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WO1994012518A2 - Reagenz zur kupplung veschiedener substanzen an nukleinsäuren sowie verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Reagenz zur kupplung veschiedener substanzen an nukleinsäuren sowie verfahren zu dessen herstellung Download PDF

Info

Publication number
WO1994012518A2
WO1994012518A2 PCT/DE1993/001101 DE9301101W WO9412518A2 WO 1994012518 A2 WO1994012518 A2 WO 1994012518A2 DE 9301101 W DE9301101 W DE 9301101W WO 9412518 A2 WO9412518 A2 WO 9412518A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ribooligonucleotide
rna
reagent
nucleic acids
molecule
Prior art date
Application number
PCT/DE1993/001101
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO1994012518A3 (de
Inventor
Gabor Igloi
Original Assignee
Gabor Igloi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gabor Igloi filed Critical Gabor Igloi
Publication of WO1994012518A2 publication Critical patent/WO1994012518A2/de
Publication of WO1994012518A3 publication Critical patent/WO1994012518A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a modified ribooligonucleotide, that is to say a reagent for coupling at least one molecule to nucleic acids, in particular ribonucleic acids (RNA), a method for its production, its use and a reagent kit based on this modified ribooligonucleotide.
  • This coupling reagent is a specifically modified ribooligonucleotide, which in principle consists of any number, but at least one ribonucleotide.
  • this coupling reagent it is possible to use a variety of labels, in particular fluorescent labels, but also digoxigenin or biotin derivatives, or else other molecules, such as e.g. B. to couple proteins to nucleic acids, especially ribonucleic acids (RNA).
  • nucleic acids The coupling of a wide variety of molecules to nucleic acids is a widely used method in molecular biology. Such methods are particularly important for labeling nucleic acids. They are used for protein-nucleic acid interaction studies, nucleic acid structure studies, for DNA and RNA sequencing or, for medical diagnostics of enormous importance, in hybridization methods, especially in-situ hybridization methods. Labeling has so far been carried out mainly on a radioactive basis with the aid of isotope-substituted nucleotides and corresponding enzymes. However, since radioactively labeled substances are quite expensive, handling them is not safe and the disposal of radioactive waste is problematic for ecological reasons, efforts have been made for some time to use alternative (i.e. non-radioactive) labeling options.
  • RNA RNA molecule that is extended by one nucleotide and bears a radioactive label at the 3 "terminus. This method only allows the radioactive labeling of RNA.
  • the object of the present invention is to develop a special ribooligonucleotide, i.e. H. to provide a reagent for coupling at least one molecule, more generally considered different substances, in particular a fluorescent marker, a biotin derivative, a digoxigenin derivative or a protein to nucleic acids, in particular ribonucleic acids (RNA), which avoids the disadvantages mentioned, i.e. its use on enzymatic Implementations is based and therefore has a high specificity that is easy to carry out and that allows many different substances to be coupled to nucleic acids. Furthermore, it is the object of the present invention to provide specific possible uses for the modified ribooligonucleotide, as well as a reagent kit based on this ribooligonucleotide.
  • a special ribooligonucleotide i.e. H. to provide a reagent for coupling at least one molecule, more generally considered different substances, in particular a fluorescent marker,
  • Nucleic acid is coupled, is preferably a fluorescent marker, for example a fluorescein derivative, but can also be a digoxigenin or biotin derivative or a protein, for example. Regardless of the nature of this molecule R 3 , it is referred to below as a marker for the sake of simplicity.
  • a radioactive isotope is also possible, in contrast to the pCp conventionally used for radioactive labeling with the Coupling reagent according to the invention also "exotic" isotopes, such as 125 J can be introduced.
  • the coupling reagent according to the invention consists of a ribooligonucleotide of any length in which a reactive group, in particular an amino group, is bonded directly or via a spacer group to one or more 3 ′′ phosphate groups.
  • a sulfhydryl group can also be used as a reactive group "However, it is more sensitive and does not react with as many substituents as an amino group.
  • Ri is a phosphate group
  • R 2 is a nucleobase, especially cytidine
  • R 3 is the molecule to be coupled
  • a coupling reagent which also functions according to the invention is likewise obtained, but the conversion rates of the coupling reaction are up to 50% lower than when using cytidine.
  • the ribooligonucleotide can be extended on its 3 "phosphate group with further nucleotides, which can also be substituted.
  • the alkyl chain used as spacer contains no phosphate group and therefore also no R 4 radical.
  • a hydrogen atom is then instead bonded to the carbon atom of the alkyl chain to which a phosphate group is bonded according to claims 1 and 2.
  • An extension of the coupling reagent in the manner described above is then not possible and the coupling reagent has only a single marker molecule R 3 .
  • RNA ligase especially the T4 RNA ligase.
  • the minimum requirements of this enzyme must be Substrate is a 3 ", 5" ribonucleoside bisphosphate. Ribooligonucleotides which contain such a group at their 5 "end are bound by the RNA ligase to the 3" - OH group of any ribonucleic acid.
  • the reagent can also be coupled to a DNA; all that is required is to attach a ribonucleotide to the 3 "end of the DNA before coupling.
  • the reactive group which binds the marker is bonded to the 3 "phosphate group of the coupling reagent via a spacer containing phosphate.
  • the spacer is an alkyl chain with a length of between 1 and 30 carbon atoms, to which a phosphate group can be bound.
  • the coupling reagent can be extended further at this phosphate group of the spacer: Either by attaching another nucleoside to which a marker can in turn be bound (see formula I), or by directly introducing further marker molecules with a spacer (see formula II) .
  • the length of the ribooligonucleotide can be selected as required and there is in principle the possibility of binding markers to any or all of the phosphate groups with the exception of the 5 "terminal phosphate group, a reagent is available with the coupling reagent according to the invention with which nucleic acids can be used in one step can be coupled with several markers, which, for example, gives a stronger signal, particularly in connection with in situ hybridization methods, which is a major advantage of the coupling reagent according to the invention, since it is very complex to obtain a signal amplification in conventional labeling methods.
  • the coupling reagent is synthesized analogously to the automatic DNA synthesis. It is essential to the invention that the coupling reagent can be synthesized automatically with the aid of conventional DNA synthesizers, the synthesis cycle being suitably modified to the requirements of RNA synthesis.
  • ribonucleotides are used as building blocks instead of deoxyribonucleotides and uracil is used instead of thymidine.
  • the 2 "-OH group is protected by a protective group, for example a silyl group, during the reaction.
  • the reaction time in RNA synthesis is approximately 10 minutes compared to approximately 3 minutes in DNA synthesis.
  • ribooligonucleotide is synthesized according to the phosphoramidite method, which is described in detail by T. Atkinson and M. Smith (in: Oligonucleotide Synthesis; A Practical approach; MJ Gait (ed.) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1984) on the solid phase from 3 "to 5".
  • a reactive amino group is preferably introduced with the aid of a special amination reagent of the form (l-dimethoxytrityloxy-3-fluorenylmethoxycarbonylamino-propan-2-yl) - (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) - phosphoramidite (for example from the company Glen Research [Sterling, Vancouver, Canada] available as 5 "-branched modifier C3).
  • amination reagent results in a coupling reagent with a 3" -terminal nucleoside.
  • This can be modified further, for example by oxidizing the 2 "- and 3" -OH groups to aldehyde groups.
  • These aldehyde groups can react with amino groups to form a Schiff base. If the aldehyde groups are reacted with corresponding amino groups of enzymes, the enzyme is bound to the oligonucleotide.
  • the terminal nucleoside is not modified, there is a risk that the 3 "OH group of this nucleoside reacts with the 5" phosphate group of the same type of molecule.
  • the nucleoside can be split off at the 3 "end by means of ⁇ -elimination and the self-ligation can thereby be prevented.
  • the reactive amino group can also be introduced with an amination reagent of the form (l-dimethoxytrityloxy-3-fluorenylmethoxycarbonylamino-propane-2-succinoyl) - aminoalkane (available, for example, from Glen Research as a 3 "amino-modifier-CPG), where directly a 3 "phosphate group according to formula (I) or (II) results.
  • an amination reagent of the form (l-dimethoxytrityloxy-3-fluorenylmethoxycarbonylamino-propane-2-succinoyl) - aminoalkane (available, for example, from Glen Research as a 3 "amino-modifier-CPG), where directly a 3 "phosphate group according to formula (I) or (II) results.
  • the ⁇ -elimination is saved if you do not want a terminal nucleoside.
  • R 3 Various substances (R 3 ) which easily react with an amino group, such as fluorescent markers, for example a fluorescein derivative, or digoxigenin or biotin derivatives or else proteins, in particular nucleases, are then linked to the introduced amino group.
  • Activated substituents can exist as isothiocyanates, isocyanates, as N-hydroxysuccinimide esters, p-nitrophenyl esters, sulfonic acid chlorides, triazine chlorides or as acid azides.
  • the following substances are preferably used as markers: fluorescein succinimide ester, NBD-F (4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole), tetramethylrhodamine 5 (6) isothiocyanate, Texas red (sulphorhodamine-101-acid chloride) , Biotin succinimide ester, digoxygenin succinimide ester.
  • proteins in particular nucleases
  • this "crosslinking" of an enzyme to an oligonucleotide can in principle be carried out in the following ways: on the one hand, a free sulfhydryl group can be incorporated into the enzyme by incorporating a cysteine residue (see R. Zuckermann et al., Journal "J. Am. Chem. Soc.
  • hetero cross-linking reagent eg N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate
  • the succinimidyl residue of the hetero crosslinking reagent reacts with the amino group of the coupling reagent, causing the enzyme to cross the
  • Crosslinking reagent is bound to the coupling reagent.
  • Another way of introducing a free SH group into the corresponding enzyme is to chemically convert an amino group into an SH group (see Carlsson et al., Journal "Biochem. J”. 173, 723-737 (1978)) .
  • the actual cross-linking takes place as described above.
  • a third possibility of binding an enzyme to the coupling reagent is to use a homo cross-linking reagent which, in contrast to the hetero cross-linking reagent mentioned above, has two succinimidyl residues. It reacts both with the amino group of the coupling reagent and with an amino group of the enzyme.
  • a phosphate group at the 5 "terminus of the ribooligonucleotide which is necessary for the reaction of the ribooligonucleotide with the nucleic acid to be labeled, is preferably carried out by means of a phosphorylation reagent of the form: 2- [2- (4,4" -dimethoxotrityloxy) ethylsulfonyl ] ethyl- (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) - phosphoramidite (available from Glen Research as a chemical phosphorylation reagent).
  • a 5 "phosphorylation is also possible with other methods, for example using ATP and the enzyme polynucleotide kinase. However, this method is extremely cumbersome and lengthy, especially on a larger scale.
  • the coupling reagent according to the invention can be used with the aid of conventional DNA synthesizers are automatically synthesized.
  • the synthesis of a coupling reagent of the form 5 "pCpCp fluorescein is explained in more detail below as an exemplary embodiment.
  • RNA triplet was first produced from the following building blocks (direction: 5 "- 3") using the phosphoramidite method:
  • the reagents were obtained from Glen Research, but are also available from other companies.
  • RiboA-CPG are filled into a column and this is then sealed.
  • the RNA synthesis cycle is started.
  • the setting on the DNA synthesizer is: Tr off, auto. This means that the protective groups are split off and the product is split off from the carrier.
  • the column after the reaction is rinsed with ethanol: NH 3/1: 3.
  • the product thus obtained is lyophilized and then taken up again in 0.2 ml of 1 M tetraethylammonium fluoride in tetrahydrofuran. It is then incubated for 6 h at room temperature, as a result of which the protective groups on the ribose are split off. 0.3 ml of 1 M ammonium acetate solution, pH 5.3, is then added to this solution and diluted with 5 ml of water.
  • the substance can be stored at -20 ° C or lyophilized for a long time without loss.
  • the incubation medium contains:
  • the incubation medium contains: - 50 ⁇ ⁇ labeled ribooligonucleotide (from b)
  • the coupling reagent is used for coupling to nucleic acids.
  • An enzyme namely an RNA ligase, preferably the T4 RNA ligase, catalyzes the bond between the 5 "phosphate end of the coupling reagent and the 3" OH end of the nucleic acid to be modified.
  • the reaction is carried out in a special RNA ligase buffer which contains magnesium chloride, an organic solvent, ATP, coupling reagent, the nucleic acid to be modified and the RNA ligase at a slightly alkaline pH. This mixture is incubated at temperatures between 0 and 10 ° C. for 4 to 24 h and the modified nucleic acid is then extracted with phenol and precipitated with ethanol.
  • RNA with fluorescein is carried out below using the coupling reagent, the synthesis of which was described in the example above.
  • the total volume of the incubation medium contains 30 ⁇ :
  • RNA ligase buffer 100 mM Hepes / KOH, pH 7.8; 40 mM magnesium chloride; 7 mM dithiothreitol; 20 ⁇ g / ml bovine serum albumin; 20% dimethyl sulfoxide
  • a main application of the coupling reagent according to the invention is the coupling of labeling substances (R 3 ), in particular fluorescent markers, to nucleic acids.
  • labeling substances R 3
  • the straightforwardness of the method of binding marker substances to the coupling reagent and the coupling reagent to a nucleic acid makes it possible, for example in the form of a kit, to provide the user with the still unmodified coupling reagent and separately various marker substances. The user can then easily produce the coupling reagent as required and in the required modification as required. Since the coupling of the modified coupling reagent to the nucleic acid to be labeled is an enzymatic method, the user has a simple possibility of coupling any nucleic acids with markers of his choice very gently and with high specificity.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Ribooligonukleotid der Formel (I) oder (II), wobei jeweils R1 eine Hydroxylgruppe oder Phosphatgruppe oder mindestens ein 3', 5'- Nukleotidbisphosphat, R2 eine Nukleobase, R3 das zu kuppelnde Molekül und R4 ein Wasserstoffatom oder ein Nukleosid bedeuten, und wobei m eine Zahl zwischen 1 und 100, insbesondere zwischen 2 und 5, n1 entweder O oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, und n2 entweder O oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1 sind. Das Ribooligonukleotid ist geeignet, Markersubstanzen, insbesondere Fluoreszenzmarker, aber auch Proteine, insbesondere Nukleasen, unter Katalyse einer RNA-Ligase an Nukleinsäuren zu kuppeln. Dieses modifizierte Ribooligonukleotid kann verwendet werden a) für Hybridisierungverfahren oder b) für RNA-Strukturuntersuchungen oder c) für Protein-RNA-Wechselwirkungsstudien oder d) zum gezielten Bearbeiten von Nukleinsäuren.

Description

Reagenz zur Kupplung verschiedener Substanzen an Nukleinsäuren sowie Verfahren zu dessen Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Ribooligonukleotid, das heißt ein Reagenz zur Kupplung mindestens eines Moleküls an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), ein Verfahren zu dessen Herstellung, dessen Verwendung sowie ein auf diesem modifizierten Ribooligonukleotid basierendes Reagenzkit. Bei diesem Kupplungsreagenz handelt es sich um ein spezifisch modifiziertes Ribooligonukleotid, das im Prinzip aus beliebig vielen, mindestens aber aus einem Ribonukleotid besteht. Mit Hilfe dieses Kupplungsreagenz ist es möglich, mittels enzymatischer Methoden verschiedenste Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen aber auch Digoxigenin- oder Biotinderivate, oder auch andere Moleküle , wie z. B. Proteine an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), zu kuppeln.
Die Kupplung unterschiedlichster Moleküle an Nukleinsäuren ist ein weitverbreitetes Verfahren in der Molekularbiologie. Besonders zur Markierung von Nukleinsäuren sind derartige Verfahren von großer Bedeutung. Sie werden eingesetzt für Protein- Nukleinsäure-Wechselwirkungsstudien, Nukleinsäure-Strukturuntersuchungen, zur DNA- und RNA-Sequenzierung oder, für die medizinische Diagnostik von enormer Bedeutung, bei Hybridisierungsverfahren, insbesondere in-situ- Hybridisierungsverfahren. Die Markierung erfolgte bisher hauptsächlich auf radioaktiver Basis mit Hilfe von isotop-substituierten Nukleotiden und entsprechenden Enzymen. Da radioaktiv markierte Stoffe aber recht teuer sind, der Umgang mit ihnen nicht ungefährlich ist und auch die Entsorgung des radioaktiven Abfalls aus ökologischen Erwägungen heraus problematisch ist, gibt es seit einiger Zeit Bemühungen, alternative (d.h. nicht radioaktive) Markierungsmöglichkeiten einzusetzen.
Die wohl am häufigsten eingesetzte Markierungstechnik für RNA bedient sich eines 3 \ 5" -Bisphosphats, normalerweise [5 -32P]pCp (Cytidin-3\ 5" -Bisphosphat), aber pCp kann auch mit anderen Isotopen als 32P maikiert werden. Unter Katalyse einer RNA-Ligase wird dieses pCp an das 3 -Ende einer RNA gekuppelt. Das Produkt dieser Reaktion ist ein RNA-Molekül, aas um ein Nukleotid verlängert ist und eine radioaktive Markierung am 3 "-Terminus trägt. Diese Methode erlaubt ausschließlich die radioaktive Markierung von RNA.
In der Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 12 (4) 1791-1810 (1984) ist eine enzymatische Methode zur Fluoreszenzmarkierung von tRNA und Oligodeoxynukleotiden beschrieben. Als Kupplungsreagenz wird ein modifiziertes pdCp verwendet, bei dem ein Sauerstoffatom der 3 "-Phosphatgruppe gegen ein Schwefelatom ausgetauscht ist, so daß ein Molekül der Form pdCp(S) entsteht. An dieses Schwefelatom wird ein fluoreszentes Molekül, ein Biman, gebunden. Mittels T4 RNA-Ligase wird dieses Molekül dann an das 3 "-Ende einer tRNA, sowie an verschiedene synthetische Oligodeoxynukleotide, die als Modelle für Deoxynukleinsäuren verwendet werden, gebunden. Nachteilig dabei ist, daß man bei der Auswahl des Fluoreszenzmarkers sehr beschränkt ist, da sich nur wenige der gebräuchlichen Marker an den Schwefel binden lassen.
Im "Journal of Histochemistry and Cytochemistry" 29, 227-237 und 238-246 (1981), ist eine Methode beschrieben, mit der sich durch Periodatoxidation der benachbarten 2", 3 "-Hydroxylgruppen eines endständigen Ribosids geeignete Markierungen an die entstehenden Aldehydgruppen binden lassen. Nachteilig an dieser Methode sind die auftretenden Nebenreaktionen. So geht ein Großteil des Produktes durch die zwangsläufig eintretende ß-Eliminierung verloren. Lediglich bei Verwendung von Hydraziden gelangt man zu befriedigenden Ergebnissen, da in diesem Fall keine ß- Eliminierung eintritt: Ein weiterer Nachteil ist, daß die als Donor verwendeten Substanzen einer recht aufwendigen chemischen Vorbehandlung unterzogen werden müssen. Darüberhinaus haben derartige chemische Markierungsmethoden gegenüber enzymatischen Verfahren ganz allgemein den großen Nachteil, weniger spezifisch zu sein. Durch die hohe Spezifität von Enzymen werden Nebenreaktionen von vornherein weitestgehend ausgeschlossen.
Einen Fortschritt bringt bereits die von R.W. Richardson und R.I. Gumport in der Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 11 (18), 6167-6184 (1983) beschriebene weitere Markierungsmethode für RNA. Es wird vorgeschlagen, ß-substituierte ADP-Derivate der Form Ado-5"PP-X dazu zu verwenden, unter Katalyse des Enzyms T4 RNA- Ligase den Molekülteil P-X unter Bildung einer 3"-Phosphodiester-Bindung an das 3 "-Ende einer RNA zu binden. X kann dabei z.B. ein Fluoreszenzmarker wie Fluoreszein oder Rhodamin sein. Ein Nachteil dieser Methode ist darin zu sehen, daß die Synthese der ADP-Derivate relativ kompliziert und aufwendig ist. Darüberhinaus ist auch bei dieser Methode die Anzahl der Markersubstanzen, die verwendet werden können, sehr eingeschränkt.
Ein weiterer Fortschritt ist in der Methode von Zuckermann et al. (vgl. Zeitschrift "Nucleic Acids Research" 15 (13), 5305 - 5321 (1987)) zu sehen. Die Autoren beschreiben ein Verfahren zur Synthese von DNA-Oligomeren mit einer freien 3"- Thiolgruppe, die mit geeigneten Proben markiert werden können. Die SH-Gruppe, die zur Bindung des Markers vorgesehen ist, fungiert während der Synthese als Bindemolekül an das Säulenmaterial. Dies bedingt aber beispielsweise, daß nur ein Marker an das Oligonukleotid gebunden werden kann. Ein weiterer Nachteil ist, daß eine freie SH-Gruppe relativ empfindlich ist, so daß eine längere Aufbewahrung des unmarkierten Oligonukleotids kritisch ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein spezielles Ribooligonukleotid, d. h. ein Reagenz zur Kupplung mindestens eines Moleküls, allgemeiner betrachtet verschiedener Substanzen, insbesondere eines Fluoreszenzmarkers, eines Biotinderivates, eines Digoxigeninderivates oder eines Proteins an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), zur Verfügung zu stellen, das die genannten Nachteile vermeidet, dessen Verwendung also auf enzymatischen Umsetzungen beruht und dadurch eine hohe Spezifität besitzt, die einfach durchführbar ist und die es erlaubt, viele verschiedene Substanzen an Nukleinsäuren zu kuppeln. Weiterhin ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, spezifische Verwendungsmöglichkeiten für das modifizierte Ribooligonukleotid, sowie ein Reagenzkit auf der Basis dieses Ribooligonukleotids zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Kupplungsreagenz mit einer Struktur gemäß Formel (I) nach Anspruch 1 oder (II) nach Anspruch 2 oder (III) nach Anspruch 3 zur Verfügung gestellt wird. An dieses Kupplungsreagenz wird das Molekül R3 (oder die Moleküle), das an die Nukleinsäure gekuppelt werden soll gebunden und mittels eines einfachen Verfahrens mit der zu markierenden
Nukleinsäure gekuppelt. Das Molekül (R3) das mittels des Kupplungsreagenz an eine
Nukleinsäure gekuppelt wird, ist bevorzugt ein Fluoreszenzmarker, z.B. ein Fluoreszeinderivat, kann aber beispielsweise auch ein Digoxigenin- oder Biotinderivat oder ein Protein sein. Unabhängig von der Natur dieses Moleküls R3 wird es im folgenden der Einfachheit halber als Marker bezeichnet. Grundsätzlich ist auch die Einführung eines radioaktiven Isotops möglich, wobei im Gegensatz zu dem herkömmlicherweise für radioaktive Markierungen benutzten pCp mit dem erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz auch "exotische" Isotope , wie z.B. 125J eingeführt werden können.
Die durch das erfindungsgemäße Kupplungsreagenz nunmehr gute Verfügbarkeit von Fluoreszein-markierter RNA ermöglicht es auch, RNA-Sequenzanalysen in Analogie zu DNA-Sequenzanalysen mit Hilfe von DNA-Sequenzanalysegeräten automatisch durchzuführen. Die automatische DNA-Sequenzanalyse ist ausführlich beschrieben bei Ansorge et al., Zeitschrift "Nucleic Acids Res". 16, 2203 (1988).
Die Option, neben Markersubstanzen auch Proteine mit Hilfe von modifizierten Ribooligonukleotiden gezielt an Nukleinsäuren kuppeln zu können, eröffnet ganz neue Möglichkeiten in der Manipulation von Nukleinsäuren. Durch Kupplung von entsprechenden Nukleasen an Ribooligonukleotide, die als Sonde eingesetzt werden, ist es möglich, Nukleinsäuren an genau definierter Stelle zu spalten. Daß hierfür großer Bedarf besteht, wird von U. Englisch und D.H. Gauss explizit betont: "An der Möglichkeit zur künstlichen ortsspezifischen Spaltung von immer wieder anderen RNA- oder DNA-Einzelsträngen besteht Bedarf." [Chemisch modifizierte Oligonukleotide als Sonden und Agentien; Zeitschrift "Angewandte Chemie" 103 (6), 629 - 739 (1991)]. Besonders vorteilhaft ist die Kupplung eines DNA-spaltenden Enzyms an ein Ribooligonukleotid, da auf diese Weise ausgeschlossen ist, daß das Enzym das als Sonde fungierende Oligonukleotid, an das es gekoppelt ist, zerstört.
Weitere Spezifikationen im Hinblick auf die erfindungsgemäße RNA sind Gegenstand der Unteransprüche.
Mit anderen als im Hauptanspruch gebrauchten Worten besteht das erfindungsgemäße Kupplungsreagenz aus einem Ribooligonukleotid beliebiger Länge, bei dem an eine oder mehrere 3 "-Phosphatgruppen direkt oder über eine Spacergruppe eine reaktive Gruppe, insbesondere eine Aminogruppe gebunden ist, Auch eine Sulfhydrylgruppe ist als reaktive Gruppe einsetzbar, sie ist allerdings empfindlicher und reagiert nicht mit so vielen Substituenten wie eine Aminogruppe. Mit der minimalen Anzahl an Nukleotiden, mit der es erfindungsgemäß funktionsfähig ist, besitzt das Kupplungsreagenz z.B. die Form gemäß Anspruch 2:
Figure imgf000007_0001
wobei jeweils
Ri eine Phosphatgruppe
R2 eine Nukleobase, insbesondere Cytidin
R3 das zu kuppelnde Molekül und
R„ ein Wasserstoffatom bedeuten, und wobei m = 1, nx = 1 und n2 =
Bei Verwendung der Basen Adenin, Guanin oder Uracil erhält man ebenfalls ein erfindungsgemäß funktionierendes Kupplungsreagenz, die Umsatzraten der Kupplungsreaktion liegen allerdings bis zu 50% niedriger als bei Verwendung von Cytidin. Das Ribooligonukleotid kann an seiner 3 "Phosphatgruppe mit weiteren Nukleotiden verlängert werden, die ebenfalls substituiert sein können.
In einer weiteren Ausführungsform enthält die als Spacer verwendete Alkylkette keine Phosphatgruppe und damit auch keinen Rest R4. An das C-Atom der Alkylkette, an das nach den Ansprüchen 1 und 2 eine Phosphatgruppe gebunden ist, ist dann stattdessen ein Wasserstoffatom gebunden. Eine Verlängerung des Kupplungsreagenz auf die oben beschriebene Art ist dann nicht möglich und das Kupplungsreagenz verfügt nur über ein einziges Markermolekül R3.
Einer der Vorteile der Verwendung eines modifizierten Ribooligonukleotids als Kupplungsreagenz liegt darin, daß seine Kupplung an das 3 "-Ende einer Nukleinsäure enzymatisch erfolgen kann, unter Verwendung einer RNA-Ligase, insbesondere der T4-RNA-Ligase. Die Mindestanforderungen dieses Enzyms an sein Substrat sind ein 3", 5"- Ribonukleosid-Bisphosphat. Ribooligonukleotide, die an ihrem 5 "-Ende eine solche Gruppe enthalten, werden von der RNA-Ligase an die 3"- OH-Gruppe einer beliebigen Ribonukleinsäure gebunden. Auch an eine DNA kann das Reagenz gekuppelt werden, es muß hierzu nur vor der Kupplung ein Ribonukleotid an das 3 " -Ende der DNA angehängt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die den Marker bindende reaktive Gruppe über einen Phosphat enthaltenden Spacer an die 3 "-Phosphatgruppe des Kupplungsreagenz gebunden. Der Spacer ist eine Alkylkette mit einer Länge zwischen 1 und 30 C-Atomen, an den eine Phosphatgruppe gebunden sein kann. An dieser Phosphatgruppe des Spacers kann das Kupplungsreagenz weiter verlängert werden: Entweder, indem ein weiteres Nukleosid, an das wiederum ein Marker gebunden sein kann, angehängt wird (siehe Formel I), oder indem direkt weitere Markermoleküle mit Spacer eingeführt werden (siehe Formel II).
Da die Länge des Ribooligonukleotids ganz nach Bedarf gewählt werden kann und prinzipiell die Möglichkeit besteht, Marker beliebig an mehrere oder alle Phosphatgruppen mit Ausnahme der 5"terminalen Phosphatgruppe zu binden, steht mit dem erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz ein Reagenz zur Verfügung, mit dem Nukleinsäuren in einem Arbeitsschritt mit mehreren Markern gekuppelt werden können, wodurch beispielsweise ein stärkeres Signal erhalten wird. Insbesondere im Zusammenhang mit in situ Hybridisierungsverfahren ist dies ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz, da es bei konventionellen Markierungsmethoden sehr aufwendig ist, zu einer Signalverstärkung zu gelangen.
Die Synthese des Kupplungsreagenz erfolgt analog zur automatischen DNA- Synthese. Es ist erfindungswesentlich, daß das Kupplungsreagenz automatisch mit Hilfe von herkömmlichen DNA-Synthesegeräten synthetisiert werden kann, wobei der Synthesezyclus in geeigneter Weise auf die Belange der RNA-Synthese modifiziert ist.
Das heißt, es werden Ribonukleotide anstatt Desoxyribonukleotiden als Bausteine verwendet und statt Thymidin wird Uracil eingesetzt. Weiterhin wird die 2"-OH- Gruppe durch eine Schutzgruppe, beispielsweise eine Silylgruppe während der Reaktion geschützt. Schließlich beträgt die Reaktionszeit bei der RNA-Synthese ca. 10 min gegenüber ca. 3 min bei der DNA-Synthese.
Das Ribooligonukleotid wird nach der Phosphoramidit-Methode, die im Einzelnen beschrieben ist bei T. Atkinson und M. Smith (in: Oligonucleotide Synthesis; A Practical Approach; M. J. Gait (Hrsg.) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1984) an der Festphase von 3 " nach 5 " aufgebaut.
Die Einführung einer reaktiven Aminogruppe erfolgt bevorzugt mit Hilfe eines speziellen Aminierungsreagenz der Form (l-Dimethoxytrityloxy-3- fluorenylmethoxycarbonylamino-propan-2-yl)-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)- phosphoramidit (z.B. bei der Firma Glen Research [Sterling, Vancouver, Kanada] als 5"-Branched Modifier C3 erhältlich). Bei Verwendung dieses Aminierungsreagenz resultiert ein Kupplungsreagenz mit einem 3"-terminalen Nukleosid. Dieses kann weiter modifiziert werden, beispielsweise, indem die 2"- und 3"-OH-Gruppen zu Aldehydgruppen oxidiert werden. Diese Aldehydgruppen können mit Aminogruppen unter Ausbildung einer Schiff" sehen Base reagieren. Läßt man die Aldehydgruppen mit entsprechenden Aminogruppen von Enzymen reagieren, erreicht man eine Bindung des Enzyms an das Oligonukleotid.
Erfolgt keine Modifikation des endständigen Nukleosids, besteht die Gefahr, daß die 3"-OH-Gruppe dieses Nukleosids mit der 5 "-Phosphatgruppe gleichartiger Moleküle reagiert. Um eine solche Selbstligierung des erfindungsgemäßen Ribooligonukleotids zu vermeiden, wodurch ein kleiner Prozentsatz des Kupplungsreagenz inaktiviert werden kann, kann das Nukleosid am 3 "-Ende mittels ß-Eliminierung abgespalten und dadurch die Selbstligierung unterbunden werden.
Alternativ kann die reaktive Aminogruppe auch mit einem Aminierungsreagenz der Form (l-Dimethoxytrityloxy-3-fluorenylmethoxycarbonylamino-propan-2-succinoyl)- aminoalkan (z.B. bei der Firma Glen Research als 3"-Amino-Modifier-CPG erhältlich) eingeführt werden, wobei direkt eine 3 "-Phosphatgruppe gemäß Formel (I) oder (II) resultiert. In diesem Fall spart man sich die ß-Eliminierung, wenn man kein endständiges Nukleosid wünscht.
Mit der eingeführten Aminogruppe werden dann verschiedene Substanzen (R3), die leicht mit einer Aminogruppe reagieren, wie Fluoreszenzmarker, z.B. ein Fluoreszeinderivat, oder Digoxigenin- oder Biotinderivate oder auch Proteine, insbesondere Nukleasen, verknüpft. Aktivierte Substituenten können vorliegen als Isothiocyanate, Isocyanate, als N-Hydroxysuccinimidester, p-Nitrophenylester, Sulfonsäurechloride, Triazinchloride oder als Säureazide. o
Bevorzugt werden folgende Substanzen als Marker verwendet: Fluoreszein-Succinimidester, NBD-F (4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-l,3 diazol), Tetramethylrhodamin 5(6) isothiocyanat, Texas Rot (Sulphorhodamin-101- Säurechlorid), Biotin-Succinimidester, Digoxygenin-Succinimidester.
Neben derartigen Markersubstanzen können auch Proteine, insbesondere Nukleasen an das Kupplungsreagenz gebunden werden. Dieses "Crosslinking" eines Enzyms an ein Oligonukleotid kann neben der oben bereits beschriebenen Methode prinzipiell auf folgenden Wegen erfolgen: Zum einen kann durch Einbau eines Cysteinrestes eine freie Sulfhydrylgruppe in das Enzym eingebaut werden (siehe R. Zuckermann et al., Zeitschrift "J. Am. Chem. Soc." 110, 1614 (1988)), die dann mit der Sulfhydrylgruppe eines sogenannten Heteroquervernetzungsreagenz (z.B. N- succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat) unter Ausbildung einer Disulfidbrücke reagiert. Der Succinimidylrest des Heteroquervernetzungsreagenz reagiert mit der Aminogruppe des Kupplungsreagenz, wodurch das Enzym über das
Vernetzungsreagenz an das Kupplungsreagenz gebunden wird. Eine weitere Möglichkeit, eine freie SH-Gruppe in das entsprechende Enzym einzuführen, ist die, eine Aminogruppe chemisch in eine SH-Gruppe umzuwandeln (siehe Carlsson et al., Zeitschrift "Biochem. J". 173, 723 - 737 (1978)). Die eigentliche Quervernetzung erfogt wie oben beschrieben. Eine dritte Möglichkeit der Bindung eines Enzyms an das Kupplungsreagenz besteht in der Verwendung eines Homoquerveraetzungsreagenz, das im Gegensatz zum oben genannten Heteroquervernetzungsreagenz zwei Succinimidylreste besitzt. Es reagiert sowohl mit der Aminogruppe des Kupplungsreagenz als auch mit einer Aminogruppe des Enzyms.
Die Einführung einer Phosphatgruppe am 5 "-Terminus des Ribooligonukleotids, die für die Reaktion des Ribooligonukleotids mit der zu markierenden Nukleinsäure nötig ist, erfolgt bevorzugt mittels eines Phosphorylierungsreagenz der Form: 2-[2- (4,4"-Dimethoxy- trityloxy) ethylsulfonyl] ethyl-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)- phosphoramidit (z.B. bei der Firma Glen Research als Chemical Phosphorylation Reagent erhältlich). Eine solche 5"-Phosphorylierung ist auch mit anderen Methoden möglich, z.B. mittels ATP und dem Enzym Polynukleotidkinase. Diese Methode ist aber insbesondere im größeren Maßstab äußerst umständlich und langwierig.
Unter Verwendung der entsprechenden aktivierten Nukleoside sowie der oben beschriebenen Aminierungs- und Phosphorylierungsreagenzien kann das erfindungsgemäße Kupplungsreagenz mit Hilfe konventioneller DNA-Synthesegeräte automatisch synthetisiert werden. Im folgenden wird als Ausführungsbeispiel die Synthese eines Kupplungsreagenz der Form 5"pCpCp-Fluoreszein näher erläutert.
a) Synthese des Zwischenproduktes 5"pCpCp. Amino)A
Mit Hilfe des DNA-Synthesegerätes 394 der Firma Applied Biosystems [Foster City, Kalifornien, USA] wurde mittels der Phosphoramidit-Methode zunächst ein modifiziertes RNA-Triplett hergestellt aus folgenden Bausteinen (Richtung: 5"- 3"):
5" 1.) Phosphorylierungsreagenz (Chemical Phosphorylation Reagent) 2.) RiboC-Phosphoramidit 3.) RiboC-Phosphoramidit
4.) Aminierungsreagenz (5"-Branched Modifier C3) 3" 5.) RiboA-CPG (control pore glass)
Die Reagenzien wurden bei der Fa. Glen Research bezogen, sind aber auch bei anderen Firmen erhältlich.
Für die Synthese von ca. 1 μmol pCC(Amino)A werden 30 mg RiboA-CPG in eine Säule gefüllt und diese danach abgedichtet. Der Synthesezyklus der RNA wird gestartet. Die Einstellung am DNA-Synthesegerät ist: Tr off, auto. Das bedeutet, daß die Schutzgruppen abgespalten sowie das Produkt vom Träger abgespalten wird. Hierzu wird nach Beendigung der Reaktion die Säule gespült mit Ethanol:NH3 / 1:3.
Inkubation der erhaltenen Lösung für 12 h bei 55°C vervollständigt die Abspaltung der Schutzgruppen.
Das so erhaltene Produkt wird lyophilisiert und anschließend wieder aufgenommen in 0,2 ml 1 M Tetraethylamrnoniumfluorid in Tetrahydrofuran. Anschließend wird für 6 h bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch die Schutzgruppen an der Ribose abgespalten werden. Dieser Lösung wird nun 0,3 ml 1 M Ammoniumacetat-Lösung, pH 5,3, zugesetzt und mit 5 ml Wasser verdünnt. Diese Lösung wird zur Aufreinigung des Ribooligonukleotids mittels Ionenaustauschchromatographie auf eine mit 50 mM Triethylammoniumacetat (TEAA) äquilibrierte Sephadex A25 Ionenaustauschsäule (Pharmacia [Uppsala, Schweden]) mit einem Volumen von 1 ml gegeben. Diese Säule wird anschließend zunächst mit 0,2 M TEAA, danach mit 0,5 M TEAA gewaschen und das Produkt anschließend mit 2 M TEAA eluiert. Das so erhaltene Produkt wird lyophylisiert, in 70% Ethanol aufgenommen und wiederum lyophylisiert. Schließlich wird das modifizierte Ribooligonukleotid in 100 μl Wasser gelöst und seine Konzentration ermittelt durch spektralphotometrische Bestimmung der Absoφtion bei 260 nm (1 OD = 30μg/ml). Die Substanz läßt sich bei -20°C oder lyophilisiert für längere Zeit ohne Verlust aufbewahren.
b) Markierung des Ribooligonukleotids mit Fluoreszein
Das Inkubationsmedium enthält:
- 0,1 μmol des modifizierten Ribooligonukleotids in 1 ml Wasser
- 0,1 ml 1 M Natriumhydrogencarbonat, pH 8,8 - 3 mg Fluoreszein-Succinimidester (FLUOS, Fa. Boehringer [Mannheim,
BRD]) in 150 l Dimethylformamid
Diese Mischung wird für 18 h bei Raumtemperatur im dunkeln inkubiert. Nach 18 h werden 0,2 ml 1 M Ammoniumacetat- Lösung, pH 5,3, zugegeben und diese Lösung dann lyophylisiert. Freies Fluoreszein wird vom getrockneten Produkt durch viermaliges Extrahieren mit je 1 ml Ethanol entfernt. Anschließend wird das Produkt in 100 μ\ 2 M TEAA, pH 7, aufgenommen und wiederum lyophylisiert. Die Reinigung erfolgt anschließend chromatographisch, wie unter a) beschrieben.
c) Entfernen des 3"-terminalen Adenosinrestes durch Periodatoxidation
Um das 3 '-Ende vor Selbstliga tion zu schützen, wird der 3'-terminale Adenosinrest durch Periodatoxidation entfernt. Das Inkubationsmedium enthält: - 50 μ\ markiertes Ribooligonukleotid (aus b)
- 1 μ\ 3 M Natriumacetat, pH 4,8
- 50 μ\ 50 mM Natriumperiodat
Die Inkubation erfolgt bei 0°C für 1 h. Durch Zugabe von 50 μ\ Ethylenglycol und weitere Inkubation für 30 min bei 0°C wird überschüssiges Periodat zerstört. Durch anschließende Zugabe von 150 μl 0,5 M Lysin (oder beliebige primäre Amine), pH 9,3 und Inkubation für 4 h bei Raumtemperatur wird die Ribose zusammen mit der daranhängenden Adeninbase mittels ß-Eliminierung entfernt. Die Reaktionslösung wird nun mit Wasser auf 1,5 ml verdünnt und, wie unter a) beschrieben, auf eine Sephadex A 25 Säule aufgegeben, gewaschen, eluiert, das Eluat lyophylisiert, in Wasser gelöst und seine Konzentration bestimmt. Das Kupplungsreagenz hat jetzt die Form gemäß Formel II (Anspruch 2), wobei Rα 3",5"-Cytidylbisphosphat, R2 Cytidin, R3 eine Fluoresceinylgruppe und R4 ein Wasserstoffatom sind und wobei n2 = 1, n2 = 1 und m = 1 sind. In dieser Form wird das Kupplungsreagenz zur Kupplung an Nukleinsäuren verwendet.
Kupplung des Kupplungsreagenz an Nukleinsäuren
Ein Enzym, und zwar eine RNA-Ligase, bevorzugt die T4 RNA-Ligase, katalysiert die Bindung zwischen dem 5 " -Phosphatende des Kupplungsreagenz und dem 3 " -OH- Ende der zu modifizierenden Nukleinsäure. Die Reaktion wird durchgeführt in einem speziellen RNA Ligase-Puffer, der bei einem leicht alkalischen pH- Wert Magnesiumchlorid, ein organisches Lösungsmittel, ATP, Kupplungsreagenz, die zu modifizierende Nukleinsäure sowie die RNA Ligase enthält. Diese Mischung wird bei Temperaturen zwischen 0 und 10°C für 4 bis 24 h inkubiert und die modifizierte Nukleinsäure anschließend mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
Als Beispiel ist im Folgenden die Markierung einer RNA mit Fluoreszein mittels des Kupplungsreagenzes ausgeführt, dessen Synthese im obigen Beispiel beschrieben wurde.
Das Inkubationsmedium enthält im Gesamtvolumen von 30 μ\:
- 15 μl doppelt konzentrierter RNA-Ligase-Puffer ( 100 mM Hepes/KOH, pH 7,8; 40 mM Magnesiumchlorid; 7 mM Dithiothreitol; 20 μg/ml Rinderserumalbumin; 20% Dimethylsulfoxid)
- 3 μl 1 mM ATP
- 1 μl 180 μM Kupplungsreagenz (an das Fluoreszein gebunden ist)
- 5 μg RNA (oder auch weniger)
- 20 U T4-RNA-Ligase
Diese Mischung wird bei 4°C für 8 h inkubiert. Die markierte RNA wird danach durch Phenolextraktion und anschließender Fällung mit Ethanol gewonnen. Verwendung des Kupplungsreagenz
Eine Hauptanwendung des erfindungsgemäßen Kupplungsreagenz ist die Kupplung von Markierungssubstanzen (R3), insbesondere Fluoreszenzmarkern, an Nukleinsäuren. Die Unkompliziertheit des Verfahrens, Markersubstanzen an das Kupplungsreagenz sowie das Kupplungsreagenz an eine Nukleinsäure zu binden, ermöglicht in der Praxis, dem Anwender beispielsweise in Form eines Kits das noch unmodifizierte Kupplungsreagenz und separat diverse Markersubstanzen zur Verfügung zu stellen. Der Anwender kann sich dann je nach Bedarf das Kupplungsreagenz leicht selbst in der richtigen Menge und der benötigten Modifikation herstellen. Da es sich bei der Kupplung des modifizierten Kupplungsreagenz an die zu markierende Nukleinsäure um ein enzymatisches Verfahren handelt, ist dem Anwender eine einfache Möglichkeit gegeben, sehr schonend und mit hoher Spezifität beliebige Nukleinsäuren mit Markern seiner Wahl zu kuppeln.

Claims

Patentansprüche
1. Ribooligonukleotid zur Kupplung mindestens eines Moleküls, beispielsweise eines Fluoreszenzmarkers oder eines Biotinderivates oder eines Digoxigeninderivates oder eines Proteins, an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), gekennzeichnet durch folgende Strukturformel (I):
Figure imgf000015_0001
wobei jeweils
Rx eine Hydroxylgruppe oder Phosphatgruppe oder mindestens ein
3 " ,5 " -Nukleotidbisphosphat,
R2 eine Nukleobase,
R3 das zu kuppelnde Molekül und R. ein Wasserstoffatom oder ein Nukleosid bedeuten, und wobei m eine Zahl zwischen 1 und 100, insbesondere zwischen 2 und 5, und x entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, und n, entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, sind. Ribooligonukleotid zur Kupplung mindestens eines Moleküls, beispielsweise eines Fluoreszenzmarkers oder eines Biotinderivates oder eines Digoxigeninderivates oder eines Proteins, an Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), gekennzeichnet durch folgende Strukturformel (II):
Figure imgf000016_0001
wobei jeweils
Rx eine Hydroxylgruppe oder Phosphatgruppe oder mindestens ein
3 " ,5 " -Nukleotidbisphosphat, R2 eine Nukleobase,
R3 das zu kuppelnde Molekül und
R4 ein Wasserstoffatom oder ein Nukleosid bedeuten, und wobei m eine Zahl zwischen 1 und 100, insbesondere zwischen 2 und 5, und nj entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, und n, entweder 0 oder eine Zahl zwischen 1 und 30, insbesondere 1, sind
3. Ribooligonukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die als Spacer dienende Alkylkette keine Phosphatgruppe mit daran gebundenem R4 und stattdessen ein Wasserstoffatom enthält (Formel III).
4. Ribooligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleobase (R2) ein Adenin, Guanin, Uracil oder
Cytidin ist. 5. Ribooligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das zu kuppelnde Molekül R3 ein Fluoreszenzmarker, insbesondere ein Fluoreszeinderivat, ein Biotinderivat, ein Digoxigeninderivat, oder ein Protein, insbesondere eine Nuklease, ist.
6. Verfahren zur Synthese eines Ribooligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese eines mit einer oder mehreren Aminogruppen modifizierten Ribooligonukleotids mit einem DNA-Synthesegerät bei modifiziertem Synthesezyclus durchgeführt wird wobei die Bestandteile:
- Phosphoramidite
- Aminierungsreagenzien
- Phosphorylierungsreagenz verwandt werden und der gewünschte Marker (R3) anschließend mittels an sich bekannter Methoden an dieses modifizierte Ribooligonukleotid gebunden wird.
7. Verwendung von Riboohgonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 a) zur Herstellung von Sonden für Hybridisierungsverfahren, insbesondere in situ Hybridisierungsverfahren oder b) für RNA-Strukturuntersuchungen oder c) für Protein-RNA- Wechselwirkungsstudien oder d) zur Herstellung von Oligonukleotid-Enzym-Komplexen, die zum gezielten Bearbeiten von Nukleinsäuren geeignet sind.
8. Reagenzkit zur Kupplung von Molekülen an Nukleinsäuren, insbesondere
Ribonukleinsäuren, bestehend aus: a) Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R1? R, und gegebenenfalls R4 die obige Bedeutung haben und R3 anstatt des zu kuppelnden
Moleküls ein Wasserstoffatom ist b) Markersubstanz oder Nuklease c) RNA Ligase, insbesondere T4 RNA Ligase
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