viscosity and a crosslinking silicone.
- the seal according to the invention is used in micro probes which can be used to analyze substances on a microscale which can permeate through the respective silicone.
- the invention allows the construction of very small, highly sensitive and selective sensors which do not impair or change the metabolism of biological samples. It is suitable for micro probes used in cell biology, e.g. for measuring the concentration of C0 and 0 2 as control variables for cellular energy metabolism and cellular uptake or for measuring the formation of C0 2 and NH 3 in infection foci on host cells or on microbial pathogens.
- By doping the electrolyte behind the silicone seal with a suitable enzyme it is possible to selectively convert a specific primary analyte from a biological sample into a secondary analyte.
- the silicone seal according to the invention in a probe in combination with the enzyme doping of the electrolyte and a suitable measuring electrode, it is possible to measure the secondary analyte by amperometric or potentiometric means.
- the seal is particularly suitable for probes with which, for example, carbon dioxide on individual stomata (stomata) of plant leaves is used as a control variable of opening and closing movements of the stomata can be measured.
- Another object of the invention is to provide a method for producing seals which are permeable to analytes, electrically insulating and can be implemented in micro-probes.
- a process for producing a silicone seal in two stages In the first step, a non-cross-linking silicone oil with low viscosity is introduced into the tip of a microsensor.
- the low viscosity allows suction through fine probe tips, for example through 2 micron narrow glass micropipettes. The suction is done with the help of an adapter.
- this non-crosslinking silicone oil is brought into contact with a crosslinking silicone, so that the crosslinking only occurs when the silicone is in the correct position within the probe tip.
- the low viscosity of the non-crosslinking silicone oil is a prerequisite for the positionability of the mixture of both silicone oils within the tip of the glass micropipette.
- the mixing of the two silicone oils on a micro scale is achieved by the diffusion movement of the silicone molecules.
- Another object of the invention is to provide a method for producing a microsensor using the seal according to the invention.
- This method is solved according to the invention by first (as described above) producing a seal according to the invention in a glass micropipette. Immediately afterwards, an enzyme-containing solution is introduced into the first glass micropipette from behind; the freshly made seal then hardens. Then a second glass micropipette with a Solution made of a proton-sensitive cocktail and PVC filled in THF. Evaporation of the solvent THF forms a solid PVC gel. The solid PVC gel is first overlaid with undiluted proton-sensitive cocktail and then with a reference buffer. Finally, a working electrode is used.
- the first glass micropipette with the silicone seal according to the invention is equipped with an electrode (reference electrode) which projects into the enzyme solution. Then the second glass micropipette prepared as described is pushed into the tip of the first glass micropipette in such a way that the second, inner micropipette protrudes at its end facing away from this tip by approximately 2.5 cm beyond the first, outer micropipette.
- the two micropipettes are attached to each other with an adhesive.
- the protruding end of the second glass micropipette is connected to a conventional electrode holder.
- the seal according to the invention is characterized in that on the one hand it electrically isolates the analyte to be determined, but on the other hand it has a high permeability for this analyte, so that the analyte can quickly pass through the membrane to the actual measuring range of a probe containing the seal.
- a non-crosslinking silicone oil 1 is poured into the container capillary 6 (see FIG. 1) and this horizontally under the lens 2 Microscope mounted.
- the glass micropipette 4 to be sealed is filled with distilled water 3 and introduced into the capillary 6.
- the adapter head 12 is placed on the other end of the glass 5 (see FIG. 3), at the end of which there is a 50 ml syringe 17.
- the rubber seal 11 is attached with the help of the sealing screw 12 at the end 5 of the glass micropipette.
- the adapter device is then clamped on the metal tube 13 in a micromanipulator.
- the metal tube 13 is connected via a plastic hose 14 and a three-way valve 15 with a 50 ml syringe 17 with a Luer lock
- the stopper is shortened to the final length of the seal by lowering the syringe plunger, excess 1 draining off.
- the surface tension between water and silicone can be reduced by adding surface-active substances (e.g. nonionic surfactants) to the water, so that an excess-free one
- the crosslinking silicone oil 8 is applied to the holder 7 and brought into contact with the glass micropipette 4, which is filled with non-crosslinking silicone oil (see FIG. 2).
- the Holder with 8 is fed to the tip 4, and 8 acts twice, preferably 45 seconds, on the non-crosslinking silicone oil 3.
- the interruption of the action prevents the crosslinking silicone oil from adhering to the outside of the glass micropipette or the non-crosslinking silicone oil being pulled out when the drop is removed from the crosslinking silicone oil.
- the glass micropipette must not protrude more than 10 ⁇ m into the cross-linking silicone oil, otherwise the probe diameter will be increased by cross-linking silicone oil.
- the filling capillary 9 with the electrolyte 18 containing enzyme is introduced into the glass micropipette 4 from behind.
- the seal then hardens for about 2-6 hours at room temperature.
- curing can also take place at 40-80 ° C in the presence of moisture, which accelerates the curing process by a few hours. Curing times of 4 hours at room temperature or 1 hour at about 60 ° C. and moist heat are particularly preferred.
- the enzyme 18 in the filling capillary 9 serves to convert a primary analyte quantitatively and stoichiometrically into a secondary analyte, which is then measured.
- a particularly suitable enzyme is, for example, carbonic anhydrase (C0 2 ).
- the enzyme can be stabilized with suitable antioxidants.
- suitable antioxidants are, for example, ascorbic acid, glutathione, rosemary acid, benzoic acid, catechins.
- Potentiometric (pH, NH 4 + ) or amperometric micro probes are used as transducers to measure the concentration of primary or secondary analyte behind the silicone seal (see S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle, Sensors and Actuators 2001 , B81, 107-114). You will from the end that is not provided with the seal, pushed into the glass micropipette 4.
- the micro-probe according to the invention is distinguished in that it realizes the advantages of the seal according to the invention in an arrangement which is so small that it can be used for the measurement of the smallest quantities of analyte and / or for measurements in the smallest space.
- the manufacture of the microsonde according to the invention is a technical development of a microsonde described in the literature (see S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle, Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114).
- a seal according to the invention is first produced as described. A proton-sensitive cocktail is then dissolved in PVC / THF and poured into a second glass micropipette (23). A solid PVC gel forms after the solvent has evaporated.
- the solid PVC gel is first overlaid with undiluted proton-sensitive cocktail 24 and then with a suitable reference buffer.
- a conventional electrode holder is used for this purpose, in which an electrode is integrated and which allows to connect the pH-sensitive microelectrode to another electrode.
- the electrode integrated in the electrode holder contains a metal and its salt, preferably a noble metal and a noble metal salt.
- a reference electrode 21 is pushed into the first glass micropipette 4.
- the pH-sensitive microelectrode 20 is then pushed into the first glass micropipette 4 and placed as close as possible to the silicone seal 22, approximately 20 ⁇ m from the tip opening removed.
- the two glass micropipettes are immediately attached to one another with adhesive 19, leaving about 2.5 cm of the end of the pH-sensitive microelectrode 20 facing away from the seal.
- This end 25 is inserted into a conventional electrode holder.
- Dow Corning Product 200 Fluid with a viscosity of 0.1 Stokes (25 ° C) and an activity of 100% was used as the non-crosslinking silicone oil.
- the container capillary used had an inner diameter of 2 mm.
- the glass micropipette to be sealed was filled with 1 ⁇ sterile distilled water before the seal was made.
- Dow Corning Product (R) 1340 RTV Coating was used as the cross-linking silicone oil.
- mixtures of a silanol with a viscosity of 50-120 cSt e.g. Dow Corning product DC 2-1273
- a silanol with a viscosity of 2,000 cSt e.g. Dow Corning product DC 3-0133, each mixed with 5-10 wt .-% methyltrimethoxysiloxane, can be used.
- the seal and micro probe are made as described above.
- Glass micropipette 4 and filling capillary with enzyme electrolyte 9 consist of glass, preferably borosilicate glass (for example from Hilgenberg GmbH, Malsdorf, Germany) and are filled with a solution of 0.2% before the seal is manufactured.
- Tributylchlorosilane in chloroform silanized by methods known to those skilled in the art.
- a carbonic anhydrase solution is filled into the filling capillary 9.
- a 1% stock solution of chloramphenicol in ethanol and a buffer solution of 1 mM NaHC0 3 and 100 mM NaCl (pH 8.3) are first prepared.
- the enzyme solution is then prepared from 0.4 ml of the NaHC0 3 buffer solution described, 3 mg of lyophilized carbonic anhydrase and 2 ⁇ l of chloramphenicol stock solution and immediately for the
- the carbonic anhydrase solution was stabilized with an oxidizing agent, preferably with 5 mM ascorbic acid, before filling.
- Another glass micropipette (outer diameter 1 mm, inner diameter 0.6 mm) made of borosilicate glass is silanized as described above.
- a proton-sensitive hydrophobic cocktail known to the person skilled in the art preferably Fluka product # 95297, hydrogen ionophore II-Cocktail A, Selectophore " , is dissolved in a mixture of 40 mg PVC / ml THF in a ratio of 30:70 (V / V)
- This (hydrophobic) solution is filled into the second glass micropipette from behind using a filling capillary, and the (hydrophobic) solution collects in the
- Morpholino-] ethanesulfonic acid is adjusted to pH 8.3 with a solution of 100 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, then 100 mM KC1 are added.
- a silver-silver chloride electrode is used as the reference electrode (installation in the first glass micropipette). Production: approx. 1 mm of the Teflon coating of a Teflon-coated silver wire is removed and the bare silver tip is chloridated for 3 minutes at 300 ⁇ A in a 3M KCl solution.
- the assembly was carried out as described.
- the two glass micropipettes are immediately attached to one another with adhesive, preferably a commercially available cyanoacrylate adhesive (eg Tesa " superglue, Beiersdorf AG, Hamburg, Germany).
- adhesive preferably a commercially available cyanoacrylate adhesive (eg Tesa " superglue, Beiersdorf AG, Hamburg, Germany).
- the free end of the second glass micropipette facing away from the silicone seal is then inserted into a conventional electrode holder.
- This electrode holder contains an Ag-AgCl plate encased in plastic, which serves as a reference electrode.
- the area of the outer glass micropipette in which the chlorinated tip of the silver electrode is located is provided with a 5 mm wide ring made of acrylic paint, since the electrical potential at the Ag / AgCl electrode is light-sensitive.
- Silicone oil (8) is applied to the holder (7) and brought into contact with the glass micropipette (4). After the glass micropipette (4) has been pulled out of the non-crosslinking silicone oil (8), the filling capillary with the enzyme-containing electrolyte (9) is inserted into the glass micropipette (4) from behind.
- the adapter for sucking non-crosslinking silicone oil (1) into the tip of a glass micropipette (4).
- the adapter consists of a sealing screw (10), rubber seal (11), adapter head (12), a metal tube (13) for clamping the adapter in the micromanipulator and a plastic tube (14).
- FIG. 4 Schematic representation of the finished micro-probe:
- the micro-probe consists of two concentric glass micropipettes (4 and 23) pushed into each other, which are attached to each other with an adhesive (19).
- the inner glass micropipette (23) contains a proton sensitive cocktail (24).
- Inner glass micropipette, proton-sensitive cocktail covered with reference buffer and working electrode together form the pH-sensitive microelectrode (20).
- the electrode used is preferably an electrode which is integrated in a conventional electrode holder.
- the pH-sensitive microelectrode (20) is positioned in the tip of the outer glass micropipette (4).
- the tip of the pH-sensitive microelectrode (20) is located about 20 ⁇ m behind the tip of the outer glass micropipette (4), which is closed with a silicone seal (22) produced by the method according to the invention.
- the space between the outer glass micropipette (4) and the pH-sensitive microelectrode (20) is filled with an enzyme solution (18).
- a reference electrode (21) connects the enzyme solution to the earth.
- the rear end (25) of the pH-sensitive microelectrode is connected to a conventional electrode holder.
- FIG. 5 Schematic representation of the tip of the finished microprobe:
- first glass micropipette (4) is the silicone seal (22) produced by the method according to the invention.
- the space behind this silicone seal (22) is filled with enzyme electrolyte (18).
- the tip of the second glass micropipette (23) is pushed into the tip of the first glass micropipette (4).
- a proton-selective cocktail (24) is located in the tip of the second glass micropipette (23).
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Abstract
Die Erfindung betrifft Silikon-Dichtungen zur Messung von Gaskonzentrationen, Verfahren zur Herstellung dieser Dichtungen und Verfahren zur Herstellung von Mikrosonden unter Verwendung dieser Dichtungen. Die Dichtungen weisen eine hohe Permeabilität für den Analyten auf, sind elektrisch isolierend und können in Mikrosonden realisiert werden. Die erfindungsgemässen Mikrosonden sind besonders geeignet für phytophysiologische Messungen und können beispielsweise für die hoch auflösende Messung von Gasen an einzelnen Stomata von Pflanzenblättern verwendet werden.
Description
Patentanmeldung
Silikon-Dichtung für Mikrosonden
Der qualitative und quantitative Nachweis von Gasen sowie in Flüssigkeiten gelösten Gasen und Ionen spielt in Wissenschaft und Technik eine große Rolle. Die derzeit realisierten Sonden und Sensoren erlauben die Bestimmung von Gasen, Ionen oder aus gasförmigen Stoffen gebildeten Ionen beispielsweise in Verbrennungsanlagen, bei der Kontrolle von Abgasen und in zahlreichen biologischen Systemen. Dabei kommen verschiedene Messverfahren für die Substanzbestimmung zum Einsatz, wobei die Verwendung eines bestimmten Analyseverfahrens von Charakter und voraussichtlicher Konzentration des zu bestimmenden Stoffes und dem Einsatz- bzw. Messort (Makro- oder Mikromaß- stab) abhängt .
Zur Detektion geeignet sind solche physikalischen und / oder chemischen Eigenschaften des Analyten, die eindeutige Rückschlüsse auf seine Natur zulassen und die sich proportional zu seiner Konzentration verändern. Zu den eingesetzten Messverfahren zählen potentiometrische und amperometrische Verfahren sowie Messungen von Leitfähigkeit, Temperatur, Druck bzw. Partialdruck, Resonanzfrequenz und magnetischer Suszep- tibilität. Je nach Messanordnung und Natur des Analyten und der Messeinrichtung kann die Änderung der Eigenschaften des Analyten (Primärsubstanz) direkt bestimmt werden, oder der Analyt wird in eine Sekundärsubstanz überführt, welche dann gemessen wird. Im letztgenannten Fall müssen Primär- und Sekundärsubstanz in einem definierten mathematischen Verhält- nis zueinander stehen.
Um Analyten auch in Substanzgemischen bestimmen zu können, werden häufig Messapparaturen eingesetzt, bei denen der eigentliche Messbereich durch eine semipermeable Membran vom zu untersuchenden Gemisch getrennt ist. Im Idealfall kann
diese Membran nur von einem oder wenigen der zu analysierenden Stoffe passiert werden. Diese Membran kann beispielsweise aus Glas, Kunststoffen / Polymeren oder metallischen Verbindungen bestehen. Silikonmembranen sind seit langem im Einsatz in Messsonden für Kohlendioxid und Sauerstoff. Der hohe elektrische Widerstand von Silikonen gewährleistet bei Benutzung in leitenden Medien, dass das elektrische Potenzial der Messlösung nicht den Sensorstromkreis beeinflusst.
Beschreibung und Stand der Technik
Derzeit sind verschiedene Elektroden und Sensoren bekannt, mit denen gasförmige Stoffe oder in Flüssigkeit gelöste Gase und Ionen bestimmt werden können. Dabei werden verschiedene chemische und physikalische Parameter genutzt, um die zu bestimmenden Analyten ggf. auch in Substanzgemischen zu identifizieren. Viele Messmethoden bedienen sich verschiedener Elektroden aus Edelmetallen und ihren Salzen. Das Salz kann dabei je nach Ausführung der Elektrode in gelöster oder fester Form vorliegen. Die Detektion des Analyten kann beispielsweise durch amperometrische oder potentiometrische Messung erfolgen. Nachteilig für die Messung sehr kleiner oder sich rasch ändernder Analytkonzentrationen sind die meist zu hohe Nachweisgrenze des Sensors, eine zu geringe Selektivität für einen bestimmten Analyten in einem Gemisch sowie der Zeitbedarf bis zum Erhalt des Messsignals. Allen Messanordnungen ist gemein, dass sich zwischen dem Messmedium und dem Detektionssystem eine semipermeable Mem- bran befindet, die nur für den Analyten oder das Gemisch der zu analysierenden Substanzen durchlässig ist, um auf diese Weise die Selektivität der Messung zu erhöhen. Die DE 19921532 AI, DE 96402705 T2 , DE 69031901 T2 , DE 19914628 AI und WO 97/46853 beschreiben Sensoren, die Gase
amperometrisch, potentiometrisch oder über Partialdruck, Temperatur, elektrische und Wärmeleitfähigkeit bzw. Adsorption bestimmen. Sauerstoff lässt sich nach DE 3541341 C2 durch Messung der 02-abhängigen Änderung der magnetischen Suszepti- bilität messen. Die DE 19602861 C2 beschreibt einen Sauerstoffsensor, der aus einer Dialysemembran, einer Silber- Silberchlorid-Anode und einer Kathode aus Silber oder Platin besteht. Die Membran wird aus einem Gel hergestellt, das sowohl ein Salz als auch ein Enzym enthält. Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung handelt es sich nicht um ein elektrisch isolierendes Polymer.
Es existieren zahlreiche Veröffentlichungen zur Messung von Ionen in biologischen Proben: Die DE 4013665 C2 beschreibt Schwingquarzsensoren, deren Resonanzfrequenz von der Analyt- konzentration in der Probenflüssigkeit abhängt, wobei Störungen des Stoffwechsels biologischer Proben nicht auszuschließen sind. In DE 69415644 T2 ist eine chloridsensitive Elektrode mit einer Silikonmembran zur Messung von Chloridionen beschrieben. Eine Bakterien enthaltende Mikrosonde zur Be- Stimmung von Nitrat ist in WO 99/45376 erläutert. Die DE 3813709 AI und DE 69514427 T2 beschreiben Elektroden zur Messung von Substanzen in Körperflüssigkeiten, die eine Polymerschicht mit aktiven Enzymen enthalten. In DE 10018750 AI wird eine Elektrode beschrieben, die aus einer intrinsisch leitfähigen, polymeren Kontaktschicht und einer ionenselektiven Glasmembran bestehen.
Alle genannten Elektroden und Sensoren sind jedoch nicht für die Messung kleinster Konzentrationen oder Volumina in biologischen Proben geeignet.
Das Messprinzip vieler Sensoren beruht auf einer stöchio- metrischen Umsetzung eines Primäranalyten zu einem Sekundär- analyten. In vielen Fällen enthält die Messanordnung einen Stromkreis, der auf die Konzentration bzw. Aktivität des
Sekundäranalyten reagiert und ein von dessen Konzentration abhängiges Messsignal liefert. Bei potentiometrischen Sonden, die auf Grund der erforderlichen Messempfindlichkeit Messsignale in der Größenordnung von 50 μV erkennen müssen, muss der Stromkreis des Sensors von der Probe elektrisch isoliert sein, damit das elektrische Potenzial der Probenflüssigkeit nicht das Messergebnis verfälscht. Vorteilhaft ist weiterhin, die Verdünnung des Sekundäranalyten durch Diffusion aus dem Sensor durch geeignete Membranen zu unterbinden. Silikone können chemisch so beschaffen sein, dass sie elektrisch isolierende und (gas-)permeable Eigenschaften vereinen.
Die bisher genannten Erfindungen weisen Membranen mit perme- ablen, aber nicht elektrisch isolierenden Eigenschaften auf. Dagegen beschreiben die DE 69519698 T2 härtbare Silikonzusammensetzungen für Trennüberzüge, die jedoch nicht gaspermeabel sind, und in der DE 4118667 AI ist ein Ableitelement für potentiometrische Messketten dargestellt, das aus gas- und flüssigkeitsdichten Silikonklebern und Vergussmassen hergestellt wird. Bei den beiden letztgenannten Erfindungen ist die beschriebene Dichtung zwar elektrisch isolierend, aber nicht für Analyten permeabel .
Semipermeable Membranen in den bisher genannten Erfindungen können nicht zur dauerhaften elektrischen Isolierung einer Elektrolytlösung in Mikrokapillaren verwendet werden. Keine der aufgeführten Erfindungen vereint elektrisch isolierende mit semipermeablen Eigenschaften in einer Mikrosonde. Diese Kombination ist jedoch zwingend notwendig, um mit hoch empfindlichen potentiometrischen Mikrosonden kleinste Analytkon- zentrationen im Mikromaßstab zu messen, ohne dabei das die Sonde umgebende System zu stören oder zu verändern.
Zur Erzielung mechanisch stabiler Silikondichtungen muss ein ausreichender Vernetzungsgrad der Silikonbestandteile gewährleistet sein. In der Elektronik sind Silikone üblich, deren Vernetzung bei Raumtemperatur in Anwesenheit von Luftfeuch- tigkeit abläuft (z.B. Dow Corning* RTV 3140). Deren Fließfähigkeit ist für ein Eindringen in trockene Mikrokapillaren ausreichend. Es ist jedoch auf Grund der hohen Grenzflächenspannung zwischen Silikon- und wässriger Phase technisch sehr schwierig, innerhalb sehr enger Mikrokapillaren eine entspre- chende Grenzfläche aufzubauen, da dies energetisch ungünstig ist. Die wässrige Phase muss von innen mit Hilfe noch engerer Füllkapillaren direkt an die Dichtung gespritzt werden. Allein zum Ausstoßen des Wassers aus den Füllkapillaren ist ein hoher Injektionsdruck erforderlich. Der Energieaufwand steigt noch durch die aufzubauende hohe Grenzflächenspannung. Entsprechend dem energetisch günstigeren Zustand verbleibt oft Luft zwischen hydrophober und wässriger Phase. Ein anderer technischer Ansatz besteht darin, die Phasengrenze bereits an der Öffnung der Mikrokapillare aufzubauen, indem eine bereits mit Wasser gefüllte Mikrokapillare in ein geeignetes Silikonöl getaucht wird und im Inneren der Kapillare ein Unterdruck erzeugt wird. Nach dem bisherigen Stand der Technik sind allerdings keine bei Raumtemperatur vernetzenden Silikonformulierungen bekannt, deren Fließfähigkeit für eine ausreichende Zeitspanne groß genug ist, dass das Einsaugen in sehr feine wassergefüllte Mikrokapillaren gelingt. Eine Gas-Mikrosonde mit Silikondichtung, basierend auf einem handelsüblichen Silikonelastomer, wurde bereits von Hanstein et al . publiziert (S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle, Sensors and Actuators 2001, B81 , 107-114) . Die dort vorgestellte Sonde besitzt eine Dichtung aus Silikonmasse für Dispersionsüberzüge, die in einem einstufigen Prozess hergestellt wurde. Gegenüber der hier vorliegenden erfindungsgemäßen Silikondichtung und dem erfindungsgemäßen Herstellungs-
verfahren ist die bereits publizierte Dichtung unvorteilhaft, denn die Vernetzungsreaktion der verwendeten Silikonmischung setzt bereits bei Kontakt mit der wässrigen Phase ein und erhöht somit die Viskosität des Silikons derart, dass nur höchstens eine von vier Sensorspitzen erfolgreich abgedichtet werden kann. Eine weitere Miniaturisierung der Sonde ist mit dem bereits publizierten Verfahren unmöglich.
Das erfindungsgemäße zweistufige Herstellungsverfahren für Silikondichtungen zeichnet sich gegenüber dem Stand der
Technik dadurch aus, dass sie das Einziehen der Phasengrenze zwischen wässriger und hydrophober Phase in engen Mikrokapillaren entscheidend erleichtert bzw. bei sehr engen Mikrokapillaren erst ermöglicht. Bei dem erfindungsgemäßen Herstel- lungsverfahren wird ein zu schnelles Auspolymerisieren der flüssigen Silikonmasse vermieden. Die Länge der in der Sondenspitze befindlichen Silikonphase lässt sich bei Bedarf nachträglich noch verringern. Entscheidende Vorteile des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens liegen darin begrün- det, dass es mit einem gegenüber dem Stand der Technik deutlich verminderten Fertigungsausschuss verbunden ist. Des weiteren weist die erfindungsgemäße Dichtung dadurch eine höhere Messempfindlichkeit auf, dass eine geringe Dicke der Silikondichtung effizienter erzielt werden kann. Die erhöhte Messempfindlichkeit bedingt bei niedrigeren Analytkonzentra- tionen besser reproduzierbare Messergebnisse. Die erfindungsgemäße neuartige Silikondichtung erfüllt die Voraussetzungen, dass der interne Stromkreis des Sensors elektrisch von der Analyseflüssigkeit bzw. dem Analyseobjekt isoliert wird und gleichzeitig eine hohe Permeabilität für die zu analysierende
Substanz gewährleistet ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, Dichtungen für Mikrosonden bereitzustellen, wobei diese Dichtungen die bekannten Nachteile des Standes der Technik ausschalten. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Dichtungen, die eine hohe Permeabilität für den zu messenden Analyten aufweisen, elektrisch isolierende Eigenschaften aufweisen und in Mikrosonden realisiert werden können. Bevorzugt bestehen diese Dichtungen aus einem nicht vernetzenden Silikon geringer Viskosität und einem vernetzenden Silikon.
Die erfindungsgemäße Dichtung findet Anwendung in Mikrosonden, mit deren Hilfe Substanzen im Mikromaßstab analysiert werden können, die durch das jeweilige Silikon permeieren können. Die Erfindung gestattet die Konstruktion sehr klei- ner, hoch empfindlicher und selektiver Sensoren, welche den Stoffwechsel biologischer Proben nicht beeinträchtigen oder verändern. Sie ist geeignet für Mikrosonden, die im zellbiologischen Bereich zum Einsatz kommen, z.B. zur Messung der Konzentration von C0 und 02 als Steuergrößen des zellulären Energiestoffwechsels und der zellulären Stoffaufnähme oder zur Messung der Bildung von C02 und NH3 in Infektionsherden an Wirtszellen oder an mikrobiellen Pathogenen. Durch Dotieren des Elektrolyten hinter der Silikondichtung mit einem geeigneten Enzym ist es möglich, einen bestimmten Primaranalyten aus einer biologischen Probe selektiv zu einem Sekundäranalyten umzusetzen. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Silikondichtung in einer Sonde in Kombination mit der Enzymdotierung des Elektrolyten und einer geeigneten Messelektrode ist es möglich, den Sekundäranalyten amperometrisch oder potentiometrisch zu messen.
Konstruktionsbedingt eignet sich die Dichtung besonders für Sonden, mit denen beispielsweise Kohlendioxid an einzelnen Stomata (Spaltöffnungen) von Pflanzenblättern als Steuergröße
von Öffnungs- und Schließbewegungen der Stomata gemessen werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Dichtungen bereitzustellen, die für Analyten permeabel, elektrisch isolierend und in Mikrosonden realisierbar sind.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren, eine Silikondichtung in zwei Stufen herzustellen. Dabei wird im ersten Schritt ein nicht vernetzendes Silikonöl mit niedriger Viskosität in die Spitze einer Mikrosonde eingebracht. Die niedrige Viskosität erlaubt ein Einsaugen durch feine Sondenspitzen, beispielsweise durch 2 μm enge Glas- Mikropipetten. Das Einsaugen geschieht mit Hilfe eines Adap- ters . Im zweiten Schritt wird dieses nicht vernetzende Silikonöl mit einem vernetzenden Silikon in Kontakt gebracht, so dass die Vernetzung erst dann eintritt, wenn sich das Silikon in der korrekten Position innerhalb der Sondenspitze befindet. Die niedrige Viskosität des nicht vernetzenden Silikon- öls ist Voraussetzung für die Platzierbarkeit des Gemisches aus beiden Silikonölen innerhalb der Spitze der Glas- Mikropipette. Die Vermischung der beiden Silikonöle im MikroMaßstab wird durch die Diffusionsbewegung der Silikonmoleküle geleistet .
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer Mikrosonde unter Verwendung der erfindungsgemäßen Dichtung bereitzustellen. Dieses Verfahren wird erfindungsgemäß gelöst, indem zunächst (wie oben beschrieben) eine erfindungsgemäße Dichtung in einer Glas-Mikropipette hergestellt wird. Unmittelbar danach wird von hinten eine enzymhaltige Lösung in die erste Glas-Mikropipette eingebracht; anschließend härtet die frisch hergestellte Dichtung aus. Danach wird eine zweite Glas-Mikropipette mit einer
Lösung aus einem Protonen-sensitiven Cocktail und PVC in THF befüllt. Durch Verdampfen des Lösungsmittels THF bildet sich ein festes PVC-Gel. Das feste PVC-Gel wird zunächst mit unverdünntem Protonen-sensitivem Cocktail und dann mit einem Referenzpuffer überschichtet. Zuletzt wird eine Arbeitselektrode eingesetzt. Die erste Glas-Mikropipette mit der erfindungsgemäßen Silikondichtung wird mit einer Elektrode bestückt (Referenzelektrode) , die in die Enzymlösung hinein ragt . Danach wird die wie beschrieben vorbereitete zweite Glas-Mikropipette so in die Spitze der erste Glas- Mikropipette geschoben, dass die zweite, innere Mikropipette an ihrem dieser Spitze abgewandten Ende um etwa 2,5 cm über die erste, äußere Mikropipette hinausragt. Die beiden Mikro- pipetten werden mit einem Kleber aneinander befestigt. Das herausragende Ende der zweiten Glas-Mikropipette wird mit einem konventionellen Elektrodenhalter verbunden.
Der Stand der Technik kennt zahlreiche Verfahren, um permeab- le Membranen, Dichtungen und Isolatorschichten aus silikon- haltigern Material herzustellen. Die dem Fachmann bekannten
Verfahren sind jedoch nicht geeignet, eine wässrige Phase elektrisch dichtend innerhalb einer Mikrosonde zu überschichten, deren Spitzendurchmesser in der Größenordnung von 2 μm oder darunter liegt. Die erfindungsgemäße Dichtung zeichnet sich dadurch aus, dass sie den zu bestimmenden Analyten einerseits elektrisch isolieren, andererseits jedoch eine hohe Permeabilität für diesen Analyten aufweisen, so dass der Analyt rasch durch die Membran hindurch zum eigentlichen Messbereich einer die Dichtung enthaltenden Sonde gelangen kann.
Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Silikondichtungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein nicht vernetzendes Silikonöl 1 in die Behälter-Kapillare 6 eingefüllt (siehe Fig. 1) und diese waagerecht unter dem Objektiv 2 eines
Mikroskops montiert. Die abzudichtende Glas-Mikropipette 4 wird mit destilliertem Wasser 3 gefüllt und in die Kapillare 6 eingeführt . Am anderen Ende des Glases 5 wird der Adapterkopf 12 aufgesetzt (siehe Fig. 3), an dessen Ende sich eine 50 ml-Spritze 17 befindet. Die Gummidichtung 11 wird mit Hilfe der Dichtungsschraube 12 am Ende 5 der Glas-Mikropipette befestigt. Anschließend wird die Adaptervorrichtung am Metallrohr 13 in einem Mikromanipulator eingespannt. Das Metallrohr 13 ist über einen Kunststoffschlauch 14 und einen Dreiwegehahn 15 mit einer 50 ml Spritze 17 mit Luerlock-
Anschluss verbunden. Durch Schließen des Dreiwegehahns 15 und Kolbenhub der Spritze 17 wird ein Unterdruck erzeugt und unter mikroskopischer Kontrolle nicht vernetzendes Silikon 1 in die Glas-Mikropipette 4 eingesaugt. Da die Grenzflächen- Spannung zwischen Silikonphase und wässriger Phase in der Spitze 4 überwunden werden muss, geschieht dies ruckartig. Dabei wird die notwendige scharfe Phasengrenze ohne Ausbuchtungen nur dann erzielt, wenn die wässrige Phase proteinfrei ist. Überschüssiges Silikon wird in zwei Schritten aus der Spitze herausgedrückt: Zuerst wird der Spritzenkolben so weit gesenkt, bis der Stopfen maximal fünf Mal so lang ist, wie er in der endgültigen Dichtung sein soll. Anschließend werden Glas-Mikropipette 4, Adapter und Spritze aus der Behälter- Kapillare 6 entfernt. Die Verkürzung des Stopfens auf die endgültige Länge der Dichtung wird durch Senken des Spritzenkolbens vorgenommen, wobei überschüssiges 1 abläuft. Alternativ zu dem hier beschriebenen Einsaugverfahren kann durch Zusatz oberflächenaktiver Substanzen (z.B. nichtionische Tenside) zum Wasser die Grenzflächenspannung zwischen Wasser und Silikon herabgesetzt werden, so dass ein überschussfreies
Einsaugen des Silikons in die Spitze möglich ist. Das vernetzende Silikonöl 8 wird auf den Halter 7 aufgetragen und in Kontakt mit der Glas-Mikropipette 4 gebracht, die mit nicht vernetzendem Silikonöl befüllt ist (siehe Fig. 2) . Der
Halter mit 8 wird auf die Spitze 4 zugeführt, und 8 wirkt zwei Mal vorzugsweise 45 Sekunden auf das nicht vernetzende Silikonöl 3 ein. Die Unterbrechung der Einwirkung verhindert die Haftung des vernetzenden Silikonöls an der Außenseite der Glas-Mikropipette bzw. das Herausziehen des nicht vernetzenden Silikonöls beim Entfernen des Tropfens aus vernetzendem Silikonöl. Die Glas-Mikropipette darf nicht weiter als 10 μm in das vernetzende Silikonöl hinein ragen, da sonst der Sondendurchmesser durch außen anhaftendes vernetzendes Sili- konöl erhöht wird. Nach Herausziehen der Glas-Mikropipette 4 aus dem nicht vernetzenden Silikon 8 wird die Füllkapillare 9 mit enzymhaltigem Elektrolyt 18 von hinten in die Glas- Mikropipette 4 eingebracht. Anschließend härtet die Dichtung für etwa 2-6 Stunden bei Raumtemperatur aus. Alternativ kann das Aushärten auch bei 40-80 °C in Anwesenheit von Feuchtigkeit erfolgen, was den Aushärteprozess um einige Stunden beschleunigt. Besonders bevorzugt sind Aushärtezeiten von 4 Stunden bei Raumtemperatur bzw. 1 Stunde bei etwa 60 °C und feuchter Wärme .
Das Enzym 18 in der Füllkapillare 9 dient dazu, einen Primaranalyten quantitativ und stöchiometrisch in einen Sekundäranalyten umzusetzen, welcher anschließend gemessen wird. Ein besonders geeignetes Enzym ist beispielsweise Carboanhydrase (C02) .
Das Enzym kann mit geeigneten Oxidationsschutzmitteln stabilisiert werden. Geeignete Oxidationsschutzmittel sind beispielsweise Ascorbinsäure, Glutathion, Rosmarinsäure, Benzoe- säure, Catechine . Als Transducer zur Messung der Konzentration von Primär- oder Sekundäranalyt hinter der Silikondichtung kommen potentiomet- rische (pH, NH4 +) oder amperometrische Mikrosonden zum Einsatz (vgl. S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle, Sensors and Actuators 2001, B81 , 107-114) . Sie werden von dem Ende her,
das nicht mit der Dichtung versehen ist, in die Glas- Mikropipette 4 geschoben.
Die erfindungsgemäße Mikrosonde zeichnet sich dadurch aus, dass sie die Vorteile der erfindungsgemäßen Dichtung in einer Anordnung realisiert, die so klein ist, dass sie für die Messung kleinster Analytmengen und / oder für Messungen auf kleinstem Raum verwendet werden kann. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrosonde ist eine technische Weiterentwicklung einer in der Literatur beschriebenen Mikrosonde (vgl. S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle, Sensors and Actuators 2001, B81 , 107-114) . Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mikrosonden wird zu- nächst eine erfindungsgemäße Dichtung wie beschrieben hergestellt. Anschließend wird ein Protonen-sensitiver Cocktail in PVC / THF gelöst und in eine zweite Glas-Mikropipette (23) eingefüllt. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bildet sich ein festes PVC-Gel. Das feste PVC-Gel wird zunächst mit unverdünntem Protonen-sensitivem Cocktail 24 und dann mit einem geeigneten Referenzpuffer überschichtet. Die zweite Glas-Mikropipette 23, der Protonen-sensitive Cocktail 24 und der Referenzpuffer bilden gemeinsam mit einer einzubauenden Arbeitselektrode die pH-sensitive Mikroelektrode 20. Vorteil- haft wird hierfür ein konventioneller Elektrodenhalter verwendet, in den eine Elektrode integriert ist und der es gestattet, die pH-sensitive Mikroelektrode mit einer weiteren Elektrode zu verbinden. Die in den Elektrodenhalter integrierte Elektrode enthält ein Metall und dessen Salz, bevor- zugt ein Edelmetall und ein Edelmetallsalz.
In die erste Glas-Mikropipette 4 wird eine Referenzelektrode 21 geschoben. Danach wird die pH-sensitive Mikroelektrode 20 in die erste Glas-Mikropipette 4 geschoben und so nahe wie möglich an der Silikondichtung 22 platziert, etwa 20 μm von
der Spitzenδffnung entfernt. Die beiden Glas-Mikropipetten werden sofort mit Kleber 19 aneinander befestigt, wobei etwa 2,5 cm des der Dichtung abwandten Endes der pH-sensitiven Mikroelektrode 20 frei bleiben. Dieses Ende 25 wird in einen konventionellen Elektrodenhalter eingeführt.
Ausführungsbeispiele
1. Verfahren zur Herstellung der Dichtung
Als nicht vernetzendes Silikonöl wurde Dow Corning Produkt 200 (R) Fluid mit einer Viskosität von 0,1 Stokes (25 °C) und einer Aktivität von 100 % eingesetzt. Die verwendete Behäl- terkapillare hatte einen Innendurchmesser von 2 mm. Die abzudichtende Glas-Mikropipette wurde vor Herstellung der Dichtung mit 1 μ sterilem destilliertem Wasser gefüllt. Als vernetzendes Silikonöl diente Dow Corning Produkt (R) 1340 RTV Coating. Alternativ können als vernetzendes Silikonöl auch Gemische aus einem Silanol mit einer Viskosität von 50-120 cSt, z.B. Dow Corning Produkt DC 2-1273, oder einem Silanol mit einer Viskosität von 2.000 cSt, z.B. Dow Corning Produkt DC 3-0133, jeweils gemischt mit 5-10 Gew.-% Methyltrimethoxysiloxan, eingesetzt werden.
2. Verfahren zur Benutzung der Dichtung in einer Mikrosonde und Herstellung der Mikrosonde Die Dichtung und die Mikrosonde werden wie oben beschrieben hergestellt. Glas-Mikropipette 4 und Füllkapillare mit Enzymelektrolyt 9 bestehen aus Glas, vorzugsweise Borosilikatglas (z.B. von Fa. Hilgenberg GmbH, Malsdorf, Deutschland) und werden vor Herstellung der Dichtung mit einer Lösung von 0,2%
Tributylchlorsilan in Chloroform nach dem Fachmann bekannten Verfahren silanisiert.
Um die Dichtung in einem Sensor zur C02-Messung zu verwenden, wird in die Füllkapillare 9 eine Carboanhydrase-Lösung einge- füllt. Hierzu werden zunächst eine 1%-ige Stocklösung von Chloramphenicol in Ethanol und eine Pufferlösung aus 1 mM NaHC03 und 100 mM NaCl (pH 8,3) hergestellt. Die Enzymlösung wird anschließend aus 0,4 ml der beschriebenen NaHC03- Pufferlösung, 3 mg lyophilisierter Carboanhydrase und 2 μl Chloramphenicol-Stocklösung angesetzt und sofort für die
Befüllung der Füllkapillare verwendet. Die Carboanhydraselö- sung wurde vor dem Einfüllen mit einem Oxidationsmittel stabilisiert, bevorzugt mit 5 mM Ascorbinsäure .
Um die Dichtung in einem C02-Mikrosensor zu verwenden, wird eine weitere Glas-Mikropipette (Außendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser 0,6 mm) aus Borosilikatglas wie oben beschrieben silanisiert. Ein dem Fachmann bekannter Protonen-sensitiver hydrophober Cocktail, bevorzugt Fluka Produkt #95297, Hydro- gen ionophore Il-Cocktail A, Selectophore", wird in einem Gemisch aus 40 mg PVC / ml THF im Verhältnis 30:70 (V/V) gelöst. Diese (hydrophobe) Lösung wird mit Hilfe einer Füllkapillare von hinten in die zweite Glas-Mikropipette eingefüllt. Durch die Verwendung einer silanisierten Glas- Mikropipette sammelt sich die (hydrophobe) Lösung in der
Spitze der Glas-Mikropipette, ohne aus dieser hinauszulaufen. Das THF wird im Vakuum abgezogen, wodurch sich ein festes PVC-Gel bildet. Das feste PVC-Gel wird zunächst mit unverdünntem Protonen-sensitivem Cocktail überschichtet, anschlie- ßend mit Referenzpuffer. Referenzpuffer: 100 mM 2- [N-
Morpholino-] ethansulfonsäure wird mit einer Lösung von 100 mM Tris (hydroxymethyl) -aminomethan auf pH 8,3 eingestellt, dann werden 100 mM KC1 hinzugefügt.
Als Referenzelektrode (Einbau in die erste Glas-Mikropipette) wird eine Silber-Silberchlorid-Elektrode verwendet. Herstellung: Ca. 1 mm der Teflonbeschichtung eines Teflonbeschichteten Silberdrahtes werden abgelöst und die blanke Silberspitze 3 Minuten bei 300 μA in einer 3M KCl-Lösung chloridiert .
Der Zusammenbau erfolgte wie beschrieben. Die beiden Glas- Mikropipetten werden sofort mit Kleber, vorzugsweise einem handelsüblichen Cyanacrylatkleber (z.B. Tesa" Sekundenkleber, Beiersdorf AG, Hamburg, Deutschland) aneinander befestigt. Das freie, der Silikondichtung abgewandte Ende der zweiten Glas-Mikropipette wird anschließend in einen konventionellen Elektrodenhalter eingeführt. Dieser Elektrodenhalter enthält ein in Kunststoff gefasstes Ag-AgCl-Plättchen, das als Refe- renzelektrode dient .
Derjenige Bereich der äußeren Glas-Mikropipette, in dem sich die chloridierte Spitze der Silberelektrode befindet, wird mit einem 5 mm breiten Ring aus Acrylfarbe versehen, da das elektrische Potential an der Ag/AgCl-Elektrode lichtsensitiv ist .
Bezugszeichenliste
Im Folgenden sind 5 Zeichnungen aufgeführt ,
1 . nicht vernetzendes Silikon
2 . Obj ektiv des Mikroskops
3 . destilliertes Wasser
4 . erste Glas-Mikropipette (äußere Pipette)
5 . Stelle zum Ansetzen des Adapters 6 . Behälter-Kapillare
7 . Halter
8. vernetzendes Silikon
9. Füllkapillare mit Enzymelektrolyt
10. Dichtungsschraube 11. Gummidichtung
12. Adapterkopf
13. Metallrohr zum Einspannen des Adapters in Mikromanipula- tor
14. Kunststoffschlauch (nur Anfang und Ende eingezeichnet) 15. Dreiwegehahn
16. Luerlock-Anschluss
17. Spritze (50 ml) 18. Enzymelektrolyt 19. Kleber 20. pH-sensitive Mikroelektrode
21. Referenzelektrode
22. Silikondichtung
23. zweite Glas-Mikropipette (innere Pipette)
24. Protonen-sensitiver Cocktail 25. Stelle zum Ansetzen des Elektrodenhalters
Figure 1 :
Schematische Darstellung der Einbringung des nicht vernetzenden Silikonöls (1) in die Glas-Mikropipette (4) unter mikroskopischer Kontrolle (2) . Die Spitze der Glas-Mikropipette (4) ist mit destilliertem Wasser (3) gefüllt. Der Adapter wird am hinteren Ende (5) der Kapillare aufgesetzt. Die wassergefüllte Glas-Mikropipette wird in die Kapillare (6) mit dem Silikonöl (1) eingeführt. Durch Kolbenhub der Adapterspritze (s. Fig. 3) wird ein Unterdruck erzeugt und Sili- konöl (1) in die Glas-Mikropipette (4) gesaugt.
Figure 2 :
Schematische Darstellung des Einbringens des vernetzenden
Silikonöls (8) . Das vernetzende Silikonöl (8) wird auf den Halter (7) aufgetragen und mit der Glas-Mikropipette (4) in Kontakt gebracht. Nach Herausziehen der Glas-Mikropipette (4) aus dem nicht vernetzenden Silikonöl (8) wird die Füllkapillare mit enzymhaltigem Elektrolyt (9) von hinten in die Glas- Mikropipette (4) eingebracht.
Figure 3 :
Darstellung im Querschnitt: Adapter zum Einsaugen von nicht vernetzendem Silikonöl (1) in die Spitze einer Glas- Mikropipette (4) . Der Adapter besteht aus Dichtungsschraube (10) , Gummidichtung (11) , Adapterkopf (12) , einem Metallrohr (13) zum Einspannen des Adapters in den Mikromanipulator und einem Kunststoffschlauch (14) .
Figure 4 : Schematische Darstellung der fertigen Mikrosonde: Die Mikrosonde besteht aus zwei konzentrischen, ineinander geschobenen Glas-Mikropipetten (4 und 23) , die mit einem Kleber (19) aneinander befestigt sind. Die innere Glas-Mikropipette (23) enthält einen mit Referenzpuffer überschichteten Protonen-
sensitiven Cocktail (24) . Innere Glas-Mikropipette, mit Referenzpuffer überschichteter Protonen-sensitiver Cocktail und Arbeitselektrode bilden gemeinsam die pH-sensitive Mikroelektrode (20) . Dabei wird als Arbeitselektrode bevorzugt eine solche Elektrode verwendet, die in einen konventionellen Elektrodenhalter integriert ist. Die pH-sensitive Mikroelektrode (20) wird in der Spitze der äußeren Glas-Mikropipette (4) positioniert. Die Spitze der pH-sensitiven Mikroelektrode (20) befindet sich dabei etwa 20 μm hinter der Spitze der äußeren Glas-Mikropipette (4) , die mit einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Silikondichtung (22) verschlossen ist. Der Raum zwischen äußerer Glas-Mikropipette (4) und pH-sensitiver Mikroelektrode (20) ist mit einer Enzymlösung (18) gefüllt. Eine Referenzelektrode (21) verbin- det die Enzymlösung mit der Erdung. Das hintere Ende (25) der pH-sensitiven Mikroelektrode wird mit einem konventionellen Elektrodenhalter verbunden.
Figure 5 : Schematische Darstellung der Spitze der fertigen Mikrosonde: In der Spitze der äußeren, ersten Glas-Mikropipette (4) befindet sich die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Silikondichtung (22) . Der Raum hinter dieser Silikondichtung (22) ist mit Enzymelektrolyt (18) gefüllt. Die Spitze der zweiten Glas-Mikropipette (23) wird in die Spitze der ersten Glas-Mikropipette (4) geschoben. In der Spitze der zweiten Glas-Mikropipette (23) befindet sich ein Protonenselektiver Cocktail (24) .
Claims
1. Dichtung für Sonden zur Messung von Gaskonzentrationen, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Mischung' von Silikon-Polymeren besteht, die permeabel für Gasmoleküle ist .
2. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung innerhalb einer Glas-Mikropipette, vorzugsweise in der Spitze einer Glas- Mikropipette, im Besonderen einer Silikondichtung für
Mikrosonden zur Messung von Gaskonzentrationen, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
1. Einsaugen eines nicht vernetzenden Silikonöls in eine flüssigkeitsgefüllte, bevorzugt mit Wasser ge- füllte Glas-Mikropipette.
2. Herausdrücken überschüssigen nicht vernetzenden Silikonöls .
3. Eintauchen der Spitze der Glas-Mikropipette in einen Tropfen vernetzenden Silikonöls 4. Spitze der Glas-Mikropipette für mindestens 5 Sekunden im vernetzenden Silikonöl belassen.
5. Glas-Mikropipette aus dem vernetzenden Silikonöl herausziehen.
6. Schritte 3 bis 5 bis zum Erreichen des gewünschten Vernetzungsgrades wiederholen.
7. Aushärten der Silikondichtung.
3. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung für Mikrosonden, bevorzugt einer Silikondichtung für Mikrosonden zur Mes- sung von Gaskonzentrationen, gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Glas-Mikropipette aus Borosili- kat, Aluminiumsilikat oder Quarzglas besteht.
4. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung für Mikrosonden, bevorzugt eine Silikondichtung für Mikrosonden zur Messung von Gaskonzentrationen, gemäß Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichtung einen Innendurch- messer kleiner oder gleich 12 μm, bevorzugt zwischen 0,5 μm und 2 μm, ganz besonders bevorzugt zwischen 1,75 und 2 μm besitzt.
5. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung für Mikrosonden, bevorzugt eine Silikondichtung für Mikrosonden zur Messung von Gaskonzentrationen, gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichtung eine Länge kleiner oder gleich 50 μm, bevorzugt zwischen 5 μm und 20 μm, ganz besonders bevorzugt zwischen 8 μm und 12 μm besitzt.
6. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung für Mikrosonden, bevorzugt einer Silikondichtung für Mikrosonden zur Messung von Gaskonzentrationen, gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Silikon elektrische Isolatoreigenschaften besitzt.
7. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung für Mikrosonden, bevorzugt einer Silikondichtung für Mikrosonden zur Mes- sung von Gaskonzentrationen, gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Spitze der Glas- Mikropipette einen Innendurchmesser kleiner oder gleich 4 μm besitzt.
8. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung für Mikrosonden, bevorzugt einer Silikondichtung für Mikrosonden zur Messung von Gaskonzentrationen, gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Glas-Mikropipette vor dem Einsaugen des nicht vernetzenden Silikonöls mit Wasser
befüllt wird, dem eine oberflächenaktive Substanz, bevorzugt ein nichtionisches Tensid, zugesetzt wurde und dass im Falle des Zusetzens der oberflächenaktiven Substanz das Herausdrücken überschüssigen nicht vernetzenden Sili- konöls gemäß den Verfahrensschritten 2 und 3 nach Anspruch 2 entfällt.
9. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung für Mikrosonden, bevorzugt einer Silikondichtung für Mikrosonden zur Mes- sung von Gaskonzentrationen, gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Glas-Mikropipette vor Herstellung der Dichtung silanisiert wird.
10. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung für Mikrosonden, bevorzugt einer Silikondichtung für Mikrosonden zur Messung von Gaskonzentrationen, gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem nicht vernetzenden Silikonöl um ein nicht vernetzendes Silikonöl mit Trimethyl-Siloxy-Endgruppen handelt, bevorzugt um ein nicht vernetzendes Polydimethylsiloxan mit Trimethyl-
Siloxy-Endgruppen, besonders bevorzugt um ein nicht vernetzendes Polydimethylsiloxan mit Trimethyl-Siloxy- Endgruppen und einer Viskosität zwischen 0,02 und 0,5 Stokes, ganz besonders bevorzugt um ein nicht vernetzen- des Polydimethylsiloxan mit Trimethyl-Siloxy-Endgruppen und einer Viskosität zwischen 0,05 und 0,1 Stokes.
11. Verfahren zur Herstellung einer Dichtung für Mikrosonden, bevorzugt einer Silikondichtung für Mikrosonden zur Mes- sung von Gaskonzentrationen, gemäß einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem vernetzenden Silikon um ein Gemisch aus Dimethylsiloxan mit endständigen Hydoxylgruppen und Trimethylsiloxan sowie einem Vernetzer handelt, bevorzugt um ein vernetzendes
RTV-Silikonölgemisch aus Dimethylsiloxan mit endständigen Hydoxylgruppen und Trimethylsiloxan sowie einem Vernetzer, besonders bevorzugt um ein vernetzendes RTV- Silikonölgemisch aus Dimethylsiloxan mit endständigen Hydroxylgruppen und Trimethylsiloxan sowie 5-10 % Me- thyltrimethoxysiloxan als Vernetzer, ganz besonders bevorzugt um ein vernetzendes RTV-Silikonölgemisch aus Dimethylsiloxan mit endständigen Hydoxylgruppen und Trimethylsiloxan sowie 5-10 % Methyltrimethoxysiloxan als Vernetzer, wobei das vernetzende RTV-Silikonölgemisch aus Dimethylsiloxan mit endständigen Hydroxylgruppen und Trimethylsiloxan sowie 5-10 % Methyltrimethoxysiloxan als Vernetzer eine Viskosität kleiner oder gleich 28.000 cSt besitzt .
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Silikondichtung für 2 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur ausgehärtet wird, bevorzugt, besonders bevorzugt für 3 bis 5 Stunden bei Raumtempera- tur, ganz besonders bevorzugt für 4 Stunden bei Raumtemperatur .
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Silikondichtung in feuchter Wär- me bei 40-80 °C ausgehärtet wird, bevorzugt für 0,5-4
Stunden bei 50-70 °C, besonders bevorzugt für 45-75 min bei 55-65 °C.
14. Verfahren zur Herstellung einer Mikrosonde zur Messung von Gaskonzentrationen unter Verwendung einer Dichtung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Schritte: 1. Herstellung der Dichtung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 13, wobei die Glas-Mikropipette nach dem Herausziehen aus dem vernetzenden Silikonöl gemäß Verfah-
rensschritt 5 nach Anspruch 2 im Falle des Erreichens des gewünschten Vernetzungsgrades gemäß Verfahrens- schritt 6 nach Anspruch 2 zunächst mit einer Enzymlösung dotiert wird und die Dichtung anschließend gemäß Verfahrensschritt 7 nach Anspruch 2 ausgehärtet wird
2. Befüllen einer zweiten Glas-Mikropipette mit einer Lösung aus einem Protonen-sensitiven Cocktail und einem flüssigem Polymer, wobei das Befüllen von der der Spitze abgewandten Seite der Glas-Mikropipette erfolgt 3. Aushärten des Gemisches aus Protonen-sensitivem Cocktail und Polymer, so dass sich die Spitze der Pipette verschließt 4. Überschichten des ausgehärteten Gemisches mit Protonen-sensitivem Cocktail und einem Referenzpuffer 5. Einführen einer Arbeitselektrode in die zweite Glas- Mikropipette
6. Einführen einer Referenzelektrode in die erste Glas- Mikropipette
7. Spitze der zweiten Glas-Mikropipette unter Wahrung ei- nes Abstandes zwischen der Spitze der zweiten Glas-
Mikropipette und der Silikondichtung in die erste Glas-Mikropipette schieben
8. beide Glas-Mikropipetten durch Kleber aneinander befestigen
15. Verfahren zur Herstellung einer Mikrosonde zur Messung von Gaskonzentrationen gemäß Anspruch 14 unter Verwendung einer Dichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass auf den Einbau der Arbeitselektrode gemäß Verfah- rensschritt 5 nach Anspruch 14 verzichtet wird und stattdessen nach der Befestigung der beiden Glas-Mikropipetten durch Kleber gemäß Verfahrensschritt 8 nach Anspruch 14 das hintere Ende der zweiten Glas-Mikropipette mit einem konventionellen Elektrodenhalter verbunden wird, wobei
der Elektrodenhalter eine Elektrode aus einem Metall und einem Salz dieses Metalls enthält.
16. Verfahren zur Herstellung einer Mikrosonde zur Messung von Gaskonzentrationen gemäß Anspruch 15 unter Verwendung einer Dichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrode aus einem Silber-Silberchlorid- Plättchen besteht, das in Kunststoff gefasst ist.
17. Verfahren zur Herstellung einer Mikrosonde zur Messung von Gaskonzentrationen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Enzym um Carboanhydrase handelt .
18. Verfahren zur Herstellung einer Mikrosonde zur Messung von Gaskonzentrationen gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass dem Enzym ein Oxidationsschutz zugesetzt wird, bevorzugt ein Oxidationsschutz aus der Gruppe As- corbinsäure, Glutathion, Catechine, Benzoesäure, Rosma- rinsäure, besonders bevorzugt Ascorbinsäure .
19. Verfahren zur Herstellung einer Mikrosonde zur Messung von Gaskonzentrationen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Elektro- den um nicht toxische Elektroden handelt, bevorzugt um
Silber-Silberchlorid-Elektroden.
20. Verwendung einer Dichtung in einer Mikrosonde gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrosonde für Messungen von Gasen aus der Gruppe Kohlendioxid, Ammoniak und Sauerstoff, bevorzugt für die Messung von Kohlendioxid, verwendet wird.
21. Verwendung einer Dichtung in einer Mikrosonde gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrosonde für Untersuchungen von biologischen Systemen eingesetzt wird.
22. Verwendung einer Dichtung in einer Mikrosonde gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrosonde für Untersuchungen von Gasen in phytophysiologischen Systemen eingesetzt wird, bevorzugt für die Messung der Zellatmung, besonders bevorzugt für die Messung von Kohlendioxid und/oder NH3 in Pflanzenblättern, ganz besonders bevorzugt für hoch auflösende Kohlendioxid- und/oder NH3-Messungen an einzelnen Stomata von Pflanzenblättern.
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| US5102526A (en) * | 1990-05-02 | 1992-04-07 | The University Of Michigan | Solid state ion sensor with silicon membrane |
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Non-Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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