DE69731132T2

DE69731132T2 - Festträger-Reagenzien für die direkte Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden

Info

Publication number: DE69731132T2
Application number: DE69731132T
Authority: DE
Inventors: Khairuzzaman Bashar Mullah; William A. Andrus
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1996-01-29
Filing date: 1997-01-24
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2017-01-25
Also published as: US5736626A; JPH09208595A; EP0786468B1; DE69731132D1; JP2008247908A; AU1016997A; CA2195256A1; JP4127870B2; EP0786468A3; EP0786468A2; CA2195256C; AU704180B2

Description

HINTERGRUND
Die Erfindung betrifft allgemein Festträger-Reagenzien, die für die Synthese von funktionalisierten Polynukleotiden verwendbar sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Syntheseträger, die für die direkte Synthese von Polynukleotiden mit einer Markierung, die an dem 3'-Ende vorliegt, verwendbar sind, und Verfahren, die solche Reagenzien verwenden.
Die anhaltende schnelle Entwicklung von nicht isotopisch markierten Polynukleotid-Sonden, DNA/RNA-Amplifikationsverfahren, automatisierter DNA-Sequenzierung und biowirksamen Antisense- und Triplexsynthesereagenzien hat den Bedarf an chemisch modifizierten Polynukleotiden stark erhöht. Eine besonders verwendbare Polynukleotid-Modifikation ist der Einbau einer Markierung an dem 3'-Ende des Oligonukleotids.
Ein solches 3'-Markieren von synthetischen Polynukleotiden kann am einfachsten in einem von zwei Wegen erreicht werden. In einem ersten Verfahren, das hierin als das "Zwei-Schritt-Markierungsverfahren" bezeichnet wird, wird ein primäres aliphatisches Amin an dem 3'-Ende eines Polynukleotids eingebaut und nach einer Polynukleotidsynthese wird die Aminogruppe mit Markierungen, die eine elektrophile Gruppe enthalten, z. B. Isothiocyanate oder aktivierte Ester, z. B. NHS-Ester, umgesetzt. In einem zweiten alternativen Verfahren, das hierin als das "direkte Markierungsverfahren" bezeichnet wird, wird eine Markierung direkt in das Polynukleotid während oder vor einer Synthese eingebaut.
Das effektivste und leichteste Verfahren zum Einbauen einer Markierung an dem 3'-Ende eines synthetischen Polynukleotids besteht in der Verwendung eines direkten Markierungsverfahrens, das einen geeigneterweise funktionalisierten Syntheseträger verwendet, da (i) direkte Verfahren keinen Nach-Synthese-Reakti onsschritt benötigen, wodurch die Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden vereinfacht wird, und (ii) direkte Verfahren diejenigen Probleme vermeiden, die mit der niedrigen Reaktionsausbeute (< 60%) verbunden sind, die typischerweise angetroffen wird, wenn ein Aminogruppe-markiertes Oligonukleotid mit einer Markierung, z. B. einer Farbstoff-NHS-Ester-Markierung, umgesetzt wird, nämlich: (a) Aufreinigung des markierten Oligonukleotids von einem Überschuss an Markierung, (b) Aufreinigung des markierten Oligonukleotids von nicht markiertem Oligonukleotid, (c) erhöhte Kosten, die mit der niedrigen Produktausbeute verbunden sind, die durch Wegwerfen des großen Teils an nicht markierten Oligonukleotiden verursacht wird, und (d) irreversibles Cappen der 3'-Amin-Funktionalität während einer Synthese.
Die EP 0 323 152 beschreibt Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden auf Festphasenträgern und Markieren von synthetischen Oligonukleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen.
Biological Abstracts, Band 77 (1984), Abstract Nr. 048606 (Dobrynin, V. N. et al. (1983), Bioorganicheskaya Khimiya 9, 706–710) beschreibt ein Verfahren für eine schnelle Festphasensynthese von Oligodesoxynukleotiden basierend auf einer N-Methylimidazol-katalysierten Phosphotriesterkondensation.
Die WO 96/05215 beschreibt Festträger-Reagenzien, die für die Synthese von funktionalisierten Polynukleotiden verwendet werden, und Verfahren, die die Festträger-Reagenzien verwenden.
Jedoch besteht eine ernsthafte Schwäche von bestehenden Verfahren, die für die direkte 3'-Markierung von Polynukleotiden verwendet werden, darin, dass Reagenzien, die zum Abspalten des Oligonukleotids von dem Träger verwendet werden, auch viele Arten von Markierungen, z. B. Fluoreszenzfarbstoffe wie Farbstoffe auf Rhodamin-Basis, chemisch abbauen, wodurch deren Fluoreszenzeigenschaften radikal verändert werden. Vergleiche P. E. Nelson et al., Nucleic Acids Research 20(23): 6253–6259 (1992), und die US-PSen 5,401,837 und 5,141,813. Folglich müssen, wann immer Rhodamin-Farbstoffe oder andere ähnliche Farbstoffe in gegenwärtigen Festphase-Synthese-Protokollen verwendet werden, diese unter Verwendung des weniger erwünschten Zwei-Schritt-Verfahrens angebunden werden.
Folglich würde es wünschenswert sein, einen Syntheseträger bereitzustellen, der für die direkte Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden verwendbar ist und keine harschen Abspaltungsbedingungen, die mit basenlabilen Markierungen inkompatibel sind, benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG
Die Erfindung betrifft das Auffinden eines Syntheseträgers auf Diglykolat-Basis, der für die direkte Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden verwendbar ist.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Syntheseträgers, wobei eine Abspaltung des Polynukleotidprodukts unter Verwendung von im Verhältnis zu Ammoniumhydroxid milden Bedingungen bewirkt werden kann.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Syntheseträgers, wobei eine Abspaltung des Polynukleotidprodukts unter Verwendung von Bedingungen bewirkt werden kann, die für Rhodamin-Farbstoffe nicht zerstörerisch sind.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Syntheseträgers, wobei eine direkte Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden unter Verwendung von Ammoniumhydroxid-labilen Markierungen, z. B. Tetramethylrhodamin, erfolgen kann.
Eine noch weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Syntheseträgers, wobei die Abspaltungsreaktion signifikant schneller ist als diejenige, die unter Verwendung von herkömmlichen Syntheseträgern angetroffen wird.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Syntheseträgers, wobei die Ausbeute an 3'-markiertem Polynukleotid wesentlich höher ist als diejenige, die unter Verwendung von herkömmlichen Trägern angetroffen wird.
In einem ersten Aspekt werden die vorstehenden und andere erfindungsgemäßen Aufgaben durch einen Syntheseträger erreicht, der eine Verbindung der Formel:
umfasst, worin T eine säurespaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe, z. B. 4,4'-Dimethoxytritylgruppe, ist, L₁ ein Linker zum Verbinden eines 3'-terminalen Stickstoffatoms zu einem Kohlenstoffatom ist, L₂ und L₃ Linker zum Verbinden eines Sauerstoff- und Kohlenstoffatoms sind, W ein Festträger ist, L₄ ein Linker zum Verbinden des Festträgers mit einem Stickstoffatom ist, R₁ und R₂ Stickstoffatomsubstituenten sind, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Niederalkylgruppe, Stickstoffatom-Schutzgruppe oder einer Markierung, und R₃ bis R₇ Kohlenstoffatomsubstituenten sind, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom oder Niederalkylgruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist W CPG und L₄ weist die Struktur
auf.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist W ein nicht quellbares Polystyrol und L₄ ist eine Methylengruppe.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform weist L₁ die Struktur
auf, worin n von 0 bis 10 reicht und mehr bevorzugt ist n 5.
In einer ersten besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen Syntheseträger die Struktur
auf, worin DMT eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und W Polystyrol, vorzugsweise ein nicht quellbares Polystyrol ist.
In einer zweiten besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen Syntheseträger die Struktur
auf, worin DMT eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und W CPG ist.
In einer dritten besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen Syntheseträger die Struktur
auf, worin DMT eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und W Polystyrol, vorzugsweise ein nicht quellbares Polystyrol ist.
In einer vierten besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen Syntheseträger die Struktur
auf, worin DMT eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und W CPG ist.
In einem zweiten Aspekt sind erfindungsgemäß Verfahren zum Synthetisieren eines Polynukleotids mit einer Markierung oder einem Stickstoffatom an dem 3'-Ende unter Verwendung von herkömmlichen Synthesetechniken zusammen mit den vorstehend beschriebenen Syntheseträgern umfasst. Insbesondere umfassen die Verfahren die Schritte: (i) Bereitstellen eines Syntheseträgers, wie vorstehend beschrieben, (ii) Behandeln des Syntheseträgers mit Säure, um die säurespaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe zu entfernen, (iii) Zusetzen eines geschützten Nukleosid-Monomers und einer schwachen Säure, um eine Bindung zu bilden, (iv) Cappen der nicht umgesetzten Stellen auf dem Festträger, (v) Zusetzen eines Oxidationsmittels und (vi) Wiederholen der vorstehenden Schritte, bis die Polynukleotid-Kettenverlängerung vollständig ist. Nach Synthese des 3'-markierten Polynukleotids wird das Produkt sodann von dem Festträger unter Verwendung eines Abspaltungsreagenzes abgespalten und das Polynukleotid wird entschützt.
Diese und andere erfindungsgemäßen Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden mit Bezug auf die nachstehende Beschreibung, nachstehenden Zeichnungen und angehängten Ansprüche besser verstanden werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt schematisch die Synthese von Syntheseträgern des Stands der Technik dar.
Die 2 und 3 stellen schematisch die Synthese von bevorzugten erfindungsgemäßen Syntheseträgern dar.
GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Nun wird genau auf die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen Bezug genommen, und Beispiele davon sind in den begleitenden Zeichnungen und Formeln veranschaulicht. Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben werden wird, soll verstanden werden, dass sie nicht die Erfindung auf diese Ausführungsformen beschränken sollen. Im Gegensatz dazu soll die Erfindung Alternativen, Modifikationen und Äquivalente umfassen, die innerhalb der Erfindung wie sie durch die angehängten Ansprüche definiert ist, umfasst sein können.
Die Erfindung betrifft einen verbesserten Syntheseträger auf Diglykolat-Basis, der für die Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden verwendbar ist. Insbesondere weisen die erfindungsgemäßen Syntheseträger die nachstehende verallgemeinerte Struktur
FORMEL 1 auf, worin T eine säurespaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe ist, L₁ ein Linker zum Verbinden eines 3'-terminalen Stickstoffatoms an ein Kohlenstoffatom ist, L₂ und L₃ Linker zum Verbinden eines Sauerstoffatoms und eines Kohlenstoffatoms sind, W ein Festträger ist, L₄ ein Linker zum Verbinden des Festträgers an ein Stickstoffatom ist, R₁ und R₂ Stickstoffatomsubstituenten sind, die unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Niederalkylgruppe, eine Stickstoffatom-Schutzgruppe oder eine Markierung umfassen, R₃ bis R₇ Kohlenstoffatomsubstituenten sind, die unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe umfassen, und W ein Festträger ist.
Die erfindungsgemäßen Syntheseträger stellen mehrere wichtige Vorteile gegenüber herkömmlichen Syntheseträgern auf Succinat-Basis, die für die Synthese von Polynukleotiden verwendet werden, bereit. Ein besonders wichtiger Vorteil der erfindungsgemäßen Träger besteht darin, dass ein 3'-markiertes Polynukleotid, sobald es synthetisiert ist, von den Festträgern unter Verwendung von relativ milden Abspaltungsreagenzien, d. h. Abspaltungsreagenzien, die schwächere Nukleophile als Ammoniumhydroxid sind, abgespaltet werden kann. Beispielhafte milde Abspaltungsreagenzien umfassen Ethanolamin, Methylamin/Ammoniumhydroxid-Gemische und Gemische von t-Butylamin/Wasser/Methanol (1 : 2 : 1), vgl. z. B. US-PS 5,231,191 . Diese Fähigkeit einer Verwendung solcher milden Abspaltungsreagenzien ist praktisch wichtig, da sie die direkte Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden mit Markierungen erlaubt, die kein Ammoniumhydroxid tolerieren, z. B. Rhodamin-Farbstoffe wie Tetramethylrhodamin (TAMRA, manchmal als "TMR" abgekürzt), z. B. 6-Carboxytetramethylrhodamin.
Ein zweiter erfindungsgemäßer signifikanter Vorteil besteht darin, dass sogar, obwohl milde Abspaltungsreagenzien verwendet werden, die Abspaltungsreaktion wesentlich schneller ist als diejenige, die unter Verwendung herkömmlicher Verfahren und Reagenzien, d. h. Reagenzien auf Ammoniumhydroxid-Basis zusammen mit Syntheseträgern auf Succinat-Basis, festgestellt wird.
Ein dritter Vorteil der erfindungsgemäßen Träger besteht darin, dass hohe Produktausbeuten ohne manuellen Eingriff oder harsche Abspaltungsbedingungen erhalten werden können. Um hohe Ausbeuten unter Verwendung von verfügbaren Syntheseträgern auf Succinat-Basis zu erreichen, d. h. Ausbeuten in dem Bereich von 99%, wird nach der Synthese der Polynukleotid-haltige Syntheseträger manuell von der Reaktionskartusche entfernt, in ein Glasröhrchen überführt, ein Abspaltungsreagenz wird zugesetzt und die Suspension wird bei etwa 85°C für mehrere Stunden gekocht. Eine unerwünschte Folge einer Verwendung dieses harschen Abspaltungsprotokolls besteht darin, dass in dem Festträger vorhandene Verunreinigungen in die Abspaltungslösung extrahiert werden, wodurch die Reinheit des Produktoligonukleotids beeinträchtigt wird. Im Gegensatz zu den beschwerlichen und harschen Protokollen, die benötigt werden, wenn gegenwärtig erhältliche Träger verwendet werden, können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Syntheseträger 99%ige Ausbeuten in einer vollständig automatisierten Weise erhalten werden, ohne den Syntheseträger von dem Polynukleotid-Synthesegerät entfernen oder die Abspaltungsreaktion aufheizen zu müssen.
Ferner ist, da harsche Abspaltungsbedingungen nicht benötigt werden, das Produkt nicht mit Material verunreinigt, das von dem Festträger extrahiert wird.
Die Begriffe "Oligonukleotid" oder "Polynukleotid", wie hierin verwendet, betreffen Oligomere von natürlichen oder modifizierten Nukleosiden oder von nicht nukleosidischen Analoga, die durch Phosphodiesterbindungen oder Analoga davon verbunden sind, in der Größe von wenigen monomerischen Einheiten, z. B. 2 bis 5, bis mehreren hundert monomerischen Einheiten.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "Markierung" allgemein eine jegliche 3'-Modifikation des Polynukleotids, einschließlich Modifikationen, die (i) einen Nachweis vereinfachen, z. B. Farbstoffe, Enzyme oder Spin-Markierungen, (ii) ein Einfangen des Polynukleotids an ein festes Substrat erleichtern, z. B. Biotin und Haptene, (iii) eine Löslichkeit beeinflussen oder eine zelluläre Aufnahme modifizieren, z. B. PEG, Cholesterylgruppen und Triglyceride, und (iv) Gruppen einbringen, die an chemischen Reaktionen teilnehmen, z. B. Psoralene, EDTA, Phosphat und Nukleinsäure-Abspaltungsreagenzien.
Erfindungsgemäß ist W ein Festträger, auf dem die Polynukleotidsynthese stattfindet. W kann eine Vielzahl von Formen und Zusammensetzungen aufweisen, jedoch sollte der Festträger (i) im Wesentlichen unlöslich in den Polynukleotidsynthese-Reagenzien sein, (ii) gegenüber Polynukleotidsynthese-Reagenzien chemisch stabil sein, (iii) zu einer chemischen Derivatisierung fähig sein, (iv) die gewünschte Oligonukleotidbeladung bereitstellen, (v) eine geeignete Druckfestigkeit aufweisen, um einem erhöhten Druck, der während einer Verarbeitung angetroffen wird, zu widerstehen, und (vi) in einem gewünschten Partikelgrößenbereich und einer gewünschten Partikelgrößenverteilung erhältlich sein. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "Polynukleotidsynthese-Reagenzien" Lösungsmittel und Reagenzien, die typischerweise in dem Polynukleotidsyntheseverfahren verwendet werden, z. B. Iod, Methylenchlorid, Acetonitril, Tetrazol, n-Methylimidazol, Pyridin, Essigsäureanhydrid, Lutidin und Trifluoressigsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist W ein anorganisches Polymer. Eine große Vielzahl von anorganischen Polymeren kann erfindungsgemäß verwendet werden und diese umfassen z. B. Silica, poröses Glas, Aluminosilicate, Borosilicate, Metalloxide wie Tonerde und Nickeloxid und verschiedene Tone. Vorzugsweise ist der anorganische Festträger kontrolliertes Porenglas (CPG). Kontrollier tes Porenglas besteht aus gleichmäßig gemahlenen und gesiebten Partikeln aus nahezu reiner Silica, die wabenartig mit Poren einer gesteuerten Größe vorliegen. Es wird aus einem Borosilicat-Material hergestellt, das spezifisch wärmebehandelt wurde, um die Borate von den Silicaten abzutrennen. Die Poren werden durch Entfernen der Borate mittels eines sauren Ätzverfahrens hergestellt, wobei deren Größe von der Art des Erhitzungsverfahrens abhängt. Insbesondere liegt das CPG in der Form von Partikeln mit einem Durchmesser von 150 um und Poren von 500 Å vor, z. B. Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, Seiten 6-5 bis 6-9, Applied Biosystems, Ver. 2.00, Doc. Rev. A, Teil Nr. 902351 (1992), Applied Biosystems Division von The Perkin-Eimer Corporation, Foster City, CA (ABD).
Eine Derivatisierung von CPG-Trägern mit Amino-terminierten Linkern, wie erfindungsgemäß die L₄-NH-Gruppe, ist auf dem Fachgebiet der Polynukleotidsynthese bekannt, z. B. Gait, Herausgeber, Oligonucleotide Synthesis, Seiten 45 bis 49 (IRL Press, 1984), und tatsächlich sind CPG-Kügelchen, die mit einem Alkylamin mit einer primären Aminobeladung von etwa 100 mmol/g derivatisiert sind, käuflich erhältlich (Pierce Chemical Company, Rockford, IL). Kurz gesagt wird in dem Fall von Alkylaminosubstraten das CPG durch Umsetzen einer Suspension von CPG-Partikeln mit einem Aminoalkyltrimethoxysilan-Reagenz umgesetzt, gefiltert und getrocknet.
Ein zweiter bevorzugter Festträger ist nicht quellbares poröses Polystyrol, z. B. US-PS 5,047,524 . Wie hierin verwendet, bedeutet "nicht quellbar", dass das poröse Polystyrol-Material im Wesentlichen mechanisch starr bleibt, insbesondere dass es nicht zusehends an Volumen zunimmt, wenn es Polynukleotidsynthese-Reagenzien ausgesetzt wird. Wie hierin verwendet, bedeutet "porös", dass das nicht quellbare Polystyrol Poren enthält, die im Wesentlichen gleichförmige Durchmesser von 100 bis 4000 Å aufweisen.
Der Polystyrolträger ist durch Standardverfahren aminoderivatisiert, z. B. Wallace et al., Seiten 638 bis 639 in Scouten Herausgeber, Solid Phase Biochemistry (John Wiley & Sons, 1980), Wright et al., Tet. Lett., 34: 3373–3376 (1993), Bayer et al., US-PS 4,908,405 , Applied Biosystems Research News, Modell 390Z, Februar 1994. Kurz gesagt wird in einem bevorzugten Verfahren Hydroxymethylphthalimid mit dem Polystyrolträger mit einer katalytischen Menge an Methylsulfonsäure umgesetzt, um ein Phthalimidomethylpolystyrol zu bilden. Dieses Material wird sodann mit Hydrazin behandelt, um die Phthalimid-Schutzgruppe zu entfernen, was aminomethyliertes Polystyrol ergibt. Typischerweise variiert die Aminobeladung von 10 bis 60 μmol an Aminofunktionalität pro Gramm an nicht quellbarem porösem Polystyrol. Die Beladungsmenge kann dadurch gesteuert werden, dass die Konzentrationen der Reagenzien und Reaktionszeitspannen angepasst werden.
Eine kürzlich entwickelte alternative Chemie zum Derivatisieren von Polystyrol ersetzt die terminale Aminogruppe durch eine freie Hydroxylgruppe durch Anbinden von mehreren Polyoxyethylen-Resten oder -Ketten, die freie Hydroxylgruppen aufweisen, die zum Koppeln mit dem Polynukleotid fähig sind, z. B. Bayer und Rapp, US-PS 4,908,405 , Gao et al., Tetrahedron Lett. 32(40): 5477–5480 (1991).
In einer dritten bevorzugten Ausführungsform ist W ein organischer Nicht-Polystyrol-Polymerträger. Der Polymerträger kann von natürlich auftretenden Materialien, die synthetisch modifiziert werden, und/oder synthetischen Materialien abstammen. Von besonderem Interesse sind Polysaccharide, insbesondere vernetzte Polysaccharide, wie z. B. Agarose, die als Sepharose^TM erhältlich ist, Dextran, das als Sephadex^TM erhältlich ist, Cellulose und Stärke. Andere geeignete Materialien umfassen z. B. Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Silikone und Teflons^TM.
T betrifft allgemein eine säurespaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe. Vorzugsweise ist T der Triphenylmethyl-Rest und seine Elektronen zuführenden substituierten Derivate, wobei, wie hierin verwendet, der Begriff "Elektronen zuführend" die Tendenz eines Substituenten bezeichnet, Valenzelektronen an Nachbaratome in dem Molekül, von dem er ein Teil ist, abzugeben, d. h. er ist hinsichtlich der Nachbaratome elektropositiv. Vorzugsweise umfassen Elektronen zuführende Substituenten z. B. Amino-, Niederalkylgruppen mit ein bis 8 Kohlenstoffatomen, Niederarylgruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und Alkoxygruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen. Mehr bevorzugt sind die Elektronen zuführenden Substituenten Methoxygruppen. Beispielhafte Tritylgruppen umfassen 4,4'-Dimethoxytrityl- (d. h. Bis(p-anisyl)phenylmethyl-), Monomethoxytrityl-, α-Naphthyldiphenylmethyl- und Tri(p-methoxyphenyl)methylgruppen. Anbindungs- und Abspaltungsbedingungen für diese und andere Tritylgruppen finden sich in Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe (John Wiley, New York, 1991).
Die Linker L₁, L₂, L₃ und L₄ sind verbindende Gruppen, die zum Verbinden von verschiedenen Elementen der erfindungsgemäßen Verbindungen dienen. Insbesondere dient L₁ dazu, das 3'-terminale Stickstoffatom des synthetischen Polynukleotids mit dem Polynukleotid selbst zu verbinden, L₂ und L₃ dienen dazu, ein Kohlenstoffatom und ein Sauerstoffatom zu verbinden, und L₄ dient dazu, den Festträger mit einem Stickstoffatom zu verbinden. Ein zusätzlicher Zweck der Linker L₁ bis L₄ besteht in der Bereitstellung einer geeigneten Beabstandung zwischen der Markierung, dem Festträger und dem Oligonukleotid, um (i) das Ausmaß zu vermindern, zu dem die Markierung mit einer Hybridisierung des Polynukleotids mit einem komplementären Ziel wechselwirkt, (ii) das Ausmaß zu vermindern, zu dem die Markierung und/oder der Festträger mit der Synthese des Polynukleotids wechselwirkt, und (iii) die Integrität der Markierung während einer Polynukleotidsynthese zu schützen.
Vorzugsweise sind die Linker L₁ bis L₄ unabhängig voneinander Niederalkyl-, Niederalkylenoxid-, Amid-, Carbamat-, Sulfonamid-, Harnstoff-, Succinat- oder andere Dicarbonsäure-Derivate oder eine jegliche Kombination davon, wobei wie hierin verwendet, eine Alkylamidgruppe Gruppen mit der Struktur
betrifft, worin n von 0 bis 20 reicht, und Dicarbonsäure-Derivate Gruppen mit der Struktur
betreffen, worin n von 2 bis 20 reicht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist n 2, d. h. der Linker ist eine Succinatgruppe. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "Niederalkylgruppe" geradkettige, verzweigtkettige und cyclisierte Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und der Begriff "Niederalkylenoxidgruppe" betrifft geradkettige, verzweigtkettige und cyclisierte Alkylenoxidgruppen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, z. B. Polyethylenoxid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist L₁ eine n-Butyl- oder n-Hexylamidgruppe, L₂ und L₃ sind jeweils eine Methylengruppe und L₄ ist eine Methylengruppe, wenn W Polystyrol ist, und L₄ ist eine Aminopropylsuccinylhexylamingruppe, wenn W CPG ist.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen bevorzugten verbindenden Gruppen ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Linker L₃ eine Gruppe mit einer inneren Spaltstelle, die, wenn sie gespalten wird, eine zusätzliche Stelle zum Markieren eines Oligonukleotids bereitstellt, sobald es von dem Träger abgespalten wurde. Eine beispielhafte für diesen Zweck verwendbare Gruppe ist eine Gruppe mit einer Disulfidbindung, die, wenn sie mit Dithiothreitol (DTT) gespalten wird, eine -SH-Gruppe bildet. Eine besonders bevorzugte L₃-Gruppe weist die Struktur -CH₂-S-S-CH₂- auf.
Die Substituenten R₃ bis R₇ sind Kohlenstoffatomsubstituenten. Vorzugsweise sind R₃ bis R₇ unabhängig voneinander Niederalkylgruppen oder Wasserstoffatome. Mehr bevorzugt sind R₃ bis R₇ Wasserstoffatome.
R₁ und R₂ sind Stickstoffatomsubstituenten, die stark variieren können, abhängig von der Art des gewünschten Endprodukts. Es wird anerkannt werden, dass, da R₁ und R₂ keine zentralen erfindungsgemäßen Merkmale darstellen und eine allgemeine Funktion bereitstellen, R₁ eine große Vielzahl von Formen aufweisen kann. R₁ und R₂ werden derart ausgewählt, dass das gebundene Stickstoffatom während einer Synthese und einer anschließenden Oligonukleotidabspaltung chemisch stabil ist. Außerdem sind R₁ und R₂ selbst hinsichtlich Standardpolynukleotidsynthese-Reagenzien stabil.
Falls eine reaktive Aminogruppe nach einer Polynukleotidabspaltung erwünscht ist, sollten R₁ und R₂ nicht wesentlich mit der Stickstoffatomreaktivität wechselwirken. In diesem Fall ist eine der Gruppen R₁ und R₂ vorzugsweise eine Niederalkylgruppe, ein Wasserstoffatom oder eine Stickstoffatom-Schutzgruppe, z. B. FMOC, tBOC oder andere ähnliche Stickstoffatom-Schutzgruppen. Am meisten bevorzugt ist eine der Gruppe R₁ und R₂ ein Wasserstoffatom.
In dem Fall, in dem entweder eine der Gruppen R₁ oder R₂ oder beide Markierungen sind, die vor einer Polynukleotidsynthese als Teil eines direkten Markie rungsverfahrens eingebaut werden, sollte die Markierung in Gegenwart von DNA-Synthesereagenzien und milden Abspaltungsreagenzien stabil sein. Solche Markierungen umfassen z. B. Fluorophore, Enzyme, Biotin, Interkalatoren, Vernetzungsmittel, Nukleinsäureabspaltungsreagenzien und Modifizierungsmittel einer zellulären Aufnahme. Vorzugsweise ist die Markierung ein Rhodamin-Farbstoff, z. B. Tetramethylrhodamin.
Eine genaue Beschreibung der Chemie, die zum Bilden von Polynukleotiden verwendet wird, wird an anderer Stelle bereitgestellt, z. B. Caruthers et al., US-PS 4,458,066 , Caruthers et al., US-PS 4,415,732 , Caruthers et al., Genetic Engineering, 4: 1–17 (1982), Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, Seiten 6-1 bis 6-22, Applied Biosystems, Teil Nr. 901237 (1991).
Das Phosphoramiditverfahren einer Polynukleotidsynthese ist aufgrund seiner wirksamen und schnellen Kopplung und der Stabilität der Ausgangsmaterialien das bevorzugte Verfahren. Die Synthese erfolgt unter Bindung der wachsenden Polynukleotidkette an einen Festträger, so dass ein Überschuss an Reagenzien, die in der flüssigen Phase vorliegen, leicht durch Filtration entfernt werden kann, wodurch der Bedarf an Aufreinigungsschritten zwischen den Zyklen vermieden wird.
Das Nachstehende beschreibt kurz die Schritte eines typischen Polynukleotidsynthesezyklus unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens. Zuerst wird der Festträger mit Säure, z. B. Trichloressigsäure, behandelt, um die Hydroxyl-Schutzgruppe T zu entfernen, was die Hydroxylgruppe für eine anschließende Kopplungsreaktion freisetzt. Eine aktivierte Zwischenverbindung wird sodann durch gleichzeitige Zugabe des geschützten Phosphoramiditnukleosid-Monomers und einer schwachen Säure, z. B. Tetrazol, zu der Reaktion gebildet. Die schwache Säure protoniert das Stickstoffatom des Phosphoramidits, wodurch eine reaktive Zwischenverbindung gebildet wird. Eine Nukleosidaddition ist innerhalb von 30 Sekunden abgeschlossen. Sodann erfolgt ein Capping-Schritt, der jegliche Polynukleotidketten terminiert, die keine Nukleosidaddition unterliefen. Ein Cappen erfolgt vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid und 1-Methylimidazol. Die Internukleotidbindung wird sodann von dem Phosphit zu dem stabileren Phosphotriester durch Oxidation unter Verwendung von Iod als dem bevorzugten Oxidationsmittel und Wasser als dem Sauerstoffdonor umgewandelt. Nach Oxidation wird die Hydroxyl-Schutzgruppe mit einer protischen Säure, z. B. Trichlor essigsäure oder Dichloressigsäure, entfernt und der Zyklus wird wiederholt, bis eine Kettenverlängerung abgeschlossen ist. Nach einer Synthese wird die Polynukleotidkette von dem Träger unter Verwendung einer Base, z. B. Ammoniumhydroxid oder t-Butylamin, abgespalten. Die Abspaltungsreaktion entfernt auch jegliche Phosphat-Schutzgruppen, z. B. Cyanethylgruppen. Schließlich werden die Schutzgruppen an den exocyclischen Aminen der Basen durch Behandeln der Polynukleotidlösung in Base bei einer erhöhten Temperatur, z. B. 55°C, entfernt.
BEISPIELE
Die Erfindung wird durch eine Betrachtung der nachstehenden Beispiele weiter verdeutlicht, die nur beispielhaft für die Erfindung sein und in keiner Weise deren Umfang begrenzen sollen.
BEISPIEL 1 (Vergleichsbeispiel)
Synthese von TAMRA-Farbstoff-markiertem CPG-Träger der Struktur 14a. (vgl. 1)
Synthese der Verbindung 9: Serinol (773 mg, 8,50 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (574 mg, 4,25 mmol), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (1,61 g, 4,25 mmol) und Diisopropylethylamin (1,68 g, 13 mmol) wurden zu einer gerührten Lösung von 6-N-Fmoc-ε-aminocapronsäure in DMF (20 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre zwei Stunden gerührt. DMF wurde durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (100 ml) gelöst und mit 5%iger wässriger HCl (1 × 50 ml), H₂O (1 × 50 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (1 × 50 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und verdampft, um ein Öl zu ergeben, das in EtOH (10 ml) gelöst und eingefroren wurde. Die Verbindung 9 kristallisierte als farblose feine Nadeln (1,2 g, 66%). ¹H-NMR (CDCl₃) d: 1,35 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,66 (m, 2H), 2,23 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,18 (m, 2H), 3,74 (dd, J = 11,1, 4,2 Hz, 2H), 3,82 (dd, J = 11,1, 3,9 Hz, 2H), 3,95 (m, 1H), 4,20 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 5,00 (bs, 1H), 6,40 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,28–7,43 (m, 4H), 7,58 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 7,2 Hz, 2H).
Synthese der Verbindung 10: Eine Lösung von Dimethoxytritylchlorid (1,16 g, 3,43 mmol) in trockenem Pyridin (20 ml) wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung der Verbindung 9 (1,33 g, 3,12 mmol) in Pyridin (20 ml) bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gegeben. Die Zugabe war in 30 Minuten abgeschlossen. Der Kolben wurde verschlossen und bei Raumtemperatur 48 Stunden gerührt. Eine DSC zeigte das Vorhandensein von Ausgangsmaterial und dem Produkt 10. Pyridin wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde in CHCl₃ (50 ml) gelöst und mit H₂O (1 × 30 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (1 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und verdampft, um ein gelbliches Öl zu ergeben. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie auf Silicagel isoliert, wobei mit 1% MeOH in CHCl₃ eluiert wurde. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und verdampft, was einen farblosen Schaum (1,31 g, 57%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃) d: 1,26 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,62 (m, 2H), 2,16 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,85 (bs, 1H), 3,16 (m, 2H), 3,28 (dd, J = 9,9, 4,8 Hz, 1H), 3,33 (dd, J = 9,9 Hz, 4,5 Hz, 1H), 3,68 (m, 1H), 3,74 (s, 6H), 3,81 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 4,19 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 4,91 (bs, 1H), 5,95 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,7 Hz, 4H), 7,20–7,42 (m, 13H), 7,58 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,75 (d, J = 7,2 Hz, 2H).
Synthese des Succinats 11: Bernsteinsäureanhydrid (82 mg, 0,82 mmol), Et₃N (69 mg, 0,68 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (42 mg, 0,34 mmol) wurden zu einer Lösung der Verbindung 10 (500 mg, 0,68 mmol) in CH₂Cl₂ (15 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur drei Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH₂Cl₂ (30 ml) verdünnt und mit 5%iger wässriger Zitronensäure (1 × 30 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (2 × 30 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und verdampft, um einen Schaum zu ergeben. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie auf Silicagel aufgereinigt, wobei mit einem CHCl₃-MeOH-Gradienten (0 bis 5% MeOH) eluiert wurde. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und verdampft, um die Verbindung 11 als einen farblosen Schaum (439 mg, 78%) zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl₃) d: 1,25 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,60 (m, 2H), 2,18 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,52 (s, 4H), 3,13 (m, 3H), 3,25 (dd, J = 8,7, 4,0 Hz, 1H), 3,78 (s, 6H), 4,22 (m, 2H), 4,41 (m, 4H), 5,00 (nicht aufgelöstes t, 1H), 6,10 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,80 (d, J = 8,5 Hz, 4H), 7,19–7,41 (m, 13H), 7,56 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,75 (d, J = 7,2 Hz, 2H).
Synthese des TAMRA-Farbstoff-markierten CPG-Trägers 14a: Ein Gemisch aus CPG (500 Å, 40 μmol/g Aminbeladung, 1 g, 40 μmol (ABD)), Verbindung 11 (67 mg, 80 μmol), 1-Hydroxybenzotriazol (11 mg, 80 μmol), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (30 mg, 80 μmol), Diisopro pylethylamin (16 mg, 120 μmol) in DMF (8 ml) wurde auf einem Wrist-Action-Schüttler vier Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte 6 μmol/g an auf dem Träger verbliebenem Amin. Der Träger wurde mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) zwei Stunden bei Raumtemperatur gecappt.
Der Träger 12a wurde mit CH₃CN (3 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und sodann mit 20%igem Piperidin in DMF (3 × 10 ml, 10 Minuten pro Waschgang) behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, was den Träger 13a ergab. Die Entfernung der Fmoc-Gruppe wurde durch Messen der UV-Absorption der Lösung bei 302 nm überwacht. Der Träger 13a wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Der Träger (500 mg, 16 μmol) wurde sodann mit TAMRA-NHS-Ester (ABD, p/n 400981) (26 mg, 49 μmol) und Et₃N (10,1 mg, 100 μmol) in DMF (5 ml) 42 Stunden auf einem Schüttler behandelt, um den Farbstoff-markierten Träger 14a zu ergeben. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte 1 μmol/g an verbliebenem Amin. Der Träger wurde sodann mit einem in THF gelösten Essigsäureanhydrid/Lutidin-Gemisch (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) eine Stunde gecappt, mit CH₃CN (3 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (2 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Der Tritylkation-Test zeigte eine Endbeladung von 30,3 μmol/g.
BEISPIEL 2 (Vergleichsbeispiel)
Synthese des TAMRA-Farbstoff-markierten Polystyrol-Trägers der Struktur 14b (vgl. 1)
Hochvernetztes Polystyrol (1000 Å, 10 μmol/g Aminbeladung, 2 g, 20 μmol (ABD)) wurde mit der Verbindung 11 aus Beispiel 1 (34 mg, 40 μmol), 1-Hydroxybenzotriazol (5,5 mg, 40 μmol), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (15 mg, 40 μmol) und Diisopropylethylamin (8 mg, 60 μmol) in DMF (10 ml) auf einem Wrist-Action-Schüttler vier Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte 0,6 μmol/g an auf dem Träger verbliebenem Amin. Der Träger wurde mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) zwei Stunden bei Raumtemperatur gecappt. Der Träger 12b wurde mit CH₃CN (3 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen. Ein Tritylkation-Test ergab eine Beladung der Verbindung 11 auf dem Polystyrol-Träger von 9 μmol/g. Der Träger 12b wurde sodann mit 20%igem Piperidin in DMF (3 × 10 ml, 10 Minuten pro Waschgang) behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, was den Träger 13b ergab. Die Entfernung der Fmoc-Gruppe wurde durch Messen der UV-Absorption der Lösung bei 302 nm überwacht. Der Träger 13b wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Der Träger (1 g, 9 μmol) wurde sodann mit TAMRA-NHS-Ester (15 mg, 28,5 μmol) und Et₃N (8,6 mg, 85 μmol) in DMF (10 ml) bei Raumtemperatur 36 Stunden auf einem Schüttler behandelt, um den Träger 14b zu ergeben. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte weniger als 0,5 μmol/g an verbliebenem Amin. Der Träger wurde sodann mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) eine Stunde gecappt und sodann mit CH₃CN (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (2 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Der Tritylkation-Test zeigte eine Endbeladung von 8,8 μmol/g.
BEISPIEL 3
Synthese des TAMRA-Farbstoff-markierten CPG-Trägers der Struktur 18a (vgl. 2)
Synthese der 1-O-Dimethoxytrityl-2-(N-Fmoc-4-aminobutyl)-1,3-propandiol-Verbindung 4: Verbindung 4 wurde nach dem Verfahren synthetisiert, das von Nelson et al., Nucleic Acid Research 20: 6253–6259 (1992), beschrieben wurde. Eine Lösung an Dimethoxytritylchlorid (3,66 g, 10,82 mmol) in trockenem Pyridin (60 ml) wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung an 2-(N-Fmoc-aminobutyl)-1,3-propandiol (4,0 g, 10,82 mmol) in Pyridin (50 ml) bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gegeben. Die Zugabe war in zwei Stunden abgeschlossen. Der Kolben wurde verschlossen und bei Raumtemperatur 48 Stunden gerührt. Eine DSC zeigte das Vorhandensein von Ausgangsmaterial und dem Produkt 4. Pyridin wurde durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in CHCl₃ (100 ml) gelöst und mit H₂O (1 × 100 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (1 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und verdampft, um ein gelbliches Öl zu ergeben. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie auf Silicagel isoliert, wobei mit 1% MeOH in CHCl₃ eluiert wurde. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und zu einem farblosen Schaum (3,4 g, 46%) verdampft. ¹H-NMR (CDCl₃) d: 1,15–1,45 (m, 6H), 1,88 (m, 1H), 2,44 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 3,07 (dd, J = 9,3, 7,5 Hz, 1H), 3,12 (m, 2H), 3,29 (dd, J = 9,3, 4,2 Hz, 1H), 3,64 (m, 2H), 3,78 (s, 6H), 4,20 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 4,72 (nicht aufgelöstes t, 1H), 6,82 (d, J = 9,0 Hz, 4H), 7,25–7,43 (m, 13H), 7,58 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,75 (d, J = 7,2 Hz, 2H).
Synthese des Diglykolats 15: Eine Lösung an Diglykolsäureanhydrid (81 mg, 0,94 mmol) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurde tropfenweise zu einem Gemisch aus Et₃N (90 mg, 0,89 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (45 mg, 0,37 mmol) und der Verbindung 4 (500 mg, 0,74 mmol) in CH₂Cl₂ (15 ml) bei 0°C (Eisbad) unter Argonatmosphäre gegeben. Nach Abschluss der Zugabe (10 Minuten) wurde das Eisbad entfernt und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CHCl₃ (30 ml) verdünnt und mit 5%iger wässriger Zitronensäure (1 × 50 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (2 × 50 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und verdampft, um einen Schaum zu ergeben. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie auf Silicagel aufgereinigt, wobei mit einem CHCl₃-EtOH-Gradienten (2 bis 10% EtOH) eluiert wurde. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und verdampft, um die Verbindung 15 als einen farblosen Schaum (354 mg, 60%) zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl₃) d: 1,00–1,25 (m, 6H), 1,75 (m, 1H), 2,88 (m, 4H), 3,70 (s, 6H), 3,96 (s, 2H), 4,04 (s, 2H), 4,13 (m, 3H), 4,31 (d, J = 6,9 Hz), 5,18 (bs, 1H), 6,74 (d, J = 8,7 Hz, 4H), 7,18–7,34 (m, 13H), 7,53 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,67 (d, J = 7,5 Hz, 2H).
Synthese des TAMRA-Farbstoff-markierten CPG-Trägers 18a: Ein Gemisch aus CPG (500 Å, 40 μmol/g an Aminbeladung, 2 g, 80 μmol), der Verbindung 15 (126 mg, 160 μmol), 1-Hydroxybenzotriazol (22 mg, 160 μmol), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (61 mg, 160 μmol) und Diisopropylethylamin (35 mg, 270 μmol) in DMF (10 ml) wurde auf einem Wrist-Action-Schüttler vier Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte 3 μmol/g an auf dem Träger verbliebenem Amin. Der Tritylkation-Test ergab eine Beladung der Verbindung 15 auf dem CPG-Träger von 37,5 μmol/g. Der Träger wurde mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) zwei Stunden bei Raumtemperatur gecappt. Der Träger 16a wurde mit CH₃CN (3 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und sodann mit 20%igem Piperidin in DMF (3 × 10 ml, 10 Minuten pro Waschgang) behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, was den Träger 17a mit einer freien Aminogruppe ergab. Die Entfernung der Fmoc-Gruppe wurde durch Messen der UV-Absorption der Lösung bei 302 nm überwacht. Der Träger 17a wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Der Träger 17a (500 mg, 19 μmol) wurde sodann mit TAMRA-NHS-Ester (30 mg, 57 μmol) und Et₃N (13,1 mg, 130 μmol) in DMF (5 ml) 42 Stunden auf einem Schüttler behandelt, um den Farbstoff-markierten Träger 18a zu ergeben. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte, dass 1 μmol/g Amin auf dem Träger verblieben war. Der Träger wurde sodann mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) eine Stunde gecappt und sodann mit CH₃CN (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (2 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Der Tritylkation-Test zeigte eine Endbeladung von 36 μmol/g.
BEISPIEL 4
Synthese des TAMRA-Farbstoff-markierten Polystyrol-Trägers der Struktur 18b (vgl. 2)
Hochvernetztes Polystyrol (1000 Å, 10 μmol/g Aminbeladung, 2 g, 20 μmol) wurde mit der Verbindung 15 (32 mg, 40 μmol), 1-Hydroxybenzotriazol (5,5 mg, 40 μmol), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (15 mg, 40 μmol) und Diisopropylethylamin (8 mg, 60 μmol) in DMF (10 ml) auf einem Wrist-Action-Schüttler 4 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte 0,5 μmol/g an auf dem Träger verbliebenen Amin. Der Träger wurde mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazal in THF (16%ige Lösung, 5 ml) zwei Stunden bei Raumtemperatur gecappt. Der Träger 16b wurde mit CH₃CN (3 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen. Ein Tritylkation-Test ergab eine Beladung der Verbindung 15 auf dem Polystyrol-Träger von 9 μmol/g. Der Träger 16b wurde mit 20%igem Piperidin in DMF (3 × 10 ml, 10 Minuten pro Waschgang) behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, was den Träger 17b ergab. Der Träger 17b wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Der Träger 17b (1 g, 9 μmol) wurde mit TAMRA-NHS-Ester (15 mg, 28,5 μmol) und Et₃N (8,6 mg, 85 μmol) in DMF (10 ml) bei Raumtemperatur 36 Stunden auf einem Schüttler behandelt, um den Träger 18b zu ergeben. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte weniger als 0,5 μmol/g an verbliebenem Amin. Der Träger wurde sodann mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) eine Stunde gecappt und sodann mit CH₃CN (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (2 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Der Tritylkation-Test zeigte eine Endbeladung von 8,7 μmol/g.
BEISPIEL 5
Synthese des TAMRA-Farbstoff-markierten CPG-Trägers der Struktur 22a (vgl. 3)
Synthese des Diglykolats 19: Eine Lösung an Diglykolsäureanhydrid (64 mg, 0,55 mmol) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurde zu einem Gemisch aus Et₃N (67 mg, 0,66 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (34 mg, 0,28 mmol) und der Verbindung 10 (400 mg, 0,55 mmol) in CH₂Cl₂ (15 ml) bei 0°C unter Argonatmosphäre gegeben. Nach Abschluss der Zugabe (10 Minuten) wurde das Eisbad entfernt und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH₂Cl₂ (30 ml) verdünnt und mit 5%iger wässriger Zitronensäure (1 × 50 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (2 × 50 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und verdampft, um einen Schaum zu ergeben. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie auf Silicagel aufgereinigt, wobei mit einem CHCl₃-EtOH-Gradienten (2 bis 10% EtOH) eluiert wurde. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und verdampft, um die Verbindung 19 als einen farblosen Schaum (260 mg, 56%) zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl₃) d: 1,20 (m, 2H), 1,39 (m, 2H), 1,58 (m, 2H), 2,18 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,90–3,25 (m, 4H), 3,80 (s, 6H), 3,86 (s, 4H), 4,00–4,40 (m, 6H), 4,85 (nicht aufgelöstes t, 1H), 5,92 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 8,1 Hz, 4H), 7,20–7,40 (m, 13H), 7,52 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,69 (d, J = 7,2 Hz, 2H).
Synthese des TAMRA-Farbstoff-markierten CPG-Trägers 22a: Ein Gemisch aus CPG (500 Å, 33 μmol/g Aminbeladung, 1 g, 33 μmol), der Verbindung 19 (56 mg, 66 μmol), 1-Hydroxybenzotriazol (9 mg, 66 μmol), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (25 mg, 66 μmol) und Diisopropylethylamin (13 mg, 100 μmol) in DMF (6 ml) wurde auf einem Wrist-Action-Schüttler vier Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Träger wurde mit DMF (3 × 8 ml), CH₃CN (2 × 8 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 8 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte 3 μmol/g an auf dem Träger verbliebenem Amin. Der Tritylkation-Test ergab eine Beladung der Verbindung 19 auf dem CPG-Träger von 29 μmol/g. Der Träger wurde mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 3 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 3 ml) zwei Stunden bei Raumtemperatur gecappt. Der Träger 20a wurde mit CH₃CN (3 × 8 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 8 ml) gewaschen und sodann mit 20%igem Piperidin in DMF (3 × 5 ml, 10 Minuten pro Waschgang) behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, was den Träger 21a mit einer freien Aminogruppe ergab. Der Träger 21a wurde mit DMF (3 × 8 ml), CH₃CN (2 × 8 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 8 ml) gewaschen und unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Der Träger 21a (500 mg, 15 μmol) wurde sodann mit TAMRA-NHS-Ester (24 mg, 45 μmol) und Et₃N (11 mg, 110 μmol) in DMF (5 ml) 42 Stunden auf einem Schüttler behandelt, um den Farbstoff-markierten Träger 22a zu ergeben. Der Träger 22a wurde mit DMF (3 × 8 ml), CH₃CN (2 × 8 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 8 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte 1,2 μmol/g an auf dem Träger verbliebenem Amin. Der Träger wurde sodann mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 3 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 3 ml) eine Stunde gecappt und sodann mit CH₃CN (3 × 8 ml), CH₂Cl₂ (2 × 8 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Der Tritylkation-Test zeigte eine Endbeladung von 28 μmol/g.
BEISPIEL 6
Synthese des TAMRA-Farbstoff-markierten Polystyrol-Trägers der Struktur 22b (vgl. 3)
Hochvernetztes Polystyrol (1000 Å, 10 μmol/g Aminbeladung, 1 g, 10 μmol) wurde mit der Verbindung 19 (17 mg, 20 μmol), 1-Hydroxybenzotriazol (3 mg, 20 μmol), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (8 mg, 20 μmol) und Diisopropylethylamin (8 mg, 60 μmol) in DMF (10 ml) auf einem Wrist-Action-Schüttler vier Stunden bei Raumtemperatur behandelt, um 20b zu ergeben. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte 0,5 μmol/g an auf dem Träger verbliebenem Amin. Der Träger wurde mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) zwei Stunden bei Raumtemperatur gecappt. Der Träger 20b wurde mit CH₃CN (3 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen. Ein Tritylkation-Test ergab eine Beladung der Verbindung 19 auf dem Polystyrol-Träger von 9,2 μmol/g. Der Träger 20b wurde mit 20%igem Piperidin in DMF (3 × 10 ml, 10 Minuten pro Waschgang) behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, was den Träger 21b ergab. Der Träger 21b wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Der Träger 21b (1 g, 9,2 μmol) wurde mit TAMRA-NHS-Ester (15 mg, 28,5 μmol) und Et₃N (8,6 mg, 85 μmol) in DMF (10 ml) bei Raumtemperatur 36 Stunden auf einem Schüttler behandelt, um den Träger 22b zu ergeben. Der Träger wurde mit DMF (3 × 10 ml), CH₃CN (2 × 10 ml) und CH₂Cl₂ (1 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Ein Ninhydrin-Test zeigte weniger als 0,5 μmol/g an auf dem Träger verbliebenem Amin. Der Träger wurde mit Essigsäureanhydrid/Lutidin in THF (10%ige Lösung, 5 ml) und 1-Methylimidazol in THF (16%ige Lösung, 5 ml) eine Stunde gecappt und sodann mit CH₃CN (3 × 10 ml), CH₂Cl₂ (2 × 10 ml) gewaschen und unter stark vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Der Tritylkation-Test zeigte eine Endbeladung von 8,8 μmol/g.
BEISPIEL 7
Synthese von doppelt Farbstoff-markierten Oligonukleotiden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Träger
Doppelt Farbstoff-markierte Oligonukleotide wurden unter Verwendung der TAMRA-markierten Träger 14a, 14b, 18a, 18b und 22a, den DNA-FastPhosphoramidites und den Fluoreszenzfarbstoff-Amiditen FAM, TET, HEX in 40 bis 1000 nmol-Maßstab synthetisiert, wobei "FAM" 6-Carboxyfluorescein betrifft, "TET" 6-Carboxy-4,7,2',7'-tetrachlorfluorescein betrifft und "HEX" 6-Carboxy-4,7,2',4',5',7'-hexachlorfluorescein betrifft. Eine automatisierte Oligonukleotidsynthese erfolgte auf einem Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA-Synthesegerät (ABD) gemäß den in der Betriebsanleitung beschriebenen allgemeinen Verfahren.
Die Oligonukleotidsequenz 5'>FAM-TCA CAG TCT GAT CTC GAT-TAMRA<3' wurde in einen 0,2 μmol-Maßstab unter Verwendung von TAMRA-markierten Trägern 18a und 22a, DNA-FastPhosphoramidites (User Bulletin Nr. 85, 1994, Applied Biosystems Division) und FAM-Amidit (User Bulletin Nr. 78, 1994, Applied Biosystems Division) synthetisiert. Der Standard 0,2 μmol-Synthesezyklus wurde dadurch leicht modifiziert, dass die Kopplungszeit des FAM-Amidits um zusätzliche 120 Sekunden verlängert wurde (User Bulletin Nr. 78, 1994, Applied Biosystems Division). Nach Abschluss der Synthese wurden Oligonukleotide automatisch von dem Träger durch Behandeln des Trägers mit einem Gemisch aus MeOH : t-BuNH₂ : HaO (1 : 1 : 2), vgl. z. B. US-PS 5,231,191 , unter Verwendung eines 1-stündigen Autoabspaltungsverfahrens ("END CE-Verfahren") abgespalten, wie in dem Bedienungshandbuch für das Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA-Synthesegerät beschrieben. Basen-Schutzgruppen wurden durch Erhitzen des Gemisches bei 85°C für eine Stunde oder bei 65°C für drei Stunden entfernt. Mehr als 99% der Oligonukleotide wurden von jedem der Träger abgespalten.
Die gleiche vorstehend beschriebene Oligonukleotidsequenz wurde auch auf dem 394 DNA/RNA-Synthesegerät in einem 40 nmol-Maßstab unter Verwendung von TAMRA-markiertem Träger 18b, DNA-FastPhosphoramidites (User Bulletin Nr. 85, 1994, Applied Biosystems Division) und FAM-Amidit (User Bulletin Nr. 78, 1994, Applied Biosystems Division) synthetisiert. In ähnlicher Weise wurde der Standard 40 nmol-Synthesezyklus leicht dadurch modifiziert, dass die Kopp lungszeit von FAM durch zusätzliche 120 Sekunden verlängert wurde (User Bulletin Nr. 78, 1994, Applied Biosystems Division). Mehr als 99% der Oligonukleotide wurden von jedem der Träger abgespalten.
TAMRA-markierte Träger 14a und 14b wurden auch für die Synthese des vorstehend beschriebenen Oligonukleotids in einem 0,2 μmol-Maßstab, wie vorstehend beschrieben, verwendet. Die Oligonukleotide wurden von den Trägern durch ein 2-stündiges Autoabspaltungsprotokoll (END RNA), wie in dem Benutzerhandbuch für das 394 DNA/RNA-Gerät beschrieben, unter Verwendung von MeOH : t-BuNH₂ : H₂O (1 : 1 : 2) abgespalten. Mehr als 92% des Oligonukleotids wurden von dem Träger in 2 Stunden abgespalten. Jedoch konnte das Oligonukleotid von dem Träger dadurch abgespalten und basenentschützt werden, dass das Träger-gebundene Oligonukleotid in 1 ml MeOH : t-BuNH₂ : H₂O (1 : 1 : 2) bei 85°C eine Stunde behandelt wurde. Mehr als 99% der Oligonukleotide wurden von jedem der Träger abgespalten. Die feste Trägermatrix, CPG oder Polystyrol, machte keinen Unterschied bei der Abspaltungsgeschwindigkeit des Oligonukleotids von dem Träger. Die Rohausbeute der vorstehend beschriebenen Oligonukleotide betrug 25 bis 30 ODU bei einem 0,2 μmol-Maßstab und 7 bis 10 ODU bei einem 40 nmol-Maßstab. Die nicht aufgereinigten Oligonukleotiden wurden sowohl durch HPLC mit reverser Phase als auch Anionenaustausch-HPLC analysiert.
Das HPLC-System mit reverser Phase, das zum Analysieren der Oligonukleotidprodukte verwendet wurde, war wie folgt: Perkin Elmer Serie 200 Lösungsmittelzuführsystem, ausgestattet mit einem ABI 783A programmierbaren Nachweisgerät, Perkin Elmer ISS200-Autosampler und PE Nelson 900 Serie Datensystem, RP-18 reverse Phase-Säule (220 × 4,6 mm, Applied Biosystems Division), Lösungsmittel A: 0,1 M Triethylammoniumacetat, Lösungsmittel B: CH₃CN, Gradient: 8 bis 20% B in 24 Minuten, 20 bis 40% B in 10 Minuten, 40 bis 8% B in 2 Minuten, 8% B für 7 Minuten, Flussrate: 1 ml/min, Nachweisgerät: 260 nm.
Das Anionenaustausch-HPLC-System, das zum Analysieren der Oligonukleotidprodukte verwendet wurde, war wie folgt: Perkin Elmer Serie 200 Lösungsmittelzuführsystem, ausgestattet mit einem ABI 783A programmierbaren Nachweisgerät, Perkin Elmer ISS200-Autosampler und PE Nelson 900 Serie Datensystem, Nucleopac PA-100-Säule (250 × 4 mm, Dionex Corporation), Lösungsmittel A: 20 mM LiClO₄ und 20 mM NaOAc in H₂O : CH₃CN (9 : 1, pH-Wert von 6,5), Lösungsmittel B: 600 mM LiClO₄ und 20 mM NaOAc in H₂O : CH₃CN (9 : 1, pH-Wert von 6,5), Flussrate 1 ml/min, Gradient: 0 bis 60% B in 40 Minuten, Nachweisgerät: 260 nm.
BEISPIEL 8
Enzymatische Analyse von in Beispiel 7 hergestellten doppelt Farbstoff-markierten Oligonukleotiden
Enzymatischer Verdau mit Schlangengiftphosphodiesterase und alkalischer Phosphatase: Schlangengiftphosphodiesterase (Crotalus adamanteus) und alkalische Phosphodiesterase (E. coli) wurden von Pharmacia, Piscataway, NJ, bezogen. Schlangengiftphosphodiesterase wurde als Pulver erhalten, das in Wasser bei 1 mg/ml gelöst wurde. Ein Verdaugemisch (55 μl) für jede Probe wurde durch Mischen der nachstehenden Reagenzien hergestellt: Wasser (44 μl), 1 M MgCl₂ (0,8 μl), 0,5 M Tris-Puffer, pH-Wert von 7,5 (3,5 μl), alkalische Phosphatase (4,0 μl) und Schlangengiftphosphodiesterase (2,4 μl). Typischerweise wurden 0,2 bis 0,4 A₂₆₀ an Oligoribonukleotid in einem Verdaugemisch gelöst und bei 37°C 8 Stunden erhitzt. Nach Inkubation wurden 3 M Natriumacetat (7 μl) und Ethanol (155 μl) zu jeder Probe gegeben. Jede Probe wurde vortexiert, auf Trockeneis 10 Minuten abgekühlt und sodann 10 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden vorsichtig in einen Satz neuer Röhrchen überführt und Ethanol (452 μl) wurde zu jeder Probe gegeben. Die Proben wurden vortexiert und auf Trockeneis 10 Minuten abgekühlt und 10 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden vorsichtig in einen Satz neuer Röhrchen überführt. Proben wurden zur Trockne unter vermindertem Druck verdampft. Jede Probe wurde in Wasser (60 μl) gelöst und durch HPLC mit reverser Phase, wie nachstehend beschrieben, analysiert.
Reverse Phase HPLC-Analyse von enzymatischen Verdauansätzen: Die HPLC-Analysen erfolgten auf einem Applied Biosystems 400 Lösungsmittelzuführsystem, ausgestattet mit einem ABI 783A programmierbaren Nachweisgerät, Perkin Elmer ISS200-Autosampler und PE Nelson 900 Serie Datensystem. Eine Applied Biosystems RP-18 reverse Phase-Säule (220 × 4,6 mm) wurde verwendet. Das Nachweisgerät wurde auf 260 nm eingestellt, 3% Acetonitril in 0,1 M Triethylammoniumacetat war Lösungsmittel A und 90% Acetonitril in Wasser war Lösungsmittel B. Der Gradient betrug 100% A für 5 Minuten, 100 bis 90% A in 30 Minuten, 90 bis 0% A in 30 Minuten, 100% B für 5 Minuten, 0 bis 100% A in 2 Minuten, 100% A für 15 Minuten bei einer Flussrate von 0,5 ml/min. Die Reihenfolge einer Elution war dC, dG, T, dA, 6-Carboxyfluorescein-(6-hydroxyhexyl amid), Thymidin-TAMRA-Linker-Konjugat. Die Untersuchung des enzymatischen Verdaus ergab eine erwartete Nukleosidzusammensetzung und zeigte keinerlei Basenmodifikation.
Obwohl lediglich wenige Ausführungsformen genau vorstehend beschrieben wurden, wird der Fachmann auf dem Gebiet der Polynukleotidsynthese klar verstehen, dass viele Modifikationen bei der bevorzugten Ausführungsform möglich sind, ohne von deren Lehre abzuweichen. Alle solchen Modifikationen sollen von den nachstehenden Ansprüche umfasst sein.

Claims

Syntheseträger für die Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden, umfassend eine Verbindung der Formel:
worin T eine säurespaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe ist, L₁ ein Linker zum Verbinden eines 3'-terminalen Stickstoffatoms mit einem Kohlenstoffatom ist, L₂ und L₃ Linker zum Verbinden eines Sauerstoffatoms und eines Kohlenstoffatoms sind, W ein Festträger ist, L₄ ein Linker zum Verbinden des Festträgers mit einem Stickstoffatom ist, R₁ und R₂ Stickstoffatomsubstituenten sind, einzeln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, geradkettigen, verzweigtkettigen und cyclischen Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, einer Stickstoffatom-Schutzgruppe oder einer Markierung, und R₃ bis R₇ Kohlenstoffatomsubstituenten sind, einzeln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom oder geradkettigen, verzweigtkettigen und cyclischen Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen.
Träger nach Anspruch 1, worin W kontrolliertes Porenglas (CPG) ist.
Träger nach Anspruch 2, worin L₄ die Struktur
aufweist.
Träger nach Anspruch 1, worin W nicht-quellbares Polystyrol ist.
Träger nach Anspruch 4, worin L₄ eine Methylengruppe ist.
Träger nach Anspruch 1, worin T eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist.
Träger nach Anspruch 1, worin L₁ die Struktur
aufweist, worin n von 0 bis 10 reicht.
Träger nach Anspruch 7, worin n 5 ist.
Träger nach Anspruch 1, worin L₂ und L₃ jeweils Methylengruppen sind.
Träger nach Anspruch 1, worin R₂ Tetramethylrhodamin ist.
Träger nach Anspruch 1, worin L₃ eine Disulfidbindung umfasst.
Träger nach Anspruch 1 für die Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden. umfassend eine Verbindung der Formel:
worin DMT eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und W nicht-quellbares Polystyrol ist.
Träger nach Anspruch 1 für die Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden, umfassend eine Verbindung der Formel:
worin DMT eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und W kontrolliertes Porenglas (CPG) ist.
Träger nach Anspruch 1 für die Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden, umfassend eine Verbindung der Formel:
worin DMT eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und W nicht-quellbares Polystyrol ist.
Träger nach Anspruch 1 für die Synthese von 3'-markierten Polynukleotiden, umfassend eine Verbindung der Formel:
worin DMT eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist und W kontrolliertes Porenglas (CPG) ist.
Verfahren zum Synthetisieren von 3'-markierten Polynukleotiden, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Syntheseträgers, umfassend eine Verbindung der Formel
worin T eine säurespaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe ist, L₁ ein Linker zum Verbinden eines 3'-terminalen Stickstoffatoms mit einem Kohlenstoffatom ist, L₂ und L₃ Linker zum Verbinden eines Sauerstoffatoms und eines Kohlenstoffatoms sind, W ein Festträger ist, L₄ ein Linker zum Verbinden des Festträgers mit einem Stickstoffatom ist, R₁ und R₂ Stickstoffatomsubstituenten sind, einzeln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, geradkettigen, verzweigtkettigen und cyclischen Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, einer Stickstoffatom-Schutzgruppe oder einer Markierung, und R₃ bis R₇ Kohlenstoffatomsubstituenten sind, einzeln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom oder geradkettigen, verzweigtkettigen und cyclischen Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, (b) Behandeln des Festträgers mit Säure, um die säurespaltbare Hydroxyl-Schutzgruppe zu entfernen, (c) Zusetzen eines geschützten Nukleosidmonomers und einer schwachen Säure, um eine Bindung zu bilden, (d) Cappen von nicht-umgesetzten Stellen auf dem Festträger, (e) Zusetzen eines Oxidationsmittels, (f) Wiederholen der Schritte (b) bis (e), bis die Polynukleotid-Kettenverlängerung vollständig ist, (g) Abspalten des Polynukleotids vom Festträger und (h) Entschützen des Polynukleotids.