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WO2022196675A1 - 複合体またはその塩、およびその製造方法 - Google Patents

複合体またはその塩、およびその製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2022196675A1
WO2022196675A1 PCT/JP2022/011534 JP2022011534W WO2022196675A1 WO 2022196675 A1 WO2022196675 A1 WO 2022196675A1 JP 2022011534 W JP2022011534 W JP 2022011534W WO 2022196675 A1 WO2022196675 A1 WO 2022196675A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
human ferritin
ferritin
modified
chain
human
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/011534
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English (en)
French (fr)
Inventor
慧 山田
豊 松田
一平 井之上
奈都紀 敷田
和高 新保
Original Assignee
味の素株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 味の素株式会社 filed Critical 味の素株式会社
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Priority to JP2023507124A priority patent/JPWO2022196675A1/ja
Publication of WO2022196675A1 publication Critical patent/WO2022196675A1/ja
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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain

Definitions

  • the present invention relates to a complex or a salt thereof, and a method for producing the same.
  • a ferritin particle is a globular protein with a lumen composed of multiple monomers that exists universally from animals and plants to microorganisms.
  • ferritin particles are composed of two types of monomers, H and L chains, and ferritin particles are multimers (mostly In the case of , it is a mixture of H and L chains) and is known to have a cage-like morphology with an outer diameter of 12 nm and a lumen with an inner diameter of 7 nm.
  • the N-terminus of the monomer constituting the ferritin particle is exposed on the surface of the 24-mer, the C-terminus of the monomer is not exposed on the surface and is present in the lumen.
  • Ferritin particles are deeply involved in the homeostasis of iron elements in living organisms or cells by being able to retain iron in their lumens and playing a role in physiological functions such as transportation and storage of iron. Since ferritin particles can dissociate and associate relatively easily, they take the form of 24-mers or monomers, or a form in which both of them coexist, depending on the conditions such as the solvent containing the ferritin particles. Therefore, by appropriately adjusting conditions such as a solvent containing ferritin particles, the 24-mer can be dissociated into monomers, and the dissociated monomers can be re-associated into 24-mers. . It is also known that, upon reassociation, a given substance can be enclosed in the lumen of the reassociated 24-mer by allowing a given substance to coexist with the ferritin monomer in a solvent.
  • ADC antibody drug conjugates
  • ADCs including the T-DM1 have had a problem of non-uniformity since the beginning of development. That is, the drug-antibody ratio (DAR) and conjugation position are not constant. It has been found that such random conjugation methods usually result in DARs in the range of 0 to 8, resulting in multiple antibody agents with different binding numbers of drugs. In recent years, it has been reported that changing the binding number and binding position of a drug to an ADC changes its pharmacokinetics, drug release rate, and effect. For these reasons, next-generation ADCs are required to control the number and positions of drugs to be conjugated. It is believed that a constant number and position solves the problem of expected efficiency, variations in conjugation drugs, lot differences, so-called regulation.
  • DAR drug-antibody ratio
  • Ferritin particles are also known to be complexed with antibodies.
  • Patent Document 1 reports a complex of an antibody (nanobody) and ferritin particles, in which a fusion protein of an antibody (nanobody) and a ferritin monomer is used as a monomer unit. Since this complex uses a fusion protein of antibodies and ferritin monomers, the ratio of antibodies and ferritin particles (antibody/ferritin particles) corresponds to the number of ferritin monomers that make up the ferritin particles. Therefore, if the ferritin particle is a homo24mer of a fusion protein of an antibody (nanobody) and a ferritin monomer, the number of antibodies per ferritin particle is 24.
  • Non-Patent Document 1 describes a complex of an IgG antibody and ferritin particles linked using glutaraldehyde. Since the method described in Non-Patent Document 1 uses glutaraldehyde to randomly introduce antibodies into ferritin particles, the linking sites in the ferritin particles for the antibodies (that is, the ferritin single used for linking with the antibodies) No regioselectivity is observed at both the site in the ferritin particle) and the linking site in the antibody to ferritin particles. In addition, the method described in Non-Patent Document 1 cannot control the number of antibodies per ferritin particle.
  • Non-Patent Document 2 describes a complex of covalently linked monoclonal antibodies and ferritin particles.
  • ferritin particles are constructed using a ferritin L chain mutated by gene recombination technology.
  • no regioselectivity is observed in the linking site in the ferritin particles for the antibody.
  • the method described in Non-Patent Document 2 cannot strictly control the number of antibodies introduced to ferritin particles to a specific value, and the number of antibodies per ferritin particle is 1 to 4.
  • a range of conjugates (a mixture of conjugates containing different proportions of antibody and ferritin particles) is generated.
  • Non-Patent Document 3 describes a complex of covalently linked monoclonal antibodies and ferritin particles. In this complex, there is no regioselectivity in the binding site of the antibody to ferritin particles. In addition, the regioselectivity of ferritin particle binding sites for antibodies is unknown. Furthermore, according to the method described in Non-Patent Document 3, antibodies are introduced to ferritin particles to produce a complex in which the number of antibodies per ferritin particle is 3.
  • All of the complexes of antibodies and ferritin particles described in the prior art described above are produced based on the technical idea of introducing a plurality of antibodies to ferritin particles, and the number of antibodies per ferritin particle is (antibody/ferritin particle) becomes a value of 1 or more.
  • a ferritin particle is a protein larger in size than an antibody, containing 24 ferritin monomer units available for linkage, and 24 ferritin monomers per ferritin particle can be used as modification sites. Therefore, the complexes described in the above-mentioned prior arts are designed based on a technical concept based on one ferritin particle, in which a plurality of antibodies are introduced into one ferritin particle.
  • the present inventors introduce a plurality of ferritin particles into a single antibody, rather than the above technical idea based on a single ferritin particle, which is to introduce a plurality of antibodies into a single ferritin particle.
  • the idea was to prepare a complex of an antibody and ferritin particles based on a single antibody.
  • human ferritin particles containing one or more human ferritin H chains and Ig antibodies are linked by a predetermined method to reduce the number of ferritin particles per antibody (ferritin particles (A) an IgG antibody, and (B) two human ferritin particles comprising one or more human ferritin heavy chains linked thereto, as a highly regulated complex of two (antibody/antibody) It has been found that a complex or a salt thereof can be produced comprising In such a complex, the number of antibodies per ferritin particle (antibody/ferritin particle) is 0.5, in contrast to the prior art described above.
  • the present inventors also found that by utilizing the thiol group (—SH) in the side chain of the cysteine residue of the human ferritin H chain, the 91st and/or 103rd
  • the sulfur atom in the side chain of the cysteine residue can be regioselectively modified with a modifying group, and the number and position of the modifying groups introduced on the ferritin surface can be easily and highly controlled, and this technology can be used to , found that an IgG antibody can be easily introduced regioselectively to the sulfur atoms in the side chains of the cysteine residues at positions 91 and/or 103 according to the standard positions of the natural human ferritin H chain.
  • the prior art neither teaches nor suggests the technical idea of controlling the positions of the modifying groups and antibodies introduced onto the ferritin surface.
  • the present inventors have further developed human ferritin particles in the side chains of specific lysine residues of IgG antibodies by utilizing the amino groups (—NH 2 ) in the side chains of specific lysine residues in IgG antibodies. It was found that it can be easily introduced regioselectively to the nitrogen atom of .
  • the present inventors have succeeded in providing a highly regulated complex containing an antibody and ferritin particles, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows. [1] A complex or a salt thereof, comprising (A) one IgG antibody and (B) two human ferritin particles containing one or more human ferritin H chains linked thereto. [2] The complex or salt thereof of [1], wherein the human ferritin particle is a 24-mer of human ferritin H chain.
  • the complex is represented by the following formula (1): X1-L1-Y-L2-X2 (1)
  • X1 and X2 each represent a human ferritin particle containing one or more human ferritin H chains, Y is an IgG antibody; L1 and L2 each represent a linker, Two human ferritin particles, denoted by X1 and X2, are connected to each other via an atom in the side chain of an amino acid residue present at the same position in the human ferritin H chain contained therein, denoted by L1 and L2.
  • the IgG antibody represented by Y is linked to two linkers represented by L1 and L2 via atoms in the side chains of amino acid residues at the same positions in the two heavy chain constant regions.
  • the complex or salt thereof according to any one of [4] to [8].
  • the complex of [9] or a salt thereof, wherein the atom in the side chain of the amino acid residue present at the same position in the two heavy chain constant regions is a nitrogen atom in the side chain of a lysine residue .
  • the bioorthogonal functional group to the protein is maleimide moiety, azide moiety, ketone moiety, aldehyde moiety, thiol moiety, alkene moiety, alkyne moiety, halogen moiety, tetrazine moiety, nitrone moiety, hydroxylamine moiety, nitrile moiety, hydrazine one or more partial structures selected from the group consisting of moieties, boronic acid moieties, cyanobenzothiazole moieties, allyl moieties, phosphine moieties, disulfide moieties, thioester moieties, ⁇ -halocarbonyl moieties, isonitrile moieties, sydone moieties, and selenium moieties
  • the functional substance comprises one or more moieties selected from the group consisting of peptides, proteins, nucleic acids, low-molecular-weight organic compounds, chelators, sugar chains, lipids, macromolecular polymers, and metals; Complex or its salt.
  • the complex or salt thereof according to any one of [1] to [20], wherein the human ferritin particles have a substance in their lumen.
  • a method for producing a complex or a salt thereof, the complex comprises (A) an IgG antibody and (B) linked thereto two human ferritin particles comprising one or more human ferritin heavy chains,
  • a method including the following (1) to (3): (1) introducing a first reactive group into an IgG antibody to produce a modified IgG antibody comprising two first reactive groups; (2) introducing a second reactive group capable of reacting with the first reactive group into human ferritin particles containing one or more human ferritin H chains, thereby obtaining one or more modified human ferritin particles containing the second reactive group; (3) reacting said modified IgG antibody with said modified particles to obtain said complexes.
  • the complex is represented by the following formula (1): X1-L1-Y-L2-X2 (1)
  • X1 and X2 each represent a human ferritin particle containing one or more human ferritin heavy chains, Y is an IgG antibody;
  • L1 and L2 each represent a linker, Two human ferritin particles, denoted by X1 and X2, are connected to each other via an atom in the side chain of an amino acid residue present at the same position in the human ferritin H chain contained therein, denoted by L1 and L2. linked to individual linkers. ], the method of [22].
  • a method for producing a complex or a salt thereof, A complex comprising (A) one IgG antibody and (B) one or more modified human ferritin heavy chains and one or more unmodified human ferritin heavy chains linked thereto, two human containing ferritin particles,
  • a method including the following (1) to (4): (1) introducing a first reactive group into an IgG antibody to produce a modified IgG antibody comprising two first reactive groups; (2) introducing a second reactive group capable of reacting with the first reactive group into human ferritin particles containing two or more human ferritin H chains, thereby obtaining two or more modified human ferritin particles containing the second reactive group; producing first modified particles comprising ferritin heavy chains; (3) In the first modified particle, a portion of the two or more modified human ferritin H chains is replaced with an unmodified human ferritin H chain to obtain one or more modified human ferritin H chains and one or more non-modified human ferritin H chains.
  • a method for producing a complex or a salt thereof, A complex comprising (A) one IgG antibody and (B) one or more modified human ferritin heavy chains and one or more unmodified human ferritin heavy chains linked thereto, two human containing ferritin particles A method including the following (1) to (4): (1) introducing a first reactive group into an IgG antibody to produce an IgG antibody comprising two first reactive groups; (2) introducing a second reactive group capable of reacting with the first reactive group into human ferritin particles containing two or more human ferritin H chains, thereby obtaining two or more modified human ferritin particles containing the second reactive group; producing first modified particles comprising ferritin heavy chains; (3) reacting the modified IgG antibody with the first modified particles to produce (A') one IgG antibody and (B') two or more modified human ferritin H chains linked thereto
  • the complex is represented by the following formula (1): X1-L1-Y-L2-X2 (1)
  • X1 and X2 represent human ferritin particles comprising one or more modified human ferritin heavy chains and one or more unmodified human ferritin heavy chains, respectively;
  • Y is an IgG antibody;
  • L1 and L2 each represent a linker,
  • Two human ferritin particles, denoted by X1 and X2 are connected to each other via an atom in the side chain of an amino acid residue present at the same position in the human ferritin H chain contained therein, denoted by L1 and L2.
  • the bioorthogonal functional group to the protein is maleimide moiety, azide moiety, ketone moiety, aldehyde moiety, thiol moiety, alkene moiety, alkyne moiety, halogen moiety, tetrazine moiety, nitrone moiety, hydroxylamine moiety, nitrile moiety, hydrazine one or more partial structures selected from the group consisting of moieties, boronic acid moieties, cyanobenzothiazole moieties, allyl moieties, phosphine moieties, disulfide moieties, thioester moieties, ⁇ -halocarbonyl moieties, isonitrile moieties, sydone moieties, and selenium moieties including The method of [33], wherein the first reactive group and the second reactive group are selected in a combination capable of reacting with each other.
  • the ratio of antibody and ferritin particles can be highly controlled.
  • regioselectivity can be achieved both in the linking site in the ferritin particle for the antibody and in the linking site in the antibody for the ferritin particle. Therefore, the present invention can realize extremely advanced quality control.
  • immunogenicity can be avoided in human clinical application by using human ferritin particles containing native human ferritin monomers and/or linkers that do not contain peptides.
  • the antibody and ferritin particles can serve as drugs and/or targeting agents, respectively. This is because the antibody itself can be used as a drug and/or targeting agent, and the ferritin particles can also be used as a drug delivery vehicle and/or targeting agent.
  • ferritin particles can be used as drug delivery vehicles because they can enclose large amounts of substances in their lumens and can bind drugs to the ferritin monomers on the surface.
  • a drug has properties that are easily degraded in vivo (eg, nucleic acid molecules such as siRNA)
  • ferritin can enclose a large amount of substance in the lumen and isolate the substance from the living body.
  • ferritin particles can be used as a targeting agent because they easily accumulate in specific organs or tissues (eg, lymph nodes, liver, spleen, cancer tissue) and easily permeate the blood-brain barrier (BBB). Therefore, the conjugate or salt thereof of the present invention can assign functions as a drug, a drug delivery means, and/or a targeting agent to one or both of the antibody and human ferritin particles. It is useful as a product.
  • FIG. 1 shows (A) the amino acid sequence of the natural human ferritin H chain (with methionine at position 1) (SEQ ID NO: 1), and (B) the polynucleotide encoding the natural human ferritin H chain (with methionine at position 1). and (C) the amino acid sequence of the natural human ferritin H chain (no methionine at position 1) (SEQ ID NO: 3).
  • FIG. 2 shows ESI-TOFMS analysis of native human ferritin H chain specifically modified with ethylmaleimide (6 equivalents).
  • FIG. 3 is a diagram showing an analysis (MS spectrum) of the modification site of the natural human ferritin H chain specifically modified with ethylmaleimide.
  • FIG. 4 is a diagram showing an analysis (CID spectrum) of the modified site of the natural human ferritin H chain specifically modified with ethylmaleimide.
  • FIG. 5 shows ESI-TOFMS analysis of native human ferritin H chain specifically modified with p-azidophenacyl bromide (6 equivalents).
  • FIG. 6 shows ESI-TOFMS analysis of native human ferritin H chain specifically modified with p-azidophenacyl bromide (12 equivalents).
  • FIG. 7 shows an analysis (MS spectrum) of the modification site of the natural human ferritin H chain specifically modified with p-azidophenacyl bromide.
  • FIG. 5 shows ESI-TOFMS analysis of native human ferritin H chain specifically modified with p-azidophenacyl bromide (6 equivalents).
  • FIG. 6 shows ESI-TOFMS analysis of native human ferritin H chain specifically modified with p-azidophenacyl bromide (12 equivalents).
  • FIG. 8 is a diagram showing an analysis (CID spectrum) of modification sites of natural human ferritin H chain specifically modified with p-azidophenacyl bromide.
  • FIG. 9 is a diagram showing a comparison of peak area values at positions 91, 103 and 131 of the human ferritin H chain based on the analysis results of modified sites of the human ferritin H chain by LC-MS/MS.
  • FIG. 10 shows ESI-TOFMS analysis of native human ferritin H chain specifically modified with p-azidophenacyl bromide (6 equivalents).
  • FIG. 11 shows ESI-TOFMS analysis of native human ferritin heavy chain specifically modified with DBCO-PEG4-maleimide (6 equivalents).
  • FIG. 12 shows ESI-TOFMS analysis of native human ferritin H chain specifically modified with 1,3-dichloroacetone (6 equivalents) and aminooxy-PEG5-azide (10 equivalents). be.
  • FIG. 13 shows ESI-TOFMS analysis of DBCO-modified antibodies.
  • FIG. 14 shows ESI-TOFMS analysis of DBCO-PEG-modified antibodies.
  • FIG. 15 is a diagram showing a migration image of the antibody-human ferritin complex by SDS-PAGE.
  • FIG. 16 is a diagram showing a transmission electron microscope (TEM) image of the antibody-human ferritin complex.
  • FIG. 17 is a diagram showing a migration image of the antibody-human ferritin complex by SDS-PAGE.
  • FIG. TEM transmission electron microscope
  • FIG. 18 shows the disassociation process of the antibody-human ferritin complex.
  • FIG. 19 shows ESI-TOFMS analysis of DBCO-modified antibody-human ferritin conjugates.
  • FIG. 20 shows ESI-TOFMS analysis of DBCO-PEG-modified antibody-human ferritin conjugates.
  • Figure 21 shows a reversed-phase chromatographic analysis of mosaic ferritin.
  • FIG. 22 shows reversed-phase chromatographic analysis of DBCO-modified antibody-mosaic ferritin conjugates.
  • FIG. 23 is a diagram showing changes in the amount of mosaic ferritin monomer due to antibody modification reaction.
  • FIG. 24 is a diagram showing a migration image of the antibody-human ferritin complex by SDS-PAGE.
  • the present invention provides a complex or salt thereof comprising (A) one IgG antibody and (B) linked thereto two human ferritin particles comprising one or more human ferritin H chains. .
  • Each of the two human ferritin particles contains one or more human ferritin heavy chains.
  • Human Ferritin Particles (I-1) Human Ferritin Particles Containing Human Ferritin H Chains Human ferritin particles can form 24-mers containing 24 ferritin monomers (H and L chains) . Ferritin particles naturally occurring in humans are usually hetero24mers, a mixture of H and L chains, while experimentally prepared ferritin particles are usually homo24mers. When preparing a hetero-24-mer in an experiment, it is necessary to separately prepare H-chain and L-chain ferritin particles and mix them. for the body is prepared. Thus, a human ferritin particle containing one or more human ferritin H chains may be a homo24mer containing only human ferritin H chains or a hetero24mer containing human ferritin H and L chains.
  • the human ferritin L chain may contain the mutations described below for the human ferritin H chain (eg, mutations that further include a functional peptide, and N-terminal and C-terminal modifications).
  • the human ferritin particles are preferably homo24mers containing 24 human ferritin H chains.
  • the positions of amino acid residues in the human ferritin H chain are determined according to the standard positions of the natural human ferritin H chain.
  • the term "native” indicates that the amino acid sequence is in its natural form. Therefore, "natural human ferritin H chain” means a human ferritin H chain having a natural amino acid sequence.
  • the "modified human ferritin H chain” described later means a human ferritin H chain in which the side chains of the amino acid residues constituting the human ferritin H chain are modified. It is different from “native human ferritin H chain” which does not mean.
  • a native human ferritin H chain is typically a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • native human ferritin H chain includes not only polypeptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but also naturally occurring variants thereof.
  • the native human ferritin H chain is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • the human ferritin H chain contained in the modified ferritin of the present invention may be a natural human ferritin H chain that may lack the methionine residue at position 1.
  • a natural human ferritin H chain in which the methionine residue at position 1 is not deleted corresponds to a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • a native human ferritin H chain lacking the methionine residue at position 1 corresponds to a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3.
  • the human ferritin heavy chain may be: (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3; (B) an amino acid sequence containing one or several amino acid residue mutations selected from the group consisting of amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3; and (C) an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and having the ability to form a 24-mer protein with
  • one or several amino acid residues can be modified by 1, 2, 3 or 4 mutations selected from the group consisting of deletion, substitution, addition and insertion of amino acid residues.
  • Amino acid residue mutations may be introduced in one region in the amino acid sequence, but may also be introduced in a plurality of different regions. Substitution of an amino acid residue other than a cysteine residue to a cysteine residue cannot be intended as a substitution of an amino acid residue in the present invention. Also, for the addition and insertion of amino acid residues, the addition and insertion of cysteine residues or cysteine residue-containing regions cannot be intended.
  • the term "one or several" indicates the number that does not impair the 24-mer formation ability. The number indicated by the term “one or several” is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5 (eg, 1, 2, 3, 4, or 5).
  • the degree of identity to the subject amino acid sequence is preferably 92% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, most preferably 98% or more. Or 99% or more.
  • the percent identity of the amino acid sequences was calculated using the software GENETYX Ver13.1.1 of Genetics Co., Ltd., and using the full length of the polypeptide portion encoded by the ORF, muscle alignment, clustal alignment or multiple sequence alignment was performed. This can be done later using the numerical values calculated in the setting of Gaps are taken into account.
  • the position of the amino acid residue to be mutated in the amino acid sequence is obvious to a person skilled in the art, but may be specified with further reference to sequence alignment. Specifically, one skilled in the art can 1) compare multiple amino acid sequences, 2) identify regions that are relatively conserved, and regions that are relatively unconserved, and then 3) relatively From the conserved regions and the relatively unconserved regions, it is possible to predict the regions that can play an important role in function and the regions that cannot play an important role in function, respectively. recognizable. Accordingly, those skilled in the art can identify positions to be mutated in an amino acid sequence by utilizing sequence alignments, and also use known secondary and tertiary structural information in conjunction with amino acid sequences to be mutated in an amino acid sequence.
  • Residue positions can also be specified. Introduction of mutations to amino acid residues in the C-terminal region and other regions located inside the cage structure of ferritin under normal circumstances (amino acid residues with low risk of immunogenicity because they are not exposed to the surface) is also preferred from the viewpoint of avoiding the risk of immunogenicity.
  • cysteine residues or cysteine residue-containing peptide mutations may be introduced, but cysteine residues or cysteine residues It is also preferred that no mutations (eg, substitutions, insertions, and additions to the N-terminal region) of the residue-containing peptide are introduced.
  • substitution of the amino acid residue may be a conservative substitution.
  • conservative substitution refers to the replacement of a given amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains are well known in the art. For example, such families include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged polar side chains. (e.g.
  • glycine asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • amino acids with non-polar side chains e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • ⁇ -branched side chains e.g. threonine, valine, isoleucine
  • amino acids with aromatic side chains e.g. tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • amino acids with hydroxyl group e.g. alcoholic, phenolic
  • amino acids with sulfur-containing side chains eg, cysteine, methionine
  • conservative amino acid substitutions are between aspartic acid and glutamic acid, between arginine and lysine and histidine, between tryptophan and phenylalanine, between phenylalanine and valine.
  • the human ferritin H chain in the proteins (B) and (C) above may be a human ferritin H chain further comprising a functional peptide containing no cysteine residues.
  • genetic modification other than genetic modification for introducing a modifying group to the surface of ferritin is permitted, so genetic modification for further inclusion of a functional peptide is permitted.
  • the N-termini of higher organism ferritin monomers are exposed on the surface of the 24-mer.
  • Various functional peptides can be inserted into the N-terminus of the human ferritin H chain, which is a ferritin monomer of higher organisms, while maintaining the ability to form a 24-mer.
  • higher organism ferritin monomers have six ⁇ -helices that are highly conserved among different higher organisms.
  • Human ferritin H chain which is a ferritin monomer of higher organisms, has six ⁇ -helices: 1) a first region (also called A region) consisting of amino acid residues at positions 15 to 42, 2) positions 50 to 77.
  • a third region (also called a C region) consisting of amino acid residues at positions 97-124, 4) consisting of amino acid residues at positions 128-137 4th region (also referred to as D region), 5) 5th region consisting of amino acid residues at positions 139-159 (also referred to as D region), 6) 6th region consisting of amino acid residues at positions 165-174 (E region also called) exists.
  • the region between these ⁇ -helices is called a flexible linker region, and it has been reported that various functional peptides can be inserted between the flexible linker regions while maintaining the ability to form 24-mers.
  • the flexible linker region between the ⁇ -helices of the B region and the C region into which the functional peptide is inserted in the present invention is also well known in the art, and can be appropriately specified by those skilled in the art.
  • positions 78 to 96 preferably positions 83 to 91
  • positions 78 to 96 which are flexible linker regions between the second and third regions, can be suitably used as such insertion positions of functional peptides into the human ferritin H chain. (eg, WO2019/163871).
  • a peptide that can add any function to the target protein when fused with the target protein can be used.
  • Such peptides include peptides capable of binding to target materials, protease-degradable peptides, cell-permeable peptides, and stabilizing peptides.
  • the functional peptide inserted into the region described above may be a single peptide having the desired function, or a plurality of homologous or heterologous peptides having the desired function (e.g., two, three or several, such as four) peptides.
  • the functional peptide is a plurality of peptides as described above, the plurality of functional peptides can be inserted in any order and fused with the ferritin monomer. Fusion can be accomplished via an amide bond. Fusions may be accomplished directly through an amide bond, or by one or a few amino acid residues (eg 2-20, preferably 2-10, more preferably 2, 3, 4 or 5). ) amino acid residues (peptide linker) intervening amide bond. Since various peptide linkers are known, such peptide linkers can also be used in the present invention. Preferably, the length of the entire peptide inserted into the region mentioned above is 20 amino acid residues or less.
  • examples of the target material include bioorganic molecules, protein purification tags (e.g., histidine tag, maltose-binding protein tag, glutathione-S-transferase) and Materials that can interact (eg, nickel, maltose, glutathione), labeling substances (eg, radioactive substances, fluorescent substances, dyes) are included.
  • Ferritin is known to be taken up by transferrin receptor-presenting cells (eg, L. Li et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107(8): 3505-10).
  • ferritin can be delivered to cells and organs expressing the bioorganic molecule to which ferritin does not normally bind.
  • Bioorganic molecules include, for example, proteins (e.g. oligopeptides or polypeptides), nucleic acids (e.g. DNA or RNA, or nucleosides, nucleotides, oligonucleotides or polynucleotides), carbohydrates (e.g. monosaccharides, oligosaccharides or polysaccharides), lipids.
  • Bioorganic molecules can also be cell surface antigens (eg, cancer antigens, cardiac disease markers, diabetes markers, neurological disease markers, immune disease markers, inflammatory markers, hormones, infectious disease markers).
  • Bioorganic molecules may also be disease antigens (eg, cancer antigens, cardiac disease markers, diabetes markers, neurological disease markers, immune disease markers, inflammatory markers, hormones, infectious disease markers).
  • disease antigens eg, cancer antigens, cardiac disease markers, diabetes markers, neurological disease markers, immune disease markers, inflammatory markers, hormones, infectious disease markers.
  • Various peptides have been reported as peptides capable of binding to such bioorganic molecules.
  • proteins e.g., F. Danhier et al., Mol. Pharmaceutics, 2012, vol.9, No. 11, p.2961., CH. Wu et al., Sci. Transl Med., 2015, vol.7, No. 290, 290ra 91.
  • the protease includes, for example, cysteine proteases such as caspase and cathepsin (D. McIlwain1 et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 2013, vol.5, a008656, V Stoka et al., IUBMB Life.2005, vol.57, No.4-5 p.347), collagenase (G. Lee et al., Eur J Pharm Biopharm., 2007, vol.67, No.3), p. 646), thrombin and factor Xa (R. Jenny et al., Protein Expr. Purif., 2003, vol. 31, p.
  • cysteine proteases such as caspase and cathepsin (D. McIlwain1 et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 2013, vol.5, a008656, V Stoka et al., IUBMB Life.2005, vol.57, No.4-5 p.347)
  • stabilizing peptides When stabilizing peptides are used as functional peptides, various stabilizing peptides can be used (eg, X. Meng et al., Nanoscale, 2011, vol.3, No.3, p.977; Falvo et al., Biomacromolecules, 2016, vol.17, No.2, p.514).
  • cell-permeable peptides When cell-permeable peptides are used as functional peptides, various cell-permeable peptides can be used (eg, Z. Guo et al. Biomed. Rep., 2016, vol. 4, No. 5, p. 528).
  • Peptides that have the ability to bind to target materials are preferred as functional peptides.
  • Peptides capable of binding to target materials are preferably peptides capable of binding to bioorganic molecules, and more preferably peptides capable of binding to proteins.
  • the human ferritin H chain may be modified in its N-terminal region and/or C-terminal region.
  • the N-terminus of animal ferritin monomers such as human ferritin monomer, is exposed on the surface of the multimer and its C-terminus may not be exposed on the surface. Therefore, the peptide moiety attached to the N-terminus of the animal ferritin monomer is exposed on the surface of the multimer and can interact with target materials present on the exterior of the multimer, whereas the C-terminus of the animal ferritin monomer
  • the peptide moieties that are added are not exposed on the surface of the multimer and are unable to interact with target materials present on the exterior of the multimer (eg WO2006/126595).
  • the human ferritin H chain may have a peptide moiety added to the N-terminus as a modification of its N-terminal region.
  • Peptide moieties to be added include, for example, functional peptides as described above.
  • the peptide moiety to be added also includes, for example, a peptide component that improves the solubility of the target protein (eg, Nus-tag), a peptide component that acts as a chaperone (eg, trigger factor), and a peptide component that has other functions. (eg, full-length proteins or portions thereof), as well as linkers.
  • the same or different peptide as the functional peptide inserted into the region between the second and third ⁇ -helices can be used, but the peptide is directed to a different target material. It is also preferable to use different peptides from the viewpoint of realizing the interaction of .
  • the peptide portion added to the N-terminus of the human ferritin H chain is a functional peptide as described above.
  • Peptide moieties added to the N-terminus are also preferably designed to include an amino acid residue corresponding to the initiation codon (eg, a methionine residue) at the N-terminus. Such a design can facilitate translation of the human ferritin heavy chain.
  • the C-terminal region of the human ferritin H chain may be modified such that amino acid residues in the C-terminal region are substituted with reactive amino acid residues, A residue may be inserted, or a reactive amino acid residue or a peptide containing it (for example, a peptide consisting of 2 to 12, preferably 2 to 5 amino acid residues) may be added to the C-terminus. good.
  • a C-terminal region is, for example, a region consisting of amino acid residues at positions 175-183 (preferably positions 179-183) for human ferritin H chain.
  • Such modifications allow reactive amino acid residues and substances of interest (e.g., drugs, labeling substances) to react, thereby covalently encapsulating the substance of interest in the lumen of the multimer.
  • reactive amino acid residues include cysteine residues having a thiol group, lysine residues having an amino group, arginine residues, asparagine residues, and glutamine residues, with cysteine residues being preferred.
  • the modification of the C-terminal region of the fusion protein of the invention is the addition of reactive amino acid residues or peptides containing them to the C-terminus.
  • the functional peptide when the human ferritin H chain further contains a functional peptide, the functional peptide may be a human-derived peptide.
  • the functional peptide is a human-derived peptide, the risk of immunogenicity to humans can be reduced.
  • Human ferritin particles containing one or more human ferritin H chains are produced using host cells containing polynucleotides encoding human ferritin H chains. can be obtained by producing a human ferritin H chain in a host cell to form a 24-mer.
  • Host cells for producing human ferritin H chains include, for example, cells derived from animals, insects, plants, or microorganisms. Animals are preferably mammals or birds (eg, chickens), more preferably mammals. Mammals include, for example, primates (e.g. humans, monkeys, chimpanzees), rodents (e.g. mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits), livestock and working mammals (e.g. cows, pigs, sheep, goats, horses).
  • the host cell is a human cell or a cell commonly used for the production of human proteins (eg, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, human embryonic kidney-derived HEK293 cells). From the viewpoint of clinical application to humans, it is preferable to use such host cells.
  • human cells eg, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, human embryonic kidney-derived HEK293 cells. From the viewpoint of clinical application to humans, it is preferable to use such host cells.
  • the host cell is a microorganism.
  • Such host cells may be used from the viewpoint of mass production of fusion proteins.
  • Microorganisms include, for example, bacteria and fungi.
  • the bacterium any bacterium that is used as a host cell can be used. Examples include Corynebacterium glutamicum], bacteria of the genus Escherichia [e.g., Escherichia coli], and bacteria of the genus Pantoea (e.g., Pantoea ananatis).
  • any fungi that are used as host cells can be used, for example, fungi of the genus Saccharomyces [e.g., Saccharomyces cerevisiae], and Schizosaccharomyces. Fungi of the genus [e.g., Schizosaccharomyces pombe].
  • filamentous fungi may be used as microorganisms.Filamentous fungi include, for example, Acremonium/Talaromyces ), Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Fusarium, Chrysosporium, Humicola, Emericella, and Hypocrea (Hypocrea).
  • a host cell can be designed to contain, in addition to a polynucleotide encoding a human ferritin H chain, an expression unit comprising a promoter operably linked to the polynucleotide.
  • expression unit includes a given polynucleotide to be expressed as a protein and a promoter operably linked thereto, which enables the transcription of said polynucleotide and thus the production of the protein encoded by said polynucleotide. It means the unit to do.
  • Expression units may further include elements such as terminators, ribosome binding sites, and drug resistance genes.
  • the expression unit may be DNA or RNA, preferably DNA.
  • the expression unit is a genomic region (e.g., a natural genomic region that is a natural locus where the polynucleotide encoding the protein is uniquely present in a microorganism (host cell), or a non-natural genomic region that is not the natural locus), or a non-genomic It can be contained in a region (eg, intracytoplasmic).
  • An expression unit may be contained in a genomic region at one or more (eg, 1, 2, 3, 4, or 5) different positions.
  • Specific forms of expression units contained in non-genomic regions include, for example, plasmids, viral vectors, phages, and artificial chromosomes.
  • the human ferritin H chain contained in the human ferritin particles may be a modified human ferritin H chain.
  • a modified human ferritin H chain means a human ferritin H chain in which side chains of amino acid residues constituting the human ferritin H chain are modified.
  • the modified human ferritin H chain includes a modified human ferritin H chain having a modification group that is used for linkage with an IgG antibody and a modified human ferritin H chain that has a modification group that is not used for linkage with an IgG antibody. Modification of the human ferritin H chain can be performed at the side chain of any amino acid residue.
  • cysteine residues present at positions 91 and/or 103 according to the reference position of the native human ferritin H chain A cysteine residue in the side chain of is utilized.
  • the amino acid residue in the human ferritin H chain to be modified in the present invention may be a cysteine residue at position 91 and/or 103 according to the standard position of the native human ferritin H chain. .
  • the thiol groups in the side chains of such cysteine residues By utilizing the thiol groups in the side chains of such cysteine residues, the number of human ferritin particles linked to the antibody, the linking site of the human ferritin H chain to the antibody, and the regioselectivity of the site modified by the modifying group can be determined. Highly controllable.
  • regioselective or “regioselectivity” means that the linking site and the modification site are specific regions in the human ferritin H chain. (eg, cysteine residues at positions 91 and/or 103).
  • regioselectivity is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, 95% or more, 96% or more, It may be 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 100%.
  • human ferritin particles the cysteine residues at positions 91 and 103 are close to each other.
  • Human ferritin particles can contain one or two modifying groups per human ferritin heavy chain at such positions. Therefore, the human ferritin particles may contain a modified human ferritin heavy chain containing either of the following modification groups (A) or (B): (A) Human ferritin comprising one or two modifying groups specifically covalently attached to one or two sulfur atoms in the side chains of one or both cysteine residues at positions 91 or 103 H chain; or (B) a human ferritin H chain comprising a single modifying group bridging the two sulfur atoms in the side chains of the cysteine residues at positions 91 and 103 by specific covalent bonds.
  • modification groups A) Human ferritin comprising one or two modifying groups specifically covalently attached to one or two sulfur atoms in the side chains of one or both cysteine residues at positions 91 or 103 H chain
  • B a human ferritin H chain compris
  • Modified ferritin containing such a human ferritin H chain has a molar ratio of human ferritin to a thiol-modifying reagent or functional substance described later (human ferritin: thiol-modifying reagent or functional substance) of, for example, 1:1 to 1:30. , preferably 1:1 to 1:20, more preferably 1:1 to 1:15, and reacting them.
  • the human ferritin particles can contain 24 or 48 modifying groups. This is because a 24-mer, which can contain one or two modifying groups per human ferritin H chain at the 91st and 103rd cysteine residues, can be used as a human ferritin particle.
  • the human ferritin particles may further contain unmodified human ferritin H chains that do not contain modifying groups.
  • An unmodified human ferritin H chain means a human ferritin H chain in which side chains of amino acid residues constituting the human ferritin H chain are not modified.
  • Human ferritin particles further containing unmodified human ferritin H chains can be prepared by reacting ferritin with a reactive substance (eg, a thiol-modifying reagent and a functional substance) at a low ratio.
  • Human ferritin particles further comprising an unmodified human ferritin H chain also human ferritin particles comprising a modified human ferritin H chain comprising a modification group specifically covalently bound to the cysteine residues at positions 91 and/or 103; and human ferritin particles containing unmodified human ferritin H chains that do not contain the modifying group, and then dissociating and re-associating these particles in a solution containing these particles at a predetermined ratio. Since ferritin particles can dissociate and associate relatively easily, they take the form of 24-mers or monomers, or a form in which both of them coexist, depending on the conditions such as the solvent containing the ferritin particles.
  • the 24-mer can be dissociated into monomers, and the dissociated monomers can be re-associated into 24-mers.
  • Such dissociation and reassociation are utilized in encapsulating various substances (eg, drugs described below) in the lumen of ferritin particles (eg, WO2020/090708; Chinese Patent Application Publication No. 106110333). Journal of Controlled Release 196 (2014) 184-196; Biomacromolecules 2016, 17, 514-522; Proc Natl Acad Sci USA. 2014 111(41):14900-5).
  • the molar ratio of the modified human ferritin H chain containing the modifying group and the unmodified human ferritin H chain not containing the modifying group in the human ferritin particles is can be controlled depending on the quantitative ratio of reactive substances to , or their quantitative ratios before reassociation in solution.
  • the modifying group may contain a reactive group.
  • the human ferritin particles comprise modified human ferritin heavy chains comprising modifying groups comprising reactive groups linked to cysteine residues at positions 91 and/or 103.
  • Human ferritin particles containing such a modified human ferritin H chain are obtained by using a modified human ferritin H chain or a human ferritin particle containing the same (preferably, a human ferritin particle containing such a modified human ferritin H chain) with the thiol modification described below. It can be produced by reacting with a reagent.
  • the reactive group may be appropriately set so as to react with the functional substance.
  • a reactive group includes a moiety that can react with a predetermined functional group in a functional agent (the functional agent may be derivatized to have a predetermined functional group capable of reacting with the reactive group).
  • the number of reactive groups contained in the modifying group may be single or multiple, for example 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2, still more preferably 1.
  • the plural reactive groups may be the same or different. For example, when reaction with a plurality of functional substances of the same type is desired, reactive groups of the same type are preferred from the viewpoint of adopting a simple structure. On the other hand, when reactions with a plurality of different types of functional substances are desired, different types of reactive groups are preferred from the viewpoint of securing reaction selectivity.
  • the reactive group may be a bioorthogonal functional group to the protein.
  • the reaction between the ferritin H chain and the functional substance can be promoted while suppressing the reaction between the ferritin monomers.
  • a bioorthogonal functional group is one that cannot react with biological constituents (e.g., amino acids, nucleic acids, lipids, sugars, phosphoric acids), or hardly reacts with biological constituents, but reacts with components other than biological constituents.
  • Bioorthogonal functional groups are well known in the art (e.g., Sharpless KB et al., Angew. Chem. Int. Ed. 40, 2004 (2015); Bertozzi C. R.
  • the 20 natural amino acids that make up proteins are alanine (A), asparagine (N), cysteine (C), glutamine (Q), glycine (G), isoleucine (I), leucine (L), methionine (M ), phenylalanine (F), proline (P), serine (S), threonine (T), tryptophan (W), tyrosine (Y), valine (V), aspartic acid (D), glutamic acid (E), arginine ( R), histidine (H), and lysine (L).
  • glycine without a side chain i.e., a hydrogen atom
  • the side chain is a hydrocarbon group
  • the side chain is a hydrocarbon group
  • Bioorthogonal functional groups for proteins are thus asparagine, glutamine, methionine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, in addition to those amino acid side chains with side chains that are inert to normal reactions.
  • cysteine side chains e.g., the cysteine residues at positions 91 and/or 103 of the human ferritin heavy chain are fully modified.
  • cysteine side chains e.g., the cysteine residues at positions 91 and/or 103 of the human ferritin heavy chain are fully modified.
  • Bioorthogonal functional groups for proteins include, for example, maleimide moieties, azide moieties, ketone moieties, aldehyde moieties, thiol moieties, alkene moieties (in other words, vinyl (ethenyl), which is the smallest unit having a double bond between carbon atoms). or a vinylene (ethynylene) moiety.
  • maleimide moieties azide moieties, ketone moieties, aldehyde moieties, thiol moieties, alkene moieties (in other words, vinyl (ethenyl), which is the smallest unit having a double bond between carbon atoms). or a vinylene (ethynylene) moiety.
  • an alkyne moiety in other words, an ethynyl moiety or an ethynylene moiety, which is the smallest unit having a triple bond between carbon atoms.
  • halogen moieties e.g., fluorinated moieties, chloride moieties, bromide moieties, iodide moieties
  • tetrazine moieties nitrone moieties, hydroxylamine moieties, nitrile moieties, hydrazine moieties, boron Acid moieties, cyanobenzothiazole moieties, allyl moieties, phosphine moieties, disulfide moieties, thioester moieties, ⁇ -halocarbonyl moieties (e.g., carbonyl moieties having a fluorine atom, chlorine atom, bromine atom or iodine atom at the ⁇ position), isonitrile moieties , a sydnon moiety, and a group containing one or more partial structures selected from the group consisting of selenium moieties.
  • fluorinated moieties e.g., chloride
  • proteins include proteins that may contain free thiols in the side chains of cysteine residues (e.g., proteins other than antibodies), and proteins that may not contain free thiols (e.g., antibodies, proteins that do not contain cysteine residues, and ferritins, including human ferritin heavy chains in which the cysteine residues at positions 91 and/or 103 are fully modified, as provided in the present invention).
  • Thiols function as bioorthogonal functional groups in proteins that cannot contain free thiols.
  • bioorthogonal functional groups for proteins include thiol moieties.
  • the protein Bioorthogonal functional groups do not include thiol moieties.
  • the reactive group may also be combined with a predetermined functional group in the functional substance. It can be set to react specifically.
  • the reaction for producing a modified human ferritin H chain containing a reactive group as described above should be appropriately carried out under conditions (mild conditions) that do not cause denaturation/degradation of ferritin (e.g. cleavage of amide bond).
  • a reaction can be carried out in an appropriate reaction system, such as a buffer solution, under temperature conditions that do not cause denaturation/decomposition of ferritin (for example, about 15 to 60°C, preferably 15 to 45°C).
  • the pH of the buffer is, for example, 3.0 to 12.0, preferably 5.0 to 9.0, more preferably 6.0 to 8.0.
  • the buffer may contain components such as catalysts.
  • the reaction time is, for example, 1 minute to 20 hours, preferably 10 minutes to 15 hours, more preferably 20 minutes to 10 hours, still more preferably 30 minutes to 8 hours.
  • the modifying group may contain a functional substance.
  • the human ferritin particle comprises a modified human ferritin heavy chain comprising modifying groups comprising functional agents linked to cysteine residues at positions 91 and/or 103.
  • the functional substance is not particularly limited as long as it is a substance that imparts an arbitrary function to ferritin, and includes, for example, drugs, labeling substances, and stabilizers, preferably drugs or labeling substances.
  • a functional substance may also be a single functional substance, or a substance in which two or more functional substances are linked.
  • the drug may be a drug for any disease.
  • diseases include, for example, cancer (e.g., lung cancer, stomach cancer, colon cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, liver cancer, thyroid cancer, prostate cancer, bladder cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bone cancer, skin cancer, brain tumor, melanoma), autoimmune diseases/inflammatory diseases (e.g., allergic diseases, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus), cranial nerve diseases (e.g., cerebral infarction, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis), Infectious diseases (e.g., bacterial infections, viral infections), hereditary/rare diseases (e.g., hereditary spherocytosis, non-dystrophic myotonia), eye diseases (e.g., age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, retinitis pigmentosa), bone/orthopedic diseases (e.g.
  • the drug is an anticancer agent.
  • Anti-cancer agents include, for example, chemotherapeutic agents, toxins, radioactive isotopes or substances containing the same.
  • Chemotherapeutic agents include, for example, DNA damaging agents, antimetabolites, enzyme inhibitors, DNA intercalating agents, DNA cleaving agents, topoisomerase inhibitors, DNA binding inhibitors, tubulin binding inhibitors, cytotoxic nucleosides, A platinum compound is mentioned.
  • Toxins include, for example, bacterial toxins (eg, diphtheria toxin), plant toxins (eg, ricin).
  • Radioisotopes include, for example, a hydrogen atom radioisotope (e.g., 3 H), a carbon atom radioisotope (e.g., 14 C), a phosphorus atom radioisotope (e.g., 32 P), and a sulfur atom radioisotope (e.g., 32 P).
  • Radioisotopes e.g. 35 S
  • yttrium radioisotopes e.g. 90 Y
  • technetium radioisotopes e.g. 99m Tc
  • indium radioisotopes e.g.
  • Isotopes e.g., 123 I, 125 I, 129 I, 131 I
  • radioisotopes of samarium e.g., 153 Sm
  • radioisotopes of rhenium e.g., 186 Re
  • radioisotopes of astatine e.g., 211 At
  • radioactive isotopes of bismuth e.g, 212 Bi
  • drugs include auristatins (MMAE, MMAF), maytansine (DM1, DM4), PBD (pyrrolobenzodiazepine), IGN, camptothecin analogues, calicheamicin, duocalmicin, eribulin, anthracycline, dmDNA31, tubulisin is mentioned.
  • a targeting substance is an affinity substance for a target (eg, tissue, cell, substance).
  • Targeting substances include, for example, antibodies against target substances or fragments thereof capable of binding to target substances, ligands capable of binding to receptors, proteins capable of forming complexes (e.g., adapter proteins), and sugar chains. proteins (lectins), sugar chains capable of binding to proteins, and nucleic acids capable of binding to complementary sequences (eg, natural nucleic acids such as DNA and RNA, or artificial nucleic acids).
  • a labeling substance is a substance that enables detection of a target (eg, tissue, cell, substance).
  • labeling substances include enzymes (e.g., peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase), affinity substances (e.g., streptavidin, biotin, digoxigenin, aptamers), fluorescent substances (e.g., fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine , green fluorescent protein, red fluorescent protein), luminescent substances (e.g., luciferin, aequorin, acridinium ester, tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium, luminol), radioisotopes (e.g., those described above), or Substances containing it are mentioned.
  • enzymes e.g., peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇
  • a stabilizer is a substance that enables the stabilization of ferritin.
  • Stabilizers include, for example, diols, glycerin, nonionic surfactants, anionic surfactants, natural surfactants, saccharides, and polyols.
  • Functional substances also include peptides, proteins (e.g., antibodies), nucleic acids (e.g., DNA, RNA, and artificial nucleic acids), low-molecular-weight organic compounds (e.g., low-molecular-weight organic compounds described later), chelators, sugar chains, lipids, It may be a polymer, a metal (eg gold).
  • proteins e.g., antibodies
  • nucleic acids e.g., DNA, RNA, and artificial nucleic acids
  • low-molecular-weight organic compounds e.g., low-molecular-weight organic compounds described later
  • chelators e.g., sugar chains, lipids, It may be a polymer, a metal (eg gold).
  • Human ferritin particles containing modified human ferritin H chains containing modifying groups containing functional substances can be produced by reacting human ferritin particles with functional substances.
  • the functional substance used in such reactions is a reactive substance having at least one reactive site for a thiol group, and having the ability to add a modifying group containing the functional substance to human ferritin by reaction. is. Any functional substance having a functional group that readily reacts with a thiol group can be used as the functional substance used in such a reaction. Alternatively, if the functional substance does not have a functional group that readily reacts with thiol groups, a functional substance derivatized to have such a functional group can be used.
  • functional substances include maleimide moieties, benzyl halide moieties, ⁇ -haloamide moieties, ⁇ -haloketone moieties, alkene moieties, alkyne moieties, fluoroaryl moieties, and nitroaryl moieties. , a methylsulfonyloxadiazole moiety, and a disulfide moiety.
  • Human ferritin particles containing a modified human ferritin H chain containing a modifying group containing a functional substance are also obtained by reacting human ferritin with a thiol modifying reagent, and then reacting the modified human ferritin H chain containing a reactive group obtained by the reaction. It can be produced by further reacting the containing human ferritin particles with a functional substance.
  • the step of reacting human ferritin particles with a thiol-modifying reagent can be performed as described above.
  • the functional substance used in the step of further reacting the human ferritin particles containing the modified human ferritin H chain containing a reactive group with the functional substance has at least one functional substance for the reactive group of the modified human ferritin H chain containing a reactive group.
  • modifying groups including functional substances, to human ferritin by reaction.
  • Any functional substance having a functional group that readily reacts with the reactive group can be used as the functional substance used in such a reaction.
  • a functional substance derivatized to have such a functional group can be used. Therefore, depending on the type of reactive group, the functional group in the functional substance used in the reaction can be appropriately determined.
  • derivatization of functional substances is common technical knowledge in the art (e.g., International Publication No. 2004/010957, US Patent Application Publication No. 2006/0074008, US Patent Application Publication No. 2005/0238649).
  • derivatization may be performed using a cross-linking agent as described above.
  • derivatization may be performed with specific linkers bearing desired functional groups.
  • linker may be capable of separating the functional substance and the antibody by cleaving the linker in an appropriate environment (eg, intracellular or extracellular).
  • linkers include, for example, peptidyl linkers ( Dubowchik et al., Pharm.Therapeutics 83:67-123 (1999)), linkers that can be cleaved at local acidic sites present in vivo (e.g., US Patent No. 5 , 622,929, 5,122,368; 5,824,805).
  • Linkers may be self-immolative (eg, WO 02/083180, WO 04/043493, WO 05/112919).
  • a derivatized functional substance can also be simply referred to as a "functional substance".
  • the functional substance is a functional substance that has a functional group that readily reacts with a reactive group that is a bioorthogonal functional group to a protein, or a derivative that has a functional group that readily reacts with the reactive group. It may be a modified functional substance.
  • Functional groups that are reactive with bioorthogonal functional groups may also vary depending on the specific type of bioorthogonal functional group. A person skilled in the art can appropriately select an appropriate functional group as a functional group that readily reacts with the bioorthogonal functional group (eg, Boutureira et al., Chem. Rev., 2015, 115, 2174-2195 ).
  • Functional groups that readily react with bioorthogonal functional groups include, for example, maleimide groups and disulfide groups when the bioorthogonal functional groups correspond to thiol moieties, and when the bioorthogonal functional groups correspond to alkyne moieties. includes, but is not limited to, azide groups and, where the bioorthogonal functional group corresponds to an aldehyde or ketone moiety, hydrazine groups.
  • the reaction for producing human ferritin particles containing a modified human ferritin H chain containing a modifying group containing a functional substance is carried out under conditions (mild conditions) that do not cause denaturation/decomposition (e.g., amide bond cleavage) of ferritin.
  • conditions such a reaction can be carried out in an appropriate reaction system, such as a buffer solution, under temperature conditions that do not cause denaturation/decomposition of ferritin (for example, about 15 to 60°C, preferably 15 to 45°C).
  • the pH of the buffer is, for example, 3.0 to 12.0, preferably 5.0 to 9.0, more preferably 6.0 to 8.0.
  • the buffer may contain components such as catalysts.
  • the reaction time is, for example, 1 minute to 20 hours, preferably 10 minutes to 15 hours, more preferably 20 minutes to 10 hours, still more preferably 30 minutes to 8 hours.
  • Human ferritin particles may have substances in their lumens. Encapsulation of substances in the lumen of human ferritin particles can be achieved by utilizing the properties of human ferritin particles that can take up substances. Human ferritin particles form cage-like structures with lumens on the order of 12 nm outer diameter (7 nm inner diameter). Accordingly, the size of the substance may be such that it allows it to be enclosed within such a lumen. It has been reported that various inorganic and organic substances can be encapsulated in the lumen of human ferritin particles (e.g., WO2020/090708; Chinese Patent Application Publication No.
  • Encapsulation of a substance into the lumen of human ferritin particles can be performed before or after subjecting the human ferritin particles to a modification reaction.
  • a low-molecular-weight organic compound is preferable as the substance.
  • a low molecular weight organic compound means an organic compound having a molecular weight of 1500 or less. Small organic compounds are natural or synthetic compounds. The molecular weight of the small organic compound may be 1200 or less, 1000 or less, 900 or less, 800 or less, 700 or less, 600 or less, 500 or less, 400 or less, or 300 or less.
  • the molecular weight of the small organic compound may also be 30 or greater, 40 or greater, or 50 or greater.
  • a small organic compound may be a drug or labeling substance as described above.
  • Examples of low-molecular-weight organic compounds include amino acids, oligopeptides, vitamins, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, monosaccharides, oligosaccharides, lipids, fatty acids, and salts thereof.
  • the human ferritin particles may be provided as a set of different types of modified ferritin, including different types (e.g., 2, 3, or 4) of substances. .
  • modified ferritin including different types (e.g., 2, 3, or 4) of substances.
  • the human ferritin particles are provided as a set of two modified ferritins having two substances, such sets are each separately prepared with the first modified ferritin having the first substance and , and a second modified ferritin having a second substance different from the first substance.
  • Confirmation of the production of human ferritin particles containing modified human ferritin H chains depends on the type and molecular weight of the modification group, but can be performed, for example, by electrophoresis, chromatography (e.g., gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse chromatography). phase column chromatography, HPLC), and/or mass spectroscopy. Confirmation of the regioselectivity of modifications can be performed, for example, by peptide mapping. Peptide mapping can be performed, for example, by protease (eg, trypsin, chymotrypsin) treatment and mass spectrometry. As the protease, an endoprotease is preferred.
  • protease eg, trypsin, chymotrypsin
  • Such endoproteases include, for example, trypsin, chymotrypsin, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N.
  • the modified human ferritin H chain or human ferritin particles containing it can be appropriately purified by any method such as chromatography (eg, the above-described chromatography and affinity chromatography).
  • IgG antibody or salt thereof The type of IgG antibody is not particularly limited, and is derived from animals such as mammals and birds (eg, chicken), preferably from mammals. Examples of such mammals include primates (e.g., humans, monkeys, chimpanzees), rodents (e.g., mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits), pets (e.g., dogs, cats), livestock. (eg, cows, pigs, goats), working animals (eg, horses, sheep), preferably primates or rodents, more preferably humans.
  • mammals e.g., humans, monkeys, chimpanzees
  • rodents e.g., mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits
  • pets e.g., dogs, cats
  • livestock. eg, cows, pigs, goats
  • working animals eg, horses, sheep
  • primates or rodents more preferably humans.
  • the type of IgG antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies include, for example, chimeric, humanized, or human antibodies.
  • the IgG antibody is a chimeric monoclonal antibody containing human IgG-derived portions, a humanized monoclonal antibody containing human IgG-derived portions, or a human IgG monoclonal antibody.
  • IgG isotypes include, for example, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • IgG antibodies also include IgG antibodies to which predetermined sugar chains have been added (e.g., antibodies modified to have a sugar chain-binding consensus sequence such as an N-type sugar chain-binding consensus sequence), bispecific IgG antibodies, IgG It may be an Fc region protein, or an IgG Fc fusion protein.
  • the IgG antibody may further be a full-length IgG antibody, or an IgG antibody fragment containing the variable region and the CH1 and CH2 domains (all or part).
  • the IgG antibody is a full length IgG antibody.
  • any antigen can be used as the antigen for the IgG antibody.
  • antigens include proteins [oligopeptides and polypeptides. proteins modified with biomolecules such as sugars (eg, glycoproteins)], sugar chains, nucleic acids, and low-molecular-weight compounds.
  • the IgG antibody may be an antibody against a protein antigen. Proteins include, for example, cell membrane receptors, cell membrane proteins other than cell membrane receptors (eg, extracellular matrix proteins), ligands, and soluble receptors.
  • the protein that is the antigen of the IgG antibody may be a disease target protein.
  • Disease target proteins include, for example:
  • Amyloid AL Hereditary/rare diseases Amyloid AL, SEMA4D (CD100), insulin receptor, ANGPTL3, IL4, IL13, FGF23, adrenocorticotropic hormone, transthyretin, huntingtin
  • IgG antibodies include certain chimeric antibodies (e.g., rituximab, basiliximab, infliximab, cetuximab, siltuximab, dinutuximab, orthotoxashimab), certain humanized antibodies (e.g., daclizumab, palivizumab, trastuzumab, alentuzumab, omalizumab).
  • chimeric antibodies e.g., rituximab, basiliximab, infliximab, cetuximab, siltuximab, dinutuximab, orthotoxashimab
  • humanized antibodies e.g., daclizumab, palivizumab, trastuzumab, alentuzumab, omalizumab.
  • efalizumab bevacizumab, natalizumab (IgG4), tocilizumab, eculizumab (IgG2), mogamulizumab, pertuzumab, obinutuzumab, vedrizumab, penprolizumab (IgG4), mepolidumab, elotuzumab, daratumumab, ikesekizumab (IgG4), leslidumab (specific G), atezomab (Ig) human antibodies (e.g., adalimumab (IgG1), panitumumab, golimumab, ustekinumab, canakinumab, ofatumumab, denosumab (IgG2), ipilimumab, belimumab, laxivacumab, ramucirumab, nivolumab, dupilumab
  • the position of amino acid residues in IgG antibodies and the position of the heavy chain constant region follow EU numbering (see http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html) .
  • the lysine residue at position 246 corresponds to the 16th amino acid residue of the human IgG CH2 region
  • the lysine residue at position 248 corresponds to the 18th amino acid residue of the human IgG CH2 region.
  • the lysine residue at position 288 corresponds to the 58th amino acid residue of the human IgG CH2 region
  • the lysine residue at position 290 corresponds to the 60th amino acid residue of the human IgG CH2 region.
  • the lysine residue at position 317 corresponds to the 87th amino acid residue of the human IgG CH2 region.
  • the notation 246/248 indicates that the lysine residue at position 246 or 248 is of interest.
  • the notation 288/290 indicates that the lysine residue at position 288 or 290 is of interest.
  • the IgG antibody may be regioselectively modified at specific amino acid residues.
  • regioselectivity or “regioselectivity” refers to the presence of specific amino acid residues in IgG antibodies, even though specific amino acid residues are not localized to specific regions in IgG antibodies. It means that a given structural unit capable of binding to a residue is ubiquitously distributed in a specific region in an IgG antibody.
  • expressions related to regioselectivity such as “regioselectively having", “regioselectively binding”, “regioselectively binding”, etc., refer to target regions comprising one or more specific amino acid residues.
  • Such regioselectivity is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, 95% or more, 96% or more, It may be 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 100%.
  • Such specific amino acid residues include amino acid residues (e.g., lysine residues, aspartic acid residues) having easily modifiable side chains (e.g., amino group, carboxyl group, amide group, hydroxy group, thiol group).
  • glutamic acid residues glutamine residues, threonine residues, serine residues, tyrosine residues, cysteine residues
  • glutamic acid residues can be utilized, but preferably lysine residues having side chains containing amino groups, hydroxyl tyrosine, serine and threonine residues with side chains containing groups, or cysteine residues with side chains containing thiol groups, more preferably lysine residues (i.e.
  • salts with inorganic acids include, for example, salts with hydrogen chloride, hydrogen bromide, phosphoric acid, sulfuric acid, and nitric acid.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, lactic acid, tartaric acid, fumaric acid, oxalic acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, benzenesulfonic acid, and p-toluenesulfonic acid.
  • Salts with inorganic bases include, for example, salts with alkali metals (eg, sodium, potassium), alkaline earth metals (eg, calcium, magnesium), and other metals such as zinc, aluminum, and ammonium.
  • Salts with organic bases include, for example, salts with trimethylamine, triethylamine, propylenediamine, ethylenediamine, pyridine, ethanolamine, monoalkylethanolamine, dialkylethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine.
  • salts with amino acids include salts with basic amino acids (eg, arginine, histidine, lysine, ornithine) and acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid).
  • the salt is preferably a salt with an inorganic acid (eg hydrogen chloride) or an organic acid (eg trifluoroacetic acid).
  • human ferritin particles and IgG antibodies may be site-selectively linked.
  • the IgG antibody of the present invention can be represented by the following formula (1): X1-L1-Y-L2-X2 (1) [In the formula, X1 and X2 each represent a human ferritin particle containing one or more human ferritin H chains, Y indicates an IgG antibody, L1 and L2 each represent a linker, Two human ferritin particles, denoted by X1 and X2, are connected to each other via an atom in the side chain of an amino acid residue present at the same position in the human ferritin H chain contained therein, denoted by L1 and L2. linked to individual linkers. ].
  • X1 and X2 each indicate human ferritin particles containing one or more human ferritin H chains.
  • the details of the human ferritin H chain and human ferritin particles are as described above.
  • the human ferritin particles indicated by X1 and X2 may be the same or different, but are preferably the same.
  • human ferritin particles containing one or more human ferritin heavy chains may contain one or more modified human ferritin heavy chains and one or more unmodified human ferritin heavy chains.
  • Y indicates an IgG antibody. Details of the IgG antibody are as described above.
  • L1 and L2 each represent a linker.
  • An IgG antibody and two human ferritin particles are linked via such a linker.
  • the linkers represented by L1 and L2 may be the same or different, but are preferably the same.
  • the linker may contain a peptide portion, but preferably does not contain a peptide portion. This is because the peptide portion has potential immunogenicity and is susceptible to hydrolysis in blood.
  • Methods for regioselectively linking an antibody to a target substance via a linker containing a peptide moiety include, for example, WO2016/186206, WO2017/209471, and WO2017/217347. Publication WO 2018/230257.
  • Methods for regioselectively linking an antibody to a target substance via a linker that does not contain a peptide portion include, for example, WO2018/199337, WO2019/240287, and WO2019/240288. No. WO 2020/009165 and WO 2020/090979.
  • specific amino acid residues in the heavy chain of an antibody can be regioselectively modified without using a linker containing a peptide moiety.
  • linkers that do not contain peptide moieties is desirable in clinical applications.
  • Two human ferritin particles denoted by X1 and X2, respectively, through atoms in the side chains of amino acid residues present at the same positions in the human ferritin H chain contained therein, are denoted by L1 and L2. linked to individual linkers.
  • the human ferritin particle is linked to the linker via atoms in the side chains of such amino acid residues to achieve regioselectivity for the site of attachment of the human ferritin particle to the IgG antibody.
  • an atom in the side chain of an amino acid residue at the same position in the human ferritin H chain is a cysteine residue (e.g., position 91 and/or 103 according to the standard position of the native human ferritin H chain). is the sulfur atom in the side chain of the cysteine residue present in
  • the IgG antibody designated Y is linked to two heavy chain constant regions designated L1 and L2 via atoms in the side chains of amino acid residues at the same position in the two heavy chain constant regions. It may be linked to a linker.
  • linker By linking the IgG antibody to the linker through atoms in the side chains of such amino acid residues, regioselectivity is achieved for the site of attachment of the IgG antibody to human ferritin particles.
  • amino acid residues include amino acid residues (e.g., lysine residues, aspartic acid residues, glutamic acid residues) having easily modifiable side chains (e.g., amino group, carboxyl group, amide group, hydroxy group, thiol group).
  • amino acid residues are lysine residues with side chains containing amino groups (through the nitrogen atom), tyrosine residues with side chains containing hydroxy groups, serine residues, and threonine residues ( via an oxygen atom), or a cysteine residue with a side chain containing a thiol group (via a sulfur atom).
  • atoms in the side chains of amino acid residues at the same positions in the two heavy chain constant regions are lysine residues (e.g. positions 246/248, 288 /A nitrogen atom in the side chain of the lysine residue at position 290 or 317).
  • lysine residues e.g. positions 246/248, 288 /A nitrogen atom in the side chain of the lysine residue at position 290 or 317.
  • the human ferritin particles may be homo24mers of human ferritin H chains, each particle containing the following average numbers of the following human ferritin H chains (a) and (b): : (a) the number of modified human ferritin H chains that are not linked to a linker and introduced with a modification group, n; and (b) the number of unmodified human ferritin H chains, m;
  • n is a number from 0 to 23
  • m is a number from 0 to 23
  • the sum of n and m is 23.
  • n and m are 23 in the above (a) and (b) because one of the 24 human ferritin H chains constituting the human ferritin particles is used for binding to the IgG antibody. It is for That is, the total number of n and m is 23 because the number of human ferritin H chains in the human ferritin particles that are not used for ligation with the IgG antibody is 23.
  • n and m can be determined as follows. First, after treating a solution containing the IgG antibody of the present invention under conditions capable of dissociating human ferritin particles, the solution is subjected to chromatography to obtain (a) no linker and no modification group introduced. (b) unmodified human ferritin heavy chain; (c) the conjugate of two modified ferritin heavy chains connected via a linker and an IgG antibody. Next, determine the average numbers n and m by calculating the ratio of (a) and (b) from the area ratio of the peaks of (a) and (b) and multiplying this ratio by 23. can be done.
  • n and m may be expressed as integers, but may also be expressed as numbers having values with one decimal place or less.
  • the ratio of the modified human ferritin H chain and the unmodified human ferritin H chain contained in the human ferritin particles linked to the IgG antibody may not be uniform in all human ferritin particles. This is because the value can be calculated.
  • the human ferritin particles may be homo24mers (mosaic bodies) of human ferritin H chains, which contain an average number of 1 or more unmodified human ferritin H chains.
  • n is a number from 0 to 22
  • m is a number from 1 to 22
  • the sum of n and m is 23.
  • the human ferritin particles may be homo24mers (mosaic) of human ferritin heavy chains, comprising an average number of 12 or more unmodified human ferritin heavy chains.
  • n is a number from 0 to 11
  • m is a number from 12 to 23, and the sum of n and m is 23.
  • more than half of the human ferritin H chains constituting the human ferritin particles are non-modified human ferritin H chains, and highly non-modified human ferritin particles can be provided.
  • n is a number from 0 to 10 and m is a number from 13 to 23; (ii) n is a number from 0 to 9 and m is a number from 14 to 23; (iii) n is a number from 0 to 8 and m is a number from 15 to 23; (iv) n is a number from 0 to 7 and m is a number from 16 to 23; (v) n is a number from 0 to 6 and m is a number from 17 to 23; (vi) n is a number from 0 to 5 and m is a number from 18 to 23; (vii) n is a number from 0 to 4 and m is a number from 19 to 23; (viii) n is a number from 0 to 3 and m is a number from 20 to 23; (ix) n is a number from 0 to
  • the present invention also provides a method for producing the conjugate of the present invention or a salt thereof.
  • Method (1) The present invention provides a method for producing a complex or a salt thereof comprising (A) one IgG antibody and (B) two human ferritin particles containing one or more human ferritin H chains linked thereto. offer.
  • the method of the present invention includes the following (1) to (3): (1) introducing a first reactive group into an IgG antibody to produce a modified IgG antibody comprising two first reactive groups; (2) introducing a second reactive group capable of reacting with the first reactive group into human ferritin particles containing one or more human ferritin H chains, thereby obtaining one or more modified human ferritin particles containing the second reactive group; (3) reacting said modified IgG antibody with said modified particles to obtain said complexes.
  • Step (1) can be performed by any method that can introduce two first reactive groups into the IgG antibody.
  • the introduction of the first reactive group into the IgG antibody can be done regioselectively.
  • Site-selective introduction of an IgG antibody can be performed in the same manner as the method of site-selectively linking an antibody to a target substance as described above (see the above-mentioned references).
  • a first reactive group can be regioselectively introduced to specific amino acid residues in two heavy chains in an IgG antibody without using a linker containing a peptide moiety.
  • Specific amino acid residues include the amino acid residues described above, and lysine residues (e.g., lysine residues at positions 246/248, lysine residues at positions 288/290, and lysine residues at position 317) are preferable.
  • Step (2) can be performed by any method that can introduce a second reactive group capable of reacting with the first reactive group into the human ferritin particles containing one or more human ferritin H chains.
  • Introduction of the second reactive group to the human ferritin particles can be performed via the human ferritin H chain.
  • introduction of the second reactive group into the human ferritin particles is performed by cysteine residues present in the human ferritin H chain (e.g., at positions 91 and/or 103 according to the standard position of the natural human ferritin H chain). It can be done through the sulfur atom in the side chain of the cysteine residue).
  • cysteine residues present in the human ferritin H chain e.g., at positions 91 and/or 103 according to the standard position of the natural human ferritin H chain. It can be done through the sulfur atom in the side chain of the cysteine residue).
  • the thiol-modifying reagent used in the present invention is a reactive substance containing at least one reactive site for a thiol group, and has the ability to add a modifying group containing a reactive group to human ferritin by reaction. . Any reagent capable of catalyzing such a reaction can be used as a thiol-modifying reagent.
  • thiol-modifying reagents include maleimide moieties, benzyl halide moieties, ⁇ -haloamide moieties, ⁇ -haloketone moieties, alkene moieties, alkyne moieties, fluoroaryl moieties, nitroaryl moieties, methylsulfonyloxadiazole moieties, and Those containing one or more partial structures selected from the group consisting of disulfide moieties and a second reactive group are preferred.
  • step (3) the modified IgG antibody obtained in step (1) above is reacted with the modified particles obtained in step (2) above.
  • the first reactive group introduced into the modified IgG antibody and the second reactive group introduced into the modified particles react with each other to obtain the conjugate of the present invention or a salt thereof.
  • the molar ratio of the modified IgG antibody to the modified particles in the reaction is, for example, 30:1 to 1:30, preferably 20:1 to 1:20, more preferably 15:1 to 1:15. good.
  • the reaction may be set based on the molar ratio between the first reactive group introduced into the modified IgG antibody and the second reactive group introduced into the modified particle.
  • the molar ratio of the first reactive group to the second reactive group in the reaction is, for example, 1:1 to 1:30, preferably 1:1 to 1:20, more preferably 1:1 to 1:15. may be within
  • the reactions of steps (1) to (3) above can be appropriately carried out under conditions (mild conditions) that do not cause protein denaturation/decomposition (eg, cleavage of amide bonds).
  • a reaction can be carried out in an appropriate reaction system, such as a buffer solution, under temperature conditions that do not cause denaturation/decomposition of ferritin (for example, about 15 to 60°C, preferably 15 to 45°C).
  • the pH of the buffer is, for example, 3.0 to 12.0, preferably 5.0 to 9.0, more preferably 6.0 to 8.0.
  • the buffer may contain components such as catalysts.
  • the reaction time is, for example, 1 minute to 20 hours, preferably 10 minutes to 15 hours, more preferably 20 minutes to 10 hours, still more preferably 30 minutes to 8 hours.
  • the methods of the invention comprise (A) an IgG antibody and (B) linked thereto one or more modified human ferritin heavy chains and one or more unmodified human ferritins. It may be a method for producing a complex containing two H chain-containing human ferritin particles or a salt thereof.
  • such method (2-1) of the present invention comprises the following (1) to (4): (1) introducing a first reactive group into an IgG antibody to produce a modified IgG antibody comprising two first reactive groups; (2) introducing a second reactive group capable of reacting with the first reactive group into human ferritin particles containing two or more human ferritin H chains, thereby obtaining two or more modified human ferritin particles containing the second reactive group; producing first modified particles comprising ferritin heavy chains; (3) In the first modified particle, a portion of the two or more modified human ferritin H chains is replaced with an unmodified human ferritin H chain to obtain one or more modified human ferritin H chains and one or more non-modified human ferritin H chains. producing a second modified particle comprising a modified human ferritin heavy chain; and (4) reacting said modified IgG antibody with said second modified particle to obtain said complex.
  • Steps (1) and (2) in method (2-1) can be performed in the same manner as steps (1) and (2) in method (1).
  • step (3) of method (2-1) in the first modified particles containing two or more modified human ferritin H chains containing a second reactive group, a portion of the two or more modified human ferritin H chains is replaced by unmodified human ferritin heavy chain.
  • a portion of two or more modified human ferritin H chains that is, at least one modified human ferritin H chain
  • is exchanged for an unmodified human ferritin H chain so that one or more modified human ferritin H chains
  • a second modified particle is produced comprising a chain and one or more unmodified human ferritin heavy chains.
  • the above exchange comprises first modified particles comprising two or more modified human ferritin H chains containing second reactive groups, and unmodified human ferritin particles comprising unmodified human ferritin H chains, human ferritin from human ferritin particles.
  • This can be done by coexisting under conditions that allow the dissociation of the H chains and the re-association from the human ferritin H chains to the human ferritin particles.
  • Such dissociation and reassociation have been utilized in encapsulating various substances in the lumen of ferritin particles (e.g., WO2020/090708; Chinese Patent Application Publication No. 106110333; Journal of Controlled Release 196 (2014) 184-196; Biomacromolecules 2016, 17, 514-522; Proc Natl Acad Sci USA.
  • the condition that allows dissociation is to place the ferritin particles in an aqueous solution of pH 1.5-3.0 adjusted with an acid (eg, hydrochloric acid, glycine hydrochloride, sulfuric acid) (eg, 4-30 °C for 5-60 minutes).
  • an acid eg, hydrochloric acid, glycine hydrochloride, sulfuric acid
  • a condition that allows reassociation is placing the ferritin particles in an aqueous solution of pH 1.5-3.0 (eg, 4-30° C. for 30-180 minutes).
  • a buffer e.g., Tris buffer, HEPES buffer, phosphate buffer, borate buffer, citrate buffer, carbonate buffer, glycine buffer
  • a buffer e.g., Tris buffer, HEPES buffer, phosphate buffer, borate buffer, citrate buffer, carbonate buffer, glycine buffer
  • the molar ratio of unmodified human ferritin particles to first modified particles is, for example, 1 or more, 1.5 or more, 2 or more, 2.5 or more, 3 or more, 4 or more. , 5 or more, 6 or more, 7 or more, 9 or more, or 10 or more.
  • the molar ratio may also be 50 or less, 40 or less, 30 or less, or 20 or less.
  • the average number of unmodified human ferritin H chains in the second modified particles can be set to 1 or less.
  • one modified human ferritin H chain and 23 unmodified human ferritin H chains that can be linked to the linker during the reaction of step (4) are included because one of them is used in the reaction of step (4).
  • Step (4) in method (2-1) can be performed in the same manner as step (3) in method (1).
  • such method (2-2) of the present invention comprises the following (1) to (4): (1) introducing a first reactive group into an IgG antibody to produce an IgG antibody comprising two first reactive groups; (2) introducing a second reactive group capable of reacting with the first reactive group into human ferritin particles containing two or more human ferritin H chains, thereby obtaining two or more modified human ferritin particles containing the second reactive group; producing first modified particles comprising ferritin heavy chains; (3) reacting the modified IgG antibody with the first modified particles to produce (A') one IgG antibody and (B') two or more modified human ferritin H chains linked thereto; and (4) (A') one IgG antibody, and (B') two or more modified human linked thereto. (A) one (A) one and (B) linked thereto two human ferritin particles comprising one or more modified human ferritin H chains and one or more unmodified human ferritin H chains, or a salt thereof to get
  • Steps (1) to (3) in method (2-2) can be performed in the same manner as steps (1) to (3) in method (1).
  • step (4) in method (2-2), (A′) one IgG antibody and (B′) two human ferritins comprising two or more modified human ferritin H chains linked thereto
  • two or more portions of the modified human ferritin H chains are exchanged for non-modified human ferritin H chains.
  • a portion of two or more modified human ferritin H chains (that is, at least one modified human ferritin H chain) is exchanged for an unmodified human ferritin H chain, so (A) one IgG antibody and (B) two human ferritin particles comprising one or more modified human ferritin heavy chains and one or more unmodified human ferritin heavy chains linked thereto or a salt thereof is produced.
  • the exchange comprises (A′) one IgG antibody and (B′) linked thereto two human ferritin particles comprising two or more modified human ferritin H chains, or a complex or a salt thereof; and unmodified human ferritin particles containing unmodified human ferritin H chains under conditions that allow dissociation and reassociation as described above.
  • Such dissociation and reassociation have been utilized in encapsulating various substances within the lumen of ferritin particles. Therefore, encapsulation of the substance in the lumen of the ferritin particles may be performed at the same time in this step.
  • the conditions that allow dissociation and the conditions that allow reassociation are as described above.
  • the molar ratio of unmodified human ferritin particles to raw material complexes is, for example, 1 or more, 1.5 or more, 2 or more, 2.5 or more, 3 or more, 4 or more, 5 , 6 or more, 7 or more, 9 or more, or 10 or more.
  • the molar ratio may also be 50 or less, 40 or less, 30 or less, or 20 or less.
  • the average number of unmodified human ferritin H chains in the resulting complex or salt thereof can be set to one.
  • modified human ferritin particles enriched in unmodified human ferritin H chains can be produced, including one modified human ferritin H chain and 23 unmodified human ferritin H chains linked to linkers.
  • the method of the present invention further includes the step of encapsulating a substance in the lumen of human ferritin particles, and if a modified human ferritin H chain having a modifying group remains in the human ferritin particle, a functional substance is added to such a modifying group.
  • a further step of reacting may be included.
  • Confirmation of the conjugate of the present invention or a salt thereof can be performed, for example, by electron microscopy, electrophoresis, chromatography (eg, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reversed-phase column chromatography, HPLC), and/or mass spectrometry. It can be done by When the complex of the present invention or a salt thereof contains a modified human ferritin H chain having a modifying group, it is appropriately selected from the above methods depending on the type and molecular weight of the modifying group. Confirmation of regioselectivity can be performed, for example, by peptide mapping.
  • Peptide mapping can be performed, for example, by protease (eg, trypsin, chymotrypsin) treatment and mass spectrometry.
  • protease eg, trypsin, chymotrypsin
  • an endoprotease is preferred.
  • Such endoproteases include, for example, trypsin, chymotrypsin, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N.
  • Modified ferritin can be appropriately purified by any method such as chromatography (eg, the above-described chromatography and affinity chromatography).
  • positions of amino acid residues in human ferritin are specified based on a typical natural human ferritin H chain defined by the amino acid sequence of SEQ ID NO:1. If necessary, the position of the amino acid sequence of SEQ ID NO:3 may also be indicated.
  • PCR was performed using 5'-GAAGGAGATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3' (SEQ ID NO: 4) and 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3' (SEQ ID NO: 5) as primers.
  • PCR was performed using pET20 (Merck) as a template and 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3' (SEQ ID NO: 6) and 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3' (SEQ ID NO: 7) as primers.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) into which the constructed pET20-FTH was introduced was added to LB medium (10 g/l Bacto-typone, 5 g/l Bacto-yeast extract, 5 g/l NaCl, 100 mg/l ampicillin). (containing) was cultured in a 100 ml flask at 37° C. for 24 hours. After sonicating the obtained cells, the supernatant was heated at 60° C. for 20 minutes.
  • the solution was injected into a HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column (Cytiva) equilibrated with 10 mM TrisHCl buffer (pH 8.0) to separate and purify FTH.
  • the FTH-containing solution was concentrated by centrifugal ultrafiltration using Vivaspn 20-100K (Cytiva), and the contained protein concentration was determined with a protein assay CBB solution (Nacalai Tesque) using bovine albumin as a standard. As a result, 1 ml of a solution containing 5 mg/ml of FTH was obtained per 100 ml of culture solution.
  • Reference Example 2 Specific Modification of Human Ferritin H Chain with Ethylmaleimide and ESI-TOFMS Analysis
  • 2-1 Specific Modification of Human Ferritin H Chain with Ethylmaleimide and ESI-TOFMS Analysis Human ferritin H expressed in Reference Example 1
  • the strands were dissolved in PBS buffer pH 7.4 to a concentration of 5.0 mg/ml.
  • Ethylmaleimide was dissolved in N,N-dimethylformamide to a concentration of 20 mM. After adding 6 equivalents of ethylmaleimide (based on the molar amount; the same shall apply hereinafter) to the aqueous solution containing the human ferritin H chain and stirring, the mixture was reacted with shaking at room temperature for 1 hour.
  • the reaction solution was replaced with a 20 mM ammonium acetate buffer, and the mass was measured by ESI-TOFMS.
  • a peak at 21093 was observed for the raw material human ferritin H chain, and a peak at 21344 was confirmed for the product in which two ethylmaleimide (molecular weight: 125) was introduced (Fig. 2).
  • Reference Example 3 Peptide Mapping of Ethylmaleimide-Conducted Human Ferritin H Chain (3-1) Trypsin Treatment of Ethylmaleimide-Conducted Human Ferritin H Chain After adding 10 ⁇ L of 50 mM Tris-HCl buffer/8 M urea and 10 ⁇ L of trifluoroethanol and stirring, 15 ⁇ L of 48 mM dithiothreitol aqueous solution was added. After heating at 65° C. for 1 hour, 15 ⁇ L of 120 mM iodoacetamide aqueous solution was added and reacted at room temperature for 60 minutes under light shielding.
  • Reference Example 4 Specific modification of human ferritin H chain with p-azidophenacyl bromide and ESI-TOFMS analysis (4-1) Specific modification of human ferritin H chain with 6 equivalents of p-azidophenacyl bromide and ESI-TOFMS Analysis
  • the human ferritin H chain expressed in Reference Example 1 was dissolved in PBS buffer of pH 7.4 to a concentration of 5.0 mg/ml.
  • p-azidophenacyl bromide was dissolved in N,N-dimethylformamide to a concentration of 20 mM.
  • reaction solution was replaced with a 20 mM ammonium acetate buffer, and the mass was measured by ESI-TOFMS.
  • a peak was observed at 21093 for the raw material human ferritin H chain, and peaks at 21252 and 21412, respectively, where one p-azidophenacyl (molecular weight: 160) was introduced and two were introduced (FIG. 6).
  • Reference Example 5 Peptide mapping of p-azidophenacyl derivative of human ferritin H chain (5-1) Trypsin treatment of p-azidophenacyl derivative of human ferritin H chain Ethylmaleimide of human ferritin heavy chain prepared in Reference Example 2 Referential Example 3 (3- In the same manner as in 1), the ethylmaleimide derivative of human ferritin heavy chain was subjected to LC-MS/MS measurement.
  • Reference Example 6 Specific Modification of Human Ferritin H Chain with Cy5-PEG-Maleimide and ESI-TOFMS Analysis (6-1) Specific Modification of Human Ferritin H Chain with Cy5-PEG-Maleimide and ESI-TOFMS Analysis Reference Example 1 was dissolved in PBS buffer of pH 7.4 to a concentration of 5.0 mg/ml. Cy5-PEG-maleimide (Broad Pharm, BP-23037) was dissolved in N,N-dimethylformamide to a concentration of 20 mM. After adding 6 equivalents of Cy5-PEG-maleimide to the aqueous solution containing the H chain of human ferritin and stirring, the mixture was reacted with shaking at room temperature for 1 hour.
  • reaction solution was replaced with a 20 mM ammonium acetate buffer, and the mass was measured by ESI-TOFMS.
  • a peak at 21094 was observed for the raw material human ferritin H chain, and a peak at 22836 where two Cy5-PEG-maleimides (molecular weight 871) were introduced was confirmed for the product (FIG. 10).
  • Reference Example 7 Specific Modification of Human Ferritin H Chain with DBCO-PEG4-Maleimide and ESI-TOFMS Analysis (7-1) Specific Modification of Human Ferritin H Chain with DBCO-PEG4-Maleimide and ESI-TOFMS Analysis Reference Example 1 was dissolved in PBS buffer of pH 7.4 to a concentration of 5.0 mg/ml. DBCO-PEG4-maleimide (Broad Pharm, BP-22294) was dissolved in N,N-dimethylformamide to a concentration of 20 mM.
  • Reference Example 8 Specific modification of human ferritin H chain with 1,3-dichloroacetone, oxime ligation with aminooxy-PEG5-azide, and ESI-TOFMS analysis (8-1) Human ferritin H chain with 1,3-dichloroacetone Specific Modification and ESI-TOFMS Analysis
  • the human ferritin H chain expressed in Reference Example 1 was dissolved in PBS buffer of pH 7.4 to a concentration of 5.0 mg/ml.
  • 1,3-Dichloroacetone was dissolved in N,N-dimethylformamide to a concentration of 20 mM.
  • reaction solution was replaced with a 20 mM ammonium acetate buffer, and the mass was measured by ESI-TOFMS.
  • a peak at 21148 was observed for the starting human ferritin H chain acetone-modified product, and a peak at 21452 was confirmed for the product, in which one aminooxy-PEG5-azide (molecular weight: 304) was introduced (Fig. 12).
  • Example 1 Synthesis of specifically modified antibody (1-1) Synthesis of site-specifically modified antibody by DBCO-maleimide
  • thiol group-introduced trastuzumab was reacted with dibenzocyclooctyne (DBCO)-maleimide.
  • DBCO dibenzocyclooctyne
  • an antibody derivative (thiol group-introduced trastuzumab) described in Example 81-7 of WO 2019/240287 was used.
  • This antibody derivative has the following structure in which a thiol group is regioselectively introduced into trastuzumab (humanized IgG1 antibody) via the side chain amino group of the lysine residue at position 246 or 248 of the antibody heavy chain. (the position of the lysine residue follows EU numbering).
  • thiol group-introduced trastuzumab was reacted with dibenzocyclooctyne (DBCO)-PEG-maleimide.
  • DBCO dibenzocyclooctyne
  • the antibody derivative described in Example (1-1) was used as the antibody.
  • Example 2 Specific modification of human ferritin H chain with p-azidophenacyl bromide
  • human ferritin particles composed of 24-mers of human ferritin H chain were reacted with p-azidophenacyl bromide. .
  • Human ferritin particles were dissolved in pH 7.4 PBS buffer to a concentration of 2.5 mg/ml (final concentration 5 ⁇ M).
  • p-azidophenacyl bromide was dissolved in N,N-dimethylformamide to a concentration of 100 mM.
  • 106 equivalents of p-azidophenacyl bromide was added to the aqueous solution containing human ferritin particles and stirred, followed by shaking reaction at 25° C. for 1 hour.
  • the reaction solution was replaced with a 20 mM ammonium acetate buffer, and the mass was measured by ESI-TOFMS.
  • azidated ferritin having 48 azide groups per cage structure composed of human ferritin H chain 24-mer (considering the above reference example, two cysteine residues at positions 91 and 103 in human ferritin H chain Production of a modified human ferritin H chain 24-mer) in which a modifying group containing an azide group was introduced to the sulfur atom in the side chain of was confirmed.
  • Example 3 Construction of antibody-human ferritin complex (1)
  • the DBCO-modified antibody obtained in Example 1 and the azide ferritin obtained in Example 2 were allowed to react.
  • the alkyne moiety in DBCO can be easily reacted with an azide group by a click reaction under mild conditions. Therefore, by reacting a DBCO-modified antibody with azide ferritin, an IgG antibody (antibody-human ferritin complex) linked to two human ferritin particles can be generated.
  • the DBCO-modified antibody obtained in Example 1 and the azide ferritin particles obtained in Example 2 were each dissolved in a PBS buffer of pH 7.4 to a final concentration of 2.5 ⁇ M, and shaken at 25°C for 1 hour. let me The resulting sample was diluted 12.5-fold with water, mixed with Laemmli sample buffer (Biorad) containing 5% ⁇ -mercaptoethanol at a ratio of 1:1, and then heat-treated at 95°C for 5 minutes. A 10 ⁇ l portion of the solution was analyzed by SDS-PAGE.
  • Example 4 TEM Analysis of Antibody-Human Ferritin Complex The structure of the antibody-human ferritin complex obtained in Example 3 was confirmed by a transmission electron microscope (TEM) image stained with 3% phosphotungstic acid.
  • TEM transmission electron microscope
  • the antibody-human ferritin complex obtained in Example 3 is an antibody linked to two human ferritin particles (the azide groups in the ferritin H chains in the two human ferritin particles are reacted with DBCO group).
  • Example 5 Construction of antibody-human ferritin complex (2)
  • the DBCO-modified antibody or DBCO-PEG-modified antibody obtained in Example 1 and the azide ferritin particles obtained in Example 2 were reacted at several ratios.
  • the DBCO-modified antibody or DBCO-PEG-modified antibody obtained in Example 1 was added to a pH 7.4 PBS buffer in which the azide-ferritin particles obtained in Example 2 were dissolved to a final concentration of 1.0 ⁇ M. Each was added to a final concentration of 2.5 ⁇ M, 5.0 ⁇ M, or 12.5 ⁇ M, and reacted with shaking at 25° C. for 1 hour. At this time, the quantitative ratio of the azide groups presented on the azide ferritin particles to the DBCO groups of each modified antibody was 10:1, 5:1 or 2:1.
  • the sample was diluted 5-fold with water, mixed with Laemmli sample buffer (Biorad) containing 5% ⁇ -mercaptoethanol at a ratio of 1:1, and then heat-treated at 95° C. for 5 minutes. 10 ⁇ l of the solution was analyzed by SDS-PAGE.
  • Laemmli sample buffer Biorad
  • Example 6 Construction of antibody-human ferritin complex (mosaic complex) (3)
  • the number of unreacted azidated human ferritin H chains was reduced. .
  • the antibody-human ferritin complex obtained in Example 5 was suspended in 100 mM glycine hydrochloride buffer (pH 2.3) so that the final concentration per ferritin was 0.8 ⁇ M.
  • Unmodified human ferritin particles (unmodified human ferritin H chain 24-mer) were added to the solution to a final concentration of 20 ⁇ M, and allowed to stand at 25° C. for 15 minutes to disassociate the ferritin particle cage structure. rice field.
  • a Tris hydrochloride buffer pH 9.0 was added to a final concentration of 200 mM to reassociate the antibody-linked human ferritin H chain with the unmodified ferritin H chain.
  • this mosaic complex was injected into a Superdex200 increase 10/30 GL column (Cytiva) equilibrated with PBS (pH 7.4) and separated and purified according to size at a flow rate of 0.8 ml/min.
  • Example 7 ESI-TOFMS Analysis of Antibody-Human Ferritin Complex (Mosaic Complex)
  • the solution containing the antibody-human ferritin complex obtained in Example 6 was replaced with a 20 mM ammonium acetate buffer, followed by a previously reported (Anal. Chem., 2019, 91, 20, 12724-12732), mass was measured by ESI-TOFMS.
  • Example 8 Construction of Mosaic Ferritin Particles
  • Unmodified human ferritin particles consisting of 24-mers of unmodified human ferritin H chain were obtained in Example 2 at a final concentration of 6.0 ⁇ M in 2 mL of 100 mM glycine hydrochloride buffer at pH 2.2.
  • azidated ferritin particles modified human ferritin particles consisting of 24-mers of modified human ferritin H chains to which bioorthogonal functional groups have been introduced
  • were mixed to a final concentration of 2.0 ⁇ M and allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
  • 0.2 mL of 1 M Tris hydrochloride buffer was added to neutralize and allowed to stand at room temperature for 1 hour (reaggregation process).
  • the resulting solution was injected into a HiTrap Q FF 1 mL column (Cytiva) equilibrated with 50 mM TrisHCl buffer (pH 8.0), and the 50 mM TrisHCl buffer containing 0 M to 1 M NaCl was injected at an elution rate of 1 mL/min.
  • Mosaic ferritin particles were separated and purified according to the difference in surface charges by applying a salt concentration gradient at pH 8.0.
  • the solvent of the solution containing mosaic ferritin particles was replaced with 10 mM TrisHCl buffer (pH 8.0) by centrifugal ultrafiltration using Vivaspn 20-100K (Cytiva).
  • the ratio of unmodified ferritin H chains and modified ferritin H chains (azidated ferritin H chains) constituting the recovered mosaic ferritin particles was analyzed by reversed-phase chromatography.
  • a 0.1% by volume trifluoroacetic acid aqueous solution was used as the mobile phase A, and an 80% by volume acetonitrile aqueous solution containing 0.1% by volume trifluoroacetic acid was used as the mobile phase B.
  • a 10 ⁇ L sample was applied to PLRP-S 300A 3 ⁇ M 150 ⁇ 4.6 MM (Agilent Technologies) equilibrated with a solution of mobile phase A 70% and mobile phase B 30%.
  • the unmodified ferritin H chain and the modified ferritin H chain could be separated (Fig. 21).
  • the ratio of the modified ferritin H chain and the modified ferritin H chain (azidated ferritin H chain) contained in the mosaic ferritin particles was 2.7 to 1.0. , which was found to contain an average of 6 to 7 azide ferritin subunits per mosaic ferritin particle. It was also found that an average of 12 to 14 azide groups were presented per one mosaic ferritin particle.
  • Example 9 Construction of antibody-human ferritin complex (mosaic complex) (4)
  • the DBCO-PEG-modified antibody obtained in Example 1 was added to 50 mM HEPES buffer (pH 8.0) or 50 mM CHES buffer (pH 9.0) in which the mosaic ferritin particles obtained in Example 8 were dissolved to a final concentration of 5.0 ⁇ M. was added to a final concentration of 1.0 ⁇ M and shaken at 25° C. for 18 hours to generate an IgG antibody (mosaic complex) linked to two human ferritin particles.
  • the resulting solution was injected into a HiTrap Q FF 1 mL column (Cytiva) equilibrated with 50 mM TrisHCl buffer (pH 8.0), and eluted at an elution rate of 1 mL/min.
  • a salt concentration gradient with a TrisHCl buffer (pH 8.0)
  • the target protein was separated and purified according to the difference in surface charge.
  • the ratio of unmodified ferritin H chains and modified ferritin H chains (azidated ferritin H chains) constituting mosaic ferritin particles in the recovered mosaic complex was analyzed by reversed-phase chromatography.
  • a 0.1% by volume trifluoroacetic acid aqueous solution was used as the mobile phase A, and an 80% by volume acetonitrile aqueous solution containing 0.1% by volume trifluoroacetic acid was used as the mobile phase B.
  • a 10 ⁇ L sample was applied to PLRP-S 300A 3 ⁇ M 150 ⁇ 4.6 MM (Agilent Technologies) equilibrated with a solution of mobile phase A 70% and mobile phase B 30%.
  • the resulting sample was mixed with a Laemmli sample buffer (Biorad) containing 5% ⁇ -mercaptoethanol at a ratio of 1:1, and then heat-treated at 95°C for 5 minutes.
  • a protein band of around 100 kDa formed by complexing the ferritin H chain and the antibody heavy chain which was not observed with the antibody or ferritin particles alone, could be observed only in the complex reaction sample. (Fig. 24).
  • the band obtained by this conjugation reaction is the antibody heavy chain and the azide ferritin H chain (monomer). mers) were thought to be two covalently complexed proteins.

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Abstract

本発明は、抗体およびフェリチン粒子を含む、高度に制御された複合体を提供する。より具体的には、本発明は、下記（Ｉ）および（ＩＩ）の発明を提供する。 （Ｉ）（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、および（Ｂ）それに連結されている、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む、複合体またはその塩。 （ＩＩ）下記（１）～（３）を含む、複合体またはその塩の製造方法： （１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含む修飾ＩｇＧ抗体を生成すること； （２）１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む修飾粒子を生成すること；ならびに （３）前記修飾ＩｇＧ抗体を前記修飾粒子と反応させて、前記複合体を得ること。

Description

複合体またはその塩、およびその製造方法
　本発明は、複合体またはその塩、およびその製造方法に関する。
　フェリチン粒子は、動植物から微生物まで普遍的に存在する、複数の単量体から構成される内腔を有する球状タンパク質である。ヒト等の動物では、フェリチン粒子を構成する単量体としてＨ鎖およびＬ鎖の２種の単量体が存在すること、ならびにフェリチン粒子は２４個の単量体から構成される多量体（多くの場合、Ｈ鎖およびＬ鎖の混合物）であって、外径１２ｎｍのカゴ状の形態および内径７ｎｍの内腔を有することが知られている。また、フェリチン粒子を構成する単量体のＮ末端は、２４量体の表面上に露出するものの、当該単量体のＣ末端は表面上に露出せず内腔中に存在する。フェリチン粒子は、その内腔中に鉄を保持でき、鉄の輸送・貯蔵等の生理学的機能の役割を担うことにより、生体あるいは細胞中の鉄元素のホメオスタシスに深く関与している。フェリチン粒子はまた、比較的容易に解離および会合し得ることから、それを含む溶媒等の条件に応じて、２４量体もしくは単量体の形態、またはそれらが共存した形態となる。したがって、フェリチン粒子を含む溶媒等の条件を適宜調整することにより、２４量体を単量体に解離させることができ、また、解離した単量体を２４量体へと再会合させることができる。また、再会合の際、所定の物質をフェリチン単量体と溶媒中で共存させることで、再会合した２４量体の内腔中に当該物質を封入できることも知られている。
　近年、抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）の研究開発が盛んに行われている。ＡＤＣはその名の通り、抗体に薬物（例、抗がん剤）をコンジュゲーションした薬剤であり、がん細胞などに対して直接的な殺細胞活性を有する。代表的なＡＤＣとしては、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ社およびＲｏｃｈｅ社が共同開発したＴ－ＤＭ１（商品名：カドサイラ（登録商標））がある。
　Ｔ－ＤＭ１を始めとするＡＤＣは、開発当初からその不均一性が問題となっている。すなわち、薬物抗体比（Ｄｒｕｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｒａｔｉｏ：ＤＡＲ）やコンジュゲーション位置が一定ではない。通常このようなランダムコンジュゲーション法になるとＤＡＲが０～８の範囲となり、薬物の結合数が異なる複数の抗体薬剤が生じることが分かっている。近年ＡＤＣの薬物の結合数および結合位置を変化させると、体内動態や薬物の放出速度、効果が変化することが報告されている。これらのことから次世代型ＡＤＣではコンジュゲーションする薬物の個数と位置を制御することが求められている。個数および位置が一定であると、期待通りのｅｆｆｉｃａｃｙ、コンジュゲーション薬剤のバリエーション、ロット差いわゆるレギュレーションの問題が解決すると考えられている。
　フェリチン粒子についても、抗体との複合体が知られている。
　特許文献１には、抗体（ナノボディ）およびフェリチン単量体の融合タンパク質を単量体単位とする抗体（ナノボディ）およびフェリチン粒子の複合体が報告されている。この複合体は、抗体およびフェリチン単量体の融合タンパク質を用いるため、抗体およびフェリチン粒子の比率（抗体／フェリチン粒子）は、フェリチン粒子を構成するフェリチン単量体の数に対応する。したがって、フェリチン粒子が、抗体（ナノボディ）およびフェリチン単量体の融合タンパク質のホモ２４量体である場合、１個のフェリチン粒子あたりの抗体数は、２４である。
　非特許文献１には、グルタルアルデヒドを用いて連結されたＩｇＧ抗体およびフェリチン粒子の複合体が記載されている。非特許文献１に記載される方法は、グルタルアルデヒドを用いてフェリチン粒子に対して抗体をランダムに導入するため、抗体に対するフェリチン粒子中の連結部位（すなわち、抗体との連結に用いられたフェリチン単量体中の部位）、およびフェリチン粒子に対する抗体中の連結部位の双方において位置選択性は認められない。また、非特許文献１に記載される方法は、１個のフェリチン粒子あたりの抗体数を制御することができない。
　非特許文献２には、共有結合により連結されたモノクローナル抗体およびフェリチン粒子の複合体が記載されている。この複合体では、遺伝子組換え技術により変異が導入されたフェリチンＬ鎖を用いてフェリチン粒子が構成されている。また、この複合体では、抗体に対するフェリチン粒子中の連結部位に位置選択性は認められない。さらに、非特許文献２に記載される方法は、フェリチン粒子に対して導入される抗体数を特定の一の値に厳密に制御できず、１個のフェリチン粒子あたりの抗体数が１～４の範囲にある複合体（抗体およびフェリチン粒子を異なる比率で含む複数の複合体の混合物）を生成する。
　非特許文献３には、共有結合により連結されたモノクローナル抗体およびフェリチン粒子の複合体が記載されている。この複合体では、フェリチン粒子に対する抗体の連結部位に位置選択性は認められない。また、抗体に対するフェリチン粒子の連結部位における位置選択性については不明である。さらに、非特許文献３に記載される方法は、フェリチン粒子に対して抗体が導入され、１個のフェリチン粒子あたりの抗体数が３である複合体を生成する。
　上述の先行技術に記載される抗体およびフェリチン粒子の複合体はいずれも、フェリチン粒子に対して複数の抗体を導入するという技術思想に基づいて作製されており、１個のフェリチン粒子あたりの抗体数（抗体／フェリチン粒子）が１以上の値となる。フェリチン粒子は、連結に利用可能なフェリチン単量体単位を２４個含む、抗体よりもサイズが大きいタンパク質であり、１個のフェリチン粒子あたり２４個のフェリチン単量体を修飾部位として利用できる。したがって、上述の先行技術に記載される複合体は、１個のフェリチン粒子に対して複数の抗体を導入するという１個のフェリチン粒子を基準とした技術思想により設計されている。
中国特許出願公開第１０８９７６２９９号明細書
Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９７４），７１（５），２０３３－２０３７ Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ（２０１８），２９（４），１２０９－１２１８ Ｎａｎｏｓｃａｌｅ（２０１３），５（２４），１２２７８－８５
　臨床応用では高度な品質管理が要求されるため、抗体およびフェリチン粒子の複合体は、高度に制御されることが望ましい。したがって、本発明の目的は、抗体およびフェリチン粒子を含む、高度に制御された複合体を提供することである。
　本発明者らは、１個のフェリチン粒子に対して複数の抗体を導入するという１個のフェリチン粒子を基準とする上記技術思想ではなく、１個の抗体に対して複数のフェリチン粒子を導入するという１個の抗体を基準として抗体およびフェリチン粒子の複合体を作製することを着想した。本発明者らは、鋭意検討した結果、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子、およびＩｇ抗体を所定の方法により連結することにより、１個の抗体あたりのフェリチン粒子数（フェリチン粒子／抗体）が２に高度に制御された複合体として、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、および（Ｂ）それに連結されている、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む、複合体またはその塩を作製できることを見出した。このような複合体では、１個のフェリチン粒子あたりの抗体数（抗体／フェリチン粒子）が０．５であり、上述の先行技術とは対照的である。本発明者らが把握する限り、先行技術は、１個のフェリチン粒子あたりの抗体数（抗体／フェリチン粒子）が複数である複合体を報告しているが、１個の抗体あたりのフェリチン粒子数（フェリチン粒子／抗体）が複数（特に２）に高度に制御された複合体を記載も示唆もしていない。
　本発明者らはまた、ヒトフェリチンＨ鎖のシステイン残基の側鎖中のチオール基（－ＳＨ）を利用することで、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位のシステイン残基の側鎖中の硫黄原子を、修飾基で位置選択的に修飾でき、ひいてはフェリチン表面に導入される修飾基の数および位置を容易かつ高度に制御できること、ならびに本技術を利用して、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位のシステイン残基の側鎖中の硫黄原子に対して、ＩｇＧ抗体を位置選択的に容易に導入できることを見出した。本発明者らが把握する限り、先行技術は、フェリチン表面に導入される修飾基および抗体の位置を制御するという技術思想を教示も示唆もしていない。
　本発明者らはさらに、ＩｇＧ抗体における特定のリジン残基の側鎖中のアミノ基（－ＮＨ２）を利用することで、ヒトフェリチン粒子を、ｉｇＧ抗体の特定のリジン残基の側鎖中の窒素原子に対して、位置選択的に容易に導入できることを見出した。
　以上のとおり、本発明者らは、抗体およびフェリチン粒子を含む、高度に制御された複合体を提供することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、および（Ｂ）それに連結されている、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む、複合体またはその塩。
〔２〕ヒトフェリチン粒子が、ヒトフェリチンＨ鎖の２４量体である、〔１〕の複合体またはその塩。
〔３〕ヒトフェリチンＨ鎖が、１位のメチオニン残基を欠失していてもよい天然型ヒトフェリチンＨ鎖である、〔１〕または〔２〕の複合体またはその塩。
〔４〕前記複合体が、下記式（１）：
　　Ｘ１－Ｌ１－Ｙ－Ｌ２－Ｘ２　（１）
〔式中、
　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を示し、
　Ｙは、ＩｇＧ抗体であり、
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ、リンカーを示し、
　Ｘ１およびＸ２で示される２個のヒトフェリチン粒子は、それぞれ、それに含まれるヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている。〕で表される、〔１〕～〔３〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔５〕リンカーがペプチド部分を含有しない、〔４〕の複合体またはその塩。
〔６〕ヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子が、システイン残基の側鎖中の硫黄原子である、〔４〕または〔５〕の複合体またはその塩。
〔７〕システイン残基が、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在する、〔６〕の複合体またはその塩。
〔８〕抗体が、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒトモノクローナル抗体である、〔１〕～〔７〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔９〕Ｙで示されるＩｇＧ抗体は、２個の重鎖定常領域中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている、〔４〕～〔８〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔１０〕２個の重鎖定常領域中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子が、リジン残基の側鎖中の窒素原子である、〔９〕の複合体またはその塩。
〔１１〕リジン残基が、ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＩｇＧ抗体重鎖の２４６／２４８位、２８８／２９０位、または３１７位に存在する、〔１０〕の複合体またはその塩。
〔１２〕１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子が、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む、〔１〕～〔１１〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔１３〕ヒトフェリチン粒子が、１粒子あたり、下記（ａ）～（ｃ）の各ヒトフェリチンＨ鎖を下記平均数で含む粒子である、〔１〕～〔１２〕のいずれかの複合体またはその塩：
（ａ）リンカーと連結されている修飾ヒトフェリチンＨ鎖の数　１個；
（ｂ）リンカーと連結されておらず、かつ修飾基が導入されている修飾ヒトフェリチンＨ鎖の数　ｎ個；および
（ｃ）非修飾ヒトフェリチンＨ鎖の数　ｍ個；
　ここで、ｎは０～２３の数であり、ｍは０～２３の数であり、ｎおよびｍの合計は２３である。
〔１４〕ヒトフェリチン粒子が、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を平均数１個以上で含む粒子である、〔１〕～〔１３〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔１５〕ヒトフェリチン粒子が、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を平均数１２個以上で含む粒子である、〔１〕～〔１４〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔１６〕修飾基が反応性基を含む、〔１３〕～〔１５〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔１７〕反応性基がタンパク質に対する生体直交性官能基である、〔１６〕の複合体またはその塩。
〔１８〕タンパク質に対する生体直交性官能基が、マレイミド部分、アジド部分、ケトン部分、アルデヒド部分、チオール部分、アルケン部分、アルキン部分、ハロゲン部分、テトラジン部分、ニトロン部分、ヒドロキシルアミン部分、ニトリル部分、ヒドラジン部分、ボロン酸部分、シアノベンゾチアゾール部分、アリル部分、ホスフィン部分、ジスルフィド部分、チオエステル部分、α－ハロカルボニル部分、イソニトリル部分、シドノン部分、およびセレン部分からなる群より選ばれる１個以上の部分構造を含む、〔１６〕の複合体またはその塩。
〔１９〕修飾基が機能性物質を含む、〔１３〕～〔１５〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔２０〕機能性物質が、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子有機化合物、キレーター、糖鎖、脂質、高分子ポリマー、および金属からなる群より選ばれる１個以上の部分を含む、〔１９〕の複合体またはその塩。
〔２１〕ヒトフェリチン粒子が内腔中に物質を有する、〔１〕～〔２０〕のいずれかの複合体またはその塩。
〔２２〕複合体またはその塩の製造方法であって、
　複合体が、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、および（Ｂ）それに連結されている、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含み、
　下記（１）～（３）を含む、方法：
（１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含む修飾ＩｇＧ抗体を生成すること；
（２）１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む修飾粒子を生成すること；ならびに
（３）前記修飾ＩｇＧ抗体を前記修飾粒子と反応させて、前記複合体を得ること。
〔２３〕前記複合体が、下記式（１）：
　　Ｘ１－Ｌ１－Ｙ－Ｌ２－Ｘ２　（１）
〔式中、
　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を示し、
　Ｙは、ＩｇＧ抗体であり、
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ、リンカーを示し、
　Ｘ１およびＸ２で示される２個のヒトフェリチン粒子は、それぞれ、それに含まれるヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている。〕で表される、〔２２〕の方法。
〔２４〕リンカーがペプチド部分を含有しない、〔２３〕の方法。
〔２５〕ヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子が、システイン残基の側鎖中の硫黄原子である、〔２３〕または〔２４〕の方法。
〔２６〕システイン残基が、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在する、〔２５〕の方法。
〔２７〕複合体またはその塩の製造方法であって、
　複合体が、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ）それに連結されている、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含み、
　下記（１）～（４）を含む、方法：
（１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含む修飾ＩｇＧ抗体を生成すること；
（２）２個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第１修飾粒子を生成すること；
（３）前記第１修飾粒子において、前記２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部を非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換して、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第２修飾粒子を生成すること；ならびに
（４）前記修飾ＩｇＧ抗体を、前記第２修飾粒子と反応させて、前記複合体を得ること。
〔２８〕複合体またはその塩の製造方法であって、
　複合体が、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ）それに連結されている、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含み、
　下記（１）～（４）を含む、方法：
（１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含むＩｇＧ抗体を生成すること；
（２）２個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第１修飾粒子を生成すること；
（３）前記修飾ＩｇＧ抗体を、前記第１修飾粒子と反応させて、（Ａ’）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ’）それに連結されている、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩を生成すること；ならびに
（４）（Ａ’）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ’）それに連結されている、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩において、前記２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部を非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換して、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ）それに連結されている、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩を得ること。
〔２９〕前記複合体が、下記式（１）：
　　Ｘ１－Ｌ１－Ｙ－Ｌ２－Ｘ２　（１）
〔式中、
　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を示し、
　Ｙは、ＩｇＧ抗体であり、
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ、リンカーを示し、
　Ｘ１およびＸ２で示される２個のヒトフェリチン粒子は、それぞれ、それに含まれるヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている。〕で表される、〔２７〕または〔２８〕の方法。
〔３０〕リンカーがペプチド部分を含有しない、〔２９〕の方法。
〔３１〕ヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子が、システイン残基の側鎖中の硫黄原子である、〔３０〕の方法。
〔３２〕システイン残基が、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在する、〔３１〕の方法。
〔３３〕第１反応性基および第２反応性基が、タンパク質に対する生体直交性官能基である、〔２２〕～〔３２〕のいずれかの方法。
〔３４〕タンパク質に対する生体直交性官能基が、マレイミド部分、アジド部分、ケトン部分、アルデヒド部分、チオール部分、アルケン部分、アルキン部分、ハロゲン部分、テトラジン部分、ニトロン部分、ヒドロキシルアミン部分、ニトリル部分、ヒドラジン部分、ボロン酸部分、シアノベンゾチアゾール部分、アリル部分、ホスフィン部分、ジスルフィド部分、チオエステル部分、α－ハロカルボニル部分、イソニトリル部分、シドノン部分、およびセレン部分からなる群より選ばれる１個以上の部分構造を含み、
　第１反応性基および第２反応性基が、互いに反応可能な組合せで選ばれる、〔３３〕の方法。
　本発明によれば、抗体およびフェリチン粒子の比率を高度に制御することができる。また、抗体に対するフェリチン粒子中の連結部位、およびフェリチン粒子に対する抗体中の連結部位の双方において位置選択性を実現することができる。したがって、本発明は、極めて高度な品質管理を実現することができる。
　また、天然型ヒトフェリチン単量体を含むヒトフェリチン粒子、および／またはペプチドを含まないリンカーを使用することで、ヒトへの臨床応用に際して、免疫原性を回避することができる。
　さらに、本発明の複合体またはその塩において、抗体およびフェリチン粒子は、それぞれ、薬物および／または標的化剤としての機能を担うことができる。これは、抗体自体が薬物および／または標的化剤として使用でき、また、フェリチン粒子についても、薬物送達手段および／または標的化剤として使用できるためである。例えば、フェリチン粒子は、内腔中に多量の物質を封入可能であり、また、表面上のフェリチン単量体に薬物を結合可能であるため、薬物送達手段として使用できる。特に、薬物が生体中で分解し易い性質を有する場合（例、ｓｉＲＮＡ等の核酸分子）、フェリチンは、内腔中に多量の物質を封入して、生体から物質を隔離できるので、薬物送達手段として有用である。また、フェリチン粒子は、特定臓器または組織（例、リンパ節、肝臓、脾臓、癌組織）に集積し易く、また、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過し易いため、標的化剤として使用できる。したがって、本発明の複合体またはその塩は、薬物、薬物送達手段、および／または標的化剤としての機能を、抗体およびヒトフェリチン粒子の一方または双方に振り分けることができるので、医薬または試薬等の製品として有用である。
図１は、（Ａ）天然型ヒトフェリチンＨ鎖のアミノ酸配列（１位のメチオニン有り）（配列番号１）、（Ｂ）天然型ヒトフェリチンＨ鎖（１位のメチオニン有り）をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号２）、および（Ｃ）天然型ヒトフェリチンＨ鎖のアミノ酸配列（１位のメチオニン無し）（配列番号３）を示す図である。 図２は、エチルマレイミド（６当量）で特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である。 図３は、エチルマレイミドで特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖の修飾部位の解析（ＭＳスペクトル）を示す図である。 図４は、エチルマレイミドで特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖の修飾部位の解析（ＣＩＤスペクトル）を示す図である。 図５は、ｐ－アジドフェナシルブロミド（６当量）で特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である。 図６は、ｐ－アジドフェナシルブロミド（１２当量）で特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である。 図７は、ｐ－アジドフェナシルブロミドで特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖の修飾部位の解析（ＭＳスペクトル）を示す図である。 図８は、ｐ－アジドフェナシルブロミドで特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖の修飾部位の解析（ＣＩＤスペクトル）を示す図である。 図９は、ヒトフェリチンＨ鎖のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果に基づくヒトフェリチンＨ鎖の９１位、１０３位および１３１位のピーク面積値の比較を示す図である。 図１０は、ｐ－アジドフェナシルブロミド（６当量）で特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である。 図１１は、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミド（６等量）で特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である。 図１２は、１，３－ジクロロアセトン（６等量）、およびアミノオキシ－ＰＥＧ５－アジド（１０等量）で特異的に修飾された天然型ヒトフェリチンＨ鎖のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析を示す図である。 図１３は、ＤＢＣＯ修飾抗体のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ分析を示す図である。 図１４は、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－修飾抗体のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ分析を示す図である。 図１５は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる抗体－ヒトフェリチン複合体の泳動像を示す図である。 図１６は、抗体－ヒトフェリチン複合体の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。 図１７は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる抗体－ヒトフェリチン複合体の泳動像を示す図である。 図１８は、抗体－ヒトフェリチン複合体の脱会合プロセスを示す図である。 図１９は、ＤＢＣＯ修飾抗体－ヒトフェリチン複合体のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ分析を示す図である。 図２０は、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－修飾抗体－ヒトフェリチン複合体のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ分析を示す図である。 図２１は、モザイクフェリチンの逆相クロマトグラフィー分析を示す図である。 図２２は、ＤＢＣＯ修飾抗体－モザイクフェリチン複合体の逆相クロマトグラフィー分析を示す図である。 図２３は、抗体修飾反応によるモザイクフェリチンモノマーの量の変化を示す図である。 図２４は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる抗体－ヒトフェリチン複合体の泳動像を示す図である。
　本発明は、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、および（Ｂ）それに連結されている、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む、複合体またはその塩を提供する。２個のヒトフェリチン粒子はそれぞれ１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含む。
（Ｉ）ヒトフェリチン粒子
（Ｉ－１）ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子
　ヒトフェリチン粒子は、２４個のフェリチン単量体（Ｈ鎖およびＬ鎖）を含む２４量体を形成することができる。ヒトにおいて天然に存在するフェリチン粒子は通常、Ｈ鎖およびＬ鎖の混合物であるヘテロ２４量体であり、実験的に調製されるフェリチン粒子は通常、ホモ２４量体である。これは、ヘテロ２４量体を実験において調製する場合にはＨ鎖およびＬ鎖のフェリチン粒子を別途調製し、それらを混合するという負担を要することから、実験負担の軽減の観点より、ホモ２４量体が調製されるためである。したがって、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子は、ヒトフェリチンＨ鎖のみを含むホモ２４量体、またはヒトフェリチンＨ鎖およびＬ鎖を含むヘテロ２４量体であってもよい。この場合、ヒトフェリチンＬ鎖は、ヒトフェリチンＨ鎖について後述するような変異（例、機能性ペプチドをさらに含むような変異、ならびにＮ末端およびＣ末端の改変）を含んでいてもよい。簡便な調製の観点では、ヒトフェリチン粒子は、２４個のヒトフェリチンＨ鎖を含むホモ２４量体が好ましい。
　ヒトフェリチンＨ鎖におけるアミノ酸残基の位置（例、１位のメチオニン残基、９１位のシステイン残基、および１０３位のシステイン残基）は、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従って決定される。本明細書中で使用される場合、用語「天然型」とは、アミノ酸配列が天然型であることを示す。したがって、「天然型ヒトフェリチンＨ鎖」とは、天然型のアミノ酸配列を有するヒトフェリチンＨ鎖を意味する。一方、後述の「修飾ヒトフェリチンＨ鎖」とは、ヒトフェリチンＨ鎖を構成するアミノ酸残基の側鎖が修飾されたヒトフェリチンＨ鎖を意味する点で、アミノ酸残基の側鎖の修飾を意味しない「天然型ヒトフェリチンＨ鎖」と異なる。天然型ヒトフェリチンＨ鎖は、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。本発明では、天然型ヒトフェリチンＨ鎖には、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドのみならず、天然に生じるそのバリアントも含まれる。好ましくは、天然型ヒトフェリチンＨ鎖は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
　本発明の修飾フェリチンに含まれるヒトフェリチンＨ鎖は、１位のメチオニン残基を欠失していてもよい天然型ヒトフェリチンＨ鎖であってもよい。１位のメチオニン残基を欠失していない天然型ヒトフェリチンＨ鎖は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対応する。１位のメチオニン残基を欠失している天然型ヒトフェリチンＨ鎖は、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対応する。
　特定の実施形態では、ヒトフェリチンＨ鎖は、以下であってもよい：
（Ａ）配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含み、かつ２４量体形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、２４量体形成能を有するタンパク質。
　タンパク質（Ｂ）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基を改変することができる。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。本発明では、アミノ酸残基の置換として、システイン残基以外のアミノ酸残基からシステイン残基への置換は意図され得ない。また、アミノ酸残基の付加および挿入についても、システイン残基、またはシステイン残基含有領域の付加および挿入は意図され得ない。用語「１または数個」は、２４量体形成能を損なわない個数を示す。用語「１または数個」が示す数は、例えば１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個、さらにより好ましくは１～５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
　タンパク質（Ｃ）では、対象のアミノ酸配列に対する同一性の程度は、好ましくは９２％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらにより好ましくは９７％以上であり、最も好ましくは９８％以上または９９％以上である。アミノ酸配列の同一性％の算出は、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ１３．１．１を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｍｕｓｃｌｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔもしくはＣｌｕｓｔａｌＷ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔもしくはＭｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔを行った後にＧａｐｓ　ａｒｅ　ｔａｋｅ　ｉｎｔｏ　ａｃｃｏｕｎｔの設定で計算させた際の数値を用いて行うことができる。
　アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして特定されてもよい。具体的には、当業者は、１）複数のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、配列アライメントを利用することによりアミノ酸配列において変異を導入すべき位置を特定でき、また、既知の二次および三次構造情報を併用して、アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置を特定することもできる。通常環境下ではフェリチンのかご状構造内部に位置するＣ末端領域および他の領域中のアミノ酸残基（表面に露出しないため、免疫原性を生じるリスクが低いアミノ酸残基）に変異を導入することもまた、免疫原性を生じるリスクの回避の観点より、好ましい。また、フェリチン表面に露出しない位置については、システイン残基またはシステイン残基含有ペプチドの変異（例、置換、挿入、およびＮ末端領域への付加）が導入されてもよいが、システイン残基またはシステイン残基含有ペプチドの変異（例、置換、挿入、およびＮ末端領域への付加）が導入されないこともまた好ましい。
　アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
　特定の実施形態では、上記（Ｂ）および（Ｃ）のタンパク質におけるヒトフェリチンＨ鎖は、システイン残基を含まない機能性ペプチドをさらに含むヒトフェリチンＨ鎖であってもよい。本発明では、フェリチン表面に修飾基を導入するための遺伝子改変以外の遺伝子改変は許容されるので、機能性ペプチドをさらに含むための遺伝子改変は許容される。高等生物のフェリチン単量体のＮ末端は２４量体の表面上に露出している。高等生物のフェリチン単量体であるヒトフェリチンＨ鎖では、２４量体形成能を維持しつつ、そのＮ末端に種々の機能性ペプチドが挿入可能である。また、高等生物のフェリチン単量体は、種々の高等生物間で高度に保存された６つのα－ヘリックスを有する。高等生物のフェリチン単量体であるヒトフェリチンＨ鎖では、６つのα－ヘリックスとして、１）１５～４２位のアミノ酸残基からなる第１領域（Ａ領域とも呼ばれる）、２）５０～７７位のアミノ酸残基からなる第２領域（Ｂ領域とも呼ばれる）、３）９７～１２４位のアミノ酸残基からなる第３領域（Ｃ領域とも呼ばれる）、４）１２８～１３７位のアミノ酸残基からなる第４領域（Ｄ領域とも呼ばれる）、５）１３９～１５９位のアミノ酸残基からなる第５領域（Ｄ領域とも呼ばれる）、６）１６５～１７４位のアミノ酸残基からなる第６領域（Ｅ領域とも呼ばれる）が存在する。これらのα－ヘリックスの間の領域はフレキシブルリンカー領域と呼ばれており、２４量体形成能を維持しつつ、フレキシブルリンカー領域間に種々の機能性ペプチドが挿入可能であることが報告されている（例、国際公開第２０１９／１６３８７１号；米国特許出願公開第２０１６／００６０３０７号明細書；Ｊａｅ　Ｏｇ　Ｊｅｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＣＳ　Ｎａｎｏ（２０１３），７（９），７４６２－７４７１；Ｓｏｏｊｉ　Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１６），１７（３），１１５０－１１５９；Ｙｏｕｎｇ　Ｊｉ　Ｋａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１２），１３（１２），４０５７－４０６４）。例えば、フェリチン単量体におけるＢ領域およびＣ領域のα－ヘリックスは、当該分野において周知であり、また、当業者であれば、各種生物由来のフェリチン単量体において、Ｂ領域およびＣ領域のα－ヘリックスの位置を適宜特定することができる。したがって、本発明において機能性ペプチドが挿入されるＢ領域およびＣ領域のα－ヘリックスの間のフレキシブルリンカー領域もまた、当該分野において周知であり、また、当業者であれば適宜特定することができる。例えば、ヒトフェリチンＨ鎖に対する機能性ペプチドのこのような挿入位置として、上記第２および第３領域間のフレキシブルリンカー領域である７８～９６位（好ましくは８３～９１位）を好適に利用することができる（例、国際公開第２０１９／１６３８７１号）。
　機能性ペプチドとしては、目的タンパク質と融合された場合に任意の機能を目的タンパク質に付加することができるペプチドを用いることができる。このようなペプチドとしては、標的材料に対する結合能を有するペプチド、プロテアーゼ分解性ペプチド、細胞透過性ペプチド、安定化ペプチドが挙げられる。
　上述した領域中に挿入される機能性ペプチドは、所望の機能を有する１個のペプチドのみであってもよいし、または所望の機能を有する同種もしくは異種の複数（例、２個、３個もしくは４個等の数個）のペプチドであってもよい。機能性ペプチドが上記のような複数のペプチドである場合、複数の機能性ペプチドは、任意の順序で挿入されて、フェリチン単量体と融合することができる。融合は、アミド結合を介して達成することができる。融合は、アミド結合により直接的に達成されてもよいし、あるいは１個のアミノ酸残基または数個（例えば２～２０個、好ましくは２～１０個、より好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により間接的に達成されてもよい。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。好ましくは、上述した領域中に挿入されるペプチド全体の長さは、２０個のアミノ酸残基以下である。
　機能性ペプチドとして、標的材料に対する結合能を有するペプチドを用いる場合、標的材料としては、例えば、生体有機分子、タンパク質精製用タグ（例、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）と相互作用できる材料（例、ニッケル、マルトース、グルタチオン）、標識物質（例、放射性物質、蛍光物質、色素）が挙げられる。フェリチンは、トランスフェリン受容体提示細胞に取り込まれることが知られている（例、Ｌ．　Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　２０１０；１０７（８）：３５０５－１０）。機能性ペプチドとして、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドを用いる場合、本来であればフェリチンが結合しない生体有機分子を発現する細胞および器官に対してフェリチンを送達することができる。
　生体有機分子としては、例えば、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、糖質（例、モノサッカリド、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド）、脂質が挙げられる。生体有機分子はまた、細胞表面抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。生体有機分子はまた、疾患抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。このような生体有機分子に対する結合能を有するペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている。例えば、タンパク質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｆ．Ｄａｎｈｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．２９６１．、Ｃ－Ｈ．Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１５，ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２９０，２９０ｒａ９１．Ｌ．Ｖａｎｎｕｃｃｉ　ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２，ｖｏｌ．７，ｐ．１４８９、Ｊ．Ｃｕｔｒｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，ｖｏｌ．１９（８），ｐ．１４６８、Ｒ．Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１７，ｖｏｌ．１１０－１１１，ｐ．１３を参照）、核酸に対する結合能を有するペプチド（例、Ｒ．Ｔａｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５、ｖｏｌ．９２，ｐ．５２８２、Ｒ．Ｔａｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ、１９９３、ｖｏｌ．７３，　ｐ．１０３１、Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ　ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２，ｖｏｌ．３１，ｐ．６８７１を参照）、糖質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｋ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ　ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．１２，ｐ．５３９３－５３９７．，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．１１１，ｐ．４３６，Ａ．Ｂａｉｍｉｅｖ　ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｃｏｗ），２００５，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，ｐ．９０．を参照）、脂質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｏ．Ｋｒｕｓｅ　ｅｔ．ａｌ．，Ｂ　Ｚ．　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９５，ｖｏｌ．５０ｃ，ｐ．３８０，Ｏ．Ｓｉｌｖａ　ｅｔ．ａｌ．，　Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．６，２７１２８．，　Ａ．Ｆｉｌｏｔｅｏ　ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．１７，ｐ．１１８００を参照）等の種々のペプチドが報告されている。
　機能性ペプチドとしてプロテアーゼ分解性ペプチドが用いられる場合、プロテアーゼとしては、例えば、カスパーゼやカテプシンなどのシステインプロテアーゼ（Ｄ．　ＭｃＩｌｗａｉｎ１　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ　Ｂｉｏｌ．，２０１３，ｖｏｌ．５，ａ００８６５６、Ｖ．Ｓｔｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．，ＩＵＢＭＢ　Ｌｉｆｅ．２００５，ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．４－５ｐ．３４７）、コラゲナーゼ（Ｇ．Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３）　，ｐ．６４６）、トロンビンやＸａ因子（Ｒ．Ｊｅｎｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１、Ｈ．Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，　２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６）、ウイルス由来プロテアーゼ（Ｃ．Ｂｙｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ．　Ｒｅｓ．，２００６，ｖｏｌ．６７，ｐ．５０１）が挙げられる。種々のプロテアーゼ分解性ペプチドが知られている（例、Ｅ．Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２０１５，ｖｏｌ．２５，ｐ．１２７９；Ｇ．Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３，ｐ．６４６；Ｙ．Ｋａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１２，ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１２，ｐ．４０５７；Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，ｖｏｌ．２７２，ｐ．９６７７；Ｊｅｎｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１；Ｈ．Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６）。本発明では、種々のプロテアーゼ分解性ペプチドを用いることができる（例、Ｅ．Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２０１５，ｖｏｌ．２５，ｐ．１２７９；Ｇ．Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３，ｐ．６４６；Ｙ．Ｋａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１２，ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１２，ｐ．４０５７；Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，ｖｏｌ．２７２，ｐ．９６７７；Ｊｅｎｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１；Ｈ．Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６）。
　機能性ペプチドとして安定化ペプチドが用いられる場合、種々の安定化ペプチドを用いることができる（例、Ｘ．Ｍｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１１，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，ｐ．９７７；Ｅ．Ｆａｌｖｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６，ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，ｐ．５１４）。
　機能性ペプチドとして細胞透過性ペプチドが用いられる場合、種々の細胞透過性ペプチドを用いることができる（例、Ｚ．Ｇｕｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐ．５２８）。
　機能性ペプチドとしては、標的材料に対する結合能を有するペプチドが好ましい。標的材料に対する結合能を有するペプチドとしては、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドが好ましく、タンパク質に対する結合能を有するペプチドがより好ましい。
　ヒトフェリチンＨ鎖は、そのＮ末端領域および／またはＣ末端領域において改変されていてもよい。ヒトフェリチン単量体等の動物フェリチン単量体のＮ末端は多量体の表面上に露出され、そのＣ末端は表面上に露出し得ない。したがって、動物フェリチン単量体のＮ末端に付加されるペプチド部分は多量体の表面に露出して、多量体の外部に存在する標的材料と相互作用できるものの、動物フェリチン単量体のＣ末端に付加されるペプチド部分は多量体の表面に露出せず、多量体の外部に存在する標的材料と相互作用することができない（例、国際公開第２００６／１２６５９５号）。しかし、動物フェリチン単量体のＣ末端は、そのアミノ酸残基を改変することで、多量体の内腔中への薬剤の封入に利用できることが報告されている（例、Ｙ．Ｊ．Ｋａｎｇ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１２，ｖｏｌ．１３（１２），４０５７を参照）。
　特定の実施形態では、ヒトフェリチンＨ鎖は、そのＮ末端領域における改変として、Ｎ末端にペプチド部分が付加されていてもよい。付加されるべきペプチド部分としては、例えば、上述したような機能性ペプチドが挙げられる。あるいは、付加されるべきペプチド部分としてはまた、例えば、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ－ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。ヒトフェリチンＨ鎖のＮ末端に付加されるペプチド部分として、第２および第３α－ヘリックスの間の領域に挿入される機能性ペプチドと同じまたは異なるペプチドを利用することができるが、異なる標的材料への相互作用の実現等の観点から、異なるペプチドを利用することもまた好ましい。好ましくは、ヒトフェリチンＨ鎖のＮ末端に付加されるペプチド部分は、上述したような機能性ペプチドである。Ｎ末端に付加されるペプチド部分はまた、開始コドンに対応するアミノ酸残基（例、メチオニン残基）をＮ末端に含むように設計することが好ましい。このような設計により、ヒトフェリチンＨ鎖の翻訳を促進することができる。
　別の特定の実施形態では、ヒトフェリチンＨ鎖は、そのＣ末端領域における改変として、Ｃ末端領域におけるアミノ酸残基が反応性アミノ酸残基に置換されていてもよく、Ｃ末端領域において反応性アミノ酸残基が挿入されていてもよく、またはＣ末端に反応性アミノ酸残基またはその含有ペプチド（例えば２～１２個、好ましくは２～５個のアミノ酸残基からなるペプチド）が付加されていてもよい。このようなＣ末端領域としては、例えば、ヒトフェリチンＨ鎖については１７５～１８３位（好ましくは１７９～１８３位）のアミノ酸残基からなる領域である。このような改変により、反応性アミノ酸残基および所定の物質（例、薬物、標識物質）を反応させることができ、それにより多量体の内腔中に所定の物質を共有結合を介して封入することができる。このような反応性アミノ酸残基としては、例えば、チオール基を有するシステイン残基、アミノ基を有するリジン残基、アルギニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基が挙げられるが、システイン残基が好ましい。好ましくは、本発明の融合タンパク質のＣ末端領域の改変は、反応性アミノ酸残基またはその含有ペプチドのＣ末端への付加である。
　好ましい実施形態では、ヒトフェリチンＨ鎖が機能性ペプチドをさらに含む場合、機能性ペプチドは、ヒト由来ペプチドであってもよい。機能性ペプチドがヒト由来ペプチドである場合、ヒトに対して免疫原性が生じるリスクを低減することができる。
（Ｉ－２）１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子の製造
　１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子は、ヒトフェリチンＨ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を用いて、ヒトフェリチンＨ鎖を宿主細胞に産生させて２４量体を形成させることにより得ることができる。ヒトフェリチンＨ鎖を産生させるための宿主細胞としては、例えば、動物、昆虫、植物、または微生物に由来する細胞が挙げられる。動物としては、哺乳動物または鳥類（例、ニワトリ）が好ましく、哺乳動物がより好ましい。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。
　好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞、またはヒトタンパク質の産生に汎用されている細胞（例、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞）である。ヒトへの臨床応用の観点より、このような宿主細胞を用いることが好ましい。
　別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、微生物である。融合タンパク質の大量生産等の観点より、このような宿主細胞を用いてもよい。微生物としては、例えば、細菌および真菌が挙げられる。細菌としては、宿主細胞として用いられている任意の細菌を使用することができ、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌〔例、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌〔（例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌〔例、シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）〕、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌（例、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ））が挙げられる。真菌としては、宿主細胞として用いられている任意の真菌を使用することができ、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌〔例、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌〔例、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）〕が挙げられる。あるいは、微生物として、糸状菌を用いてもよい。糸状菌としては、例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）／タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アルペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、およびハイポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）に属する細菌が挙げられる。
　宿主細胞は、ヒトフェリチンＨ鎖をコードするポリヌクレオチドに加えて、当該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含むように設計することができる。用語「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。発現単位は、微生物（宿主細胞）においてゲノム領域（例、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドが固有に存在する天然ローカスである天然ゲノム領域、もしくは当該天然ローカスではない非天然ゲノム領域）、または非ゲノム領域（例、細胞質内）に含まれることができる。発現単位は、１または２以上（例、１、２、３、４、または５）の異なる位置においてゲノム領域中に含まれていてもよい。非ゲノム領域に含まれる発現単位の具体的な形態としては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、および人工染色体が挙げられる。
（Ｉ－３）ヒトフェリチンＨ鎖の修飾
　ヒトフェリチン粒子に含まれるヒトフェリチンＨ鎖は、修飾ヒトフェリチンＨ鎖であってもよい。修飾ヒトフェリチンＨ鎖とは、ヒトフェリチンＨ鎖を構成するアミノ酸残基の側鎖が修飾されているヒトフェリチンＨ鎖を意味する。修飾ヒトフェリチンＨ鎖には、ＩｇＧ抗体との連結に利用される修飾基を有する修飾ヒトフェリチンＨ鎖、およびＩｇＧ抗体との連結に利用されない修飾基を有する修飾ヒトフェリチンＨ鎖が含まれる。ヒトフェリチンＨ鎖の修飾は、任意のアミノ酸残基の側鎖において行うことができる。好ましくは、抗体に対するヒトフェリチン粒子の連結数、および修飾の位置選択性を高度に制御するためには、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在するシステイン残基の側鎖中のシステイン残基が利用される。
　好ましい実施形態では、本発明において修飾されるヒトフェリチンＨ鎖中のアミノ酸残基は、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在するシステイン残基であってもよい。このようなシステイン残基の側鎖中のチオール基を利用することにより、抗体に対するヒトフェリチン粒子の連結数、ならびに抗体に対するヒトフェリチンＨ鎖の連結部位、および修飾基による修飾部位の位置選択性を高度に制御することができる。抗体に対するヒトフェリチンＨ鎖の連結部位、および修飾基による修飾部位に関連して、「位置選択的」または「位置選択性」とは、連結部位および修飾部位が、ヒトフェリチンＨ鎖中の特定領域（例、９１位および／または１０３位のシステイン残基）に偏在することをいう。このような位置選択性は、５０％以上であり、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％であってもよい。
　ヒトフェリチン粒子において、９１位および１０３位のシステイン残基は互いに近接している。ヒトフェリチン粒子は、このような位置において１個のヒトフェリチンＨ鎖あたり１個または２個の修飾基を含むことができる。したがって、ヒトフェリチン粒子は、下記（Ａ）あるいは（Ｂ）のいずれかの修飾基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含んでいてもよい：
（Ａ）９１位または１０３位の一方または双方のシステイン残基の側鎖中の１個または２個の硫黄原子に特異的に共有結合している１個または２個の修飾基を含むヒトフェリチンＨ鎖；あるいは
（Ｂ）９１位および１０３位のシステイン残基の側鎖中の２個の硫黄原子を特異的な共有結合により架橋している１個の修飾基を含むヒトフェリチンＨ鎖。
　このようなヒトフェリチンＨ鎖を含む修飾フェリチンは、ヒトフェリチンと後述のチオール修飾試薬または機能性物質のモル量比（ヒトフェリチン：チオール修飾試薬または機能性物質）が例えば１：１～１：３０、好ましくは１：１～１：２０、より好ましくは１：１～１：１５の範囲内になるように設定して、これらを反応させることにより調製できる。
　一実施形態では、ヒトフェリチン粒子は、２４個または４８個の修飾基を含むことができる。ヒトフェリチン粒子として、９１位および１０３位のシステイン残基において１個のヒトフェリチンＨ鎖あたり１個または２個の修飾基を含むことができる２４量体を使用できるためである。
　ヒトフェリチン粒子は、修飾基を含まない非修飾ヒトフェリチンＨ鎖をさらに含んでいてもよい。非修飾ヒトフェリチンＨ鎖とは、ヒトフェリチンＨ鎖を構成するアミノ酸残基の側鎖が修飾されていないヒトフェリチンＨ鎖を意味する。非修飾ヒトフェリチンＨ鎖をさらに含むヒトフェリチン粒子は、フェリチンに対して反応性物質（例、チオール修飾試薬および機能性物質）を低い量比で反応させることにより調製できる。非修飾ヒトフェリチンＨ鎖をさらに含むヒトフェリチン粒子はまた、９１位および／または１０３位のシステイン残基に特異的に共有結合している修飾基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子、および当該修飾基を含まない非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を別途調製し、次いで、これらの粒子を所定の量比で含む溶液中でこれらを解離および再会合させることにより調製できる。フェリチン粒子は、比較的容易に解離および会合し得ることから、それを含む溶媒等の条件に応じて、２４量体もしくは単量体の形態、またはそれらが共存した形態となる。したがって、フェリチン粒子を含む溶媒等の条件を適宜調整することにより、２４量体を単量体に解離させることができ、また、解離した単量体を２４量体へと再会合させることができる。このような解離および再会合は、フェリチン粒子の内腔中に種々の物質（例、後述の薬物）を封入する際に利用されている（例、ＷＯ２０２０／０９０７０８；中国特許出願公開第１０６１１０３３３号明細書；Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　１９６（２０１４）　１８４－１９６；Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２０１６，１７，５１４－５２２；Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　２０１４　１１１（４１）：１４９００－５を参照）。ヒトフェリチン粒子が非修飾ヒトフェリチンＨ鎖をさらに含む場合、ヒトフェリチン粒子における、修飾基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および修飾基を含まない非修飾ヒトフェリチンＨ鎖のモル量比は、フェリチン粒子に対する反応性物質の量比、または溶液中における再会合前のこれらの量比に応じて制御することができる。
　一実施形態では、修飾基は、反応性基を含んでいてもよい。この場合、ヒトフェリチン粒子は、９１位および／または１０３位のシステイン残基に連結している、反応性基を含む修飾基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む。このような修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子は、修飾ヒトフェリチンＨ鎖またはそれを含むヒトフェリチン粒子（好ましくは、このような修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子）を後述のチオール修飾試薬と反応させることにより製造することができる。
　反応性基は、機能性物質と反応するように適宜設定されてもよい。したがって、反応性基は、機能性物質中の所定の官能基（機能性物質は、反応性基と反応できる所定の官能基を有するように誘導体化されてもよい）と反応できる部分を含んでいてもよい。修飾基に含まれる反応性基の数は、単一または複数であり、例えば１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１または２個、さらにより好ましくは１個である。修飾基に含まれる反応性基の数が複数である場合、複数の反応性基は、同種であっても異種であってもよい。例えば、複数の同種の機能性物質との反応が所望される場合、単純な構造の採用等の観点では、同種の反応性基が好ましい。一方、複数の異種の機能性物質との反応が所望される場合、反応の選択性の確保等の観点では、異種の反応性基が好ましい。
　特定の実施形態では、反応性基は、タンパク質に対する生体直交性官能基であってもよい。このような場合、フェリチン単量体間の反応を抑制しつつ、フェリチンＨ鎖と機能性物質との反応を促進することができる。生体直交性官能基とは、生体構成成分（例、アミノ酸、核酸、脂質、糖、リン酸）とは反応できないか、または生体構成成分と反応し難いものの、生体構成成分以外の成分と反応し易いという反応選択性を有する基をいう。生体直交性官能基は、当該技術分野において周知である（例、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ　Ｋ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０，２００４（２０１５）；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ　Ｃ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９１，２３５７（２００１）；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ　Ｃ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１，１３（２００５）を参照）。したがって、タンパク質に対する生体直交性官能基とは、タンパク質を構成する天然の２０種のアミノ酸残基の側鎖と反応できないか、または当該側鎖と反応し難いものの、当該側鎖以外の標的と反応し易いという反応選択性を有する基を意味する。タンパク質を構成する天然の２０種のアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリジン（Ｌ）である。これらの天然の２０種のアミノ酸のうち、側鎖がない（すなわち、水素原子である）グリシン、ならびに側鎖が炭化水素基である（すなわち、硫黄原子、窒素原子、および酸素原子からなる群より選ばれるヘテロ原子を側鎖に含まない）アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンは、通常の反応に対して不活性である。したがって、タンパク質に対する生体直交性官能基は、通常の反応に対して不活性である側鎖を有するこれらのアミノ酸の側鎖に加えて、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンの側鎖、ならびに必要に応じてシステインの側鎖（例、ヒトフェリチンＨ鎖の９１位および／または１０３位のシステイン残基が十分に修飾されていない場合）に対しても反応できない官能基である。
　タンパク質に対する生体直交性官能基としては、例えば、マレイミド部分、アジド部分、ケトン部分、アルデヒド部分、チオール部分、アルケン部分（換言すれば、炭素原子間二重結合を有する最小単位であるビニル（エテニル）部分またはビニレン（エテニレン）部分を有していればよい。本明細書中同様。）、アルキン部分（換言すれば、炭素原子間三重結合を有する最小単位であるエチニル部分またはエチニレン部分を有していればよい。本明細書中同様。）、ハロゲン部分（例、フッ化部分、塩化部分、臭化部分、ヨウ化部分）、テトラジン部分、ニトロン部分、ヒドロキシルアミン部分、ニトリル部分、ヒドラジン部分、ボロン酸部分、シアノベンゾチアゾール部分、アリル部分、ホスフィン部分、ジスルフィド部分、チオエステル部分、α―ハロカルボニル部分（例、α位にフッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を有するカルボニル部分）、イソニトリル部分、シドノン部分、およびセレン部分からなる群より選ばれる１個以上の部分構造を含む基が挙げられる。タンパク質としては、システイン残基の側鎖中に遊離のチオールを含み得るタンパク質（例、抗体以外のタンパク質）、および遊離のチオールを含み得ないタンパク質（例、抗体、システイン残基を含まないタンパク質、および本発明で提供されるような、９１位および／または１０３位のシステイン残基が十分に修飾されているヒトフェリチンＨ鎖を含むフェリチン）が存在する。遊離のチオールを含み得ないタンパク質においては、チオールが生体直交性官能基として機能する。したがって、本発明では、原則として、タンパク質に対する生体直交性官能基にはチオール部分が含まれる。しかし、９１位および／または１０３位のシステイン残基が十分に修飾されていない場合（例、１個のヒトフェリチンＨ鎖あたりのシステイン残基の平均修飾数が１個である場合）、タンパク質に対する生体直交性官能基にはチオール部分は含まれない。
　反応性基はまた、反応性基と後に反応され得る機能性物質の種類（例、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、低分子有機化合物）に応じて、当該機能性物質中の所定の官能基と特異的に反応するように設定することができる。
　上述のような反応性基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を製造するための反応は、フェリチンの変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。例えば、このような反応は、適切な反応系、例えば緩衝液中において、フェリチンの変性・分解を引き起こし得ない温度条件（例えば約１５～６０℃、好ましくは１５～４５℃）で行うことができる。緩衝液のｐＨは、例えば３．０～１２．０であり、好ましくは５．０～９．０であり、より好ましくは６．０～８．０である。緩衝液は、触媒等の成分を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分～２０時間、好ましくは１０分～１５時間、より好ましくは２０分～１０時間、さらにより好ましくは３０分～８時間である。
　別の実施形態では、修飾基は、機能性物質を含んでいてもよい。この場合、ヒトフェリチン粒子は、９１位および／または１０３位のシステイン残基に連結している、機能性物質を含む修飾基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む。
　機能性物質は、フェリチンに任意の機能を付与する物質である限り特に限定されず、例えば、薬物、標識物質、安定化剤が挙げられるが、好ましくは薬物または標識物質である。機能性物質はまた、単一の機能性物質であってもよく、または２以上の機能性物質が連結された物質であってもよい。
　薬物としては、任意の疾患に対する薬物であってもよい。このような疾患としては、例えば、癌（例、肺癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、黒色腫）、自己免疫疾患・炎症性疾患（例、アレルギー疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）、脳神経疾患（例、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症）、感染症（例、細菌感染症、ウイルス感染症）、遺伝性・希少疾患（例、遺伝性球状赤血球症、非ジストロフィー筋緊張症）、眼疾患（例、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜色素変性症）、骨・整形外科領域の疾患（例、変形性関節症）、血液疾患（例、白血病、紫斑病）、その他の疾患（例、糖尿病、高脂血症等の代謝異常症、肝臓疾患、腎疾患、肺疾患、循環器系疾患、消化器官系疾患）が挙げられる。薬物は、疾患の予防または治療薬、副作用の緩和薬であってもよい。
　より具体的には、薬物は、抗癌剤である。抗癌剤としては、例えば、化学療法剤、毒素、放射性同位体またはそれを含む物質が挙げられる。化学療法剤としては、例えば、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗薬、酵素阻害剤、ＤＮＡインターカレート剤、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ結合阻害剤、チューブリン結合阻害剤、細胞傷害性ヌクレオシド、白金化合物が挙げられる。毒素としては、例えば、細菌毒素（例、ジフテリア毒素）、植物毒素（例、リシン）が挙げられる。放射性同位体としては、例えば、水素原子の放射性同位体（例、３Ｈ）、炭素原子の放射性同位体（例、１４Ｃ）、リン原子の放射性同位体（例、３２Ｐ）、硫黄原子の放射性同位体（例、３５Ｓ）、イットリウムの放射性同位体（例、９０Ｙ）、テクネチウムの放射性同位体（例、９９ｍＴｃ）、インジウムの放射性同位体（例、１１１Ｉｎ）、ヨウ素原子の放射性同位体（例、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ)、サマリウムの放射性同位体（例、１５３Ｓｍ）、レニウムの放射性同位体（例、１８６Ｒｅ）、アスタチンの放射性同位体（例、２１１Ａｔ）、ビスマスの放射性同位体（例、２１２Ｂｉ）が挙げられる。更に具体的には、薬物として、オーリスタチン（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、メイタンシン（ＤＭ１、ＤＭ４）、ＰＢＤ（ピロロベンゾジアゼピン）、ＩＧＮ、カンプトテシン類縁体、カリケアミシン、デュオカルミシン、エリブリン、アントラサイクリン、ｄｍＤＮＡ３１、ツブリシンが挙げられる。
　標的化物質は、標的（例、組織、細胞、物質）に対する親和性物質である。標的化物質としては、例えば、標的物質に対する抗体または標的物質に対する結合能を有するその断片、受容体に対する結合能を有するリガンド、複合体を形成する能力があるタンパク質（例、アダプタータンパク質）、糖鎖に対する結合能を有するタンパク質（レクチン）、タンパク質に対する結合能を有する糖鎖、および相補配列に結合能を有する核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の天然核酸、または人工核酸）が挙げられる。
　標識物質は、標的（例、組織、細胞、物質）の検出を可能にする物質である。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アプタマー）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウムエステル、トリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム、ルミノール）、放射性同位体（例、上述したもの）、またはそれを含む物質が挙げられる。
　安定化剤は、フェリチンの安定化を可能にする物質である。安定化剤としては、例えば、ジオール類、グリセリン、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、天然系界面活性剤、サッカリド、およびポリオール類が挙げられる。
　機能性物質はまた、ペプチド、タンパク質（例、抗体）、核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および人工核酸）、低分子有機化合物（例、後述する低分子有機化合物）、キレーター、糖鎖、脂質、高分子ポリマー、金属（例、金）であってもよい。
　機能性物質を含む修飾基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子は、ヒトフェリチン粒子を機能性物質と反応させることにより製造することができる。このような反応で用いられる機能性物質は、チオール基に対する少なくとも１個の反応部位を有する反応性物質であって、反応により、機能性物質を含む修飾基をヒトフェリチンに付加する能力を有するものである。このような反応で用いられる機能性物質としては、チオール基と反応し易い官能基を有する任意の機能性物質を使用することができる。あるいは、機能性物質がチオール基と反応し易い官能基を有しない場合、このような官能基を有するように誘導体化された機能性物質を使用することができる。反応効率の向上の観点から、機能性物質（誘導化されていてもよい）は、マレイミド部分、ベンジルハライド部分、αハロアミド部分、αハロケトン部分、アルケン部分、アルキン部分、フルオロアリール部分、ニトロアリール部分、メチルスルホニルオキサジアゾール部分、およびジスルフィド部分からなる群より選ばれる１個以上の部分構造を含むものが好ましい。
　機能性物質を含む修飾基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子はまた、ヒトフェリチンをチオール修飾試薬と反応させ、次いで、反応により得られた反応性基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を機能性物質とさらに反応させることにより製造することができる。ヒトフェリチン粒子をチオール修飾試薬と反応させる工程は、上述のとおり行うことができる。反応性基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を機能性物質とさらに反応させる工程で用いられる機能性物質は、反応性基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖の反応性基に対する少なくとも１個の反応部位を有する反応性物質であって、反応により、機能性物質を含む修飾基をヒトフェリチンに付加する能力を有するものである。このような反応で用いられる機能性物質としては、反応性基と反応し易い官能基を有する任意の機能性物質を使用することができる。あるいは、機能性物質が反応性基と反応し易い官能基を有しない場合、このような官能基を有するように誘導体化された機能性物質を使用することができる。したがって、反応性基の種類に応じて、反応に利用される機能性物質中の官能基を適宜決定することができる。
　機能性物質の誘導体化は、当該分野における技術常識である（例、国際公開第２００４／０１０９５７号、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書）。例えば、誘導体化は、上述したような架橋剤を用いて行われてもよい。あるいは、誘導体化は、所望の官能基を有する特定のリンカーを用いて行われてもよい。例えば、このようなリンカーは、適切な環境（例、細胞内または細胞外）において機能性物質と抗体とをリンカーの切断により分離可能なものであってもよい。このようなリンカーとしては、例えば、特定のプロテアーゼ〔例、細胞内プロテアーゼ（例、リソソーム、またはエンドソーム中に存在するプロテアーゼ）、細胞外プロテアーゼ（例、分泌性プロテアーゼ）〕で分解されるペプチジルリンカー（例、米国特許第６，２１４，３４５号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　８３：６７－１２３（１９９９））、生体内に存在する局所酸性部位で切断され得るリンカー（例、米国特許第５，６２２，９２９号、同第５，１２２，３６８号；同第５，８２４，８０５号）が挙げられる。リンカーは、自壊的（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）であってもよい（例、国際公開第０２／０８３１８０号、国際公開第０４／０４３４９３号、国際公開第０５／１１２９１９号）。本発明では、誘導体化された機能性物質も、単に「機能性物質」と呼称することができる。
　特定の実施形態では、機能性物質は、タンパク質に対する生体直交性官能基である反応性基と反応し易い官能基を有する機能性物質、または当該応性基と反応し易い官能基を有するように誘導体化された機能性物質であってもよい。生体直交性官能基と反応し易い官能基は、生体直交性官能基の具体的な種類によっても異なり得る。当業者であれば、適切な官能基を、生体直交性官能基と反応し易い官能基として適宜選択することができる（例、Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｖ．，２０１５，１１５，２１７４－２１９５）。生体直交性官能基と反応し易い官能基としては、例えば、生体直交性官能基がチオール部分に対応する場合はマレイミド基およびジスルフィド基が挙げられ、生体直交性官能基がアルキン部分に対応する場合はアジド基が挙げられ、生体直交性官能基がアルデヒド部分またはケトン部分に対応する場合はヒドラジン基が挙げられるが、これらに限定されない。
　機能性物質を含む修飾基を含む修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を製造するための反応は、フェリチンの変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。例えば、このような反応は、適切な反応系、例えば緩衝液中において、フェリチンの変性・分解を引き起こし得ない温度条件（例えば約１５～６０℃、好ましくは１５～４５℃）で行うことができる。緩衝液のｐＨは、例えば３．０～１２．０であり、好ましくは５．０～９．０であり、より好ましくは６．０～８．０である。緩衝液は、触媒等の成分を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分～２０時間、好ましくは１０分～１５時間、より好ましくは２０分～１０時間、さらにより好ましくは３０分～８時間である。
　ヒトフェリチン粒子は、内腔中に物質を有していてもよい。ヒトフェリチン粒子の内腔中への物質の封入は、物質を取り込むことができるヒトフェリチン粒子の特性を利用することにより行うことができる。ヒトフェリチン粒子は、外径１２ｎｍ（内径７ｎｍ）の程度の内腔を有するかご状構造を形成する。したがって、物質のサイズは、このような内腔中に封入されることを可能にするサイズであり得る。種々の無機物質および有機物質をヒトフェリチン粒子の内腔中に封入できることが報告されている（例、ＷＯ２０２０／０９０７０８；中国特許出願公開第１０６１１０３３３号明細書；Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　１９６（２０１４）　１８４－１９６；Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２０１６，１７，５１４－５２２；Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　２０１４　１１１（４１）：１４９００－５を参照）。ヒトフェリチン粒子の内腔中への物質の封入は、ヒトフェリチン粒子を修飾反応に付す前後において行うことができる。物質としては、低分子有機化合物が好ましい。低分子有機化合物とは、分子量１５００以下の有機化合物をいう。低分子有機化合物は、天然化合物または合成化合物である。低分子有機化合物の分子量は、１２００以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、または３００以下であってもよい。低分子有機化合物の分子量はまた、３０以上、４０以上、または５０以上であってもよい。低分子有機化合物は、上述したような薬物または標識物質であってもよい。また、低分子有機化合物としては、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ビタミン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、脂質、脂肪酸、およびそれらの塩が挙げられる。
　ヒトフェリチン粒子は、内腔中に物質を有する場合、異なる複数の種類（例、２種、３種または４種）の物質を含む、異なる複数の種類の修飾フェリチンのセットとして提供されてもよい。例えば、ヒトフェリチン粒子が２種の物質を有する２種の修飾フェリチンのセットとして提供される場合、このようなセットは、各々別々に調製された、第１の物質を有する第１の修飾フェリチンと、第１の物質とは異なる第２の物質を有する第２の修飾フェリチンとを、組み合せることにより、得ることができる。
　修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子の生成の確認は、その修飾基の種類および分子量にもよるが、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、および／または質量分析によりにより行うことができる。修飾の位置選択性の確認は、例えば、ペプチドマッピングにより行うことができる。ペプチドマッピングは、例えば、プロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、）処理および質量分析により行うことができる。プロテアーゼとしては、エンドプロテアーゼが好ましい。このようなエンドプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎが挙げられる。修飾ヒトフェリチンＨ鎖またはそれを含むヒトフェリチン粒子は、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
（ＩＩ）ＩｇＧ抗体またはその塩
　ＩｇＧ抗体の種類は、特に限定されず、例えば、哺乳動物、鳥類（例、ニワトリ）等の動物に由来し、好ましくは、哺乳動物に由来する。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、愛玩動物（例、イヌ、ネコ）、家畜（例、ウシ、ブタ、ヤギ）、使役動物（例、ウマ、ヒツジ）が挙げられ、好ましくは霊長類または齧歯類であり、より好ましくはヒトである。
　ＩｇＧ抗体の種類は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体としては、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体が挙げられる。好ましくは、ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ由来部分を含むキメラモノクローナル抗体、ヒトＩｇＧ由来部分を含むヒト化モノクローナル抗体、またはヒトＩｇＧモノクローナル抗体である。ＩｇＧのアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられる。
　ＩｇＧ抗体はまた、所定の糖鎖が付加されたＩｇＧ抗体（例、Ｎ型糖鎖結合コンセンサス配列等の糖鎖結合コンセンサス配列を有するように改変された抗体）、二重特異性ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ　Ｆｃ領域タンパク質、またはＩｇＧ　Ｆｃ融合タンパク質であってもよい。
　ＩｇＧ抗体はさらに、全長ＩｇＧ抗体、または可変領域ならびにＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン（全部または一部）を含むＩｇＧ抗体断片であってもよい。好ましくは、ＩｇＧ抗体は、全長ＩｇＧ抗体である。
　ＩｇＧ抗体の抗原としては、任意の抗原を用いることができる。例えば、このような抗原としては、タンパク質〔オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。糖等の生体分子で修飾されたタンパク質（例、糖タンパク質）であってもよい〕、糖鎖、核酸、低分子化合物が挙げられる。好ましくは、ＩｇＧ抗体は、タンパク質を抗原とする抗体であってもよい。タンパク質としては、例えば、細胞膜受容体、細胞膜受容体以外の細胞膜タンパク質（例、細胞外基質タンパク質）、リガンド、可溶性受容体が挙げられる。
　より具体的には、ＩｇＧ抗体の抗原であるタンパク質は、疾患標的タンパク質であってもよい。疾患標的タンパク質としては、例えば、以下が挙げられる。
（１）がん領域
　ＰＤ－Ｌ１、ＧＤ２、ＰＤＧＦＲα（血小板由来成長因子受容体）、ＣＤ２２、ＨＥＲ２、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＥｐＣＡＭ、フィブロネクチン、ＰＤ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ３３、ＨＧＦ、ｇｐＮＭＢ、ＣＤ２７、ＤＥＣ－２０５、葉酸受容体、ＣＤ３７、ＣＤ１９、Ｔｒｏｐ２、ＣＥＡＣＡＭ５、Ｓ１Ｐ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ－１Ｒ、ＤＬＬ４、ＴＮＴ－１／Ｂ、ＣＰＡＡｓ、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ３０、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３８、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１，２，、ＮＫＧ２Ａ、ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＣＴＬＡ－４、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＣＤ１３８、ｃ－Ｍｅｔ、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＣＤ７９ｂ、ＥＮＰＤ３、葉酸受容体α、ＴＥＭ－１、ＧＭ２、グリピカン３、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ、ＣＤ７４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、ＣＤ３７、ＴＬＲ－２、ＣＤ３、ＣＳＦ－１Ｒ、ＦＧＦＲ２ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥｐｈＡ３、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ１２３、ｇｐＡ３３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７受容体、ＤＬＬ４、ＶＥＧＦ、ＲＳＰＯ、ＬＩＶ－１、ＳＬＩＴＲＫ６、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、ＣＤ２５、ＭＥＴ、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ、ＩＬ－８、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、ＫＩＲ３ＤＬ２、Ｂｓｔ１（ＣＤ１５７）、Ｐ－カドヘリン、ＣＥＡ、ＧＩＴＲ、ＴＡＭ（ｔｕｍｏｒ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ＣＥＡ、ＤＬＬ４、Ａｎｇ２、ＣＤ７３、ＦＧＦＲ２、ＣＸＣＲ４、ＬＡＧ－３、ＧＩＴＲ、Ｆｕｃｏｓｙｌ　ＧＭ１、ＩＧＦ－１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ　２、ＣＳＦ－１Ｒ、ＦＧＦＲ３、ＯＸ４０、ＢＣＭＡ、ＥｒｂＢ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＰＴＫ７、ＥＦＮＡ４、ＦＡＰ、ＤＲ５、ＣＥＡ、Ｌｙ６Ｅ、ＣＡ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ＬＡＭＰ１、ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ、ＥＰＨＡ２、ＤＲ５、Ｂ７－Ｈ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ２、α２－ＰＩ、Ａ３３、ＧＤＦ１５、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６６、ＲＯＲ１、ＧＩＴＲ、ＢＣＭＡ、ＴＢＡ、ＬＡＧ－３、ＥｐｈＡ２、ＴＩＭ－３、ＣＤ－２００、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＰＩＧＦ、Ａｘｌ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ、ＣＤ３９、ＣＤ３７、ＣＤ７３、ＣＬＥＣ１２Ａ、Ｌｇｒ３、トランスフェリン受容体、ＴＧＦβ、ＩＬ－１７、５Ｔ４、ＲＴＫ、Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮａＰｉ２ｂ、ルイス血液型Ｂ抗原、Ａ３４、Ｌｙｓｉｌ－Ｏｘｉｄａｓｅ、ＤＬＫ－１、ＴＲＯＰ－２、α９インテグリン、ＴＡＧ－７２（ＣＡ７２－４）、ＣＤ７０
（２）自己免疫疾患・炎症性疾患
　ＩＬ－１７、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１７Ｒ、ＩＮＦ－α、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－１３、ＩＬ－２３、ＩＬ－６、ＡｃｔＲＩＩＢ、β７－Ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＩＬ－４αＲ、ＨＡＳ、Ｅｏｔａｘｉｎ－１、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１５、ＣＤ３ε、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１α、ＩＬ－１７、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＬＡＭＰ（Ａｌｐｈａ４　Ｂｅｔａ　７　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＴＳＬＰ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＴＬＲ－３、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＭＡｄＣＡＭ、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ－３３、ＣＤ７４、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、Ｃ５、ＦｃＲｎ、ＣＤ２８、ＴＬＲ４、ＭＣＡＭ、Ｂ７ＲＰ１、ＣＸＣＲ１，２　Ｌｉｇａｎｄｓ、ＩＬ－２１、Ｃａｄｈｅｒｉｎ－１１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２０、ＩＬ－３６Ｒ、ＩＬ－１０Ｒ、ＣＤ８６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－７Ｒ、Ｋｖ１．３、α９インテグリン、ＬＩＦＨＴ
（３）脳神経疾患
　ＣＧＲＰ、ＣＤ２０、βアミロイド、βアミロイドプロトフィブリン、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ　Ｇｅｎｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＩＮＧＯ（Ｉｇ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１）、αシヌクレイン、細胞外ｔａｕ、ＣＤ５２、インスリン受容体、ｔａｕタンパク、ＴＤＰ－４３、ＳＯＤ１、ＴａｕＣ３、ＪＣウイルス
（４）感染症
　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　ｔｏｘｉｎ　Ｂ、サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス、ＬＰＳ、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ　Ａｌｐｈａ－ｔｏｘｉｎ、Ｍ２ｅタンパク、Ｐｓｌ、ＰｃｒＶ、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ　ｔｏｘｉｎ、インフルエンザＡ、Ａｌｇｉｎａｔｅ、黄色ブドウ球菌、ＰＤ－Ｌ１、インフルエンザＢ、アシネトバクター、Ｆ－ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅｎｖ、ＣＤ３、病原性大腸菌、クレブシエラ、肺炎球菌
（５）遺伝性・希少疾患
　アミロイドＡＬ、ＳＥＭＡ４Ｄ（ＣＤ１００）、インスリン受容体、ＡＮＧＰＴＬ３、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＦＧＦ２３、副腎皮質刺激ホルモン、トランスサイレチン、ハンチンチン
（６）眼疾患
　Ｆａｃｔｏｒ　Ｄ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＰＧＤＦＲ、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＣＤ－１０５（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、ＩＧＦ－１Ｒ、βアミロイド
（７）骨・整形外科領域
　Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１、ＧＤＦ８、ＲＮＡＫＬ、ＨＡＳ、Ｓｉｇｌｅｃ－１５
（８）血液疾患
　ｖＷＦ、Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸａ、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘ、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＢＭＰ－６、Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ、ＴＦＰＩ
（９）その他の疾患
　ＢＡＦＦ（Ｂ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ－１β、ＰＣＳＫ９、ＮＧＦ、ＣＤ４５、ＴＬＲ－２、ＧＬＰ－１、ＴＮＦＲ１、Ｃ５、ＣＤ４０、ＬＰＡ、プロラクチン受容体、ＶＥＧＦＲ－１、ＣＢ１、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＰＴＨ１Ｒ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１β、ＡＴ２－Ｒ、ＩＡＰＰ
　ＩｇＧ抗体の具体例としては、特定のキメラ抗体（例、リツキシマブ、バシリキシマブ、インフリキシマブ、セツキシマブ、シルツキシマブ、ディヌツキシマブ、オルタトキサシマブ）、特定のヒト化抗体（例、ダクリヅマブ、パリビズマブ、トラスツズマブ、アレンツズマブ、オマリヅマブ、エファリヅマブ、ベバシヅマブ、ナタリヅマブ（ＩｇＧ４）、トシリヅマブ、エクリヅマブ（ＩｇＧ２）、モガムリヅマブ、ペルツヅマブ、オビヌツヅマブ、ベドリヅマブ、ペンプロリヅマブ（ＩｇＧ４）、メポリヅマブ、エロツヅマブ、ダラツムマブ、イケセキヅマブ（ＩｇＧ４）、レスリヅマブ（ＩｇＧ４）、アテゾリヅマブ）、特定のヒト抗体（例、アダリムマブ（ＩｇＧ１）、パニツムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、オファツムマブ、デノスマブ（ＩｇＧ２）、イピリムマブ、ベリムマブ、ラキシバクマブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、デュピルマブ（ＩｇＧ４）、セクキヌマブ、エボロクマブ（ＩｇＧ２）、アリロクマブ、ネシツムマブ、ブロダルマブ（ＩｇＧ２）、オララツマブ）が挙げられる（ＩｇＧサブタイプに言及していない場合、ＩｇＧ１であることを示す）。
　ＩｇＧ抗体中のアミノ酸残基の位置、および重鎖の定常領域の位置（例、ＣＨ２ドメイン）についてはＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌを参照）。例えば、ヒトＩｇＧを対象とする場合、２４６位のリジン残基は、ヒトＩｇＧ　ＣＨ２領域の１６番目のアミノ酸残基に相当し、２４８位のリジン残基は、ヒトＩｇＧ　ＣＨ２領域の１８番目のアミノ酸残基に相当し、２８８位のリジン残基は、ヒトＩｇＧ　ＣＨ２領域の５８番目のアミノ酸残基に相当し、２９０位のリジン残基は、ヒトＩｇＧ　ＣＨ２領域の６０番目のアミノ酸残基に相当し、３１７位のリジン残基は、ヒトＩｇＧ　ＣＨ２領域の８７番目のアミノ酸残基に相当する。２４６／２４８位の表記は、２４６位または２４８位のリジン残基が対象であることを示す。２８８／２９０位の表記は、２８８位または２９０位のリジン残基が対象であることを示す。
　一実施形態では、ＩｇＧ抗体は、特定のアミノ酸残基において位置選択的に修飾されていてもよい。ＩｇＧ抗体に関連して、「位置選択的」または「位置選択性」とは、ＩｇＧ抗体において特定のアミノ酸残基が特定の領域に偏在していないにもかかわらず、ＩｇＧ抗体中の特定のアミノ酸残基と結合できる所定の構造単位が、ＩｇＧ抗体中の特定の領域に偏在することをいう。したがって、「位置選択的に有する」、「位置選択的な結合」、「位置選択性での結合」等の位置選択性に関連する表現は、１個以上の特定のアミノ酸残基を含む標的領域における所定の構造単位の保有率または結合率が、標的領域における当該特定のアミノ酸残基と同種である複数個のアミノ酸残基を含む非標的領域における当該構造単位の保有率または結合率よりも有意なレベルで高いことを意味する。このような位置選択性は、５０％以上であり、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％であってもよい。例えば、抗体における所定の位置の特定のアミノ酸残基を位置選択的に修飾する方法は、国際公開第２０１８／１９９３３７号、国際公開第２０１９／２４０２８８号、国際公開第２０１９／２４０２８７号、および国際公開第２０２０／０９０９７９号に記載されている。このような特定のアミノ酸残基としては、修飾し易い側鎖（例、アミノ基、カルボキシ基、アミド基、ヒドロキシ基、チオール基）を有するアミノ酸残基（例、リジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、スレオニン残基、セリン残基、チロシン残基、システイン残基）を利用できるが、好ましくは、アミノ基を含む側鎖を有するリジン残基、ヒドロキシ基を含む側鎖を有するチロシン残基、セリン残基、およびスレオニン残基、またはチオール基を含む側鎖を有するシステイン残基であり、より好ましくは、リジン残基であってもよい（すなわち、２４６／２４８位のリジン残基、２８８／２９０位のリジン残基、および３１７位のリジン残基のうちの、２つのリジン残基が位置選択的に二重修飾されていてもよく、３つのリジン残基が位置選択的に三重修飾されていてもよい）。
　本発明において、用語「塩」としては、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、およびアミノ酸との塩が挙げられる。無機酸との塩としては、例えば、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸との塩が挙げられる。有機酸との塩としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、シュウ酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。無機塩基との塩としては、例えば、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）、および亜鉛、アルミニウム等の他の金属、ならびにアンモニウムとの塩が挙げられる。有機塩基との塩としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、プロピレンジアミン、エチレンジアミン、ピリジン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンとの塩が挙げられる。アミノ酸との塩としては、例えば、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン）、および酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩が挙げられる。塩は、好ましくは、無機酸（例、塩化水素）との塩、または有機酸（例、トリフルオロ酢酸）との塩である。
（ＩＩＩ）ヒトフェリチン粒子およびＩｇＧ抗体の連結
　特定の実施形態では、ヒトフェリチン粒子およびＩｇＧ抗体は、位置選択的に連結されていてもよい。この場合、本発明のＩｇＧ抗体は、下記式（１）で表すことができる：
　　Ｘ１－Ｌ１－Ｙ－Ｌ２－Ｘ２　（１）
〔式中、
　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を示し、
　Ｙは、ＩｇＧ抗体を示し、
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ、リンカーを示し、
　Ｘ１およびＸ２で示される２個のヒトフェリチン粒子は、それぞれ、それに含まれるヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている。〕。
　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を示す。ヒトフェリチンＨ鎖、およびヒトフェリチン粒子の詳細は、上述したとおりである。Ｘ１およびＸ２で示されるヒトフェリチン粒子は、同一であっても、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。特定の場合、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子は、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含んでいてもよい。
　Ｙは、ＩｇＧ抗体を示す。ＩｇＧ抗体の詳細は、上述したとおりである。
　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ、リンカーを示す。ＩｇＧ抗体、および２個のヒトフェリチン粒子は、このようなリンカーを介して連結される。Ｌ１およびＬ２で示されるリンカーは、同一であっても、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。リンカーは、ペプチド部分を含んでいてもよいが、ペプチド部分を含まないことが好ましい。ペプチド部分は、潜在的な免疫原性を有し、また血中で加水分解され易いためである。ペプチド部分を含むリンカーを介して、抗体を目的物質に位置選択的に連結する方法は、例えば、国際公開第２０１６／１８６２０６号公報、国際公開第２０１７／２０９４７１号公報、国際公開第２０１７／２１７３４７号公報、国際公開第２０１８／２３０２５７号公報に開示されている。ペプチド部分を含まないリンカーを介して、抗体を目的物質に位置選択的に連結する方法は、例えば、国際公開第２０１８／１９９３３７号公報、国際公開第２０１９／２４０２８７号公報、国際公開第２０１９／２４０２８８号公報、国際公開第２０２０／００９１６５号公報、国際公開第２０２０／０９０９７９号公報に開示されている。本発明によれば、ペプチド部分を含むリンカーを利用せずに、抗体中の重鎖における特定のアミノ酸残基を位置選択的に修飾することができる。ペプチド部分を含まないリンカーの使用は、臨床応用において望ましい。
　Ｘ１およびＸ２で示される２個のヒトフェリチン粒子は、それぞれ、それに含まれるヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている。ヒトフェリチン粒子がこのようなアミノ酸残基の側鎖中の原子を介してリンカーに連結されることにより、ＩｇＧ抗体に対するヒトフェリチン粒子の連結部位について位置選択性が達成される。
　好ましい実施形態では、ヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子は、システイン残基（例、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在するシステイン残基）の側鎖中の硫黄原子である。このようなシステイン残基を利用することで、ＩｇＧ抗体に対するヒトフェリチン粒子の連結数および連結部位（位置選択性）を高度かつ容易に制御することができる。
　特定の実施形態では、Ｙで示されるＩｇＧ抗体は、２個の重鎖定常領域中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されていてもよい。ＩｇＧ抗体がこのようなアミノ酸残基の側鎖中の原子を介してリンカーに連結されることにより、ヒトフェリチン粒子に対するＩｇＧ抗体の連結部位について位置選択性が達成される。このようなアミノ酸残基としては、修飾し易い側鎖（例、アミノ基、カルボキシ基、アミド基、ヒドロキシ基、チオール基）を有するアミノ酸残基（例、リジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、スレオニン残基、セリン残基、チロシン残基、システイン残基）を利用できる。好ましくは、このようなアミノ酸残基は、アミノ基を含む側鎖を有するリジン残基（窒素原子を介する）、ヒドロキシ基を含む側鎖を有するチロシン残基、セリン残基、およびスレオニン残基（酸素原子を介する）、またはチオール基を含む側鎖を有するシステイン残基（硫黄原子を介する）であってもよい。
　好ましい実施形態では、２個の重鎖定常領域中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子は、リジン残基（例、ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＩｇＧ抗体重鎖の２４６／２４８位、２８８／２９０位、または３１７位に存在するリジン残基）の側鎖中の窒素原子である。このようなリジン残基を利用することで、ヒトフェリチン粒子に対するＩｇＧ抗体の連結数および連結部位（位置選択性）を高度かつ容易に制御することができる。
　特定の実施形態では、ヒトフェリチン粒子は、１粒子あたり、下記（ａ）および（ｂ）の各ヒトフェリチンＨ鎖を下記平均数で含む、ヒトフェリチンＨ鎖のホモ２４量体であってもよい：
（ａ）リンカーと連結されておらず、かつ修飾基が導入された修飾ヒトフェリチンＨ鎖の数　ｎ個；および
（ｂ）非修飾ヒトフェリチンＨ鎖の数　ｍ個；
　ここで、ｎは０～２３の数であり、ｍは０～２３の数であり、ｎおよびｍの合計は２３である。
　上記（ａ）および（ｂ）において、ｎおよびｍの合計が２３となる理由は、ヒトフェリチン粒子を構成する２４個のヒトフェリチンＨ鎖のうちの１個が、ＩｇＧ抗体との連結に利用されるためである。すなわち、ＩｇＧ抗体との連結に利用されないヒトフェリチン粒子中のヒトフェリチンＨ鎖の数が２３個となるため、ｎおよびｍの合計が２３となる。
　上記（ａ）および（ｂ）において、ｎおよびｍは、以下のように決定することができる。先ず、ヒトフェリチン粒子を解離できる条件下で本発明のＩｇＧ抗体を含む溶液を処理した後、その溶液をクロマトグラフィーに供して、（ａ）リンカーと連結されておらず、かつ修飾基が導入された修飾ヒトフェリチンＨ鎖、（ｂ）非修飾ヒトフェリチンＨ鎖、（ｃ）リンカーを介して連絡されている２個の修飾フェリチンＨ鎖およびＩｇＧ抗体の連結物のピークを分離する。次に、（ａ）および（ｂ）のピークの面積比から（ａ）および（ｂ）の比率を算出し、この比率を２３と乗算することにより、平均数であるｎおよびｍを決定することができる。ｎおよびｍは整数として表現されてもよいが、小数点１位以下の値を有する数として表現されてもよい。ＩｇＧ抗体に連結されているヒトフェリチン粒子に含まれる修飾ヒトフェリチンＨ鎖および非修飾ヒトフェリチンＨ鎖の割合は、全てのヒトフェリチン粒子において均一でない可能性があり、平均化により小数点１位以下の値が算出され得るためである。
　特定の実施形態では、ヒトフェリチン粒子は、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を平均数１個以上で含む、ヒトフェリチンＨ鎖のホモ２４量体（モザイク体）であってもよい。この場合、上記（ａ）および（ｂ）において、ｎは０～２２の数であり、ｍは１～２２の数であり、ｎおよびｍの合計が２３である。
　特定の実施形態では、ヒトフェリチン粒子は、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を平均数１２個以上で含む、ヒトフェリチンＨ鎖のホモ２４量体（モザイク体）であってもよい。この場合、上記（ａ）および（ｂ）において、ｎは０～１１の数であり、ｍは１２～２３の数であり、ｎおよびｍの合計が２３である。この場合、ヒトフェリチン粒子を構成するヒトフェリチンＨ鎖の半数以上が、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖となり、非修飾度が高いヒトフェリチン粒子を提供することができる。非修飾度が高いヒトフェリチン粒子を提供する観点では、下記（ｉ）～（ｘｉ）も好ましい：
（ｉ）ｎが０～１０の数であり、ｍが１３～２３の数であること；
（ｉｉ）ｎが０～９の数であり、ｍが１４～２３の数であること；
（ｉｉｉ）ｎが０～８の数であり、ｍが１５～２３の数であること；
（ｉｖ）ｎが０～７の数であり、ｍが１６～２３の数であること；
（ｖ）ｎが０～６の数であり、ｍが１７～２３の数であること；
（ｖｉ）ｎが０～５の数であり、ｍが１８～２３の数であること；
（ｖｉｉ）ｎが０～４の数であり、ｍが１９～２３の数であること；
（ｖｉｉｉ）ｎが０～３の数であり、ｍが２０～２３の数であること；
（ｉｘ）ｎが０～２の数であり、ｍが２１～２３の数であること；または
（ｘ）ｎが０～１の数であり、ｍが２２～２３の数であること；または
（ｘｉ）ｎが０の整数であり、ｍが２３の整数であること。
　本発明はまた、本発明の複合体またはその塩の製造方法を提供する。
（Ｉ）方法（１）
　本発明は、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、および（Ｂ）それに連結されている、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩の製造方法を提供する。本発明の方法は、下記（１）～（３）を含む：
（１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含む修飾ＩｇＧ抗体を生成すること；
（２）１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む修飾粒子を生成すること；ならびに
（３）前記修飾ＩｇＧ抗体を前記修飾粒子と反応させて、前記複合体を得ること。
　工程（１）では、ＩｇＧ抗体に２個の第１反応性基を導入できる任意の方法により行うことができる。好ましくは、ＩｇＧ抗体への第１反応性基の導入は、位置選択的に行うことができる。ＩｇＧ抗体の位置選択的な導入は、上述したような、抗体を目的物質に位置選択的に連結する方法と同様にして行うことができる（上述の参考文献を参照）。本発明によれば、ペプチド部分を含むリンカーを利用せずに、ＩｇＧ抗体中の２個の重鎖における特定のアミノ酸残基に第１反応性基を位置選択的に導入することができる。特定のアミノ酸残基としては、上述したアミノ酸残基が挙げられ、リジン残基（例、２４６／２４８位のリジン残基、２８８／２９０位のリジン残基、および３１７位のリジン残基）が好ましい。
　工程（２）では、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入できる任意の方法により行うことができる。ヒトフェリチン粒子への第２反応性基の導入は、ヒトフェリチンＨ鎖を介して行うことができる。好ましくは、ヒトフェリチン粒子への第２反応性基の導入は、ヒトフェリチンＨ鎖中に存在するシステイン残基（例、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在するシステイン残基）の側鎖中の硫黄原子を介して行うことができる。このようなシステイン残基を利用することで、ＩｇＧ抗体に対するヒトフェリチン粒子の連結数および連結部位（位置選択性）を高度かつ容易に制御することができる。
　ヒトフェリチンＨ鎖中に存在するシステイン残基の側鎖中の硫黄原子を介してヒトフェリチン粒子に第２反応性基が導入される場合、チオール修飾試薬の使用が好ましい。本発明で用いられるチオール修飾試薬は、チオール基に対する少なくとも１個の反応部位を含む反応性物質であって、反応により、反応性基を含む修飾基をヒトフェリチンに付加する能力を有するものである。チオール修飾試薬としては、このような反応を触媒できる任意の試薬を使用することができる。反応効率の向上の観点から、チオール修飾試薬は、マレイミド部分、ベンジルハライド部分、αハロアミド部分、αハロケトン部分、アルケン部分、アルキン部分、フルオロアリール部分、ニトロアリール部分、メチルスルホニルオキサジアゾール部分、およびジスルフィド部分からなる群より選ばれる１個以上の部分構造および第２反応性基を含むものが好ましい。
　工程（３）では、上記工程（１）で得られた修飾ＩｇＧ抗体が、上記工程（２）で得られた修飾粒子と反応される。これにより、修飾ＩｇＧ抗体に導入された第１反応性基と、修飾粒子に導入された第２反応性基が互いに反応して、本発明の複合体またはその塩を得ることができる。反応における修飾ＩｇＧ抗体と修飾粒子のモル量比は、例えば３０：１～１：３０、好ましくは２０：１～１：２０、より好ましくは１５：１～１：１５の範囲内であってもよい。あるいは、反応は、修飾ＩｇＧ抗体に導入された第１反応性基と、修飾粒子に導入された第２反応性基とのモル量比に基づき設定されてもよい。反応における第１反応性基と第２反応性基のモル量比は、例えば１：１～１：３０、好ましくは１：１～１：２０、より好ましくは１：１～１：１５の範囲内であってもよい。
　上記工程（１）～（３）の反応は、タンパク質の変性・分解（例、アミド結合の切断）を引き起こし得ない条件（温和な条件）下で適宜行うことができる。例えば、このような反応は、適切な反応系、例えば緩衝液中において、フェリチンの変性・分解を引き起こし得ない温度条件（例えば約１５～６０℃、好ましくは１５～４５℃）で行うことができる。緩衝液のｐＨは、例えば３．０～１２．０であり、好ましくは５．０～９．０であり、より好ましくは６．０～８．０である。緩衝液は、触媒等の成分を含んでいてもよい。反応時間は、例えば１分～２０時間、好ましくは１０分～１５時間、より好ましくは２０分～１０時間、さらにより好ましくは３０分～８時間である。
（ＩＩ）方法（２－１）および（２－２）
　特定の実施形態では、本発明の方法は、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ）それに連結されている、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩の製造方法であってもよい。
　一実施形態では、このような本発明の方法（２－１）は、下記（１）～（４）を含む：
（１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含む修飾ＩｇＧ抗体を生成すること；
（２）２個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第１修飾粒子を生成すること；
（３）前記第１修飾粒子において、前記２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部を非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換して、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第２修飾粒子を生成すること；ならびに
（４）前記修飾ＩｇＧ抗体を、前記第２修飾粒子と反応させて、前記複合体を得ること。
　方法（２－１）における工程（１）および（２）は、方法（１）における工程（１）および（２）と同様にして行うことができる。
　方法（２－１）における工程（３）では、第２反応性基を含む２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第１修飾粒子において、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部が非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換される。本工程では、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部（すなわち、少なくとも１個の修飾ヒトフェリチンＨ鎖）が非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換されるので、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第２修飾粒子が生成される。
　上記交換は、第２反応性基を含む２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第１修飾粒子、および非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む非修飾ヒトフェリチン粒子を、ヒトフェリチン粒子からのヒトフェリチンＨ鎖の解離およびヒトフェリチンＨ鎖からのヒトフェリチン粒子への再会合が可能な条件下で共存させることにより、行うことができる。このような解離および再会合は、フェリチン粒子の内腔中に種々の物質を封入する際に利用されている（例、ＷＯ２０２０／０９０７０８；中国特許出願公開第１０６１１０３３３号明細書；Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　１９６（２０１４）　１８４－１９６；Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２０１６，１７，５１４－５２２；Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　２０１４　１１１（４１）：１４９００－５を参照）。したがって、本工程において、フェリチン粒子の内腔中に物質を封入することが同時に行われてもよい。好ましくは、解離が可能な条件は、酸（例、塩酸、グリシン塩酸塩、硫酸）で調整されたｐＨ１．５～３．０の水溶液中にフェリチン粒子を置くことである（例、４～３０℃で５～６０分間）。また、再会合が可能な条件は、ｐＨ１．５～３．０の水溶液中にフェリチン粒子を置くことである（例、４～３０℃で３０～１８０分間）。例えば、解離物を含む溶液に緩衝液（例、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液）を添加して、溶液をｐＨ５．０～１０．０に調製してもよい。
　第１修飾粒子に対する非修飾ヒトフェリチン粒子のモル比を高く設定することにより、第２修飾粒子中の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖の割合を向上させることができる。第１修飾粒子に対する非修飾ヒトフェリチン粒子のモル比（非修飾ヒトフェリチン粒子／第１修飾粒子）は、例えば、１以上、１．５以上、２以上、２．５以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、９以上、または１０以上であってもよい。当該モル比はまた、５０以下、４０以下、３０以下、または２０以下であってもよい。第１修飾粒子に対して過剰量の非修飾ヒトフェリチン粒子を用いる場合、第２修飾粒子中の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖の平均数を１個以下に設定することができる。この場合、その１個が工程（４）の反応で利用されるので、工程（４）の反応に伴いリンカーと連結され得る修飾ヒトフェリチンＨ鎖　１個および非修飾ヒトフェリチンＨ鎖　２３個を含む、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に富む修飾ヒトフェリチン粒子を生成することができる。
　方法（２－１）における工程（４）は、方法（１）における工程（３）と同様にして行うことができる。
　別の実施形態では、このような本発明の方法（２－２）は、下記（１）～（４）を含む：
（１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含むＩｇＧ抗体を生成すること；
（２）２個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第１修飾粒子を生成すること；
（３）前記修飾ＩｇＧ抗体を、前記第１修飾粒子と反応させて、（Ａ’）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ’）それに連結されている、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩を生成すること；ならびに
（４）（Ａ’）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ’）それに連結されている、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩において、前記２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部を非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換して、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ）それに連結されている、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩を得ること。
　方法（２－２）における工程（１）～（３）は、方法（１）における工程（１）～（３）と同様にして行うことができる。
　方法（２－２）における工程（４）では、（Ａ’）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ’）それに連結されている、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩において、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部が非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換される。本工程では、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部（すなわち、少なくとも１個の修飾ヒトフェリチンＨ鎖）が非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換されるので、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ）それに連結されている、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩が生成される。
　上記交換は、（Ａ’）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ’）それに連結されている、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩、ならびに非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む非修飾ヒトフェリチン粒子を、上述したような解離および再会合が可能な条件下で共存させることにより、行うことができる。このような解離および再会合は、フェリチン粒子の内腔中に種々の物質を封入する際に利用されている。したがって、本工程において、フェリチン粒子の内腔中に物質を封入することが同時に行われてもよい。好ましくは、解離が可能な条件、および再会合が可能な条件は、上述のとおりである。
　原料複合体またはその塩に対する非修飾ヒトフェリチン粒子の割合を高く設定することにより、得られる複合体中の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖の割合を向上させることができる。原料複合体に対する非修飾ヒトフェリチン粒子のモル比（非修飾ヒトフェリチン粒子／原料複合体）は、例えば、１以上、１．５以上、２以上、２．５以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、９以上、または１０以上であってもよい。当該モル比はまた、５０以下、４０以下、３０以下、または２０以下であってもよい。原料複合体またはその塩に対して過剰量の非修飾ヒトフェリチン粒子を用いる場合、得られる複合体またはその塩中の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖の平均数を１個に設定することができる。この場合、リンカーと連結されている修飾ヒトフェリチンＨ鎖　１個および非修飾ヒトフェリチンＨ鎖　２３個を含む、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に富む修飾ヒトフェリチン粒子を生成することができる。
　本発明の方法はさらに、ヒトフェリチン粒子の内腔に物質を封入する工程、および修飾基を有する修飾ヒトフェリチンＨ鎖がヒトフェリチン粒子中に残存する場合、このような修飾基に機能性物質を反応させる工程をさらに含んでいてもよい。
　本発明の複合体またはその塩の確認は、例えば、電子顕微鏡、電気泳動法、クロマトグラフィー（例、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、および／または質量分析により行うことができる。本発明の複合体またはその塩が修飾基を有する修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む場合、その修飾基の種類および分子量に依存して、上記方法から適宜選択される。位置選択性の確認は、例えば、ペプチドマッピングにより行うことができる。ペプチドマッピングは、例えば、プロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、）処理および質量分析により行うことができる。プロテアーゼとしては、エンドプロテアーゼが好ましい。このようなエンドプロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎが挙げられる。修飾フェリチンは、クロマトグラフィー（例、上述したクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）等の任意の方法により適宜精製することができる。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
参考例１：ヒトフェリチンＨ鎖の調製
　ヒトフェリチンＨ鎖（ＦＴＨ（配列番号１））をコードするＤＮＡ（配列番号２）を全合成した。このＤＮＡの発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉに導入することによりＥ．ｃｏｌｉ中でヒトフェリチンＨ鎖を発現させると、開始コドンのメチオニンがＮ－ホルミルメチオニンとなり、翻訳後修飾で除去されるため、配列番号１のアミノ酸配列における１位のメチオニン残基が除去された配列番号３のアミノ酸配列で規定されるヒトフェリチンＨ鎖が得られることになる（図１）。以下、ヒトフェリチンのアミノ酸残基の位置は、配列番号１のアミノ酸配列により規定される典型的な天然型ヒトフェリチンＨ鎖を基準にして特定する。必要に応じて、配列番号３のアミノ酸配列の位置も併記することがある。
　ヒトフェリチンＨ鎖をコードする合成ＤＮＡを鋳型として、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ－３’（配列番号４）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ－３’（配列番号５）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号６）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号７）をプライマーとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を各々Ｗｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＨをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨ）を構築した。
　続いて、構築したｐＥＴ２０－ＦＴＨが導入されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ　Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後、冷却し、遠心分離で得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ　Ｑ　ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、表面電荷の違いにより目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｎ　２０－１００Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ　２６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００　ＨＲカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に注入し、ＦＴＨを分離精製した。そのＦＴＨを含む溶液をＶｉｖａｓｐｎ　２０－１００Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、培養液１００ｍｌあたり、５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨを含む溶液１ｍｌを得ることができた。
参考例２：エチルマレイミドによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
（２－１）エチルマレイミドによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
　参考例１で発現したヒトフェリチンＨ鎖をｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに溶解し、濃度を５．０ｍｇ／ｍｌとした。エチルマレイミドをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し濃度を２０ｍＭとした。エチルマレイミド６等量（モル量に基づく。以下同様。）を、ヒトフェリチンＨ鎖を含む水溶液に加え攪拌した後、室温で１時間振盪反応させた。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。原料のヒトフェリチンＨ鎖は２１０９３にピークが観測され、生成物はエチルマレイミド（分子量１２５）が２個導入された２１３４４のピークが確認された（図２）。
参考例３：ヒトフェリチンＨ鎖のエチルマレイミド導入体のペプチドマッピング
（３－１）ヒトフェリチンＨ鎖のエチルマレイミド導入体のトリプシン処理
　１．５ｍＬ低吸着マイクロテストチューブにサンプル溶液（参考例２で調製された、ヒトフェリチン重鎖のエチルマレイミド導入体を含む）を１０μＬ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液／８Ｍ尿素を３０μＬ、トリフルオロエタノールを１０μＬ添加し撹拌した後に、４８ｍＭのジチオスレイトール水溶液１５μＬを加えて６５℃で１時間加温後、１２０ｍＭのヨードアセトアミド水溶液１５μＬを添加し、遮光下室温、６０分間反応させた。反応後、４８ｍＭジチオスレイトール水溶液５μＬの添加により過反応を抑制し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液を１５０μＬ加えて撹拌し、１００ｎｇ／μＬのトリプシン水溶液（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｇｒａｄｅ，　Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．Ｔ６５６７－５ｘ２０μｇ（ＳＩＧＭＡ））を２．５μＬ添加して３７℃で１時間静置後、さらに１００ｎｇ／μＬトリプシン水溶液２．５μＬを添加し３７℃で１５時間酵素消化した。消化後、２０％トリフルオロ酢酸水溶液を１５μＬ添加し反応を止め、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で１０倍希釈後ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定に供した。
（３－２）ヒトフェリチン重鎖のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定条件
（分析装置）
ナノＨＰＬＣ：ＥＡＳＹ－ｎＬＣ　１０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
質量分析計：トライブリッド質量分析計Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｆｕｓｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
（ＨＰＬＣ分析条件）
　トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ　ＰｅｐＭａｐ（登録商標）　１００，７５μｍｘ２ｃｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
分析カラム：ＥＳＩ－ｃｏｌｕｍｎ（ＮＴＣＣ－３６０／７５－３－１２５，７５μｍ×１２．５ｃｍ，３μｍ（日京テクノス株式会社））
　移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
　移動相Ｂ：０．１％ギ酸、アセトニトリル溶液
　ローディング溶液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
　流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
　サンプル注入量：１μＬ
　グラジエント条件（Ｂ％）：２％（０．０－０．５分）、２％→３０％（０．５－２３．５分）、３０％→７５％（２３．５－２５．５分）、７５％（２５．５－３５.０分）
（質量分析計分析条件）
　イオン化法：ＥＳＩ，　Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
　スキャンタイプ：Ｄａｔａ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ
　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｔｙｐｅ：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ）
　データの取得は付属ソフトであるＸｃａｌｉｂｕｒ　３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック）およびＴｈｅｒｍｏ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｔｕｎｅ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて行った。
（３－３）ヒトフェリチンＨ鎖の修飾部位の解析条件
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定結果に対する修飾部位解析については、ＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒ　３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて行った。
　ＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒでの解析は、Ｓ／Ｎ　Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを２０、ＭＳ　Ｎｏｉｓｅ　Ｌｅｖｅｌを１０００に設定して実施した。また、消化酵素をＴｒｙｐｓｉｎに、ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙをＨｉｇｈに設定した。さらに、ペプチド同定時のＭａｓｓ　Ａｃｃｕｒａｃｙは５ｐｐｍとした。Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓについては、メチオニンの酸化（＋１５．９９５Ｄａ）およびシステイン残基への修飾体（Ｎ－エチルマレイミド導入体（＋１２５．０４８Ｄａ）、ヨードアセトアミドによるカルバミドメチル化（＋５７．０２１Ｄａ））を設定した。また、Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ　Ｓｃｏｒｅが８０以上、ＭＳ／ＭＳが観測できているもののみとなるようフィルターを設定した。
　また、修飾部位の検索対象のアミノ酸配列のデータとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列を用いた。
（３－４）ヒトフェリチンＨ鎖のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、参考例２のエチルマレイミドによるヒトフェリチン重鎖の特異的修飾体のトリプシン消化により生成した、二つのシステイン残基への修飾部位（Ｎ－エチルマレイミド導入体（＋１２５．０４８Ｄａ））を含むアミノ酸２９残基からなるペプチド、ＩＦＬＱＤＩＫＫＰＤＣＤＤＷＥＳＧＬＮＡＭＥＣＡＬＨＬＥＫ（配列番号８）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ　９０３．６７７２７、理論値：９０３．６７７３８、４価）が観測され（図３）、ＣＩＤスペクトルよりヒトフェリチンＨ鎖の９１位および１０３位（配列番号３のアミノ酸配列における９０位および１０２位）のシステイン残基の修飾を示す、３価のｙ２７に相当するｍ／ｚ　１１１８．２４（理論値：１１１７．８５）のプロダクトイオンが確認された（図４）。
参考例４：ｐ－アジドフェナシルブロミドによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
（４－１）ｐ－アジドフェナシルブロミド６当量によるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
　参考例１で発現したヒトフェリチンＨ鎖をｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに溶解し、濃度を５．０ｍｇ／ｍｌとした。ｐ－アジドフェナシルブロミドをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し濃度を２０ｍＭとした。ｐ－アジドフェナシルブロミド６当量を、ヒトフェリチンＨ鎖を含む水溶液に加え攪拌した後、室温で１時間振盪反応させた。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。原料のヒトフェリチンＨ鎖は２１０９３にピークが観測され、生成物は原料のピークおよびｐ－アジドフェナシル（分子量１６０）が１個導入された２１２５２、２個導入された２１４１２のピークが確認された（図５）。
（４－２）ｐ－アジドフェナシルブロミド１２当量によるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
　参考例１で発現したヒトフェリチンＨ鎖をｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに溶解し、濃度を５．０ｍｇ／ｍｌとした。ｐ－アジドフェナシルブロミドをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し濃度を２０ｍＭとした。ｐ－アジドフェナシルブロミド１２当量を、ヒトフェリチンＨ鎖を含む水溶液に加え攪拌した後、室温で１時間振盪反応させた。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。原料のヒトフェリチンＨ鎖は２１０９３にピークが観測され、生成物はｐ－アジドフェナシル（分子量１６０）が１個導入された２１２５２、２個導入された２１４１２のピークが確認された（図６）。
参考例５：ヒトフェリチンＨ鎖のｐ－アジドフェナシル導入体のペプチドマッピング
（５－１）ヒトフェリチンＨ鎖のｐ－アジドフェナシル導入体のトリプシン処理
　参考例２で調製された、ヒトフェリチン重鎖のエチルマレイミド導入体を含むサンプル溶液の代わりに、参考例４（４－２）で調製された、ヒトフェリチン重鎖のｐ－アジドフェナシル導入体を含むサンプル溶液を用いたこと以外は、参考例３（３－１）と同様に処理して、ヒトフェリチン重鎖のエチルマレイミド導入体をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定に供した。
（５－２）ヒトフェリチンＨ鎖のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定条件
　分析装置、ＨＰＬＣ分析条件、および質量分析計分析条件は、参考例３（３－２）と同じである。
（５－３）ヒトフェリチンＨ鎖の修飾部位の解析条件
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定結果に対する修飾部位解析については、ＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒ　３．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて行った。
　ＢｉｏＰｈａｒｍａ　Ｆｉｎｄｅｒでの解析は、Ｓ／Ｎ　Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを２０、ＭＳ　Ｎｏｉｓｅ　Ｌｅｖｅｌを１０００に設定して実施した。また、消化酵素をＴｒｙｐｓｉｎに、ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙをＨｉｇｈに設定した。さらに、ペプチド同定時のＭａｓｓ　Ａｃｃｕｒａｃｙは５ｐｐｍとした。Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓについては、メチオニンの酸化（＋１５．９９５Ｄａ）およびシステイン残基への修飾体（ｐ－アジドフェナシル導入体（＋１５９．０４３２６２Ｄａ）、ｐ－アミノフェナシル導入体（＋１３３．０５２７６４Ｄａ）、ヨードアセトアミドによるカルバミドメチル化（＋５７．０２１Ｄａ））を設定した。また、Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ　Ｓｃｏｒｅが８０以上、ＭＳ／ＭＳが観測できているもののみとなるようフィルターを設定した。
　また、修飾部位の検索対象のアミノ酸配列のデータとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列を用いた。
　なお、消化の際にジチオスレイトールおよびヨードアセトアミドによる還元アルキル化を行うため、ｐ－アジドフェナシル導入体は一部還元されｐ－アミノフェナシル導入体になる。
（５－４）ヒトフェリチンＨ鎖のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる修飾部位の解析結果
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた解析の結果、参考例４（４－２）のｐ－アジドフェナシルによるフェリチン重鎖の特異的修飾体のトリプシン消化により生成した、二つのシステイン残基への修飾部位（ジチオスレイトールによる還元を受けたｐ－アミノフェナシル導入体（＋１３３．０５２７６４Ｄａ））を含むアミノ酸２９残基からなるペプチド、ＩＦＬＱＤＩＫＫＰＤＣＤＤＷＥＳＧＬＮＡＭＥＣＡＬＨＬＥＫ（配列番号８）のペプチドフラグメントのＭＳスペクトル（実測値：ｍ／ｚ　９０７．６７９７７、理論値：９０７．６７９９２、４価）が観測され（図７）、ＣＩＤスペクトルよりヒトフェリチンＨ鎖の９１位および１０３位（配列番号３のアミノ酸配列における９０位および１０２位）のシステイン残基の修飾を示す、４価のｙ２７に相当するｍ／ｚ　８４２．９８（理論値：８４２．６４）のプロダクトイオンが確認された（図８）。
（５－４）で得られた解析結果に基づき、ヒトフェリチンＨ鎖の９１位、１０３位および１３１位（配列番号３のアミノ酸配列における９０位、１０２位および１３０位）のピーク面積値の比較を行った（図９）。ヒトフェリチンＨ鎖の９１位および１０３位（配列番号３のアミノ酸配列における９０位および１０３位）が選択的に修飾されていることが分かる。
参考例６：Ｃｙ５－ＰＥＧ－マレイミドによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
（６－１）Ｃｙ５－ＰＥＧ－マレイミドによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
　参考例１で発現したヒトフェリチンＨ鎖をｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに溶解し、濃度を５．０ｍｇ／ｍｌとした。Ｃｙ５－ＰＥＧ－マレイミド（Ｂｒｏａｄ　Ｐｈａｒｍ，ＢＰ－２３０３７）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し濃度を２０ｍＭとした。Ｃｙ５－ＰＥＧ－マレイミド６等量を、ヒヒトフェリチンＨ鎖を含む水溶液に加え攪拌した後、室温で１時間振盪反応させた。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。原料のヒトフェリチンＨ鎖は２１０９４にピークが観測され、生成物は原料のピークおよびＣｙ５－ＰＥＧ－マレイミド（分子量８７１）が２個導入された２２８３６のピークが確認された（図１０）。
参考例７：ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
（７－１）ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
　参考例１で発現したヒトフェリチンＨ鎖をｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに溶解し、濃度を５．０ｍｇ／ｍｌとした。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミド（Ｂｒｏａｄ　Ｐｈａｒｍ，ＢＰ－２２２９４）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し濃度を２０ｍＭとした。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミド６等量を、ヒトフェリチンＨ鎖を含む水溶液に加え攪拌した後、室温で１時間振盪反応させた。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。原料のヒトフェリチンＨ鎖は２１０９４にピークが観測され、生成物は原料のピークおよびＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミド（分子量６７３）が２個導入された２２４４３のピークが確認された（図１１）。
参考例８：１，３－ジクロロアセトンによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾とアミノオキシ－ＰＥＧ５－アジドによるオキシムライゲーションおよびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
（８－１）１，３－ジクロロアセトンによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
　参考例１で発現したヒトフェリチンＨ鎖をｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに溶解し、濃度を５．０ｍｇ／ｍｌとした。１，３－ジクロロアセトンをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し濃度を２０ｍＭとした。１，３－ジクロロアセトン６等量を、ヒトフェリチンＨ鎖を含む水溶液に加え攪拌した後、室温で１時間振盪反応させた。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。原料のヒトフェリチンＨ鎖は２１０９４にピークが観測され、生成物はアセトン（分子量５４）が１個導入された２１１４８のピークが確認された（図１２）。
（８－２）アミノオキシ－ＰＥＧ５－アジドによるオキシムライゲーションの特異的修飾およびＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
　（８－１）で得られたヒトフェリチンＨ鎖アセトン修飾体をｐＨ４．７の酢酸バッファーに溶解し、濃度を２．０ｍｇ／ｍｌとした。アミノオキシ－ＰＥＧ５－アジド（Ｂｒｏａｄ　Ｐｈａｒｍ，ＢＰ－２３１９４）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し濃度を２０ｍＭとした。アミノオキシ－ＰＥＧ５－アジド１０等量を、ヒトフェリチンＨ鎖アセトン修飾体を含む水溶液に加え攪拌した後、３７℃で１６時間振盪反応させた。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。原料のヒトフェリチンＨ鎖アセトン修飾体は２１１４８にピークが観測され、生成物はアミノオキシ－ＰＥＧ５－アジド（分子量３０４）が１個導入された２１４５２のピークが確認された（図１２）。
実施例１：特異的修飾抗体の合成
（１－１）ＤＢＣＯ－ｍａｌｅｉｍｉｄｅによる位置特異的修飾抗体の合成
　本実施例では、チオール基導入トラスツズマブと、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）－マレイミドとを反応させた。
　抗体として、国際公開第２０１９／２４０２８７号の実施例８１－７に記載される抗体誘導体（チオール基導入トラスツズマブ）を用いた。この抗体誘導体は、抗体重鎖の２４６位または２４８位のリジン残基の側鎖のアミノ基を介して、トラスツズマブ（ヒト化ＩｇＧ１抗体）にチオール基が位置選択的に導入されている下記構造を有する（リジン残基の位置はＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従う）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （上記構造において、抗体重鎖から伸びているＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－は、リジン残基の側鎖に対応し、このリジン残基の側鎖中のアミノ基に対してチオール含有基であるＨＳ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）が付加されている。）
　ＤＢＣＯ－マレイミドとして、下記を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記抗体誘導体のｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー）溶液（２ｍｇ／ｍＬ）に１０当量のジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）－マレイミドのＤＭＦ溶液（１０ｍＭ）を加え、２５℃にて２時間振盪反応後、ＮＡＰ－５　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、既報（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１９，９１，２０，１２７２４－１２７３２）の手法にしたがい非還元条件下でＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定したところ、ＤＢＣＯ基が抗体に２つ導入された１４９４４３のピークが確認された（図１３）。
　したがって、抗体誘導体中の２つのチオール基とＤＢＣＯ－マレイミド中のマレイミド基との反応により、ＤＢＣＯ基が２つ導入されたＤＢＣＯ修飾抗体が生成していることが確認された。
（１－２）ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－ｍａｌｅｉｍｉｄｅによる位置特異的修飾抗体の合成
　本実施例では、チオール基導入トラスツズマブと、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）－ＰＥＧ－マレイミドとを反応させた。
　抗体として、実施例（１－１）に記載された上記抗体誘導体を用いた。
　ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－マレイミドとして、下記を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記抗体誘導体のｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー）溶液（２ｍｇ／ｍＬ）に１０当量のジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－マレイミドのＤＭＦ溶液（１０ｍＭ）を加え、２５℃にて２時間振盪反応後、ＮＡＰ－５　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、既報（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１９，９１，２０，１２７２４－１２７３２）の手法にしたがい非還元条件下でＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。
　その結果、ＤＢＣＯ基が抗体に２つ導入された１４９９４４のピークが確認された（図１４）。したがって、抗体誘導体中の２つのチオール基とＤＢＣＯ－ＰＥＧ－マレイミド中のマレイミド基との反応により、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ基が２つ導入されたＤＢＣＯ－ＰＥＧ修飾抗体が生成していることが確認された。
実施例２：ｐ－アジドフェナシルブロミドによるヒトフェリチンＨ鎖の特異的修飾
　本実施例では、ヒトフェリチンＨ鎖の２４量体からなるヒトフェリチン粒子と、ｐ－アジドフェナシルブロミドとを反応させた。
　ヒトフェリチン粒子をｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに溶解し、濃度を２．５ｍｇ／ｍｌ（終濃度５μＭ）とした。ｐ－アジドフェナシルブロミドをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し濃度を１００ｍＭとした。ｐ－アジドフェナシルブロミド１０６当量（終濃度５２８μＭ）を、ヒトフェリチン粒子を含む水溶液に加え攪拌した後、２５℃で１時間振盪反応させた。反応液を２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。
　その結果、ヒトフェリチン粒子を構成するヒトフェリチンＨ鎖については、単量体として２１０９４にピークが観測された。生成物については、ヒトフェリチンＨ鎖に対してｐ－アジドフェナシル（分子量１６０）が２個導入された単量体である２１４１２のピークが確認された。
　したがって、ヒトフェリチンＨ鎖２４量体からなるかご状構造あたり４８個のアジド基を持つアジド化フェリチン（上記参考例を考慮すると、ヒトフェリチンＨ鎖における９１位および１０３位の２個のシステイン残基の側鎖中の硫黄原子に対して、アジド基を含む修飾基が導入された修飾ヒトフェリチンＨ鎖２４量体）の生成が確認された。
実施例３：抗体－ヒトフェリチン複合体の構築（１）
　本実施例では、実施例１で得られたＤＢＣＯ修飾抗体と、実施例２で得られたアジド化フェリチンとを反応させた。ＤＢＣＯ中のアルキン部分はアジド基とクリック反応により温和な条件で容易に反応することができる。したがって、ＤＢＣＯ修飾抗体をアジド化フェリチンと反応させることにより、２個のヒトフェリチン粒子に連結されたＩｇＧ抗体（抗体－ヒトフェリチン複合体）を生成することができる。
　実施例１で得られたＤＢＣＯ修飾抗体と実施例２で得られたアジド化フェリチン粒子を各々終濃度２．５μＭとなるようにｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに溶解し、２５℃で１時間振盪反応させた。得られたサンプルを、水で１２．５倍希釈し、５％βメルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ　サンプルバッファー（Ｂｉｏｒａｄ社）と１対１となるように混合した後、９５℃で５分間熱処理した。その溶液１０μｌ分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
　その結果、複合化反応サンプルでのみ、抗体やフェリチンＨ鎖（単量体）単独では観察されないフェリチンＨ鎖と抗体重鎖が複合化した１００ｋＤａ前後のタンパク質バンドを観察することができた（図１５）。アジド化フェリチンＨ鎖（単量体）の分子量は２１ｋＤａで抗体重鎖の分子量は５０ｋＤａから６０ｋＤａであることから、この複合化反応で得られたバンドは抗体重鎖にアジド化フェリチンＨ鎖（単量体）が２個共有結合で複合化したタンパク質であると考えられる。
実施例４：抗体－ヒトフェリチン複合体のＴＥＭ解析
　実施例３で得られた抗体－ヒトフェリチン複合体の構造を、３％りんタングステン酸染色による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像により確認した。
　その結果、アジド化フェリチン粒子（直径１２ｎｍのかご状構造）が抗体で２個つながっている様子が観察された（図１６）。したがって、実施例３で得られた抗体－ヒトフェリチン複合体は、２個のヒトフェリチン粒子に連結された抗体（２個のヒトフェリチン粒子中のフェリチンＨ鎖におけるアジド基が抗体中の２個のＤＢＣＯ基と反応したもの）であることが確認された。
実施例５：抗体－ヒトフェリチン複合体の構築（２）
　本実施例では、実施例１で得られたＤＢＣＯ修飾抗体またはＤＢＣＯ－ＰＥＧ修飾抗体と、実施例２で得られたアジド化フェリチン粒子とを、幾つかの量比で反応させた。
　実施例２で得られたアジド化フェリチン粒子が終濃度１．０μＭとなるように溶解したｐＨ７．４のＰＢＳバッファーに対して、実施例１で得られたＤＢＣＯ修飾抗体またはＤＢＣＯ－ＰＥＧ修飾抗体が各々終濃度２．５μＭ、５．０μＭ、または１２．５μＭとなるように添加し、２５℃で１時間振盪反応させた。このとき、アジド化フェリチン粒子に提示されたアジド基と各修飾抗体のＤＢＣＯ基の量比は、１０：１、５：１あるいは２：１であった。反応後のサンプルを、水で５倍希釈し、５％βメルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ　サンプルバッファー（Ｂｉｏｒａｄ社）と１対１となるように混合した後、９５℃で５分間熱処理した。その溶液１０μｌをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
　その結果、いずれの複合化反応サンプルでも、フェリチンＨ鎖２個と抗体重鎖が複合化した１００ｋＤａ前後のタンパク質バンドを観察することができた。また、アジド化フェリチン粒子のアジド基と抗体のＤＢＣＯ比が１０：１の反応では抗体重鎖は全てフェリチンＨ鎖と複合化していた（図１７）。
実施例６：抗体－ヒトフェリチン複合体（モザイク複合体）の構築（３）
　本実施例では、実施例５で得られた抗体－ヒトフェリチン複合体において、未反応のアジド化ヒトフェリチンＨ鎖（生体直交性官能基が導入されたヒトフェリチンＨ鎖）の数を低減させた。
　実施例５で得られた抗体－ヒトフェリチン複合体をフェリチン当たりの濃度が終濃度０．８μＭとなるように、１００ｍＭグリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）に懸濁した。その溶液に、非修飾ヒトフェリチン粒子（非修飾ヒトフェリチンＨ鎖２４量体）を終濃度２０μＭとなるように加え、２５℃で１５分間放置することで、フェリチン粒子のかご状構造を脱会合させた。その後、終濃度２００ｍＭとなるようにトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）を添加することで、抗体に連結されたヒトフェリチンＨ鎖を、非修飾フェリチンＨ鎖と再会合させた。
　その結果、再会合により、（ａ）アジド基とＤＢＣＯ基との反応により抗体と連結されている修飾ヒトフェリチンＨ鎖、（ｂ）抗体と連結されていないアジド化ヒトフェリチンＨ鎖（生体直交性官能基であるアジド基が導入された修飾ヒトフェリチンＨ鎖）、および（ｃ）非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を２４量体構成成分として含むことにより特徴付けられるモザイクフェリチン粒子（修飾フェリチンＨ鎖および非修飾フェリチンＨ鎖を含むフェリチン粒子）を含む抗体－ヒトフェリチン複合体（モザイク複合体）が形成された（図１８）。
　次に、このモザイク複合体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００　ｉｎｃｒｅａｓｅ　１０／３０　ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に注入し、流速０．８ｍｌ／分で、サイズによって分離精製した。
実施例７：抗体－ヒトフェリチン複合体（モザイク複合体）のＥＳＩ－ＴＯＦＭＳ解析
　実施例６で得られた抗体－ヒトフェリチン複合体を含む溶液を、２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに置換し、既報（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１９，９１，２０，１２７２４－１２７３２）の手法にしたがいＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにより質量を測定した。
　その結果、実施例（１－１）で合成したＤＢＣＯ修飾抗体にヒトフェリチンＨ鎖が２つ導入された複合体として１９２２１８のピークを確認した（図１９）。同様に、実施例（１－２）で合成したＤＢＣＯ－ＰＥＧ－修飾抗体にヒトフェリチンＨ鎖が２つ導入された複合体として１９２９０６のピークを確認した（図２０）。
実施例８：モザイクフェリチン粒子の構築
　ｐＨ２．２の１００ｍＭ　グリシン塩酸塩バッファー２ｍＬに、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖の２４量体からなる非修飾ヒトフェリチン粒子が終濃度６．０μＭ、実施例２で得られたアジド化フェリチン粒子（生体直交性官能基が導入された修飾ヒトフェリチンＨ鎖の２４量体からなる修飾ヒトフェリチン粒子）が終濃度２．０μＭとなるように混合し、室温で１５分間放置した（脱会合プロセス）。その後、１Ｍトリス塩酸塩バッファー０．２ｍＬを加え中和し、室温で１時間放置した（再会合プロセス）。このような脱会合および再会合により、実施例２で得られたアジド化フェリチン粒子において、アジド化フェリチンＨ鎖を非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換することができるため、モザイクフェリチン粒子が生成する。
　得られた溶液を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＦＦ　１ｍＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に注入し、溶出速度１ｍＬ／ｍｉｎで０Ｍから１Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、表面電荷の違いによりモザイクフェリチン粒子を分離精製した。モザイクフェリチン粒子を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｎ　２０－１００Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。
　次に、回収されたモザイクフェリチン粒子を構成する非修飾フェリチンＨ鎖と修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）の比を逆相クロマトグラフィーにより分析した。移動相Ａとして０．１容量％　トリフルオロ酢酸水溶液、移動相Ｂとして０．１容量％　トリフルオロ酢酸を含む８０容量％アセトニトリル水溶液、を用いた。移動相Ａ７０％、移動相Ｂ３０％の溶液で平衡化されたＰＬＲＰ－Ｓ　３００Ａ　３ｕＭ　１５０ｘ４．６ＭＭ（アジレント・テクノロジー社）に１０μＬのサンプルを供した。そして、移動相Ｂの濃度が３０％から７５％となるように１４分間かけて線形勾配をかけ、タンパク質を溶出させた。カラム温度は７０℃、流速は１ｍＬ／分、検出は２２０ｎｍ吸光で行った。
　その結果、非修飾フェリチンＨ鎖と修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）を分離することができた（図２１）。そして、モザイクフェリチン粒子を分析して得られたピークの面積比から、モザイクフェリチン粒子に含まれる修飾フェリチンＨ鎖と修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）の比は２．７対１．０であり、モザイクフェリチン粒子１個あたり、平均６個から７個のアジド化フェリチンサブユニットが含まれることが分かった。そして、そのモザイクフェリチン粒子には１個当たり平均１２個から１４個のアジド基が提示されていることが分かった。
実施例９：抗体－ヒトフェリチン複合体（モザイク複合体）の構築（４）
　実施例８で得られたモザイクフェリチン粒子が終濃度５．０μＭとなるように溶解したｐＨ８．０の５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーあるいはｐＨ９．０の５０ｍＭ　ＣＨＥＳバッファーに実施例１で得られたＤＢＣＯ－ＰＥＧ修飾抗体が終濃度１．０μＭとなるように添加し、２５℃で１８時間振盪反応させることにより、２個のヒトフェリチン粒子に連結されたＩｇＧ抗体（モザイク複合体）を生成させた。
　得られた溶液を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＦＦ　１ｍＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に注入し、溶出速度１ｍＬ／ｍｉｎで、０Ｍから０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、表面電荷の違いにより目的タンパク質を分離精製した。
　次に、回収されたモザイク複合体中のモザイクフェリチン粒子を構成する非修飾フェリチンＨ鎖と修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）の比を逆相クロマトグラフィーにより分析した。移動相Ａとして０．１容量％　トリフルオロ酢酸水溶液、移動相Ｂとして０．１容量％　トリフルオロ酢酸を含む８０容量％アセトニトリル水溶液、を用いた。移動相Ａ７０％、移動相Ｂ３０％の溶液で平衡化されたＰＬＲＰ－Ｓ　３００Ａ　３ｕＭ　１５０ｘ４．６ＭＭ（アジレント・テクノロジー社）に１０μＬのサンプルを供した。そして、移動相Ｂの濃度が３０％から７５％となるように１４分間かけて線形勾配をかけ、タンパク質を溶出させた。カラム温度は７０℃、流速は１ｍＬ／分、検出は２２０ｎｍ吸光で行った。
　その結果、抗体修飾反応により、非修飾フェリチンＨ鎖のピークと修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）のピークの比が変化し、修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）のピークが抗体修飾反応前の５０～６０％に減少していることが分かった（図２２と図２３）。今回の分析条件では、各ヒトフェリチンＨ鎖の溶出位置は、下記のとおりである。
（ａ）非修飾フェリチンＨ鎖：９．８ｍｉｎ
（ｂ）抗体に連結されていない修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）：１０．４ｍｉｎ
（ｃ）抗体に連結されている修飾フェリチンＨ鎖：９．８ｍｉｎ
　今回の分析条件では、抗体に連結されている修飾フェリチンＨ鎖の溶出位置は、非修飾フェリチンＨ鎖の溶出位置と同等であり、抗体に連結されている修飾フェリチンＨ鎖の増減を直接確認できない。そのため、今回観察された修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）のピークの減少は、修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）と抗体との反応による、抗体に連結されている修飾フェリチンＨ鎖の生成に伴う、修飾フェリチンＨ鎖（アジド化フェリチンＨ鎖）の減少に起因すると考えられた。
　得られたサンプルを、５％βメルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ　サンプルバッファー（Ｂｉｏｒａｄ社）と１対１となるように混合した後、９５℃で５分間熱処理した。その溶液１０μｌ分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、複合化反応サンプルでのみ、抗体やフェリチン粒子単独では観察されないフェリチンＨ鎖と抗体重鎖が複合化した１００ｋＤａ前後のタンパク質バンドを観察することができた（図２４）。アジド化フェリチンＨ鎖（単量体）の分子量は２１ｋＤａで抗体重鎖の分子量は５０ｋＤａから６０ｋＤａであることから、この複合化反応で得られたバンドは抗体重鎖にアジド化フェリチンＨ鎖（単量体）が２個共有結合で複合化したタンパク質であると考えられた。

Claims (34)

  1. 　（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、および（Ｂ）それに連結されている、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む、複合体またはその塩。
  2. 　ヒトフェリチン粒子が、ヒトフェリチンＨ鎖の２４量体である、請求項１記載の複合体またはその塩。
  3. 　ヒトフェリチンＨ鎖が、１位のメチオニン残基を欠失していてもよい天然型ヒトフェリチンＨ鎖である、請求項１または２記載の複合体またはその塩。
  4. 　前記複合体が、下記式（１）：
    　　Ｘ１－Ｌ１－Ｙ－Ｌ２－Ｘ２　（１）
    〔式中、
    　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を示し、
    　Ｙは、ＩｇＧ抗体であり、
    　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ、リンカーを示し、
    　Ｘ１およびＸ２で示される２個のヒトフェリチン粒子は、それぞれ、それに含まれるヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている。〕で表される、請求項１～３のいずれか一項記載の複合体またはその塩。
  5. 　リンカーがペプチド部分を含有しない、請求項４記載の複合体またはその塩。
  6. 　ヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子が、システイン残基の側鎖中の硫黄原子である、請求項４または５記載の複合体またはその塩。
  7. 　システイン残基が、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在する、請求項６記載の複合体またはその塩。
  8. 　抗体が、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒトモノクローナル抗体である、請求項１～７のいずれか一項記載の複合体またはその塩。
  9. 　Ｙで示されるＩｇＧ抗体は、２個の重鎖定常領域中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている、請求項４～８のいずれか一項記載の複合体またはその塩。
  10. 　２個の重鎖定常領域中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子が、リジン残基の側鎖中の窒素原子である、請求項９記載の複合体またはその塩。
  11. 　リジン残基が、ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに従うＩｇＧ抗体重鎖の２４６／２４８位、２８８／２９０位、または３１７位に存在する、請求項１０記載の複合体またはその塩。
  12. 　１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子が、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む、請求項１～１１のいずれか一項記載の複合体またはその塩。
  13. 　ヒトフェリチン粒子が、１粒子あたり、下記（ａ）～（ｃ）の各ヒトフェリチンＨ鎖を下記平均数で含む粒子である、請求項１～１２のいずれか一項記載の複合体またはその塩：
    （ａ）リンカーと連結されている修飾ヒトフェリチンＨ鎖の数　１個；
    （ｂ）リンカーと連結されておらず、かつ修飾基が導入されている修飾ヒトフェリチンＨ鎖の数　ｎ個；および
    （ｃ）非修飾ヒトフェリチンＨ鎖の数　ｍ個；
    　ここで、ｎは０～２３の数であり、ｍは０～２３の数であり、ｎおよびｍの合計は２３である。
  14. 　ヒトフェリチン粒子が、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を平均数１個以上で含む粒子である、請求項１～１３のいずれか一項記載の複合体またはその塩。
  15. 　ヒトフェリチン粒子が、非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を平均数１２個以上で含む粒子である、請求項１～１４のいずれか一項記載の複合体またはその塩。
  16. 　修飾基が反応性基を含む、請求項１３～１５のいずれか一項記載の複合体またはその塩。
  17. 　反応性基がタンパク質に対する生体直交性官能基である、請求項１６記載の複合体またはその塩。
  18. 　タンパク質に対する生体直交性官能基が、マレイミド部分、アジド部分、ケトン部分、アルデヒド部分、チオール部分、アルケン部分、アルキン部分、ハロゲン部分、テトラジン部分、ニトロン部分、ヒドロキシルアミン部分、ニトリル部分、ヒドラジン部分、ボロン酸部分、シアノベンゾチアゾール部分、アリル部分、ホスフィン部分、ジスルフィド部分、チオエステル部分、α－ハロカルボニル部分、イソニトリル部分、シドノン部分、およびセレン部分からなる群より選ばれる１個以上の部分構造を含む、請求項１６記載の複合体またはその塩。
  19. 　修飾基が機能性物質を含む、請求項１３～１５のいずれか一項記載の複合体またはその塩。
  20. 　機能性物質が、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子有機化合物、キレーター、糖鎖、脂質、高分子ポリマー、および金属からなる群より選ばれる１個以上の部分を含む、請求項１９記載の複合体またはその塩。
  21. 　ヒトフェリチン粒子が内腔中に物質を有する、請求項１～２０のいずれか一項記載の複合体またはその塩。
  22. 　複合体またはその塩の製造方法であって、
    　複合体が、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、および（Ｂ）それに連結されている、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含み、
    　下記（１）～（３）を含む、方法：
    （１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含む修飾ＩｇＧ抗体を生成すること；
    （２）１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む修飾粒子を生成すること；ならびに
    （３）前記修飾ＩｇＧ抗体を前記修飾粒子と反応させて、前記複合体を得ること。
  23. 　前記複合体が、下記式（１）：
    　　Ｘ１－Ｌ１－Ｙ－Ｌ２－Ｘ２　（１）
    〔式中、
    　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ、１個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を示し、
    　Ｙは、ＩｇＧ抗体であり、
    　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ、リンカーを示し、
    　Ｘ１およびＸ２で示される２個のヒトフェリチン粒子は、それぞれ、それに含まれるヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている。〕で表される、請求項２２記載の方法。
  24. 　リンカーがペプチド部分を含有しない、請求項２３記載の方法。
  25. 　ヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子が、システイン残基の側鎖中の硫黄原子である、請求項２３または２４記載の方法。
  26. 　システイン残基が、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在する、請求項２５記載の方法。
  27. 　複合体またはその塩の製造方法であって、
    　複合体が、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ）それに連結されている、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含み、
    　下記（１）～（４）を含む、方法：
    （１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含む修飾ＩｇＧ抗体を生成すること；
    （２）２個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第１修飾粒子を生成すること；
    （３）前記第１修飾粒子において、前記２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部を非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換して、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第２修飾粒子を生成すること；ならびに
    （４）前記修飾ＩｇＧ抗体を、前記第２修飾粒子と反応させて、前記複合体を得ること。
  28. 　複合体またはその塩の製造方法であって、
    　複合体が、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ）それに連結されている、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含み、
    　下記（１）～（４）を含む、方法：
    （１）ＩｇＧ抗体に第１反応性基を導入して、２個の第１反応性基を含むＩｇＧ抗体を生成すること；
    （２）２個以上のヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子に、第１反応性基と反応可能な第２反応性基を導入して、第２反応性基を含む２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む第１修飾粒子を生成すること；
    （３）前記修飾ＩｇＧ抗体を、前記第１修飾粒子と反応させて、（Ａ’）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ’）それに連結されている、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩を生成すること；ならびに
    （４）（Ａ’）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ’）それに連結されている、２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩において、前記２個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖の一部を非修飾ヒトフェリチンＨ鎖に交換して、（Ａ）１個のＩｇＧ抗体、ならびに（Ｂ）それに連結されている、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含む２個のヒトフェリチン粒子を含む複合体またはその塩を得ること。
  29. 　前記複合体が、下記式（１）：
    　　Ｘ１－Ｌ１－Ｙ－Ｌ２－Ｘ２　（１）
    〔式中、
    　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ、１個以上の修飾ヒトフェリチンＨ鎖、および１個以上の非修飾ヒトフェリチンＨ鎖を含むヒトフェリチン粒子を示し、
    　Ｙは、ＩｇＧ抗体であり、
    　Ｌ１およびＬ２は、それぞれ、リンカーを示し、
    　Ｘ１およびＸ２で示される２個のヒトフェリチン粒子は、それぞれ、それに含まれるヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子を介して、Ｌ１およびＬ２で示される２個のリンカーに連結されている。〕で表される、請求項２７または２８記載の方法。
  30. 　リンカーがペプチド部分を含有しない、請求項２９記載の方法。
  31. 　ヒトフェリチンＨ鎖中の同じ位置に存在するアミノ酸残基の側鎖中の原子が、システイン残基の側鎖中の硫黄原子である、請求項３０記載の方法。
  32. 　システイン残基が、天然型ヒトフェリチンＨ鎖の基準位置に従う９１位および／または１０３位に存在する、請求項３１記載の方法。
  33. 　第１反応性基および第２反応性基が、タンパク質に対する生体直交性官能基である、請求項２２～３２のいずれか一項記載の方法。
  34. 　タンパク質に対する生体直交性官能基が、マレイミド部分、アジド部分、ケトン部分、アルデヒド部分、チオール部分、アルケン部分、アルキン部分、ハロゲン部分、テトラジン部分、ニトロン部分、ヒドロキシルアミン部分、ニトリル部分、ヒドラジン部分、ボロン酸部分、シアノベンゾチアゾール部分、アリル部分、ホスフィン部分、ジスルフィド部分、チオエステル部分、α－ハロカルボニル部分、イソニトリル部分、シドノン部分、およびセレン部分からなる群より選ばれる１個以上の部分構造を含み、
    　第１反応性基および第２反応性基が、互いに反応可能な組合せで選ばれる、請求項３３記載の方法。
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