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WO2004051231A1 - 分離装置および分離方法 - Google Patents

分離装置および分離方法 Download PDF

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Publication number
WO2004051231A1
WO2004051231A1 PCT/JP2003/015260 JP0315260W WO2004051231A1 WO 2004051231 A1 WO2004051231 A1 WO 2004051231A1 JP 0315260 W JP0315260 W JP 0315260W WO 2004051231 A1 WO2004051231 A1 WO 2004051231A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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substance
separation
adsorbed
sample
channel
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/015260
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toru Sano
Masakazu Baba
Kazuhiro Iida
Hisao Kawaura
Noriyuki Iguchi
Wataru Hattori
Hiroko Someya
Minoru Asogawa
Original Assignee
Nec Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nec Corporation filed Critical Nec Corporation
Priority to JP2004556860A priority Critical patent/JPWO2004051231A1/ja
Priority to US10/536,798 priority patent/US20060000772A1/en
Publication of WO2004051231A1 publication Critical patent/WO2004051231A1/ja

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    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption

Definitions

  • the present invention relates to a separation device, a separation method, and a mass spectrometry system, and more particularly, to a separation device utilizing a specific interaction between substances.
  • an affinity adsorbent is prepared by immobilizing a substance that has a specific interaction with the substance to be separated and purified on an insoluble carrier, and the affinity adsorbent is packed into a column and used in a sample solution.
  • This is a chromatography in which the target substance is adsorbed on an affinity adsorbent and separated.
  • Affinity chromatography is a method that is particularly useful for separating and purifying biological substances because it separates components using specific interactions between substances.
  • affinity chromatography performed by packing the column was not necessarily suitable in terms of a design that efficiently separates a small amount of sample.
  • microchips with on-chip separation and analysis functions for biological substances are being actively conducted.
  • These microchips are provided with fine separation channels and the like using microfabrication technology, so that an extremely small amount of sample can be introduced into the microchip to perform separation.
  • Patent Document 1 As a technology utilizing such a microchip, an attempt to introduce a technique of affinity chromatography has been proposed (Patent Document 1).
  • the flow channel is provided with a region filled with an affinity adsorbent using beads or the like as a carrier.
  • affinity adsorbent When a sample containing the target component flows through the flow channel, the target component is adsorbed on the affinity adsorbent. It is supposed to be.
  • an affinity adsorbent is used in such a configuration. If the packing ratio is high, the affinity adsorbents cannot be sufficiently separated from each other, and the entire surface of the affinity adsorbent cannot participate in adsorption with the target substance, resulting in a decrease in separation efficiency. There was a problem.
  • the device described in Patent Document 1 describes that the channel wall can be made of an insoluble carrier.However, when only the wall is used, the surface area is small, and a sufficient affinity adsorbent may be provided. Then, the length of the channel was getting longer.
  • the target substance has been adsorbed on the affinity adsorbent, it is necessary to desorb and recover the substance from the affinity adsorbent.
  • a solution containing a highly concentrated salt solution or an organic solvent is used,
  • the target substance is a substance having a higher-order structure such as a protein, there has been a problem that irreversible denaturation or inactivation of the three-dimensional structure occurs.
  • Patent Literature 1 Japanese Patent Application Publication No. 2000-502 No. Publication of the Invention
  • a base material a flow path through which a sample provided on the base material flows, a separation part provided in the flow path, and separating a specific substance in the sample, and a separation part provided in the separation part And a fine flow path narrower than the flow path, characterized in that a layer of a substance to be adsorbed that is selectively adsorbed or bound to the specific substance is formed in the separation part.
  • “selectively adsorbing or binding” means that only the test substance is It means that it adsorbs or binds to the detection substance and does not adsorb or bind to other substances contained in the sample. There is no limitation on the mode of adsorption or binding, and it may be a physical interaction or a chemical interaction. The selective adsorption or binding is hereinafter referred to as "specific interaction" as appropriate.
  • the separation device is a device that separates a specific substance in a sample using a principle of affinity mouth chromatography in a separation section. Since the separation device according to the present invention has a configuration in which the separation section is provided in the flow path formed in the base material, when a sample containing a specific substance is introduced into the flow path, the adsorption formed in the separation section is performed. It can be selectively adsorbed or bound to a layer of material. Therefore, the specific substance can be separated by a simple operation.
  • the number of molecules of the specific substance that can approach and interact with the substance to be adsorbed on the surface of the separation section can be increased. Therefore, it is possible to separate specific substances efficiently.
  • the separation device can perform affinity opening on a microchip, it can be incorporated in a TAS (Micrototal Ana 1 ytica 1 System: Micrototal Analytical System). Is also possible. For example, by adopting a configuration in which the sample separated by the separation unit is connected to the sample drying unit, the separated sample can be dried and collected, and can be used for mass spectrometry and the like.
  • TAS Micrototal Ana 1 ytica 1 System: Micrototal Analytical System
  • a base material a flow path through which a sample provided on the base material flows, a separation part provided in the flow path, and separating a specific substance in the sample, and a separation part provided in the separation part A protruding portion, wherein a layer of the substance to be adsorbed that is selectively adsorbed or bonded to the specific substance is formed on the separation section.
  • the separation device since the projection is formed on the separation part, the number of molecules of the specific substance that can approach and interact with the substance to be adsorbed on the surface of the separation part can be increased. Adjust the shape and arrangement of the protrusions Thereby, the width of the sample passage path in the separation unit can be adjusted. Therefore, since the shape of the separation section can be optimized according to the molecular size of the specific substance, the separation efficiency can be improved as compared with the conventional method in which the carrier particles are filled in the channel.
  • an electrode may be provided in the separation unit and the flow path, and a voltage applying unit that applies a voltage between the electrodes may be further provided.
  • a configuration may be adopted in which a projection is provided on the separation section, and an electrode is formed on the projection. This makes it possible to more efficiently guide the charged specific substance to the separation unit. Also, when desorbing a specific substance that is selectively adsorbed or bound to the substance to be adsorbed in the separation unit, desorption becomes easier if the polarity of the potential applied to the electrode is controlled, so desorption flowing in the flow path It is possible to reduce the salt concentration and the organic solvent concentration of the solution for use. Therefore, even when the specific substance is a protein or the like, inactivation / denaturation can be suppressed.
  • the combination of the specific substance and the substance to be adsorbed may be an antigen and an antibody, an enzyme and a substrate, an enzyme and a substrate derivative, an enzyme and an inhibitor, a sugar and a lectin, a DNA and a DNA, a DNA and a DNA. It can be any combination of RNA, protein and nucleic acid, metal and protein, or ligand and receptor.
  • the separation device according to the present invention has a configuration in which the flow path is formed in the base material, and is a configuration suitable for separating a small amount of sample, so that the separation can be reliably performed.
  • the substance to be adsorbed may be provided on a surface of the substrate via a spacer.
  • a spacer By providing the spacer, a suitable space is formed between the substance to be adsorbed and the substrate, so that the specific substance can be efficiently adsorbed or bound.
  • the spacer by making the spacer a hydrophilic molecule, the surface of the separation part is covered with a hydrophilic graft chain. Therefore, nonspecific adsorption of unnecessary components other than the specific substance to the surface of the separation section can be suppressed.
  • a separation comprising: a flow path provided in a base material; a separation section provided in the flow path; and a fine flow path provided in the separation section and narrower than the flow path.
  • a liquid containing the substance to be adsorbed is introduced into the flow path while a voltage having a sign different from that of the substance to be adsorbed to be selectively adsorbed or bound to the substance to be separated is applied to the separation part of the device, and the liquid is adsorbed to the separation part Introducing a sample containing the substance to be separated into the flow path, and selectively adsorbing or binding to the substance to be adsorbed; and removing the substance to be separated from the substance to be adsorbed to the flow path. Introducing a desorbing liquid to be separated, desorbing and collecting the substance to be separated, and performing the following steps.
  • a separation section of a separation device including: a flow path provided in the base material; a separation section provided in the flow path; and a projection provided in the separation section; Introducing a liquid containing the substance to be adsorbed into the flow path while applying a voltage having a sign different from that of the substance to be adsorbed to be selectively adsorbed or bound to the substance to be separated, and adsorbing the liquid to the separation section; Introducing a sample containing the substance to be separated into the flow path, and selectively adsorbing or binding to the substance to be adsorbed; and a desorbing liquid for desorbing the substance to be separated from the substance to be adsorbed to the flow path. And a step of desorbing and recovering the substance to be separated and recovering the substance to be separated.
  • the substance to be adsorbed is adsorbed by adsorbing the substance to be adsorbed, introducing the sample, and desorbing and collecting the specific substance in the sample while applying a voltage to the separation section.
  • the specific substance can be easily and reliably separated without being fixed to the base material using a coupling agent or the like.
  • the substance to be adsorbed can be adsorbed to the separation section by applying a positive potential to the separation section.
  • a separation means for separating a biological sample according to a molecular size or a property comprising: A pretreatment unit for performing the treatment, a drying unit for drying the pretreated sample, and a mass analysis unit for mass spectrometry of the dried sample, wherein the separation unit includes the separation device.
  • the biological sample may be extracted from a living body or may be synthesized.
  • a flow path provided in a base material a separation part provided in the flow path, a fine flow path provided in the separation part and having a narrower width than the flow path
  • the separation section has a layer of the substance to be adsorbed that selectively adsorbs or binds to the specific substance in the sample, so that the specific substance in the sample can be efficiently separated using specific interaction
  • An apparatus or method is implemented.
  • a small-sized separation device that efficiently separates and recovers a trace amount of a specific substance is realized.
  • a separation device or a separation method is realized in which a specific substance is adsorbed and then desorbed by a simple method to recover the specific substance while maintaining high activity. Further, according to the present invention, a mass spectrometry system applicable to a biological sample is realized.
  • FIG. 1 is a top view showing the configuration of the separation device according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration of a separation region of the separation device of FIG.
  • FIG. 3 is a perspective view showing a configuration of a separation unit of the separation device of FIG.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the configuration of the surface of the separation device of FIG.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining the configuration of the surface of the columnar body of the separation device of FIG.
  • FIG. 6 is a diagram showing a configuration of the separation device according to the present embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram for explaining the configuration of the liquid reservoir of the separation device of FIG.
  • FIG. 8 is a view for explaining the configuration of the liquid reservoir of FIG. 7 in the BB ′ direction.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating a configuration of a separation unit of the separation device according to the present embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram showing a configuration of a separation unit of the separation device of FIG.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the configuration of the mass spectrometer.
  • FIG. 12 is a diagram showing the configuration of the separation device according to the present embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram showing a configuration of a drying unit of the separation device of FIG.
  • FIG. 14 is a process cross-sectional view illustrating a method for manufacturing the separation device according to the present embodiment.
  • FIG. 15 is a process cross-sectional view illustrating a method for manufacturing the separation device according to the present embodiment.
  • FIG. 17 is a process cross-sectional view illustrating a method for manufacturing the separation device according to the embodiment.
  • FIG. 17 is a process cross-sectional view illustrating the method for manufacturing the separation device according to the present embodiment.
  • FIG. 19 is a diagram showing another example of the separation device.
  • FIG. 20 is an enlarged view of the vicinity of the sample quantification tube of the separation device shown in FIG.
  • FIG. 21 is a detailed view of the separation device shown in FIG.
  • FIG. 22 is a block diagram of a mass spectrometry system including the separation device of the present embodiment.
  • FIG. 1 is a top view of the separation device 100 according to the present embodiment.
  • a flow path 103 is provided on the substrate 101, and a separation region 113 including a separation portion 107 is formed in a part of the flow path 103. Further, both ends of the flow path 103 are communicated with the sample introduction part 144 and the liquid reservoir 147, respectively.
  • the upper surface of the flow path 103 may be covered with a covering member. By providing the covering member on the upper surface of the channel 103, drying of the sample liquid is suppressed.
  • the component in the sample is a substance having a higher-order structure such as a protein
  • the component is irreversible at the gas-liquid interface by using a coating member with a hydrophilic surface and sealing the inside of the flow path 103. Denaturation is suppressed.
  • FIG. 2 is an enlarged view of the separation region 113 in the separation device 100.
  • 2 (a) is a top view
  • FIG. 2 (b) is a cross-sectional view taken along the line AA ′ of FIG. 2 (a).
  • the columnar bodies 105 are regularly formed at regular intervals in the flow path 103, and the liquid flows through the gap between the columnar bodies 105. Since a substance layer to be adsorbed is formed on the surface of the columnar body 105 as will be described later with reference to FIG. 4, specific components in the sample liquid selectively absorb non-adsorbed substances on the surface of the columnar body 105. It is possible to wear or join.
  • FIG. 3 is a perspective view showing the configuration of the substrate 101 in the separation unit 107.
  • W indicates the width of the channel 103
  • D indicates the depth of the channel 103
  • ⁇ indicates the diameter of the column 105
  • d indicates the height of the column 105
  • p Indicates the average distance between adjacent columnar bodies 105.
  • R the diameter of the molecule to be separated
  • R and p, D, or d satisfy the following conditions.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the configuration of the surface of the substrate 101. As shown in FIG. On the substrate 101, an adsorbed substance layer 109 is formed. That is, the substance to be adsorbed is immobilized on the surface of the substrate 101.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a state in which the substance A to be adsorbed is fixed to the substance layer 109 to be adsorbed, taking the surface of the columnar body 105 as an example.
  • column 1 On the surface of 05, a low molecular substance is immobilized as the substance A to be adsorbed.
  • the sample liquid containing the specific substance A ' is introduced into the columnar body 105, the specific substance A' in the sample liquid is selectively applied to the substance A as shown in Fig. 5 (b). Adsorbs or binds to form a complex.
  • the separation apparatus 100 only the specific substance A ′ having a specific interaction with the substance A to be adsorbed is selectively adsorbed on the substance layer 109 to be adsorbed and separated from other components in the sample.
  • silicon is used as a material of the substrate 101.
  • glass such as quartz or a plastic material may be used.
  • the plastic material include silicone resins, thermoplastic resins such as PMMA (polymethyl methacrylate), PET (polyethylene terephthalate), and PC (polycarbonate), and thermosetting resins such as epoxy resins. Since such a material is easily formed, the manufacturing cost of the drying apparatus can be reduced.
  • the columnar body 105 can be formed, for example, by etching the substrate 101 into a predetermined pattern shape, but the manufacturing method is not particularly limited. Further, the columnar body 105 in FIG. 2 is a cylinder, but is not limited to a pseudocolumn such as a cylinder and a pseudocolumn, but a cone such as a cone and an elliptical cone; a polygonal column such as a triangular prism and a quadrangular prism; Pillars having; and the like.
  • the adsorbed substance A and the specific substance A ′ included in the adsorbed substance layer 109 are selected from a combination that selectively adsorbs or binds. As such a combination. For example,
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA liponucleic acid
  • any one is the specific substance and the other is the substance to be adsorbed.
  • hormones such as steroids, physiologically active substances such as neurotransmitters, drugs, other blood factors, cell membrane receptors such as insulin receptors, or proteins having an affinity for the above receptors, Glycoproteins, glycolipids, or low molecular substances can be used.
  • the antigen may be a low molecular substance such as a so-called hapten or a high molecular substance such as a protein.
  • antigens include HCV antigens, tumor markers such as CEA and PSA, human immunodeficiency virus (HIV), abnormal prions, and proteins specific to Alzheimer's disease.
  • ConA concanapalin A
  • ConA receptor monosaccharide protein for example, a combination of N-acetyl-D_darcosamine and wheat germ lectin, concanapalin A (ConA) and ConA receptor monosaccharide protein can be used.
  • a mutated DNA and a DNA complementary to the mutated DNA can be used.
  • the material can be selected from, for example, the same materials as the substrate 101.
  • the same material as the substrate 101 may be used, or a different material may be used.
  • the sample liquid containing the specific substance A ′ is injected into the sample introduction part 144, and is developed in the channel 103 by a capillary effect or press-fitting using a pump.
  • the flow rate of the sample liquid is, for example, 1 On 1 Zmin or more and 1001 Zmin or less.
  • only the specific substance A ′ having a specific interaction with the substance A to be adsorbed selectively adsorbs to the substance layer 109 to be adsorbed in the separation part 107. .
  • the component that has not been adsorbed is led to the liquid reservoir 147 together with the solvent or the liquid that is the dispersion medium.
  • a buffer solution or the like for washing the flow channel 103 is flown from the sample introduction part 144 to remove components other than the specific substance A ′ staying in the flow channel 103.
  • the specific substance A ′ and the substance A to be adsorbed are adsorbed or bound by the specific interaction, they are not dissociated.
  • the specific substance A ′ is desorbed from the substance A to be adsorbed.
  • a desorption method for example, a method of introducing a NaCl solution of 0.1 mol / 1 or more and 1 mol / 1 or less from the sample introduction section 144 into the flow path 103 can be used.
  • the substance A to be adsorbed and the specific substance A ′ are an antigen and an antibody, they have a specific interaction with the substance A to be adsorbed, and the binding constant for the substance A to be adsorbed is higher than that of the specific substance A ′.
  • the desorbed specific substance A ' is led to the liquid reservoir 147 and collected.
  • the separation portion 107 is formed in the flow path 103. Therefore, even if the sample is very small, the specific substance A can be introduced by introducing it into the flow path 103. 'Can be separated and recovered. The operation is simpler than affinity chromatography using a column. In addition, since the separation device 100 is a disposable chip, the washing operation of the separation device 100 is unnecessary, and the separation can be performed reliably.
  • the flow channel groove 103 and the columnar body 105 on the substrate 101 can be formed by etching the substrate 101 into a predetermined pattern shape. Is not particularly limited.
  • FIG. 15, FIG. 16, and FIG. 17 are process cross-sectional views showing one example.
  • the center is a top view
  • the left and right views are cross-sectional views.
  • the columnar body 105 is formed by using an electron beam lithography technique using calixarene as a resist for fine processing.
  • An example of the molecular structure of calixarene is shown below.
  • Calixarene is used as a resist for electron beam exposure, and can be suitably used as a resist for nanofabrication.
  • a silicon substrate whose plane orientation is (100) is used as the substrate 101.
  • a silicon oxide film 185 A lane electron beam negative resist 18 3 is formed in this order.
  • the thicknesses of the silicon oxide film 185 and the calixarene electron beam negative resist 183 are 40 nm and 55 nm, respectively.
  • an area to be the columnar body 105 is exposed using an electron beam (EB).
  • EB electron beam
  • the development is performed using xylene, and rinsed with isopropyl alcohol.
  • the lithographic squalene electron beam negative resist 183 is patterned.
  • a positive photoresist 155 is applied to the entire surface (FIG. 15 (c)).
  • the film thickness is 1.8; ⁇ m.
  • mask exposure is performed so as to expose the region to become the flow path 103, and development is performed (FIG. 16 (a)).
  • the silicon oxide film 185 is etched by RIE using a mixed gas of CF 4 and CHF 3 .
  • the thickness after etching is 35 nm (Fig. 16 (b)) t
  • the resist is removed by organic washing using a mixture of acetone, alcohol and water
  • an oxidizing plasma treatment is performed (Fig. 16 (c)).
  • the substrate 101 is subjected to ECR etching using HBr gas.
  • the thickness of the silicon substrate after the etching is set to 40 nm (Fig. 17 (a)).
  • wet etching is performed with hydrofluoric acid in a BHF buffer to remove the silicon oxide film (Fig. 17 (b)).
  • the flow path 103 and the columnar body 105 are formed on the substrate 101.
  • the surface of the substrate 101 hydrophilic By making the surface of the substrate 101 hydrophilic, the sample liquid is smoothly introduced into the channel 103 and the columnar body 105.
  • the introduction of the sample liquid by capillary action is promoted by making the surface of the flow path hydrophilic, thereby improving the separation efficiency. I like it.
  • the substrate 101 is placed in a furnace to form a silicon thermal oxide film 187 (FIG. 17 (c)).
  • heat treatment conditions are selected so that the thickness of the oxide film is 30 nm.
  • electrostatic bonding is performed with the coating 189, sealing is performed, and the separation device is used. It is completed (Fig. 17 (d)).
  • a known material suitable for the type of the substrate 101 such as press molding using a mold such as etching or emboss molding, injection molding, or photo-curing, is used. Can be done in a way.
  • the surface of the substrate 101 hydrophilic.
  • the sample liquid is smoothly introduced into the channel 103 and the columnar body 105.
  • introduction of the sample liquid by capillary action is promoted by making the surface of the flow path 103 hydrophilic. It is preferable because the drying efficiency is improved.
  • Examples of the surface treatment for imparting hydrophilicity include, for example, cutlets having a hydrophilic group.
  • the pulling agent can be applied to the side wall of the channel 103.
  • Examples of the coupling agent having a hydrophilic group include a silane coupling agent having an amino group.
  • These force coupling agents can be applied by a spin coating method, a spray method, a dip method, a gas phase method or the like.
  • an adhesion preventing treatment can be performed on the flow path 103.
  • the anti-adhesion treatment for example, a substance having a structure similar to the phospholipid constituting the cell wall can be applied to the side wall of the flow path 103.
  • the c hydrophilic treatment and adhesion preventing process can be improved, for example, can be used Ripijiyua (registered trademark, manufactured by NOF Corporation).
  • Lipidure (registered trademark) is dissolved in a buffer solution such as a buffer so as to have a concentration of 0.5 wt%, and the solution is filled in the flow channel 103 and left for several minutes to flow.
  • the inner wall of road 10'3 can be treated. Thereafter, the solution is blown off with an air gun or the like to dry the channel 103.
  • a fluororesin can be applied to the side wall of the channel 103.
  • a method for immobilizing the substance to be adsorbed on the surface of the substrate 101 in the separation unit 107 for example, a method such as a physical adsorption method or a covalent bonding method can be used.
  • a monomolecular film of the substance to be adsorbed can be prepared and adsorbed on the surface of the substrate 101 in the separation section 107.
  • the surface of the substrate 101 is subjected to surface
  • the substrate 101 is brought into contact with the solution containing the substance to be adsorbed by introducing a functional group or an active group of the above, so that the substance to be adsorbed can be bonded to the surface of the substrate 101.
  • the method for modifying the surface of the substrate 101 can be appropriately selected according to the purpose. For example, a plasma treatment, a treatment with an ion beam, an electron beam treatment, or the like can be used.
  • a spacer molecule can be immobilized on the surface of the substrate 101, and the spacer molecule can be bound to the substance to be adsorbed. The method of immobilizing the spacer molecule will be described later.
  • a coupling agent such as a silane coupling agent can be used to chemically bond the substance A to be adsorbed to the surface.
  • a coupling agent is used, the coupling agent is applied to the surface of the columnar body 105, and then the organic functional group of the coupling agent is bonded to the substance A to be adsorbed.
  • a thiol group, an amino group, a propyloxyl group, an aldehyde group, a hydroxyl group, or the like of the substance A to be adsorbed can be used.
  • the substrate 101 of the ligand can be immobilized as follows.
  • the substrate 101 is immersed in an aqueous solution of a silane coupling agent having an —NH 2 group.
  • concentration of the silane coupling agent is, for example, 0.1% or more and 2.0% or less.
  • the ligand is immobilized on the substrate 101 surface-treated with the silane coupling agent by a method using a condensing reagent such as, for example, a carbodiimide method. In the case of immobilization, an activator such as N-hydroxysuccinimide may be used if necessary.
  • One NH 2 group of the silane coupling agent binds to the carboxyl group of the ligand. In this way, a separation unit 107 is obtained in which the layer on which the ligand is immobilized is used as the substance layer 109 to be adsorbed.
  • the substance A to be adsorbed is previously biotinylated. If it is biotinylated, avidin or streptavidin can be immobilized on the substrate 101, and the specific substance can be selectively adsorbed by the interaction between biotin and avidin. At this time, since the binding constant between avidin and biotin is significantly larger than the binding constant between normal antigen and antibody, The specific substance A ′ can be desorbed from the adsorbed substance A and recovered under the condition that the adsorbed substance A does not desorb from the avidin or the like immobilized on the substrate 101.
  • the fixed density of the substance to be adsorbed on the substrate 101 is preferably sufficiently dense so that the specific substance can bind to the substance to be adsorbed. By doing so, non-specific adsorption or binding of other substances contained in the sample to the substrate 101 surface can be suppressed.
  • the substance A to be adsorbed is a low molecular substance and the specific substance A 'is a high molecular substance with a raised structure, the specific substance A' cannot be adsorbed or bound to the substance A due to steric hindrance. It is preferable to set the fixed density so as not to cause any problem.
  • a ⁇ -type polymer layer to which a specific substance can be bonded is provided on the surface of the substrate 101 by using a molecular imprinting method.
  • the molecular imprinting method is a method of synthesizing a polymer material that recognizes the target molecule in a tailor-made manner in one step according to the target molecule, and is specifically performed as follows. First, the target molecule is made into a ⁇ type, and a functional monomer is bound by a covalent bond or a non-covalent bond to form a ⁇ type molecule-functional polymer complex.
  • the functional monomer a difunctional or higher functional monomer having a functional group capable of binding to the ⁇ -type molecule and a polymerizable group such as a vinyl group can be used.
  • a crosslinking agent and a polymerization initiator are added to the solution containing the ⁇ -type molecule-monofunctional monomer complex, and a polymerization reaction is performed on the wall surface of the separation unit 107.
  • the type I molecule is decomposed and removed from the polymerized polymer by, for example, enzymatic decomposition. Then, a specific binding site for the type I molecule is formed in the obtained polymer.
  • a spacer 11 9 is appropriately placed between the substrate 101 and the substance A to be adsorbed.
  • the spacer 1 19 is to separate the substance A from the substrate 101 so that the selective adsorption or binding of the specific substance A ′ and the substance A can proceed without steric hindrance. Therefore, it refers to a compound that is inserted between the substrate 101 and the substance A to be adsorbed.
  • the spacer 119 preferably has a relatively short chain length. Further, those having an active group are preferred. This is because the operation of immobilizing the substance A to be adsorbed becomes easier.
  • the active group is not particularly limited as long as it is a functional group having reactivity with the substance A to be adsorbed. If the spacer 119 does not have an active group, the functional group of the spacer 119 and the substance A to be adsorbed are bonded using a condensing reagent or the like. For example, a thiol group, an amino group, a propyloxyl group, an aldehyde group, a hydroxyl group, etc. of the substance A to be adsorbed can be used.
  • HMDA hexamethylenediamine
  • EGDG ethylene glycol diglycidyl ether
  • PEG Short chain polyethylene glycol
  • PEO polyethylene oxide
  • a structure in which the substance A to be adsorbed is fixed on the surface of the substrate 101 a structure in which a ⁇ -type polymer layer to which the specific substance A ′ can be bound by a molecular printing method may be provided. .
  • FIG. 9 is a diagram showing a configuration of the separation region 113 of the separation device 100 according to the present embodiment.
  • 9 (a) is a top view
  • FIG. 9 (b) is a cross-sectional view taken along the line CC ′ of FIG. 9 (a).
  • the partition walls 151 are formed regularly at regular intervals in the flow path 103, and the liquid flows through the gap between the partition walls 151. That is, channels narrower than channel 103 are formed, and these fine channels are used as channels 149 for separation.
  • the surface of the separation channel 149 is the same as the first embodiment. Similarly, since the substance layer 109 to be adsorbed is formed, the specific substance A 'in the sample liquid can be selectively adsorbed or bound to the non-adsorbed substance A in the separation channel 149. It is.
  • the separation region 113 in FIG. 9 can be manufactured in the same manner as in the first embodiment.
  • FIG. 14 is a process cross-sectional view illustrating the method for manufacturing the separation device according to the present embodiment.
  • a mold 173 including an electrode mounting portion is prepared (FIG. 14 (a)).
  • the electrode 1775 is set on the mold 173 (FIG. 14 (b)).
  • the material used for the electrode 175 is, for example, Au, P 1;, Ag, A 1, Cu, or the like.
  • the coating mold 1779 is set on the mold 1703, the electrode 1775 is fixed, and the resin 1177 which will become the substrate 101 is injected into the mold 1733. And molding (Fig. 14 (c)).
  • PMMA is used as the resin 177.
  • the substrate 101 having the flow path 103 formed thereon is obtained (FIG. 14D).
  • Impurities on the surface of the electrode 175 on the back surface of the substrate 101 are removed by asking to expose the electrode 175 material metal.
  • a metal film is formed on the bottom surface of the substrate 101 by vapor deposition or the like, and this is used as a wiring 181 (FIG. 14 (e)).
  • the separation portion 107 having the electrode 175 as the columnar body 105 is formed in the channel 103.
  • the electrode or wiring 18 1 thus formed is connected to an external power supply (not shown) so that a voltage can be applied.
  • an insulating film may be formed on the entire surface of the channel 103. At this time, the thickness of the insulating film is, for example, 10 nm or more and 500 nm or less.
  • the sample introduction part If electrodes are formed in the same manner or in the method described in the fourth embodiment, the electrodes are connected to an external power supply (not shown) by conducting the electrodes on the lower surface of the substrate 101 or the like. , Between the sample introduction part 145 and the separation part 107, between the separation part 107 and the liquid reservoir 147, and between the sample introduction part 145 and the liquid reservoir 147. Each of these voltages can be applied.
  • the target component in the sample can be more reliably and efficiently separated.
  • the sample introduction part 144 is a positive electrode, and the separation part is When a current is passed through the negative electrode 107, the positively charged protein is efficiently guided to the separating portion 107, and is selectively adsorbed to the substance layer 109 to be adsorbed.
  • the separation section 107 was turned on as the positive electrode and the reservoir 147 was turned on as the negative electrode, it was retained in the substance layer 109 to be adsorbed. Protein desorption and induction into the reservoir 147 are promoted.
  • the application of an AC electric field increases the motility of the protein molecules and further promotes desorption.
  • the salt concentration and the organic solvent concentration of the eluent flowing through the flow path 103 for desorbing the specific substance A ′ and the substance A to be adsorbed can be reduced. Therefore, even when the specific substance A ′ is a substance having a higher-order structure such as a protein, irreversible denaturation and inactivation of the three-dimensional structure can be suppressed.
  • the operation of immobilizing the substance A to be adsorbed on the substrate 101 may not be required in some cases.
  • the substance A to be adsorbed is a protein
  • the receptor for the substance is a specific substance A '
  • the ligand is not charged or positively charged under the pH condition where the protein is negatively charged
  • the specific substance A ′ can be separated as follows.
  • a solution of the substance A to be adsorbed that is, a protein
  • the column To apply an electrostatic field.
  • the protein is adsorbed on the surface of the pillar 105 by electrostatic interaction.
  • a sample containing a ligand is introduced into the channel 103.
  • the ligand is adsorbed on the protein surface, it is separated from other components.
  • the ligand is desorbed from the protein and collected by flowing a salt solution or the like after washing the channel 103.
  • the state in which the protein is adsorbed on the surface of the columnar body 105 is maintained.
  • FIG. 6 is a diagram showing a configuration of the separation device 171 according to the present embodiment.
  • a separation channel 1311 is formed on the substrate 121, and an input channel 1229 and a collection channel 1335 are formed so as to intersect with this.
  • C The input channel 1 2 9, the separation channel 1 3 1, and the recovery channel 1 3 5 have liquid reservoirs at both ends 1 2 5 a, 1 2 5 b and 1 2 3, respectively.
  • a, 123 b, 127 a and 127 b are formed.
  • Each of the liquid reservoirs is provided with an electrode, which can be used to apply a voltage to both ends of the separation channel 131, for example.
  • a separation section 107 is provided in the separation flow path 13 1.
  • the configuration of the separation unit 107 may be the configuration described in any of the first to third embodiments.
  • FIG. 7 is an enlarged view of the vicinity of the liquid reservoir 123 in FIG.
  • FIG. 8 is a sectional view taken along the line BB ′ of FIG. Separation channels 1 3 1 and
  • a cover 133 provided with an opening 133 for injecting a buffer solution or the like is provided on the substrate 121 provided with the liquid reservoir 123a.
  • a conductive path 141 is provided on the cover 137 so that it can be connected to an external power supply.
  • the electrode plate 144 is disposed along the wall surface of the liquid reservoir 123 a and the conductive path 141.
  • Electrode plate 144 and conductive path 144 are crimped and electrically connected.
  • the other reservoirs have the same structure as above.
  • the electrode plates 144 formed in the respective reservoirs are connected to an external power supply (not shown) by conducting the lower surface of the substrate 101 and the like, a voltage can be applied.
  • a sample containing the specific substance A ' is injected into the reservoir 125a or the reservoir 125b.
  • a voltage is applied so that the sample flows in the direction of the reservoir 125b, and when the liquid is poured into the reservoir 125b, the reservoir 1
  • the separation device 17 1 has a charging channel 1 29 and a collecting channel 1 35 in addition to the separation channel 13 1, so that unnecessary components and the specific substance A 'are stored in different reservoirs. Can lead. For this reason, mixing of unnecessary components remaining in the liquid reservoir into the specific substance A ′ is suppressed, and the separation efficiency is further improved.
  • a reaction reagent into the liquid reservoir 125a or liquid reservoir 125b, a specific substance A 'induced in the recovery channel 135 can be used for enzyme reaction and detection. It is possible to carry out various reactions such as a color reaction.
  • FIG. 12 is a diagram showing the configuration of the separation device 165 according to the present embodiment.
  • the separation device 165 has the basic configuration of the separation device 100 described in the third embodiment.
  • the substrate 101 in the separation device 100 corresponds to the substrate 133 in the separation device 165, and the channel 103 corresponds to the first channel 157, respectively.
  • the second flow path 159 which is narrower than the first flow path 157, communicates with the flow path 157.
  • a drying section 161 is provided at the end of the second flow path 159.
  • Coatings 163 are provided on the upper surfaces of the first channel 157 and the second channel 159, and the sample introduction section 145, the liquid reservoir 147, and the drying section 161 are provided.
  • the upper surface is an opening.
  • a metal film (not shown) is provided on the surfaces of the sample introduction part 145, the liquid reservoir 147, the first flow path 157, and the drying part 161. Voltage can be applied between them.
  • FIG. 13 is a diagram showing the configuration of the drying unit 161 in the separation device 165.
  • Fig. 13 (a) is a top view
  • Fig. 13 (b) is a cross-sectional view taken along the line D-D 'in Fig. 13 (a).
  • the drying section 161 is provided with a plurality of columnar bodies 167.
  • a heater 169 is provided on the bottom of the drying unit 161 to promote drying.
  • the method of using the separator 165 is as follows. That is, first, the sample liquid containing the specific substance A ′ is injected from the sample introduction part 145, and is developed in the first channel 157 by a capillary effect or press-fitting using a pump.
  • the sample introduction part 145 is used as a positive electrode and the separation part 107 is used as a negative electrode, because the induction of the specific substance A ′ to the separation part 107 is promoted.
  • the components not adsorbed on the substance A to be adsorbed are guided to the liquid reservoir 147 together with the solvent or the liquid as the dispersion medium, and are discharged.
  • a buffer solution for washing the flow path 103 is passed through the sample introduction part 145 to wash, and components other than the specific substance A ′ staying in the first flow path 157 are removed.
  • the specific substance A ′ and the substance A to be adsorbed are adsorbed or bound by the specific interaction, they are not dissociated.
  • the specific substance A ′ is desorbed from the substance A to be adsorbed in the same manner as in the first and second embodiments.
  • power is supplied to the separation unit 107 as the positive electrode and the drying unit 161 to the negative electrode, and when the drying unit 161 is heated to, for example, 30 ° C or more and 70 ° C or less by the heater 169, the dissociation is identified.
  • the liquid containing the substance A ' is led to the drying section 161 via the second flow path 159, and is dried quickly in the drying section 161.
  • a plurality of columnar bodies 167 are provided in the drying section 161, and the liquid in the second flow path 159 is efficiently introduced by capillary action, and drying proceeds promptly.
  • the second flow path 159 is narrower than the first flow path 157, the first flow path 157 is efficiently moved from the first flow path 157 to the second flow path 159. Liquid is introduced.
  • the specific substance A 'separated in the separation unit 107 is dried in the drying unit 161 and collected.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the configuration of the mass spectrometer.
  • a dried sample is placed on a sample stage. Then, the dried sample is irradiated with a nitrogen gas laser having a wavelength of 337 nm under vacuum. The dried sample then evaporates with the matrix.
  • the sample stage is an electrode, and when a voltage is applied, the vaporized sample flies in a vacuum and is detected by a detection unit that includes a reflector detector, a reflector, and a linear detector.
  • the separation device 165 only the specific substance A ′ can be separated from a sample containing a plurality of components, and further dried and collected. Then, the dried specific substance A ′ can be subjected to MALD I — TO F MS together with the separation device 165. Therefore, the extraction, drying, and structural analysis of the target component can be performed on a single separation device 165, which is useful for proteome analysis and the like.
  • the matrix for MALD I-TOFMS is appropriately selected depending on the substance to be measured.
  • ⁇ -CHCA cyano 4-hydroxycinnamic acid
  • 2,5-DHB 2,5- Dihydroxybenzoic acid
  • DHBs 5-methoxysalicylic acid
  • HABA 4- (4-hydroxyphenylazo) benzoic acid
  • Disulanol THAP
  • a GFP Green Fluorescent
  • His-Tag an anti-His-Tag (histidine tag) antibody
  • Protein purification method
  • the anti-His-Tag antibody is immobilized on the surface of the separation portion 107 to form the adsorbed substance layer 109.
  • immobilization for example, the same method as in the first embodiment or a known method for immobilizing an antibody for affinity chromatography is used.
  • the separation unit 107 is subjected to a surface treatment using a silane coupling agent having one NH 2 group.
  • a spacer is coupled to the separation unit 107.
  • EGD E ethylene glycol diglycidyl ether
  • a large excess of EGDE is added to a pH II NaOH solution and the mixture is stirred at 30 ° C., for example. This solution is added dropwise to the separation unit 107 and reacted for, for example, 24 hours.
  • the anti-His-Tag antibody is immobilized using the epoxy group at the end of the spacer.
  • the extract containing His-Tag-added GFP expressed in Escherichia coli is introduced into the sample introduction part 145 of the obtained separator 100. Then, only the GFP to which the His-Tag is added selectively interacts with the anti-His-Tag antibody and is adsorbed on the substance layer 109 to be adsorbed. When the separation part 107 is observed after washing the flow path 103, the region where GFP is adsorbed emits green fluorescence, so that it can be easily confirmed visually.
  • the His-Tag-added GFP can be obtained from the liquid reservoir 147. Can be recovered.
  • an anti-His-Tag antibody was used. You may. Further, the purification method of the present embodiment is also applicable to the configuration of the separation device described in the second to fifth embodiments.
  • This embodiment relates to a method for separating a substance having a specific interaction with a metal using the separation device 100 according to the first embodiment.
  • Such a separation device is manufactured as follows. That is, following the step of FIG. 17 (c), a resist film is provided on the entire surface of the substrate 101, and a resist pattern exposing only the region to be the separation portion 107 is formed. This resist pattern
  • a metal film is formed on the entire surface of the substrate using the mask as a mask.
  • the material of the metal film is a substance that is stable in water, such as Pt and Au.
  • the metal film is formed by, for example, vapor deposition. Then, if the resist is removed using a stripper that dissolves the resist mask without dissolving the silicon thermal oxide film 187, a metal film is formed on the surface of the separation portion 107.
  • the metal binding substance By introducing a sample containing a metal binding substance into the obtained separation device 100, the metal binding substance can be efficiently separated.
  • An embodiment may be used in which a chelating agent, a chelating protein, or a crown ether that chelate ions is used and immobilized on the surface of the separation unit 107 in a state where these are chelated.
  • the immobilization at this time can be performed in the same manner as in the first embodiment.
  • the separation method of the present embodiment is also applicable to the configuration of the separation device described in the second to fifth embodiments.
  • the separation apparatus 100 uses lectin as the substance A to be adsorbed and uses lectin as a lectin relating to a method for separating a specific sugar chain in a sample.
  • Concanapalin A is used.
  • Recti Is a lectin specific to mannose and glucose in monosaccharides, and has affinity for glycoproteins having high mannose-type sugar chains and polysaccharides.
  • ConA is immobilized on the surface of the separation section 107 to form an adsorbed substance layer 109.
  • the separation unit 107 is subjected to a surface treatment using a silane coupling agent having an —NH 2 group.
  • a spacer is coupled to the separation unit 107.
  • EGD E ethylene glycol diglycidyl ether
  • a large excess of EGDE is added to a pH II NaOH solution and stirred at, for example, 30 ° C. This solution is added dropwise to the separation unit 107 and reacted for, for example, 24 hours.
  • the lectin is immobilized using the epoxy group at the end of the spacer.
  • an alkaline solution of lectin containing —SH group, —OH group, and —NH 2 is dropped into the separation unit 107 provided with the spacer.
  • the separation apparatus 100 By using the obtained separation apparatus 100, the presence or absence of a glycoprotein or polysaccharide having a high-mannose type sugar chain can be easily separated with high precision and high sensitivity, and recovered.
  • a spacer is provided between the lectin and the surface of the substrate 101, thereby facilitating the specific interaction between the lectin and the sugar chain. . Therefore, separation can be performed more efficiently.
  • the separation method of the present embodiment is also applicable to the configuration of the separation device described in the second to fifth embodiments.
  • FIG. 18 is a diagram showing a configuration of a separation apparatus that moves a sample by utilizing a capillary phenomenon. By utilizing the capillary phenomenon, it is not necessary to apply external force such as electric power and pressure, and energy for driving is unnecessary.
  • the separation section (not shown) described in the first embodiment is formed in the separation channel 540 provided in the substrate 550.
  • An air hole 560 is provided at one end of the separation channel 540, and a buffer inlet 510 for injecting a buffer at the time of separation is provided at the other end.
  • the separation channel 540 is hermetically closed except for the buffer inlet 510 and the air hole 560.
  • a sample quantification tube 530 is connected to the starting portion of the separation channel 540, and a sample injection port 520 is provided at the other end of the sample quantification tube 530.
  • FIG. 20 is an enlarged view showing the vicinity of the sample quantification tube 5330.
  • a hydrophilic absorption region is provided inside the sample quantitative tube 530, the sample holding section 503, and the buffer introduction section 504.
  • An absorption region 506 is also provided near the inlet to the separation channel 540.
  • a temporary stop slit 502 is provided between the sample quantitative tube 530 and the sample holding section 503.
  • the pause slit 502 can be a hydrophobic region.
  • the absorption zones are separated by pause slits 505 and 507.
  • the void volume of the sample holder 503 is substantially equal to the sum of the void volume of the sample quantitative tube 5330 and the volume of the temporary stop slit 502.
  • the width of the pause slit 505 is smaller than the width of the pause slit 502.
  • the sample quantification tube 530 has a hydrophilic function, and is configured to function as a sample introduction unit.
  • the sample is gradually injected into the sample injection port 5200 to fill the sample quantitative tube 5330. At this time, make sure that the water surface does not rise.
  • the sample metering tube 530 is filled with sample, the sample gradually seeps into the pause slit 502.
  • the sample inside the pause slit 502 and the sample quantification tube 530 becomes a sample with a larger capillary effect. Holder It is all sucked up to 503.
  • each absorption region is formed so as to have a different degree of hydrophilicity depending on the selection of the hydrophilic material, and the sample holding section 503 has a larger capillary effect than the sample quantitative tube 530.
  • the pause slits 505 and 507 exist, so that the sample does not flow into the buffer introducing section 504.
  • a separation buffer is injected into the buffer inlet 510.
  • the injected buffer is temporarily filled in the buffer introduction section 504, and the interface with the sample holding section 503 becomes linear.
  • the buffer is further filled, it is exuded into the pause slit 505, flows into the sample holding section 503, and further passes through the pause slit 507 while dragging the sample for separation. It proceeds in the direction of the flow path.
  • the width of the pause slit 502 is larger than the width of the pause slits 505 and 507, even if the buffer flows backward to the pause slit 502, the sample is already sampled. There is almost no backflow of the sample because it is proceeding before the holding section 503.
  • the separation buffer 1 is a capillary phenomenon, and the separation flow path is further advanced toward the air hole 560. In this process, the sample is separated. When the separation buffer reaches the air hole 560, the buffer flow stops. Measure the separation of the sample when the buffer flow is stopped or when the buffer is in progress.
  • the above embodiment is an example of a separation apparatus using the capillary phenomenon. Another example of sample injection utilizing this principle will be described with reference to FIGS. 19 and 21 .
  • a sample introduction tube 570 is provided in place of the sample quantification tube 530 in 8.
  • a sample inlet 520 and an outlet 580 are provided.
  • the sample is introduced into the sample inlet 520 and filled up to the outlet 580. During this time, the sample is absorbed by the sample holder 503 through the charging hole 509. Thereafter, air is injected into the sample inlet 520, and the sample is discharged from the outlet 580, thereby wiping and drying the sample inside the sample inlet tube 570.
  • a separation buffer is injected as described above.
  • electrophoretic separation a buffer for electrophoresis is introduced from the liquid reservoir corresponding to the buffer inlet 510 and the liquid reservoir corresponding to the air hole 560 before the sample is introduced. Due to the presence of the widely formed pause slits 505 and 507, they do not flow into the sample holder.
  • the electrophoresis buffer 1 is made continuous, and a voltage is applied for separation.
  • FIG. 22 is a block diagram of a mass spectrometry system including the separation device of the present embodiment. As shown in Fig. 22 (a), this system provides purification 1002 of sample 1001 to remove some contaminants and separation 1000 to remove unnecessary components 1004. 3. It has means for executing the steps of pretreatment of the separated sample (105), drying of the sample after the pretreatment (106), and identification (107) of the sample by mass spectrometry.
  • the separation by the separation device described in the above embodiment corresponds to the step of separation 1003, and is performed on the microchip 1008.
  • a separation device for removing only macro components such as blood cells is used.
  • the pre-processing step 105 the molecular weight is reduced using trypsin or the like, mixed with a matrix, or the like.
  • drying 106 the pretreated sample is dried to obtain a dry sample for mass spectrometry.
  • the separation device according to the present embodiment has a flow path, as shown in FIG. 22 (b), the steps from purification 102 to drying 106 are performed on one microchip. It can also be performed on 1 0 8.
  • the steps from purification 102 to drying 106 are performed on one microchip. It can also be performed on 1 0 8.
  • By continuously processing the sample on the microchip 108 it is possible to efficiently and reliably identify even a very small amount of a component using a method with little loss.
  • appropriately selected steps or all steps can be performed on the microchip 1008.
  • the reaction apparatus 100 in which the columnar body 105 is formed on the surface of the channel 103 by the method described in the first embodiment is manufactured.
  • the substrate 101 is formed of a silicon substrate having a (100) plane as a main surface.
  • a column 105 (FIG. 2) is provided in the separating part 107.
  • the columnar body 105 is formed by the method described with reference to FIGS.
  • the interval p between the pillars 105 is set to about 200 nm.
  • the antisense oligonucleotide A against a part of the tpa_1 gene of the nematode (C. elegans: Caenorhabditise 1 egans) was coated on the surface of the silicon pillar, which is the pillar 105, using a coupling agent. Fix to the pillar surface.
  • the 5 ′ end of the antisense oligonucleotide A is modified with an SH group.
  • N- (2-aminoethyl) —3-aminopropyl N- (2-aminoethyl) —3-aminopropyl, a kind of aminosilane, is used.
  • EDA trimethoxysilane
  • the separation unit 1 0 7 1 1 conc. HC 1: to immersion CH 3 ⁇ _H about 30 minutes, washed with distilled water and immersed in concentrated H 2 S_ ⁇ 4 for about 30 minutes. After washing with distilled water, boil for several minutes in deionized water. Subsequently, aminosilane, such as 1% EDA (in an aqueous solution of ImM acetic acid), is introduced into the separation unit 107, and the mixture is allowed to reach room temperature Incubate for about 20 minutes. As a result, the EDA is fixed to the surface of the separation unit 107. Then, the residue is washed with distilled water and dried by heating at about 120 ° C for 3 to 4 minutes in an inert gas atmosphere.
  • aminosilane such as 1% EDA (in an aqueous solution of ImM acetic acid)
  • succinimidyl 4- (maleimidophenyl) butylate (SMPB) in ImM dissolve in a small amount of DMS O, and dilute.
  • the separating part 107 is immersed in this diluted solution at room temperature for 2 hours, washed with a diluting solvent, and dried under an inert gas atmosphere.
  • the ester group of SMPB reacts with the amino group of EDA, and the maleimide is exposed on the surface of the separating portion 107.
  • the antisense oligonucleotide A having a thiol group is introduced into the separation part 107.
  • the thiol group of the antisense oligonucleotide A reacts with the maleimide on the surface of the separation part 107, and the antisense oligonucleotide A is fixed on the surface of the separation part 107 (for example, Chrisey et al., Nu. cleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 15, 30, 31 to 30-39).
  • RNA extracted from C. elegans is mixed with a hybridization solution (Rapidhybridizitationbuffer, manufactured by Amérsham).
  • a sample was introduced from the sample introduction part 1 45, and after reacting at 70 ° C for 2 hours in a humidity chamber, 2 XSSC (standard saline citrate buffer) and 0.1% SDS (do Wash with sodium xyl sulfate) at room temperature for 15 minutes, then with 0.2 X SSC, 0.1% SDS for 65 t for 15 minutes.
  • DEPC diethylprocarbonate
  • DEPC diethylprocarbonate
  • RNA having a specific sequence can be satisfactorily separated from the RNA mixture.

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Abstract

基板（１０１）に流路（１０３）を形成し、流路（１０３）の一部に、分離部（１０７）を設ける。分離部（１０７）には、多数の柱状体が形成され、表面に特定物質に対して特異的相互作用をする被吸着物質が固定化された被吸着物質層が形成されている。試料を流路（１０３）に導入すると、特定物質が被吸着物質層に吸着し、他の成分から分離される。流路（１０３）内をバッファーで洗浄後、流路（１０３）に脱離液を流して特定物質を被吸着物質層から脱着させ、回収する。

Description

分離装置および分離方法 技術分野
本発明は、 分離装置、 分離方法、 および質量分析システムに関し、 特に物 質間の特異的相互作用を利用した分離装置に関する。
明
背景技術 田
ァフィ二ティ一クロマトグラフィーは、 不溶性の担体に分離、 精製を目的 とする物質に対する特異的相互作用を有する物質を固定化して親和性吸着体 を作製し、 これをカラムに充填して試料溶液中の目的物質を親和性吸着体に 吸着させて分離するクロマトグラフィーである。 ァフィ二ティークロマトグ ラフィ一は、 物質間の特異的相互作用を利用して成分を分離するため、 特に 生体由来物質の分離、 精製に有用な方法である。
しかし、 カラムに充填して行うァフィ二ティ一クロマトグラフィーは、 微 量の試料の分離を効率よく行う設計という面では必ずしも適しているとはい えなかった。
一方、 生体由来物質の分離、 分析機能をチップ上に備えたマイクロチップ の研究開発が活発に行われている。 これらのマイクロチップには、 微細加工 技術を用いて微細な分離用流路等が設けられており、 極めて少量の試料をマ ィクロチップに導入し、 分離を行うことができるようになつている。
こうしたマイクロチップを活用する技術において、 ァフィ二ティークロマ トグラフィ一の技術を導入する試みが提案されている （特許文献 1 ) 。 この 装置においては、 流路中にビーズ等を担体とする親和性吸着体の充填領域が 設けられており、 流路に目的成分を含む試料を流すと、 目的成分が親和性吸 着体に吸着されるようになっている。 ところが、 このような構成では、 従来 のカラムを用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィー同様、 親和性吸着体の 充填率が高い場合、 親和性吸着体同士が充分に離間して存在することができ ず、 親和性吸着体の表面全体が目的物質との吸着に関与することができず、 分離効率が低下するという課題があった。
また、 特許文献 1に記載の装置では、 チャネルの壁を不溶性の担体とする ことができる旨記載されているが、 壁のみを用いる場合表面積が小さく、 充. 分な親和性吸着体を備えようとすると、 チャネルの長さが大きくなつてしま つていた。
さらに、 目的の物質を親和性吸着体に吸着させた後、 親和性吸着体から脱 着させて回収する必要があるが、 この際に高濃度の塩溶液や有機溶媒を含む 溶液を用いるため、 目的の物質がタンパク質等の高次構造を有する物質であ る場合、 立体構造の不可逆的な変性や、 失活などが生じるという課題があつ た。
特許文献 1 特表 2 0 0 2— 5 0 2 5 9 7号公報 発明の開示
上記事情に鑑み、 本発明の目的は、 特異的相互作用を用いて試料中の特定 物質を効率よく分離する装置または方法を提供することにある。 また、 本発 明の別の目的は、 微量の特定物質を効率よく分離し、 回収する小型の分離装 置を提供することにある。 また、 本発明のさらに別の目的は、 特定物質を吸 着させた後簡易な方法で脱着させ、 高い活性を維持した状態で回収する分離 装置または分離方法を提供することにある。 また、 本発明のさらにまた別の 目的は、 生体試料に適用可能な質量分析システムを提供することにある。 本発明によれば、 基材と、 該基材に設けられた試料が流れる流路と、 該流 路に設けられ、 前記試料中の特定物質を分離する分離部と、 該分離部に設け られ、 前記流路よりも幅狭の微細流路と、 を含み、 前記分離部に前記特定物 質と選択的に吸着または結合する被吸着物質の層が形成されていることを特 徴とする分離装置が提供される。
本発明において、 「選択的に吸着または結合する」 とは、 被検物質のみが 検出物質と吸着または結合し、 試料中に含まれる他の物質は吸着または結合 しないことをいう。 吸着または結合の様式に制限はなく、 物理的な相互作用 であっても、 化学的な相互作用であってもよい。 また、 選択的な吸着または 結合のことを、 以下適宜 「特異的相互作用」 と呼ぶ。
本発明に係る分離装置は、 分離部においてァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一の原理を利用して試料中の特定物質の分離を行う装置である。 本発明に 係る分離装置では、 基材に形成された流路に分離部が設けられた構成となつ ているため、 特定物質を含む試料を流路に導入すると、 分離部に形成された 被吸着物質の層に選択的に吸着または結合させることができる。 このため、 簡便な操作により特定物質の分離を行うことができる。
また、 分離部に流路よりも幅狭の微細流路を形成することにより、 分離部 表面の被吸着物質に接近し、 相互作用することができる特定物質の分子数を 増加させることができる。 よって、 特定物質を効率よく分離することが可能 である。
本発明に係る分離装置はマイクロチップ上でァフィ二ティーク口マトダラ フィーを行うことができるため、 T A S (M i c r o t o t a l A n a 1 y t i c a 1 S y s t e m :マイクロト一タル ·アナリティカル · シス テム） に組み込むことも可能となる。 たとえば、 分離部により分離された試 料を試料乾燥部に連通する構成とすることにより、 分離した試料を乾燥させ て回収し、 また質量分析等に供することが可能となる。
本発明によれば、 基材と、 該基材に設けられた試料が流れる流路と、 該流 路に設けられ、 前記試料中の特定物質を分離する分離部と、 該分離部に設け られた突起部と、 を含み、 前記分離部に前記特定物質と選択的に吸着または 結合する被吸着物質の層が形成されていることを特徴とする分離装置が提供 される。
本発明に係る分離装置では、 分離部に突起部が形成されているため、 分離 部表面の被吸着物質に接近し、 相互作用することができる特定物質の分子数 を増加させることができる。 また、 突起部の形状および配置を調節すること により、 分離部における試料通過経路の幅を調節することができる。 したが つて、 分離部の形状を特定物質の分子サイズに応じて最適化することができ るため、 担体粒子を流路に充填する従来の方法に比べて分離効率を向上させ ることができる。
本発明の分離装置において、 前記分離部および前記流路に電極が設けられ、 前記電極間に電圧を付与する電圧付与手段をさらに備える構成とすることが できる。
また、 本発明の分離装置において、 前記分離部に突起部が設けられ、 該突 起部に電極が形成されている構成とすることができる。 こうすることにより、 帯電した特定物質をより一層効率よく分離部に誘導することが可能となる。 また、 分離部において被吸着物質に選択的に吸着または結合した特定物質を 脱着させる際にも、 電極に付与する電位の正負を制御すれば脱着が容易とな るため、 流路に流す脱離用溶液の塩濃度、 有機溶媒濃度等を低減することが できる。 したがって、 特定物質がタンパク質等である場合にも、 失活ゃ変性 を抑制することができる。
本発明の分離装置において、 前記特定物質と前記被吸着物質との組み合わ せは、 抗原と抗体、 酵素と基質、 酵素と基質誘導体、 酵素と阻害剤、 糖とレ クチン、 D N Aと D N A、 D N Aと R N A、 タンパク質と核酸、 金属とタン パク質またはリガンドとレセプターのいずれかの組み合わせとすることがで きる。 こうすることにより、 生体試料中から特定物質を分離することができ る。 このとき、 本発明に係る分離装置は、 基材に流路が形成された構成であ り、 微量の試料の分離にも適した構成であるため、 確実に分離を行うことが できる。
本発明の分離装置において、 前記被吸着物質がスぺーサーを介して前記基 材の表面に備えられた構成とすることができる。 スぺーサ一を設けることに より、 被吸着物質と基板との間に好適な空間が形成されるため、 特定物質の 吸着または結合を効率よく形成させることができる。 また、 スぺーサーを親 水性分子とすることにより、 分離部の表面が親水性のグラフト鎖で被覆され ることになるため、 分離部表面への特定物質以外の不要成分の非特異的な吸 着を抑制することができる。
本発明によれば、 基材に設けられた流路と、 該流路に設けられた分離部と、 該分離部に設けられ、 前記流路よりも幅狭の微細流路と、 を含む分離装置の 分離部に、 分離対象物質に選択的に吸着または結合する被吸着物質と異なる 符号の電圧を印加しながら、 前記流路に前記被吸着物質を含む液体を導入し、 前記分離部に吸着させるステップと、 前記流路に前記分離対象物質を含む試 料を導入し、 前記被吸着物質に選択的に吸着または結合させるステップと、 前記流路に前記分離対象物質を前記被吸着物質から脱離させる脱離液を導入 し、 前記分離対象物質を脱離させ、 回収するステップと、 を行うことを特徴 とする分離方法が提供される。
また、 本発明によれば、 基材に設けられた流路と、 該流路に設けられた分 離部と、 該分離部に設けられた突起部と、 を含む分離装置の分離部に、 分離 対象物質に選択的に吸着または結合する被吸着物質と異なる符号の電圧を印 加しながら、 前記流路に前記被吸着物質を含む液体を導入し、 前記分離部に 吸着させるステップと、 前記流路に前記分離対象物質を含む試料を導入し、 前記被吸着物質に選択的に吸着または結合させるステップと、 前記流路に前 記分離対象物質を前記被吸着物質から脱離させる脱離液を導入し、 前記分離 対象物質を脱離させ、 回収するステップと、 を行うことを特徴とする分離方 法が提供される。
本発明に係る分離方法によれば、 分離部に電圧を印加しながら被吸着物質 の吸着、 試料の導入、 および試料中の特定物質の脱離と回収を行うことによ り、 被吸着物質をカップリング剤等を用いて基材に固定化することなく、 簡 便かつ確実に特定物質の分離を行うことが可能となる。 たとえば、 被吸着物 質がマイナスに帯電している場合、 分離部にプラスの電位を付与することに より、 被吸着物質を分離部に吸着させることができる。
本発明によれば、 生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離 手段と、 前記分離手段により分離された試料に対し、 酵素消化処理を含む前 処理を行う前処理手段と、 前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、 乾燥 後の試料を質量分析する質量分析手段と、 を備え、 前記分離手段は、 前記分 離装置を含むことを特徴とする質量分析システムが提供される。 ここで生体 試料は、 生体から抽出したものであってもよく、 合成したものであってもよ い。
なお、 以上の構成要素の任意の組み合わせや、 本発明の構成要素や表現を 方法、 装置の間で相互に置換したものもまた、 本発明の態様として有効であ る。
以上説明したように本発明によれば、 基材に設けられた流路と、 流路に設 けられた分離部と、 分離部に設けられ、 流路よりも幅狭の微細流路と、 を含 み、 分離部に試料中の特定物質と選択的に吸着または結合する被吸着物質の 層が形成されていることにより、 特異的相互作用を用いて試料中の特定物質 を効率よく分離する装置または方法が実現される。 また、 本発明によれば、 微量の特定物質を効率よく分離し、 回収する小型の分離装置が実現される。 また、 本発明によれば、 特定物質を吸着させた後簡易な方法で脱着させ、 高 い活性を維持した状態で回収する分離装置または分離方法が実現される。 ま た、 本発明によれば、 生体試料に適用可能な質量分析システムが実現される < 図面の簡単な説明
上述した目的、 およびその他の目的、 特徴および利点は、 以下に述べる好 適な実施の形態、 およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかに なる。
図 1は、 本実施形態に係る分離装置の構成を示す上面図である。
図 2は、 図 1の分離装置の分離領域の構成を示す図である。
図 3は、 図 1の分離装置の分離部の構成を示す斜視図である。
図 4は、 図 1の分離装置の表面の構成を説明するための図である。
図 5は、 図 1の分離装置の柱状体表面の構成を説明するための図である。 図 6は、 本実施形態に係る分離装置の構成を示す図である。 図 7は、 図 6の分離装置の液溜めの構成を説明するための図である。
図 8は、 図 7の液溜めの B— B ' 方向の構成を説明するための図である。 図 9は、 本実施形態に係る分離装置の分離部の構成を示す図である。
図 1 0は、 図 1の分離装置の分離部の構成を示す図である。
図 1 1は、 質量分析装置の構成を示す概略図である。
図 1 2は、 本実施形態に係る分離装置の構成を示す図である。
図 1 3は、 図 1 2の分離装置の乾燥部の構成を示す図である。
図 1 4は、 本実施形態に係る分離装置の作製方法を示す工程断面図である 図 1 5は、 本実施形態に係る分離装置の作製方法を示す工程断面図である 図 1 6は、 本実施形態に係る分離装置の作製方法を示す工程断面図である 図 1 7は、 本実施形態に係る分離装置の作製方法を示す工程断面図である 図 1 8は、 分離装置の他の例を示す図である。
図 1 9は、 分離装置の他の例を示す図である。
図 2 0は、 図 1 8に示した分離装置のサンプル定量管の近傍の拡大図であ る。
図 2 1は、 図 1 9に示した分離装置の詳細図である。
図 2 2は、 本実施形態の分離装置を含む質量分析システムのブロック図で ある。 発明を実施するための最良の形態
以下、 好ましい実施の形態について図面を参照しながら説明する。 なお、 すべての図面において、 同様な構成要素には同様の符号を付し、 適宜説明を 省略する。
(第一の実施形態）
図 1は、 本実施形態に係る分離装置 1 0 0の上面図である。 分離装置 1 0 0においては、 基板 1 0 1上に流路 1 0 3が設けられ、 流路 1 0 3の一部に 分離部 1 0 7を含む分離領域 1 1 3が形成されている。 また、 流路 1 0 3の 両端はそれぞれ試料導入部 1 4 5および液溜め 1 4 7に連通している。 なお、 流路 1 0 3の上面を被覆部材により被覆してもよい。 流路 1 0 3の 上面に被覆部材を設けることにより、 試料液体の乾燥が抑制される。 また、 試料中の成分がタンパク質等高次構造を有する物質である場合、 表面が親水 性の被覆部材を用い、 流路 1 0 3内を密閉することにより、 気液界面におい てこの成分が不可逆的に変性することが抑制される。
図 2は、 分離装置 1 0 0における分離領域 1 1 3の拡大図である。 図 2 ( a ) は上面図、 図 2 ( b ) は図 2 ( a ) の A— A '方向の断面図である。 分離部 1 0 7においては、 流路 1 0 3中に柱状体 1 0 5が等間隔で規則正し く形成されており、 柱状体 1 0 5間の間隙を液体が流れる。 柱状体 1 0 5の 表面には、 図 4において後述するように被吸着物質層が形成されているため、 試料液体中の特定成分が柱状体 1 0 5表面において非吸着物質と選択的に吸 着または結合することが可能である。
図 3は、 分離部 1 0 7における基板 1 0 1の構成を示す斜視図である。 図 3において、 Wは流路 1 0 3の幅、 Dは流路 1 0 3の深さを示し、 φ は柱 状体 1 0 5の直径、 dは柱状体 1 0 5の高さ、 pは隣接する柱状体 1 0 5間 の平均間隔を示す。 これらの各寸法は、 たとえば図 3に示された範囲とする ことができる。 また、 分離目的の分子の直径を Rとした場合、 Rと p、 D、 または dとについては次の条件を満たすことが好ましい。 こうすることによ り、 分離部 1 0 7に導入された試料中の特定物質 A 'が効率よく壁面に接触 し、 分離される。
p ： 0 . 5 R≤ p≤ 5 0 R
D ： 5 R≤ D≤ 5 0 R
d ： R≤ d≤ 5 0 R
図 4は、 基板 1 0 1の表面の構成を説明するための図である。 基板 1 0 1 には、 被吸着物質層 1 0 9が形成されている。 すなわち、 被吸着物質は基板 1 0 1の表面に固定化されている。
また図 5は、 柱状体 1 0 5表面を例に、 被吸着物質層 1 0 9に被吸着物質 Aが固定化されている様子を説明する図である。 図 5 ( a ) では、 柱状体 1 0 5の表面に低分子物質が被吸着物質 Aとして固定化されている。 このよう な柱状体 1 0 5に特定物質 A'を含む試料液体が導入されると、 図 5 (b) に示すように、 試料液体中の特定物質 A'が被吸着物質 Aに選択的に吸着ま たは結合し、 複合体を形成する。 したがって、 分離装置 1 0 0では、 被吸着 物質 Aに対する特異的相互作用を有する特定物質 A'のみを選択的に被吸着 物質層 1 0 9に吸着させ、 試料中の他の成分から分離することができる。 分離装置 1 00において、 基板 1 0 1の材料としてシリコンを用いる。 ま た、 シリコンにかえて、 たとえば石英等のガラス、 プラスチック材料等を用 いてもよい。 プラスチック材料として、 たとえばシリコン樹脂、 PMMA (ポリメ夕クリル酸メチル） 、 PET (ポリエチレンテレフタレート） 、 P C (ポリカーボネート） 等の熱可塑性樹脂や、 エポキシ樹脂などの熱硬化性 樹脂等が挙げられる。 このような材料は成形加工が容易なため、 乾燥装置の 製造コストを抑えることができる。
柱状体 1 0 5は、 たとえば、 基板 1 0 1を所定のパタ一ン形状にエツチン グすることにより形成することができるが、 その作製方法には特に制限はな い。 また、 図 2の柱状体 10 5は円柱であるが、 円柱、 擬円柱等の擬円柱に 限らず、 円錐、 楕円錘等の錐体；三角柱、 四角柱等の多角柱；その他の断面 形状を有する柱体；等としてもよい。
被吸着物質層 1 09に備える被吸着物質 Aと特定物質 A'は、 選択的に吸 着または結合する組み合わせから選択される。 このような組み合わせとして. たとえば、
(a) リガンドとレセプター、
(b) 抗原と抗体、
(c) 酵素と基質、 酵素と基質誘導体、 または酵素と阻害剤、
(d) 糖とレクチン、
(e) DNA (デォキシリボ核酸） と RNA (リポ核酸） 、 または DNAと DNA、
( f ) タンパク質と核酸 (g) 金属とタンパク質
の組み合わせを用いることができる。 それぞれの組み合わせにおいて、 任意 の一方が特定物質となり、 他方が被吸着物質となる。
(a) の場合、 ステロイドなどのホルモン、 神経伝達物質などの生理活性 物質、 薬物、 その他の血中因子、 インシュリンレセプターなどの細胞膜レセ プター、 あるいは上記レセプ夕一に対して親和性を有するタンパク質、 糖夕 ンパク質、 糖脂質、 または低分子物質など、 を用いることができる。
(b) の場合、 抗原は、 いわゆるハプテンなどの低分子物質であっても、 タンパク質などの高分子物質であってもよい。 抗原の例として、 たとえば、 HCV抗原や、 CEA、 P S Aなどの腫瘍マーカ一、 ヒト免疫不全ウィルス (H I V) 、 異常プリオン、 アルツハイマー症に特有のタンパク質等を用い ることができる。 とその阻害剤候補、 H I Vウィルスの逆転写酵素とその阻害剤候補、 または H I Vプロテア一ゼとその阻害剤候補等の組み合わせとすることができる。
(d) の場合、 たとえば N—ァセチル— D_ダルコサミンと小麦胚レクチ ン、 コンカナパリン A (C o nA) と C o n Aレセプ夕一糖タンパク質等の 組み合わせを用いることができる。
(e) の場合、 変異した DNAと、 変異した DNAに対する相補的 DNA などを用いることができる。
( f ) の場合、 たとえば DN A結合タンパク質と DN Aなどの組み わせ を用いることができる。
また、 (g) の場合、 たとえばニッケルとヒスチジンタグ （H i s— T a g) などの組み合わせを用いることができる。
なお、 流路 1 03の上部に被覆部材を設ける場合、 その材料としては、 た とえば基板 1 0 1と同様の材料の中から選択することができる。 基板 1 0 1 と同種の材料を用いてもよいし、 異なる材料としてもよい。
次に、 分離装置 1 00を用いた特定物質 A'の分離方法について説明する < 図 1にもどり、 特定物質 A 'を含む試料液体を試料導入部 1 4 5に注入し、 毛細管効果あるいはポンプを用いた圧入などにより流路 1 0 3に展開させる。 試料液体の流速は、 たとえば 1 O n 1 Zm i n以上 1 0 0 1 Zm i n以下 とする。 すると、 図 5を用いて前述したように、 分離部 1 0 7において被吸 着物質 Aに対する特異的相互作用を有する特定物質 A 'のみが選択的に被吸 着物質層 1 0 9に吸着する。 吸着しなかった成分は、 溶媒または分散媒であ る液体とともに液溜め 1 4 7に導かれる。
次に、 試料導入部 1 4 5から流路 1 0 3洗浄用の緩衝液等を流し、 流路 1 0 3に滞留する特定物質 A '以外の成分を除去する。 このとき、 特定物質 A 'と被吸着物質 Aとは特異的相互作用により吸着または結合しているため、 これらが解離することはない。
流路 1 0 3を洗浄した後、 特定物質 A 'を被吸着物質 Aから脱着させる。 脱着方法として、 たとえば 0 . 1 m o 1 / 1以上 1 m o 1 / 1以下の N a C 1溶液を試料導入部 1 4 5から流路 1 0 3に導入する方法を用いることがで きる。 また、 被吸着物質 Aと特定物質 A 'とが抗原と抗体であるような場合 には、 被吸着物質 Aに対する特異的相互作用を有し、 被吸着物質 Aに対する 結合定数が特定物質 A 'よりも大きい物質を競争阻害剤として流路 1 0 3に 導入し、 特定物質 A 'を脱着させることもできる。 脱着した特定物質 A 'は、 液溜め 1 4 7に導かれ、 回収される。
以上のように、 分離装置 1 0 0は流路 1 0 3に分離部 1 0 7が形成されて いるため、 試料が微量である場合にも流路 1 0 3に導入することにより特定 物質 A 'を分離し、 回収することが可能である。 カラムを用いたァフィニテ ィ一クロマトグラフィーに比べ、 操作は簡便である。 また、 分離装置 1 0 0 は使い捨てのチップであるため、 分離装置 1 0 0の洗浄操作が不要であり、 確実に分離を行うことができる。
次に、 分離装置 1 0 0の製造方法について説明する。
基板 1 0 1上への流路溝 1 0 3および柱状体 1 0 5の形成は、 基板 1 0 1 を所定のパターン形状にエッチング等を行うことができるが、 その作製方法 には特に制限はない。
図 1 5、 図 1 6、 および図 1 7はその一例を示す工程断面図である。 各分 図において、 中央が上面図であり、 左右の図が断面図となっている。 この方 法では、 微細加工用レジス卜のカリックスァレーンを用いた電子線リソグラ フィ技術を利用して柱状体 1 0 5を形成する。 カリックスァレーンの分子構 造の一例を以下に示す。 カリックスァレーンは電子線露光用のレジストとし て用いられ、 ナノ加工用のレジストとして好適に利用することができる。
Figure imgf000014_0001
ここでは、 基板 1 0 1として面方位が （1 0 0) のシリコン基板を用いる まず、 図 1 5 (a) に示すように、 基板 1 0 1上にシリコン酸化膜 1 8 5、 力リックスァレーン電子ビームネガレジスト 1 8 3をこの順で形成する。 シ リコン酸化膜 1 8 5、 カリックスァレーン電子ビームネガレジスト 1 8 3の 膜厚は、 それぞれ 4 0 nm、 5 5 nmとする。 次に、 電子ビーム （EB) を 用い、 柱状体 1 0 5となる領域を露光する。 現像はキシレンを用いて行い、 イソプロピルアルコールによりリンスする。 この工程により、 図 1 5 (b) に示すように、 力リックスァレーン電子ビームネガレジスト 1 8 3がパター ニングされる。
つづいて全面にポジフォトレジスト 1 5 5を塗布する （図 1 5 (c ) ) 。 膜厚は 1. 8 ;^mとする。 その後、 流路 1 0 3となる領域が露光するように マスク露光をし、 現像を行う （図 1 6 (a) ) 。
次に、 シリコン酸化膜 1 8 5を C F4、 CHF3の混合ガスを用いて R I Eエッチングする。 エッチング後の膜厚を 3 5 nmとする （図 1 6 (b) ) t レジストをアセトン、 アルコール、 水の混合液を用いた有機洗浄により除去 した後、 酸化プラズマ処理をする （図 1 6 ( c ) ) 。 つづいて、 基板 1 0 1 を HB rガスを用いて E C Rエッチングする。 エッチング後のシリコン基板 の膜厚を 4 O O nmとする （図 1 7 ( a) ) 。 つづいて B H Fバッファ一ド フッ酸でウエットエッチングを行い、 シリコン酸化膜を除去する （図 1 7 (b) ) 。 以上により、 基板 1 0 1上に流路 1 0 3および柱状体 1 0 5が形 成される。
ここで、 図 1 7 (b) の工程に次いで、 基板 1 0 1表面の親水化を行うこ とが好ましい。 基板 1 0 1表面を親水化することにより、 流路 1 0 3や柱状 体 1 0 5に試料液体が円滑に導入される。 特に、 柱状体 1 0 5により流路が 微細化した分離部 1 0 7においては、 流路の表面を親水化することにより、 試料液体の毛管現象による導入が促進され、 分離効率が向上するため好まし い。
そこで、 図 1 7 (b) の工程の後、 基板 1 0 1を炉に入れてシリコン熱酸 化膜 1 8 7を形成する （図 1 7 (c ) ) 。 このとき、 酸化膜の膜厚が 3 0 n mとなるように熱処理条件を選択する。 シリコン熱酸化膜 1 8 7を形成する ことにより、 分離装置内に液体を導入する際の困難を解消することができる ( その後、 被覆 1 8 9で静電接合を行い、 シーリングして分離装置を完成する (図 1 7 (d) ) 。
なお、 基板 1 0 1にプラスチック材料を用いる場合、 エッチングやェンポ ス成形等の金型を用いたプレス成形、 射出成形、 光硬化による形成等、 基板 1 0 1の材料の種類に適した公知の方法で行うことができる。
基板 1 0 1にプラスチック材料を用いる場合にも、 基板 1 0 1表面の親水 化を行うことが好ましい。 基板 1 0 1表面を親水化することにより、 流路 1 0 3や柱状体 1 0 5に試料液体が円滑に導入される。 特に、 柱状体 1 0 5に より流路 1 0 3が微細化した分離部 1 0 7においては、 流路 1 0 3の表面を 親水化することにより、 試料液体の毛管現象による導入が促進され、 乾燥効 率が向上するため好ましい。
親水性を付与するための表面処理としては、 たとえば、 親水基をもつカツ プリング剤を流路 1 0 3の側壁に塗布することができる。 親水基をもつカツ プリング剤としては、 たとえばアミノ基を有するシランカップリング剤が挙 げられ、 具体的には N— ιδ (アミノエチル） ァ―ァミノプロピルメチルジメ トキシシラン、 Ν— )3 (アミノエチル） ァ一ァミノプロピルトリメトキシシ ラン、 Ν— ;8 (アミノエチル） ァーァミノプロピルトリエトキシシラン、 γ ーァミノプロビルトリメトキシシラン、 ァーァミノプロピルトリエトキシシ ラン、 Ν—フエ二ルーァ―ァミノプロピルトリメトキシシラン等が例示され る。 これらの力ップリング剤は、 スピンコ一ト法、 スプレー法、 ディップ法、 気相法等により塗布することができる。
また、 流路壁に試料の分子が粘着するのを防ぐために、 流路 1 0 3に付着 防止処理を行うことができる。 付着防止処理としては、 たとえば、 細胞壁を 構成するリン脂質に類似した構造を有する物質を流路 1 0 3の側壁に塗布す ることができる。 このような処理により、 試料がタンパク質等の生体成分で ある場合、 成分の変性を防ぐことができると共に、 流路 1 0 3における特定 の成分の非特異吸着を抑制することができ、 回収率を向上することができる c 親水性処理および付着防止処理としては、 たとえば、 リピジユア （登録商標、 日本油脂社製） を用いることができる。 この場合、 リピジユア （登録商標） を 0 . 5 w t %となるように Τ Β Εバッファ一等の緩衝液に溶解させ、 この 溶液で流路 1 0 3内を満たし、 数分間放置することによって流路 1 0 ' 3の内 壁を処理することができる。 この後、 溶液をエアガン等で吹き飛ばして流路 1 0 3を乾燥させる。 付着防止処理の他の例としては、 たとえばフッ素樹脂 を流路 1 0 3の側壁に塗布することができる。
次に、 分離部 1 0 7における基板 1 0 1表面への被吸着物質の固定化方法 として、 たとえば、 物理的吸着法、 共有結合法、 などの方法を用いることが でさる。
物理的吸着法を用いる場合、 たとえば被吸着物質の単分子膜を作製し、 分 離部 1 0 7における基板 1 0 1の表面に吸着させることができる。
また、 共有結合法を用いる場合、 基板 1 0 1表面に表面改質を施し反応性 の官能基や活性基を導入し、 被吸着物質を含む溶液と基板 1 0 1とを接触さ せ、 基板 1 0 1表面に被吸着物質を結合させることができる。 基板 1 0 1の 表面改質方法は、 目的に応じ適宜選択することができるが、 たとえば、 ブラ ズマ処理や、 イオンビームによる処理、 電子線処理、 などを用いることがで きる。 このとき、 基板 1 0 1の表面にスぺ一サ一分子を固定化し、 スぺーサ —分子と被吸着物質とを結合させることもできる。 スぺ一サー分子の固定化 方法については後述する。
また、 石英系ガラス製などの基板 1 0 1を用いる場合、 この表面に被吸着 物質 Aを化学的に結合させるために、 シランカツプリング剤などのカツプリ ング剤を用いることができる。 カップリング剤を用いる場合、 柱状体 1 0 5 の表面にカツプリング剤を塗布した後、 カツプリング剤のもつ有機官能基と 被吸着物質 Aとを結合させる。 このとき、 たとえば被吸着物質 Aのチオール 基や、 アミノ基、 力ルポキシル基、 アルデヒド基、 水酸基等を利用すること ができる。 たとえば、 リガンドのカルボキシル基を用いる場合、 リガンドの 基板 1 0 1の固定化は以下のようにして行うことができる。 基板 1 0 1を、 — N H 2基を有するシランカツプリング剤の水溶液に浸漬する。 シランカツ プリング剤の濃度は、 たとえば 0 . 1 %以上 2 . 0 %以下とする。 シラン力 ップリング剤により表面処理された基板 1 0 1に、 たとえばカルポジイミド 法など、 縮合試薬を用いた方法によりリガンドを固定化する。 なお、 固定化 の際には必要に応じて、 N—ヒドロキシスクシンイミドなどの活性化剤を併 用してもよい。 シランカップリング剤の一 N H 2基と、 リガンドのカルポキ シル基とが結合する。 こうして、 リガンドが固定化された層を被吸着物質層 1 0 9とする分離部 1 0 7が得られる。
また、 別の固定化方法として、 被吸着物質 Aを予めピオチン化する方法が ある。 ピオチン化しておけば、 基板 1 0 1にアビジンまたはストレプトアビ ジンを固定化し、 ピオチンとアビジンとの相互作用により特定物質を選択的 に吸着させることができる。 このとき、 アビジンとピオチンとの間の結合定 数は通常の抗原抗体間の結合定数等に比べて顕著に大きいため、 ピオチン化 した被吸着物質 Aが基板 1 0 1に固定化されたアビジン等から脱離しない条 件で被吸着物質 Aから特定物質 A 'を脱離させ、 回収することができる。
基板 1 0 1への被吸着物質の固定密度は、 特定物質が被吸着物質と結合で きる程度に十分に密であることが好ましい。 こうすることにより、 試料中に 含まれる他の物質が、 基板 1 0 1表面に非特異的に吸着または結合すること を抑制することができる。 また特に、 たとえば被吸着物質 Aが低分子物質で 特定物質 A 'がかざ高い構造の高分子物質である場合、 立体障害により特定 物質 A 'が被吸着物質 Aに吸着または結合することができなくなることがな いような固定密度とすることが好ましい。
さらに、 被吸着物質層 1 0 9の形成方法として、 被吸着物質を固定化する 方法にかわり、 分子インプリンティング法を用いて、 特定物質が結合できる 铸型ポリマー層を基板 1 0 1表面に設けることもできる。 分子インプリンテ ィング法では、 目的分子にあわせてテ一ラ一メイド的にそれを認識する高分 子材料を一段階で合成する方法で、 具体的には以下のようにして行う。 まず、 目的分子を铸型として、 機能性モノマーを共有結合または非共有結合により 結合させ、 錶型分子—機能性ポリマー複合体を形成させる。 ここで、 機能性 モノマーとして铸型分子と結合可能な官能基と、 ビニル基などの重合可能な 基を有する 2官能性以上のモノマーを用いることができる。 次に、 铸型分子 一機能性モノマー複合体を含む溶液に、 架橋剤と重合開始剤を加え、 分離部 1 0 7の壁面にて重合反応を行う。 そして、 铸型分子を、 たとえば酵素分解 などにより、 重合したポリマ一から分解除去する。 すると、 得られたポリマ 一には、 铸型分子との特異的結合部位が形成される。
なお、 前述のように、 被吸着物質 Aを化学的に結合させる場合、 図 1 0に 示すように、 基板 1 0 1と被吸着物質 Aとの間に、 適宜、 スぺ一サー 1 1 9 を設けることもできる。 スぺ一サ一 1 1 9とは、 特定物質 A 'と被吸着物質 Aとの選択的な吸着または結合が立体障害なしに進行するように、 被吸着物 質 Aを基板 1 0 1から離すため、 基板 1 0 1と被吸着物質 Aとの間に挿入さ せる化合物のことをいう。 こうすることにより、 図 1 0 ( a ) および図 1 0 (b) のように、 被吸着物質 Aと特定物質 A'との吸着または結合が容易と なる。 また、 スぺ一サー 1 1 9に親水性の分子を用いることにより、 基板 1 0 1表面への目的外成分の非選択的な吸着を抑制することができる。 スぺー サー 1 1 9の鎖長は比較的短いことが好ましい。 また、 活性基を有するもの が好ましい。 被吸着物質 Aの固定化操作がより簡便になるからである。 活性 基は、 被吸着物質 Aとの反応性を有する官能基であれば特に制限はない。 な お、 スぺーサー 1 1 9に活性基がない場合は、 縮合試薬等を用いてスぺ一サ 一 1 1 9の官能基と被吸着物質 Aとを結合させる。 たとえば、 被吸着物質 A のチオール基や、 アミノ基、 力ルポキシル基、 アルデヒド基、 水酸基等を利 用することができる。
スぺーサ— 1 1 9は、 ァフィ二ティークロマトグラフィ一や S P R法など で用いられる分子を適宜選択することができるが、 たとえば、 へキサメチレ ンジァミン （HMDA) 、 エチレングリコールジグリシジルエーテル （E G D G) や、 鎖長の短いポリエチレングリコール (P E G) 、 ポリエチレンォ キサイド （P EO) 、 デキストランまたはその誘導体、 などを用いることが できる。
さらに、 基板 1 0 1表面に被吸着物質 Aが固定化された構成にかわり、 分 子ィンプリンティング法により、 特定物質 A'が結合できる錶型ポリマー層 が設けられた構成とすることもできる。
(第二の実施形態）
本実施形態は、 第一の実施形態に記載の分離装置において、 分離部 1 0 7 が隔壁によって隔てられた複数の細分化流路となっている構成である。 図 9 は、 本実施形態に係る分離装置 1 0 0の分離領域 1 1 3の構成を示す図であ る。 図 9 (a) は上面図、 図 9 (b) は図 9 ( a) の C— C'方向の断面図 である。 分離部 1 5 3においては、 流路 1 0 3中に隔壁 1 5 1が等間隔で規 則正しく形成されており、 隔壁 1 5 1間の間隙を液体が流れる。 すなわち、 流路 1 0 3より幅狭の流路が形成されており、 これらの微細流路が分離用流 路 1 4 9となる。 そして、 分離用流路 1 4 9の表面には、 第一の実施形態と 同様に、 被吸着物質層 1 0 9が形成されているため、 試料液体中の特定物質 A'が分離用流路 1 4 9において非吸着物質 Aと選択的に吸着または結合す ることが可能である。
図 9の分離領域 1 1 3は、 第一の実施形態と同様にして作製することがで きる。
(第三の実施形態）
本実施形態は、 第一の実施形態に記載の分離装置 1 0 0において、 分離部 1 0 7に設けられた柱状体 1 0 5の内部に電極が設けられており、 これらの 電極に電位を付与する態様である。 分離部 1 0 7の内部に電極を形成する方 法としての一例は以下の通りである。 図 1 4は、 本実施形態に係る分離装置 の製造方法を示す工程断面図である。 まず、 電極の装着部分を含む金型 1 7 3を用意する （図 1 4 (a) ) 。 そして、 金型 1 7 3に電極 1 7 5を設置す る （図 1 4 (b) ) 。 電極 1 7 5に用いる材料は、 たとえば Au、 P 1； 、 A g、 A 1 、 Cuなどとする。 次に、 金型 1 7 3上に被覆用金型 1 7 9をセッ トして電極 1 7 5を固定し、 基板 1 0 1となる榭脂 1 7 7を金型 1 7 3内に 射出し、 成形する （図 1 4 (c) ) 。 樹脂 1 7 7として、 たとえば PMMA を用いる。
そして、 成形された樹脂 1 7 7を金型 1 7 3および被覆用金型 1 7 9から 外すと、 流路 1 0 3の形成された基板 1 0 1が得られる （図 1 4 (d) ) 。 基板 1 0 1の裏面の電極 1 7 5表面の不純物をアツシングにより除去し、 電 極 1 7 5材料金属を露出させる。 必要に応じて、 基板 1 0 1の底面に金属膜 を蒸着等により形成し、 これを配線 1 8 1とする （図 1 4 (e) ) 。 以上の ようにして、 流路 1 0 3中に電極 1 7 5を柱状体 1 0 5とする分離部 1 0 7 が形成される。 こうして形成された電極または配線 1 8 1は、 外部電源 （不 図示） に接続され、 電圧を印加することができるようになつている。 なお、 上記工程の後、 流路 1 0 3の全面に絶縁膜を形成してもよい。 このとき、 絶 縁膜の厚さは、 たとえば 1 0 nm以上 5 0 0 nm以下とする。
なお、 分離装置 1 0 0 (図 1) において、 試料導入部 1 4 5および液溜め 1 4 7についても同様の方法あるいは第四の実施形態に記載の方法で電極を 形成しておけば、 電極を基板 1 0 1の下面等を導通させて外部電源 （不図 示） に接続し、 試料導入部 1 4 5と分離部 1 0 7との間、 分離部 1 0 7と液 溜め 1 4 7との間、 および試料導入部 1 4 5と液溜め 1 4 7との間、 にそれ ぞれ電圧を付与することが可能となる。
このような構成とすると、 試料中の目的成分の分離をより一層確実に効率 よく行うことができる。 たとえば、 特定物質 A 'がタンパク質であって、 そ のタンパク質の等電点よりも低 p Hの緩衝液に溶解された試料から分離を行 う場合、 試料導入部 1 4 5を正極、 分離部 1 0 7を負極として通電すると、 正に帯電したタンパク質が効率よく分離部 1 0 7に導かれ、 被吸着物質層 1 0 9に選択的に吸着する。 流路 1 0 3中の他の成分を除去した後、 今度は分 離部 1 0 7を正極、 液溜め 1 4 7を負極として通電すれば、 被吸着物質層 1 0 9に保持されていたタンパク質の脱離および液溜め 1 4 7への誘導が促進 される。 なお、 被吸着物質層 1 0 9に保持されていたタンパク質を脱離させ る際には、 交流電場を付与することにより、 タンパク質分子の運動性が増し、 さらに脱離が促進される。
このため、 特定物質 A 'と被吸着物質 Aとを脱離させるために流路 1 0 3 に流す溶離液の塩濃度や有機溶媒濃度を低減することができる。 したがって， 特定物質 A 'がタンパク質等の高次構造を有する物質である場合にも、 立体 構造の不可逆的な変性や、 失活などを抑制することができる。
さらに、 柱状体 1 0 5を電極として電位を付与することにより、 被吸着物 質 Aを基板 1 0 1に固定化する操作が不要となる場合がある。 たとえば、 被 吸着物質 Aをタンパク質とし、 これに対するレセプターが特定物質 A 'であ つて、 タンパク質がマイナスに帯電している p H条件でリガンドが帯電して いないかあるいはプラスに帯電している場合、 以下のようにして特定物質 A 'の分離を行うことができる。
まず、 流路 1 0 3に被吸着物質 Aすなわちタンパク質の溶液を導入する。 このとき、 タンパク質はマイナスに帯電しているため、 柱状体 1 0 5を正極 として静電界を付与する。 すると、 タンパク質は静電相互作用により柱状体 1 0 5表面にタンパク質が吸着する。 柱状体 1 0 5に静電界を付与しながら、 流路 1 0 3中の余分なタンパク質をバッファ一により洗い流した後、 流路 1 0 3にリガンドを含む試料を導入する。 すると、 タンパク質表面にリガンド が吸着するため、 他の成分から分離される。 そして、 第一の実施形態等と同 様にして、 流路 1 0 3を洗浄後、 塩溶液等を流すことにより、 リガンドが夕 ンパク質から脱着し、 回収される。 このとき、 電界を付与したままリガンド を脱離させるため、 タンパク質は柱状体 1 0 5表面に吸着された状態が維持 される。
以上のように、 柱状体 1 0 5に電極を形成することにより、 被吸着物質 A をカツプリング剤等を用いて固定化する工程が不要となるため、 より簡便に 分離を行うことが可能となる。 なお、 タンパク質がプラスに帯電しており、 リガンドが帯電していないかあるいはマイナスに帯電している場合にも、 柱 状体 1 0 5にマイナスの電位を付与することにより、 同様にしてリガンドを 分離することができる。
(第四の実施形態）
図 6は、 本実施形態に係る分離装置 1 7 1の構成を示す図である。 分離装 置 1 7 1においては、 基板 1 2 1上に分離用流路 1 3 1が形成され、 これと 交差するように投入用流路 1 2 9および回収用流路 1 3 5が形成されている c 投入用流路 1 2 9、 分離用流路 1 3 1および回収用流路 1 3 5には、 それぞ れその両端に液溜め 1 2 5 a、 1 2 5 b、 1 2 3 a、 1 2 3 b、 1 2 7 a、 1 2 7 bが形成されている。 各々の液溜めには電極が設けられており、 これ を用いて例えば分離用流路 1 3 1の両端に電圧を付与することができる。 ま た、 分離用流路 1 3 1には、 分離部 1 0 7が設けられている。 分離部 1 0 7 の構成は、 第一〜第三の実施形態のいずれに記載の構成としてもよい。
ここで、 電極が設けられた液溜めの構造について、 図 7および図 8を参照 して説明する。 図 7は、 図 1における液溜め 1 2 3 a付近の拡大図である。 また図 8は、 図 7における B— B '断面図である。 分離用流路 1 3 1および 液溜め 1 2 3 aが設けられた基板 1 2 1上には、 緩衝液等を注入できるよう にするための開口部 1 3 9が設けられた被覆 1 3 7が配設される。 また被覆 1 3 7の上には、 外部電源に接続することができるように電導路 1 4 1が設 けられる。 さらに図 8に示されるように、 電極板 1 4 3が液溜め 1 2 3 aの 壁面と電導路 1 4 1とに沿うように配設させる。 電極板 1 4 3と電導路 1 4 1とは圧着され、 電気的に接続される。 なお、 その他の液溜めについても上 記と同様な構造を有する。 それぞれの液溜めに形成された電極板 1 4 3は、 基板 1 0 1の下面等を導通させて外部電源 （不図示） に接続すると、 電圧が 印加可能となる。
図 6に戻り、 この装置を使って試料の分離を行う方法について説明する。 まず特定物質 A 'を含む試料を液溜め 1 2 5 a、 もしくは液溜め 1 2 5 bに 注入する。 液溜め 1 2 5 aに注入した場合は、 液溜め 1 2 5 bの方向へ試料 が流れるように電圧を印加し、 液溜め 1 2 5 bに注入した場合は、 液溜め 1
2 5 aの方向へ試料が流れるように電圧を印加する。 これにより、 試料は投 入用流路 1 2 9へと流入し、 結果的に投入用流路 1 2 9の全体を満たす。 こ の時、 分離用流路 1 3 1上では、 試料は投入用流路 1 2 9との交点にのみ存 在し、 投入用流路 1 2 9の幅程度の狭いパンドを形成している。
次に、 液溜め 1 2 5 a、 液溜め 1 2 5 bの間への電圧印加をやめ、 液溜め 1 2 3 aと液溜め 1 2 3 bの間に、 試料が液溜め 1 2 3 bの方向へ流れるよ うに電圧を印加する。 これにより試料は分離用流路 1 3 1を通過することに なる。 分離用流路 1 3 1中に設けられた分離部 1 0 7において、 特定物質 A 'のみが被吸着物質 Aと特異的に相互作用し、 他の成分は液溜め 1 2 3 bへ と排出される。 第一、 第二の実施形態と同様にして分離用流路 1 3 1を洗浄 した後、 液溜め 1 2 3 a、 液溜め 1 2 3 b間への電圧印加をやめ、 代わりに 液溜め 1 2 7 a、 液溜め 1 2 7 bの間に電圧を印加する。 すると分離用流路 1 3 1中と、 回収用流路 1 3 5の交差点に存在するバンドは、 回収用流路 1
3 5に流れこむ。 液溜め 1 2 7 a、 液溜め 1 2 7 b間への電圧印加を一定時 間の後に停止すると、 液溜め 1 2 7 aまたは液溜め 1 2 7 bに、 分離された バンドに含まれる特定物質 A 'が回収される。
以上の手順により、 特定物質 A 'が分離される。 分離装置 1 7 1は、 分離 用流路 1 3 1に加えて投入用流路 1 2 9、 回収用流路 1 3 5を備えるため、 不要な成分と特定物質 A 'とを異なる液溜めに導くことができる。 このため、 液溜めに残存する不要成分の特定物質 A 'への混入が抑制され、 分離効率が より一層向上する。
また、 液溜め 1 2 5 aまたは液溜め 1 2 5 bに反応試薬を導入することに より、 回収用流路 1 3 5中に誘導された特定物質 A 'に対し、 酵素反応ゃ検 出用の発色反応等、 種々の反応を施すことが可能となる。
(第五の実施形態）
本実施形態は、 目的成分の分離および濃縮、 乾燥を行い、 また乾燥した試 料を質量分析測定に供する際の質量分析用基板として利用可能な分離装置に 関する。 図 1 2は、 本実施形態に係る分離装置 1 6 5の構成を示す図である 分離装置 1 6 5は、 第三の実施形態に記載の分離装置 1 0 0を基本構成とす る。 分離装置 1 0 0における基板 1 0 1が分離装置 1 6 5における基板 1 3 3に、 流路 1 0 3が第一の流路 1 5 7にそれぞれ対応した構成となっており、 第一の流路 1 5 7に第一の流路 1 5 7より幅狭の第二の流路 1 5 9が連通し ている。 第二の流路 1 5 9の末端に乾燥部 1 6 1が設けられている。 第一の 流路 1 5 7および第二の流路 1 5 9の上面には被覆 1 6 3が設けられており、 試料導入部 1 4 5、 液溜め 1 4 7、 および乾燥部 1 6 1の上面が開口部とな つている。 さらに、 第三の実施形態と同様に、 試料導入部 1 4 5、 液溜め 1 4 7、 第一の流路 1 5 7および乾燥部 1 6 1の表面には金属膜 （不図示） が 設けられており、 これらの間に電圧を付与することができる。
また、 図 1 3は、 分離装置 1 6 5における乾燥部 1 6 1の構成を示す図で ある。 図 1 3 ( a ) が上面図、 図 1 3 ( b ) は図 1 3 ( a ) の D— D '方向 の断面図である。 図 1 3に示されるように、 乾燥部 1 6 1には複数の柱状体 1 6 7が備えられている。 また、 乾燥部 1 6 1の底面には乾燥を促進させる ためのヒータ一 1 6 9が設けられている。 分離装置 1 65の使用方法は以下の通りである。 すなわち、 まず、 特定物 質 A'を含む試料液体を、 試料導入部 145から注入し、 毛細管効果あるい はポンプを用いた圧入などにより第一の流路 1 57に展開させる。 すると、 分離部 1 07において被吸着物質 Aに対する特異的相互作用を有する特定物 質 A'のみが選択的に被吸着物質層 1 0 9に吸着する。 このとき、 試料導入 部 145を正極、 分離部 1 0 7を負極として通電すると、 特定物質 A'の分 離部 1 07への誘導が促進され、 好ましい。 被吸着物質 Aに吸着しなかった 成分は、 溶媒または分散媒である液体とともに液溜め 147に導かれ、 排出 される。
次に、 試料導入部 145から流路 1 0 3洗浄用の緩衝液等を流して洗浄し、 第一の流路 1 57に滞留する特定物質 A'以外の成分を除去する。 このとき、 特定物質 A'と被吸着物質 Aとは特異的相互作用により吸着または結合して いるため、 これらが解離することはない。
その後、 特定物質 A'を第一および第二の実施形態と同様にして、 被吸着 物質 Aから脱着させる。 このとき、 分離部 1 07を正極、 乾燥部 1 6 1を負 極として通電するともに、 乾燥部 1 6 1をヒーター 1 69によりたとえば 3 0°C以上 70°C以下に加熱すると、 解離した特定物質 A'を含む液体が第二 の流路 1 59を経由して乾燥部 1 6 1に導かれ、 乾燥部 1 6 1において速や かに乾燥する。 乾燥部 1 6 1には複数の柱状体 1 67が設けられており、 毛 細管現象により効率よく第二の流路 1 5 9中の液体が導入されるとともに、 すみやかに乾燥が進行する。 またこのとき、 第二の流路 1 5 9は第一の流路 1 57より幅狭となっているため、 第一の流路 1 5 7から第二の流路 1 5 9 へと効率よく液体が導入される。
以上により、 分離部 1 0 7で分離された特定物質 A'が乾燥部 1 6 1で乾 燥され、 回収される。
また、 特定物質 A 'を乾燥部 1 6 1で乾燥させる際に MALD I— TOF MS (Ma t r i x— A s s i s t e d L a s e r D e s o r p t i o n I o n i z a t i o n— T i me o f F l i g h t Ma s s S p e c t r ome t e r :マトリックス支援レーザ一脱離イオン化飛行時間 型質量分析装置） のマトリックスと混合することにより、 MALD I — TO FMS用の試料が得られる。 ここで、 本実施形態で用いる質量分析装置につ いて簡単に説明する。 図 1 1は、 質量分析装置の構成を示す概略図である。 図 1 1において、 試料台上に乾燥試料が設置される。 そして、 真空下で乾燥 試料に波長 3 3 7 nmの窒素ガスレーザーが照射される。 すると、 乾燥試料 はマトリックスとともに蒸発する。 試料台は電極となっており、 電圧を印加 することにより、 気化した試料は真空中を飛行し、 リフレクター検知器、 リ フレクタ一、 およびリニア一検知器を含む検出部において検出される。
したがって、 分離装置 1 6 5中の液体を完全に乾燥させた後、 分離装置 1 6 5を MALD I _ TO FMS装置の真空槽に設置し、 これを試料台として MALD I —TO FMSを行うことが可能である。 ここで、 乾燥部 1 6 1の 表面には金属膜が形成されており、 外部電源に接続可能な構成となっている ため、 試料台として電位を付与することが可能となっている。
このように、 分離装置 1 6 5を用いることにより、 複数の成分を含む試料 中から特定物質 A'のみを分離し、 さらに乾燥して回収することができる。 そして、 乾燥した特定物質 A'を、 分離装置 1 6 5ごと MALD I — TO F MSに供することができる。 したがって、 目的とする成分の抽出、 乾燥、 お よび構造解析を一枚の分離装置 1 6 5上で行うことができるため、 プロテオ —ム解析等にも有用である。
なお、 MALD I — TOFMS用のマトリックスは、 測定対象物質に応じ て適宜選択されるが、 たとえば、 シナピン酸、 α— CHCA ( ーシァノー 4—ヒドロキシ桂皮酸） 、 2， 5 -DHB (2， 5—ジヒドロキシ安息香 酸） 、 2 , 5—DHBおよび DHB s ( 5—メトキシサリチル酸） の混合物、 HABA ( 2— ( 4—ヒドロキシフエニルァゾ） 安息香酸） 、 3— HPA ( 3—ヒドロキシピコリン酸） 、 ジスラノール、 THAP ( 2 , 4， 6—ト リヒドロキシァセトフエノン) 、 I AA (トランス _ 3 _インド一ルァクリ ル酸） 、 ピコリン酸、 ニコチン酸等を用いることができる。 (第六の実施形態）
本実施形態は、 第一の実施形態に記載の分離装置 1 0 0を用いて抗 H i s -T a g (ヒスチジンタグ） 抗体を用いて H i s— T a gを導入した GF P (G r e e n F l u o r e s c e n t P r o t e i n) の精製を rつ方 法に関する。
分離装置 1 0 0において、 抗 H i s -T a g抗体を分離部 1 0 7の表面に 固定化し、 被吸着物質層 1 0 9を形成する。 固定化には、 たとえば第一の実 施例と同様の方法や、 あるいはァフィ二ティークロマトグラフィー用の抗体 の固定化に関する公知の方法を用いる。
具体的には、 たとえば分離部 1 0 7を、 一 NH2基を有するシランカップ リング剤を用いて表面処理する。 次に、 分離部 1 0 7にスぺーサーを結合さ せる。 スぺーサ一として、 たとえば E GD E (エチレングリコ一ルジグリシ ジルエーテル） を用いる。 スぺ一サ一の結合は、 たとえば pH l lの N aO H溶液に大過剰の EGDEを加え、 たとえば 3 0°Cにて攪拌する。 この溶液 を分離部 1 0 7に滴下し、 たとえば 24時間反応させる。 その後、 スぺ一サ —の末端のエポキシ基を用いて、 抗 H i s— T a g抗体を固定化する。 この とき、 抗 H i s— T a g抗体のアルカリ溶液を、 スぺ一サ一の設けられた分 離部 1 0 7に滴下し、 静置する。 そして、 分離部を洗浄すると、 分離部 1 0 7に抗 H i s -T a g抗体が固定化された分離装置 1 0 0が得られる。
得られた分離装置 1 0 0の試料導入部 1 45に、 大腸菌中で発現させた H i s— T a g付加 GF Pを含む抽出物を導入する。 すると、 H i s— T a g を付加された GF Pのみが選択的に抗 H i s—T a g抗体と相互作用し、 被 吸着物質層 1 0 9に吸着される。 流路 1 0 3を洗浄後、 分離部 1 0 7を観察 すると、 GF Pが吸着している領域は緑色の蛍光を発するため、 目視で容易 に確認することができる。
こうして分離された H i s—T a g付加 GF Pを第一の実施形態と同様に して被吸着物質層 1 0 9から脱着させることにより、 液溜め 1 47から H i s— T a g付加 GF Pを回収することができる。 なお、 本実施形態においては、 抗 H i s — T a g抗体を用いたが、 H i s 一 T a g結合性のニッケルカラムと同様にして、 分離部 1 0 7に二トリ口 3 酢酸などを固定化してもよい。 また、 本実施形態の精製方法は、 第二〜第五 の実施形態に記載の分離装置の構成にも適用可能である。
(第七の実施形態）
本実施形態は、 第一の実施形態に記載の分離装置 1 0 0を用いて金属に対 して特異的相互作用を有する物質を分離する方法に関する。
このような分離装置は以下のようにして作製する。 すなわち、 図 1 7 ( c ) の工程に続き、 基板 1 0 1全面にレジスト膜を設け、 分離部 1 0 7と なる領域のみを露出させるレジストパターンを形成する。 このレジストパタ
—ンをマスクとして基板全面に金属膜を形成する。 金属膜の材料は、 たとえ ば P t、 A u等水中で安定しうる物質とする。 また金属膜の形成は、 たとえ ば蒸着等により行う。 そして、 シリコン熱酸化膜 1 8 7を溶解せずレジスト マスクを溶解する剥離液を用いてレジストを除去すれば、 分離部 1 0 7表面 に金属膜が形成される。
得られた分離装置 1 0 0に金属結合性物質を含む試料を導入することによ り、 金属結合性物質を効率よく分離することができる。
なお、 水溶液中で不安定な金属、 たとえば F e、 C u、 A g、 A l 、 N i ， U、 G e等に対して特異的相互作用する物質を分離したい塲合には、 これら のイオンをキレートするキレート剤やキレ一トタンパク質、 クラウンェ一テ ルを用い、 これらにキレートさせた状態で分離部 1 0 7の表面に固定化する 態様とすることができる。 このときの固定化は、 第一の実施形態と同様にし て行うことができる。 また、 本実施形態の分離方法は、 第二〜第五の実施形 態に記載の分離装置の構成にも適用可能である。
(第八の実施形態）
本実施形態は、 第一の実施形態に記載の分離装置 1 0 0において、 レクチ ンを被吸着物質 Aとして用い、 試料中の特定の糖鎖を分離する方法に関する レクチンとして、 たとえば C o n A (コンカナパリン A ) を用いる。 レクチ ンは、 単糖ではマンノ一スおよびグルコースに特異的なレクチンであり、 ま た、 高マンノース型の糖鎖を有する糖タンパク質や、 多糖類に対する親和性 を有する。
分離装置 1 00において、 C o nAを分離部 1 07の表面に固定化し、 被 吸着物質層 1 09を形成する。 固定化には、 たとえば第一の実施例と同様の 方法や、 あるいはァフィ二ティークロマトグラフィー用の固定化レクチンに 関する公知の作製方法を用いる。
具体的には、 たとえば分離部 1 07を、 _NH2基を有するシランカップ リング剤を用いて表面処理する。 次に、 分離部 1 0 7にスぺーサーを結合さ せる。 スぺーサ一として、 たとえば E GD E (エチレングリコールジグリシ ジルエーテル） を用いる。 スぺ一サ一の結合は、 たとえば pH l lの N aO H溶液に大過剰の EGDEを加え、 たとえば 30°Cにて攪拌する。 この溶液 を分離部 1 0 7に滴下し、 たとえば 24時間反応させる。 その後、 スぺ一サ 一の末端のエポキシ基を用いて、 レクチンを固定化する。 このとき、 たとえ ば— SH基、 — OH基、 _NH2を含むレクチンのアルカリ溶液を、 スぺー サ一の設けられた分離部 107に滴下する。
得られた分離装置 1 00を用いることにより、 高マンノース型の糖鎖を有 する糖タンパク質または多糖類の有無を簡便に高精度、 高感度で分離し、 回 収することが可能である。 分離装置 1 00の分離部 1 0 7には、 レクチンと 基板 1 0 1表面との間にスぺ一サ一が設けられているため、 レクチンと糖鎖 との特異的相互作用が容易になる。 したがって、 より効率よく分離を行うこ とができる。 なお、 本実施形態の分離方法は、 第二〜第五の実施形態に記載 の分離装置の構成にも適用可能である。
以上、 本発明を実施形態に基づき説明した。 これらの実施形態は例示であ り、 各構成要素や各製造工程の組合せにいろいろな変形例が可能なこと、 ま たそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところで ある。
たとえば、 本実施形態に係る分離装置を次のように構成することもできる 図 1 8は、 毛細管現象を利用して試料を移動させる方式の分離装置の構成を 示す図である。 毛細管現象を利用することにより、 電力、 圧力等の外力の印 加が不要で駆動のためのエネルギーが不要となる。 図 1 8において、 基板 5 5 0に設けられた分離用流路 5 4 0には、 第一の実施形態に記載の分離部 (不図示） が形成されている。 分離用流路 5 4 0の一端には空気穴 5 6 0が 設けられ、 他端には分離時にバッファーを注入するためのバッファー注入口 5 1 0が設けられている。 分離用流路 5 4 0は、 バッファー注入口 5 1 0、 空気穴 5 6 0以外の部分では密閉されている。 分離用流路 5 4 0の起始部に は、 サンプル定量管 5 3 0がつながっており、 サンプル定量管 5 3 0の他方 の端は、 サンプル注入口 5 2 0が設けられている。
図 2 0は、 サンプル定量管 5 3 0の近傍を拡大して示したものである。 サ ンプル定量管 5 3 0内部、 サンプル保持部 5 0 3、 およびバッファ一導入部 5 0 4には、 親水性の吸収領域が設けられる。 また分離用流路 5 4 0への導 入口付近にも吸収領域 5 0 6が設けられる。 サンプル定量管 5 3 0とサンプ ル保持部 5 0 3との間には、 一時停止スリット 5 0 2が設けられている。 一 時停止スリット 5 0 2は疎水性領域とすることができる。 各吸収領域の間は、 一時停止スリット 5 0 5および 5 0 7で隔てられている。 サンプル保持部 5 0 3の空隙体積は、 サンプル定量管 5 3 0の空隙体積と一時停止スリット 5 0 2の体積の和にほぼ等しい。 一時停止スリツト 5 0 5の幅は、 一時停止ス リット 5 0 2の幅よりも狭い。 ここで、 サンプル定量管 5 3 0は、 親水性の 機能を有し、 試料の導入部としての機能が果たせるように構成される。
次に、 図 1 8の装置を用いた分離操作の手順について説明する。 まず、 サ ンプル注入口 5 2 0にサンプルを徐々に注入しサンプル定量管 5 3 0を満た す。 この時、 水面が盛り上がらないようにする。 サンプル定量管 5 3 0がサ ンプルで満たされた後、 サンプルは一時停止スリット 5 0 2に徐々にしみ出 してゆく。 一時停止スリット 5 0 2にしみだしたサンプルが、 サンプル保持 部 5 0 3の表面に到達すると、 一時停止スリツト 5 0 2およびサンプル定量 管 5 3 0の内部のサンプルは、 さらに毛細管効果の大きい、 サンプル保持部 5 0 3へとすべて吸い取られる。 ここで、 各吸収領域は、 親水性材料の選択 により、 親水性の度合いが異なるように形成され、 サンプル保持部 5 0 3は、 サンプル定量管 5 3 0よりも大きい毛細管効果を有する。 サンプル保持部 5 0 3へのサンプル充填の間は、 一時停止スリット 5 0 5、 5 0 7が存在する ため、 サンプルがバッファー導入部 5 0 4に流れ込むことは無い。
サンプル保持部 5 0 3にサンプルが導入された後、 バッファー注入口 5 1 0に分離用バッファーを注入する。 注入されたバッファ一は、 バッファー導 入部 5 0 4に一時的に充填されて、 サンプル保持部 5 0 3との界面が直線状 になる。 さらにバッファ一が充填されると、 一時停止スリット 5 0 5にしみ だして、 サンプル保持部 5 0 3に流入し、 さらに、 サンプルをひきずりなが ら、 一時停止スリット 5 0 7を超えて分離用流路の方向へと進行する。 この 際、 一時停止スリット 5 0 2の幅が、 一時停止スリット 5 0 5、 5 0 7の幅 よりも大きいため、 一時停止スリット 5 0 2へバッファーが逆流しても、 サ ンプルは既に、 サンプル保持部 5 0 3より先に進行しているため、 サンプル の逆流はほとんどない。
分離用バッファ一は毛細管現象で、 分離用流路を空気穴 5 6 0へ向けてさ らに進行し、 この過程で、 サンプルが分離される。 分離用バッファーが、 空 気穴 5 6 0に到達すると、 バッファーの流入が停止する。 バッファーの流入 が停止した段階、 もしくは、 バッファ一が進行中の段階で、 サンプルの分離 状態を計測する。
上記実施形態は、 毛細管現象を用いた分離装置の例であるが、 この原理を 利用した試料注入の他の例について図 1 9および図 2 1を参照して説明する c この装置では、 図 1 8におけるサンプル定量管 5 3 0に代えて、 サンプル投 入管 5 7 0が設けられている。 サンプル投入管 5 7 0の両端には、 サンプル 注入口 5 2 0と、 排出口 5 8 0が設けられている。
この装置を用いた分離手順について説明する。 まず、 サンプルを、 サンプ ル注入口 5 2 0に投入し、 排出口 5 8 0まで満たす。 この間に、 サンプルは, 投入穴 5 0 9を介してサンプル保持部 5 0 3に吸収される。 しかる後に、 サンプル注入口 5 2 0に空気を圧入して、 サンプルを排出口 5 8 0から排出することによりサンプル投入管 5 7 0の内部のサンプルを払 拭、 乾燥する。 毛細管現象による分離の場合は、 上記と同様に、 分離用バッ ファーを注入する。 電気泳動による分離の場合は、 サンプルの投入以前に、 バッファー注入口 5 1 0に相当する液溜め、 空気穴 5 6 0に相当する液溜め から泳動用バッファ一を導入しておく。 広く作られた一時停止スリット 5 0 5、 5 0 7が存在するため、 サンプル保持部には、 流入しない。
サンプル保持部 5 0 3へのサンプルの保持が終わった段階で、 さらに微量 の泳動用バッファ一を分離用流路の一端の液溜めに加えるか、 サンプル保持 部 5 0 3の周辺に軽く振動を与えることで、 泳動バッファ一を連続させ、 電 圧を印加して分離する。
なお、 図 2 2は本実施形態の分離装置を含む質量分析システムのブロック 図である。 このシステムは、 図 2 2 ( a ) に示すように、 試料 1 0 0 1につ いて、 夾雑物をある程度除去する精製 1 0 0 2、 不要成分 1 0 0 4を除去す る分離 1 0 0 3、 分離した試料の前処理 1 0 0 5,、 前処理後の試料の乾燥 1 0 0 6、 質量分析による同定 1 0 0 7、 の各ステップを実行する手段を備え ている。
ここで、 以上の実施形態で説明した分離装置による分離は、 分離 1 0 0 3 のステップに対応しており、 マイクロチップ 1 0 0 8上で行われる。 また、 精製 1 0 0 2のステップにはたとえば血球等の巨大成分のみを除去するため の分離装置等を用いる。 前処理 1 0 0 5では、 上述のトリプシン等を用いた 低分子化、 マトリックスとの混合等を行う。 乾燥 1 0 0 6では、 前処理の施 された試料を乾燥し、 質量分析用乾燥試料を得る。
また、 本実施形態に係る分離装置は流路を有しているため、 図 2 2 ( b ) に示すように、 精製 1 0 0 2から乾燥 1 0 0 6までのステップを一枚のマイ クロチップ 1 0 0 8上で行うこともできる。 試料をマイクロチップ 1 0 0 8 上で連続的に処理することにより、 微量の成分についても損出が少ない方法 で効率よく確実に同定を行うことが可能となる。 このように、 図 2 2に示される試料の処理のうち、 適宜選択したステップ またはすベてのステップをマイクロチップ 1 00 8上にて行うことが可能と なる。
(実施例）
以下、 本発明を DN Aと RN Aの組み合わせを例にした実施例により説明 するが、 本発明はこれに限定されるものではない。
第一の実施の形態で説明した方法で流路 1 03の表面に柱状体 1 0 5が形 成された反応装置 1 00 (図 1) を製造する。 基板 1 0 1は、 （1 00) 面 を主面とするシリコン基板により構成する。 分離部 1 07に、 柱状体 1 0 5 (図 2) を設ける。 柱状体 1 0 5は、 図 1 5〜図 1 7を用いて説明した方法 で形成する。 ここでは、 柱状体 1 05の間隔 pが約 200 nmとなるように する。
次に、 柱状体 1 0 5であるシリコンピラーの表面に、 カップリング剤を用 いて線虫 （C. エレガンス ： C a e n o r h a b d i t i s e 1 e g a n s ) の t p a _ 1遺伝子の一部に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド A をシリコンピラー表面に固定する。
A： 5 ' 一 SH— TCGATTTTCAAACCGTTTCC - 3 ' (配 列番号 1 )
ここで、 アンチセンスオリゴヌクレオチド Aは 5 ' 末端が SH基により修 飾されている。
具体的には、 図 1において分離部 1 07の表面に、 アンチセンスオリゴヌ クレオチド Aのチオール基と結合する化合物として、 ァミノシランの一種で ある N— (2一アミノエチル) — 3—ァミノプロピルトリメトキシシラン (EDA) を固定する。
このとき、 分離部 1 0 7を 1 ： 1の濃 HC 1 ： CH3〇Hに約 30分間浸 し、 蒸留水で洗浄した後、 濃 H2S〇4に約 30分間浸する。 そして、 蒸留水 で洗浄した後、 脱イオン水中で数分間煮沸させる。 つづいて、 1 %EDA (ImM酢酸水溶液中） 等のアミノシランを分離部 1 0 7に導入し、 室温で 約 2 0分間反応させる。 これにより、 分離部 1 0 7の表面に EDAが固定さ れる。 その後、 蒸留水で残さを洗浄し、 不活性ガス雰囲気下にて約 1 2 0°C で 3〜4分加熱して乾燥させる。
つづいて、 二官能性のクロスリンカ一として、 ImMのスクシンィミジル 4 - (マレイミドフエ二ル） プチレート （SMP B) 溶液を準備し、 少量の DMS Oに溶解させた後、 希釈する。 分離部 1 0 7をこの希釈溶液に室温で 2時間浸し、 希釈溶媒で洗浄した後不活性ガス雰囲気下で乾燥する。
これにより、 SMPBのエステル基が EDAのァミノ基と反応し、 分離部 1 0 7表面にマレイミドが露出した状態となる。 このような状態で、 分離部 1 0 7に、 チオール基が付いたアンチセンスオリゴヌクレオチド Aを導入す る。 こうすると、 アンチセンスオリゴヌクレオチド Aのチオール基と分離部 1 0 7の表面のマレイミドとが反応し、 アンチセンスオリゴヌクレオチド A が分離部 1 0 7の表面に固定される （たとえば C h r i s e yら、 Nu c l e i c Ac i d s R e s e a r c h、 1 9 9 6年、 Vo l . 24、 No. 1 5, 3 0 3 1頁〜 3 0 3 9頁） 。 これにより、 流路 1 0 3および柱状体 1 0 5の表面に、 アンチセンスオリゴヌクレオチド Aを固定することができる £ 以上の手順により、 分離装置 1 0 0が得られる。 得られた分離装置 1 0 0 を用いて、 RNAの分離を行う。
線虫から抽出した RNAをハイブリダィゼーシヨン溶液 （R a p i d h y b r i d i z a t i o n b u f f e r 、 Am e r s h a m社製) と混合 する。
試料導入部 1 4 5よりサンプルを導入し、 調湿箱内で、 7 0°Cで 2時間反 応した後、 2 X S S C (標準食塩クェン酸緩衝液） 、 0. 1 %SD S (ドデ シル硫酸ナトリウム） で室温 1 5分、 続いて 0. 2 X S S C、 0. 1 % S D Sで 6 5t 1 5分の洗浄を行う。 次に DE P C (D i e t h y l p r o c a r b o n a t e) 処理水を試料導入部 1 4 5より導入し、 液溜め 14 7に押 し出された液の除去と液溜め 1 47の洗浄を行う。 そして、 8 0°Cで変性を 行い、 急冷により分離部 1 0 7に固定化された DNAと RNAを分けた後、 溶液部分を液溜め 147に回収すると、 t p a— 1遺伝子由来の RN Aを高 率に含有する溶液が得られる。
このように本実施例によれば、 RNA混合物から特定の配列を持つ RNA を良好に分離することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 基材と、 該基材に設けられた試料が流れる流路と、 該流路に設けられ， 前記試料中の特定物質を分離する分離部と、 該分離部に設けられ、 前記流路 よりも幅狭の微細流路と、 を含み、 前記分離部に前記特定物質と選択的に吸 着または結合する被吸着物質の層が形成されていることを特徴とする分離装
2 . 基材と、 該基材に設けられた試料が流れる流路と、 該流路に設けられ、 前記試料中の特定物質を分離する分離部と、 該分離部に設けられた突起部と、 を含み、 前記分離部に前記特定物質と選択的に吸着または結合する被吸着物 質の層が形成されていることを特徴とする分離装置。
3 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載の分離装置において、 前記分離 部および前記流路に電極が設けられ、 前記電極間に電圧を付与する電圧付与 手段をさらに備えることを特徴とする分離装置。
4 . 請求の範囲第 1項乃至第 3項いずれかに記載の分離装置において、 前 記分離部に突起部が設けられ、 該突起部に電極が形成されていることを特徴 とする分離装置。
5 . 請求の範囲第 1項乃至第 4項いずれかに記載の分離装置において、 前 記特定物質と前記被吸着物質との組み合わせが、 抗原と抗体、 酵素と基質、 酵素と基質誘導体、 酵素と阻害剤、 糖とレクチン、 D N Aと D N A、 D N A と R N A、 タンパク質と核酸、 金属とタンパク質またはリガンドとレセプ夕 一、 のいずれかの組み合わせであることを特徴とする分離装置。
6 . 請求の範囲第 1項乃至第 5項いずれかに記載の分離装置において、 前 記被吸着物質がスぺーサーを介して前記基材の表面に備えられたことを特徴 とする分離装置。
7 . 基材に設けられた流路と、 該流路に設けられた分離部と、 該分離部に 設けられ、 前記流路よりも幅狭の微細流路と、 を含む分離装置の分離部に、 分離対象物質に選択的に吸着または結合する被吸着物質と異なる符号の電圧 を印加しながら、
前記流路に前記被吸着物質を含む液体を導入し、 前記分離部に吸着させる ステップと、
前記流路に前記分離対象物質を含む試料を導入し、 前記被吸着物質に選択 的に吸着または結合させるステップと、
前記流路に前記分離対象物質を前記被吸着物質から脱離させる脱離液を導 入し、 前記分離対象物質を脱離させ、 回収するステップと、
を行うことを特徴とする分離方法。
8 . 基材に設けられた流路と、 該流路に設けられた分離部と、 該分離部に 設けられた突起部と、 を含む分離装置の分離部に、 分離対象物質に選択的に 吸着または結合する被吸着物質と異なる符号の電圧を印加しながら、 前記流路に前記被吸着物質を含む液体を導入し、 前記分離部に吸着させる ステップと、
前記流路に前記分離対象物質を含む試料を導入し、 前記被吸着物質に選択 的に吸着または結合させるステップと、
前記流路に前記分離対象物質を前記被吸着物質から脱離させる脱離液を導 入し、 前記分離対象物質を脱離させ、 回収するステップと、
を行うことを特徴とする分離方法。
9 . 生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離手段と、 前記分離手段により分離された試料に対し、 酵素消化処理を含む前処理を 行う前処理手段と、
前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、
乾燥後の試料を質量分析する質量分析手段と、
を備え、
前記分離手段は、 請求の範囲第 1項乃至第 6項いずれかに記載の分離装置 を含むことを特徴とする質量分析システム。
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