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WO1995030166A1 - Verfahren zur lumineszenz-rastermikroskopie und ein lumineszenzrastermikroskop - Google Patents

Verfahren zur lumineszenz-rastermikroskopie und ein lumineszenzrastermikroskop Download PDF

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WO1995030166A1
WO1995030166A1 PCT/DE1995/000566 DE9500566W WO9530166A1 WO 1995030166 A1 WO1995030166 A1 WO 1995030166A1 DE 9500566 W DE9500566 W DE 9500566W WO 9530166 A1 WO9530166 A1 WO 9530166A1
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laser
luminescence
luminescent
scanning microscope
light emitted
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PCT/DE1995/000566
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Inventor
Pekka Hänninen
Stefan Hell
Original Assignee
Haenninen Pekka
Stefan Hell
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

Definitions

  • the invention relates to a method for luminescence scanning microscopy according to the preamble of the main claim and a luminescence scanning microscope for performing this method.
  • REPLACEMENT LEAF luminescent, especially fluorescent dye The dye in the object is excited by the joint action of two photons and the light emitted by the dye is registered and evaluated by means of a detector. In order to capture the entire sample, the laser beam is scanned over the object. The values of all points of the object are registered, which enables a three-dimensional representation of the evaluation results.
  • the two-photon excitation in connection with the scanning leads to a direct three-dimensional image of the object.
  • laser pulses are used, the duration of which is in the sub-pico second range. Lasers that generate such extremely short pulses are very expensive.
  • biological objects are often destroyed by the pulses of high power. Excitation of the object with laser pulses in the sub-pico-second range often leads to the luminescence signal "breaking down". This "collapse” can be clearly illustrated as a "micro-explosion” that destroys the object material.
  • the object of the invention is to develop a generic method in such a way that the disadvantages mentioned above do not occur.
  • Measuring times are usually applied, the sensitivity of the detector used being adapted to the measuring conditions. It has been found that if the
  • lasers with continuous or pulsed radiation can be used as the light source for carrying out the measuring method according to the invention. These are not expensive.
  • Conventional semiconductor or gas lasers can be used. HeNe lasers and krypton ion lasers are particularly suitable as gas lasers.
  • the laser arrangement can also be designed in the form of an array. The use of two or three lasers for irradiating the same object point has proven to be particularly advantageous.
  • a detector with a high signal-to-noise ratio is used to record and evaluate the luminescent light. It is particularly important that the detector used has a correspondingly high sensitivity and a has low self-noise.
  • the array-like arrangement of the lasers and detectors and the resulting irradiation and measurement of several raster points makes it possible to shorten the duration of the method.
  • a beam screening device is arranged upstream of the object, the beam being scanned over the object.
  • Filters are also provided in the luminescence scanning microscope according to the invention for separating the light emitted by the sample from the laser light.
  • a detector can also be used, which filters out the corresponding wavelength.
  • FIG. 1 A schematic representation of a luminescence scanning microscope for carrying out the method according to the invention is shown in FIG. 1.
  • the luminescence scanning microscope has a laser 1 for generating the laser light, a photo detector 2 for evaluating the measurement results and a lens 3 for focusing the laser beam 4 emitted by the laser light source 1 onto the object 5 to be examined.
  • the laser beam 4 is controlled with a beam raster device 6 for scanning the object 5.
  • the luminescence scanning microscope has filters 7 and 8 for separating the laser light 4 from the luminescent light.
  • the laser light source 1 is designed as a conventional laser with continuous or pulsed radiation.
  • the laser light source 1 can also be formed by an array-like arrangement of lasers.

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  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie mit Zwei-Photonen Anregung, insbesondere zur Untersuchung von biologischen Objekten (5) beschrieben. Dabei regt ein Laserimpuls lumineszierende, insbesondere fluoreszierende Moleküle an, das vom Objekt (5) ausgesandte Lumineszenzlicht wird gemessen und ausgewertet. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung der im Objekt (5) vorhandenen lumineszierenden Moleküle durch Laserimpulse erfolgt ist, deren Dauer größer ist als 10-12 Sekunden. Ein Lumineszenz-Rastermikroskop zur Durchführung des Verfahrens weist einen Detektor (2), ein Filter (7, 8) zum Separieren des von der Probe emittierten Lichts von dem Laserlicht (4) und eine Laserlichtquelle auf, wobei als Laserlichtquelle ein Laser (1) mit gepulster oder kontinuierlicher Strahlung dient.

Description

Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie und ein Lumineszenzrastermikroskop
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lumineszenz-Raster¬ mikroskopie gemäß dem Oberbegriff des Hauptanspruches und ein Lumineszenz-Rastermikroskop zur Durchführung dieses Verfahrens.
Ein derartiges Verfahren ist aus der US PS 5034613 bekannt. Bei dem beschriebenen Verfahren handelt es sich um ein Verfahren mit Zwei-Photonenanregung. Ein zu untersuchendes Objekt, vorzugsweise ein biologisches Objekt wird mit einem
ERSATZBLATT lumineszierenden, insbesondere fluoreszierenden Farbstoff versehen. Der im Objekt befindliche Farbstoff wird durch die gemeinsame Wirkung von zwei Photonen angeregt und das vom Farbstoff emittierte Licht mittels eines Detektors registriert und ausgewertet. Um die gesamte Probe zu erfassen, wird der Laserstrahl über das Objekt gerastert. Die Werte von allen Punkten des Objektes werden registriert, wodurch eine dreidimensionale Darstellung der Auswerteergebnisse möglich ist. Die Zwei-Photonenanregung in Verbindung mit dem Rastern führt zu einer direkten dreidimensionalen Abbildung des Objektes. Um die Wahrscheinlichkeit der Zwei-Photonenanregung zu erhöhen, werden Laserimpulse verwendet, deren Dauer im Sub- Piko Sekundenbereich liegt. Laser, die solche extrem kurze Impulse erzeugen, sind sehr teuer. Darüber hinaus werden bio¬ logische Objekte durch die Impulse hoher Leistung oft zerstört. Eine Anregung des Objektes mit Laserimpulsen im Sub- Pico-Sekundenbereich führt oft dazu, daß das Lumineszenzsignal "zusammenbricht". Dieses "Zusammenbrechen" kann anschaulich als eine "Mikro-Explosion" dargestellt werden, die das Objektmaterial zerstört.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein gattungsgemäßes Verfahren so weiterzubilden, daß die oben genannten Nachteile nicht auftre¬ ten.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen 1 - 3 angegebe¬ nen Merkmale gelöst. Es wurde überraschend gefunden, daß eine Messung von Zwei-Photonen Lumineszenz mit Laserimpulsen von längerer Dauer oder sogar mit kontinuierlichem Licht möglich ist und zu guten Meßergebnissen führt. Durch die Anregung mit Laserimpulsen, deren Dauer größer ist als 10" Sekunden oder durch die Anregung mit kontinuierlichem Licht sind die Leistungsspitzen im Anregungslicht soweit reduziert, daß eine Zerstörung des Objektes nicht auftritt. Ein sehr vorteilhafter Bereich der Impulsdauer liegt im Picosekunden-Bereich. Da die verwendeten Laserimpulse eine niedrigere Leistung aufweisen, als die Leistung im Sub-Picosekundenbereich, sind längere
Meßzeiten in der Regel angebracht, wobei die Empfindlichkeit des verwendeten Detektors den Meßbedingungen angepaßt wird. Es hat sich herausgestellt, daß wenn als Auswertungsverfahren das
Verfahren des Photonenzählens (Photon Counting) eingesetzt wird, dieses zu sehr guten Messergebnissen führt. Besonders vorteilhaft ist es, wenn als Detektor eine Avalanche-Photo- diode eingesetzt wird. Sogar mit kontinuierlichem Laserlicht mittlerer Leistung ist die Aufnahme und Auswertung der
Meßergebnisse möglich Bei einer entsprechend verlängerten
Zeitdauer der Messung und der Wahl eines Detektors mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis sind die Ergebnisse mit denen des Verfahrens unter Verwendung von Laserimpulsen im Sub-Piko- sekundenbereich vergleichbar.
Von besonderem Vorteil ist es, daß zur Durchführung des erfindungsgemäßen Meßverfahrens als Lichtquelle handelsübliche Laser mit kontinuierlicher oder gepulster Strahlung eingesetzt werden können. Diese sind nicht teuer. Es können übliche Halb¬ leiter- oder Gaslaser eingesetzt werden. Als Gaslaser eignen sich insbesondere HeNe-Laser und Krypton-Ion Laser. Die Laseranordnung kann auch arrayförmig ausgebildet sein. Die Be¬ nutzung von zwei oder drei Lasern zur Bestrahlung des gleichen Objektpunktes hat sich als besonders vorteilhaft herausge¬ stellt.
Wie oben bereits ausgeführt, ist es wesentlich, daß zur Aufnahme und Auswertung des lumineszierenden Lichtes ein Detektor mit einem hohen Siganl-Rausch-Verhältnis eingesetzt wird. Von besonderer Bedeutung ist dabei, daß der eingesetzte Detektor eine entsprechend hohe Empfindlichkeit und ein kleines Eigenrauschen aufweist. Durch die arrayformige Anord¬ nung der Laser und Detektoren und die dadurch gegebene Be¬ strahlung und Messung von mehreren Rasterpunkten, ist die Möglichkeit gegeben, die Dauer des Verfahrens zu verkürzen.
Vorteilhaft ist, wenn dem Objekt eine Strahlrastereinrichtung vorgeordnet ist, wobei der Strahl über das Objekt gerastert wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Luminesenz-Rastermikroskop sind weiterhin Filter vorgesehen zum Seperieren des von der Probe emmitierten Lichtes von dem Laserlicht. Anstatt eines Filters kann auch ein Detektor eingesetzt werden, der die entsprechende Wellenlänge herausfiltert.
Eine schematische Darstellung eines Lumineszenz-Rastermikro- skopes zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Figur 1 wiedergegeben.
Das Luminesenz-Rastermikroskop weist einen Laser 1 zur Erzeugung des Laserlichtes, einen Fotodedektor 2 zur Auswerung der Meßergebnisse und ein Objektiv 3 zur Fokussierung des von der Laserlichtquelle 1 ausgesandten Laserstrahles 4 auf das zu untersuchende Objekt 5 auf. Der Laserstrahl 4 wird mit einer Strahlrastereinrichtung 6 zum Abrastern des Objektes 5 gesteuert. Ferner weist das Lumineszenz-Rastermikroskop Filter 7 und 8 zum Separieren des Laserlichtes 4 vom Lumineszlicht auf. Gemäß der Erfindung ist die Laserlichtquelle 1 als ein herkömmlicher Laser mit kontinuierlicher oder gepulster Strahlung ausgebildet. Die Laserlichtquelle 1 kann auch durch eine arryformige Anordnung von Lasern gebildet sein. Das gleiche trifft für den Fotodedektor 2 zu. Dieser kann entweder punkt-oder arrayformig ausgebildet sein. Im Falle einer arrayformigen Anbordnung der Laser 1 und Detektoren 2 sind diese sowie der abzubildende Probenbereich in jeweils zueinan¬ der optisch konjugierten Ebenen zur gleichzeitigen Aufnahme von mehreren Ras terpunkten angeordnet.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie mit Zwei-Pho¬ tonen Anregung, insbesondere zur Untersuchung von biologischen Objekten, wobei ein Laserimpuls lumineszie- rende, insbesondere fluoreszierende Molelüle angeregt und das vom Objekt ausgesandte Lumineszenzlicht gemessen und ausgewertet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung der im Objekt (5) vorhandenen luminesziernden Moleküle durch Laserimpulse erfolgt, deren Dauer größer ist als 10"12 Sekunden.
Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie mit Zwei-Pho- toen Anregung, insbesondere zur Untersuchung von biologischen Objekten, wobei ein LaserImpuls lumineszie- rende, insbesondere fluoresziernede Moleküle anregt und das vom Objekt ausgesandte Lumineszenzlicht gemessen und ausgewertet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung der im Objekt (5) vorhandenen lumineszierenden Moleküle durch Laserimpulse erfolgt, deren Dauer 10" Se¬ kunden, ist.
Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie mit Zwei-Pho- tonen Anregung, insbesondere zur Untersuchung von biologischen Objekten, wobei Laserlicht lumineszierende, insbesondere fluoreszierende Moleküle anregt und das vom Objekt ausgesandte Lumineszenzlicht gemessen und ausge¬ wertet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung der im Objekt vorhandenen lumineszierenden Moleküle durch kontinuierliches Laserlicht erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch ge¬ kennzeichnet, daß das Auswerten des vom Objekt (5) ausgesandten Lumineszenzlichtes im Verfahren des Photonenzählens erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch ge¬ kennzeichnet, daß mehrere Rasterpunkte des Objektes (5) gleichzeitig angeregt werden und das von diesen Raster¬ punkten ausgesandte Lumineszenzlicht gleichzeitig gemes¬ sen wird.
Lumineszenz-Rastermikroskop zur Durchführung des Verfah¬ rens nach einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 5 mit minde¬ stens einer Laserlichtquelle, mindestens einem Detektor, mindestens einem Filter zum Separieren des von der Probe emittierten Lichts von dem Laserlicht, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß als Laserlichtquelle ein Laser (1) mit ge¬ pulster Strahlung dient.
Lumineszenz-Rastermikroskop zur Durchführung des Verfah¬ rens nach einem der Ansprüche 3 bis 5 mit mindestens ei¬ ner Laserlichtquelle, mindestens einem Detektor, mindestens einem Filter zum Separieren des von der Probe emittierten Lichts von dem Laserlicht, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß als Laserlichtquelle ein Laser (1) mit kon¬ tinuierlicher Strahlung dient. Lumineszenz-Rastermikroskop nach Anspruch 6 oder 7 da¬ durch gekennzeichnet, daß der Laser ein Halbleiterlaser ist.
Lumineszenz-Rastermikroskop nach Anspruch 6 oder 7 da¬ durch gekennzeichnet, daß der Laser ein Gas-Laser ist.
Lumineszenz-Rastermikroskop nach Anspruch 9 dadurch ge¬ kennzeichnet, daß der Laser ein HeNe-Laser oder ein Kryp- ton-Ion-Laser ist.
Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 10 dadurch gekennzeichnet daß ein Detektor (2) mit ein hohen Signal-Rauschverhältnis eingesetzt wird.
Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 11 dadurch gekennzeichnet, daß eiene
Strahlrastereinrichtung ( 6 ) zum gesteuerten Abrastern des Objektes (5) vorgesehen ist.
Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß ein Array aus Laser ( 1 ) als Lichtquelle dient und ein Array aus Detektoren (2), die in einer optisch konjugierten Ebene zur Fokal¬ ebene des Objektes (5) angeordnet sind, verwendet wird.
Lumineszenz-Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 13 dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (2) eine Avalanche-Photodiode ist.
PCT/DE1995/000566 1994-04-28 1995-04-27 Verfahren zur lumineszenz-rastermikroskopie und ein lumineszenzrastermikroskop WO1995030166A1 (de)

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