CN114106182B - 抗tigit的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及抗TIGIT的抗体及其用途。具体地，本发明涉及一种抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1至HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:3‑5所示，所述轻链可变区的LCDR1至LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:8‑10所示；并且按照EU编号系统，所述重链恒定区包含L234A和L235A等突变。本发明的抗体能够有效地结合TIGIT，毒副作用较小，具有应用于肿瘤防治的潜力。

Description

抗TIGIT的抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及抗TIGIT的抗体及其用途。具体地，本发明涉及一种抗TIGIT的单克隆抗体、药物组合物及用途。

背景技术

TIGIT（T cell Ig and ITIM domain, 又称为WUCAM，Vstm3，VSIG9）是脊髓灰质炎病毒受体（PVR）/Nectin家族的成员。TIGIT由细胞外免疫球蛋白可变区（IgV）结构域，I型跨膜结构域和具有经典免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫球蛋白酪氨酸尾（ITT）基序的细胞内结构域组成。TIGIT在淋巴细胞特别是在效应和调节性CD4+ T细胞、滤泡辅助CD4+ T细胞和效应CD8+ T细胞以及自然杀伤（NK）细胞中高表达（Yu X, Harden K, Gonzalez LC, et al. The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promotingthe generation of mature immunoregulatory dendritic cells[J]. Natureimmunology, 2009, 10(1): 48）。

CD155（又称为PVR、Necl5或Tage4）、CD112（又称为PVRL2 / nectin 2）和CD113（又称为PVRL3）是TIGIT结合的配体(Martinet L, Smyth M J. Balancing natural killercell activation through paired receptors[J]. Nature Reviews Immunology, 2015,15(4): 243-254.)，其中CD155是TIGIT的高亲和力配体。在NK细胞中，TIGIT结合配体CD155和CD112可以抑制NK细胞对TIGIT高表达细胞的杀伤作用（Stanietsky N, Simic H,Arapovic J, et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits humanNK cell cytotoxicity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2009, 106(42): 17858-17863）。而有报道发现在同时阻断PD-1和TIGIT时，可以增强CD8+T细胞的杀伤作用（Johnston R J, Comps-Agrar L, Hackney J, et al. Theimmunoreceptor TIGIT regulates antitumor and antiviral CD8+ T cell effectorfunction[J]. Cancer cell, 2014, 26(6): 923-937）。在最新的研究中发现，TIGIT作为NK细胞的免疫检查点，肿瘤发展过程中抑制性受体TIGIT可导致NK细胞耗竭，并证明抗TIGIT单抗可逆转NK细胞耗竭并用于多种肿瘤例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、宫颈瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞瘤、浆细胞癌等的免疫治疗（Zhang Q, Bi J, Zheng X, et al. Blockade of thecheckpoint receptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potentanti-tumor immunity[J]. Nature immunology, 2018, 19(7): 723-732）。

随着癌变程度由高到低，肝细胞癌（HCC）患者的癌组织中TIGIT和CD155的表达水平上调。HCC术后患者外周血中TIGIT+cd4+T细胞和TIGIT+Treg细胞频率降低。TIGIT 表达增加与 AFP 水平呈正相关。 这些结果表明，共抑制受体 TIGIT 可能参与 HCC 的发病机制，并代表了 HCC 诊断和治疗的新靶点（Duan Xiangguo,Liu Juanxi,Cui Jianjian etal. Expression of TIGIT/CD155 and correlations with clinical pathologicalfeatures in human hepatocellular carcinoma.[J] .Mol Med Rep, 2019, 20: 3773-3781.）。

此外有报道，TIGIT阻断剂单独或与PD-1阻滞剂联合使用再加上CD96阻断剂，可以显著降低野生型和Cd155-/-小鼠模型中B16黑色素瘤的生长（Li X-Y, Das I, LepletierA, et al. . Cd155 loss enhances tumor suppression via combined host andtumor-intrinsic mechanisms. J Clin Invest 2018;128:2613–25）。CD112R阻断剂单独或与TIGIT阻断剂和/或PD-1阻断剂联合使用，能增加卵巢瘤、子宫内膜瘤和肺肿瘤中TIL产生细胞因子的能力 （ Whelan S, Ophir E, Kotturi MF, et al. . PVRIG and PVRL2Are Induced in Cancer and Inhibit CD8⁺ T-cell Function. Cancer Immunol Res2019;7:257–68）。

抗TIGIT抗体药物作为新型免疫检查点抗体药物具有广泛的应用前景，可用于肿瘤的免疫治疗。罗氏制药（Roche）研发的Tiragolumab（研发代号为RG6058）已处于临床3期阶段，并且据报道TIGIT单抗Tiragolumab联合PD-L1药物Tecentrip（阿特珠单抗Atezolizumab）作为一线疗法，在治疗PD-L1阳性转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的2期临床研究中发现Tiragolumab与Tecentriq的组合耐受性良好，疾病进展风险下降43%，联用效果显著(Exit C. Roche to present first clinical data on novel anti-TIGITcancer immunotherapy tiragolumab at ASCO[J])。

百时美施贵宝公司研发的BMS 22G2是一款靶向TIGIT的IgG1亚型抗体药物，其Fc段经过优化后无ADCC和CDC效应。目前正在实体瘤患者中进行临床Ⅰ/Ⅱ期试验（NCT02913313），以评估BMS-986207单药和与Nivolumab联用的安全性和有效性（HarjunpH,Guillerey C . TIGIT as an emerging immune checkpoint[J]. Clinical &Experimental Immunology, 2019, 200(13).）。

ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicitye）即抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞（NK细胞、巨噬细胞等）表面的Fc受体（Fc Receptor, FcR）结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。

CDC（complement dependent cytotoxicity）即补体依赖的细胞毒性，是指当抗体与细胞膜表面相应抗原特异性结合后，形成复合物而激活补体系统，进而在靶细胞表面形成MAC，导致靶细胞溶解。补体能导致多种细菌和其他病原生物细胞的溶解，是机体抵抗病原生物感染的重要防御机制。

IgG家族包含四个成员，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，它们重链恒定区的可结晶片段（fragment crystallizable，Fc）区域存在氨基酸的差异，导致它们与FcγRs的亲和力各不相同。IgG1是人体内最多的亚型，也是单抗药物中用的最多的亚型，IgG1能够结合各种FcγRs，能够引发ADCC以及CDC效应。IgG2与FcγRs的亲和力最弱，但是IgG2仍能够通过与FcγRIIa的结合引发单核细胞介导的ADCC。IgG3与FcγRs的结合能力最强，能引发ADCC，且CDC效应比IgG1更强。IgG4分子与FcγRI之外的FcγRs结合较弱，IgG4分子引起CDC和NK细胞介导的ADCC的可能性较低；然而，IgG4亚型抗体可通过与FcγRI的结合介导ADCP效应，靶向于免疫细胞的抗体药物存在ADCP效应可能会导致免疫细胞损伤，具有影响药物药理学负面效应。

由于TIGIT蛋白在CD8+T细胞及NK细胞等免疫细胞的细胞膜表达，被其配体CD155（PVR）或CD112（PVRL2）（通常在肿瘤细胞表面表达）激活后，通过信号通路的传导，能够抑制CD8+T细胞和NK的免疫杀伤活性，从而使肿瘤细胞逃逸免疫细胞的杀伤。另外，抗TIGIT抗体作为受体拮抗剂，阻断受体和配体的结合，抑制信号通路的传导，降低ADCC效应和/或CDC效应能够减少或者消除对抗TIGIT抗体所结合的免疫细胞造成的损伤，提高抗体药物药效。

因此，需要开发与TIGIT具有高亲和力的抗体药物，并减少或消除抗体介导的ADCC和/或CDC，用于自身免疫疾病的治疗，使其具有更好的治疗效果和更低的毒副作用。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的人TIGIT作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过对大量样本的筛选，得到了杂交瘤细胞株LT019（保藏编号为CCTCC NO:C2020208）。

本发明人惊奇地发现，杂交瘤细胞株LT019分别能够分泌产生与人TIGIT特异性结合的特异性单克隆抗体（命名为26B12），并且该单克隆抗体能够十分有效地结合TIGIT，降低TIGIT抑制免疫细胞的作用，促进T细胞活性，逆转NK细胞耗竭，增强免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。进一步地，本发明人创造性地制得了抗人TIGIT的人源化抗体，分别命名为26B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1）。

本发明人还惊奇地发现，本发明的抗体26B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1具有与TIGIT结合的活性，226B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1可以有效地降低TIGIT的活性。

进一步地，本发明人在26B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1的基础上，通过在其重链恒定区的第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变（L234A），和第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变（L235A），获得了恒定区突变的人源化抗体26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)，其重链恒定区均为IgG1亚型。

本发明人发现，相对于突变之前的野生型抗体，26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)降低了对T细胞的ADCC和CDC毒副作用，增加抗TIGIT抗体药物的药物效能。

本发明的抗体具有用于治疗肿瘤（例如肝癌、肾癌、脑瘤、尿路上皮癌、骨肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素癌、胰腺癌、宫颈瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞瘤、卵巢癌、浆细胞癌、子宫内膜癌、前列腺癌、睾丸癌）等疾病的潜力。

由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，

所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1至HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1至LCDR3；

HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；

并且按照EU编号系统，所述重链恒定区包含如下突变：

L234A和L235A；

L234A和G237A；

L235A和G237A；

或者

L234A、L235A和G237A。

轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区（CDR）（重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链（L）的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Bethesda M.d., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 1991; 1-3:91-3242。

优选地，本发明中的CDR由IMGT编号系统定义，请参见Ehrenmann, Francois,Quentin Kaas, and Marie-Paule Lefranc. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, Tcell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. Nucleic acids research 2009; 38(suppl_1): D301-D307。

通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库根据IMGT定义分析单克隆抗体序列的CDR区的氨基酸序列。

本发明中，如果没有特别说明，位点之前的字母表示突变前的氨基酸，位点之后的字母表示突变后的氨基酸。

在本发明的一些实施方式中，所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，按照EU编号系统，所述抗体的重链恒定区还包含选自如下的一个或多个突变：

N297A、D265A、D270A、P238D、L328E、E233D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D、G236R、G236A、L328R、A330S、P331S、H268A、E318A和K320A。

在本发明的一些实施方式中，所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13和SEQID NO: 15；并且

所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 17和SEQID NO: 19。

在本发明的一些实施方式中，所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示；

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示；

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示。

在本发明的一些实施方式中，所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，

所述的抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链恒定区为Ig gamma-1 chain C region（例如NCBI ACCESSION: P01857）或Iggamma-4 chain C region（例如NCBI ACCESSION: P01861.1）；轻链恒定区为Ig kappachain C region（例如NCBI ACCESSION: P01834）；

优选地，所述抗体的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，所述抗体的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。

在本发明的一些实施方式中，所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体与TIGIT-mFc结合的EC₅₀小于或等于RG6058(G1DM)和/或BMS 22G2；优选地，所述亲和力通过ELISA方法测得。

在本发明的一些实施方式中，所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的EC₅₀小于0.5nM；优选地，所述EC₅₀通过竞争ELISA方法测得。

在本发明的一些实施方式中，所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体在10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL的浓度下均无ADCC效应；和/或

所述抗体在10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL的浓度下均无CDC效应。

本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明中任一项所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。

本发明的再一方面涉及一种重组载体，其包含本发明的分离的核酸分子。

本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者本发明的重组载体。

本发明的另一方面涉及一种偶联物，其包括抗体以及偶联部分，其中，所述抗体为本发明中任一项所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其包括本发明中任一项所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，或者包括本发明的偶联物；

优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明的另一方面涉及一种双特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其中：

所述第一蛋白功能区靶向TIGIT，

所述第二蛋白功能区靶向不同于TIGIT的靶点（例如，PD-1），

其中，所述第一蛋白功能区为本发明中任一项所述的抗体或抗原结合片段；

优选地，所述双特异性抗体为IgG-scFv模式；

优选地，所述第一蛋白功能区为本发明中任一项所述的抗体且为免疫球蛋白形式，并且所述第二蛋白功能区为单链抗体；或者

优选地，所述第一蛋白功能区为单链抗体，并且所述第二蛋白功能区为靶向不同于TIGIT的靶点（例如，PD-1）的免疫球蛋白形式的抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个、2个或者2个以上。

在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述单链抗体分别连接在免疫球蛋白形式的抗体的两条重链的C末端。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、本发明的偶联物或者本发明中任一项所述的双特异性抗体；可选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的辅料。

在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其还包含一种或多种抗PD-1抗体，或者一种或多种抗PD-L1抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中，按照抗体的质量计算，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的质量比为（1：5）-（5：1），例如1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1或5：1。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的单位剂量，按照其中的所述抗体的质量计算，为100mg-1000mg、200mg-800mg、200mg-500mg、300mg-600mg、400mg-500mg或者450mg。

本发明的再一方面涉及一种组合产品，其包含独立包装的第一产品和第二产品，其中，

所述第一产品包含其包含本发明中任一项所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、本发明的偶联物或者本发明中任一项所述的双特异性抗体；

所述第二产品包含至少一种抗PD-1抗体或者至少一种抗PD-L1抗体；

优选地，所述第一产品和所述第二产品还独立地包含一种或多种药学上可接受的辅料；

优选地，所述组合产品还包含产品说明书。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合产品，其中，按照抗体的质量计算，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的质量比为（1：5）-（5：1），例如1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1或5：1。

根据本发明中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的偶联物、本发明中任一项所述的双特异性抗体或者本发明中任一项所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防肿瘤；

优选地，所述肿瘤选自肝癌、肾癌、脑瘤、尿路上皮癌、骨肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素癌、胰腺癌、宫颈瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞瘤、卵巢癌、浆细胞癌、子宫内膜癌、前列腺癌和睾丸癌中的一种或多种。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的偶联物、本发明中任一项所述的双特异性抗体或者本发明中任一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途；

优选地，所述肿瘤选自肝癌、肾癌、脑瘤、尿路上皮癌、骨肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素癌、胰腺癌、宫颈瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞瘤、卵巢癌、浆细胞癌、子宫内膜癌、前列腺癌和睾丸癌中的一种或多种。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防肿瘤的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的偶联物、本发明中任一项所述的双特异性抗体或者本发明中任一项所述的药物组合物的步骤；

优选地，所述肿瘤选自肝癌、肾癌、脑瘤、尿路上皮癌、骨肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素癌、胰腺癌、宫颈瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞瘤、卵巢癌、浆细胞癌、子宫内膜癌、前列腺癌和睾丸癌中的一种或多种。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述的方法，其中，所述给予有需求的受试者以有效量的抗TIGIT抗体的步骤为在手术治疗之前或之后，和/或在放射治疗之前或之后。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述的方法，其中，

抗TIGIT抗体的单次给药剂量为每千克体重0.1-100mg，优选1-10mg（例如1 mg、2mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg或10 mg）；或者，抗TIGIT抗体的单次给药剂量为每位受试者10-1000mg（例如大约100mg、大约150mg、大约200 mg、大约250 mg、大约300mg、大约350 mg、大约400 mg 、大约450 mg、大约500 mg、大约600 mg、大约700 mg、大约800mg、大约900 mg或大约1000 mg），优选50-500mg、100-400mg、150-300mg、150-250mg或200mg；

优选地，每3天、4天、5天、6天、10天、1周、2周或3周给药一次；

优选地，给药方式为静脉滴注或静脉注射。

在一些方案中，抗TIGIT抗体的施用治疗以2周（14天）或3周（21天）为一个周期，优选在每个周期第一天（D1）静脉给予抗TIGIT抗体。例如，所述抗TIGIT抗体以每两周一次（q2w）或者每三周一次（q3w）的频率施用。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，当提及TIGIT（NCBI GenBank ID: NP_776160.2）的氨基酸序列时，其包括TIGIT蛋白的全长，或者细胞外免疫球蛋白可变区（IgV）结构域或者包含细胞外免疫球蛋白可变区（IgV）结构域的片段；还包括TIGIT的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段（mFc或hFc）进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在TIGIT蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于置换，缺失和/或添加），而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“TIGIT蛋白”或“TIGIT”应包括所有此类序列，包括所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述TIGIT蛋白的序列片段时，其不仅包括的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。

如本文中所使用的，术语EC₅₀是指半最大效应浓度（concentration for 50% ofmaximal effect），是指能引起50%最大效应的浓度。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对多肽链（每对具有一条“轻”（L）链和一条“重”（H）链）组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由3个结构域(C_H1、C_H2和C_H3)组成。各轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。V_H和V_L区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区（FR）的区域。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗原结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda M.d.(1987 and 1991))，或Chothia &Lesk J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917; Chothia等人Nature 1989; 342:878-883或者IMGT编号系统定义，见Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas, and Marie-PauleLefranc. "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a toolfor immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF."Nucleic acids research 2009; 38(suppl_1): D301-D307.的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG (例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology, Ch. 7(Paul, W., ed., 第2版，Raven Press, N.Y. (1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体（例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由V_H和C_H1结构域组成的抗体片段; 术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由V_H结构域组成的抗体片段(Ward 等人, Nature 341:544-546 (1989))；术语“Fab片段”意指由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如，scFv)，其中V_L和V_H结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如, Bird等人,Science 242:423-426 (1988)和Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-V_L-接头-V_H-COOH或NH₂-V_H-接头-V_L-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90: 6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，ProteinEng. 8:725-731，Choi等人(2001)，Eur. J. Immunol. 31: 94-106，Hu等人(1996)，CancerRes. 56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J. Mol. Biol. 293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中V_H和V_L结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)，和Poljak R.J.等人, Structure 2:1121-1123 (1994))。

在另一些情况下，抗体的抗原结合片段是 “双特异性抗体”，指由第一抗体(片段)和第二抗体(片段)或抗体类似物通过偶联臂所形成的偶联物，偶联的方式包括但不限于化学反应、基因融合和酶促。 抗体的抗原结合片段可以是“多特异性抗体”包括例如：三特异性抗体和四特异性抗体，前者是具有三种不同抗原结合特异性的抗体，而后者是具有四种不同抗原结合特异性的抗体。例如，经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)，与IgG抗体，scFv-Fc抗体片段相连或其组合，如CN104341529A。抗IL-17a的fynomer与抗IL-6R抗体结合，如WO2015141862A1。

可使用本领域技术人员已知的常规技术（例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法）从给定的抗体（例如本发明提供的单克隆抗体26B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1）获得抗体的抗原结合片段（例如，上述抗体片段），并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得（Köhler G, Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J]. nature, 1975; 256(5517): 495），但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。

如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白（受体抗体）的全部或部分CDR区被一非人源抗体（供体抗体）的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源（例如，小鼠、大鼠或兔）抗体。此外，受体抗体的构架区（FR）的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al., Nature 1986; 321:522-525; Reichmann etal., Nature 1988; 332:323-329; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992; 2:593-596；和Clark M. Antibody humanization: a case of the ‘Emperor’s new clothes’[J]. Immunol. Today, 2000; 21(8): 397-402。

如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“载体（vector）”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1来源的人工染色体（PAC）；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒（如SV40）。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，GS细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体（或对某抗原具有特异性的抗体）是指，抗体以小于大约10^-5 M，例如小于大约10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M、10^-9M或10^-10 M或更小的亲和力（K_D）结合该抗原。

如本文中所使用的，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10^-5 M，例如小于大约10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M、10^-9 M或10^-10 M或更小的解离平衡常数（K_D）结合抗原（例如，TIGIT蛋白）。可以使用本领域技术人员知悉的方法测定K_D，例如使用Fortebio分子相互作用仪测定。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed.Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995），并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病（例如肿瘤）有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病（例如肿瘤）的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。

如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。

在本发明中，如果没有特别说明，所述“第一”（例如第一产品或第一蛋白功能区）和“第二”（例如第二产品或第二蛋白功能区）是为了指代上的区分或表述上的清楚，并不具有典型的次序上的含义。

本发明中，术语“无CDC效应”或者“消除CDC效应”是指通过现有的仪器设备检测显示没有信号或信号极低；或者超出了现有仪器设备的检测最小灵敏度范围。术语“无ADCC效应”或者“消除ADCC效应”也可作类似理解。

发明的有益效果

本发明实现了如下的（1）至（7）项中所述技术效果中的一项或多项：

（1）本发明的抗体能够高特异性地与TIGIT结合。

（2）本发明的抗体能够十分有效地结合TIGIT，降低TIGIT抑制免疫细胞的作用，促进T细胞活性，逆转NK细胞耗竭，增强免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。

（3）本发明的抗体消除了CDC效应和/或ADCC效应。

（4）本发明的抗体与抗PD-1抗体或者与化疗药物之间很可能具有协同作用。

（5）本发明的抗体能够有效地治疗和/或预防肿瘤，例如肝癌、肾癌、脑瘤、尿路上皮癌、骨肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素癌、胰腺癌、宫颈瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤 、B淋巴细胞瘤、卵巢癌、浆细胞癌、子宫内膜癌、前列腺癌或睾丸癌等。

（6）在Jurkat-TIGIT和HT1080-aCD3scFv共培养体系中，本发明的抗体特别是人源化抗体26B12H4L4(G1DM)促进IL-2分泌的能力强于阳性对照抗体RG6058(G1DM)。

（7）本发明的抗体具有较低的毒副作用。

附图说明

图1：26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)抗体以及对照药BMS22G2与TIGIT-mFc的结合活性检测结果。

图2：26B12H4L1(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、和26B12H4L4(G1DM)抗体以及对照药RG6058(G1DM)与TIGIT-mFc的结合活性检测结果。

图3：26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)抗体以及对照药BMS22G2与人CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的活性检测结果。

图4：26B12H4L1(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、和26B12H4L4(G1DM)抗体以及对照药RG6058(G1DM)与人CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的活性检测结果。

图5：26B12 H4L4(G1DM)与TIGIT-mFc亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、16.7nM、5.57nM、1.85nM、0.62 nM。

图6：26B12 H1L4(G1DM) 与TIGIT-mFc亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、16.7nM、5.57nM、1.85nM、0.62 nM。

图7：26B12 H4L1(G1DM) 与TIGIT-mFc亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、16.7nM、5.57nM、1.85nM、0.62 nM。

图8：RG6058(G1DM) 与TIGIT-mFc亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、16.7nM、5.57nM、1.85nM、0.62 nM。

图9：BMS 22G2(G1DM) 与TIGIT-mFc亲和力常数检测结果图。图中从上到下的每对曲线中加入抗体的浓度分别为50nM、16.7nM、5.57nM、1.85nM、0.62 nM。

图10：FACS检测人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)与293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的结合活性。

图11：FACS检测人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)与CD155-mG1Fc竞争结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的活性。

图12：FACS检测人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)与CD112-mG1Fc竞争结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的活性。

图13：检测抗TIGIT 抗体在Jurkat-TIGIT和THP-1细胞共培养体系中对IL-2分泌的影响（CD155-hFc）。

图14：检测抗TIGIT 抗体在Jurkat-TIGIT和THP-1细胞共培养体系中对IL-2分泌的影响(CD112-hFc)。

图15：检测抗TIGIT 抗体在Jurkat-TIGIT和HT1080-aCD3scFv细胞共培养体系中对IL-2分泌的影响。

图16：26B12H4L4(G1DM)抗体的CDC效应。

图17：26B12H4L4(G1DM) 抗体的ADCC效应。

图18：PD1/PDL1/TIGIT TG C57BL/6转基因小鼠MC38肿瘤模型效果。

图19：PD1/PDL1/TIGIT TG C57BL/6转基因小鼠MC38肿瘤模型体重变化。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，为可以通过市场购买获得的常规产品。例如293T细胞可以购自ATCC。

在本发明的下述实施例中：

PD1/PDL1/TIGIT 转基因C57BL/6 小鼠（导入人源PD-1、PD-L1和TIGIT基因，其淋巴细胞表面表达人源PD-1、PD-L1和TIGIT），购自南京Gempharmatech。

阳性对照抗体RG6058(hG1WT) （即RG6058），其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 26所示。

阳性对照抗体RG6058(G1DM) ，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 27所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 28所示。

阳性对照抗体BMS 22G2，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 29所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 30所示。

阳性对照抗体BMS 22G2(G1DM) ，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 31所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 32所示。

同型对照抗体为人抗鸡蛋溶酶体抗体（human anti-Hen Egg Lysozyme IgG，即anti-HEL抗体，或者human IgG，简称hIgG）的序列来自于Acierno等人发表的Affinitymaturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies中Fab F10.6.6序列的可变区序列（Acierno等人. J Mol Biol.2007; 374(1): 130-146.）。

TIGIT-mFc为中山康方生物医药有限公司生产，批号：20171110。

CD155-mG1Fc为中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190726。

CD112-mG1Fc为中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190726。

CD155-hFc为中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190726。

CD112-hFc为中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190726。

CD28购自R&D公司，货号：MAB342-500。

IgG1DM为中山康方生物医药有限公司生产，批号：20181107。

CD3为中山康方生物医药有限公司生产，批号：20170830。

PBMC-A为中山康方生物医药有限公司生产，批号：PBMC19082。

Jurkat-TIGIT细胞构建：细胞转染前24小时将293T细胞接种至6cm细胞培养皿中，种板细胞密度约为60%。24小时后，将细胞培养基换成预热的无血清OM培养基。将各病毒包装质粒以及plenti6.3/V5-TIGITFL-BSD等质粒按以下比例进行转染：plenti6.3/V5-TIGITFL-BSD质粒2μg、pMDL质粒1μg、pVSVG质粒0.6μg、PRev质粒0.4μg。具体转染操作参照Lipofectamine-2000说明书。质粒转染48小时后，收集病毒上清液。将病毒上清液用45 μm滤器过滤，去除包装细胞。将2mL过滤后的病毒上清液加到Jurkat细胞中，并加入终浓度未8μg/mL的polybrene。用病毒液将细胞轻轻悬起，1200g、4℃离心2小时。24小时后，弃去病毒上清液，换成完全培养基。48小时后，向被感染的细胞加入终浓度为3μg/mL的BSD培养3天。用未感染的细胞作为细胞杀伤对照，待未感染的细胞全部死亡，则认定被感染细胞中存活的细胞是稳定的过表达细胞。

HT1080-aCD3scFv细胞构建：细胞转染前24小时内用胰酶消化分离293T细胞，接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行传代培养，接种密度为5×10⁶个细胞每10cm培养皿。转染前2小时，将细胞培养基换成opti-MEM培养基。在无菌试管中用opti-MEM稀释质粒DNA，而且包装质粒间的比例为pLP1：pLP2：pVSVG=1：1：1，包装质粒与转染载体的比例为2：1；向一10cm培养皿中加入0.5mL+9μg总量的DNA。在无菌试管中，用opti-MEM稀释Lipofectamine-2000，向上述10cm培养皿中加入0.5mL+25μL的Lipofectamine-2000。室温放置15min后，将Lipofectamine-2000+DNA混合液均匀滴加到含细胞的培养皿中。转染8小时后，更换新鲜的培养基。转染48小时后收获病毒液。4000×g、4℃离心10min，用0.45 μm滤嘴过滤并进行慢病毒浓缩。将病毒上清液加到正在培养的HT-1080细胞中。感染6-12小时后，更换新鲜培养基。感染24小时后，加药筛选，并设置对照孔。数小时后，待作为细胞杀伤对照的未感染的细胞全部死亡，收获筛选完的细胞进行继续培养。

CHO-K1-TIGIT细胞构建：细胞转染前24小时内用胰酶消化分离293T细胞，接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行传代培养，接种密度为5×10⁶个细胞每10cm培养皿。转染前2小时，将细胞培养基换成opti-MEM培养基。在无菌试管中用opti-MEM稀释质粒DNA，而且包装质粒间的比例为pLP1：pLP2：pVSVG=1：1：1，包装质粒与转染载体的比例为2：1；向一10cm培养皿中加入0.5mL+9 μg总量的DNA。在无菌试管中，用opti-MEM稀释PEI，向上述10cm培养皿中加入0.5mL+25μL的PEI。室温放置15min后，将PEI+DNA混合液均匀滴加到含细胞的培养皿中。转染8小时后，更换新鲜的培养基。转染48小时后收获病毒液。4000×g、4℃离心10min，用0.45 μm滤嘴过滤并进行慢病毒浓缩。将病毒上清液加到正在培养的CHO-K1细胞中。感染6-12小时后，更换新鲜培养基。感染24小时后，加药筛选，并设置对照孔。数小时后，待作为细胞杀伤对照的未感染的细胞全部死亡，收获筛选完的细胞进行继续培养。

实施例1：抗TIGIT抗体26B12的制备

1. 杂交瘤细胞株LT019的制备

制备抗TIGIT抗体所用的抗原为人TIGIT-mFc（TIGIT为GenbankID: NP_776160.2）。取免疫后的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制成杂交瘤细胞。以人TIGIT-mFc作为抗原，对杂交瘤细胞进行间接ELISA法筛选，获得能够分泌与TIGIT特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。对筛选得到的杂交瘤细胞，经过有限稀释法得到稳定的杂交瘤细胞株。将以上杂交瘤细胞株分别命名为杂交瘤细胞株LT019，其分泌的单克隆抗体分别命名为26B12。

杂交瘤细胞株LT019，其于2020年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: C2020208，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。

2. 抗TIGIT抗体26B12的制备

用CD培养基（Chemical Defined Medium，含1%青链霉素）对上面制得的LT019细胞株在5% CO₂，37°C条件下进行培养。7天后收集细胞培养上清，通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，并使用HiTrap protein A HP柱进行纯化，制得抗体26B12。

实施例2：抗TIGIT的抗体26B12的序列分析

按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒（Tiangen，货号DP430）的方法，从实施例1中培养的LT019细胞株中提取mRNA。

按照Invitrogen SuperScript® III First-Strand Synthesis System forRT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。

PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1 Cloning Kit（TransgenCT101）试剂盒说明书进行。

将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：

重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO: 2所示，片段长363 bp。

其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示，长度为121个氨基酸。

其中重链HCDR1的序列如SEQ ID NO: 3所示，HCDR2的序列如SEQ ID NO: 4所示，HCDR3的序列如SEQ ID NO: 5所示。

轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO: 7所示，长度为321 bp。

其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 6所示，长度为107个氨基酸。

其中轻链LCDR1的序列如SEQ ID NO: 8所示，LCDR2的序列如SEQ ID NO: 9所示，LCDR3的序列如SEQ ID NO: 10所示。

实施例3：抗人TIGIT的人源化抗体的轻链和重链设计和制备

1．抗人TIGIT的人源化抗体26B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1的轻链和重链设计

根据人TIGIT蛋白的三维晶体结构以及实施例2获得的抗体26B12的序列，通过计算机模拟抗体模型，随后根据模型设计突变，得到抗体26B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1的可变区序列（抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区均采用Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION: P01857；轻链恒定区为Ig kappa chain Cregion，ACCESSION: P01834）。

设计的可变区序列如下面的表A所示。

表A：可变区序列

以上的5个抗体26B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1，重链可变区的核酸序列的长度均为363 bp，其编码的氨基酸序列的长度均为121aa；轻链可变区的核酸序列的长度均为321 bp，其编码的氨基酸序列的长度均为107aa。

并且上述5个抗体具有相同的HCDR1-HCDR3和LCDR1-LCDR3，如下：

HCDR1的序列如SEQ ID NO: 3所示，HCDR2的序列如SEQ ID NO: 4所示，HCDR3的序列如SEQ ID NO: 5所示；

LCDR1的序列如SEQ ID NO: 8所示，LCDR2的序列如SEQ ID NO: 9所示，LCDR3的序列如SEQ ID NO: 10所示。

2．人源化抗体26B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1的制备

重链恒定区均采用Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION: P01857；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION: P01834。

将26B12H5L4重链cDNA和轻链的cDNA、26B12H5L1重链cDNA和轻链的cDNA、26B12H4L4重链cDNA和轻链的cDNA、26B12H1L4重链cDNA和轻链的cDNA以及26B12H4L1重链cDNA和轻链的cDNA、，分别克隆到pUC57simple（金斯瑞公司提供）载体中，分别获得pUC57simple-26B12H5、pUC57simple-26B12L4；pUC57simple-26B12H5、pUC57simple-26B12L1； pUC57simple-26B12H4、pUC57simple-26B12L4；pUC57simple-26B12H4、pUC57simple-26B12L1；pUC57simple-26B12H1和pUC57simple-26B12L4。参照《分子克隆实验指南（第二版）》介绍的标准技术，EcoRI&HindIII酶切合成的重、轻链全长基因，通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中获得表达质粒pcDNA3.1-26B12H5、pcDNA3.1-26B12L1、pcDNA3.1-26B12H4、pcDNA3.1-26B12L4和pcDNA3.1-26B12H1，并进一步对重组表达质粒的重/轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质粒设计基因组合（pcDNA3.1-26B12H5/pcDNA3.1-26B12L1，pcDNA3.1-26B12H5/pcDNA3.1-26B12L4 ，pcDNA3.1-26B12H4/pcDNA3.1-26B12L4，pcDNA3.1-26B12H4/pcDNA3.1-26B12L1和pcDNA3.1-26B12H1/pcDNA3.1-26B12L4）分别共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱进行亲和纯化获得人源化抗体。

3. 人源化抗体26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)的重链恒定区IgG1亚型的设计和制备

本发明人在26B12H5L4、26B12H5L1、26B12H4L4、26B12H1L4和26B12H4L1的基础上，通过在其重链恒定区的第234号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变（L234A），和第235号位点引进了亮氨酸到丙氨酸的点突变（L235A）获得了恒定区突变的人源化抗体26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)，其重链恒定区均为IgG1亚型。

人源化抗体26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)的重链恒定区的氨基酸序列均如SEQ ID NO: 21所示；重链恒定区的核酸序列均如SEQ ID NO: 22所示。

人源化抗体26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)的轻链恒定区的氨基酸序列均如SEQ ID NO: 23所示；轻链恒定区的核酸序列均如SEQ ID NO: 24所示。

人源化抗体26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)的制备方法与上面步骤2中的方法类似。

实施例4：ELISA方法测定抗TIGIT抗体与抗原TIGIT-mFc的结合活性

实验步骤：将羊抗鼠IgG Fc，2μg/mL包被酶标板后， 4℃孵育16小时。孵育结束后使用PBST漂洗包被了抗原的酶标板1次，使用1% BSA的PBST溶液作为酶标板封闭液，封闭2小时。酶标板结束封闭后用PBST洗板3次。再加入抗原人TIGIT-mFc 1μg/mL，置于37℃条件下孵育30分钟后用PBST洗板3次。在酶标板孔内加入PBST溶液梯度稀释的抗体，抗体稀释梯度详见表1。加入了待测抗体的酶标板置于37℃条件下孵育30分钟，孵育完成后用PBST洗板3次。洗板后加入1:5000比例稀释的HRP标记羊抗人IgG Fc二抗工作液，置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板4次，后加入TMB（Neogen，308177）避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。

检测抗TIGIT抗体与抗原TIGIT-mFc结合的结果如图1、图2所示。各剂量的OD值见表1、表2。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行曲线拟合，计算抗体的结合EC₅₀，结果如表1、表2和图1、图2所示。

表1：26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)和BMS 22G2与TIGIT-mFc的结合活性检测结果

表2：26B12H4L1(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)与TIGIT-mFc的结合活性检测结果

实验结果显示，抗体26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)均能有效与人TIGIT-mFc结合，结合效率呈剂量依赖关系。

抗体26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H5L4(G1DM)和26B12H5L1(G1DM)、BMS 22G2（作为阳性对照）的结合效率EC₅₀分别为0.013nM、0.016nM、0.017nM、0.017nM、0.017nM、0.017nM。

抗体26B12H4L1(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、RG6058(G1DM)（作为阳性对照）的结合效率EC₅₀分别为0.017nM、0.017nM、0.015nM、0.017nM。

实验结果还显示：在相同实验条件下26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H5L4(G1DM)和26B12H5L1(G1DM)分别与TIGIT-mFc的结合活性与同靶点阳性药BMS 22G2相当；26B12H4L1(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)和26B12H4L4(G1DM) 分别与TIGIT-mFc的结合活性与RG6058(G1DM)相当。结果表明，26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H5L4(G1DM)和26B12H5L1(G1DM)均具有有效结合TIGIT的功能。

实施例5：竞争ELISA方法分别测定抗TIGIT抗体与CD155-hFc-Biotin竞争结合 TIGIT-mFc的活性

实验步骤：将TIGIT-mFc，2μg/mL包被酶标板后， 4℃孵育过夜。孵育结束后使用PBST漂洗包被了抗原的酶标板1次，使用1% BSA的PBST溶液作为酶标板封闭液，封闭2小时。酶标板结束封闭后用PBST洗板3次。在酶标板孔内加入PBST溶液梯度稀释的抗体，抗体终浓度详见表3。加入了待测抗体的酶标板置于室温条件下孵育10分钟，孵育完成后加入4μg/mL的CD155-hFc-Biotin（终浓度为2μg/mL），置于37℃条件下孵育30分钟后用PBST洗板3次。洗板后加入1:4000比例稀释的SA-HRP工作液，置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板4次，后加入TMB（Neogen，308177）避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro6.2.1软件对数据进行分析处理。

检测抗TIGIT抗体与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的活性的结果见表3、表4，检测结果如图3、图4所示。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行曲线拟合，计算抗体的结合EC₅₀，结果如表3、表4和图3、图4所示。

表3：26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)和BMS 22G2与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的活性检测结果

表4：26B12H4L1(G1DM) 、26B12H5L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM) 与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的活性检测结果

结果显示：

抗体26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H5L4(G1DM)、26B12H5L1(G1DM)、BMS 22G2（作为阳性对照）与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的结合效率EC₅₀分别为0.403nM、0.403nM、0.397nM、0.481nM、0.486nM、0.513nM；

抗体26B12H4L1(G1DM) 、26B12H5L1(G1DM) 、26B12H4L4(G1DM) 、RG6058(G1DM)（作为阳性对照）与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc结合效率EC₅₀分别为0.440nM、0.490nM、0.439nM、0.425nM。

结果表明，在相同实验条件下26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H5L4(G1DM)和26B12H5L1(G1DM)分别与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的活性与BMS 22G2相当甚至更优，而26B12H4L1(G1DM) 、26B12H5L1(G1DM)和26B12H4L4(G1DM) 分别与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的活性与同靶点阳性药RG6058(G1DM)相当。结果表明，26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)、26B12H4L4(G1DM)、26B12H5L4(G1DM)和26B12H5L1(G1DM)均具有与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT的功能。

实施例6：使用Fortebio分子相互作用仪测定人源化抗体26B12H4L4(G1DM)、 26B12H1L4(G1DM)和26B12H4L1(G1DM)和RG6058(G1DM)、BMS 22G2(G1DM)与抗原人TIGIT- mFc结合的动力学参数

样品稀释缓冲液为PBS，0.02%Tween-20，0.1%BSA，pH7.4。5 μg/mL 的抗体固定在AHC传感器上，时间15s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的抗体与TIGIT-mFc结合，TIGIT-mFc浓度为0.62-50 nM（三倍梯度稀释），时间120s，蛋白在缓冲液中解离，时间300s。检测温度为37度，检测频率为0.3 Hz，样品板震动速率为1000 rpm。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。

人源化抗体（作为对照抗体）与TIGIT的亲和力常数测定结果见表5，检测结果如图5至图9所示。

表5：人源化抗体与抗原TIGIT-mFc亲和力常数检测结果

K_D为亲和力常数； K_D=kdis/kon。

结果显示，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)和RG6058(G1DM)以及BMS 22G2(G1DM)与TIGIT-mFc的亲和力常数依次为7.50E-10M、7.30E-10M、5.50E-10 M、8.47E-10 M和6.28E-10 M。

结果表明，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)、26B12H1L4(G1DM)、26B12H4L1(G1DM)与TIGIT-mFc结合的亲和力与阳性药物RG6058(G1DM)和BMS 22G2(G1DM)相当。

实施例7：FACS检测人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)与293T-TIGIT细 胞表面TIGIT抗原的结合

实验方法：通过慢病毒载体构建稳定细胞株293T-TIGIT。收集293T-TIGIT(DMEM+10%FBS)细胞，离心5min后去上清，重悬，计数及活率（95.79%），稀释细胞，透明尖底96孔板每个孔中加入300000细胞，每管加200 μL 1%PBSA，离心5min，去上清。按实验设计每孔对应加入100 μL抗体 (终浓度为300 nM、100 nM、33.3 nM、11.1 nM、3.7 nM、1.23 nM、0.41 nM、0.041 nM和0.0041nM)，并设计空白对照及同型对照，冰上孵育60min。每管加200 μL 1%PBSA，离心5min，去上清，洗两遍。每个样品加FITC羊抗人IgG(用PBSA 500倍稀释)，冰上避光孵育40min；每管加入200 μL 1%PBSA，离心5min，去上清。加入200 μL 1% PBSA重悬细胞，转移到流式管中，流式细胞仪检测各浓度下细胞的平均荧光强度。

实验结果如表6和图10所示。

表6：FACS检测人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)与293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的亲和力

结果显示，阳性对照抗体RG6058(G1DM)与293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原结合的EC₅₀为1.146nM，而人源化抗体26B12H4L4(G1DM)与293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原结合的EC₅₀为1.307nM。

结果表明，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的能力与阳性对照抗体RG6058(G1DM)相当。

实施例8：FACS检测人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)与CD155-mG1Fc 或者CD112-mG1Fc竞争结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的活性

实验方法：通过慢病毒载体构建稳定细胞株293T-TIGIT。收集293T-TIGIT细胞，离心5min后去上清，重悬，计数及活率（94.95%），稀释细胞，透明尖底96孔板每个孔中加入300000细胞，每管加200 μL 1%PBSA，离心5min，去上清。按实验设计每孔对应加入100 μL抗体 (终浓度为300 nM、100 nM、33.3 nM、11.1nM、3.7nM、1.23nM、0.123nM和0.0123nM)，并设计空白对照及同型对照，冰上孵育30min。每个样品加CD155-mG1Fc (终浓度为10nM)或CD112-mG1Fc(终浓度为30nM)，冰上避光孵育60min;每管加200 μL 1%PBSA，离心5min，去上清，洗两遍。每个样品加APC 羊抗鼠 IgG (最小交叉反应活性minimal x-reactivity) 抗体(用PBSA 300倍稀释)，冰上避光孵育40min；每管加入200μL 1% PBSA，离心5min，去上清。加入200 μL 1% PBSA重悬细胞，转移到流式管中，流式细胞仪检测各浓度下细胞的平均荧光强度。

实验结果如表7、表8和图11、图12所示。

表7：FACS检测人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)与CD155-mG1Fc竞争结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的亲和力

表8：FACS检测人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)与CD112-mG1Fc竞争结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的亲和力

表7和图11显示，阳性对照抗体RG6058(G1DM)竞争CD155-mG1Fc结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的EC₅₀为1.217nM，而人源化抗体26B12H4L4(G1DM)竞争CD155-mG1Fc结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的EC₅₀为1.208nM。

表8和图12显示，阳性对照抗体RG6058(G1DM)竞争CD112-mG1Fc结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的EC₅₀为1.288nM，而人源化抗体26B12H4L4(G1DM)竞争CD112-mG1Fc结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的EC₅₀为1.614nM。

结果表明，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)竞争CD155-mG1Fc结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的能力与阳性对照抗体RG6058(G1DM)相当，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)竞争CD112-mG1Fc结合293T-TIGIT细胞表面TIGIT抗原的能力与阳性对照抗体RG6058(G1DM)相当。

实施例9：Jurkat-TIGIT和THP-1细胞共培养体系中加入抗TIGIT抗体的混合淋巴 反应

实验方法：通过慢病毒载体构建稳定细胞株Jurkat-TIGIT。抗人 CD3（2µg/mL） 37℃包被96孔板2h；去掉包被液，预冷PBS（300μL）洗一次； Jurkat-TIGIT细胞计数，96孔板中，每孔种入5万细胞；按照实验设计加入抗体，37℃ 孵育30min；按照实验设计加入CD155-hFc/CD112-hFc；THP-1细胞计数，96孔板中，每孔种入5万细胞；放入培养箱中培养48h；收集培养液上清，用IL-2 ELISA检测试剂盒检测IL-2含量。

实验结果如图13和图14所示。

图13显示，在加入CD155-hFc的细胞体系中，CD155-hFc可抑制体系中IL-2的分泌，而加入人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和阳性对照抗体RG6058(G1DM)可阻断CD155-hFc对IL-2分泌的抑制，增加了IL-2的分泌量，而且在各浓度下（0.3μg/mL、1μg/mL和10μg/mL)，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)活性优于RG6058(G1DM)。

图14显示，在加入CD112-hFc的细胞体系中，CD112-hFc可抑制体系中IL-2的分泌，而加入人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和阳性对照抗体RG6058(G1DM)可阻断CD112-hFc对IL-2分泌的抑制，增加了IL-2的分泌量，而且在各浓度下（0.3μg/mL、1μg/mL和10μg/mL)人源化抗体26B12H4L4(G1DM)活性优于RG6058(G1DM)。

实验结果表明，在Jurkat-TIGIT和THP-1细胞共培养体系中，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)阻断CD155-hFc/CD112-hFc对IL-2分泌的抑制能力强于阳性对照抗体RG6058(G1DM)。

实施例10：Jurkat-TIGIT和HT1080-aCD3scFv细胞共培养体系中加入抗TIGIT抗体 的混合淋巴反应

实验方法：通过慢病毒载体构建稳定细胞株Jurkat-TIGIT和HT1080-aCD3scFv。收集对数生长期Jurkat-TIGIT和HT1080-aCD3scFv细胞计数， Jurkat-TIGIT每孔50000，HT1080-aCD3scF_V每孔10000；加入稀释好的抗体（终浓度为10、50和250nM)；加入抗人CD28（3μg/mL）；放入培养箱中培养48h；收集培养液上清，用IL-2 ELISA检测试剂盒检测IL-2含量。

实验结果如图15所示。

结果显示，加入人源化抗体26B12H4L4(G1DM)和阳性对照抗体RG6058(G1DM)均可促进体系中IL-2的分泌量，而且在各浓度下（10 nM、50 nM和250nM)人源化抗体26B12H4L4(G1DM)比RG6058(G1DM)促进IL-2分泌的量更多。

实验结果表明，在Jurkat-TIGIT和HT1080-aCD3scFv共培养体系中，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)促进IL-2分泌的能力强于阳性对照抗体RG6058(G1DM)。

实施例11：抗TIGIT抗体的CDC效应

实验方法：通过慢病毒载体构建稳定细胞株CHO-K1-TIGIT。收集CHO-K1-TIGIT(F12+10%FBS)细胞，离心5min后，再用RPMI-1640(含1%FBS)重悬细胞，洗涤2次细胞；细胞计数及计活率，用RPMI-1640(含1%FBS)将细胞浓度调整到合适范围，在96孔板中每孔对应加入30000cells/100μL的靶细胞悬液，加入50μL抗体(终浓度为10、1和0. 1 μg/mL)，室温孵育10min；预孵育的细胞中每管对应加入50μL人血清使终浓度为2%(每孔的终体积为200μL)，充分混匀，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育4h。离心5min；小心吸取100μL细胞上清（注意不要吸到板底细胞）于新的96孔平底微量板中，每孔加入100μL新配的反应液，室温避光孵育30min；在490nm、650nm处测量OD值。

实验结果如图16所示。

结果显示，野生型的人源化抗体26B12H4L4(hG1WT)（即实施例3制得的26B12H4L4）和RG6058(hG1WT)在（10μg/mL和1μg/mL）浓度下有明显的CDC效应，而26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)在（10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL）浓度下均无CDC效应。

实验结果表明，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)所引入的氨基酸突变能够有效地消除其 CDC效应。

实施例12：抗TIGIT抗体的ADCC效应

实验方法：通过慢病毒载体构建稳定细胞株CHO-K1-TIGIT。分离PBMC-A，过夜孵育(培养基1640+10%FBS)；收集CHO-K1-TIGIT细胞(培养基F12+10%FBS)、PBMC(培养基1640+10%FBS) ，离心5min后，再用RPMI-1640(含1%FBS)重悬细胞，洗涤2次细胞；细胞计数及计活率，用RPMI-1640(含1%FBS)将细胞浓度调整到合适范围，在96孔板中每孔对应加入30000cells/100μL的靶细胞悬液，加入50μL 抗体(终浓度为10、1和0.1μg/mL)，室温孵育1h；预孵育后的靶细胞中加入90Wcells/50μL的PBMC（活率：99%）(E/T=30)，充分混匀；37℃、5% CO₂的培养箱中孵育4h；离心5min；小心吸取100 μL细胞上清（注意不要吸到板底细胞）于新的96孔平底微量板中，每孔加入100 μL新配的反应液，室温避光孵育30min；在490 nm、650 nm处测量OD值。

实验结果如图17所示。

结果显示，野生型的人源化抗体26B12H4L4(hG1WT)和RG6058(hG1WT)在（10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL）浓度下有明显的ADCC效应，而26B12H4L4(G1DM)和RG6058(G1DM)在（10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL）浓度下均无ADCC效应。

实验结果表明，人源化抗体26B12H4L4(G1DM)所引入的氨基酸突变能够有效地消除其 ADCC效应。

实施例13：26B12H4L4(G1DM)对在hTigit-BALB/c转基因小鼠接种MC38小鼠移植瘤 的治疗作用

采用在Tigit高表达的PD1/PDL1/TIGIT TG C57BL/6小鼠皮下注射接种100万/只MC38细胞，实验具体步骤为MC38细胞皮下注射(s.c.)接种小鼠的方法建立小鼠肿瘤模型。

实验小鼠每组6只，分别是：

同型对照组，给药剂量为30mg/kg，给药方式为静脉注射(i.p.)，每天3次，在0、3、6、9、12、15天注射IgG1DM；

高剂量组，给药剂量为30mg/kg，给药方式为静脉注射(i.p.)，每天3次，在0、3、6,9, 12, 15天注射26B12H4L4(G1DM)；

低剂量组，给药剂量为6mg/kg，给药方式为静脉注射(i.p.)，每天3次，在0、3、6、9、12、15天注射26B12H4L4(G1DM)；以及

对照组，给药剂量为30mg/kg，给药方式为静脉注射(i.p.)，每天3次，在0、3、6、9、12、15天注射RG6058(G1DM)。

具体方案如表9和图18、图19所示。

表9：小鼠MC38肿瘤模型的建模和抗体的给药方案

实验结果如图19所示。

结果显示：26B12H4L4(G1DM)在PD1/PDL1/TIGIT TG C57BL/6 背景小鼠MC38肿瘤模型中，26B12H4L4(G1DM)比同型对照以及RG6058肿瘤的体积有明显的减少，26B12H4L4(G1DM)有明显的抑制肿瘤生长的效果；26B12H4L4(G1DM)对hTIGIT-BALB/c转基因小鼠MC38肿瘤模型体重没有影响。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 中山康方生物医药有限公司

<120> 抗TIGIT的抗体及其用途

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly His Ser Phe Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asp Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctggc ctggtgaaac cctctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcca ctcattcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acagactgga gtggatgggc tacataagct acagtgatag cactaactac 180

aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ttgcagatga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagattggac 300

tatggtaact acggtggggc tatggactac tggggtcaag ggacctcagt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly His Ser Phe Thr Ser Asp Tyr Ala

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Ser Tyr Ser Asp Ser Thr

1 5

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Arg Leu Asp Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Glu Phe Met Ser Thr Ser Leu Arg

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln His Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatattgtgc taactcagtc tcacgaattc atgtccacct cattacgaga cagggtcagc 60

atcacctgca aatccagtca acatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgaaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatatta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaataaa a 321

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln His Val Ser Thr Ala

1 5

<210> 9

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Ala Ser

1

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 11

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly His Ser Phe Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asp Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatgtgcagc tgcaggagag cggccccgga ctggtgaagc cttcccagac cctgtctctg 60

acctgtacag tgtctggcca cagcttcaca tccgactacg cctggaactg gatcaggcag 120

tttccaggca agggcctgga gtggatcggc tacatctctt atagcgactc caccaactat 180

aatccctctc tgaagagccg gatcaccatc agcagagata catccaagaa ccagttcttt 240

ctgcagctga acagcgtgac agccgccgac accgccacat actattgcgc ccggctggac 300

tacggcaatt atggcggagc catggattac tggggccagg gcacctccgt gacagtgagc 360

tcc 363

<210> 13

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly His Ser Phe Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asp Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatgtgcagc tgcaggagag cggccccgga ctggtgaagc cttcccagac cctgtctctg 60

acctgtacag tgtctggcca cagcttcaca tccgactacg cctggaactg gatcaggcag 120

tttccaggca agggcctgga gtggatgggc tacatctctt atagcgactc caccaactat 180

aatccctctc tgaagagccg gatcaccatc agcagagata catccaagaa ccagttcttt 240

ctgcagctga acagcgtgac agccgccgac accgccacat actattgcgc ccggctggac 300

tacggcaatt atggcggagc catggattac tggggccagg gcacctccgt gacagtgagc 360

tcc 363

<210> 15

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly His Ser Phe Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Asp Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Asp Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gatgtgcagc tgcaggagag cggccccgga ctggtgaagc cttcccagac cctgtctctg 60

acctgtacag tgtctggcca cagcttcaca tccgactacg cctggaactg gatcaggcag 120

tttccaggca agggcctgga gtggatgggc tacatctctt atagcgactc caccaactat 180

aatccctctc tgaagagccg gatcaccatc agcagagata catccaagaa ccagttcttt 240

ctgcagatga acagcgtgac agccgccgac accgccacat actattgcgc ccggctggac 300

tacggcaatt atggcggagc catggattac tggggccagg gcacctccgt gacagtgagc 360

tcc 363

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln His Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gacatccaga tgacccagtc ccctaagtcc ctgtctacaa gcgtgggcga tcgggtgacc 60

atcacatgta gaagctccca gcacgtgtct accgcagtgg catggtacca gcagaagcca 120

ggcaagagcc ctaagctgct gatctattcc gcctcttaca ggtattccgg agtgccagac 180

cggtttagcg gctccggctc tggcaccgat ttcaccttta caatctctag cgtgcagcca 240

gaggacttcg ccacatacta ttgccagcag cactacatca ccccatggac cttcggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln His Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gacatccaga tgacccagtc ccctaagtcc atgtctacaa gcgtgggcga cagggtgacc 60

atcacatgta gaagctccca gcacgtgtct accgcagtgg catggtacca gcagaagcca 120

ggcaagagcc ctaagctgct gatctattcc gcctcttaca ggtattccgg agtgccagac 180

cggtttagcg gctccggctc tggcaccgat ttcaccttta caatctctag cgtgcagcca 240

gaggacttcg ccacatacta ttgccagcag cactacatca ccccatggac cttcggcggc 300

ggcacaaagc tggagatcaa g 321

<210> 21

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 22

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcctctacca aggggcccag cgtgtttcct ctcgccccct cctccaaaag caccagcgga 60

ggaaccgctg ctctcggatg tctggtgaag gactacttcc ctgaacccgt caccgtgagc 120

tggaatagcg gcgctctgac aagcggagtc catacattcc ctgctgtgct gcaaagcagc 180

ggactctatt ccctgtccag cgtcgtcaca gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 240

tacatctgta acgtcaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa agtggagccc 300

aaatcctgcg acaagacaca cacctgtccc ccctgtcctg ctcccgaagc tgctggaggc 360

cctagcgtct tcctctttcc tcccaaaccc aaggacaccc tcatgatcag cagaacccct 420

gaagtcacct gtgtcgtcgt ggatgtcagc catgaggacc ccgaggtgaa attcaactgg 480

tatgtcgatg gcgtcgaggt gcacaacgcc aaaaccaagc ccagggagga acagtacaac 540

tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgaca gtcctccacc aggactggct gaacggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct ctccctgccc ccattgagaa gaccatcagc 660

aaggccaaag gccaacccag ggagccccag gtctatacac tgcctccctc cagggacgaa 720

ctcaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtcaagg gcttttatcc cagcgacatc 780

gccgtcgagt gggagtccaa cggacagccc gagaataact acaagaccac ccctcctgtc 840

ctcgactccg acggctcctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa aagcaggtgg 900

cagcagggaa acgtgttctc ctgcagcgtg atgcacgaag ccctccacaa ccactacacc 960

cagaaaagcc tgtccctgag ccccggcaaa 990

<210> 23

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 24

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgtacggtgg cagccccatc tgtcttcatt tttcccccta gtgacgagca gctgaaatcc 60

ggaacagcct ctgtggtctg tctgctgaac aatttctacc ctcgcgaagc caaggtgcag 120

tggaaagtcg ataacgctct gcagagtggc aattcacagg agagcgtgac tgaacaggac 180

tccaaggatt ctacctatag tctgagctcc actctgaccc tgtccaaagc agattacgaa 240

aagcacaaag tgtatgcctg tgaggtcacc caccaggggc tgagttctcc agtcaccaaa 300

tccttcaaca gaggcgaatg t 321

<210> 25

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Phe Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Phe Tyr Cys Thr Arg Glu Ser Thr Thr Tyr Asp Leu Leu Ala Gly Pro

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 26

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 27

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Phe Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Phe Tyr Cys Thr Arg Glu Ser Thr Thr Tyr Asp Leu Leu Ala Gly Pro

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 28

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 29

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Val Ser Gly Asn Tyr Tyr Asn Val Asp Tyr

100 105 110

Tyr Phe Phe Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

130 135 140

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

145 150 155 160

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

165 170 175

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

195 200 205

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

210 215 220

Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

225 230 235 240

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe

245 250 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

260 265 270

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

275 280 285

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

290 295 300

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

305 310 315 320

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

325 330 335

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

340 345 350

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

355 360 365

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

370 375 380

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

385 390 395 400

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

405 410 415

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

420 425 430

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

435 440 445

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 30

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 31

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Val Ser Gly Asn Tyr Tyr Asn Val Asp Tyr

100 105 110

Tyr Phe Phe Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

130 135 140

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

145 150 155 160

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

165 170 175

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

195 200 205

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

210 215 220

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

225 230 235 240

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

245 250 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

260 265 270

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

275 280 285

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

290 295 300

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

305 310 315 320

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

325 330 335

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

340 345 350

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

355 360 365

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

370 375 380

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

385 390 395 400

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

405 410 415

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

420 425 430

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

435 440 445

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 32

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims (46)

1.抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，

所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1至HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1至LCDR3；

HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；

并且按照EU编号系统，所述抗体的重链恒定区包含如下突变：

L234A和L235A；

L234A和G237A；

L235A和G237A；

或者

L234A、L235A和G237A。

2.根据权利要求1所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，按照EU编号系统，所述重链恒定区还包含选自如下的一个或多个突变：

N297A、D265A、D270A、P238D、L328E、E233D、H268D、P271G、A330R、C226S、C229S、E233P、P331S、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、T256E、N297Q、P238S、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、T394D、G236R、G236A、L328R、A330S、H268A、E318A和K320A。

3.根据权利要求1所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 15；并且

所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 19。

4.根据权利要求1所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO: 6所示；

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO: 19所示；

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO: 17所示；

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO: 19所示；

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO: 19所示；或者

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO: 17所示。

5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

6.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，

所述的抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种。

7.根据权利要求6所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述非-CDR区来自人抗体。

8.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链恒定区为Ig gamma-1 chain C region或Ig gamma-4 chain C region；轻链恒定区为Ig kappa chain C region 。

9.根据权利要求8所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述Ig gamma-1chain C region是NCBI ACCESSION: P01857。

10.根据权利要求8所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述Ig gamma-4chain C region是NCBI ACCESSION: P01861.1。

11.根据权利要求8所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述Ig kappa chainC region是NCBI ACCESSION: P01834。

12.根据权利要求8所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，所述抗体的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。

13.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体与TIGIT-mFc结合的EC₅₀小于或等于BMS 22G2。

14.根据权利要求13所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述EC₅₀通过ELISA方法测得。

15.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体与CD155-hFc-Biotin竞争结合TIGIT-mFc的EC₅₀小于0.5nM。

16.根据权利要求15所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述EC₅₀通过竞争ELISA方法测得。

17.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体在10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL的浓度下均无ADCC效应；和/或

所述抗体在10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL的浓度下均无CDC效应。

18.分离的核酸分子，其编码权利要求1至17中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段。

19.一种重组载体，其包含权利要求18所述的分离的核酸分子。

20.一种宿主细胞，其包含权利要求18所述的分离的核酸分子，或者权利要求19所述的重组载体。

21.偶联物，其包括抗体以及偶联部分，其中，所述抗体为权利要求1至17中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为可检测的标记。

22.根据权利要求21所述的偶联物，其中，所述偶联部分为放射性同位素、发光物质、有色物质或酶。

23.根据权利要求21所述的偶联物，其中，所述偶联部分为荧光物质。

24.试剂盒，其包括权利要求1至17中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，或者包括权利要求21至23中任一权利要求所述的偶联物。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗体。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中，所述第二抗体还包括可检测的标记。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中，所述可检测的标记为放射性同位素、发光物质、有色物质或酶。

28.根据权利要求26所述的试剂盒，其中，所述可检测的标记为荧光物质。

29.一种双特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其中：

所述第一蛋白功能区靶向TIGIT，

所述第二蛋白功能区靶向不同于TIGIT的靶点，

其中，所述第一蛋白功能区为权利要求1至17中任一权利要求所述的抗体或抗原结合片段。

30.根据权利要求29所述的双特异性抗体，其中，所述不同于TIGIT的靶点是PD-1。

31.根据权利要求29所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体为IgG-scFv模式。

32.根据权利要求29所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区为权利要求1至17中任一权利要求所述的抗体且为免疫球蛋白形式，并且所述第二蛋白功能区为单链抗体。

33.根据权利要求29所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区为单链抗体，并且所述第二蛋白功能区为靶向不同于TIGIT的靶点的免疫球蛋白形式的抗体。

34.根据权利要求33所述的双特异性抗体，其中，所述不同于TIGIT的靶点是PD-1。

35.根据权利要求29至34中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区直接连接或者通过连接片段连接。

36.根据权利要求29至34中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为1个、2个或者2个以上。

37.根据权利要求32至34中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述单链抗体分别连接在免疫球蛋白形式的抗体的两条重链的C末端。

38.一种药物组合物，其包含权利要求1至17中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段或者权利要求21至23中任一权利要求所述的偶联物。

39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的辅料。

40.根据权利要求38至39中任一权利要求所述的药物组合物，其还包含一种或多种抗PD-1抗体，或者一种或多种抗PD-L1抗体。

41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中，按照抗体的质量计算，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的质量比为（1：5）-（5：1）。

42.一种组合产品，其包含独立包装的第一产品和第二产品，其中，

所述第一产品包含其包含权利要求1至17中任一权利要求所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段或者权利要求21至23中任一权利要求所述的偶联物；

所述第二产品包含至少一种抗PD-1抗体或者至少一种抗PD-L1抗体。

43.根据权利要求42所述的组合产品，其中，所述第一产品和所述第二产品还独立地包含一种或多种药学上可接受的辅料。

44.根据权利要求42所述的组合产品，其中，所述组合产品还包含产品说明书。

45.根据权利要求42至44中任一权利要求所述的组合产品，其中，按照抗体的质量计算，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的质量比为（1：5）-（5：1）。

46.权利要求1至17中任一权利要求所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求21至23中任一权利要求所述的偶联物、权利要求29至37中任一权利要求所述的双特异性抗体或者权利要求38至41中任一权利要求所述的药物组合物在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的用途；

其中，所述肿瘤选自肝癌、肾癌、脑瘤、尿路上皮癌、骨肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素癌、胰腺癌、宫颈瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞瘤、浆细胞癌、子宫内膜癌、前列腺癌和睾丸癌中的一种或多种。

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