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WO2004084929A1 - VERWENDUNG VON proNGF, INSBESONDERE ZUR WUNDHEILUNG DER CORNEA UND DER HAUT - Google Patents

VERWENDUNG VON proNGF, INSBESONDERE ZUR WUNDHEILUNG DER CORNEA UND DER HAUT Download PDF

Info

Publication number
WO2004084929A1
WO2004084929A1 PCT/EP2004/002899 EP2004002899W WO2004084929A1 WO 2004084929 A1 WO2004084929 A1 WO 2004084929A1 EP 2004002899 W EP2004002899 W EP 2004002899W WO 2004084929 A1 WO2004084929 A1 WO 2004084929A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
prongf
cells
use according
skin
ngf
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/002899
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Susan Lorey
Bernhard Janowski
Gabriele Proetzel
Ulrike Fiedler
Original Assignee
Scil Proteins Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scil Proteins Gmbh filed Critical Scil Proteins Gmbh
Publication of WO2004084929A1 publication Critical patent/WO2004084929A1/de

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • proNGF especially for wound healing of the cornea and skin
  • the invention relates to new uses of proNGF, derivatives of proNGF and functional parts of proNGF.
  • the cornea has the function of refraction of light as an essential prerequisite for sharp vision.
  • the cornea consists of 3 layers, an outer layer of epithelium, the stroma and an inner layer of endothelium.
  • the stroma is delimited on the outside by the Bowman membrane and on the inside by the desertion membrane. Corneal lesions can appear in all layers. Injuries to the epithelial layer are compensated for by migration processes of the epithelial cells in early phases and proliferation processes in late phases of wound healing.
  • Stroma injuries are compensated for by the proliferation and migration processes of keratinocytes of the stromal tissue and after their fibroblastic transformation by the production of various collagens, essentially type I and type VI, lesions of the endothelium are compensated for depending on the species by proliferation and / or migration of endothelial cells.
  • Corneal injuries can impair this function and, in severe cases, lead to loss of eyesight.
  • Various causes of corneal injuries are described: viral-induced keratitis, neurotrophic and neuroparalytic keratitis, post-traumatic keratitis, post-infectious keratitis, post-surgical keratitis, dystrophic, degenerative or post-traumatic keratitis but also comea transplants (lamellar, penetrating).
  • comeal impairments are associated with reduced tear production (e.g. from medication, contact lenses, disturbed hormone balance etc.), as a result of laser treatment of the cornea, as a result of chemical or physical burns (Burn) and as a result of non-traumatic pathological conditions (e.g. B. Autoimmune diseases, diabetes, infections).
  • the healing of stringy corneal wounds is often restricted and can make postoperative or posttraumatic recovery difficult. It is not uncommon for corneal ulcerations to result in corneal perforations.
  • Stimulation or induction of dermal wound healing is important when there are wound healing disorders that can often lead to chronic wounds.
  • the risk of chronic wounds, if not treated, is the need for limb amputation and an increased mortality rate.
  • Impaired dermal wound healing is often found in connection with circulatory disorders in peripheral tissues (e.g. the skin) and / or reduced peripheral sensitivity and inflammatory processes. Examples of dermal wound healing disorders are the diabetic foot ulcer, the venous ulcer or the pressure ulcer.
  • the conventional treatment of dermal wounds consists in the use of various wound dressings, which are intended to maintain a moist milieu of the wound, but also compression bandages and the administration of antibiotics to curb or prevent infections.
  • additional agents promoting wound healing are used, e.g. B. protease inhibitors, but also wound dressings based on growth factor level (OASIS TM) or skin equivalents (Apligraf, De ⁇ nagraft).
  • OASIS TM growth factor level
  • a PDGF-BB based product is currently on a gel basis the market that stimulates wound healing in patients with diabetic foot ulcers.
  • the number of amputations necessary due to a diabetic foot ulcer is enormous and amounts to 60,000 amputations per year in the United States alone.
  • Growth factors are proteins that, due to their specific interaction with a receptor, are able to stimulate or influence cell division, migration, differentiation and maturation processes.
  • the proteins can be produced on a large scale both in genetically modified eukaryotes and in prokaryotes (EP0994188, WO0022119). The importance of growth factors in wound healing of the skin has already been demonstrated.
  • NGF from the salivary glands of the mouse (WO9848002, US2002037584) has been described as an active ingredient for the treatment of corneal epithelial damage.
  • US6063757 describes the use of recombinant human NGF for healing corneal and also dermal damage.
  • WO0044396 describes an increase in intraocular pressure both in the animal model (rabbit) and in patients with reduced intraocular pressure. Against the background of a therapeutic application of NGF for corneal defects, such an effect is to be assessed negatively as a possible cause of the development of damage to the fundus (glaucoma).
  • ProNGF is the precursor protein of the NGF.
  • Human NGF is synthesized in vivo as preproNGF.
  • the pre-sequence has a length of 21 amino acids and is cleaved after the translocation of the protein into the endoplasmic reticulum.
  • the resulting proprotein is then proteolytically processed at the N- and C-terminal, making the mature NGF accessible.
  • ProNGF has a molecular weight of 49 kDa, consists of 221 amino acids and appears in its mature form as a homodimer.
  • the pro sequence is localized and almost on the surface of the folded NGF unstructured (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem. 2001, 268, 3296-3303; J. Mol. Biol. 2001, 305, 523-533).
  • ProNGF was detected in various tissues in vivo.
  • the biological activity of NGF precursors and peptide sequences of the precursor protein in various in vitro and in vivo systems induction of neurite growth or redistribution of F-actin in PC12 cells, increase in the activity of choline enzymes after intracerebroventricular injection in neonatal rats) (Chen et al., Mol. Cell. Endocrinol. 1997, 127, 129-136; Clos et al., Develop. Brain Res. 1997, 99, 267-270).
  • the biological significance of proNGF which is assumed on the basis of sequence homologies of the pro sequences within the neurotrophins and the localization in different tissues, has not yet been clarified.
  • proproteins are discussed as a reservoir of the mature active protein.
  • the pro sequence acts as a helper in the folding of the mature protein (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem. 2001, 268, 3296-3303; J. Mol. Biol. 2001, 305, 523-533) or a role in the sorting of neurotrophins by anabolic or catabolic routes (Farhadi et al, J. Neurosci. 2000, 20, 4059-4068).
  • proNGF The pharmaceutical activity of proNGF was first shown in EP 0 994 188.
  • example 4f the stimulability and survival of sensory neurons from dissociated dorsal root ganglia are examined on the basis of the formation of neurites.
  • the biological activity for the recombinant proNGF was half that of the recombinant mature ⁇ -NGF. Based on these test results, it was proposed to use recombinant proNGF for the manufacture of a medicament for the treatment of neuropathies. Use on comea and conjunctiva cells and skin cells is not described.
  • WO 96/08562 describes NGF, which N-terminal is extended by a peptide fragment of up to approx. 19 amino acids, this peptide fragment being the C-terminal fragment of the precursor part of NGF.
  • This precursor contains a furin-type consensus site at the C-terminus, in which an exchange in amino acid 1 and / or -2 has taken place. It is proposed to use such NGF variants in drugs for the treatment of diseases of the nervous system, for example of degenerative diseases of the nervous system such as degeneration of the retina, in the treatment of injuries or damage to the nervous system etc. An application to cornea and conjunctiva cells and skin cells is not shown.
  • EP 0786520 describes N-terminally extended ⁇ -NGF which, like natural ⁇ -NGF, is said to have an effect on neurons. An effect on the indication areas proposed here is not discussed.
  • TrkA a high affinity receptor with tyrosine activity and P75 a low affinity receptor, to which other neurotrophic proteins and cytokines bind in addition to NGF.
  • TrkA was detected in the basal layer of the corneal epithelium as well as in the stroma and endothelium (Lambiase et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 1998, 39, 1272-1275; Lambiase et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000, 41, 1063-1069; You et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.
  • P75 is expressed by all cell types of the cornea / Touhami et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Be. 2002, 43, 987-994).
  • stimulation of NGF receptor expression can lead to increased NGF binding (Lambiase et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 2000, 41, 1063-1069).
  • P75 is described as a receptor through which apoptotic processes are mediated.
  • TrkA processes mediated by TrkA such as proliferation and survival and differentiation of cells can be enhanced in the presence of P75.
  • proNGF The preferred binding to P75 and the associated increased activation of the P75-mediated signal cascade is seen as the cause of the apoptosis processes induced by proNGF.
  • the induction of apoptosis by proNGF has been demonstrated both for cells that only express P75 and for neurons that carry both receptors. According to these results, proNGF is regarded as a stimulator of apoptosis processes via a P75 mediated signal cascade, while NGF via its preferred TrkA binding can cause cell survival even in the presence of P75.
  • apoptosis induction increased by at least a factor of 10 compared to mature NGF. Since P75 is especially expressed in inflammatory processes, degenerative diseases and injuries together with neurotrophins, proNGF seems to play a role in these diseases for the induction of the apoptotic processes taking place here.
  • proNGF progenitor protein
  • derivatives of proNGF with the exception of those in which the pro portion was completely deleted, and or a functional part thereof in an effective amount together with excipients for the prophylaxis and therapy of diseases of skin, Cornea and conjunctiva cells, in particular tissue, can be used.
  • the results obtained according to the invention also allow the conclusion that the active substances mentioned are suitable for the storage and stabilization of skin, comea and conjunctiva cells and for the in vitro reproduction of these cells.
  • the invention also includes proNGF derivatives in which one or more amino acids have been exchanged, deleted, added and / or chemically modified, always while maintaining the pharmaceutical, medical and biological effectiveness described above.
  • Amino acid substitutions can be made based on the similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, HydiOphilie, and / or the amphipathic (amphiphilic) nature of the residues involved.
  • nonpolar (hydrophobic) amino acids are alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine.
  • Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, thyrosine, asparagine and glutamine.
  • Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • “Insertions” or “deletions” typically range from one to five amino acids. The degree of variation allowed can be determined experimentally by systematically inserting, deleting and / or substituting amino acids in a polypeptide molecule using recombinant DNA techniques and by examining the resulting recombinant variants for their biological activity.
  • the hydropatic index of the amino acids can also be considered when making these changes.
  • Each amino acid can be assigned a specific hydropatic index based on its hydrophobicity and charge properties. Examples of this can be found in WO 00/32039, in US 4,554,101 and in Kyte & Doolittle, 1982, which are referred to here with their content. It is known that certain amino acids can be substituted by other amino acids if they have a similar hydropatic index and, when they are exchanged, bring about a comparable biological activity of the whole molecule. With all derivatizations of the proNGF it is crucial that the biological, medical or pharmaceutical effectiveness is maintained.
  • the derivatization of proNGF can refer to both the pro portion and the NGF portion.
  • the changes in the pro portion also include amino acid additions at the N-terminus of the pro portion defined by the pre portion are.
  • proNGF functional part of proNGF is understood to mean those parts which fulfill the indications and uses claimed in the present application, with simultaneous deactivation, e.g. by deletion, those portions of proNGF that do not contribute to the function.
  • the functional parts can be determined by a person skilled in the art, for example, by deletion analyzes. Systematic deletions of the pro portion, the prepro portion and / or the NGF portion and a subsequent analysis of the remaining molecule for the indications described and claimed here enable the person skilled in the art to determine the desired functional sections.
  • Such functional parts are, for example, the 25 or 71 amino acids of the pro-C terminus of proNGF.
  • the functional parts should remain as unchanged as possible in order to ensure the physiological function of the proNGF, for example its binding to the receptor.
  • modifications as described below are also possible in the functional parts. The number and type of modifications can be determined experimentally by a person skilled in the art.
  • One or more modifications in the pro, prepro and / or NGF portion can be carried out, for example deletions or substitutions of an amino acid.
  • the protein modified in this way is then examined for its functionality in the context of the present invention, and it is determined whether the change made brings about an improvement or deterioration in the properties.
  • the active ingredient proNGF includes those of human origin, animal origin, in particular from rodents such as rats, rabbits and mice, from cattle and pigs, and recombinantly produced proNGF.
  • the recombinant forms of proNGF also include proNGF fusion proteins in which proNGF is combined with another protein or Peptide was linked.
  • proNGF fusion proteins in which proNGF is combined with another protein or Peptide was linked.
  • the derivatives of the pro portion of NGF include, in particular, those pro forms in which at least 25, more preferably 71 amino acids of the pro-C terminus are present at the N terminus of the NGF (Dicou et al, J. Cell. Biol. 1997 , 136, 389-398). Preference is furthermore given to those derivatives of proNGF which, at the amino acid level, have a homology to the pro form, to the prepro form and / or to the NGF portion of the proNGF of at least 80%, preferably 85%, 90% or 95% or about that. Homology means that the specified percentage of amino acids, based on the starting form of the proNGF used, for example rh-proNGF, is contained in identical form.
  • the number and type of modifications in the derivatives is always limited by the maintenance of the physiological functions of the proNGF, in particular, of course, by the maintenance of the therapeutic and prophylactic and other functional properties of the proNGF as described in the present invention.
  • no more than 10, preferably no more than 5 and more preferably less than 5, modifications are made in the proNGF.
  • a maximum of 5 modifications are preferably introduced in the pro portion.
  • the functional sections of the pro portion remain functional, i.e. positions 143 - 221 and 78 - 221 of the proNGF (numbering of the positions starting at the N-terminus of the proNGF).
  • proNGF can take place at the amino acid level via direct chemical modifications of amino acids.
  • modification by mutagenesis of the DNA coding for the protein is preferred. This includes, for example, site-directed mutagenesis, as is known from the prior art and is constantly being further developed (Brannigan and Wilkinson, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002, 3, 964-970).
  • proNGF and its derivatives by recombinant techniques is described and reference is made to this prepublished literature here (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem. 2001, 268, 3296-3303; Rattenholl et al., J. Mol Biol. 2001, 305, 523-533).
  • ProNGF and the derivatives described above stimulate the proliferation and migration of cornea cells, conjunctiva cells and dermal cells, promote the maintenance of the vitality of these cells and the wound healing of the skin and the cornea, for example acute and chronic traumatically-induced and non-traumatic- induced wounds.
  • the regeneration processes are also induced and promoted. Further details on effectiveness are described below.
  • the active compounds of the present invention can be used either as a single substance or in conjunction with the proNGF derivatives or in conjunction with other active compounds.
  • Particularly suitable active ingredients are those which stimulate healing, have an anti-inflammatory effect, have antibiotic properties, have antiviral activity, antifungal substances and active substances which relieve or prevent pain.
  • the further active ingredients contained in the pharmaceutical composition are intended to increase the activity of the proNGF active ingredient or to supplement its activity during treatment in a form which is more favorable for the patient.
  • Preferred is a synergistic effect in the drug and a minimization of side effects and undesirable effects.
  • the active ingredients of the present invention are preferably used in the form of a pharmaceutical composition in which they are mixed with suitable carriers in such doses so that the disease is treated and / or alleviated.
  • a composition can contain (in addition to the active ingredients and the carrier) diluents, fillers, salts, buffers, stabilizers, solubilizers, penetration enhancers and other materials which are well known in the art.
  • pharmaceutically acceptable is defined as a non-toxic material that does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active substance or substance.
  • carrier and other additives depends on the route of administration. Ophthalmologically and dermatologically compatible carriers and additives were preferably used.
  • a therapeutically effective dose also refers to an amount of the compound sufficient to achieve improvement in symptoms, for example treatment, healing, prevention or improvement in such conditions.
  • Suitable routes of administration are in particular a topical application.
  • the compositions can be in liquid form, for example in the form of emulsions, suspensions and solutions, in spray form, in the form of transdermal systems such as plasters, in the form of a cream, an ointment or a gel. Retard forms are also preferred. Further, known forms of presentation are known to the person skilled in the art.
  • the amount of drug that is adequate to achieve the effects described above is defined as the therapeutically effective dose.
  • the amount that is effective for this use depends on the severity of the patient's condition and disease.
  • Single or multiple administrations according to a daily, weekly or monthly treatment schedule can be combined with dose strengths and mustem, which are selected by the treating doctor.
  • the doses to be used are also determined by the doctor, with amounts of preferably from 1 ng / ml to 1 mg / ml or 1 ng / g to 1 mg / g, preferably from 10 ng / ml to 200 ⁇ g / ml or 10 ng / g to 200 ⁇ g / g can be used.
  • other doses of active substance can also be used, which also depend, for example, on the formulation of the active substance, on the presence of further active substances, on the individual patient, on the application site, on the type of disease, etc.
  • proNGF as used in the present context also includes the configurations specified in the patent claims and defined in more detail in the present description, for example also derivatives of proNGF.
  • the present invention involves the use of proNGF to maintain the vitality of corneal cells and to stimulate proliferative and migratory processes of cells.
  • ProNGF is suitable for the treatment of corneal and dermal injuries with the aim of supporting or stimulating corneal and dermal Regeneration processes.
  • the proNGF-containing compositions are suitable for the positioning and stabilization of comeas and their ability to positively influence the vitality of corneal cells.
  • proNGF and its derivatives to accelerate wound healing further includes: I.) providing an ophthalmologically and / or dermatologically compatible composition that contains an effective concentration of proNGF, II.) Applying the composition to the cornea preventively before an injury the cornea or therapeutically after an injury to the cornea with the aim of achieving a clinically demonstrable stimulation of the healing of the corneal injuries by stimulating proliferative and / or migratory processes of corneal cells of the epithelium, stroma or endothelium or therapeutically for the treatment of dermal wounds with the aim of to achieve a clinically demonstrable stimulation of the healing of the injuries by stimulating proliferative and or migratory processes of dermal cells.
  • proNGF includes: 1.) the amino acid sequence of the NGF, which is extended at the N-terminal by the complete or partial sequence of the proprotein or preproprotein, the extension at least the amino acids from positions 1 to 25, further 1-71 of the C-terminus of the prosequence and 2.) is glycosylated or non-glycosylated or differs in the glycation status, 3.) is of human or non-human origin, 4.) is obtained recombinantly or non-recombinantly, 5.) as a fusion protein with a other heterologous protein is present as a fusion partner or unfused, 6.) is unmodified or modified by
  • B ProNGF can be obtained using various methods: 1.) isolation from human or animal tissue, 2.) chemical synthesis z.
  • C Ophthalmologically compatible compositions are materials of aqueous, ointment-like or gel-like consistency that contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carriers can contain sterile water, various organic solvents, emulsifying or suspending agents or diluents.
  • the carriers can contain physiologically compatible surface-active ionic or nonionic substances.
  • the carriers can contain antibacterial, antifungal components and / or preservatives (e.g.
  • the carriers can contain buffers to maintain a pH between 5.0 and 8.0.
  • the buffers can be conventional buffers such as e.g. B. phosphate, borate, citrate, bicarbonate or Tris-HCl buffer.
  • the carriers can be isotonic by adding appropriate osmotically active components (e.g. saline, sugar).
  • the carriers can contain other solubilizing components such as proteinaceous carriers or solubilizers (e.g. albumin).
  • the carriers can include antioxidants and stabilizers such as e.g. B. sodium bisulfite, sodium metabisulfite, sodium thiosulfate, thiourea.
  • Possible wetting agents can e.g. B. Polysorbate 80, Polysorbate 20, Poloxamer 282 or Tyloxapol.
  • the carriers can include viscosity-increasing agents such as e.g. B. dextran 40, gelatin, glycerol, lanolin, cellulose derivatives (e.g. hydroxyethyl cellulose, hydroymethyl propyl cellulose,
  • the carriers can contain antibiotics to control infections.
  • the carriers can contain agents for the slow release of the growth factor. All components of the carrier are characterized in that they are ophthalmologically compatible and non-toxic.
  • the concentration of the proNGF in the carrier is between 1 ng / ml and 1 mg ml. If ointments or gels are used as an ophthalmologically compatible carrier for the treatment of the comea, the concentration is of the proNGF in the carrier between 1 ng / g and 1 mg / g.
  • proNGF can be used in the ophthalmologically compatible carrier alone or in combination with other healing-stimulating, anti-inflammatory or pain-relieving substances.
  • Dermatologically compatible compositions are materials with an aqueous, ointment-like, emulsion-like, cream-like or gel-like consistency that contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carriers can contain sterile water, various organic solvents, emulsifying or suspending agents or diluents.
  • the carriers can be physiologically compatible surface-active ionic or nonionic substances.
  • the carriers can contain antibacterial, antifungal components and / or preservatives (e.g. parabens, chlorobutanol, sorbic acid, phenol, thimerosal).
  • the carriers can contain buffers to maintain a defined pH.
  • the buffers can be conventional buffers such as e.g. B. phosphate, borate, citrate, bicarbonate or Tris-HCl buffer.
  • the carriers can contain other solubilizing components.
  • the carriers can contain antioxidants and stabilizers.
  • the carriers can include viscosity-increasing agents / polymers such as e.g. B. dextran 40, gelatin, glycerol, cellulose derivatives (e.g. hydroxyethyl cellulose, hy droymethyl propyl cellulose, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose),
  • Polyethylene glycol Polyethylene glycol, vinyl polymers (e.g. polyvinyl alcohol, polyvinylpolyvinylpyrrolidone), polyacrylic acid and its derivatives, polyoxyethylenes, polyoxypropylene and their copolymers (e.g. Pluronic), polysaccharides (e.g. hyaluronic acid, heparin) collagen and / or vegetable oils or fatty acids or contain fatty acid esters or derivatives.
  • the carriers can contain antibiotics to control infections. All components of the carrier are characterized in that they are dermatologically compatible and non-toxic.
  • the concentration of the proNGF in the carrier is between 1 ng / g and lmg / g.
  • the proNGF concentration in the carrier is between 1 ng / ml and 1 mg / ml.
  • Wound dressings can with an effective dose of lyophilized proNGF's are prepared in a range between 1 ng / cm 2 and 1 mg / cm 2 .
  • proNGF can be used alone in the dermatologically compatible carrier or in combination with other healing-stimulating, anti-inflammatory or pain-relieving substances.
  • the application of the proNGF-containing carrier to the cornea can take place preventively before an injury to the cornea or therapeutically after an injury to the cornea in an amount that is clinically demonstrable stimulation of the healing of the corneal injuries by stimulating proliferative and / or migratory Processes of corneal cells.
  • the proNGF-containing carrier is applied to the cornea in an amount between 10 and 500 ⁇ l, preferably 50 to 100 ⁇ l.
  • Corneal injuries are understood to mean all processes and conditions that cause or characterize damage to all areas of the comea, the epithelium, the stroma and the endothelium (including the Bowman and membrane membranes). This includes both superficial injuries and deep wounds on the entire area of the comea. Examples of superficial wounds of the epithelium and stroma are viral-induced, neurotrophic and neuroparalytic, post-traumatic, post-infectious, post-surgical, dy strophic, degenerative keratitis, but also corneal transplants and corneal impairments in connection with reduced tear production (e.g.
  • Deep injuries up to the endothelium can e.g. B. by diseases that are associated with the development of abnormalities of the endothelium (e.g. Fuchs dystrophy, aphakic bullous keratopathy, pseudoaphakic bullous keratopathy, viral endothelitis, ulceris) or by surgery in the anterior eye area, e.g. B. after cataract surgery, penetrating keratoplasty, intraocular lens insertion, intraocular lens replacement, iridoplasty, pupiloplasty, trabeculectomy arise.
  • diseases that are associated with the development of abnormalities of the endothelium e.g. Fuchs dystrophy, aphakic bullous keratopathy, pseudoaphakic bullous keratopathy, viral endothelitis, ulceris
  • cataract surgery e.g. B. after cataract surgery, penetrating keratoplasty, intraocular lens insertion, intraocular lens replacement, iridoplasty, pupiloplasty, trabeculectomy arise.
  • proNGF-containing carrier to dermal wounds takes place therapeutically after an injury in an amount which is sufficient to achieve clinically demonstrable stimulation of the healing of the dermal injury by stimulating proliferative or migratory processes of dermal cells.
  • the proNGF-containing carrier is applied to the skin wound in an amount sufficient to cover the wound area.
  • Skin means the epidermis and the corium with their individual layers. For details, see the keywords “Cutis”, “Epidermis” and “Korium” in Pschyrembel, Kim. Dictionary, de Gruyter Verlag, Berlin-New York, last edition, noted.
  • Skin injuries are understood to mean all processes and conditions that cause or characterize damage to all areas of the skin. This includes both superficial injuries and deep skin wounds. Examples of dermal wounds are the diabetic foot ulcer, the venous ulcer and the pressure ulcer, Skin wounds associated with systemic diseases (e.g. systemic sclerosis, rheumatoid arthritis), skin injuries due to chemical or thermal effects, accidents, microorganisms such as viruses, fungi and bacteria etc. Dermal wounds can be acute or chronic wounds.
  • systemic diseases e.g. systemic sclerosis, rheumatoid arthritis
  • Dermal wounds can be acute or chronic wounds.
  • the proNGF active ingredients used according to the invention can also be used for the storage, cultivation and production in vitro of comea, conjunctiva and skin cells, cell groups, in particular cell tissues.
  • the active compounds are then added to the culture medium in an amount which promotes storage and cultivation and can be determined by a person skilled in the art; Amounts of 1 ng / ml to 100 ⁇ g / ml are preferably used.
  • the addition of the proNGF active ingredients stimulates proliferation and maintains the vitality of the skin, cornea and conjunctiva cells, promotes the regeneration of injured cells and thus facilitates the positioning and stabilization of these cells and supports the cultivation of the cells in vitro.
  • the cells obtained in this way can be used, for example, for transplantation in patients with damaged skin, comea and conjunctiva cell dressings.
  • the cells can be stored over a longer period of time by using the proNGF active ingredients and thus promote the possibility of transplantation of skin, comea and conjunctiva tissue. Longer transport times from the donor to the recipient of the graft can thus be bridged.
  • the cells can be co-cultivated in connection with carrier tissues and various cell types. It is also possible to produce comea cell mixed tissue in order to use an artificial comea for transplantation (Griffith et al, Comea 2002, 21 (7 Suppl), S54-61; Germain et al., Prog. Retin. Eye. Res. 2000 , 19, 497-527).
  • comea cell mixed tissue in order to use an artificial comea for transplantation (Griffith et al, Comea 2002, 21 (7 Suppl), S54-61; Germain et al., Prog. Retin. Eye. Res. 2000 , 19, 497-527).
  • the differentiation processes of the skin, comea and conjunctiva cells can also be stimulated by the proNGF molecules used according to the invention.
  • proNGF The induction of apoptosis by proNGF has been demonstrated both for cells that only express P75 and for neurons that carry both receptors and therefore does not appear to be influenced by the coexpression of the high-affinity receptor TrkA. According to these results, proNGF is regarded as a stimulator of apoptosis processes via a P75-mediated signal cascade, while NGF can cause cell survival even in the presence of P75 via its preferred TrkA binding. Against the background of the Hempstead et al. Published apoptosis induction by proNGF seems to be unsuitable for proNGF to stimulate comeal and dermal wound healing and for the other indications described here regarding the induction of proliferative and migratory processes.
  • proNGF does not induce apoptosis as previously described, but rather stimulate the proliferation and survival and migration of cells in the cells used according to the invention.
  • various in vitro tests have even demonstrated a stronger effect of proNGF on the proliferation and migration of corneal cells.
  • animal experiments have shown that proNGF has a stronger effect on the healing of artificially placed corneal wounds compared to NGF. Accordingly, proNGF does not induce apoptosis in the cell systems we use. All these results indicate that the mechanism of action mediated by proNGF does not only result in apoptotic processes through an interaction with P75, but surprisingly can also initiate proliferative or migratory processes.
  • the in vitro test system for migration induction described here is mouse fibroblasts (3T3), which were examined for the effects mediated by rh-proNGF and rh-NGF on migration in the Boyden chamber test. If an apoptosis induction by proNGF should be expected according to the above results due to the interaction with P75, no migratory activity of the cells in the presence of rh-proNGF should be demonstrated in this test. Surprisingly, a stimulatory activity of rh-proNGF on the migration of the fibroblasts in vitro, which has not been described so far, could be found in this test system.
  • the effect mediated by rh-proNGF is comparable to the effect mediated by rh-NGF (Example 1, Fig. 1).
  • the in vitro test systems described here are cells of the comea tissue (BCE C / D 1-b), which were examined for the effects mediated by proNGF and NGF. According to the above results, an apoptosis induction by proNGF would have been expected due to the interaction with P75. However, a previously not described stimulatory activity of proNGF on the proliferation and migration of corneal cells in vitro was found (Examples 2 and 3, Figs. 2 and 3). Surprisingly, in contrast to the previously published data on the induction of apoptosis by proNGF, no evidence of apoptosis could be provided in these test systems. In addition, it was shown that proNGF triggers a stronger proliferation induction (Fig. 2) and a significantly stronger migration induction (Fig. 3) than bovine corneal cells (BCE C / D 1-b). 3.) Effect of proNGF on the healing of corneal wounds in the animal model
  • the invention thus also encompasses methods of treating the human and animal body, namely the prophylaxis and / or therapy of diseases of the skin, comea and conjunctiva, a therapeutically effective amount of proNGF and / or derivatives of proNGF, with the exception of those in which the pro portion has been completely deleted, and / or a functional portion thereof is administered together with carriers and / or diluents.
  • Further refinements of the method result from the attached patent claims and from the present description.
  • the dose to be used depends on the type of illness to be treated, on the patient, on the form of preparation, on the type of application, on the severity of the illness and on other parameters known per se. The same applies to prophylaxis.
  • the appropriate preparation forms, application forms and dose-response relationships can be determined by conventional tests in vitro, on animal models and in the context of clinical studies on patients.
  • the cells are grown in full medium (DMEM (Sigma D 5796) with 10% FBS (Sigma, F-2442) and 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin (Sigma, P-4333) at 37 ° C, 5% CO .. 2 and 95% humidity cultured Upon reaching a confluence of approximately 60%, the cells are trypsinized the 210 ul of a rh-NGF or rh-proNGF-containing solution of various concentrations (for example rh-NGF.
  • test medium DMEM with 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin
  • test medium DMEM with 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin
  • each 800 ⁇ l of a cell suspension with a density of 2-10 5 cells / ml are placed in the upper chamber the Boyden crest he given.
  • the chambers are incubated for 4 hours at 37 ° C, 5% CO2 and 95% humidity.
  • the chambers are then screwed apart and the membranes are stained using hemalum / eosin (HEMACOLOR ® fixing solution HEMACOLOR ® 2 staining reagent red HEMACOLOR ® 3 staining reagent blue, VWR International, 1.1 1957.2500).
  • Rh-proNGF shows a significant one at doses 5-10 "7 M and 5T0 " 8 M.
  • Rh-proNGF also demonstrates a migration induction comparable to that of rh-NGF.
  • the cells are grown in complete medium (DMEM (Sigma, D-6046) with 5% FBS (Sigma, F-2442) and 10% calf suspension (Sigma, C-8056), 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin ( Sigma, P-4333) and 150 ⁇ M monothioglycerol (Sigma, M-6145) are cultured at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% atmospheric humidity, and the cells are trypsinized when a confluence of approximately 80% is reached Cell suspension with a density of 5-10 4 cells / ml is sown in the wells of a 24-hole plate, the cells are cultured in full medium for 24 hours, after which the medium is removed, the cells are washed 3 times with sterile PBS and then in 1 ml each Test medium (DMEM with 1% FBS as well as 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin) which contains the rh-NG
  • Rh-proNGF shows a significant at all doses (10 "7 M, 10 ⁇ 9 M and 10 " u M)
  • Rh-proNGF also makes it stronger
  • the cells are grown in full medium (DMEM (Sigma, D-6046) with 5% FBS (Sigma, F-2442) and 10% calf serum (Sigma, C-8056), 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin (Sigma , P-4333) and 150 ⁇ M monothioglycerol (Sigma, M-6145) cultivated at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% atmospheric humidity, when the confluence of approx. 80% is reached, the cells are trypsinized -NGF or rh-proNGF-containing solution of different concentrations (e.g.
  • NGF 10 "6 , 10 ⁇ 7 , 10 " 8 M
  • proNGF 10 "6 , 10 " 7 , 10 “8 M
  • test medium DMEM with 50 U / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin
  • Test medium with antibiotic serves as a negative control
  • a porous membrane VWR, 150446, Whatman, Nuclepore Track-Etch Membrane, PC MB, 13 mm, 8.0 ⁇ m pore size, PVPF
  • each 800 ⁇ l of a cell suspension of a density is used of 2T0 5 cells / ml in the upper chamber of the Boyden chamber.
  • the chambers are incubated for 4 hours at 37 ° C, 5% CO2 and 95% humidity.
  • HEMACOLOR ® - fixing solution HEMACOLOR ® 2 - coloring reagent red HEMACOLOR ® 3 - coloring reagent blue, VWR International, 1.11957.2500.
  • the value of the positive control is set to 100% and all other values are related to it.
  • Rh-proNGF shows a significant migration induction of the corneal cells compared to migration in the test medium alone at a dose of 10 "6 M. Furthermore, at this dose rh-proNGF shows a significantly stronger migration induction compared to the migration caused by rh-NGF.
  • New Zealand albino rabbits (2.5 to 3.1 kg body weight, female) are surgically placed bilateral coma wounds.
  • the animals are z. B. with 25 mg / kg of Tiletamine-Zolazepam (Zoletil ® , VIRBAC) and 5 mg / ml of xylazine (Rompun ® 2%, BAYER AG).
  • a topical complementary anesthesia of the eye is done by dropping z.
  • the wound on the comea occurs on day 0 using a bilateral, centrally located 6 mm lamellar keratectomy.
  • the entire treatment is carried out under standardized aseptic conditions.
  • the comea of the animals is treated four times a day by dropping in 50 ⁇ l of a 0.9% saline solution or one containing rh-proNGF or rh-NGF (2 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml or 200 ⁇ g / ml protein) 0.9% saline solution starting on day 1 after wounding up to and including day 7 after wounding.
  • the wound healing process is followed daily from day 1 to day 7 by dropping a fluorescein solution into the eyes and digital photo documentation of morphological changes based on the corneal staining.
  • the wound size is determined using appropriate morphometry software (e.g. Focus ® , ESCIL).
  • morphometry software e.g. Focus ® , ESCIL.
  • rh-proNGF at a concentration of 2 ⁇ g / ml surprisingly has the strongest stimulatory effect on the healing of corneal wounds (Fig. 4) and also causes a greater acceleration in wound healing compared to rh-NGF. Almost complete healing of the wounds (> 98%) is achieved with this dose as early as the 4th day after wounding. On day 5 after wounding, almost complete healing of the wounds (> 98%) was achieved with rh-proNGF at a dose of 20 ⁇ g / ml and 200 ⁇ g / ml.
  • the EC 5 o-value was determined for rh-proNGF and rh-NGF a dose of 2 micrograms / ml in comparison to the vehicle control. Accordingly, wound size was reduced by 50% after 1.24 days with rh-proNGF treatment, while a 50% reduction was found after 1.28 days in the case of rh-NGF. When treating the eyes with the vehicle control, a 50% reduction in the wound area is only achieved after 1.42 days.
  • the comea of New Zealand albino rabbits (2.5 to 3.1 kg body weight, female) is made 4 times a day by dropping 50 ⁇ l of 0.9% saline or rh-proNGF-containing (200 ⁇ g / ml protein) 0 , 9% saline over a period of 6 days.
  • Diabetic sugar rats (360 to 425 g body weight, male) are surgically B. 2 skin wounds each.
  • the animals are z. B. anesthetized with 50 mg / kg of Tiletamine-Zolazepam (Zoletil ® 100, VIRBAC).
  • Two paravertebral areas are shaved and the skin is disinfected with povidone iodine (e.g. VETEDJNE ® solution, VETOQUINOL).
  • povidone iodine e.g. VETEDJNE ® solution, VETOQUINOL
  • 2 paravertebral symmetrical dermo-epidermal wounds with a size of e.g. B. 2.0 x 2.0 cm placed on the flanks of each animal.
  • the wounds are covered with an approx. 4.4 x 4.4 cm dressing (e.g. TEGADERM ® ) which is fixed by an elastic bandage (e.g. VETRAP ®
  • the skin wounds of the animals are treated four times a day by dropping 50 ⁇ l of a PBS solution or a rh-proNGF or rh-NGF-containing (3.8540 "6 M, 3.85-10 " 7 M) PBS solution. Treatment begins on day 1 after wounding and continues until day 10 after wounding. From day 11 to day 18, wounds are treated once a day. The wounds are all over . Treatment covered.
  • the wound healing process is photo-documented on days 0, 2, 4, 8, 10, 14 and 21 under standardized conditions.
  • the wound size is determined semi-automatically using appropriate morphometry software (e.g. SAMBA TITN image analyzer).
  • SAMBA TITN image analyzer e.g. SAMBA TITN image analyzer.
  • Fig. 5 The results of the morphometric evaluation are shown in Fig. 5 and Tab. 2.
  • the course of the wound healing (Fig. 5) shows that, in comparison to the vehicle control rli-proNGF, surprisingly, in both dosages, it shows a stimulatory effect on the early wound healing phase (day 2) that exceeds the effect mediated by rh-NGF.
  • day 2 On day 4 a stimulatory effect on wound healing was also observed for both rh-proNGF doses compared to the vehicle control. This effect is only surpassed by rh-NGF in the low dosage.
  • rh-proNGF shows the best wound healing stimulation in high doses.
  • the EC 25 and ECc> 5 values of wound healing were determined for both dosages rh-proNGF and rh-NGF in comparison to the vehicle control (Table 2).
  • this stimulation of the early wound healing phase is not significant compared to the vehicle control.
  • An almost complete healing of the wounds (95%) is surprisingly achieved with the high dosage of rh-proNGF after 13.56 days.

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Abstract

Die Erfindung beschreibt die Verwendung von proNGF, Derivaten des proNGF, mit Ausnahme solcher, bei denen der pro-Anteil vollständig deletiert wurde, und/oder einem funktionellen Teil hiervon in einer wirksamen Menge zusammen mit Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen der Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen, zur Lagerung und Stabilisierung der Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen, und zur in vitro-Vermehrung der Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen.

Description

Verwendung von proNGF, insbesondere zur Wundheilung der Cornea und der Haut
Die Erfindung betrifft neue Verwendungen von proNGF, Derivaten des proNGF und funktionellen Teilen von proNGF.
Allgemeiner Stand der Technik
Die Cornea hat die Funktion der Lichtbrechung als wesentliche Voraussetzung des scharfen Sehens. Die Cornea besteht aus 3 Schichten, einer äußeren Epithelschicht, dem Stroma und einer inneren Endothelschicht. Das Stroma ist durch die Bowmansche Membran nach außen und durch die Descement-Membran nach innen abgegrenzt. Läsionen der Cornea können in allen Schichten auftreten. Verletzungen der Epithelschicht werden durch Migrationsprozesse der Epithelzellen in frühen Phasen und Proliferationsprozesse in späten Phasen der Wundheilung ausgeglichen.
Stromaverletzungen werden durch Proliferations- und Migrationsprozesse von Keratinozyten des Stromagewebes sowie nach deren fibroblastischer Transformation durch die Produktion verschiedener Kollagene, im wesentlichen Typ I und Typ VI, ausgeglichen Läsionen des Endothels werden in Abhängigkeit der Spezies durch Proliferation und/oder Migration endothelialer Zellen ausgeglichen.
Verletzungen der Kornea können diese Funktion beeinträchtigen und in schweren Fällen zum Verlust des Augenlichts führen. Es werden verschiedene Ursachen cornealer Verletzungen beschrieben: viral-induzierte Keratitis, neurotrophe und neuroparalytische Keratitis, post-traumatische Keratitis, post-infektiöse Keratitis, post-chirurgische Keratitis, dystrophische, degenerative oder post-traumatische Keratitis aber auch Komeatransplantationen (lamellar, penetrierend). Darüber hinaus treten comeale Beeinträchtigungen in Zusammenhang mit eingeschränkter Tränenproduktion (z. B. durch Medikamente, Kontaktlinsen, gestörter Hormonhaushalt etc.), als Folge von Laserbehandlungen der Kornea, als Folge chemischer oder physikalischer Verbrennungen (Burn) und als Folge nichttraumatischer pathologischer Zustände (z. B. Autoimmunerkrankungen, Diabetes, Infektionen) auf. Die Heilung deraitiger cornealer Wunden ist häufig eingeschränkt und kann die postoperative bzw. posttraumatische Genesung erschweren. Nicht selten entstehen corneale Ulzerationen bis hin zu corneal en Perforationen.
Zur Behandlung cornealer Verletzungen existieren verschiedene Therapieansätze, die unter anderem Tränenersatzmittel in flüssiger und gelartiger Form, antiinflammatorische Substanzen (z. B. Kortikoide, Cyclosporin A, Antibiotika) und therapeutische Kontaktlinsen einschließen. Diese Applikationen zeigen jedoch nicht den optimalen Erfolg bei der Behandlung von Korneaschäden. Eine Therapie mit heilungs stimulierender Wirkung auf corneale Wunden wird daher angestrebt. Vor diesem Hintergrund wird zunehmend die Bedeutung von Wachstums faktoren für die Förderung von Wundheilungsprozessen, aber auch für die Aufrechterhaltung der Integrität der Augenoberfläche, diskutiert.
Eine Stimulation bzw. Induktion der dermalen Wundheilung ist dann von Bedeutung, wenn Wundheilungsstörungen vorliegen, die nicht selten chronische Wunden zur Folge haben können. Die Gefahr chronischer Wunden besteht, bei Nichtbehandlung, in der Notwendigkeit von Gliedmaßenamputationen und einer erhöhten Mortalitätsrate. Eine gestörte dermale Wundheilung findet man häufig in Zusammenhang mit Durchblutungsstörungen peripherer Gewebe (z. B. der Haut) und/oder verminderter peripherer Sensitivität sowie entzündlicher Prozesse. Als Beispiele dermaler Wundheilungsstörungen sind das diabetische Fußulkus, das venöse Ulkus oder das Druckulkus zu nennen.
Die konventionelle Behandlung dermaler Wunden besteht in der Anwendung verschiedener Wundauflagen, die ein feuchtes Milieu der Wunde aufrechterhalten sollen, aber auch von Kompressionsverbänden sowie der Gabe von Antibiotika zur Eindämmung bzw. Verhinderung von Infektionen. Darüber hinaus werden zusätzliche, die Wundheilung fördernde Agenzien eingesetzt, z. B. Protease-Hemmer, aber auch auf Wachstumsfaktorebene basierende Wundauflagen (OASIS™) bzw. Hautäquivalente (Apligraf, Deπnagraft). Auf Gelbasis ist derzeit ein PDGF-BB-basierendes Produkt auf dem Markt, welches die Wundheilung bei Patienten mit diabetischen Fußulkus stimuliert. Trotz dieser Therapieansätze ist die Zahl der aufgrund eines diabetischen Fußulkus notwendigen Amputationen enorm und beläuft sich allein in den USA auf 60 000 Amputationen pro Jahr.
Wachstumsfaktoren sind Proteine, die aufgrund ihrer spezifischen Wechselwirkung mit einem Rezeptor in der Lage sind, Zellteilungs-, Migrations-, Differenzierungs- und Reifungsprozesse anzuregen bzw. zu beeinflussen. Die Proteine lassen sich in großem Maßstab sowohl in genetisch modifizierten Eukaryoten als auch Prokaryoten herstellen (EP0994188, WO0022119). Die Bedeutung von Wachstums faktoren bei der Wundheilung der Haut wurde bereits nachgewiesen.
NGF aus den Speicheldrüsen der Maus (WO9848002, US2002037584) wurde als Wirkstoff zur Behandlung cornealer epithelialer Schädigungen beschrieben.
Die US6063757 beschreibt die Anwendung von rekombinantem humanen NGF zur Heilung cornealer und auch dermaler Schäden.
In der WO0044396 wird nach Applikation von murin em NGF eine Steigerung des Augeninnendrucks sowohl im Tiermodell (Kaninchen) als auch bei Patienten mit vermindertem Augeninnendruck beschrieben. Vor dem Hintergrund einer therapeutischen Anwendung von NGF bei cornealen Defekten ist eine solche Wirkung als möglicher Verursacher der Entwicklung von Schädigungen des Augenhintergrundes (Glaukom) negativ zu bewerten.
ProNGF ist das Vorläuferprotein des NGF. Humaner NGF wird in vivo als präproNGF synthetisiert. Die prä-Sequenz umfasst eine Länge von 21 Aminosäuren und wird nach der Translokation des Proteins in das endoplasmatische Retikulum abgespalten. Das entstandene Proprotein wird anschließend N- und C-terminal proteolytisch prozessiert, wodurch der reife NGF zugänglich wird. ProNGF besitzt ein Molekulargewicht von 49 kDa, besteht aus 221 Aminosäuren und tritt in seiner reifen Form als Homodimer auf. Die pro-Sequenz ist auf der Oberfläche des gefalteten NGF lokalisiert und nahezu unstrukturiert (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem. 2001, 268, 3296-3303; J. Mol. Biol. 2001, 305, 523-533).
In vivo wurde proNGF in verschiedenen Geweben detektiert. Darüber hinaus wurde die biologische Aktivität von NGF- Vorstufen und Peptidsequenzen des Precursorproteins in verschiedenen in vitro- und in vivo-Systemen (Induktion des Neuritenwachstums bzw. Umverteilung des F-Actin in PC12-Zellen, Steigerung der Aktivität cholin erger Enzyme nach intrazerebroventrikularer Injektion in neonatale Ratten) nachgewiesen (Chen et al., Mol. Cell. Endocrinol. 1997, 127, 129-136; Clos et al., Develop. Brain Res. 1997, 99, 267- 270). Die biologische Bedeutung von proNGF, von der aufgrund von Sequenzhomologien der Prosequenzen innerhalb der Neurotrophine und der Lokalisation in verschiedenen Geweben ausgegangen wird, ist bislang nicht geklärt. Einerseits werden Proproteine als Reservoir des reifen aktiven Proteins diskutiert. Daneben wird der pro-Sequenz eine Funktion als Helfer der Faltung des reifen Proteins (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem. 2001, 268, 3296-3303; J. Mol. Biol. 2001, 305, 523-533) oder eine Rolle bei der Sortierung der Neurotrophine hinsichtlich anaboler oder kataboler Wege (Farhadi et al, J. Neurosci. 2000, 20, 4059-4068) zugeschrieben.
Die pharmazeutische Aktivität von proNGF wurde zum ersten Mal in der EP 0 994 188 gezeigt. Im Beispiel 4f wird die Stimulierbarkeit und das Überleben sensorischer Neuronen aus dissoziierten Dorsalwurzelganglien anhand der Ausbildung von Neuriten untersucht. Bei diesen Versuchen ergab sich eine halb so große biologische Aktivität für den rekombinanten proNGF im Vergleich zum rekombinanten reifen ß-NGF. Aufgrund dieser Versuchsergebnisse wurde vorgeschlagen, rekombinanten proNGF zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Neuropathien einzusetzen. Eine Anwendung an Comea- und Conjunctivazellen und Hautzellen wird nicht beschrieben.
Die WO 96/08562 beschreibt NGF, welcher N-Terminal um ein Peptidfragment von bis zu ca. 19 Aminosäuren verlängert ist, wobei es sich bei diesem Peptidfragment um das C- terminale Fragment des Precursor- Anteils von NGF handelt. Dieser Precursor enthält am C-Terminus eine Konsensusspaltstelle des Furintyps, in der ein Austausch in der Aminosäure- 1 und/oder -2 erfolgt ist. Es wird vorgeschlagen, derartige NGF- Varianten in Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems einzusetzen, beispielsweise von degenerativen Erkrankungen des Nervensystems wie einer Degeneration der Retina, bei der Behandlung von Verletzungen oder Beschädigungen des Nervensystems usw. Eine Anwendung an Cornea- und Conjunctivazellen sowie Hautzellen wird nicht gezeigt.
Die EP 0786520 beschreibt N-terminal verlängerten ß-NGF, der, wie natüiiicher ß-NGF, eine Wirkung auf Neuronen zeigen soll. Eine Wirkung auf die hier vorgeschlagenen Indikationsgebiete wird nicht diskutiert.
Die Wirkung von Wachstumsfaktoren wird über deren Bindung an spezifische Rezeptoren vermittelt. Für NGF sind 2 Rezeptoren beschrieben, TrkA ein hochaffiner Rezeptor mit Tyrosinkinaktivität und P75 ein niedrig affiner Rezeptor, an den neben NGF auch andere neurotrophe Proteine sowie Zytokine binden. Die Expression von TrkA wurde in der Basalschicht des cornealen Epithels sowie im Stroma und Endothel nachgewiesen (Lambiase et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 1998, 39, 1272-1275; Lambiase et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 2000, 41, 1063-1069; You et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 2000, 41, 692-702). P75 wird von allen Zelltypen der Cornea exprimiert /Touhami et al., Invest. Ophtalmol. Vis. Sei. 2002, 43, 987-994). Im verletzten Corneagewebe kann eine Stimulierung der NGF-Rezeptorexpression zur verstärkten NGF-Bindung führen (Lambiase et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 2000, 41, 1063-1069).
Die Wirkung, die über die Interaktion des NGF mit den jeweiligen Rezeptoren vermittelt wird, ist bislang nicht bis in alle Details geklärt. P75 wird als Rezeptor beschrieben, über den apoptotische Prozesse vermittelt werden. Es wurde allerdings auch gezeigt, dass die durch TrkA vermittelten Prozesse wie Proliferation und Überleben sowie Differenzierung von Zellen in Gegenwart von P75 verstärkt werden können.
Auch für proNGF wird nach neuesten Untersuchungen aufgrund der Wechselwirkung mit den jeweiligen Rezeptoren von einer eigenständigen biologischen Funktion ausgegangen. So konnten Hempstead et al. (Science 2002, 294, 1945-1948) erstmals zeigen, dass an der Furinspaltstelle mutagenisiertes und damit nicht spaltbares rh-proNGF (rekombinanter humaner proNGF) im Vergleich zu NGF mit einer geringen Affinität an TrkA, jedoch mit einer höheren Affinität an P75 bindet. Die stärkere Wechselwirkung mit P75, dem Rezeptor, über den apoptotische Prozesse vermittelt werden, und die schwächere Wechselwirkung mit TrkA, dem Rezeptor, über den Proliferation und Überleben vermittelt werden, lassen für proNGF einen alternativen Wirkmechanismus im Vergleich zu NGF vermuten.
Die bevorzugte Bindung an P75 und die damit verbundene erhöhte Aktivierung der P75- vermittelten Signalkaskade wird als Ursache der durch proNGF induzierten Apoptoseprozesse gesehen. Die Induktion der Apoptose durch proNGF wurde sowohl für Zellen, die nur P75 exprimieren als auch für Neuronen, die beide Rezeptoren tragen, nachgewiesen. Nach diesen Ergebnissen wird proNGF als Stimulator von Apoptoseprozessen über eine P75 veiinittelte Signalkaskade angesehen, während NGF über dessen bevorzugte TrkA-Bindung das Überleben der Zellen auch in Gegenwart von P75 bewirken kann. In diesen Versuchen konnte eine um mindestens den Faktor 10 erhöhte Apoptose-Induktion im Vergleich zu reifem NGF festgestellt werden. Da P75 gerade bei Entzündungsprozessen, degenerativen Erkrankungen und bei Verletzungen zusammen mit Neurotrophinen exprimiert wird, scheint proNGF bei diesen Erkrankungen für die Induktion der hier ablaufenden apoptotischen Prozesse eine Rolle zu spielen.
Auch in der Veröffentlichung von Beattie et al. (Neuron 2002, 36, 375-386) wird gezeigt, dass der Neurotrophinrezeptor P75, der bei verschiedenen Verletzungen des Nervensystems induziert wird, durch seine Verbindung mit proNGF den Zelltod von Oligodendrozyten fördert. Durch proNGF spezifische Antikörper konnte die apoptotische Wirkung des proNGF-P75-Rezeptorkomplexes verhindert werden. Diese Daten zeigen, dass proNGF bei der Eliminierung von geschädigten Nervenzellen durch Aktivierung der P75-vermittelten Apoptose ein entscheidende Rolle spielt. Die Aktivierung von P75 durch proNGF bewirkt damit den Zelltod von Oligodendrozyten. Das Wechselspiel zwischen dem P75-Neurotrophinrezeptor und proNGF ist damit ein zentraler Punkt bei Apoptoseprozessen nach Verletzungen des Nervensystems.
Weitere Hinweise auf P75-vermittelte Apoptoseprozesse werden in Zusammenhang mit einer erhöhten proNGF-Konzentration im Gehirn von Alzheimer Patienten diskutiert (Fahnestock et al., Mol. Cell. Neurosci. 2001, 18, 210-220). Die oben beschriebenen, erst in jüngster Zeit veröffentlichten Untersuchungen, unter anderem in der höchst renommierten Wissenschaftszeitschrift Science, scheinen zu beweisen, dass proNGF Apoptoseprozesse induziert. Für einen auf diesem Gebiet arbeitenden Fachmann erscheint es damit kontraproduktiv, zur Behandlung von Wunden, beispielsweise von Verletzungen der Haut, der Cornea und der Conjunctiva, proNGF und seine Derivate einzusetzen. Die Ergebnisse lassen nämlich vermuten, dass bei Anwendung von proNGF bei der Behandlung von Wunden z. B. die geschädigten Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen abgetötet werden. Eine therapeutische Wirksamkeit von proNGF scheint ausgeschlossen.
Die in der WO 96/08562 und der EP 0 994 188 beschriebenen Versuche zur Wirksamkeit von proNGF und Derivaten von NGF mit einem Anteil von bis zu 19 Aminosäuren des Precursor- Anteils von NGF am N-Terminus wurden an sensorischen Neuronen und symphatischen Neuronen, an Neuronen der Dorsalwurzelganglien bzw. neuronalen embryonalen Zellen als Testsystemen durchgeführt. Experimente mit nicht neuronalen Systemen oder eine Übertragbarkeit auf derartige Systeme wurde nicht beschrieben. In der EP 0 994 188 wurde zudem auf eine signifikant schlechtere biologisch-medizinische Wirksamkeit von proNGF auf neuronale embryonale Zellen hingewiesen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Wirkstoff zur Wundheilung und zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen der Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen bereitzustellen.
Diese Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass proNGF, Derivate des proNGF, mit Ausnahme solcher, bei denen der pro-Anteil vollständig deletiert wurde, und oder ein funktioneller Teil hiervon in einer wirksamen Menge zusammen mit Trägerstoffen zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen von Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen, insbesondere - gewebe, einsetzbar sind. Die erfmdungsgemäß gewonnenen Ergebnisse lassen auch den Schluss zu, dass die genannten Wirkstoffe zur Lagerung und Stabilisierung von Haut-, Comea- und Conjunctivazellen sowie zur in-vitro-Vermehrung dieser Zellen geeignet sind.
Von der Erfindung umfasst werden auch Derivate des proNGF, bei denen ein oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht, deletiert, hinzugefügt und/oder chemisch modifiziert wurden, immer unter Beibehaltung der oben beschriebenen pharmazeutischen, medizinischen und biologischen Wirksamkeit.
Aminosäuresubstitutionen können auf Grundlage der Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, HydiOphilie, und/oder der amphipatischen (amphiphilen) Natur der involvierten Reste vorgenommen werden. Beispiele für unpolare (hydrophobe) Aminosäuren sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.
"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise im Bereich von ein bis fünf Aminosäuren. Der erlaubte Variationsgrad kann experimentell durch systematisch vorgenommene Insertionen, Deletionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken und durch Untersuchen der sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer biologischen Aktivität ermittelt werden.
Bei der Durchführung dieser Änderungen kann auch der hydropatische Index der Aminosäuren in Betracht gezogen werden. Jeder Aminosäure kann auf der Grundlage ihrer Hydrophobizität und ihrer Ladungseigenschaften ein bestimmter hydropatischer Index zugeschrieben werden. Beispiele hierfür finden sich in der WO 00/32039, in der US 4,554,101 sowie in Kyte & Doolittle, 1982, auf die hier mit ihrem Inhalt Bezug genommen wird. Es ist bekannt, daß bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren substituierbar sind, wenn sie einen ähnlichen hydropatischen Index besitzen und bei Ihrem Austausch eine vergleichbare biologische Aktivität des Gesamtmoleküls bewirken. Entscheidend ist bei allen Derivatisierungen des proNGF immer, daß die biologische, medizinische bzw. pharmazeutische Wirksamkeit beibehalten bleibt.
Die Derivatisierungen von proNGF können sich sowohl auf den pro-Anteil als auch auf den NGF-Anteil beziehen. Die Abänderungen des pro-Anteils umfassen auch Aminosäureadditionen am N-Terminus des pro-Anteils, die durch den pre-Anteil definiert sind. Die Sequenz des pre-Anteils, des pro-Anteils von NGF und von NGF selbst sind bekannt, und es wird hier beispielsweise verwiesen auf: http: //www .ncbi .nlm.nih. gov: 80/entrez/query . fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list uids=2173196&doρt=GenBank bzw. http://www.ncbi.nlm.nih.gov: 0/entrez/query.fcgi?cmd:=Retrieve&db=nucleotide&list uid s 2171804&dopt=GenBank sowie die EP-A-0 994 188.
Unter "funktioneil er Teil" von proNGF werden erfindungsgemäß solche Teile verstanden, welche die in der vorliegenden Anmeldung beanspmchten Indikationen und Verwendungen erfüllen, bei gleichzeitiger Ausschaltung, z.B. durch Deletion, solcher Anteile von proNGF, die zur Funktion nicht beitragen.
Die funktionellen Anteile können von einem Fachmann beispielsweise durch Deletionsanalysen ermittelt werden. Durch systematische Deletionen des pro-Anteils, des prepro-Anteils und/oder des NGF-Anteils und einer nachfolgenden Analyse des verbleibenden Moleküls auf die hier beschriebenen und beanspruchten Indikationen ist der Fachmann in der Lage, die gewünschten funktioneilen Abschnitte zu ermitteln. Beispielsweise sind derartige funktioneile Anteile die 25 bzw. 71 Aminosäuren des pro-C- Terminus von proNGF. Die funktionellen Anteile sollten möglichst unverändert bleiben, um die physiologische Funktion des proNGF, beispielsweise seine Bindung an den Rezeptor, zu gewährleisten. Aber auch in den funktionellen Anteilen sind Modifikationen, wie sie nachfolgend hier beschrieben werden, möglich. Die Anzahl und die Art der Modifikationen kann vom Fachmann experimentell bestimmt werden. So können ein oder mehrere Modifikationen im pro-, prepro- und/oder NGF-Anteil vorgenommen werden, beispielsweise Deletionen oder Substitutionen einer Aminosäure. Das derartig modifizierte Protein wird dann auf seine Funktionsfähigkeit im Rahmen der vorliegenden Erfindung untersucht, und es wird bestimmt, ob die vorgenommene Änderung eine Verbesserung oder Verschlechterung der Eigenschaften mit sich bringt.
Der Wirkstoff proNGF umfasst solchen humanen Ursprungs, tierischen Ursprungs, insbesondere von Nagern wie Ratte, Kaninchen und Maus, von Rind und Schwein, sowie rekombinant hergestellten proNGF. Zu den rekombinanten Formen des proNGF gehören auch Fusionsproteine des proNGF, bei denen proNGF mit einem anderen Protein bzw. Peptid verknüpft wurde. Zu Beispielen für NGF, in denen Fusionierungen mit Proteasen eine kontrollierte Freisetzung des NGF aus Matrices ermöglichen, verweisen wir auf Sakiyama-Elbert et al., FASEB J. 2001, 15, 1300-1302; Park et al, J. Drug Target 1998, 6, 53-64.
Die Derivate des pro-Anteils von NGF umfassen insbesondere solche pro-Formen, bei denen mindestens 25, weiterhin bevorzugt 71 Aminosäuren des pro-C-Terminus am N- Terminus des NGF vorhanden sind (Dicou et al, J. Cell. Biol. 1997, 136, 389-398). Weiterhin bevorzugt werden solche Derivate des proNGF, die auf Aminosäureebene eine Homologie zur pro-Form, zur prepro-Form und/oder zum NGF-Anteil des proNGF von mindestens 80% aufweisen, bevorzugt von 85 %, von 90 % oder von 95 % oder darüber. Homologie bedeutet, daß der angegebene Prozentsatz an Aminosäuren, bezogen auf die Ausgangsform des eingesetzten proNGF, zum Beispiel rh-proNGF, in identischer Form enthalten ist. Dies heißt, daß bevorzugt weniger als 15 %, insbesondere bevorzugt weniger als 10 % und noch weiter bevorzugt weniger als 5 % der Anzahl der Aminosäurereste in der Sequenz des proNGF unterschiedlich sind von den Aminosäureresten in der Sequenz der entsprechenden Domäne der Ausgangsform. Unterschiedlich heißt, daß sie beispielsweise gegen eine andere Aminosäure substituiert wurden, daß eine andere Aminosäure insertiert oder deletiert wurde oder eine Kombination hiervon. Hierunter fallen auch Veränderungen an der Aminosäure selbst, so beispielsweise Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Acetylierungen, Sulphatierungen oder Lipidierungen. Auch Verbindungen der Aminosäuren mit einer Markierung, beispielsweise einem Farbstoff wie einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Enzym, einem Toxin usw. sind möglich. All diese Abänderungen werden unter den Begriff "Derivate" subsummiert.
Die Anzahl und die Art der Modifikationen in den Derivaten ist immer begrenzt von der Beibehaltung der physiologischen Funktionen des proNGF, insbesondere natürlich von der Aufrechterhaltung der therapeutischen und prophylaktischen und der anderen funktionellen Eigenschaften des proNGF, wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden. Im allgemeinen werden nicht mehr als 10, bevorzugt nicht mehr als 5 und weiterhin bevorzugt weniger als 5 Modifikationen im proNGF vorgenommen. Im pro-Anteil werden bevorzugt maximal 5 Modifikationen eingeführt. Insbesondere sollen die funktionellen Abschnitte des pro-Anteils funktionell bleiben, also die Positionen 143 - 221 bzw. 78 - 221 des proNGF (Nummerierung der Positionen beginnend am N- Terminus des proNGF).
Voraussetzung für die erfindungsgemäße Anwendbarkeit der Derivate ist also immer, daß nach der Derivatisierung die Wirksamkeit in den hier beanspmchten Einsatzgebieten erhalten bleibt. Verschiedene Testsysteme zur Bestimmung der Aktivität des proNGF und seiner Derivate sind in den nachfolgenden Beispielen angegeben. Der Fachmann kann aber auch andere beispielhafte Testsysteme aus der Literatur ermitteln oder entwickeln (DRG- Test: Davies, in: Nerve Growth Factors (Rusch, R. A., ed.), 95-109, Wiley &Sons, Boston; PC12-Test: Greene und Tischler, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 1976, 73, 2424-2428; in vitro skin wound healing model: Geer et al., Tissue Eng. 2002, 8, 787-798; in vitro cornea wound healing model: Taliana et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 2001, 42, 81-89).
Die Derivatisierungen von proNGF können sowohl auf Aminosäure-Ebene stattfinden über direkte chemische Modifikationen von Aminosäuren. Bevorzugt ist aber eine Modifikation durch Mutagenese der für das Protein kodierenden DNA. Hierzu gehört beispielsweise die site directed-Mutagenese, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt ist und beständig weiterentwickelt wird (Brannigan und Wilkinson, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002, 3, 964- 970).
Die Herstellung von proNGF und seiner Derivate durch rekombinante Techniken ist beschrieben, und auf diese vorveröffentlichte Literatur wird hier Bezug genommen (Rattenholl et al., Eur. J. Biochem. 2001, 268, 3296-3303; Rattenholl et al., J. Mol. Biol. 2001, 305, 523-533).
ProNGF und die oben beschriebenen Derivate stimulieren die Proliferation und die Migration von Cornea-Zellen, Conjunctivazellen und dermalen Zellen, fördern die Aufrechterhaltung der Vitalität dieser Zellen und die Wundheilung der Haut und der Cornea, beispielsweise akuter und chronischer traumatisch-induzierter und nicht- traumatisch-induzierter Wunden. Auch werden die Regenerationsprozesse induziert und gefördert. Weitere Einzelheiten zur Wirksamkeit werden nachfolgend beschrieben. Die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können entweder als Einzelsubstanz oder in Verbindung mit den Derivaten des proNGF oder in Verbindung mit anderen Wirkstoffen eingesetzt werden. Insbesondere geeignete Wirkstoffe sind solche, die die Heilung stimulieren, entzündungshemmend wirken, antibiotische Eigenschaften haben, antivirale Wirksamkeit entfalten, antimykotische Stoffe und Wirksubstanzen, die Schmerzen lindern oder vorbeugen. Eine Vielzahl weiterer Wirkstoffkombinationen ist möglich, und hängt vom Anwendungszweck, vom zu behandelnden Patienten, von der Verträglichkeit der Wirkstoffe miteinander und weiteren, dem Fachmann bekannten Faktoren ab. Insbesondere sollen die weiteren in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen Wirkstoffe die Aktivität des proNGF- Wirkstoffs erhöhen oder dessen Aktivität bei der Behandlung in für den Patienten günstiger Form ergänzen. Bevorzugt ist eine synergistische Wirkung im Arzneimittel und eine Minimierung von Nebenwirkungen und unerwünschten Wirkungen.
Die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet, in der sie mit geeigneten Trägem in solchen Dosen vermischt werden, so daß die Erkrankung behandelt und/oder gelindert wird. Eine derartige Zusammensetzung kann (zusätzlich zu den Wirkstoffen und dem Träger) Verdünnungsmittel, Füllmaterialien, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel, Penetrations Verstärker und andere Materialien enthalten, die in der Technik wohlbekannt sind. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" ist als ein nichttoxisches Material definiert, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Inhalts Stoffes bzw. Wirkstoffes nicht stört. Die Auswahl des Trägers und der weiteren Additive hängt vom Verabreichungsweg ab. Bevorzugt wurden ophthalmologisch und dermatologisch verträgliche Träger und Additive eingesetzt.
Techniken zur Formuli erung bzw. Zubereitung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Ausgabe, zu finden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich ferner auf eine Menge der Verbindung, die ausreicht, um eine Verbesserung der Symptome zu erreichen, beispielsweise eine Behandlung, Heilung, Prävention oder Verbesserung derartiger Zustände. Geeignete Verabreichungswege sind insbesondere eine topische Anwendung. Hierzu können die Zusammensetzungen in flüssiger Form vorliegen, beispielsweise in Form von Emulsionen, Suspensionen und Lösungen, in Sprayform, in Form transdermaler Systeme wie Pflaster, in Form einer Creme, einer Salbe oder eines Gels. Bevorzugt werden auch Retardformen. Weitere, an sich bekannte Darceichungsforrnen sind dem Fachmann geläufig.
Die Menge an Wirkstoff, die adäquat ist, um die oben beschriebenen Wirkungen zu erreichen, wird als therapeutisch wirksame Dosis definiert. Die Menge, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen vom Schweregrad des Zustandes des Patienten und seiner Erkrankung ab. Einfache oder mehrfache Verabreichungen nach einem täglichen, wöchentlichen oder monatlichen Behandlungsplan können mit Dosisstärken und Mustem kombiniert werden, die durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden. Die einzusetzenden Dosen werden ebenfalls durch den Arzt bestimmt, wobei bevorzugt Mengen von 1 ng/ml bis 1 mg/ml bzw. 1 ng/g bis 1 mg/g, bevorzugt von 10 ng/ml bis 200 μg/ml bzw. 10 ng/g bis 200 μg/g eingesetzt werden. Selbstverständlich sind auch andere Wirkstoff dosen einsetzbar, die beispielsweise auch von der Formulierung des Wirkstoffs, von der Anwesenheit weiterer Wirkstoffe, vom einzelnen Patienten, vom Applikations ort, von der Art der Erkrankung usw. abhängen.
Es wird darauf hingewiesen, daß der Ausdruck "proNGF", wie er vorliegend eingesetzt wird, die in den Patentansprüchen angegebenen und der vorliegenden Beschreibung näher definierten Ausgestaltungen mit umfasst, also beispielsweise auch Derivate des proNGF.
Die beiliegenden Tabellen und Figuren zeigen:
Tabelle 1
Untersuchung des Augeninnendrucks während der Behandlung mit rh-proNGF über einen
Zeitraum von 7 Tagen.
Tabelle 2
25 % und 95 % Heilungszeiten, ausgedrückt in Tagen Abb. 1
Vergleich der Migrationsinduktion durch rh-NGF und rh-proNGF an 3T3-Zellen
(Fibroblasten der Maus)
Abb. 2
Vergleich der Proliferationsinduktion von rh-NGF und rh-proNGF an BCE C/D-lb-Zellen
(corneale Endothelzellen vom Rind)
Abb. 3
Vergleich der Migrationsinduktion von rh-NGF und rh-proNGF an BCE C/D-lb-Zellen
(corneale Endothelzellen vom Rind)
Abb. 4
Entwicklung der Wundfläche der Cornea während der Behandlung mit rh-proNGF und rh- NGF
Abb. 5
Entwicklung der Wundfläche der Haut während der Behandlung mit rh-proNGF und rh- NGF
Nachfolgend wird die Erfindung in weiteren Einzelheiten beschrieben, wobei der Fachmann aufgrund seines Fachwissens in der Lage ist, die Erfindung im Rahmen der Patentansprüche abzuwandeln, so daß auch Ausgestaltungen mitumfasst werden, die in der vorliegenden Beschreibung nicht gesondert aufgeführt sind.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung von proNGF zur Aufrechterhaltung der Vitalität cornealer Zellen und zur Stimulation proliferativer und migratorischer Prozesse von Zellen. ProNGF ist geeignet zur Behandlung cornealer und dermaler Verletzungen mit dem Ziel einer Unterstützung bzw. Stimulation cornealer und dermaler Regenerationsprozesse. Die proNGF-haltigen Zusammensetzungen sind geeignet zur Lagemng und Stabilisiemng von Comeas aufgmnd deren Fähigkeit, die Vitalität cornealer Zellen positiv zu beeinflussen.
Die zugrunde liegende Verwendung von proNGF und seiner Derivate zur Beschleunigung der Wundheilung beinhaltet weiterhin: I.) Bereitstellung einer ophthalmologisch und/oder dermatologisch verträglichen Zusammensetzung, die eine wirksame Konzentration an proNGF enthält, II.) Applikation der Zusammensetzung auf die Kornea präventiv vor einer Verletzung der Kornea oder therapeutisch nach einer Verletzung der Kornea mit dem Ziel eine klinisch nachweisbare Stimulation der Heilung der cornealen Verletzungen durch Stimulation proliferativer und/oder migratorischer Prozesse cornealer Zellen des Epithels, Stromas oder Endothels zu erreichen bzw. therapeutisch zur Behandlung dermaler Wunden mit dem Ziel, eine klinisch nachweisbare Stimulation der Heilung der Verletzungen durch Stimulation proliferativer und oder migratorischer Prozesse dermaler Zellen zu erreichen.
I Ophthalmologisch und/oder dermatologisch verträgliche Zusammensetzung, die proNGF enthält
A: Die Bezeichnung proNGF schließt ein: 1.) die Aminosäuresequenz des NGF, die N- terminal um die vollständige oder partielle Sequenz des Proproteins bzw. Präproproteins erweitert ist, wobei die Erweiterung mindestens die Aminosäuren ab Position 1 bis 25, weiterhin 1 - 71 des C-Terminus der Prosequenz umfasst und 2.) glykosyliert oder nicht glykosyliert vorliegt bzw. sich im Gfykosylierangsstatus unterscheidet, 3.) humanen oder nicht humanen Ursprungs ist, 4.) rekombinant oder nicht rekombinant gewonnen wird, 5.) als Fusionsprotein mit einem anderen heterologen Protein als Fusionspartner oder nichtfusioniert vorliegt, 6.) unmodifiziert oder modifiziert ist durch
Aminosäureaustausche, Deletionen oder Insertionen oder chemisch modifizierte Derivate des proNGF.
B: ProNGF kann mittels verschiedener Methoden gewonnen werden: 1.) Isolation aus humanem oder tierischem Gewebe, 2.) chemische Synthese z. B. Festphasenpeptidsynthese, 3.) Herstellung durch gentechnisch veränderte Pro- oder Eukaryoten. C: Ophthalmologisch verträgliche Zusammensetzungen sind Materialien wässriger, salbenartiger oder gelartiger Konsistenz, die einen pharmazeutisch akzeptierten Träger enthalten. Die Träger können steriles Wasser, verschiedene organische Lösungsmittel, emulsierende oder suspendierende Agenzien oder Verdünnungsmittel enthalten. Die Träger können physiologisch verträgliche oberflächenaktive ionische oder nichtionische Substanzen enthalten. Die Träger können antibakterielle, antifungale Komponenten und/oder Konservierangsstoffe (z. B. Parabene, Chlorbutanol, Sorbinsäure, Phenol, Thimerosal) enthalten. Die Träger können Puffer zur Aufrechterhaltung eines pH- Werts zwischen 5.0 und 8.0 enthalten. Die Puffer können konventionelle Puffer sein wie z. B. Phosphat-, Borat-, Zitrat-, Bikarbonat- oder Tris-HCl-Puffer. Die Träger können durch Zugabe entsprechender osmotisch aktiver Komponenten (z. B. Kochsalzlösung, Zucker) isotonisch sein. Die Träger können andere solubilisierende Komponenten wie proteinöse Träger oder Solubilisatoren (z. B. Albumin) enthalten. Die Träger können Antioxidantien und Stabilisatoren wie z. B. Natriumbisulfit, Natriummetabisulfit, Natriumthiosulfat, Thiohamstoff enthalten. Mögliche Benetzungsagenzien können z. B. Polysorbat 80, Polysorbat 20, Poloxamer 282 oder Tyloxapol sein. Die Träger können viskositäts steigernde Agenzien wie z. B. Dextran 40, Gelatine, Glycerin, Lanolin, Zellulosederivate (z.B. Hydroxyethylzellulose, Hydroymethylpropylzellulose,
Methylzellulose, Carboxymethylzellulose), Vinylpolymere (z.B. Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon) Hyaluronsäure, Polyacrylsäure, Petrolatum, Polyoxyethylen, Polyethylenglycol, Polyoxypropylen und/oder pflanzliche Öle zur Erleichterung der Applikation und/oder für eine bessere Tolerierbarkeit enthalten. Die Träger können Antibiotika zur Kontrolle von Infekten enthalten. Die Träger können Agenzien zur verlangsamten Freisetzung des Wachstumsfaktors enthalten. Alle Bestandteile des Trägers sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ophthalmologisch verträglich und nicht toxisch sind.
D: Wenn als ophthalmologisch verträglicher Träger zur Behandlung der Cornea Augentropfen verwendet werden, liegt die Konzentration des proNGF im Träger zwischen 1 ng/ml und 1 mg ml. Wenn als ophthalmologisch verträglicher Träger zur Behandlung der Comea Salben oder Gele verwendet werden, liegt die Konzentration des proNGF im Träger zwischen 1 ng/g und 1 mg/g. E: proNGF kann im ophthalmologisch verträglichen Träger alleine oder in Kombination mit anderen heilungsstimulierenden, antiinflammatorischen oder schmerzlindernden Substanzen eingesetzt werden.
F: Dermatologisch verträgliche Zusammensetzungen sind Materialien auf wässriger, salbenartiger, emulsions artiger, cremeartiger oder gelartiger Konsistenz, die einen pharmazeutisch akzeptierten Träger enthalten. Die Träger können steriles Wasser, verschiedene organische Lösungsmittel, emulsierende oder suspendierende Agenzien oder Verdünnungsmittel enthalten.
Die Träger können physiologisch verträgliche oberflächenaktive ionische oder nichtionische Substanzen. Die Träger können antibakterielle, antifungale Komponenten und/oder Konservierungsstoffe (z. B. Parabene, Chlorbutanol, Sorbinsäure, Phenol, Thimerosal) enthalten. Die Träger können Puffer zur Aufrechterhaltung eines definierten pH- Werts enthalten. Die Puffer können konventionelle Puffer sein wie z. B. Phosphat-, Borat-, Zitrat-, Bikarbonat- oder Tris-HCl-Puffer. Die Träger können andere solubilisierende Komponenten enthalten. Die Träger können Antioxidantien und Stabilisatoren enthalten. Die Träger können viskositäts steigernde Agenzien/Polymere wie z. B. Dextran 40, Gelatine, Glycerin, Zellulosederivate (z. B. Hydroxyethylzellulose, Hy droymethylpropylzellulos e, Methylzellulos e, Carboxymethylzellulose) ,
Polyethylenglycol, Vinylpolymere (z. B. Polyvinylalkohol, Polyvinylpolyvinylpyrrolidon), Polyacrylsäure und deren Derivate, Polyoxyethylene, Polyoxypropylen und deren Copolymere (z. B Pluronic), Polysaccharide (z. B. Hyaluronsäure, Heparin) Kollagen und/oder pflanzliche Öle bzw. Fettsäuren oder Fettsäureester bzw. -Derivate enthalten. Die Träger können Antibiotika zur Kontrolle von Infekten enthalten. Alle Bestandteile des Trägers sind dadurch gekennzeichnet, dass sie dermatologisch verträglich und nicht toxisch sind.
G: Bei Verwendung eines dermatologisch verträglichen Trägers zur Behandlung von Hautwunden auf Salben- Gel- oder Cremebasis, liegt die Konzentration des proNGF im Träger zwischen 1 ng/g und lmg/g. Bei Verwendung von Lösungen, Sprays etc. liegt die proNGF-Konzentration im Träger zwischen 1 ng/ml und 1 mg/ml. Wundauflagen können mit einer effektiven Dosis lyophilisierten proNGF's präpariert werden in einem Bereich zwischen 1 ng/cm2 und 1 mg/cm2.
H: proNGF kann im dermatologisch verträglichen Träger alleine oder in Kombination mit anderen heilungsstimulierenden, antiinflammatorischen oder schmerzlindernden Substanzen eingesetzt werden.
II Applikation
A: Die Applikation des proNGF-enthaltenden Trägers auf die Kornea kann präventiv vor einer Verletzung der Kornea oder therapeutisch nach einer Verletzung der Kornea erfolgen in einer Menge die ausreichend ist, eine klinisch nachweisbare Stimulation der Heilung der cornealen Verletzungen durch Stimulation proliferativer und/oder migratorischer Prozesse cornealer Zellen zu erreichen.
B: Der proNGF-enthaltende Träger wird auf die Kornea aufgebracht in einer Menge zwischen 10 und 500 μl, vorzugsweise 50 bis 100 μl.
C: Ein- oder mehrfache Applikationen auf die Kornea sind möglich, vorzugsweise ein- bis 4-fache Applikation täglich. Die Applikation kann zu jeder Zeit nach der Verletzung beginnen.
D: Unter Verletzungen der Cornea werden alle Vorgänge und Zustände verstanden die eine Schädigung aller Bereiche der Comea, des Epithels, des Stromas und des Endothels (einschließlich der Bowmanschen- und Descement- Membranen) verursachen oder charakterisieren. Dazu gehören sowohl oberflächliche Verletzungen als auch tiefe Wunden der gesamten Fläche der Comea. Beispiele für oberflächliche Wunden des Epithels und Stromas sind viral-induzierte, neurotrophe und neuroparalytische, post-traumatische, postinfektiöse, post-chirurgische, dy strophische, degenerative Keratitis aber auch Korneatransplantationen und corneale Beeinträchtigungen in Zusammenhang mit eingeschränkter Tränenproduktion (z. B. durch Medikamente, Kontaktlinsen, gestörter Hormonhaushalt etc.), als Folge von Laserbehandlungen, als Folge chemischer oder physikalischer Verbrennungen (Bum), Verätzungen, Prellungen, Perforationen, und als Folge nichttraumatischer pathologischer Zustände (z. B. Autoimmunerkrankungen, Diabetes).
Tiefe Verletzungen bis hin zum Endothel können z. B. durch Erkrankungen die mit der Entwicklung von Abnormitäten des Endothels einhergehen (z. B. Fuchs Dystrophie, aphakisch bullöse Keratopatie, pseudoaphakisch bullöse Keratopatie, virale Endothelitis, Iritis) oder durch operative Eingriffe im vorderen Augenbereich, z. B. nach Kataraktoperationen, penetrierender Keratoplasty, intraokularer Linseninsertion, intraokularem Linsenaustausch, Iridoplasty, Pupiloplasty, Trabeculectomy entstehen.
Die Aufbringung erfolgt bei der Behandlung von Cornea-Erkrankungen auf die Augenoberfläche und/oder in die vordere Augenkammer.
E: Die Applikation des proNGF-enthaltenden Trägers auf dermale Wunden erfolgt therapeutisch nach einer Verletzung in einer Menge die ausreichend ist, eine klinisch nachweisbare Stimulation der Heilung der dermalen Verletzung durch Stimulation proliferativer oder migratorischer Prozesse dermaler Zellen zu erreichen.
F: Der proNGF-enthaltende Träger wird auf die Hautwunde aufgebracht in einer Menge die ausreichend ist die Wundfläche zu bedecken.
G. Ein- oder mehrfache Applikationen auf die Hautwunde sind möglich, vorzugsweise ein- bis 2-fache Applikation täglich. Die Applikation kann zu jeder Zeit nach der Verletzung beginnen.
Unter "Haut" wird die Epidermis und das Korium mit ihren einzelnen Schichten verstanden. Zu den Einzelheiten wird hier auf die Stichwörter "Cutis", "Epidermis" und "Korium" in Pschyrembel, Kim. Wörterbuch, de Gruyter Verlag, Berlin-New York, letzte Auflage, hingewiesen.
H: Unter Verletzungen der Haut werden alle Vorgänge und Zustände verstanden, die eine Schädigung aller Bereiche der Haut verursachen oder charakterisieren. Dazu gehören sowohl oberflächliche Verletzungen als auch tiefe Hautwunden. Beispiele für dermale Wunden sind das diabetische Fußulkus, das venöse Ulkus und das Druckulkus, Hautwunden die mit systemischen Erkrankungen assoziiert sind (z. Bsp. systemische Sklerose, Rheumatoide Arthritis), Verletzungen der Haut durch chemische oder thermische Einwirkungen, durch Unfälle, durch Mikroorganismen wie Viren, Pilze und Bakterien usw. Dermale Wunden können akute oder chronische Wunden sein.
Die erfindungsgemäß eingesetzten proNGF- Wirkstoffe können auch zur Lagerung, zur Kultivierung und zur Herstellung in vitro von Comea-, Conjunctiva- und Hautzellen, Zellverbänden, insbesondere Zellgeweben, eingesetzt werden. Die Wirkstoffe werden dann in das Kulturmedium in einer die Lagerung und Kultivierung fördernden Menge zugegeben, die vom Fachmann bestimmt werden kann; bevorzugt werden Mengen von 1 ng/ml bis 100 μg/ml eingesetzt. Die Zugabe der proNGF- Wirkstoffe bewirkt eine Stimulation der Proliferation sowie eine Aufrechterhaltung der Vitalität der Haut-, Cornea- und Conjunctivazellen, fördert die Regeneration von verletzten Zellen und erleichtert damit die Lagemng und Stabilisiemng dieser Zellen und unterstützt die Kultivierung der Zellen in vitro. Die so gewonnenen Zellen können beispielsweise zur Transplantation bei Patienten mit geschädigten Haut-, Comea- und Conjunctivazell verbänden eingesetzt werden. Die Zellen können durch den Einsatz der proNGF- Wirkstoffe über einen längeren Zeitraum gelagert werden und fördern damit die Möglichkeit von Transplantationen von Haut-, Comea- und Conjunctivagewebe. Längere Transportzeiten vom Spender zum Empfänger des Transplantats können damit überbrückt werden.
Bei der Förderung der Proliferation und Migration der Zellen in Kultur können die Zellen in Verbindung mit Trägergeweben und verschiedensten Zelltypen kokultiviert werden. So ist es auch möglich, Comeazell-Mischgewebe herzustellen, um eine künstliche Comea zur Transplantation einzusetzen (Griffith et al, Comea 2002, 21(7 Suppl), S54-61; Germain et al., Prog. Retin. Eye. Res. 2000, 19, 497-527). Auch die Differenzierungsprozesse der Haut-, Comea- und Conjunctivazellen können durch die erfindungsgemäß eingesetzten proNGF-Moleküle angeregt werden.
Auch bei Conjunctivazellen wird die Proliferation in Verbindung mit dem proNGF- Wirkstoffen gefördert; unterstützt wird damit die Transplantation von Conjunctivagewebe bei Patienten, die beispielsweise am Trockenaugensyndrom leiden. Die EP0994188 und WO0022119 befassen sich mit der Herstellung von NGF (Nerve Growth Factor) aus proNGF und patentieren gleichzeitig die Substanz proNGF. In dem in diesen Patenten publizierten in vitro-Assay (Dorsal Root Ganglion Assay) wird eine vergleichbare Wirkung von proNGF und NGF hinsichtlich des Überlebens von Hühnerembryoneuronen beschrieben was eine vergleichbare Wechselwirkung mit den für NGF relevanten Rezeptoren TrkA bzw. P75 vermuten lässt. Hempstead et al. (Science 2002, 294, 1945-1948) konnten jedoch zeigen, dass an der Furinspaltstelle mutagenisiertes, nicht spaltbares rh-proNGF im Vergleich zu NGF mit einer geringeren Affinität an TrkA aber mit einer höheren Affinität an P75 bindet. Die bevorzugte Bindung des proNGF an P75 und die damit verbundene verstärkte Aktivierung der P75-vermittelten Signalkaskade wird als Ursache der durch proNGF induzierten Apoptoseprozesse beschrieben. In diesem Zusammenhang wird die durch diese unterschiedliche Rezeptorbindung beider Proteine vermittelte biologische Wirkung auf verschiedene Wirkmechanismen zurückgeführt.
Die Induktion der Apoptose durch proNGF wurde sowohl für Zellen, die nur P75 exprimieren als auch für Neuronen, die beide Rezeptoren tragen, nachgewiesen und scheint demnach durch die Koexpression des hochaffinen Rezeptors TrkA nicht beeinflusst zu werden. Nach diesen Ergebnissen wird proNGF als Stimulator von Apoptoseprozessen über eine P75 vermittelte Signalkaskade angesehen während NGF über dessen bevorzugte TrkA-Bindung das Überleben der Zellen auch in Gegenwart von P75 bewirken kann. Vor dem Hintergrund der durch Hempstead et al. publizierten Apoptoseinduktion durch proNGF scheint eine Anwendung von proNGF zur Stimulierung der comealen und dermalen Wundheilung und bei den anderen, hier beschriebenen Indikationen über die Induktion proliferativer und migratorischer Prozesse ungeeignet zu sein.
Bei Untersuchungen von proNGF in verschiedenen in-vitro Zellsystemen wurde überraschenderweise festgestellt, dass proNGF nicht wie bisher beschrieben die Apoptose induziert, sondern bei den erfindungsgemäß eingesetzten Zellen die Proliferation und das Überleben sowie die Migration von Zellen stimulieren. Im Vergleich zu NGF wurde in verschiedenen in vitro-Tests sogar eine stärkere Wirkung des proNGF auf die Proliferation und Migration cornealer Zellen nachgewiesen. Darüber hinaus konnte im Tierversuch gezeigt werden, dass proNGF eine stärkere Wirkung auf die Heilung künstlich gesetzter cornealer Wunden im Vergleich zu NGF hat. Demnach wird durch proNGF keine Apoptose in den von uns verw endeten Zellsystemen induziert. Alle diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der durch proNGF vermittelte Wirkmechanismus über eine Interaktion mit P75 nicht ausschließlich apoptotische Prozesse zu Folge hat sondern überraschenderweise auch proliferative oder migratorische Prozesse initiieren kann.
1.) Wirkung von proNGF auf die Migration von Fibroblasten
Bei dem hier beschriebenen in vitro-Testsystem zur Migrationsinduktion handelt es sich um Fibroblasten aus der Maus (3T3), die hinsichtlich der durch rh-proNGF und rh-NGF vermittelten Effekte auf die Migration im Boyden-Kammer-Test untersucht wurden. Wenn eine Apoptoseinduktion durch proNGF nach obigen Ergebnissen aufgrund der Wechselwirkung mit P75 zu erwarten sein sollte, sollte sich in diesem Test keine migratorische Aktivität der Zellen in Gegenwart von rh-proNGF nachweisen lassen. Überraschenderweise konnte in diesem Testsystem eine bislang nicht beschriebene stimulatorische Aktivität von rh-proNGF auf die Migration , der Fibroblasten in vitro gefunden werden. Der durch rh-proNGF vermittelte Effekt ist dabei vergleichbar zu dem durch rh-NGF vermittelten Effekt (Beispiel 1, Abb. 1).
2.) Wirkung von proNGF auf corneale Zellen
Bei den hier beschriebenen in vitro-Testsystemen handelt es sich um Zellen des Comeagewebes (BCE C/D 1-b), die hinsichtlich der durch proNGF und NGF- vermittelten Effekte untersucht wurden. Eine Apoptoseinduktion durch proNGF wäre nach obigen Ergebnissen aufgrund der Wechselwirkung mit P75 zu erwarten gewesen. Es wurde jedoch eine bislang nicht beschriebene stimulatorische Aktivität von proNGF auf die Proliferation und die Migration cornealer Zellen in vitro gefunden (Beispiel 2 und 3, Abb. 2 und 3). Überraschenderweise konnte in diesen Testsystemen im Gegensatz zu den bereits publizierten Daten zur Apoptoseinduktion durch proNGF kein Nachweis einer Apoptose erbracht werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass proNGF im Vergleich zu NGF eine stärkere Proliferationsinduktion (Abb. 2) sowie eine signifikant stärkere Migrationsinduktion (Abb. 3) boviner Corneazellen (BCE C/D 1-b) auslöst. 3.) Wirkung von proNGF auf die Heilung cornealer Wunden im Tiermodell
Im Kaninchenmodell konnte übeiTschenderweise gezeigt werden, dass die Wundheilung nach Setzung künstlicher Wunden der Cornea durch proNGF beschleunigt verläuft und keine Anzeichen einer Apoptoseinduktion durch rh-proNGF zu beobachten sind (Beispiel 4). Überraschenderweise konnte im Vergleich zu rh-NGF gezeigt werden, dass die durch proNGF vermittelte Stimulation der Wundheilung beschleunigt ist. So wird bei einer Dosis von 2 μg/ml rh-proNGF eine fast vollständige Wundheilung (>98%) nach 4 Tagen erreicht. Für rh-NGF einer Dosis von 2 μg/ml wird eine >98%ige Wundheilung am Tag 5 erreicht während die Vehikelkontrolle erst an Tag 7 zu mehr als 98% abgeheilt war. Mit rh- proNGF wird demnach ein besserer Effekt als mit rh-NGF erreicht.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass keinerlei toxische Effekte bzw. eine Beeinflussung des Augeninnendrucks durch rh-proNGF verursacht werden (Tabelle 1). Auch diese Ergebnisse sprechen gegen eine proNGF-vermittelte Apoptoseinduktion im comealen Gewebe.
Die Erfindung umfaßt damit auch Verfahren zur Behandlung des menschlichen und tierischen Körpers, nämlich die Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen der Haut, Comea und Conjunctiva, wobei eine therapeutisch wirksame Menge an proNGF und/oder Derivaten des proNGF, mit Ausnahme solcher, bei denen der pro-Anteil vollständig deletiert wurde, und/oder einem funktionellen Teil hiervon zusammen mit Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln verabreicht werden. Weitere Ausgestaltungen des Verfahrens ergeben sich aus den beiliegenden Patentansprüchen sowie aus der vorliegenden Beschreibung. Die einzusetzende Dosis hängt von der Art der zu therapierenden Erkrankung, vom Patienten, von der Zubereitungsform, von der Applikationsart, von der Schwere der Erkrankung und von weiteren, an sich bekannten Parametern ab. Gleiches gilt für die Prophylaxe. Durch übliche Versuche in vitro, am Tiermodel und im Rahmen klinischer Studien am Patienten können die geeigneten Zubereitungsformen, Applikationsformen sowie Dosis-Wirkungs-Beziehungen bestimmt werden.
Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele illustriert. Alle Beispiele dienen der Illustration und sind nicht einschränkend zu verstehen. Beispiel 1
Migrationsinduktion muriner Fibroblasten (3T3)
Die Zellen werden in Vollmedium (DMEM (Sigma D 5796) mit 10% FBS (Sigma, F- 2442) und 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (Sigma, P-4333) bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Bei Erreichen einer Konfluenz von ca. 60% werden die Zellen trypsinisiert. Je 210 μl einer rh-NGF bzw. rh-proNGF-haltigen Lösung verschiedener Konzentrationen (z. B. rh-NGF : 10"7, 10"8, 10"9 M; rh-proNGF : 5-10"7, 5T0"8, 5-10"9, 5-10"10 M) in Testmedium (DMEM mit 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin) werden in die untere Kammer einer Boyden-Kammer (Blind well, 8 mm Durchmesser, 200 μl well (BW200L), Neuro Probe Inc.) gegeben. Als Positivkontrolle dient Vollmedium (s.o.), als Negativkontrolle dient Testmedium mit Antibiotikum. Nach Auflage einer porösen Membran (VWR, 150446, Whatman, Nuclepore Track-Etch Membrane, PC MB, 13 mm, 8.0 μm Porengröße, PVPF) werden je 800 μl einer Zellsuspension einer Dichte von 2-105 Zellen/ml in die obere Kammer der Boyden- Kammer gegeben. Die Kammern werden 4 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Danach werden die Kammern auseinander geschraubt und die Membranen mittels Hämalaun/Eosin (HEMACOLOR® - Fixierlösung HEMACOLOR® 2 - Färbereagenz rot HEMACOLOR® 3 - Färbereagenz blau, VWR International, 1.1 1957.2500) gefärbt. Je 5 Felder werden je Filter im gesamten Feld eines Netzmikrometer-Okulars (lOx Vergrößerung, 12.5 mm2 = Großquadrat, bestehend aus 100 Kleinquadraten) ausgezählt und gemittelt. Der Wert der Positivkontrolle wird 100% gesetzt und alle anderen Werte werden darauf bezogen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels t-Test ( = 0.05)
Die Ergebnisse sind in Abb. 1 dargestellt.
Rh-proNGF zeigt bei den Dosen 5-10"7 M und 5T0"8 M eine signifikante
Migrationsinduktion muriner Fibroblasten im Vergleich zur Migration im Testmedium alleine. Weiterhin wird durch rh-proNGF eine vergleichbare Migrationsinduktion wie durch rh-NGF nachgewiesen.
Beispiel 2
Proliferationsinduktion endothelialer Comeazellen (BCE C/D 1-b)
Die Zellen werden in Vollmedium (DMEM (Sigma, D-6046) mit 5% FBS (Sigma, F-2442) und 10%o Kälbersemm (Sigma, C-8056), 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (Sigma, P-4333) sowie 150 μM Monothioglycerol (Sigma, M-6145) bei 37°C, 5% CO2 und 95%o Luftfeuchtigkeit kultiviert. Bei Erreichen einer Konfluenz von ca. 80% werden die Zellen trypsinisiert. Je 1 ml Zellsuspension einer Dichte von 5-104 Zellen/ml wird in die wells einer 24-Loch Platte ausgesät. Die Zellen werden 24 Stunden in Vollmedium kultiviert, danach wird das Medium entnommen, die Zellen 3x mit sterilem PBS gewaschen und anschließend in jeweils 1 ml Testmedium (DMEM mit 1% FBS sowie 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin) welches die zu testenden Proteine rh-NGF oder rh-proNGF in verschiedenen Konzentrationen (z. B. 10"7 M, 10"9 M, 10"11 M) enthält, aufgenommen. Die Zellen werden weitere 48 Stunden kultiviert und die Proliferation anschließend mit Hilfe des Nachweises des BrdU-Einbaus (Röche, 144611) in die zelluläre DNA über anti-BrdU spezifische Antikörper entsprechend der dazu vorliegenden Vorschrift nachgewiesen.
Die Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt.
Rh-proNGF zeigt bei allen Dosen (10"7 M, 10~9 M und 10"u M) eine signifikante
Proliferationsinduktion cornealer BCE C/D 1-b-Zellen im Vergleich zur Proliferation im
Testmedium alleine. Weiterhin wird durch rh-proNGF eine stärkere
Proliferationsinduktion im Vergleich zur Proliferationsinduktion durch rh-NGF nachgewiesen. Beispiel 3
Migrationsinduktion endothelialer Corneazellen (BCE C/D 1-b)
Die Zellen werden in Vollmedium (DMEM (Sigma, D-6046) mit 5% FBS (Sigma, F-2442) und 10% Kälberserum (Sigma, C-8056), 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (Sigma, P-4333) sowie 150 μM Monothioglycerol (Sigma, M-6145) bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Bei Erreichen einer Konfluenz von ca. 80% werden die Zellen trypsinisiert. Je 210 μl einer rh-NGF bzw. rh-proNGF-haltigen Lösung verschiedener Konzentrationen (z. B. NGF : 10"6, 10~7, 10"8 M; proNGF : 10"6, 10"7, 10"8 M) in Testmedium (DMEM mit 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin) werden in die untere Kammer einer Boyden-Kammer (Blind well, 8 mm Durchmesser, 200 μl well (BW200L), Neuro Probe Inc.) gegeben. Als Positivkontrolle dient Vollmedium (s.o.), als Negativkontrolle dient Testmedium mit Antibiotikum. Nach Auflage einer porösen Membran (VWR, 150446, Whatman, Nuclepore Track-Etch Membrane, PC MB, 13 mm, 8.0 μm Porengröße, PVPF) werden je 800 μl einer Zellsuspension einer Dichte von 2T05 Zellen/ml in die obere Kammer der Boyden-Kammer gegeben. Die Kammern werden 4 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Danach werden die Kammern auseinander geschraubt und die Membranen mittels Hämalaun/Eosin (HEMACOLOR® - Fixierlösung HEMACOLOR® 2 - Färbereagenz rot HEMACOLOR® 3 - Färbereagenz blau, VWR International, 1.11957.2500) gefärbt. Je 5 Felder werden je Filter im gesamten Feld eines Netzmikrometer-Okulars (lOx Vergrößerung, 12.5 mm2 = Großquadrat, bestehend aus 100 Kleinquadraten) ausgezählt und gemittelt. Der Wert der Positivkontrolle wird 100% gesetzt und alle anderen Werte werden darauf bezogen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels t-Test (α = 0.05)
Die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt.
Rh-proNGF zeigt bei einer Dosis von 10"6 M eine signifikante Migrationsinduktion der Corneazellen im Vergleich zur Migration im Testmedium alleine. Weiterhin wird bei dieser Dosis durch rh-proNGF eine signifikant stärkere Migrationsinduktion im Vergleich zu der durch rh-NGF verursachten Migration nachgewiesen. Beispiel 4
In vivo - Beschleunigung der Heilung künstlich gesetzter Wunden der Comea
New Zealand Albino-Kaninchen (2,5 bis 3,1 kg Körpergewicht, weiblich) werden operativ bilaterale Comeawunden gesetzt. Dazu werden die Tiere z. B. mit 25 mg/kg Tiletamine- Zolazepam (Zoletil®, VIRBAC) und 5 mg/ml Xylazine (Rompun® 2%, BAYER AG) anästhesiert. Eine topische Komplementäranästhesie des Auges wird durch Eintropfen von z. B. Tetracaϊne 1% (TVM) erreicht. Die Wundsetzung auf der Comea erfolgt am Tag 0 durch Anwendung einer bilateralen, zentral lokalisierten 6 mm lamellaren Keratektomie. Die gesamte Behandlung erfolgt unter standardisierten aseptischen Bedingungen. Die Behandlung der Komea der Tiere erfolgt 4x täglich durch Eintropfen von 50 μl einer 0,9%-Kochsalzlösung oder einer rh-proNGF- bzw. rh-NGF-haltigen (2 μg/ml, 20 μg/ml oder 200 μg/ml Protein) 0,9%-Kochsalzlösung beginnend am Tag 1 nach Wundsetzung bis einschließlich Tag 7 nach Wundsetzung.
Der Wundheilungsverlauf wird täglich von Tag 1 bis Tag 7 durch Eintropfen einer Fluoresceinlösung in die Augen und digitale Photodokumentation morphologischer Verändemngen anhand der Corneafärbung verfolgt. Die Wundgröße wird mittels entsprechender Morphometrie-Software (z. B. Focus®, ESCIL) bestimmt. Zur Bestimmung des EC5o-Wertes als Zeitpunkt zu dem 50% der Wunde abgeheilt sind, wird als 100% Wundfläche die Wundgröße am Tag 1 nach Wundsetzung zugrunde gelegt. Alle anderen Rohdaten werden darauf bezogen.
Die Ergebnisse der morphometrischen Auswertung sind in Abb. 4 dargestellt. Im Vergleich zur Kontrolle konnte gezeigt werden, dass rh-proNGF einer Konzentration von 2 μg/ml überraschenderweise den stärksten stimulatorischen Effekt auf die Heilung cornealer Wunden hat (Abb. 4) und auch im Vergleich zu rh-NGF eine stärkere Wundheilungsbeschleunigung verursacht. Eine fast vollständige Abheilung der Wunden (>98%) wird mit dieser Dosis bereits am 4. Tag nach Wundsetzung erreicht. Am Tag 5 nach Wundsetzung wird eine fast vollständige Heilung der Wunden (>98%) durch rh-proNGF einer Dosis von 20 μg/ml und 200 μg/ml erreicht. Mit rh-NGF einer Konzentration von 2 μg/ml und 20 μg/ml wird eine fast vollständige Heilung (>98%) der comealen Wunden am Tag 5 erreicht während die höhere rh-NGF-Dosierung (200 μg/ml) erst am Tag 6 eine >98%ige Wundheilung aufweist. Die mit der Vehikelkontrolle behandelten Tiere zeigten erst am 7. Tag nach Wundsetzung eine fast vollständige Abheilung (>98 >) der comealen Wunden. Diese Reduzierung der Wundheilungsdauer durch rh-proNGF um nahezu 50% ist von großer klinischer Relevanz.
Der EC5o-Wert wurde für rh-proNGF und rh-NGF einer Dosis von 2 μg/ml im Vergleich zur Vehikelkontrolle ermittelt. Demnach hat sich die Wundgröße mit einer rh-proNGF- Behandlung nach 1,24 Tagen um 50% reduziert während man im Falle des rh-NGF eine 50%ige Reduktion nach 1,28 Tagen findet. Bei Behandlung der Augen mit der Vehikelkontrolle wird eine 50%ige Verringerung der Wundfläche erst nach 1,42 Tagen erreicht.
Ein apoptotisches Potential des rh-proNGF kann in diesem in vivo-Versuch nicht nachgewiesen werden.
Beispiel 5
Die Comea von New Zealand Albino-Kaninchen (2,5 bis 3,1 kg Körpergewicht, weiblich) wird 4x täglich durch Eintropfen von 50 μl einer 0,9%-Kochsalzlösung oder rh-proNGF- haltigen (200 μg/ml Protein) 0,9%-Kochsalzlösung über einen Zeitraum von 6 Tagen behandelt.
Der Augeninnendruck und mögliche Intoleranzanzeichen (Spaltlampe) werden am Tag vor
Behandlungsbeginn (Tag 0) und an weiteren 6 Behandlungstagen (Tag 1 bis Tag 7) untersucht.
Für rh-proNGF konnte im Gegensatz zu murinem NGF (WO0044396) kein Einfluss auf den Augeninnendruck nachgewiesen werden (Tab. 1), was als Vorteil des rh-proNGF zu bewerten ist.
Nach ophthalmologischen Untersuchungen verschiedener Parameter (z. B. corneale Trübung, Rötung, Chemosis, corneale Neovaskularisierung, Photophobie, Epiphorie, Blepharospasmus, Pupillendurchmesser, konjunktivale Hyperämie, Infektionen) konnten keine Anzeichen von Unverträglichkeiten oder toxischen Nebeneffekten nachgewiesen werden. Auch diese Ergebnisse sprechen gegen ein apoptotisches Potential des rh-proNGF
Beispiel 6
Verbesserte Heilung künstlich gesetzter Wunden der Haut
Diabetischen Zucker-Ratten (360 bis 425 g Körpergewicht, männlich) werden operativ z. B. jeweils 2 Hautwunden gesetzt. Dazu werden die Tiere z. B. mit 50 mg/kg Tiletamine- Zolazepam (Zoletil® 100, VIRBAC) anästhesiert. Zwei paravertebrale Areale werden rasiert und die Haut wird mit Povidon Iodin (z. B. VETEDJNE®-Lösung, VETOQUINOL) desinfiziert. Unter Erhaltung des Panniculus camosius werden 2 paravertebrale symmetrische dermo-epidermale Wunden einer Größe von z. B. 2.0 x 2.0 cm an den Flanken jedes Tieres gesetzt. Die Wunden werden mit einem ca. 4.4 x 4.4 cm großen Dressing (z. B. TEGADERM®) welches durch eine elastische Binde (z. B. VETRAP®, COVELY) fixiert wird, abgedeckt. Die gesamte Behandlung erfolgt unter standardisierten aseptischen Bedingungen.
Die Behandlung der Hautwunden der Tiere erfolgt 4x täglich durch Auftropfen von jeweils 50 μl einer PBS-Lösung bzw. einer rh-proNGF- oder rh-NGF-haltigen (3.8540"6 M, 3.85- 10"7 M) PBS-Lösung. Die Behandlung beginnt am Tag 1 nach Wundsetzung und wird bis einschließlich Tag 10 nach Wundsetzung fortgesetzt. Von Tag 11 bis Tag 18 wird die Behandlung der Wunden lx täglich durchgeführt. Die Wunden werden über die gesamte . Behandlung abgedeckt.
Der Wundheilungs verlauf wird an den Tagen 0, 2, 4, 8, 10, 14 und 21 unter standardisierten Bedingungen photodokumentiert. Die Wundgröße wird semi automatisch mit einer entsprechenden Morphometrie-Software (z. B. SAMBA TITN image analyzer) bestimmt. Die Auswertung der Wundflächen entsprechend der Bewertung einer 25% und 95% Heilungszeit als Zeitpunkt zu dem 25% oder 95%> der Wundfläche geschlossen sind, wurde auf die Wundgröße am Tag 0 (= 100 %) bezogen.
Die Ergebnisse der morphometrischen Auswertung sind in Abb. 5 und Tab. 2 dargestellt. Der Wundheilungsverlauf (Abb. 5) zeigt, dass im Vergleich zur Vehikelkontrolle rli-proNGF überraschenderweise in beiden Dosiemngen eine stimulatorische Wirkung auf die frühe Wundheilungsphase (Tag 2) zeigt, welche den durch rh-NGF vermittelten Effekt übersteigt. Am Tag 4 wird für beide Dosiemngen rh-proNGF im Vergleich zur Vehikelkontrolle ebenfalls eine stimulatorische Wirkung auf die Wundheilung beobachtet. Dieser Effekt wird nur von rh- NGF in der niedrigen Dosierung übertroffen.
Zwischen den Tagen 4 und 10 wird für rh-proNGF und rh-NGF in allen Dosiemngen eine Verlangsamung der Wundheilungsstimulation beobachtet. Für beide Proteine wird in den geringen Dosiemngen jedoch trotzdem eine im Vergleich zur Vehikelkontrolle stimulierende Heilung beobachtet.
Am Tag 14 wird für rh-proNGF in allen Dosierungen eine verbesserte Wundheilung im Vergleich zu rh-NGF und zur Vehikelkontrolle beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt zeigt rh- proNGF in der hohen Dosierung die beste Wundheilungsstimulation.
Die EC25- und ECc>5 -Werte der Wundheilung wurden für beide Dosiemngen rh-proNGF und rh-NGF im Vergleich zur Vehikelkontrolle ermittelt (Tab. 2).
Die 25% Wundheilung wird durch rh-proNGF in beiden Dosiemngen (hohe Dosis: [9,59 μg /Behandlung]: EC25 = 2,84 Tage; niedrige Dosis [0,96 μg /Behandlung]: EC25 = 2,92 Tage) und durch rh-NGF in der niedrigen Dosierung [0,5 μg/Behandlung]: (EC25 = 3,01 Tage) im Vergleich zur Vehikelkontrolle (EC25= 3,29 Tage) stimuliert. Allerdings ist diese Stimulation der frühen Wundheilungsphase im Vergleich zur Vehikelkontrolle nicht signifikant. Eine fast vollständige Abheilung der Wunden (95%) wird überraschenderweise mit der hohen Dosierung von rh-proNGF nach 13,56 Tagen erreicht. Im Vergleich zur Vehikelkontrolle mit einem ECgs-Wert von 15,49 Tagen ist diese Verbesserung der Wundheilung statistisch signifikant (p = 0,029; Mann &Whitney, α = 5%). Die für eine fast vollständige Wundheilung erforderliche Zeit ist bei einer Behandlung mit rh-proNGF im Vergleich zur Vehikelkontrolle um ca. 15% verringert. Überraschenderweise konnte in diesem in vivo-Versuch kein Hinweis gefunden werden, dass rh-proNGF Apoptose induziert.
Abschließend wird darauf hingewiesen, daß zur vollständigen Offenbarung der Inhalt der in der Anmeldung genannten Dokumente vollständig in die Anmeldung mit aufgenommen wird. Tab.1
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enzener esswer
Tab. 2
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*: kalkulierte Daten

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verwendung von proNGF, Derivaten des proNGF, mit Ausnahme solcher, bei denen der pro-Anteil vollständig deletiert wurde, und/oder einem funktionellen Teil hiervon in einer wirksamen Menge zusammen mit Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen der Haut-, Comea- und Conjunctivazellen, zur Lagerung und Stabilisierung der Haut-, Comea- und Conjunctivazellen, und zur in vitro-Vermehrung der Haut-, Comea- und Conjunctivazellen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Derivate des proNGF ausgewählt sind aus proNGF, bei dem ein oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht, deletiert, hinzugefügt und/oder chemisch modifiziert sind, wobei die pharmazeutische Wirksamkeit erhalten bleibt.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Derivate des proNGF , bei denen ein oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt sind, die prepro-Form von NGF beinhalten.
4. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Derivate ausgewählt sind aus proNGF mit mindestens 25 oder 71 Aminosäuren des pro-C-Temώius und/oder aus Derivaten mit mindestens 80 %, 85%, 90% oder 95% Homologie zum pro-, prepro- und/oder NGF-Anteil des proNGF.
5. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei proNGF ausgewählt ist aus tierischem oder humanem proNGF, aus Gewebe isoliertem oder rekombinant hergestelltem proNGF, und/oder proNGF-
Fus ionsproteinen.
6. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verwendung die Stimulation der Proliferation und Migration von Comea- und Conjunctivazellen und dermalen Zellen, die Aufrechterhaltung der Vitalität von Haut-, Comea- und Conjunctivazellen, die Wundheilung von Haut-, Comea- und Conjunctivazellen und die Unterstützung und Stimulation von Regenerationsprozessen von Comea- und Conjunctivazellen und dermalen Zellen einschließt.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die corneale und dermale Wundheilung akute und chronische traumatisch- induzierte und nicht-traumatisch-induzierte Wunden umfasst.
8. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, enthaltend weitere Wirkstoffe.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die weiteren Wirkstoffe ausgewählt sind aus die Heilung stimulierenden, antiinflammatorischen, antibiotischen, antiviralen, antimykotischen und/oder schmerzlindernden Stoffen.
10. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das proNGF, die Derivate des proNGF, mit Ausnahme solcher, bei denen der proAnteil vollständig deletiert wurde, und oder die funktionellen Teile hiervon in einer Menge von 1 ng/ml bis 1 mg/ml oder 1 ng/g bis 1 mg/g vorliegen.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Menge 10 ng/ml bis 200 μg/ml oder 10 ng/g bis 200 μg/g beträgt.
12. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, wobei die Wirkstoffe als topisch applizierbare Zusammensetzung vorliegen.
13. Vei-wendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, wobei die Wirkstoffe in Form einer Flüssigkeit, einer Creme, einer Salbe oder eines Gels vorliegen.
14. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, wobei die Haut-, Comea- und Conjunctivazellen in Form von Zellgewebe vorliegen.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998048002A1 (en) * 1997-04-24 1998-10-29 Alessandro Lambiase Use of nerve growth factor for the storage, culture or treatment of cornea

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Title
IBANEZ, CARLOS F.: "Jekyll-Hyde neurotrophins: the story of proNGF", TRENDS IN NEUROSCIENCES , 25(6), 284-286 CODEN: TNSCDR; ISSN: 0166-2236, 2002, XP002285011 *

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121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase