TWI801862B

TWI801862B - 抗ｔｉｇｉｔ的抗體、其製備方法和應用

Info

Publication number: TWI801862B
Application number: TW110116579A
Authority: TW
Inventors: 于海佳; 蔡明清; 韋小越; 陳時; 謝劍梅; 朱向陽
Original assignee: 大陸商華博生物醫藥技術（上海）有限公司; 大陸商上海華奧泰生物藥業股份有限公司
Priority date: 2020-05-09
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2023-05-11
Also published as: EP4148068A1; AU2021273240A1; EP4148068A4; JP2023534588A; CN114507284A; US20230183345A1; CN114507284B; KR20230009441A; TW202144428A; CN115605511A; CN111995681A; WO2021227940A1; CN111995681B

Abstract

本申請涉及一種分離的抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。本申請還提供了抗TIGIT的抗體、其製備方法和應用。本申請的抗原結合蛋白能夠特異性結合TIGIT抗原，阻斷TIGIT與其配體的結合，並且能夠用於製備預防或治療TIGIT相關的疾病的藥物。

Description

抗TIGIT的抗體、其製備方法和應用

本申請涉及生物醫藥領域，具體的涉及一種靶向於TIGIT的抗原結合蛋白、其製備方法和應用。

正常情況下，T細胞依賴抗原呈現細胞(Antigen-presenting cells，APCs)呈現的外源或內源抗原-MHC-I/II複合物與T細胞(CD4⁺、CD8⁺)表面受體(T Cell Receptor，TCR)結合以及額外的共刺激(Costimulatory)信號來充分啟動，然後藉由其他效應細胞對表達相關抗原的細胞進行殺傷。相反的是，T細胞還受到共抑制(Coinhibitory)信號調節，後者對T細胞的活性、增殖、存活等具有負面調節作用，也可維持自身耐受、防止過度的自身免疫反應、減小免疫應答所致的組織損傷。在腫瘤細胞微環境中，T細胞的啟動與抑制處於異常模式，目前，其正常化被廣泛視為腫瘤治療的重要手段。

TIGIT(T cell Ig and ITIM domain，也稱為WUCAM、Vstm3或VSIG9)是脊髓灰質炎病毒受體(PVR)/Nectin家族的成員。它由細胞外免疫球蛋白可變區(IgV)結構域，1型跨膜結構域和具有經典免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)和免疫球蛋白酪胺酸尾(ITT)基序的細胞內結構域組成。TIGIT在淋巴細胞中表達，特別是在效應和調節性CD4⁺T細胞、濾泡輔助CD4⁺T細胞、效應CD8⁺T細胞和自然殺傷(NK)細胞中高表達。TIGIT基因位於人類第16號染色體，編碼由244個胺基酸組成的I型跨膜蛋白。人TIGIT分子胞膜外區長141個胺基酸，有1個免疫球蛋白V樣結構域；跨膜區23個胺基酸；胞質區較短，有80個胺基酸，具有1個PDZ結合結構域和1個ITIM模體。

CD155(也叫PVR、Necl5或Tage4)是TIGIT的高親和力配體。腫瘤表面高表達的CD155一旦與NK和T細胞表面的TIGIT結合，它們對腫瘤細胞的殺傷作用就會被抑制。TIGIT可以藉由阻止腫瘤細胞的初始死亡和釋放腫瘤抗原來抑制NK細胞效應；抑制樹突細胞協同刺激能力，導致癌抗原呈遞減少和抗炎細胞因子如IL-10增加，TIGIT還可以誘導其他細胞如腫瘤細胞的PVR信號傳導；TIGIT可以直接抑制CD8⁺T細胞效應，或者TIGIT⁺Treg可以抑制CD8⁺T細胞，防止癌細胞的清除(Manieri et al.,Inhibition cf the Cancer Immunity Cycle by TIGIT.2016)。

大量的臨床前研究結果表明，TIGIT將成為癌症乃至其他疾病患者的合適靶標，因此，鑒於TIGIT在各類相關疾病中作用和功能，本領域仍然需要開發適於治療患者的改善的抗TIGIT特異性抗體。

本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。該分離的抗原結合蛋白也可包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。該分離的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：1)能夠以1×10^-10M或更低(例如，8×10^-11M、5×10^-11M、2×10^-11M、1×10^-11M或更低)的KD 值結合TIGIT蛋白，其中該KD值藉由表面等離子體共振法測定；2)在FACS測定中，能夠阻斷CD155與TIGIT的結合；和3)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。

一方面，本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：1)能夠以1×10^-10M或更低的KD值結合TIGIT蛋白，其中該KD值藉由表面等離子體共振法測定；2)在FACS測定中，能夠阻斷CD155與TIGIT的結合；和3)能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白與參比抗體競爭結合該TIGIT蛋白，其中該參比抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列；該HCDR2包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列；該HCDR3包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，該參比抗體的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列；該LCDR2包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；該LCDR3包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段。

在某些實施方式中，該抗原結合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb。

在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。

在某些實施方式中，該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該HCDR2包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該HCDR2包含SEQ ID NO：4和42中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該HCDR3包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該HCDR3包含SEQ ID NO：5和43中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該分離的抗原結合蛋白包含選自下述的任意一組胺基酸序列：

(1)HCDR1：SEQ ID NO：3，HCDR2：SEQ ID NO：4，和HCDR3：SEQ ID NO：5；以及，

(2)HCDR1：SEQ ID NO：3，HCDR2：SEQ ID NO：42，和HCDR3：SEQ ID NO：43。

在某些實施方式中，該VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該LCDR1包含SEQ ID NO：6和52中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該LCDR2包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該LCDR3包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該LCDR3包含SEQ ID NO：8和53中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該分離的抗原結合蛋白包含選自下述的任意一組胺基酸序列：

(1)LCDR1：SEQ ID NO：6，LCDR2：SEQ ID NO：7，和，LCDR3：SEQ ID NO：8；以及

(2)LCDR1：SEQ ID NO：52，LCDR2：SEQ ID NO：7，和，LCDR3：SEQ ID NO：53。在某些實施方式中，該VL包括框架區L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。

在某些實施方式中，該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該L-FR1包含SEQ ID NO：15、16、44和45中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該L-FR2包含SEQ ID NO：17、18、46和47中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEO ID NO：72所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該L-FR3包含SEQ ID NO：19、20、21、48、49和50中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該L-FR4包含SEQ ID NO：22和51中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：2、10、11、13、33和34中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體輕鏈恆定區，且該抗體輕鏈恆定區來自人κ輕鏈恆定區，且該人κ輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該VH包括框架區H-FR1、H-FR2、H-FR3、和H-FR4。

在某些實施方式中，該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：23和35中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：24、25、26、36和37中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：27、38和39中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：28、40和41中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：1、9、12、14和32中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區包括人IgG恆定區。

在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區包括人IgG1恆定區，且人IgG1恆定區包含SEQ ID NO：29-30中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，且該分離的抗原結合蛋白包含選自下述的任意一組胺基酸序列：(1) VH：SEQ ID NO：9，VL：SEQ ID NO：10，(2)VH：SEQ ID NO：9，VL：SEQ ID NO：11，(3)VH：SEQ ID NO：12，VL：SEQ ID NO：13，(4)VH：SEQ ID NO：14，VL：SEQ ID NO：11，(5)VH：SEQ ID NO：1，VL：SEQ ID NO：2，(6)VH：SEQ ID NO：32，VL：SEQ ID NO：34，以及(7)VH：SEQ ID NO：32，VL：SEQ ID NO：33。

另一方面，本申請提供了分離的一種或多種核酸分子，其編碼該分離的抗原結合蛋白。

另一方面，本申請提供了一種載體，該載體包含該核酸分子。

另一方面，本申請提供了一種細胞，該細胞包含該核酸分子或該載體。

另一方面，本申請提供了多肽，該多肽包含該分離的抗原結合蛋白。

另一方面，本申請提供了免疫綴合物，該免疫綴合物包含該分離的抗原結合蛋白或該多肽。

另一方面，本申請提供了一種製備該分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得該分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養該細胞。

另一方面，本申請提供了一種醫藥組成物，其包含該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該多肽、該免疫綴合物和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。

另一方面，本申請提供了該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該多肽、該免疫綴合物和/或該醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療TIGIT相關疾病。

在某些實施方式中，該TIGIT相關疾病為T細胞功能障礙性病症。

在某些實施方式中，該TIGIT相關疾病為腫瘤。在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。

在某些實施方式中，該腫瘤選自下組：乳腺癌、結腸癌、肝癌、淋巴瘤、軟骨肉瘤、多發性骨髓瘤、肺癌、腎癌、黑色素瘤、T淋巴瘤和胰腺癌。

另一方面，本申請提供了一種抑制CD155與TIGIT結合的方法，該方法包括施用該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該多肽、該免疫綴合物和/或該醫藥組成物。

另一方面，本申請提供了該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該多肽、該免疫綴合物和/或該醫藥組成物，其用於預防、緩解或治療TIGIT相關疾病。

另一方面，本申請提供了一種預防、緩解或治療TIGIT相關疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者施用該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該多肽、該免疫綴合物和/或該醫藥組成物。

本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如本領域技術人員將認識到的，本申請的內容使得本領域技術人員能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。

本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：

圖1顯示的是TIGIT嵌合抗體對表達人TIGIT的細胞結合活性。

圖2顯示的是TIGIT人源化抗體對表達人TIGIT的細胞結合活性。

圖3顯示的是TIGIT嵌合抗體對人TIGIT與其配體CD155結合的阻斷活性。

圖4顯示的是TIGIT人源化抗體對人TIGIT與其配體CD155結合的阻斷活性。

圖5顯示的是TIGIT抗體在動物體內藥效檢測。

圖6顯示的是TIGIT抗體在動物體內與對照抗體Tiragolumab的藥效檢測比較。

圖7顯示的是TIGIT抗體在動物體內的藥效實驗結果。

以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公關的內容容易地瞭解本申請的其他優點及效果。

術語定義

在本申請中，術語“TIGIT”稱為“含Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體”，通常為免疫球蛋白的PVR(脊髓灰質炎病毒受體)家族的成員，其可結合PVR/CD155和Nectin-2/CD112。本申請的TIGIT可以指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類(例如人、恆河猴和食蟹猴)和齧齒類(例如小鼠和大鼠)的TIGIT蛋白。該術語涵蓋全長的TIGIT或其片段(諸如其缺乏信號肽的成熟片段)，未加工的TIGIT，因細胞中的加工所致的任何形式的TIGIT，以及人工合成的TIGIT。該術語還涵蓋TIGIT的變體，例如剪接變體或等位變體。在某些情形中，TIGIT為人TIGIT，人TIGIT的胺基酸序列包含UniProt登錄號Q495A1所示的胺基酸序列。在某些情形中，TIGIT為食蟹猴TIGIT，食蟹猴TIGIT的胺基酸序列包含UniProt登錄號G7NXM4所示的胺基酸序列。在某些情形中，TIGIT為小鼠TIGIT，小鼠TIGIT的胺基酸序列包含UniProt登錄號P86176所示的胺基酸序列。

在本申請中，術語“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及視需要地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構型的支架或骨架部分。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab、Fab’、F(ab)₂、Fv片段、F(ab’)₂、scFv、di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。

在本申請中，術語“Fab”通常是指含有重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的片段，並且還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1)；術語“Fab’”通常是指在重鏈CH1結構域的羧基端添加少量殘基(包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而不同於Fab的片段；術語“F(ab')₂”通常是指Fab’的二聚體，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。術語“Fv”通常是指含有完整抗原識別與結合位點的最小抗體片段。在某些情形中，該片段可以由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區以緊密非共價結合的二聚體組成；術語“dsFv”通常是指二硫鍵穩定的Fv片段，其單個輕鏈可變區與單個重鏈可變區之間的鍵是二硫鍵。術語“dAb片段”通常是指由VH結構域組成的抗體片段。在本申請中，術語“scFv”通常是指抗體的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域藉由柔性肽連接子共價連接配對形成的單價分子；此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-連接子-VH-COOH或NH₂-VH-連接子-VL-COOH。

在本申請中，術語“抗體”其以最廣泛意義使用，且具體涵蓋，但不限於，單株抗體(包括包含兩條輕鏈和兩條重鏈的全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人源化抗體、完全人類抗體、嵌合抗體和駱駝化單結構域抗體。“抗體”通常可以包含藉由二硫鍵互相連接的至少兩條重鏈(HC)和兩條輕鏈(LC)的蛋白，或其抗原結合片段。每條重鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗體中，重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗體中，各輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域，CL。VH和VL區可進一步細分為超變性的區域，稱為互補決定區(CDR)，其與稱為框架區(FR)的較保守的區域交替。各VH和VL包含三個CDR和四個框架區(FR)，從胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區(H-FR1、H-FR2、H-FR3、H-FR4、L-FR1、L-FR2、L-FR3、L-FR4)，大部分採用β-折疊構型，藉由三個CDRs連接，形成環連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDRs藉由FR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因數，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)結合。

在本申請中，術語“可變”通常是指這樣的事實，即抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中的三個區段，被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。可變域中更高度保守的部分被稱為框架(FR)。在本領域中，可以藉由多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))、基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見，A1-Lazikani等人，JMol Biol 273：927-48,1997)和基於IMGT本體論(IMGT-ONTOLOGY)的概念和IMGT Scientific圖表規則的IMGT定義規則。

IMGT指國際ImMunoGeneTics資訊系統，一種免疫遺傳學和免疫資訊學的全球參考資料庫(http：//www.imgt.org)。IMGT專門研究來自人類和其他脊椎動物的免疫球蛋白(IG)或抗體、T細胞受體(TR)、主要組織相容性(MH)，以及來自脊椎動物和非脊椎動物的免疫球蛋白超家族(IgSF)、MH超家族(MhSF)和免疫系統相關蛋白(RPI)。

在本申請中，術語“分離的”抗原結合蛋白通常是指已經從其產生環境(例如，天然的或重組的)的組分中識別，分離和/或回收的抗原結合蛋白。其產生環境的污染組分通常是干擾其研究、診斷或治療用途的物質，可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。分離的抗原結合蛋白或抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。

在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即集群中的個別抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突變。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。而且，與一般多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以藉由融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，本申請使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以藉由重組DNA方法製備。

在本申請中，術語“嵌合抗體”通常是指其中可變區源自一個物種，而恆定區源自另一個物種的抗體。通常，可變區源自實驗動物諸如齧齒動物的抗體(“親本抗體”)，且恆定區源自人類抗體，使得所得嵌合抗體與親本(例如小鼠來源)抗體相比，在人類個體中引發不良免疫反應的可能性降低。

在本申請中，術語“人源化抗體”通常是指非人抗體(例如小鼠抗體)的CDR區以外的部分或全部有的胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應的胺基酸置換的抗體。在CDR區中，胺基酸的小的添加、缺失、插入、置換或修飾也可以是允許的，只要它們仍保留抗體結合特定抗原的能力。人源化抗體可視需要地包含人類免疫球蛋白恆定區的至少一部分。“人源化抗體”保留類似於原始抗體的抗原特異性。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR區殘基用具有所期望性質、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠，大鼠，家兔或非人靈長類動物)的CDR區殘基替換。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白的FR區殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有的胺基酸修飾。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能，諸如結合親和力。

在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。全人源抗體可以大大減少異源抗體對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術、核糖體展示技術和RNA-多肽技術等。

在本申請中，術語“結合”、“特異性結合”或“對…特異性的”通常是指可測量且可再現的相互作用，諸如抗原和抗體之間的結合，其可以確定在存在分子(包括生物學分子)的異質群體的情況中靶物的存在。例如，抗體藉由其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。例如，特異性結合靶物(其可以是表位)的抗體是以比其結合其它靶物更大的親和力、親合力、更容易和/或以更大的持續時間結合此靶物的抗體。當抗體相比於其將結合隨機的、不相關的表位而言更容易藉由其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。“表位”是指抗原上與抗原結合蛋白(如抗體)結合的特定的原子基團(例如，糖側鏈、磷醯基、磺醯基)或胺基酸。

在本申請中，術語“KD”、“K _D”可互換地使用，通常是指平衡解離常數，“KD”是解離速率常數(kdis，也稱為“解離率(off-rate)(koff)”或“kd”)與結合速率常數(kon，也稱為“結合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用結合速率常數(kon)、解離速率常數(kdis)和平衡解離常數(KD)表示抗原結合蛋白(例如抗體)對抗原的結合親和力。確定結合和解離速率常數的方法為本領域熟知，包括但不限於生物膜干涉技術(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等離子共振(SPR)、螢光共振能量遷移(FRET)、免疫共沉澱(Co-IP)以及蛋白質晶片技術。如果在不同的條件(例如鹽濃度、pH)下測量，則所測得的某種特定蛋白-蛋白相互作用的親和力可不同。

在本申請中，術語“參比抗體”通常是指本申請所述抗原結合蛋白與之競爭結合抗原TIGIT的抗體。

在本申請中，術語“ADCC”或“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”通常是指這樣一種細胞毒性形式，一些分泌型免疫球蛋白結合到某些細胞毒性效應細胞(例如，NK細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上的Fc受體(FcR)上，使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨後用細胞毒素殺死靶細胞。介導ADCC的主要細胞(例如NK細胞)只表達Fc γ RIII，而單核細胞表達Fc γ RI、Fc γ RII和Fe γ RIII(可參見Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464頁表3)。可以進行體外和/或體內細胞毒性測定法以評估目的分子的ADCC活性，例如，可進行體外ADCC測定法，可參見美國專利號No.5,500,362或No.5,821,337或美國專利No.6,737,056(Presta)中所記載的。可用於此類測定法的效應細胞包括PBMC和NK細胞。或者/另外，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所揭露的。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合測定法以確保抗體缺乏Fc γ R結合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn結合能力。

ADCC活性可藉由修飾Fc區而減少。在某些情形中，影響與Fc受體結合的位點可被除去，例如，除去並非補救受體結合位點的位點。在某些情形中，Fc區可經修飾以除去ADCC位點。ADCC位點是本領域已知的，關於IgG1的ADCC位點，參見例如，Sarmay et al.(1992)Molec.Immunol.29(5)：633-9。

在本申請中，術語“在……之間”通常是指某種胺基酸片段的C端與第一胺基酸片段的N端直接或間接連接，並且其N端與第二胺基酸片段的C 端直接或間接連接。在輕鏈中，例如，該L-FR2的N末端與該LCDR1的C末端直接或間接相連，且該L-FR2的C末端與該LCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該L-FR3的N末端與該LCDR2的C末端直接或間接相連，且該L-FR3的C末端與該LCDR3的N末端直接或間接相連。在重鏈中，例如，該H-FR2的N末端與該HCDR1的C末端直接或間接相連，且該H-FR2的C末端與該HCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該H-FR3的N末端與該HCDR2的C末端直接或間接相連，且該H-FR3的C末端與該HCDR3的N末端直接或間接相連。在本申請中，“第一胺基酸片段”和“第二胺基酸片段”可以為相同或不同的任意一段胺基酸片段。

在本申請中，術語“分離的”抗原結合蛋白通常是指已經從其產生環境(例如，天然的或重組的)的組分中識別，分離和/或回收的抗原結合蛋白。其產生環境的污染組分通常是干擾其研究、診斷或治療用途的物質，可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。分離的抗原結合蛋白或抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。本申請所述分離的抗原結合蛋白通常不結合非TIGIT抗原的抗原。

在本申請中，術語“分離的核酸分子”或“分離的多核苷酸”通產是指基因組、mRNA、cDNA或合成來源的DNA或RNA或其一定組合，其不與在自然界中發現的多核苷酸的全部或一部分締合，或連接至其在自然界中不連接的多核苷酸。

在本申請中，術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。該載體還包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含該載體的合適的宿主細胞，該載體可以產生期望的表達產物。

在本申請中，術語“細胞”通常是指可以或已經含有包括本申請所述核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達本申請所述抗體或其抗原結合片段的個體細胞、細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的、意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同，但能夠表達本申請所述抗體或其抗原結合片段即可。該細胞可以藉由使用本申請所述載體體外轉染細胞而得到。該細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在某些情形中，該細胞可以是哺乳動物細胞。例如，該哺乳動物細胞可以是CHO-K1細胞。在本申請中，術語“重組細胞”通常是指在其中引入了重組表達載體的細胞。該重組宿主細胞不僅包括某種特定的細胞，還包括這些細胞的後代。

在本申請中，術語“藥學上可接受的佐劑”通常包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受的載體是PH緩衝水溶液。生理學可接受載體的例子可包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽，蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN^TM，聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

如本文所用，術語“給予”和“處理”是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物應用於動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體。“給予”和“處理”可以指治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸、以及試劑與流體的接觸、流體與細胞的接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理。“處理”當應用於人、動物或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷；包括TIGIT結合物與人或動物、受試者、細胞、組織、生理區室或生理流體的接觸。

如本文所用，術語“治療”指給予患者內用或外用治療劑，包含本申請的任何一種TIGIT抗原結合蛋白及其組成物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，以有效緩解一種或多種疾病症狀的治療劑的量(治療有效量)給予患者。治療的期望效果包括降低疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，和消退或改善的預後。例如，若一種或多種與癌症有關的症狀是減輕或消除的，包括但不限於，降低(或破壞)癌細胞增殖，減少源自疾病的症狀，提高那些患有疾病的個體的生命品質，降低治療疾病需要的其它藥物的劑量，延遲疾病的進展，和/或延長個體存活，則個體得到成功“治療”。

在本申請中，術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，以及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。

如本文所用，術語“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或情況可以發生但不是必須發生。

在本申請中，術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由……組成”的含義。

在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。

發明詳述

抗原結合蛋白

一方面，本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其可以包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH可包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。

一方面，本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其可以包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH可包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH可包含SEQ ID NO：1、9、12、14和32中任一項所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白的VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含HCDR1，其中該HCDR1可包含 SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列：GYSITSDYA。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含HCDR2，其中該HCDR2可包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列：IX₂X₃SGX₆X₇，其中，X₂為S或T，X₃為S或Y，X₆為A或S，且X₇為P或T。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：4和42中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含HCDR2，其中該HCDR2可包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列：ITSSGST。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含HCDR3，其中該HCDR3可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列：AX₂LX₄X₅X₆X₇YX₉X₁₀AMDY，其中，X₂為R或S，X₄為D或G，X₅為F或T，X₆為D或G，X₇為N或Y，X₉為G或不存在，X₁₀為G或不存在。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該HCDR3可以包含SEQ ID NO：5和43中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含HCDR3，其中該HCDR3可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列：ARLDFGNYGGAMDY。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白還可以包含框架區H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區H-FR1，其中該H-FR1可包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列：X₁VQLQESGPGLVKPSX₁₆X₁₇LSLTCTVX₂₅，其中，X₁為D或Q，X₁₆為E或Q，X₁₇為S或T，且X₂₅為S或T。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：23和35中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區H-FR1，其中該H-FR1可包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列：QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區H-FR2，其中該H-FR2可包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列：WX₂WIRQX₇PGX₁₀X₁₁X₁₂EWX₁₅GY；其中，X₂為I或N，X₇為F或P，X₁₀為K或N，X₁₁為G、R或K，X₁₂為L或V，且，X₁₅為I或M。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該H-FR2可包含SEQ ID NO：24-26和36-37中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區H-FR2，其中該H-FR2可包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列：WIWIRQPPGX₁₀X₁₁LEWIGY；其中，X₁₀為K或N，X₁₁為G或K。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該H-FR2可包含SEQ ID NO：24-26中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區H-FR3，其中該H-FR3可包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列：X₁YNPSLKSRX₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄DTSKNQFX₂₂LX₂₄LX₂₆X₂₇VTX₃₀X₃₁DTATYYC，其中， X₁為R、S或Y，X₁₀為I或V，X₁₁為S或T，X₁₂為F或I，X₁₃為S或T，X₁₄為R或V，X₂₂為F或S，X₂₄為K或Q，X₂₆為S或T，X₂₇為F或S，X₃₀為A或T，且，X₃₁為A或E。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該H-FR3可包含SEQ ID NO：27、38和39中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區H-FR3，其中該H-FR3可包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列：YYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYC。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區H-FR4，其中該H-FR4可包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列：WGQGTX₆VX₈VSS，其中，X₆為L或S，且X₈為I或T。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該H-FR4可包含SEQ ID NO：28、40和41中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區H-FR4，其中該H-FR4可包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列：WGQGTLVTVSS。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區VH，其中該VH可包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列：

，其中X₁為D或 Q，X₁₆為E或Q，X₁₇為S或T，X₂₅為S或T，X₃₆為I或N，X₄₁為F或P，X₄₄為N或K，X₄₅為G、K或R，X₄₆為L或V，X₄₉為I或M，X₅₃為S或T，X₅₄為S或Y，X₅₇為A或S，X₅₈為P或T，X₅₉為R、S或Y，X₆₈為I或V，X₆₉為S或T，X₇₀為F或I，X₇₁為S或T，X₇₂為R或V，X₈₀為F或S，X₈₂為K或Q，X₈₄為S或T，X₈₅為F或S，X₈₈為A或T，X₈₉為A或E，X₉₈為R或S，X₁₀₀為D或G，X₁₀₁為F或T，X₁₀₂為D或G，X₁₀₃為N或Y，X₁₀₅為G或不存在，X₁₀₆為G或不存在，X₁₁₆為L或S，且X₁₁₈為I或T。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區VH，其中該VH可包含SEQ ID NO：1、9、12、14和32中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區VH，其中該VH可包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列：

，其中X₄₄為K或N，且，X₄₅為G或K。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區VH，其中該VH可包含SEQ ID NO：9、12和14中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區可以來自人IgG，例如，人IgG1。在某些情形中，可以對人IgG1的Fc區進行修飾以達到所期望的性質(例如，ADCC KO)。該修飾可以是胺基酸突變。在某些情形中，對IgG1的修飾可以為L234A/L235A，即，按照EU編號，第234位和第235位的胺基酸分別由亮胺酸(L)突變為丙胺酸(A)。在某些情形中，本申請所述抗原結合蛋白的重鏈恆定區可以來自野生型的人IgG1。

例如，本申請所述抗原結合蛋白可以包含重鏈恆定區，其可包含SEQ ID NO：35-36中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述分離的抗原結合蛋白，其可以包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。

本申請所述分離的抗原結合蛋白，其可以包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL可包含SEQ ID NO：2、10、11、13、33和34中任一項所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白的VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含LCDR1，其中該LCDR1可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列：QHVSX₅A，其中，X₅為N或T。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該LCDR1可包含SEQ ID NO：6和52中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含LCDR1，其中該LCDR1可包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列：QHVSTA。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含LCDR2，其中該LCDR2可包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列：SAS。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含LCDR3，其中該LCDR3可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列：QQX₃YX₅X₆PX₈T，其中，X₃為H或Y，X₅為I或S，X₆為L或T，且X₈為W或Y。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該LCDR3可包含SEQ ID NO：8和53中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含LCDR3，其中該LCDR3可包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列：QQHYITPYT。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白還可以包含框架區L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區L-FR1，其中該L-FR1可包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列：DIX₃MTQSX₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃SX₁₅GDRVX₂₀ITCX₂₄AS；其中，X₃為Q或V，X₈為H或P，X₉為K或S，X₁₀為F或S，X₁₁為L或M，X₁₂為F或S，X₁₃為A或T，X₁₅為I或V，X₂₀為S或T，X₂₄為K或R。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該L-FR1可包含SEQ ID NO：15、16、44和45中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區L-FR1，其中該L-FR1可包含SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCX₂₄AS；其中，X₂₄為K或R。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該L-FR1可包含SEQ ID NO：15和16中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區L-FR2，其中該L-FR2可包含SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列：X₁X₂WYQQKPGX₁₀X₁₁PKLLIX₁₇；其中，X₁為L或V，X₂為A或N，X₁₀為K或Q，X₁₁為A或S，且，X₁₇為H或Y。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該L-FR2可包含SEQ ID NO：17、18、46和47中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區L-FR2，其中該L-FR2可包含SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列：X₁X₂WYQQKPGKAPKLLIY；其中，X₁為L或V，且X₂為A或N。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該L-FR2可包含SEQ ID NO：17和18中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區L-FR3，其中該L-FR3可包含SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列：YX₂X₃X₄GVPX8RFX₁₁GX₁₃X₁₄SGTDFTX₂₁TIX₂₄SX₂₆QX₂₈EDX₃₁AX₃₃YYC；其中，X₂為L或R，X₃為Q或Y，X₄為S或T，X₈為D或S，X₁₁為I、S或T，X₁₃為R或S，X₁₄為G或R，X₂₁為F或L，X₂₄為N或S，X₂₆為L或V，X₂₈為A或P，X₃₃為F或L，且X₁₄為T或V。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該L-FR3可包含SEQ ID NO：19-21和48-50中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區L-FR3，其中該L-FR3可包含SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列：YX₂X₃SGVPSRFSGSX₁₄SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC；其中，X₂為L或R，X₃為Q或Y，且X₁₄為G或R。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該L-FR3可包含SEQ ID NO：19-21中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區L-FR4，其中該L-FR4可包含SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列：FGX₃GTKLEIK，其中，X₃為G或Q。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該L-FR4可包括SEQ ID NO：22和51中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含框架區L-FR4，其中該L-FR4可包含SEQ ID NO；22所示的胺基酸序列：FGQGTKLEIK。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區VL，其中該VL可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列：

，其中，X₃為Q或V，X₈為H或P，X₉為K或S， X₁₀為F或S，且，X₁₁為L或M，X₁₂為F或S，X₁₃為A或T，X₁₅為I或V，X₂₀為S或T，X₂₄為K或R，X₃₁為N或T，X₃₃為L或V，X₃₄為A或N，X₄₂為K或Q，X₄₃為A或S，X₄₉為H或Y，X₅₄為L或R，X₅₅為Q或Y，X₅₆為S或T，X₆₀為D或S，X₆₃為I、S或T，X₆₅為S或R，X₆₆為G或R，X₇₃為L或F，X₇₆為S或N，X₇₈為L或V，X₈₀為A或P，X₈₃為F 或L，X₈₅為T或V，X₉₁為H或Y，X₉₃為I或S，X₉₄為L或T，X₉₆為W或Y，且，X₁₀₀為Q或G。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區VL，其中該VL可包含SEQ ID NO：2、10、11、13、33和34中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區VL，其中該VL可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCX₂₄ASQHVSTAX₃₃X₃₄WYQQKPGKAPKLLIYSASYX₅₄X₅₅SGVPSRFSGSX₆₆SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK，其中，X₂₄為K或R，X₃₃為L或V，X₃₄為A或N，X₅₄為L或R，X₅₅為Q或Y，且，X₆₆為G或R。例如，該序列可以是根據IMGT定義規則確定的序列。

例如，該抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區VL，其中該VL可包含SEQ ID NO：10、11和13中任一項所示的胺基酸序列。

本申請所述抗原結合蛋白可以包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區可以包含人輕鏈恆定區序列，例如，可以包含人κ輕鏈恆定區。例如，本申請所述分離的抗原結合蛋白的輕鏈恆定區可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR──HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。

例如，在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR──HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：4和42中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：5和43中任一項所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR──HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1、該HCDR2和該HCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區CDR──HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1、該HCDR2和該HCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR──LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。

例如，在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR──LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：6和52中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：8和53中任一項所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR──LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1、該LCDR2和該LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區CDR──LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1、該LCDR2和該LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、 HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。

例如，在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：4和42中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含SEQ ID NO：5和43中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：6和52中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：8和53中任一項所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該HCDR1、該HCDR2、該HCDR3、該LCDR1、該LCDR2和該LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。

在某些情形中，本申請所述分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該HCDR1、該HCDR2、該HCDR3、該LCDR1、該LCDR2和該LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。

在某些情形中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：13中任一項所示的胺基酸序列。

在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列。

在某些情形中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14中任一項所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13中任一項所示的胺基酸序列。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。

本申請所述分離的抗原結合蛋白還可包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區可以來自人IgG1的恆定區，該輕鏈恆定區可以來自人κ輕鏈恆定區。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列；且，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，且該輕鏈恆定區可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該分離的抗原結合蛋白可稱為HB0030。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列；且，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，且該輕鏈恆定區可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列該分離的抗原結合蛋白可稱為HB0031。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；且，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，且該輕鏈恆定區可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該分離的抗原結合蛋白可稱為HB0032。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列；且，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區可包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，且該輕鏈恆定區可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該分離的抗原結合蛋白可稱為HB0033。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列；且，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，且該輕鏈恆定區可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列該分離的抗原結合蛋白可稱為900424。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：34 所示的胺基酸序列；且，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，且該輕鏈恆定區可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該分離的抗原結合蛋白可稱為900423。

例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該VL可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列；且，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區可包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，且該輕鏈恆定區可包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該分離的抗原結合蛋白可稱為900428。

本申請所述分離的抗原結合蛋白，能夠與參比抗體競爭結合該TIGIT蛋白，其中該參比抗體可包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列；該HCDR2可以包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列；該HCDR3可以包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，該參比抗體的輕鏈可變區可以包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列；該LCDR2可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；該LCDR3可以包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。

本申請所述分離的抗原結合蛋白，能夠與參比抗體競爭結合該TIGIT蛋白，其中該參比抗體可包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列；該HCDR2可以包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；該HCDR3可以包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該參比抗體的輕鏈可變區可以包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列；該LCDR2可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；該LCDR3可以包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。

在本申請中涉及的蛋白質、多肽和/或胺基酸序列，還應理解為至少包含以下的範圍：與該該蛋白質或多肽具備相同或類似功能的變體或同源物。

在本申請中，該變體可以為，在該蛋白質和/或該多肽(例如，本申請所述抗原結合蛋白)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如，該功能性變體可包含已經藉由至少1個，例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。該功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的該蛋白質或該多肽的生物學特性。例如，該功能性變體可保持改變之前的該蛋白質或該多肽的至少60%、70%、80%、90%、或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。例如，該取代可以為保守取代。

在本申請中，該抗原結合蛋白的胺基酸序列的一部分可以與來自特定物種的抗體中相應的胺基酸序列同源，或者屬於特定的類別。例如，抗體的可變區及恆定部分均可以來自一個動物物種(如人)的抗體的可變區及恆定區。在本申請中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽(例如，本申請所述抗原結合蛋白)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。

在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、 G)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何演算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA演算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)，85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST演算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。

本申請所述抗原結合蛋白(例如，TIGIT抗體)能夠特異性結合TIGIT抗原。“特異性結合”TIGIT抗原的抗原結合蛋白(例如，抗體)通常可以以約1nM的KD值或更高親和力(例如，1nM、100pM、10pM、2pM或1pM)結合TIGIT，但不結合缺乏TIGIT序列的其它蛋白。例如，“特異性結合”TIGIT的抗體不結合人CD226、人CD155和人CD112。本申請所述抗原結合蛋白(例如，抗體)能夠特異性結合TIGIT抗原或其標記形式(例如，螢光標記的TIGIT抗原)，但不會結合缺乏TIGIT表位的其它蛋白。抗原結合蛋白(例如，抗體)是否結合 TIGIT抗原可使用本領域中已知的任何測定法確定。本領域中已知測定結合親和力的分析的實例包括表面等離子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如，KinExa或OCTET)。在某些情形中，本申請所述TIGIT抗體還可以與猴和/或鼠的TIGIT交叉反應。例如，藉由流式分析技術和酶聯免疫反應所檢測的。如本文所用，“交叉反應性”是指抗體與來自其它物種的同源蛋白反應的能力。

本申請所述抗原結合蛋白(例如，TIGIT抗體)能夠抑制TIGIT與CD155配體的結合。阻斷實驗可以使用競爭法進行檢測，例如，將該抗原結合蛋白(例如，TIGIT抗體)與抗原(或，可表達抗原的細胞)和抗原的配體(或，表達配體的細胞)混合，根據可檢測標記的的強度(例如，螢光強度或濃度)反應抗原結合蛋白與抗原的配體競爭性結合抗原的能力。例如，如使用流式細胞儀所檢測的，本申請所述抗原結合蛋白(例如，TIGIT抗體)阻斷TIGIT抗原與CD155配體結合的IC50為約0.1μg/ml-0.05μg/ml。

核酸、載體和細胞

在另一個方面，本申請還提供了分離的一種或多種核酸分子。該一種或多種核酸分子可編碼本申請所述抗原結合蛋白。例如，該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該抗原結合蛋白，也可以編碼其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、輕鏈或重鏈中的一種或多種)。

本申請所述核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶連鎖反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。

在本申請中，可以藉由本領域已知的多種方法來製備編碼該抗體、其抗原結合片段的核酸，這些方法包括但不限於，採用限制性片段操作或採用合成性寡核苷酸的重疊延伸PCR，具體操作可參見Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。

在另一個方面，本申請提供了一種或多種載體，其包含本申請所述一種或多種核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中，該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。該表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。在本申請中，適當的啟動子可包括，例如用於SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動子、CMV啟動子及其人工雜合啟動子(如CMV)，其中啟動子的某部分可與其他細胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因啟動子的某部分融合，其可包含或不包含另外的內含子。本申請所述一種或多種核酸分子可以與該表達控制元件可操作地連接。該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體。

在另一個方面，本申請提供了宿主細胞，該宿主細胞可包含本申請所述一種或多種核酸分子和/或本申請所述一種或多種載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含一個或一種本申請所述核酸分子或載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本申請所述核酸分子或載體。例如，可將本申請所述載體引入該宿主細胞中，例如真核細胞，如來自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。可藉由本領域已知的方法將本申請所述載體引入該宿主細胞中，例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。

製備方法

在另一個方面，本申請提供了製備該抗原結合蛋白的方法。該方法可包括，在使得該抗原結合蛋白表達的條件下，培養該本申請所述宿主細胞。例如，可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是本領域普通技術人員所瞭解的。

任何適於產生單株抗體的方法都可用於產生本申請的抗原結合蛋白(例如，抗TIGIT抗體)。例如，可以用連接或天然存在的TIGIT同源二聚體或其片段免疫動物。可以使用合適的免疫接種方法，包括佐劑、免疫刺激劑、重複加強免疫接種，可以使用一種或多種途徑。

任何合適形式的TIGIT都可以作為免疫原(抗原)，用於產生對TIGIT特異的非人抗體，篩選該抗體的生物學活性。激發免疫原可以是全長的成熟人TIGIT，包括天然的同源二聚體，或含單個/多個表位的肽。免疫原可以單獨使用，或與本領域已知的一種或多種免疫原性增強劑組合使用。免疫原可以由天然來源純化，或者在遺傳修飾的細胞中產生。編碼免疫原的DNA在來源上可以是基因組或非基因組的(例如cDNA)。可以使用合適的遺傳載體表達編碼免疫原的DNA，該載體包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、杆狀病毒載體、質料和非病毒載體。

生產本申請的抗人TIGIT抗體的示例性方法描述於實施例1。

人源化抗體可以選自任何種類的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本申請中，抗體是IgG抗體，使用IgG1亞型。可以藉由用下文實施例中描述的生物學測定篩選抗體實現必需恆定結構域序列的優化，以產生所需生物學活性。同樣，任一類輕鏈都可以在本文的化合物和方法中使用。具體地說，κ、λ鏈或其變體在本申請的化合物和方法中是可以用的。

人源化本申請的抗人TIGIT抗體的示例性方法描述於實施例2。

本申請的抗原結合蛋白或其片段的DNA分子的序列可以用一般技術，比如利用PCR擴增或基因組文庫篩選等方法獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。

一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其導入載體，再轉入細胞，然後藉由一般方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。

此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，藉由先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。然後可將該核酸分子引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。

本申請還涉及包含上述的適當核酸分子以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。例如，動物細胞可以包括(但並不限於)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293細胞。

本申請中該用重組DNA轉化宿主細胞的步驟可用本領域熟知的技術進行。獲得的轉化子可用一般方法培養，轉化子表達本申請的核酸分子所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，用一般培養基在合適的條件下培養。通常，在適合本申請抗原結合蛋白表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞。然後用一般的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的一般分離純化手段純化得到本申請的抗原結合蛋白。

所得單株抗體可用一般手段來鑒定。比如，單株抗體的結合特異性可用免疫沉澱或體外結合試驗(如流式細胞分選技術(FACS)、放射性免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))來測定。

醫藥組成物

另一方面，本申請還提供了一種組成物。在某些情形中，該組成物可以是醫藥組成物，它含有本申請的抗原結合蛋白或其融合蛋白或其ADC或相應的CAR-T細胞，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常可以為約5-8，例如，pH可以為約6-8，pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的醫藥組成物可以藉由一般途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：瘤內、腹膜內、靜脈內、或局部給藥。

本申請所述抗原結合蛋白也可以是由核苷酸序列在細胞內表達用於的細胞治療，比如，該抗體用於嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)等。

本申請所述醫藥組成物可直接用於結合TIGIT蛋白分子，因而可用於預防和治療TIGIT相關的疾病。此外，還可同時使用其他治療劑。

本申請的醫藥組成物可以含有安全有效量(如0.001-99wt%、0.01-90wt%、或0.1-80wt%)的本申請所述抗原結合蛋白以及藥學上可接受的佐劑(可包括載體或賦形劑)。這類載體可以包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本申請所述醫藥組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液藉由一般方法進行製備。醫藥組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重至約5毫克/千克體重。此外，本申請所述抗原結合蛋白還可與其他治療劑一起使用。

本文所述抗原結合蛋白或醫藥組成物可以符合良好醫療實踐的方式配製、給藥和施用。在此情形下的考慮因素包括所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、單個患者的臨床病狀、病症的病因、藥劑遞送部位、施用方法、施用排程和醫學從業者已知的其他因素。治療劑(例如，抗TIGIT抗體)無需但視需要地與一種或多種當前用來預防或治療所考慮的病症的藥劑一起配製和/或同時施用。此類其他藥劑的有效量取決於製劑中存在的治療劑(例如，抗TIGIT抗體)的量、病症或治療的類型以及以上論述的其他因素。這些藥劑通常可以憑經驗/臨床上確定為適當的任何劑量且藉由憑經驗/臨床上確定為適當的任何途徑加以使用。與單個治療相比，可減少組合治療中施用的抗體的劑量。藉由一般技術易於監測此療法的進展。

方法和用途

另一方面，本申請提供了該抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物在製備藥物中的用途。該藥物用於預防、緩解和/或治療TIGIT相關的疾病。在某些情形中，該TIGIT相關的疾病可以是T細胞功能障礙性病症。T細胞功能障礙體現在T細胞耗盡，是藉由增強NK細胞和啟動T細胞，增強機體免疫活性實現對疾病的治療或延遲或緩解。例如，該TIGIT相關的疾病可以是腫瘤、癌症或感染性病症。例如，該TIGIT相關的疾病可以是CD155陽性或PVR陽性的腫瘤、癌症、免疫性疾病或感染性病症，包括腫瘤、癌症、免疫性疾病或感染性病症等。在某些情形中，該腫瘤可以選自下組：乳腺癌、結腸癌、肝癌、淋巴瘤、軟骨肉瘤、多發性骨髓瘤、肺癌、腎癌、黑色素瘤、T淋巴瘤、胰腺癌。例如，該腫瘤為結腸癌。例如，本申請所述抗原結合蛋白可以抑制選自下組的腫瘤動物模型的腫瘤生長：乳腺癌、結腸癌、肝癌、淋巴瘤、軟骨肉瘤、多發性骨髓瘤、肺癌、腎癌、黑色素瘤、T淋巴瘤和胰腺癌。

本申請的抗原結合蛋白可以抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。在某些實施方式中，該腫瘤包含結腸癌。在某些實施方式中，該腫瘤或癌症為TIGIT表達異常的腫瘤或癌症。本申請還提供了以下描述的檢測生物樣品中TIGIT表達的方法。在某些情形中，該方法包括使生物樣品與本申請所述抗原結合蛋白在容許該抗原結合蛋白結合TIGIT的條件下接觸，和檢測在該抗原結合蛋白與TIGIT之間是否形成複合物。例如，該腫瘤或癌症為與非腫瘤或癌症樣品相比，TIGIT表達升高的腫瘤或癌症。此類方法可以是體外或體內方法。本申請所述抗原結合蛋白可用於例如免疫測定中，該免疫測定包括例如免疫組織化學 (IHC)、免疫螢光(IF)、免疫印跡(例如，蛋白質印跡)、流式細胞術(例如，FAGS)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)。在某些情形中，例如當TIGIT為用於選擇患者的生物標記時，該抗原結合蛋白用來選擇適於用本申請所述抗原結合蛋白和/或融合蛋白進行的療法的受試者。本申請還提供了該抗原結合蛋白在診斷患有病症(例如，癌症或免疫功能失調)的受試者的方法中的用途，該方法包括：藉由使樣品與本申請的該抗原結合蛋白接觸並檢測結合的該抗原結合蛋白和/或融合蛋白的存在來確定獲自受試者的樣品中TIGIT的存在或表達水準。

例如，在結腸癌小鼠模型中，本申請所述抗原結合蛋白(例如，TIGIT抗體)能夠減緩腫瘤生長。

本申請的抗原結合蛋白可用于檢測應用，例如用於檢測樣本，從而提供診斷資訊。

在本申請中，所採用的樣本(樣品)包括細胞、組織樣本和活檢標本。本申請使用的術語“活檢”應包括本領域技術人員已知的所有種類的活檢。因此本申請中使用的活檢可以包括例如藉由內窺鏡方法或器官的穿刺或針刺活檢製備的組織樣本。

本申請中使用的樣本包括固定的或保存的細胞或組織樣本。

本申請還提供了一種指含有本申請的抗原結合蛋白的試劑盒。在某些情形中，該試劑盒還可以包括容器、使用說明書、緩衝劑等。例如，本申請的原結合蛋白可以固定於檢測板。

另一方面，本申請還提供了如下實施方案：

分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。

根據實施方案1該分離的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL中的至少一個CDR，該VL包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。

根據實施方案1及2中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：

1.能夠以1×10^-10M或更低的KD值結合TIGIT蛋白，其中該KD值藉由表面等離子體共振法測定；

2.在FACS測定中，能夠阻斷CD155與TIGIT的結合；和

3.能夠抑制腫瘤生長和/或腫瘤細胞增殖。

4.根據實施方案1至3中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其與參比抗體競爭結合該TIGIT蛋白，其中該參比抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該參比抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列；該HCDR2包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列；該HCDR3包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，該參比抗體的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列；該LCDR2包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；該LCDR3包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。

5.根據實施方案1至4中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。

6.根據實施方案5所述分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)₂，scFv，di-scFv和/或dAb。

7.根據實施方案5至7中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其中該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。

8.根據實施方案1至7中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VH，其中該VH包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。

9.根據實施方案1至8中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VH，其中該VH包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。

10.根據實施方案9所述分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR2包含SEQ ID NO：4和42中任一項所示的胺基酸序列。

11.根據實施方案1至10中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VH，其中該VH包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。

12.根據實施方案11所述分離的抗原結合蛋白，其中該HCDR3包含SEQ ID NO：5和43所示的胺基酸序列。

13.根據實施方案1至13中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該分離的抗原結合蛋白包含選自下述的任意一組胺基酸序列：

(1)HCDR1：SEQ ID NO：3，HCDR2：SEQ ID NO：4，HCDR3：SEQ ID NO：5；和

(2)HCDR1：SEQ ID NO：3，HCDR2：SEQ ID NO：42，HCDR3：SEQ ID NO：43。

14.根據實施方案1至13中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VL，其中該VL包含LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列。

15.根據實施方案14所述分離的抗原結合蛋白該LCDR1包含SEQ ID NO：6和52中任一項所示的胺基酸序列。

16.根據實施方案1至15中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VL，其中該VL包含LCDR2，該LCDR2包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。

17.根據實施方案1至16中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VL，其中該VL包含LCDR3，該LCDR3包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。

18.根據實施方案17所述分離的抗原結合蛋白，其中該LCDR3包含SEQ ID NO：8和53中任一項所示的胺基酸序列。

19.根據實施方案1至18中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該分離的抗原結合蛋白包含選自下述的任意一組胺基酸序列：

(1)LCDR1：SEQ ID NO：6，LCDR2：SEQ ID NO：7，和，LCDR3：SEQ ID NO：8；和

(2)LCDR1：SEQ ID NO：52，LCDR2：SEQ ID NO：7，和，LCDR3：SEQ ID NO：53。

20.根據實施方案1至19中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VL，且該VL包括框架區L-FR1，該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列。

21.根據實施方案20所述分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR1包含SEQ ID NO：15、16、44和45中任一項所示的胺基酸序列。

22.根據實施方案1至21中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VL，且該VL包括框架區L-FR2，其中該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。

23.根據實施方案22所述分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR2包含SEQ ID NO：17、18、46和47中任一項所示的胺基酸序列。

24.根據實施方案1至23中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VL，且該VL包括框架區L-FR3，該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列。

25.根據實施方案24所述分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR3包含SEQ ID NO：19、20、21、48、49和50中任一項所示的胺基酸序列。

26.根據實施方案1至25中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VL，且該VL包括框架區L-FR4，其中該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列。

27.跟據實施方案26所述分離的抗原結合蛋白，其中該L-FR4包含SEQ ID NO：22和51中任一項所示的胺基酸序列。

28.根據實施方案1至27中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VL，其中該VL包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。

29.根據實施方案28所述分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO：2、10、11、13、33和34中任一項所示的胺基酸序列。

30.根據實施方案1至29中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包括抗體輕鏈恆定區，且該抗體輕鏈恆定區來自人κ輕鏈恆定區.

31.根據實施方案30所述分離的抗原結合蛋白，其中該人κ輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。

32.根據實施方案1至31中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VH，其中該VH包括框架區H-FR1，該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。

33.根據實施方案32所述分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR1包含 SEQ ID NO：23和35中任一項所示的胺基酸序列。

34.根據實施方案1至33中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VH，其中該VH包括框架區H-FR2，其中該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。

35.根據實施方案34所述分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR2包含SEQ ID NO：24-26、36和37中任一項所示的胺基酸序列。

36.根據實施方案1至35中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VH，其中該VH包括框架區H-FR3，其中該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。

37.根據實施方案36該分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR3包含SEQ ID NO：27、38和39中任一項所示的胺基酸序列。

38.根據實施方案1至37中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VH，其中該VH包括框架區H-FR4，其中該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。

39.根據實施方案38所述分離的抗原結合蛋白，其中該H-FR4包含SEQ ID NO：28、40和41中任一項所示的胺基酸序列。

40.根據實施方案1至39中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含VH，其中該VH包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。

41.根據實施方案40該分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NO：1、9、12、14和32中任一項所示的胺基酸序列。

42.根據實施方案1至41中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈恆定區，且該抗體重鏈恆定區包括人IgG恆定區。

43.根據實施方案1至42中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區包括人IgG1恆定區，且人IgG1恆定區包含SEQ ID NO：29-30中任一項所示的胺基酸序列。

44.根據實施方案1至43中任一項所述分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，且該分離的抗原結合蛋白包含選自下述的任意一組胺基酸序列：

(1)VH：SEQ ID NO：9，VL：SEQ ID NO：10，

(2)VH：SEQ ID NO：9，VL：SEQ ID NO：11，

(3)VH：SEQ ID NO：12，VL：SEQ ID NO：13，

(4)VH：SEQ ID NO：14，VL：SEQ ID NO：11，

(5)VH：SEQ ID NO：1，VL：SEQ ID NO：2，

(6)VH：SEQ ID NO：32，VL：SEQ ID NO：34，和

(7)VH：SEQ ID NO：32，VL：SEQ ID NO：33。

45.分離的一種或多種核酸分子，其編碼實施方案1至44中任一項所述分離的抗原結合蛋白。

46.載體，其包含根據實施方案45所述核酸分子。

47.細胞，其包含根據實施方案45所述核酸分子或根據實施方案46該載體。

48.多肽，其包含實施方案1至45中任一項所述分離的抗原結合蛋白。

49.免疫綴合物，其包含實施方案1至45中任一項所述分離的抗原結合蛋白或實施方案48該多肽。

50.製備實施方案1至45中任一項所述分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得實施方案1至45中任一項所述分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養根據實施方案47該細胞。

51.醫藥組成物，其包含實施方案1至44中任一項所述分離的抗原結合蛋白、實施方案45所述核酸分子、實施方案46所述載體、實施方案47所述細胞、實施方案48所述多肽和/或實施方案49所述免疫綴合物，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。

52.實施方案1至44中任一項所述分離的抗原結合蛋白、實施方案45所述核酸分子、實施方案46所述載體、實施方案47所述細胞、實施方案48所述多肽、實施方案49所述免疫綴合物和/或實施方案51所述醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療TIGIT相關疾病。

53.根據實施方案52所述用途，該TIGIT相關疾病為T細胞功能障礙性病症。

54.根據實施方案52至53中任一項所述用途，該TIGIT相關疾病為腫瘤。

55.根據實施方案54所述用途，該腫瘤為實體瘤。

56.根據實施方案54至55中任一項所述用途，該腫瘤為結腸癌。

57.抑制CD155與TIGIT結合的方法，該方法包括施用實施方案1-44中任一項所述分離的抗原結合蛋白。

58.預防、緩解或治療TIGIT相關疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者施用實施方案1至44中任一項所述分離的抗原結合蛋白、實施方案45所述核酸分子、實施方案46所述載體、實施方案47所述細胞、實施方案48所述多肽、實施方案49所述免疫綴合物和/或實施方案51所述醫藥組成物。

59.根據實施方案58所述方法，該TIGIT相關疾病為T細胞功能障礙性病症。

60.根據實施方案58至59中任一項所述方法，該TIGIT相關疾病為腫瘤。

61.根據實施方案60所述方法，該腫瘤為實體瘤。

62.根據實施方案60至61中任一項所述方法，該腫瘤為結腸癌。

63.實施方案1至44中任一項所述分離的抗原結合蛋白、實施方案45所述核酸分子、實施方案46所述載體、實施方案47所述細胞、實施方案48所述多肽、實施方案49所述免疫綴合物和/或實施方案51所述醫藥組成物，其用於預防、緩解或治療TIGIT相關疾病。

64.根據實施方案63該分離的抗原結合蛋白、核酸分子、載體、細胞、多肽、免疫綴合物和/或醫藥組成物，該TIGIT相關疾病為T細胞功能障礙性病症。

65.根據實施方案64所述分離的抗原結合蛋白、核酸分子、載體、細胞、多肽、免疫綴合物和/或醫藥組成物，該TIGIT相關疾病為腫瘤。

66.根據實施方案64至65所述分離的抗原結合蛋白、核酸分子、載體、細胞、多肽、免疫綴合物和/或醫藥組成物，該腫瘤為實體瘤。

67.根據實施方案66所述分離的抗原結合蛋白、核酸分子、載體、細胞、多肽、免疫綴合物和/或醫藥組成物，該腫瘤為結腸癌。

不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的抗原結合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本申請的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，例如Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中該條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。

實施例

實施例1 抗人TIGIT的小鼠單株抗體──原始抗體的製備方法

1.1 製備產生鼠源單株抗體的融合瘤細胞

製備鼠源單株抗體的方法採用Kohler和Milstein 1975年發明的融合瘤製備技術(Nature，1975，256：495-497)。首先將人TIGIT帶有鼠Fc標籤蛋白(ACRO，#TIT-H5253)與弗氏佐劑乳化，然後對BALB/c、CD1、C57BL/6每個品系各5隻小鼠進行多點皮下免疫。三輪免疫後取血清用ELISA法檢測效價，FACS檢測結合活性及功能活性，挑選最佳小鼠取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。經過HAT篩選融合瘤多株細胞，採用ELISA、FACS方法，篩選出特異性結合人TIGIT且可以阻斷TIGIT-CD155結合的多株細胞株後進行單株化，再次使用ELISA、FACS方法篩選特異性結合的單株細胞株，並檢測了與猴、小鼠TIGIT結合力，藉由FACS篩選出阻斷TIGIT-CD155與TIGIT-CD122結合的單株抗體，後續進行細胞功能學活性檢測，並對篩選出的單株細胞株進行親和力(Biacore)篩選，最終得到表達人TIGIT抗體的單株融合瘤細胞株進行序列分析，篩選資料列舉見表1。

表1.融合瘤篩選數據

經過高通量篩選，最終得到的單株融合瘤細胞株具有高親和力，可以與人和猴都具有結合活性，對TIGIT的兩個配體CD155及CD122同時具有阻斷功能，並且具有生物活性。將以上表1中的融合瘤細胞株進行人源化改造。

實施例2 抗TIGIT抗體可變區基因序列選殖以及人源化

2.1 融合瘤細胞中抗體的可變區基因選殖

基於TAKARA的5’RACE技術原理，選殖出由融合瘤細胞株表達的小鼠抗體可變區的cDNA序列。簡言之，用SMARTer 5’RACE合成試劑盒(TAKARA，#634859)按說明書合成重鏈和輕鏈的可變區基因特異性cDNA。用PCR引子修飾cDNA序列的5’和3’端，該引子設計成為分別在重鏈和輕鏈可變區cDNA上增加合適的前導序列，使所得PCR產物能夠藉由無縫選殖的方法轉移到到現有重組抗體表達的重鏈載體pHB-Fc和輕鏈載體pHB-C κ上。pHB-Fc表達載體上含有人IgG1重鏈恆定區基因序列，其中CH₂上帶有抗體ADCC knock out(KO)效應的L234A和L235A(Eu編碼)突變；pHB-C κ載體上含有人κ輕鏈恆定區基因序列。將重鏈和輕鏈可變區PCR擴增產物藉由In-fusion選殖試劑(TAKARA,#639650)轉移到表達載體上，並轉化到E.coli DH5 α大腸桿菌感受態細胞(益生生技，# FYE607-80VL)中。藉由挑選單株菌落進行Sanger測序，經分析獲得抗體可變區序列。其中B3/29F6表達的抗TIGIT抗體可變區序列如下：

B3/29F6 VH SEQ ID NO：1

B3/29F6 VL SEQ ID NO：2

其中，底線區為CDRs(按照IMGT定義，序列分別如下)：

表2.鼠源抗TIGIT抗體CDR序列

2.2 IgG1野生型嵌合表達載體構建

IgG1野生型為嵌合抗體和ADCC KO型嵌合抗體共用相同的輕鏈載體，不同之處在於所用含有人重鏈恆定區序列的載體上重鏈CH₂的234和235位胺基酸，ADCC KO型為A234/A235，野生型為L234/L235。IgG1野生型嵌合重鏈表達載體的方法與2.1中該表達載體構建方法原理相同，即藉由含有前導序列的引子PCR擴增重鏈可變區基因，再用無縫連接方法轉移到含有人重鏈恆定區序列(CH2為L234/L235)的載體上，完成IgG1野生型嵌合表達載體的構建。

2.3 嵌合抗體的表達

2.1和2.2中所得表達載體經過大腸桿菌擴增，用去內毒素質粒抽提試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，# DP117)製備足量質粒，用於暫態轉染表達嵌合抗體。表達所用的宿主細胞為CHO-S細胞(賽默飛，#R80007)。藉由將製備所得的兩種重鏈載體分別和輕鏈載體一起，與聚醚醯亞胺(PEI，Polysciences，# 24765-1)混合形成脂質體複合物後，轉染CHO-S細胞，放入培養箱中培養5-7天。離心收集細胞培養液上清，藉由Protein A親和層析管柱純化得到 ADCC KO型人鼠嵌合抗體(編號為900424)和IgG1野生型人鼠嵌合抗體(蛋白編號900445)。

按照上述方法得到的嵌合抗體VH和VH序列分別如下：

900423和900428 VH SEQ ID NO：32

900424 VH SEQ ID NO：1

900424 VL SEQ ID NO：2

900423 VL SEQ ID NO：34

900428 VL SEQ ID NO：33

其中，900424的重鏈恆定區胺基酸序列為SEQ ID NO：30所示，900423的重鏈恆定區胺基酸序列為SEQ ID NO：30所示，900428的重鏈恆定區胺基酸為SEQ ID NO：30所示。輕鏈恆定區均為人κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO：31)。

2.4 鼠源抗人TIGIT抗體的人源化──人源化抗體的製備方法

抗體的人源化採用以下方法。將抗體的可變區序列與NCBI IgBlast資料庫中的可用序列比較，藉由鑒定和分析，最終確定了適合在其上構建CDR移植重鏈和輕鏈的人源構架區(FR區)。

改造時，根據人抗體FR區保守的胺基酸殘基以及抗體FR區中重要的胺基酸殘基，設計改造位點，對嵌合抗體的重輕鏈的可變區分別進行人源化突變設計，利用PCR技術擴增並構建人源化點突變抗體表達質粒。將人源化點突變抗體表達質粒分別經CHO-S細胞表達，純化後得到人源化抗體蛋白。利用ELISA，Biacore和流式細胞術等檢測方法，對人源化抗體的受體結合能力，功能抑制活性和ADCC效應等指標進行篩選，獲得了四個性能優異的人源化抗TIGIT抗體。所獲得人源化抗TIGIT抗體的VH和VL序列下所示：

900461和900464 VH SEQ ID NO：9

900461 VL SEQ ID NO：10

900464和900476 VL SEQ ID NO：11

900466 VH SEQ ID NO：12

900466 VL SEQ ID NO：13

900476VH SEQ ID NO：14

其中，底線區為CDRs(按照IMGT定義)，900461，900464，900466和900476分別為四個人源化抗體蛋白編號，對應項目編號為HB0030、HB0031、HB0032、HB0033。

其中，HB0030的重鏈恆定區胺基酸序列為SEQ ID NO：29所示，HB0031的重鏈恆定區胺基酸序列為SEQ ID NO：29所示，HB0032的重鏈恆定區胺基酸序列為SEQ ID NO：29所示，HB0033的重鏈恆定區胺基酸序列為SEQ ID NO：29所示。輕鏈恆定區均為人κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO；31)。

實施例3 嵌合抗體及人源化抗體的檢測

3.1 測試TIGIT抗體對表達人TIGIT的細胞結合活性

嵌合抗體900324、900423、900424、900428，人源化抗體HB0030、HB0031、HB0032、HB0033與表達人TIGIT的細胞(CHOK1-huTIGIT-2A3，華博生物)的結合活性檢測。

所有嵌合抗體、人源化抗體均用含1%BSA的PBS溶液(1%BSA/PBS)稀釋至20μg/ml，每孔20μL加入96孔U型板中，同步設定陰性對照(只加1%BSA/PBS)。取對數生長期內表達人TIGIT的細胞(CHOK1-huTIGIT-2A3，華博生物)懸液，離心(1000rpm×5min)棄培養液，用1%BSA/PBS重新懸浮至活細胞密度為1×10⁶/mL，每孔20μL(2×10⁴個細胞)加入已有抗TIGIT抗體的96孔U型板中室溫反應30min。將反應後的96孔U型板用1%BSA/PBS重新懸浮，離心(300g×3min)棄上層液，如此洗滌1遍，加入1：200稀釋的PE-羊抗人-Fc(Jackson ImmunoResearch，#109-115-098)，室溫避光反應15min；將反應後的96孔U型板用1%BSA/PBS重新懸浮，離心(300g×3min)棄上層液，如此洗滌3遍，最終用每孔100μL 1%BSA/PBS重新懸浮，用流式細胞儀(BD，#Canto II)檢測PE通道的螢光強度。

嵌合抗體結合活力結果見圖1及表3，人源化抗體結合活力結果見圖2及表4，其中900324為CHO細胞暫態表達的來自基因泰克公司的抗人TIGIT抗體Tiragolumab，其輕重鏈可變區序列與專利申請WO2015009856A2中的抗體10A7的序列相同。結果表明嵌合抗體與人源化抗體均與表達人TIGIT的細胞(CHOK1- huTIGIT-2A3，華博生物)有很好的親和力，且親和力相當。

表3.抗TIGIT嵌合抗體對人TIGIT結合活性

表4.抗TIGIT人源化抗體對人TIGIT結合活性

3.2 測試TIGIT抗體阻斷TIGIT抗原和TIGIT分子結合的實驗(競爭法)

將抗原huCD155-moFc(ACROBiosystems，#CD5-H5254)用含1%BSA的PBS溶液(1%BSA/PBS)稀釋至40μg/ml，每孔10μL加入96孔U型板中，與系列稀釋的抗TIGIT抗體按體積比1：1混合均勻，同步設定陽性對照(只加CD155-moFc)。取對數生長期內表達人TIGIT的細胞(CHOK1-huTIGIT-2A3，華博生物)懸液，離心(1000rpm×5min)棄培養液，用1%BSA/PBS重新懸浮至活細胞密度為1×10⁶/mL，每孔20μL(2×10⁴個細胞)加入CD155-moFc與抗TIGIT抗體混勻的96孔U型板中室溫反應30min。將反應後的96孔U型板用1%BSA/PBS重新懸浮，離心(300g×3min)棄上層液，如此洗滌1遍，加入1：300稀釋的Alexa488-羊抗鼠-Fc(Jackson ImmunoResearch，#115-545-071)，室溫避光反應15min；將反應後的96孔U型板用1%BSA/PBS重新懸浮，離心(300g×3min)棄上層液，如此洗滌3遍，最終用每孔100μL 1%BSA/PBS重新懸浮，用流式細胞儀(BD，#Canto II)檢測FITC通道的螢光強度。

嵌合抗體結合活力結果見圖3及表5，人源化抗體結合活力結果見圖4及表6。結果表明嵌合抗體和人源化抗體對人的CD155具有顯著的阻斷作用，且阻斷作用力相當。

表5.抗TIGIT嵌合抗體對人TIGIT與其配體CD155結合的阻斷活性

表6.抗TIGIT人源化抗體對人TIGIT與其配體CD155結合的阻斷活性

3.3 人源化單株抗體的親和性檢測

本試驗使用SPR方法測定抗原-抗體結合動力學及親和力。採用BIOCORE(GE，#Biacore 8K)。Sereis S Sensor Chip ProteinA晶片(GE，#29-1275-56)室溫平衡20~30min，將晶片裝入儀器。用平衡緩衝液將抗體樣品稀釋至實驗工作濃度，2~8℃密封備用。用平衡緩衝液HBS-EP(10x)(GE，#BR-1006-69)稀釋抗原，組胺酸標記(His-Tag)的人TIGIT蛋白(huTIGIT，ACRO Biosystems，#TIT-H52H3)，稀釋抗原20nM起始2.5倍稀釋度5個濃度梯度，並設置2個零濃度(即平衡緩衝液)和最低濃度重複。pH1.5甘胺酸溶液(GE，#BR100354)再生晶片。採用捕獲法多迴圈動力學程式分析樣品，選用對應的分析程式對資料分析，確認無明顯reference binding，選用Kinetics，1：1binding modle，擬合分析，獲得樣品的動力學參數。

檢測結果如表7所示。與huTIGIT的親和力常數(KD(M))結果顯示，本申請的人源化單株抗體HB0030的親和力接近10^-11數量級，具有極強的親和力。

表7.人源化Mab-TIGIT抗體與hu TIGIT親和力檢測結果

實施例4 動物體內藥效試驗

本實驗研究了抗人TIGIT抗體HB0030、HB0031、HB0032、HB0033在免疫檢測點人源化小鼠BALB/c-hPD1/hTIGIT皮下接種CT26.WT結腸癌腫瘤模型中的藥效。

本實驗取用小鼠結腸癌細胞CT26.WT細胞，收集對數生長期的CT26.WT細胞，去除培養液並用PBS洗兩次後接種(荷瘤前、荷瘤後CT26.WT細胞存活率分別為：98.57%及98.28%)，接種量：5×10⁵/100μL/隻。接種後第11天，平均腫瘤體積達到94.02mm³時，小鼠根據腫瘤體積隨機分組，每組8隻。分組當天定義為D0天，並於D0、D3、D7、D10、D14、D17進行給藥，開始給藥後，於D0、D2、D4、D6、D8、D10、D13、D15、D17、D20、D23觀測腫瘤大小並稱量小鼠體重。瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm³)=0.5×(腫瘤長徑×腫瘤短徑²)。結果如圖5所示。

觀察圖5實驗結果，可見本申請的抗TIGIT人源化單株抗體HB0030、HB0031、HB0032、HB0033在單獨給藥10mg/kg時具有明顯的腫瘤抑制效果。

進一步的研究了HB0030與對照抗體Tiragolumab在10mg/kg的劑量下，對免疫檢測點人源化小鼠BALB/c-hPD1/hTIGIT皮下接種CT26.WT結腸癌腫瘤模型中的藥效。

本實驗取用小鼠結腸癌細胞CT26細胞，收集對數生長期的CT26細胞，去除培養液並用PBS洗兩次後接種(荷瘤前、荷瘤後CT26細胞存活率分別為：98.51%及97.250%)，接種量：5×10⁵/100μL/隻，接種第12天，平均腫瘤體積達到80.33mm³時，小鼠根據腫瘤體積隨機分組，每組6隻。分組當天定義為D0天，並於D0、D3、D7、D10、D14、D17進行給藥，開始給藥後，於D0、D2、D4、D6、D8、D10、D13、D15、D17、D20、D23觀測腫瘤大小並稱量小鼠體重。瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm³)=0.5×(腫瘤長徑×腫瘤短徑²)。結果如圖6所示。

觀察圖6結果可知，本申請的抗TIGIT抗體HB0030與對照抗體Tiragolumab比較，表現出更好的腫瘤抑制效果。

本研究中所有組小鼠治在接種後24天，小鼠體重均無明顯變化。

實施例5 抗TIGIT抗體HB0030在動物體內藥效實驗

為評估HB0030分子ADCC作用在體內藥效的作用，其中900541為Fc區經過L234A/L235A突變的不具有ADCC作用的HB0030，另外兩個為HB0030不同批次的樣品。本實驗以生理鹽水為陰性對照評價了以上三個藥物在小鼠結腸癌細胞CT26.WT移植人源化小鼠BALB/c-hPD1/hTIGIT中的抗腫瘤作用。

BALB/c-hPD1/hTIGIT小鼠(接種CT26.WT細胞)分別腹腔注射3mg/kg測試藥，每週2次，共給藥6次。與對照組G1(生理鹽水)相比：根據腫瘤體積結果(TIGtv)和體重結果(TIGtw)分析，900541(G2：anti-TIGIT-1，3 mpk)抑瘤率分別為TGItv 40.26%、TGItw 32.60%；抗TIGIT抗體HB0030(G3：anti-TIGIT-2，3 mpk)抑瘤率分別為TGItv 90.68%、TGItw 86.85%，對腫瘤生長具有顯著抑制作用(G3 VS G1，***Ptv<0.001,***Ptw<0.001)；抗TIGIT抗體HB0030(G4：anti-TIGIT-3，3 mpk)抑瘤率分別為TGItv 82.38%、TGItw 77.85%，對腫瘤生長具有顯著抑制作用(G4 VS G1，***Ptv<0.001,***Ptw<0.001)。此外，(G3：anti-TIGIT-2，3 mpk) 與HB0030(G4：anti-TIGIT-3，3 mpk)之間腫瘤抑制作用無明顯差別。(G4 VS G2，Ptv>0.263,Ptv>0.346)

綜上所述，在當前的測試系統下，BALB/c-hPD1/hTIGIT小鼠(接種CT26.WT細胞)分別腹腔注射3mg/kg測試藥，每週2次，共給藥6次，與生理鹽水對照組相比，G2的900541、G3和G4的HB0030(3 mpk)均表現出明顯的腫瘤抑制作用。

<110> 華博生物醫藥技術(上海)有限公司(HUABO BIOPHARM(SHANGHAI)CO.,LTD.) 上海華奧泰生物藥業股份有限公司(SHANGHAI HUAOTA BIOPHARMACEUTICAL CO.,LTD.)

<120> 抗TIGIT的抗體、其製備方法和應用

<130> 0151-PA-003

<150> CN2020103876304

<151> 2020-05-09

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<170> PatentIn version 3.5

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<223> Xaa=Ala或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (98)..(98)

<223> Xaa-Arg或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> Xaa=Asp或Gly

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> Xaa=Phe或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (102)..(102)

<223> Xaa=Asp或Gly

<220>

<221> misc_feature

<222> (103)..(103)

<223> Xaa=Asn或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (105)..(105)

<223> Xaa=Gly或不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (106)..(106)

<223> Xaa=Gly或不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (116)..(116)

<223> Xaa=Leu或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (118)..(118)

<223> Xaa=Ile或Thr

<400> 55

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 900424、HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 HCDR2；900423和900428 HCDR2

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=Ser或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa=Ala或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa=Pro或Thr

<400> 56

<210> 57

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 900423和900428 HCDR3；900424、HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 HCDR3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa=Arg或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa=Asp或Gly

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa=Phe或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa=Asp或Gly

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa=Ash或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa=Gly或不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa=Gly或不存在

<400> 57

<210> 58

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 H-FR1；900423、900424和900428 H-FR1

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa=Asp或Gln

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> Xaa=Glu或Gln

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> Xaa=Ser或Thr

<400> 58

<210> 59

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030和HB0031 H-FR2；HB0032 H-FR2；HB0033 H-FR2

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa=Lys或Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa=Gly或Lys

<400> 59

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030和HB0031 H-FR2；HB0032 H-FR2；HB0033 H-FR2； 900424 H-FR2；900423和900428 H-FR2

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa=Ile或Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa=Phe或Pro

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa=Lys或Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa=Gly、Lys或Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa=Leu或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> Xaa=Ile或Met

<400> 60

<210> 61

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 H-FR3；900423和900428 H-FR3； 900424 H-FR3

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa=Arg、Ser或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa=Ile或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa=Phe或Ile

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> Xaa=Arg或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> Xaa=Phe或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> Xaa=Lys或Gln

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> Xaa=Phe或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> Xaa=Ala或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> Xaa=Ala或Glu

<400> 61

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 H-FR4；900424 H-FR4； 900423和900428 H-FR4

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa=Leu或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa=Ile或Thr

<400> 62

<210> 63

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030 VL；HB0031和HB0033 VL；HB0032 VL

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> Xaa=Lys或Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> Xaa=Leu或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> Xaa=Ala或Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(54)

<223> Xaa=Leu或Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa=Gln或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (66)..(66)

<223> Xaa=Gly或Arg

<400> 63

<210> 64

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 900424 VL；HB0030 VL；HB0031和HB0033 VL；HB0032 VL；900423VL；900428VL

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=Gln或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa=His或Pro

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa=Lys或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa=Phe或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa=Leu或Met

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa=Phe或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa=Ala或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> Xaa=Ile或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> Xaa=Lys或Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> Xaa=Asn或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> Xaa=Leu或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> Xaa=Ala或Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> Xaa=Lys或Gln

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(43)

<223> Xaa=Ala或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(49)

<223> Xaa=His或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(54)

<223> Xaa=Leu或Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa=Gln或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(60)

<223> Xaa=Asp或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(63)

<223> Xaa=Ile、Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(65)

<223> Xaa=Arg或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (66)..(66)

<223> Xaa-Gly或Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> Xaa=Phe或Leu

<220>

<221> misc_feature

<222> (76)..(76)

<223> Xaa=Asn或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (78)..(78)

<223> Xaa=Leu或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(80)

<223> Xaa=Ala或Pro

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..(83)

<223> Xaa=Phe或Leu

<220>

<221> misc_feature

<222> (85)..(85)

<223> Xaa=Thr或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(91)

<223> Xaa=His或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (93)..(93)

<223> Xaa=Ile或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (94)..(94)

<223> Xaa=Leu或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (96)..(96)

<223> Xaa=Trp或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> Xaa=Gly或Gln

<400> 64

<210> 65

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 900424、HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 LCDR1；900423和900428 LCDR1

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa=Asn或Thr

<400> 65

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 900424、HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 LCDR3；900423和900428 LCDR3

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=His或Tyr

<220>

<221> misc_feature

< 222> (5)..(5)

<223> Xaa=Ile或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa=Leu或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa=Trp或Tyr

<400> 66

<210> 67

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0031、HB0032和HB0033 L-FR1；HB0030 L-FR1

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> Xaa=Lys或Arg

<400> 67

<210> 68

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030 L-FR1；HB0031、HB0032和HB0033 L-FR1；900424 L-FR1；900423和900428 L-FR1

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=Gln或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa=His或Pro

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa=Lys或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa=Phe或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa=Leu或Met

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa=Phe或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa=Ala或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> Xaa=Ile或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> Xaa=Lys或Arg

<400> 68

<210> 69

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030和HB0032 L-FR2；HB0031和HB0033 L-FR2

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa=Leu或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa=Ala或Asn

<400> 69

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030和HB0032 L-FR2；HB0031和HB0033 L-FR2；900424 L-FR2；900423和900428 L-FR2

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa=Leu或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa=Ala或Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa=Lys或Gln

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa=Ala或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Xaa=His或Tyr

<400> 70

<210> 71

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030 L-FR3；HB0031和HB0033 L-FR3；HB0032 L-FR3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa=Leu或Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=Gln或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> Xaa-Gly或Arg

<400> 71

<210> 72

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HB0030 L-FR3；HB0031和HB0033 L-FR3；HB0032 L-FR3；900428 L-FR3；900424 L-FR3；900423 L-FR3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa=Leu或Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=Gln或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa=Asp或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> Xaa=Ile、Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa=Arg或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> Xaa=Gly或Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> Xaa=Phe或Leu

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> Xaa=Asn或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Xaa=Leu或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> Xaa=Ala或Pro

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> Xaa=Phe或Leu

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> Xaa=Thr或Val

<400> 72

<210> 73

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 900423、900424和900428 L-FR4；HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 L-FR4

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=Gly或Gln

<400> 73

Claims

一種分離的抗原結合蛋白，其包括結合TIGIT蛋白的抗體或其抗原結合片段，該抗原結合蛋白包含VH和VL，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該分離的抗原結合蛋白包含選自下述的任意一組胺基酸序列：(1)HCDR1：SEQ ID NO：3，HCDR2：SEQ ID NO：4，HCDR3：SEQ ID NO：5，LCDR1：SEQ ID NO：6，LCDR2：SEQ ID NO：7，和，LCDR3：SEQ ID NO：8；以及(2)HCDR1：SEQ ID NO：3，HCDR2：SEQ ID NO：42，和HCDR3：SEQ ID NO：43，LCDR1：SEQ ID NO：52，LCDR2：SEQ ID NO：7，和，LCDR3：SEQ ID NO：53。
如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO：2、10、11、13、33和34中任一項所示的胺基酸序列。
如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NO：1、9、12、14和32中任一項所示的胺基酸序列。
如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，且該分離的抗原結合蛋白包含選自下述的任意一組胺基酸序列：(1)VH：SEQ ID NO：9，和VL：SEQ ID NO：10，(2)VH：SEQ ID NO：9，和VL：SEQ ID NO：11，(3)VH：SEQ ID NO：12，和VL：SEQ ID NO：13，(4)VH：SEQ ID NO：14，和VL：SEQ ID NO：11，(5)VH：SEQ ID NO：1，和VL：SEQ ID NO：2， (6)VH：SEQ ID NO：32，和VL：SEQ ID NO：34，以及(7)VH：SEQ ID NO：32，和VL：SEQ ID NO：33。
一種或多種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
一種載體，其包含如請求項5所述的核酸分子。
一種細胞，其包含如請求項5所述的核酸分子或如請求項6所述的載體。
一種製備如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養如請求項7所述的細胞。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項5所述的核酸分子和/或如請求項6所述的載體，以及任選地藥學上可接受的佐劑。
一種如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項5所述的核酸分子、如請求項6所述的載體、如請求項7所述的細胞和/或如請求項9所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療TIGIT相關疾病，所述TIGIT相關疾病為結腸癌。