TWI819235B - 天然原料之發酵液以及其用於抑制過敏反應或提升免疫力的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種天然原料的發酵液，係藉由一包含下列步驟之製備方法製得：將葡萄糖、紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁與水混合以得到培養液，以及將培養液及複數菌種進行發酵4-15日。本發明另提供一種將天然原料的發酵液用於抑制過敏反應或提升免疫力的用途。
Description
本發明關於一種將天然原料之發酵液用於抑制過敏反應或提升免疫力的用途。
當生物組織受到外在的某些刺激（諸如源自於病原體、受損細胞或刺激物的刺激）後，在某些時候將會引發過敏反應，釋放出發炎物質，進而引起發炎反應。
發炎反應原本即為血管組織對有害刺激物之既有生物反應的一部分。發炎反應為生物體的免疫系統試圖移除有害刺激物及引發癒合過程之保護性反應。在無發炎之情況下，刺激物不易排除、及/或創口感染不易痊癒。
然而，當過敏引發過於激烈的發炎反應時，反而會對生物體造成不適、不便或甚至損傷，例如引發氣喘、使受損組織無法進行修復等問題。此外，發炎可分類為急性發炎或慢性發炎。急性發炎為身體對有害刺激物之初始反應且藉由增強血漿及白血球自血液向受損組織中移動而達成，涉及局部血管系統、免疫系統及受損組織內之各種細胞，一般而言為短期之反應。然而當發炎期間較長、或是間歇性連續產生時，則稱為慢性發炎。
當身體處於長期過敏狀態而導致慢性發炎時，除了過敏症狀產生的不適所導致的疲勞、失眠等症狀外，亦會導致許多疾病，諸如枯草熱、牙周炎、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎及甚至癌症的風險。
此外，當免疫系統長期處於不正常的過度活化狀態下時，將導致當免疫系統受到真實細菌或病毒的侵害時無法有效發揮功效，使得個體之免疫力大幅下降，暴露於較高風險之中。
有鑑於此，研究或開發一種抑制過敏反應的組合物來有效舒緩過敏症狀、以及研究或開發一種提升免疫力的組合物來提升生物體的免疫力是有其需求的。
本發明的一目的在於提供一種天然原料發酵液，係藉由一包含下列步驟之製備方法製得：（a）將葡萄糖、紅棗（Ziziphus jujuba
Miller）、蘋果、蛹蟲草（Cordyceps Militaris
）、以及砂仁（Fructus Amomi
）與水混合以得到一培養液，其中水之重量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁總重的5-15倍；以及（b）將培養液及複數菌種進行發酵4-15日以得到天然原料發酵液，其中些菌種包括相對於該培養液為0.01-0.5 wt%的酵母菌、相對於培養液為0.01-0.25 wt%的乳酸菌及相對於培養液為3-10 wt%的醋酸菌。
在一些實施例中，於（a）得到培養液的步驟中，紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁之間的重量比為1：1：1：1。
在一些實施例中，於（a）得到培養液的步驟中，葡萄糖的添加量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、砂仁與水總重的8-12 wt%。
在一些實施例中，於（a）得到培養液的步驟中，包括（a1）將葡萄糖、紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁與水混合，形成混合液；以及（a2）將合液於50-100℃下萃取0.5-1.5小時以得到培養液。
在一些實施例中，於（a）得到培養液的步驟中，包括（a1）將紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁與水混合，於50-100℃下萃取0.5-1.5小時，形成天然原料的水萃液；以及（a2）將葡萄糖加入至天然原料的水萃液以得到培養液。
在一些實施例中，於（b）將培養液及複數菌種進行發酵以得到天然原料發酵液的步驟中，醋酸菌為最後加入的菌種。
在一些實施例中，於（b）將培養液及複數菌種進行發酵以得到天然原料發酵液的步驟中，包括（b1）於培養液中加入酵母菌進行發酵1-2日後形成第一初發酵液；（b2）於第一初發酵液中加入乳酸菌進行發酵1-3日後形成第二初發酵液；以及（b3）於第二初發酵液中加入醋酸菌進行發酵2-10日後形成天然原料發酵液。
在一些實施例中，於（b3）在第二初發酵液中加入醋酸菌進行發酵2-10日後形成天然原料發酵液的步驟中，包括於第二初發酵液中加入醋酸菌進行發酵2-10日後，得到天然原料發酵原液，將天然原料發酵原液在50-60℃下減壓濃縮及以200-400目篩網過濾後，得到天然原料發酵液。
在一些實施例中，於（b）將培養液及複數菌種進行發酵以得到天然原料發酵液的步驟中，包括將培養液及複數菌種進行發酵4-15日後，得到天然原料發酵原液，將天然原料發酵原液經濃縮及過濾後，得到天然原料發酵液。
在一些實施例中，於（b）將培養液及複數菌種進行發酵以得到天然原料發酵液的步驟中，包括將培養液及複數菌種進行發酵4-15日後，得到天然原料發酵原液；添加寡糖至天然原料發酵原液使天然原料發酵原液的糖度達到35-40°Bx以形成天然原料發酵液。
在一些實施例中，天然原料發酵液的pH值為3.9-4.2，且其糖度為3.0以下。
在一些實施例中，酵母菌為Saccharomyces cerevisiae
，乳酸菌為Lactobacillus helveticus
，醋酸菌為Acetobacter aceti
。
根據一些實施例，本發明提供一種將天然原料發酵液用於製備抑制過敏反應的組合物的用途。
在一些實施例中，抑制過敏反應的組合物係同時具有以下所述功能的至少其中兩種：抑制組織胺分泌、抑制一氧化氮生成、以及提升白血球介素-10（Interleukin-10，IL-10
）基因表現量。
在一些實施例中，若組合物用於抑制組織胺分泌，則組合物含有0.8-1.2 vol%的天然原料發酵液。
在一些實施例中，若組合物用於抑制一氧化氮生成或提升白血球介素-10，則組合物中含有0.030-0.035 vol%的天然原料發酵液。
根據一些實施例，本發明提供一種將天然原料發酵液用於製備提升免疫力的組合物的用途。
在一些實施例中，提升免疫力的組合物係提升白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6
）基因表現量、提升白細胞介素-8（Interleukin-8，IL-8
）基因表現量、或提升自然殺手細胞毒殺能力。
在一些實施例中，若組合物係用於提升自然殺手細胞毒殺能力，則組合物含有0.8-1.2 vol%的天然原料發酵液。
在一些實施例中，若組合物係用於白細胞介素-6基因表現量、提升白細胞介素-8基因表現量，則組合物含有0.030-0.035 vol%的天然原料發酵液。
綜上，根據任一實施例的天然原料的發酵液、或是由天然原料發酵液所製成天然原料發酵物，可用以抑制過敏反應或是提升免疫力。在一實施例中，在發酵過程中分次依序加入複數菌種並且控制使用各菌種的發酵時間，以使得菌種能有最佳的生長，並且進一步提升天然原料的發酵液中有效成分濃度。在一些實施例中，藉由使用特定的混合成分萃取物來進行發酵，所得到的天然原料的發酵液可同時以至少兩種以上的路徑來抑制過敏反應。在一些實施例中，藉由使用特定的混合成分萃取物來進行發酵，所得到的天然原料發酵液可提升白細胞介素-6基因表現量、提升白細胞介素-8基因表現量、或提升自然殺手細胞毒殺能力。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t
檢驗（student'st
-test）進行分析。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。
過敏反應係一複雜的反應機制，其主要係當生物體首次接觸到過敏原時，過敏原將接觸B細胞並與其上的受體結合，刺激B細胞分化成漿細胞並大量產生免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE）。而IgE分子可緊密地附著到位於皮下、鼻腔、上呼吸道黏膜、以及消化道等器官的肥大細胞表面上。當生物體再次接觸到過敏原時，已經附著在肥大細胞表面的IgE分子會與過敏原交互連結，而誘發了肥大細胞的活化並釋放出細胞內含的多種致敏成分（如組織胺、一氧化氮、細胞激素等）。此些致敏成分可導致局部組織充血腫脹、血管通透性增加、呼吸道平滑肌痙攣、以及眼鼻部搔癢難耐等症狀。
致敏成分中之組織胺在被分泌出來後，游離的組織胺會與血管平滑肌上的接受器（H1 receptor）結合，使血管擴張因而產生局部水腫，引起癢、打噴嚏、流鼻水等劇烈發炎現象。過量的一氧化氮所產生的自由基使得血管舒張，導致大量的其他促炎因子流入組織，引發過敏反應。另一方面，人體中亦有抑制發炎的因子（抑炎因子），用以調節過敏反應，而當抑炎因子不足時，同樣會導致過度的發炎、過敏現象產生。
故如前所述，由於過敏反應是由多種致敏成分經多重路徑所產生的結果，因此若僅針對單一路徑，例如單純服用抗組織胺藥物，將無法完全舒緩過敏作用。若希望達到所欲的抑制過敏作用效果，則必須加強所用劑量，而可能伴隨產生嗜睡或藥物依賴性等副作用，且其改善幅度有限。
而根據本案的一些實施例，以水萃取紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁的天然原料所得到之天然原料水萃液，在經過特定發酵程序後所形成的天然原料發酵液，可抑制過敏反應。故此天然原料發酵液可用於製備抑制過敏反應的組合物的用途。
根據一些實施例，本發明的天然原料發酵液可經由多種途徑來抑止過敏反應。亦即，在一些實施例中，天然原料發酵液可同時具有以下所述功效中的至少其中兩種：抑制組織胺分泌、抑制一氧化氮生成、以及提升抑炎因子（例如IL-10）基因的表現量。
在一些實施例中，將細胞與含有0.8-1.2 vol%天然原料發酵液的溶液接觸8小時後，可抑制細胞的組織胺分泌。在一些實施例中，將細胞與含有0.030-0.035 vol%天然原料發酵液的溶液接觸24小時後，可抑制細胞的一氧化氮生成量或提升細胞的白血球介素-10基因表現量。
在一些實施例中，天然原料的發酵液中所使用的天然原料為包含紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁的混合物。因此天然原料發酵液亦可稱為混合物發酵液。其中，紅棗係指鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Zizyphus）喬木所生長且成熟的褐紅色果實，在一些實施例中，可為紅棗（Ziziphus jujube
Miller）。
蘋果可為薔薇科蘋果屬（Malus）之喬木所產生的果實，又可稱為文林果、文官果、陵果、柰等。在一些實施例中，蘋果可包含蘋果（Malus domestica
）、新疆野蘋果（Malus sieversii
）、歐洲蘋果（Malus sylvestris
）、栽培蘋果（Malus pumila
）、或其組合。在一些實施方式中，所指「蘋果」可以包括其果肉/果實、含有果皮（外果皮、中間果皮和/或內果皮）的果肉/果實、或含有籽的果肉/果實。
蛹蟲草（Cordyceps Militaris
）為麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）之真菌，亦稱為北蟲草、北冬蟲夏草或金蟲草。自然環境中之蛹蟲草寄生於蟲蛹之上，以菌絲吸取宿主的身體養份維生，蟲體僵死後真菌會從感染的蛹體上長出子實體（fruit body），此即為古人所稱之「蟲草」。
砂仁（Fructus Amomi
）為多種薑科植物果實之集合稱，在一些實施例中可包含陽春砂（Amomum villosum
）、海南砂（Amomum longiligulare
）及縮砂（Amomum xanthioides
）等植物的果實。
本案所述的天然原料發酵液，如同前述，在一些實施例中係指以水萃取含有紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁的混合物得到天然原料水萃液後，再將此天然原料水萃液經過特定發酵程序，形成天然原料發酵液。
在一些實施例中，天然原料發酵液可經由其他合適的處理步驟，得到天然原料發酵液中所含有之天然原料發酵物。舉例而言，「天然原料發酵物」可為由天然原料發酵液經乾燥而得之粉末。
在一些實施例中，天然原料發酵液藉由一包含下列步驟之製備方法製得：（a）將葡萄糖、紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁與水混合以得到培養液，其中水之重量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁總重的5-15倍；以及（b）將培養液及複數菌種進行發酵4-15日以得到天然原料發酵液。
在一些實施例中，紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁之間的重量比可為（1-3）：（1-3）：（1-3）：（1-3）。在一些實施例中，紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁之間的重量比可為1：1：1：1。
在一些實施例中，葡萄糖的添加量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、砂仁與水總重的8-12 wt%。藉由添加葡萄糖，使培養液中具有足夠的糖度以確保發酵時菌種可以有足夠的養份，讓後續發酵可順利進行。
在一些實施例中，可先將葡萄糖外之成分（即紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁）與水混合，於50-100℃下浸泡0.5-1.5小時以進行萃取，得到一天然原料的水萃液；再將葡萄糖加入至天然原料的水萃液中得到培養液。
而在另一些實施例中，可先將葡萄糖與紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁與水一起混合，形成混合液；再將混合液於50-100℃下浸泡萃取0.5-1.5小時以得到培養液。藉由將葡萄糖與紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁同時混合來進行萃取程序，由於不需再開啟萃取設備添加葡萄糖、且加入的葡萄糖可再經過高溫環境處理，有助於葡萄糖的溶解且可降低原料受污染風險。
在獲得培養液後，可將培養液及複數菌種進行發酵4-15日以得到天然原料發酵液。其中，複數菌種包括相對於培養液為0.01-0.5 wt%的酵母菌、相對於培養液為0.01-0.25 wt%的乳酸菌及相對於培養液為3-10 wt%的醋酸菌（Acetobacter aceti
）。在一些實施例中，培養液不另濾除其內部的固形物（萃取後的紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁）而直接於其中加入菌種進行發酵（此時培養液的總重為固形物與液態的重量），藉以利用菌種進一步提取固形物中的活性成分。在另一些實施例中，可先濾除培養液內部的固形物，再添加菌種進行發酵（此時培養液的總重為液態的重量），藉此可避免當後續發酵反應過度時，產生其他較複雜且非所欲的成分而可較佳地控制萃取物品質。
在一些實施例中，將培養液及複數菌種進行發酵以得到天然原料發酵液的步驟中，酵母菌、乳酸菌以及醋酸菌可以同時加入至培養液中。
在一些實施例中，將培養液及複數菌種進行發酵以得到天然原料發酵液的步驟中，係將酵母菌、乳酸菌、以及醋酸菌以此特定順序進行分批發酵。舉例而言，在一些實施例中，先於培養液中加入酵母菌進行發酵1-2日後形成第一初發酵液；再於第一初發酵液中加入乳酸菌進行發酵1-3日後形成第二初發酵液；以及於第二初發酵液中加入醋酸菌進行發酵2-10日後形成天然原料發酵液。
藉由先於培養液中添加酵母菌，可先將培養液中的糖份（例如葡萄糖）經發酵轉化為乙醇，而乙醇有助於萃取天然原料內的有效成分。而後，於第一初發酵液中加入乳酸菌，可使第一初發酵液內尚未反應的糖份經發酵而轉化為乳酸，以進一步消耗其中之糖份，進而降低第二初發酵液所含糖度。由於在第二初發酵液中產生了乳酸，其將會進一步改變整體反應環境（例如使第二初發酵液的pH值下降），對於萃取天然原料內的有效成分亦有影響與助益（使溶於酸性溶液的有效成分更易萃取出）。接著，再於第二初發酵液中加入醋酸菌，藉此可使第二初發酵液內的乙醇轉化為乙酸。而由於乙醇被進一步消耗，酵母菌可進一步地繼續將糖份轉化為乙醇，使酵母菌進行的反應更為完全，糖度進一步降低。在一些實施例中，天然原料發酵液的糖度為3.0以下，以確保發酵反應完全。在一些實施例中，天然原料發酵液的pH值約為3.9-4.2，糖度約為1.8-3.0°Bx。
在另一些實施例中，將培養液及複數菌種進行發酵以得到天然原料發酵液的步驟中，酵母菌與乳酸菌彼此間的添加順序不限，但醋酸菌為最後加入的菌種。藉此，可讓發酵液中確保已經產生乙醇，使醋酸菌可更佳地生長、進行乙醇轉化反應，進而最終降低天然原料發酵液中的乙醇含量。在一些實施例中，醋酸菌進行發酵的時間長於酵母菌的發酵時間以及長於乳酸菌的發酵時間，藉此使醋酸菌可更完全地消耗發酵液中的乙醇。在一些實施例中，醋酸菌進行發酵的時間可為5-10日。
在一些實施例中，可先於培養液中同時添加酵母菌與乳酸菌進行發酵，再於其中加入醋酸菌發酵得到天然原料發酵液。因酵母菌與乳酸菌兩者的發酵反應皆較為快速，其所需發酵時間較為接近，而藉由將醋酸菌於酵母菌、乳酸菌後再加入，可讓發酵液在酵母菌、乳酸菌階段先以較短時間（例如共同發酵1日）同時完成其發酵反應，能減少整體發酵所需時間。
在一些實施例中，酵母菌、乳酸菌、以及醋酸菌可於25-40℃下進行發酵反應。若溫度超過40℃，則將會使菌種失去活性；若溫度低於25℃，則發酵反應的速率將過低、甚至無法進行發酵反應，不利於天然原料發酵液的取得。在一些實施例中，酵母菌、乳酸菌、以及醋酸菌可於28-32℃下進行發酵反應。
在一些實施例中，所使用的酵母菌可以是市售的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae
）。舉例而言，可為向財團法人食品工作發展研究所採購之寄存編號BCRC20271（國際寄存ATCC26602）菌株的啤酒酵母。
在一些實施例中，所使用的乳酸菌可以是為市售的瑞士乳酸菌（Lactobacillus helveticus
）、胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum
）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles
）或植物乳桿菌。舉例而言，可採用瑞士乳酸菌TCI357（財團法人食品工作發展研究所寄存編號BCRC910846、國際寄存編號DSM33107）、寄存編號BCRC910805（國際寄存DSM33108）菌株的胚芽乳酸桿菌TCI028、寄存編號BCRT910760（國際寄存DSM32451）菌株的胚芽乳酸桿菌TCI378、或寄存編號BCRC910636（國際寄存DSM28121）菌株的嗜熱鏈球菌TCI633。
在一些實施例中，所使用的醋酸菌係向美國菌種中心（American Type Culture Collection）所採購、寄存編號BCRC11688（國際寄存ATCC15973）菌株的醋酸菌。
在一些實施例中，當培養液完成所有菌種的發酵步驟後（例如經過醋酸菌發酵後），將先得到天然原料發酵原液。而後，將此天然原料發酵原液經過濾、濃縮，再得到天然原料發酵液。舉例而言，在一些實施例中，可將培養液及複數菌種進行發酵4-15日後所得到天然原料發酵原液，經適當孔洞大小的濾網（例如200-400目篩網）過濾，再將過濾後的液體於50℃-60℃下進行減壓濃縮，以得到天然原料發酵液。在一些實施例中，亦可先進行減壓濃縮，再進行過濾步驟。藉由濃縮步驟，可再進一步調整天然原料發酵液中的成分濃度。
在一些實施例中，可於天然原料發酵原液中添加寡糖，以使最後得到的天然原料發酵液具有所欲的糖度。舉例而言，在一些實施例中，可於天然原料發酵原液中添加寡糖，使天然原料發酵原液的糖度達到35°Bx-40°Bx。寡糖係指由3-10個單醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可為果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、或異麥芽寡糖等等。在一些實施例中，所添加的寡糖可使最後得到的天然原料發酵液中含40 wt%-70 wt%的異麥芽寡糖。在一些實施例中，添加寡糖可調整天然原料發酵液的風味，且有助於天然原料發酵液的保存。
多酚類化合物可透過抑止組織胺分泌來緩解過敏症狀。而在一些實施例中，相較於以水萃取紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁的混合物所得到之天然原料水萃液，將此天然原料水萃液經過特定發酵程序後所形成的天然原料發酵液可具有較高的總多酚含量。舉例而言，在一些實施例中，天然原料發酵液的總多酚含量為150.0-170.0 µg/ml，而天然原料水萃液的總多酚含量為86.0-87.0 µg/ml。據此可知，藉由本案發酵方式所得之天然原料發酵液，其總多酚含量可被大幅提升，故本案的發酵方式確實可有效改變天然原料水萃液中的所含成分，有效提升活性成分。此外，在一些實施例中，此總多酚含量亦可作為天然原料發酵液的檢驗基準。
此外，根據本案的一些實施例，以水萃取紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁的混合物所得到之天然原料水萃液，在經過特定發酵程序後所形成的天然原料發酵液，可提升免疫力。故此天然原料發酵液可用於製備提升免疫力的組合物的用途。
在一些實施例中，提升免疫力係包含提升白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6
）基因表現量、提升白細胞介素-8（Interleukin-8，IL-8
）基因表現量、或提升自然殺手細胞（Natural killer cell，NK cell）毒殺能力。其中，白細胞介素-8係可促進白血球分化；白細胞介素-6可活化淋巴細胞增加抗體的產生；自然殺手細胞為進行非專一性防禦，可以毒殺腫瘤細胞和被病毒感染細胞，具有影響免疫的能力。
在一些實施例中，將細胞與含有0.8-1.2 vol%天然原料發酵液的溶液接觸3小時後，可提升自然殺手細胞毒殺能力。在一些實施例中，將細胞與含有0.030-0.035 vol%天然原料發酵液的溶液接觸24小時後，可提升細胞之白細胞介素-6基因表現量、或可提升白細胞介素-8基因表現量。
在一些實施例中，前述的各組合物可為醫藥組合物、保養品組合物、食品組合物、保健食品組合物。
醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道地（enterally）、非經腸道地（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型。例如可為：注射品（injection）[例如，無菌的水性溶液（sterile aqueous solution）或分散液（dispersion）]、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或其他類似物。
醫藥組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種或多種載劑：乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些載劑的選用與數量是熟習此項技術人員可視情況進行選擇的。
在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline，PBS）、含有醇的水性溶液（alcohol containing aqueous solution）以及其他任何合適的溶劑。
在一些實施例中，該醫藥組合物可由下列所述的任一種非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部施用於皮膚上的外部製劑（external preparation）。舉例而言，其可為下列所述的任一種，但不限於此：乳劑（emulsion）、凝膠（gel）、軟膏（ointment）、乳霜（cream）、貼片（patch）、擦劑（liniment）、粉末（powder）、氣溶膠（aerosol）、噴霧（spray）、乳液（lotion）、乳漿（serum）、糊劑（paste）、泡沫（foam）、滴劑（drop）、懸浮液（suspension）、油膏（salve）以及繃帶（bandage）。
在一些實施例中，外部製劑是藉由將醫藥組合物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底（base）相混合而製成。
在一些實施例中，該基底可包含下列一種或多種的添加劑（additives）：水、醇（alcohols）、甘醇（glycol）、碳氫化合物（hydrocarbons）[諸如石油膠（petroleum, jelly）以及白凡士林（white petrolatum,）]、蠟（wax）[諸如石蠟（paraffin）以及黃蠟（yellow wax）]、保存劑（preserving agents）、抗氧化劑（antioxidants）、界面活性劑（surfactants）、吸收增強劑（absorption enhancers）、安定劑（stabilizing agents）、膠凝劑（gelling agents）[諸如卡波普®974P （carbopol®974P）、微結晶纖維素（microcrystalline cellulose）以及羧基甲基纖維素（carboxymethylcellulose）]、活性劑（active agents）、保濕劑（humectants）、氣味吸收劑（odor absorbers）、香料（fragrances）、pH調整劑（pH adjusting agents）、螯合劑（chelating agents）、乳化劑（emulsifiers）、閉塞劑（occlusive agents）、軟化劑（emollients）、增稠劑（thickeners）、助溶劑（solubilizing agents）、滲透增強劑（penetration enhancers）、抗刺激劑（anti-irritants）、著色劑（colorants）以及推進劑（propellants）等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，保養品中可包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑（acceptable adjuvant）。例如，該可接受的佐劑可包含下列一種或多種佐劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑（screening agent）、螯合劑、界面活性劑、染色試劑（coloring agent）、增稠劑（thickening agent）、填料（filler）、香料以及氣味吸收劑。可根據實際需求對這些試劑的選用與數量進行合適的調整。
在一些實施例中，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚（skincare）或化妝（makeup）的形式，其可為下列中的任一種，但不限於此：水性溶液（aqueous solution）、水-醇溶液（aqueous-alcohol solution）或油性溶液（oily solution）、呈水包油型（oil-in-water type）、油包水型（water-in-oil type）或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜（mask）、貼片、貼布（pack）、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯（mousse）、防曬油（sunblock）、化妝水（tonic water）、粉底（foundation）、卸妝產品（makeup remover products）、肥皂（soap）以及其他身體清潔產品（body cleansing products）等。
在一些實施例中，保養品亦可與下列中之已知活性的外用劑（external use agents）的一種或多種一起合併使用：美白劑（whitening agents）[諸如維生素A酸（tretinoin）、兒茶素（catechin）、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、殺菌劑（bactericides）、紫外線吸收劑（ultraviolet absorbers）、植物萃取物（plant extracts）[諸如蘆薈萃取物（aloe extract）]、皮膚營養劑（skin nutrients）、麻醉劑（anesthetics）、抗痘劑（anti-acne agents）、止癢劑（antipruritics）、止痛劑（analgesics）、抗皮膚炎劑（antidermatitis agents）、抗過角化劑（antihyperkeratolytic agents）、抗乾皮膚劑（anti-dry skin agents）、抗汗劑（antipsoriatic agents）、抗老化劑（antiaging agents）、抗皺劑（antiwrinkle agents）、抗皮脂溢出劑（antiseborrheic agents）、傷口治療劑（wound-healing agents）、皮質類固醇（corticosteroids）以及激素（hormones）。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，醫藥組合物可被當作食品添加物（food additive），藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
在一些實施例中，食品的種類可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。
下列範例中的實驗步驟若無特別敘明，即在室溫（25±5℃）、常壓（1atm）下進行。
[例1]天然原料發酵液的製備
將紅棗（Ziziphus jujube
Miller）、蘋果（Malus pumila
）、蛹蟲草（Cordyceps Militaris
）、陽春砂（Amomum villosum
）、以及水以1：1：1：1：40之重量比混合後（水之重量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁總重的10倍），在95℃下浸泡萃取1小時，得到天然原料的水萃液。而後，在尚未回溫至室溫前，根據紅棗、蘋果、蛹蟲草、砂仁、以及水的總重，添加10 wt%的葡萄糖於天然原料的水萃液中，得到培養液。培養液此時的pH值為5.4，糖度值為10.7°Bx。
待培養液冷卻至室溫後，先添加培養液0.1 wt%的BCRC20271菌株之啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae
）於培養液中，進行發酵1天以形成第一初發酵液。再添加相對於培養液為0.05 wt%的TCI357菌株之胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus helveticus
）於第一初發酵液內，進行發酵1天以形成第二初發酵液。最後添加相對於培養液為5 wt%的BCRC11688菌株之醋酸菌（Acetobacter aceti
）於第二初發酵液內，進行發酵5天以得到天然原料發酵液。前述各發酵階段皆於30℃下進行。天然原料發酵液的pH值為4.05，糖度值為2.0°Bx，顯示大部分的糖份皆已反應。
[例2]天然原料發酵液的製備
將紅棗、蘋果、蛹蟲草、陽春砂、以及水以1：1：1：1：40之重量比混合後（水之重量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁總重的10倍），在95℃下浸泡萃取1小時，得到天然原料的水萃液。而後，在尚未回溫至室溫前，根據紅棗、蘋果、蛹蟲草、砂仁、以及水的總重，添加10 wt%的葡萄糖於天然原料的水萃液中，得到培養液。培養液此時的pH值為5.4，糖度值為10.7°Bx。
待培養液冷卻至室溫後，先添加培養液0.1 wt%的BCRC20271菌株之啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae
）於培養液中，進行發酵1天以形成第一初發酵液。再添加相對於培養液為0.05 wt%的TCI357菌株之胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus helveticus
）於第一初發酵液內，進行發酵1天以形成第二初發酵液。最後添加相對於培養液為5 wt%的BCRC11688菌株之醋酸菌（Acetobacter aceti
）於第二初發酵液內，進行發酵5天以得到天然原料發酵原液。前述各發酵階段皆於30℃下進行。天然原料發酵原液的pH值為4.05，糖度值為2.0°Bx，顯示大部分的糖份皆已反應。
將天然原料發酵原液在60℃下減壓濃縮及以200目篩網過濾天然原料發酵原液，並以異麥芽寡糖60 wt%及天然原料發酵原液40 wt%之比例進行混合，以得到糖度達到40°Bx的天然原料發酵液。
[例3]天然原料發酵液的製備
將紅棗、蘋果、蛹蟲草、陽春砂、以及水以1：1：1：1：40之重量比混合後（水之重量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁總重的10倍），再根據紅棗、蘋果、蛹蟲草、砂仁、以及水的總重，添加10 wt%的葡萄糖於其中，得到混合液。將混合液於95℃下浸泡萃取1小時，得到培養液。培養液此時的pH值為5.4，糖度值為10.7°Bx。
待培養液冷卻至室溫後，先添加培養液0.1 wt%的BCRC20271菌株之啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae
）於培養液中，進行發酵1天以形成第一初發酵液。再添加相對於培養液為0.05 wt%的TCI357菌株之胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus helveticus
）於第一初發酵液內，進行發酵1天以形成第二初發酵液。最後添加相對於培養液為5 wt%的BCRC11688菌株之醋酸菌（Acetobacter aceti
）於第二初發酵液內，進行發酵5天以得到天然原料發酵液。前述各發酵階段皆於30℃下進行。
[例4]天然原料發酵液的製備
將紅棗、蘋果、蛹蟲草、陽春砂、以及水以1：1：1：1：40之重量比混合後（水之重量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁總重的10倍），在95℃下浸泡萃取1小時，得到天然原料的水萃液。而後，在尚未回溫至室溫前，根據紅棗、蘋果、蛹蟲草、砂仁、以及水的總重，添加10 wt%的葡萄糖於天然原料的水萃液中，得到培養液。培養液此時的pH值為5.4，糖度值為10.7°Bx。
待培養液冷卻至室溫後，先添加培養液0.1 wt%的BCRC20271菌株之啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae
）以及相對於培養液為0.05 wt%的TCI357菌株之胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus helveticus
）於培養液中，進行發酵1天。再添加相對於培養液為5 wt%的BCRC11688菌株之醋酸菌（Acetobacter aceti
）於其中，進行發酵5天以得到天然原料發酵液。前述各發酵階段皆於30℃下進行。
[例5] 總多酚含量測試
本案以沒食子酸（Gallic acid）當量作為總多酚相對含量的表示。故以沒食子酸（Gallic acid）作為標準品製作標準曲線（Standard curve）。
首先，配置0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、及100μL/mL之沒食子酸（沒食子酸購自Sigma，產品編號G7384）的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至各試管中。針對各試管，於其中添加500μL的佛蕭酚試劑（Folin-Ciocalteu’s phenol reagent，購自Merck，貨號1.09001.0100），混合均勻並靜置3分鐘，接著添加400μL的7.5 wt%碳酸鈉（購自Sigma，產品編號31432）水溶液於試管中，使其混合均勻並反應30分鐘。分別取其中之200μL溶液於750nm的波長下測量吸光值。將六種不同濃度的沒食子酸標準溶液依相同方式所測得之吸光值，繪製成標準曲線。
將[例1]中所得到、尚未發酵的天然原料的水萃液，以水將其稀釋至原體積濃度的1/5後，取100μL至試管中。並於試管中添加500μL的佛蕭酚試劑，混合均勻並靜置3分鐘，接著添加400μL的7.5 wt%碳酸鈉水溶液於試管中，使其混合均勻並反應30分鐘。分別取其中之200μL溶液於750 nm的波長下測量吸光值。
另將[例1]中所得到的天然原料發酵液（糖度值為2.0°Bx），以水將其稀釋至原體積濃度的1/5後，取100μL至試管中。並於試管中添加500μL的佛蕭酚試劑，混合均勻並靜置3分鐘，接著添加400μL的7.5 wt%碳酸鈉水溶液於試管中，使其混合均勻並反應30分鐘。分別取其中之200μL溶液於750 nm的波長下測量吸光值。
接著，利用標準曲線將稀釋後的天然原料水萃液、天然原料發酵液的吸光值換算成總多酚含量。於此，如圖1所示，可推算出稀釋前的天然原料水萃液的總多酚含量為88.69μg/mL；稀釋前天然原料發酵液的總多酚含量為169.64μg/mL，亦即天然原料發酵液的總多酚含量約為天然原料水萃液的總多酚含量的2倍。由此可知，經過特定發酵程序，確實可有效改變天然原料水萃液中的成分組成，提升其中所含總多酚含量。
[例6]天然原料發酵液對於抑制組織胺分泌的效用評估
肥大細胞（mast cell）是血液中白血球的一種類型，其會分泌組胺。此處將使用IgE致敏細胞並以DNP-HSA（dinitrophenyl-human serum albumin）抗原來誘發過敏反應，再藉由酵素結合免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析確定組胺的分泌量，以評估樣品的抑制組織胺能力。
材料與儀器
1. 細胞株：大鼠嗜鹼性白血病細胞（rat basophilic leukemia cells, tumor analogue of mast cells）RBL-2H3，購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC），編號CRT-2256。
2. 含胎牛血清（fetal bovine Serum，FBS）的培養基：將Eagle’s最低限度基本培養基（minimum essential medium，MEM，購自Gibco，61100-061）、胎牛血清（fetal bovine Serum，FBS，購自Gibco，10437-028）、以及抗生素-抗真菌藥（Antibiotic-Antimycotic，AA），購自Gibco，商品編號15240-062，以體積比84：15：1的方式配製而成。
3. 不含FBS的培養基：將Eagle’s最低限度基本培養基（minimum essential medium，MEM，購自Gibco，61100-061）以及抗生素-抗真菌藥（Antibiotic-Antimycotic，AA，購自Gibco，商品編號15240-062），以體積比99：1的方式配製而成。
4. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號14200-075。
5. 抗二硝基苯基化免疫球蛋白E（monoclonal anti-dinitrophenyl antibody produced in mouse IgE isotype，anti-DNP-IgE，購自Sigma，商品編號D8406-2MG）。
6. 二硝基苯基化人血清白蛋白（dinitrophenyl-human serum albumin，DNP-HSA）。
7. 組織胺（Histamine）ELISA試劑盒，購自USCN，產品編號CEA927Ge。
8. ELISA分光光度計，Epoch，型號1212171。
9. 天然原料水萃液樣品溶液：將[例1]中所得到、尚未發酵的天然原料的水萃液與不含FBS的培養基，依其體積做100倍稀釋進行配製（含有1 vol%的天然原料水萃液）。
10. 天然原料發酵液樣品溶液：將[例1]中所得到的天然原料發酵液（糖度值為2.0°Bx）與不含FBS的培養基，依其體積做100倍稀釋進行配製（約含有1 vol%的天然原料發酵液）。
實驗步驟
將RBL-2H3細胞以每孔1×105
個的方式，接種於每孔含500 μL含FBS培養基之培養盤中，並於5% CO2
、37℃環境下，培養8小時。而後，將各孔的培養基移除，並將細胞分為4組，分別為空白控制組、正對照組、天然原料水萃液組以及天然原料發酵液組。針對空白控制組以及正對照組的細胞，僅分別加入500 μL不含FBS的培養基；針對天然原料水萃液組的細胞，則是加入500 μL天然原料水萃液樣品溶液；針對天然原料發酵液組的細胞，則是加入500 μL天然原料發酵液樣品溶液。將各組細胞於5%CO2
、37℃環境下，培養6小時。
接著，於各組細胞中加入濃度為0.2 μg/ml的anti-DNP-IgE溶液（以不含FBS的培養基進行配製）500 μL，靜置30分鐘以致敏細胞。而後，移除各孔之培養基，針對空白控制組的細胞，僅加入500 μL不含FBS的培養基於每孔中；針對其他各組的細胞，加入濃度為1 μg/ml的DNP-HSA溶液（以不含FBS的培養基進行配製）500 μL於每孔中。將4組細胞於5%CO2
、37℃環境下靜置30分鐘，以誘發過敏反應。
隨後，收取各組細胞，並依照組織胺ELISA試劑盒內所附之操作手冊，使細胞呈色，再以ELISA分光光度計於450nm的波長下測量各孔吸光值。根據吸光值推算組織胺濃度，並以空白控制組的組織胺濃度為100%，將結果繪示於圖2中。
由圖2可知，當細胞以IgE致敏，並以DNP-HSA刺激細胞時，如正對照組所示，將產生大量的組織胺。天然原料水萃液與天然原料發酵液皆可抑止組織胺產生，但由圖2可見，藉由特定發酵程序的天然原料發酵液，其抑止組織胺的效果可進一步提升（相較於正對照組，天然原料發酵液可減少約90%的組織胺產生量）。天然原料發酵液組細胞的組織胺生成量，甚至可低於未受DNP-HSA處理的細胞。顯示相較於天然原料水萃液，天然原料發酵液可更有效地抑止組織胺產生。
[例7]天然原料發酵液對於抑制一氧化氮分泌的效用評估
此處以脂多醣誘發巨噬細胞發炎，模擬發炎反應時iNOS （inducible nitric oxide synthase）產生大量NO自由基，NO的測定試驗以Griess法進行。雖然Griess試劑係用以測定NO2 −
，但由於NO的半衰期很短，將會迅速地被氧化成NO2 −
。因此在短時間內，可藉由使用Griess試劑測定NO2 −
的量，來間接地表示NO的釋放量。
材料與儀器
1. 細胞株：小鼠巨噬細胞RAW 264.7，購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC），產品編號TIB-71。
2. 含FBS的培養基：於改良式Eagle’s最低限度基本培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，購自Gibco，商品編號12100-046）中額外添加其10 vol%的FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）以及1 vol%的抗生素-抗真菌藥（Antibiotic-Antimycotic，AA，購自Gibco，商品編號15240-062）配製而成。
3. 不含FBS的培養基：於改良式Eagle’s最低限度基本培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，購自Gibco，商品編號12100-046）中額外添加其10 vol%的FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）以及1 vol%的抗生素-抗真菌藥（Antibiotic-Antimycotic，AA，購自Gibco，商品編號15240-062）配製而成。
4. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號14200-075。
5. 脂多醣（Lipopolysaccharides，LPS），購自Sigma，產品編號SI-L2880。
6. Griess 試劑組，購自Life Technologies，產品編號1445263。
7. ELISA分光光度計，Epoch，型號1212171。
8. 天然原料水萃液樣品溶液：將[例1]中所得到、尚未發酵的天然原料的水萃液與不含FBS的培養基，以體積比1：3200的方式進行配製（天然原料水萃液的濃度約為0.03125 vol%）。再於其中添加LPS，使其中之LPS濃度為200 ng/ml。
9. 天然原料發酵液樣品溶液：將[例1]中所得到的天然原料發酵液（糖度值為2.0°Bx）與不含FBS的培養基，以體積比1：3200的方式進行配製（天然原料發酵液的濃度約為0.03125 vol%）。再於其中添加LPS，使其中之LPS濃度為200 ng/ml。
實驗步驟
將小鼠巨噬細胞RAW 264.7以每孔1×104
個的方式，接種於每孔含200μl之含FBS的培養基中，並於5%CO2
、37℃環境下，培養24小時。而後，將各孔的培養基移除，再將細胞分為4組，分別為空白控制組、對照組、天然原料水萃液組以及天然原料發酵液組。針對空白控制組的細胞，僅加入200 μL不含FBS的培養基；針對對照組的細胞，僅加入200 μL以不含FBS的培養基所配製的LPS溶液（LPS濃度為200 ng/ml）；針對天然原料水萃液組的細胞，則是加入200 μL的天然原料水萃液樣品溶液；針對天然原料發酵液組的細胞，則是加入200 μL天然原料發酵液樣品溶液。將各組細胞於5%CO2
、37℃環境下，培養24小時。
接著，取一新的培養盤，每孔中加入130 μL的二次水。再從前方所述各組的每孔中取出150 μL，加入至前述已含有130 μL的二次水的孔中。接著根據Griess試劑組中的說明，配製Griess試劑，並於每孔中加入20 μL配製好的Griess試劑，使細胞避光靜置30分鐘。再以ELISA分光光度計測量各孔細胞溶液在548 nm波長下的光密度值（optical density，OD），作為吸光度。OD值讀值越大，可間接表示NO的含量濃度越高。以空白控制組的NO濃度為100%，將各組結果繪示於圖3中（空白控制組為繪示於圖3）。
由圖3可知，經LPS刺激的細胞確實會大量產生NO，而相較於對照組，天然原料水萃液可減少約12%的NO產生量，天然原料發酵液可減少約17%的NO產生量。據此可知，天然原料水萃液與天然原料發酵液皆可抑止NO的產生，且天然原料發酵液的抑制功效相較於天然原料水萃液更為顯著。
[例8]天然原料發酵液對於提升IL-6、IL-8、IL-10的效用評估
材料與儀器
1. 細胞株：人類單核球細胞（human monocytic cell） THP-1，購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC），產品編號TIB202。
2. 培養基：RPMI-1640培養液（購自Gibco，產品編號31800-022）經額外添加，使其含有10 vol% FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028）、0.05 mM二硫基乙醇（2-mercaptoethanol，購自Sigma，產品編號21985023）、1 vol%的抗生素-抗真菌藥（Antibiotic-Antimycotic，AA，購自Gibco，商品編號15240-062）。
3. RNA萃取試劑套組，購自台灣Geneaid公司，產品編號RBD300-DG 。
4. SuperScript® III反轉錄酶（Reverse Transcriptase），購自Invitrogen，產品編號18080-051。
5. 引子組（IL-6、IL-8、IL-10）。
6. KAPA CYBR FAST qPCR套組（2x）（購自KAPA Biosystems，商品編號KK4603）。
7. ABI StepOnePlusTM
即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM
Real-Time PCR system），購自Thermo Fisher Scientific。
8. 天然原料水萃液樣品溶液：將[例1]中所得到、尚未發酵的天然原料的水萃液與培養基，以體積比1：3200的方式進行配製（天然原料水萃液的濃度約為0.03125 vol%）。
9. 天然原料發酵液樣品溶液：將[例1]中所得到的天然原料發酵液（糖度值為2.0°Bx）與培養基，以體積比1：3200的方式進行配製（天然原料發酵液的濃度約為0.03125 vol%）。
實驗步驟
接種1.5×105
個THP-1細胞至每孔含有2 mL培養基的培養盤中，並置於5%CO2
、37℃下培養24小時。而後，將細胞分為3組，分別為空白控制組、天然原料水萃液組以及天然原料發酵液組。針對空白控制組的細胞，不作任何處理；針對天然原料水萃液組的細胞，加入2000 μL的天然原料水萃液樣品溶液；針對天然原料發酵液組的細胞，則是加入2000 μL天然原料發酵液樣品溶液。將各組細胞於5%CO2
、37℃環境下，培養24小時。
隨後，以RNA萃取試劑套組分別萃取3組細胞溶液內的RNA。接著，從每組中取2000奈克（ng）的RNA作為模板，透過SuperScript®
III反轉錄酶，將萃取出的RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM
即時PCR系統、KAPA SYBR FAST及表1的引子，對3組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qPCR）以觀察各組細胞內的IL-6、IL-8、IL-10基因的表現量。PCR反應的熔化曲線（melting curve）是在定量即時PCR反應期間進行確認，並採用SCORE方法來確認基因表達的相對定量。SCORE法是利用ACTB基因（作為內部對照組）及基準基因（reference gene）的循環閾值（cycle threshold value （Ct
））來計算。目標基因的mRNA相對量係推導自方程式2- △△ Ct
，其中△Ct
=Ct 目標基因 / 基準基因
-Ct ACTB
，接著計算上述每個基因之表現量在各組與空白控制組的差值（△△Ct
=△Ct 目標基因
-△Ct 基準基因
），並以此差值之加總作為基因表現之分數。
表1
| 基因 | SEQ ID NO. ＃ | 引子 | 序列 | 引子長度 |
| IL-6 | 1 | IL-6-F | ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG | 23 |
| 2 | IL-6-R | CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG | 23 | |
| IL-8 | 3 | IL-8-F | TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA | 22 |
| 4 | IL-8-R | AACCCTCTGCACCCAGTTTTC | 21 | |
| IL-10 | 5 | IL-10-F | TCAAGGCGCATGTGAACTCC | 20 |
| 6 | IL-10-R | GATGTCAAACTCACTCATGGCT | 22 |
試驗結果繪示於圖4（IL-10基因）以及圖5（IL-8基因、IL-6基因）。圖式中顯示的各基因的相對基因表現量係以相對倍率呈現，並使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。
請先參閱圖4。將空白控制組的IL-10基因的表現量視為1（即100%）時，天然原料水萃液組相對於空白控制組的表現量為0.88（即88%），天然原料發酵液組對於空白控制組的表現量為2.94（即294%）。顯示相較於空白控制組，天然原料水萃液並無法有效提升抑炎因子IL-10的基因表現量，而天然原料發酵液卻可顯著提升抑炎因子IL-10的基因表現量約3倍。由此可知，當細胞以天然原料發酵液處理後，人類單核球細胞的IL-10基因的表現量提高，代表IL-10的產生量亦可提升而可抑止發炎、過敏反應。
接著請參閱圖5。將空白控制組的IL-8基因、IL-6基因的表現量視為1（即100%）時，天然原料水萃液組相對於空白控制組的IL-8基因表現量為1.29（即129%）、天然原料水萃液組相對於空白控制組的IL-6基因表現量為2.58（即258%）；天然原料發酵液組對於空白控制組的IL-8表現量為2.47（即247%）、天然原料發酵液組相對於空白控制組的IL-6基因表現量為8.47（即847%）。顯示相較於天然原料水萃液，天然原料發酵液可顯著提升IL-8、IL-6的基因表現量分別約2倍及3倍，而因IL-8、IL-6皆有助於免疫力的提升，故天然原料發酵液確實可用以提升免疫力。
[例9]天然原料發酵液對於提升自然細胞毒殺能力的效用評估
螢光染料 3,8-二氨基-5-[3（二乙基甲氨基）丙基]-6-苯基啡瞇二碘（3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-
phenylphenanthridinium diiodide，Propidium Iodide，PI，碘化丙啶）是種可對DNA染色的細胞核染色試劑，它可在嵌入雙鏈DNA後釋放紅色螢光。而由於PI不能通過活細胞膜但卻能穿過破損的細胞膜而對其細胞核進行染色，故PI可作為死細胞核酸試劑，常用於細胞凋亡檢測。PI也經常被用來與鈣黃綠素乙醯氧基甲酯（Calcein acetoxymethyl ester，calcein-AM）或者二乙酸螢光素（fluorescein diacetate，FDA）等螢光探針一起使用，以同時對活細胞和死細胞染色進行測試。
此處藉由將外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）（其中約含有10%的自然殺手細胞）與K562人類血癌細胞共培養，再以死細胞染劑PI搭配流式細胞儀檢測，分析死細胞數目，間接推知各組自然殺手細胞的細胞毒殺能力。
材料與儀器
1. RPMI 1640細胞培養液（後方略稱為RPMI），購自Gibco，產品編號31800022。
2. 1X 杜氏磷酸緩衝鹽溶液（Dulbecco's phosphate-buffered saline ，DPBS），購自Gibco，產品編號14190144。
3. 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），購自BD Biosciences，商品編號556463。
4. 鈣黃綠素AM（Calcein AM），購自Invitrogen，商品編號A13201。
5. 天然原料發酵液樣品溶液：將[例1]中所得到的天然原料發酵液（糖度值為2.0°Bx），以培養基稀釋為原體積濃度的1%。
6. 流式細胞儀（Flow cytometry），購自BD，型號Accuri™ C6 Plus。
7. K562人類血癌細胞，購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC），產品編號CCL-243。
8. 天然原料發酵液樣品溶液：將[例1]中所得到的天然原料發酵液（糖度值為2.0°Bx）以RPMI 1640細胞培養液，依其體積做100倍稀釋（約含有1 vol%的天然原料發酵液）。
先由健康捐贈者提供周邊血，並從中分離出PBMC。使用含EDTA抗凝劑之紫頭採血管（購自greiner bio-one，商品編號455036）收集數位受試者的靜脈血各6毫升，接著將抽取後的靜脈血以轉速300 xg
離心15分鐘。自離心後的靜脈血取2mL的血沉棕黃層（buffy coat）的白細胞層，並將白細胞層以2毫升DPBS稀釋為4毫升，接著在稀釋後的白細胞層中緩慢加入至含有3毫升的細胞分離液（Ficoll-Paque Plus 細胞分離液，購自GE Healthcare，商品編號17144002）的離心管，其中於加入期間，稀釋後的白細胞層與細胞分離液須為分層狀態，不能混合。接著，將裝有分層的稀釋後的白細胞層與細胞分離液的離心管以400 xg
離心40分鐘，並於離心後去除上清液，取上述離心後離心管內的中間層內的外周血單個核細胞（PBMC）2至3毫升。將PBMC以3倍體積的1X DPBS潤洗後與前述1X DPBS緩衝液混合均勻以形成PBMC混合液。接著將PBMC混合液以轉速300 xg
離心10分鐘以形成上清液及PBMC細胞沉澱物。
去除上清液，以5 mL RPMI重新懸浮PBMC細胞，並加入1 μL的Calcein AM染劑於其中，靜置5分鐘以進行染色。染色完畢，以400 xg轉速條件將細胞離心5分鐘。去除上清液，再加入5mL之PBS進行離心，而後重複此步驟三次，確保將未染上細胞的多餘Calcein AM去除。
於此處，將會規劃6個組別進行實驗，其分組方式如下：
空白控制組（含有PBMC以及K562）：（1）0小時組以及（2）3小時組；
天然原料發酵液組（含有PBMC以及K562）：（3）0小時組以及（4）3小時組；
（5）單獨培養的PBMC細胞；以及（6）單獨培養的K562細胞。
將前述清洗過、染好Calcein AM之PBMC去除上清液後，以RPMI將其稀釋為1x106
個PBMC/100 μL，並根據上述分組方式，在需要有PBMC的組別中，於每孔加入100 μL此PBMC稀釋溶液。
另外，以RPMI配製5x104
個K562細胞/100 μL的K562稀釋溶液，並根據上述分組方式，在需要有K562細胞的組別中，於每孔加入100 μL此K562稀釋溶液。
此時，（1）-（4）組因同時加入了100 μL的PBMC稀釋溶液以及100 μL的K562稀釋溶液，故體積為200 μL。再於單獨培養的（5）、（6）組中，分別加入100 μL的RPMI，使其體積皆為200 μL。
接著，針對空白控制組的（1）、（2）組細胞，不進行額外處理；而針對天然原料發酵液組的（3）、（4）組細胞則是分別於每孔中加入200 μL的天然原料發酵液樣品溶液。而後，立即於空白控制組的（1）組、天然原料發酵液組的（3）組、（5）組、以及（6）組的細胞中，加入1 μL PI染劑。加入後，再立即將（1）、（3）、（5）、以及（6）組的細胞移至流式細胞儀。先對（5）組以及（6）組偵測其散布圖分布範圍，框選PBMC、K562於散布圖中之族群，供後續試驗進行紅螢光（PE-A）之訊號定量，接著偵測（1）、（3）組的PE-A螢光訊號。
於添加天然原料發酵液樣品溶液後3小時，於（2）、（4）組的每孔中加入1 μL PI染劑，而後立即利用流式細胞儀進行PE-A螢光訊號測定。於PE-A螢光直方圖（histagram）框選或然率間格區域（Interval gate），藉此比較各孔之紅螢光訊號強度。藉由紅螢光訊號強度推算死細胞數目，並以死亡細胞數/原細胞數目代表自然殺手細胞的毒殺能力。其（2）、（4）組的毒殺能力結果繪示於圖6。
由圖6可知，相較於空白控制組，使細胞經天然原料發酵液處理3小時後，確實可有效提升自然殺手細胞的毒殺能力（在此實施例中，約可提升12%），進而可提升個體免疫力。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
[圖1] 係總多酚含量測試結果的比較數據圖。
[圖2] 係組織胺相對分泌量的測試結果數據圖。
[圖3] 係一氧化氮相對生成量的測試結果數據圖。
[圖4] 係IL-10基因的相對表現量結果數據圖。
[圖5] 係IL-8基因、IL-6基因的相對表現量結果數據圖。
[圖6] 係自然殺手細胞活性測試結果的比較數據圖。
圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
Claims (20)
- 一種天然原料發酵液，係藉由一包含下列步驟之製備方法製得：(a)將葡萄糖、紅棗(Ziziphus jujuba Miller)、蘋果、蛹蟲草(Cordyceps militaris)、以及砂仁(Fructus Amomi)與水混合以得到一培養液，其中該水之重量為該紅棗、該蘋果、該蛹蟲草、以及該砂仁總重的5-15倍，且該(a)步驟包括：(a1)將該紅棗、該蘋果、該蛹蟲草、以及該砂仁與該水混合並於50-100℃下進行一萃取以得到一天然原料的水萃液；以及(a2)將該葡萄糖加入至該天然原料的水萃液以得到該培養液；以及(b)將該培養液及複數菌種進行發酵4-15日以得到該天然原料發酵液，其中該複數菌種包括相對於該培養液為0.01-0.5wt%的酵母菌、相對於該培養液為0.01-0.25wt%的乳酸菌及相對於該培養液為3-10wt%的醋酸菌。
- 如請求項1所述的天然原料發酵液，其中該(a)步驟之得到該培養液的步驟中，紅棗、蘋果、蛹蟲草、以及砂仁之間的重量比為1：1：1：1。
- 如請求項1所述的天然原料發酵液，其中該(a)步驟之得到該培養液的步驟中，葡萄糖的添加量為紅棗、蘋果、蛹蟲草、砂仁與水總重的8-12wt%。
- 如請求項1所述的天然原料發酵液，其中該萃取的時間為0.5-1.5小時。
- 如請求項1所述的天然原料發酵液，其中於該(b)將該培養液及該複數菌種進行發酵以得到該天然原料發酵液的步驟中，醋酸菌為最後加入的菌種。
- 如請求項5所述的天然原料發酵液，其中該(b)將該培養液及該複數菌種進行發酵以得到該天然原料發酵液的步驟包括：(b1)於該培養液中加入酵母菌進行發酵1-2日後形成一第一初發酵液；(b2)於該第一初發酵液中加入乳酸菌進行發酵1-3日後形成一第二初發酵液；以及(b3)於該第二初發酵液中加入醋酸菌進行發酵2-10日後形成該天然原料發酵液。
- 如請求項6所述的天然原料發酵液，其中該(b3)於該第二初發酵液中加入醋酸菌進行發酵2-10日後形成該天然原料發酵液的步驟中包括：於該第二初發酵液中加入醋酸菌進行發酵2-10日後，得到一天然原料發酵原液，將該天然原料發酵原液在50-60℃下減壓濃縮及以200-400目篩網過濾後，得到該天然原料發酵液。
- 如請求項1所述的天然原料發酵液，其中該(b)將該培養液及該複數菌種進行發酵以得到該天然原料發酵液的步驟包括：將該培養液及該複數菌種進行發酵4-15日後，得到一天然原料發酵原液，將該天然原料發酵原液經濃縮及過濾後，得到該天然原料發酵液。
- 如請求項1所述的天然原料發酵液，其中該(b)將該培養液及複數菌種進行發酵以得到該天然原料發酵液的步驟包括：將該培養液 及該複數菌種進行發酵4-15日後，得到一天然原料發酵原液；添加一寡糖至該天然原料發酵原液以使該天然原料發酵原液的糖度達到35-40°Bx以形成該天然原料發酵液。
- 如請求項1所述的天然原料發酵液，其中該天然原料發酵液的pH值為3.9-4.2，且其糖度為3.0以下。
- 如請求項1所述的天然原料發酵液，其中酵母菌為Saccharomyces cerevisiae，乳酸菌為Lactobacillus helveticus，醋酸菌為Acetobacter aceti。
- 一種天然原料發酵物，其係由如請求項1至11中任一項所述的天然原料發酵液所獲得。
- 一種將如請求項1至11中任一項所述的天然原料發酵液用於製備一抑制過敏反應的組合物的用途。
- 如請求項13所述的用途，其中該抑制過敏反應的組合物係同時具有以下所述功能的至少其中兩種：抑制組織胺分泌、抑制一氧化氮生成、以及提升白血球介素-10(Interleukin-10，IL-10)基因表現量。
- 如請求項14所述的用途，其中若該組合物用於抑制組織胺分泌，則該組合物含有0.8-1.2vol%的該天然原料發酵液。
- 如請求項14所述的用途，其中若該組合物用於抑制一氧化氮生成或提升白血球介素-10的基因表現量，則該組合物含有0.030-0.035vol%的該天然原料發酵液。
- 一種將如請求項1至11中任一項所述的天然原料發酵液用於製備一提升免疫力的組合物的用途。
- 如請求項17所述的用途，其中該提升免疫力的組合物係提升白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)基因表現量、提升白細胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)基因表現量、或提升自然殺手細胞毒殺能力。
- 如請求項18所述的用途，其中若該組合物用於提升自然殺手細胞毒殺能力，則該組合物含有0.8-1.2vol%的該天然原料發酵液。
- 如請求項18所述的用途，其中若該組合物用於提升白細胞介素-6基因表現量或提升白細胞介素-8基因表現量，則該組合物含有0.030-0.035vol%的該天然原料發酵液。
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