TWI857798B - 用於治療及/或預防腫瘤或細胞增生及纖維化疾病之吲哚啉衍生物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於吲哚啉衍生物，及其用於治療及/或預防發炎性病狀或纖維化疾病及腫瘤或細胞增生疾病之用途。

Description

用於治療及/或預防腫瘤或細胞增生及纖維化疾病之吲哚啉衍生物

本發明係關於吲哚啉衍生物及其用於治療及/或預防發炎性病狀或纖維化疾病及腫瘤或細胞增生疾病之用途。

細胞週期蛋白依賴性蛋白激酶8 (CDK8)係一種核絲胺酸-蘇胺酸蛋白激酶，其調節若干轉錄因子及路徑，諸如Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)、TGF-β/Smad及STAT。其中，TGF-β及其在發炎過程中之參與被認為對於引發肺纖維化至關重要。因此，CDK8不僅在調節纖維變性生長因子及發炎信號傳導路徑方面發揮重要作用，而且在轉錄調節方面亦發揮重要作用。

最近對靶向CDK8之小分子抑制劑的研究有所增加，且許多研究已表明CDK8有希望作為各種癌症(諸如結腸直腸癌、轉移性前列腺癌、急性骨髓性白血病及晚期ER(+) HER2(-)轉移性乳癌)治療以及抗發炎及纖維變性療法中之目標。

然而，已觀測到，此等CDK8抑制劑展現代謝不穩定性及非特異性細胞毒性，此可能在所治療患者中導致不良事件，突出顯示了迫切需要發現新的治療目標以改良現有治療及未滿足的醫療需求。

本發明提供一種式(I)化合物： (I)， 或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥、水合物或溶劑合物，其中： R ¹為氫、C _{1 - 6}烷基、C _{1 - 6}鹵烷基、C _{1 - 6}烷氧基、C _{1 - 6}鹵烷氧基或苯基； R ^2a及R ^2b各自獨立地為C _{1 - 6}烷基、C _{1 - 6}烯基或C _{1 - 6}炔基，其視情況經鹵素取代，或 R ^2a及R ^2b與其所連接之碳原子一起形成環C，其中環C為4至6員環烷基或4至6員雜環烷基，其中該4至6員環烷基或4至6員雜環烷基視情況經苯基或苯甲基取代，其中該苯基或苯甲基視情況經鹵素或羥基取代； R ³、R ⁵及R ⁶中之各者獨立地為H、C _{1 - 6}烷基、C _{2 - 6}烯基、C _{2 - 6}炔基、6至10員芳基、5至10員雜芳基、3至8員環烷基、3至8員環烯基、3至8員雜環烷基、3至8員雜環烯基、鹵基、氰基、硝基、OR _a、SR _a、S(O)R _a、SO ₂R _a、CH=CH-C(O)NR _bR _c、NHC(O)-CH=CH-C(O)R _a、NHC(O)-CH=CH-C(O)NR _bR _c、SO ₂NR _bR _c、OC(O)R _a、C(O)NR _bR _c、NR _bRc、NHC(O)R _a、NHC(O)NR _bR _c或NHC(S)R _b，其中R _a、R _b及R _c中之各者獨立地為H、羥基、C _{1 - 6}烷氧基、6至10員芳氧基、5至10員雜芳氧基、C _{1 - 6}烷基、C _{2 - 6}烯基、C _{2 - 6}炔基、6至10員芳基、5至10員雜芳基、3至8員環烷基、3至8員環烯基、3至8員雜環烷基或3至8員雜環烯基；且 R ⁴為氫、C _{1 - 10}脂族基、苯基或5至6員雜芳基，其視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、羥基、硝基、氰基、胺基、苯基、5至6員雜芳基、C ₁- ₆烷氧基及C ₁- ₆鹵烷氧基； 環A為苯基、二唑、噻二唑、噻唑并苯或苯并哌𠯤，其視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：側氧基、鹵素、C _{1 - 6}烷基、苯基、二唑及C _{1 - 3}烷基胺基羰基，其中該取代基C _{1 - 6}烷基、苯基及二唑視情況進一步經鹵素、C _{1 - 3}烷基或其任何組合取代； -L-為-O-、-NR ^a-、-C(=O)-、-NR ^a-C(=O)-或-C(=O)-NR ^a-，其中R ^a具有如上文所定義之含義；且 環B為苯基、二唑或吡啶，其視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：硝基、鹵素、烷基、吡啶及C _{1 - 3}烷基胺基羰基；或 -L-B不存在。

在各種實施例中，在式(I)化合物中，R ¹為氫且R ^2a及R ^2b各自獨立地為甲基。在各種實施例中，環A經鹵素取代。

在一個實施例中，在式(I)化合物中，環A為苯基、二唑、噻二唑、噻唑并苯或苯并哌𠯤，其視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：側氧基、鹵素、C _{1 - 6}烷基、苯基、二唑及C _{1 - 3}烷基胺基羰基，其中該取代基C _{1 - 6}烷基、苯基及二唑視情況進一步經鹵素、C _{1 - 3}烷基或其任何組合取代； -L-為-O-、-NR ^a-或-C(=O)-；且 環B為苯基、二唑或吡啶，其視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、烷基及C _{1 - 3}烷基胺基羰基；或 -L-B不存在。

在一個實施例中，在式(I)化合物中，環A為視情況經一或多個選自由鹵素及C _{1 - 6}烷基組成之群的取代基取代之苯基；L為-O-、-NH-、-C(=O)-或-C(=O)-NR ^a-，其中環A連接至N原子；且環B為視情況經一或多個選自由硝基、鹵素、C _{1 - 6}烷基及C _{1 - 3}烷基胺基羰基組成之群的取代基取代之苯基或吡啶。

在一個實施例中，在式(I)化合物中，環A為苯基、二唑或噻二唑，其經一或多個選自由苯基、二唑或C _{1 - 3}烷基胺基羰基組成之群的取代基取代，且取代基苯基及二唑視情況進一步經C _{1 - 3}烷基取代；且-L-B不存在。

在一個實施例中，在式(I)化合物中，環A為噻唑并苯或苯并哌𠯤，其視情況經一或多個選自由側氧基、鹵素及烷基組成之群的取代基取代；且-L-B不存在。

在一個實施例中，在式(I)化合物中，環A為苯基，其視情況經一或多個選自由鹵素及烷基組成之群的取代基取代；-L-為-NH-；且環B為視情況經一或多個選自由鹵素及C _{1 - 6}烷基組成之群的取代基取代之吡啶。

在一個實施例中，在式(I)化合物中，環A為經鹵素取代之苯基；-L-為-O-；環B為經C _{1 - 3}烷基胺基羰基取代之吡啶。

在一個實施例中，式(I)化合物具有式(II)： ， 其中R係選自由以下組成之群： 。

在一個實施例中，在式(I)化合物中，環C為環丁烷、環己烷或哌啶，且環C視情況經苯甲基或苯基取代，其中該苯甲基或苯基視情況經羥基取代。

在一個實施例中，式(I)化合物具有式(III)： ， 其中R ¹、R ³、R ⁴、R ⁵、R ⁶、環A、環B及L如上文所定義，且環C係選自由以下組成之群：

、	、
及	。

本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥、水合物及溶劑合物，以及醫藥學上可接受之載劑。

本發明亦提供一種抑制個體內之CDK8的方法，其包含向該個體投與治療有效量之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥、水合物及溶劑合物。

本發明亦提供一種預防或治療發炎性病狀及/或纖維化疾病之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如本文所揭示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥、水合物及溶劑合物。

本發明亦提供一種預防或治療腫瘤及/或細胞增生疾病之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如本文所揭示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥、水合物及溶劑合物。

本發明至少部分基於使用吲哚啉衍生物及其預防及/或治療發炎性病狀或纖維化疾病之有效劑量的發現。化合物可有效預防及/或治療發炎性病狀或纖維化疾病而無細胞毒性或基因毒性。

如本文所用，除非上下文另有要求，否則術語「包含(comprise)」及該術語之變化形式，諸如「包含(comprising)」、「包含(comprises)」及「包含(comprised)」並不意欲排除其他添加物、組分、整數或步驟。

如本文所用，除非上下文另有要求，否則所揭示之方法步驟並不意欲為限制性的，亦不意欲指示各步驟對於該方法必不可少或各步驟必須按所揭示之次序進行。

如本文所用，除非另外說明，否則「或」之使用意謂「及/或」。在多重附屬項之情況下，使用「或」僅以替代之方式重新提及超過一個前述獨立項或附屬項。

如本文所用，所有數字均為近似值，且可變化以考慮量測誤差及有效數位之捨入。在某些量測量之前使用「約」包括歸因於樣本雜質、量測誤差、人為誤差及統計變化以及有效數位之捨入的變化。

如本文所用，術語「約」係指由一般技術者量測之既定值的可接受偏差，部分取決於如何量測或確定該值。

如本文所用，術語「脂族」或「脂族基」可包括飽和或不飽和直鏈、分支鏈或環狀基團，例如(環)烷烴、(環)烯烴、(環)炔烴等。在某些情況下，脂族基可含有在鏈中間雜或充當環成員原子之雜原子。

如本文所用，術語「烷基」係指飽和直鏈或分支鏈烷基，其較佳包含1-20個碳原子，且更佳1-6個碳原子，或指定碳原子數。烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、二級丁基、異丁基、三級丁基、2-乙基丁基、正戊基、異戊基、1-甲基戊基、1,3-二甲基丁基、正己基、1-甲基己基、正庚基、異庚基、1,1,3,3-四甲基丁基、1-甲基庚基、3-甲基庚基、正辛基、2-乙基己基、1,1,3-三甲基己基、1,1,3,3-四甲基戊基、壬基、癸基、十一基、1-甲基十一基、十二基、1,1,3,3,5,5-六甲基己基、十三基、十四基、十五基、十六基、十七基、十八基或其類似基團。

如本文所用，術語「烷氧基(alkoxyl)」或「烷氧基(alkoxy)」意謂具有式「-O-烷基」之基團，其中該式中「烷基」之定義具有如上文所陳述之「烷基」之含義。

如本文所用，如本文所用之術語「環烷基」意謂含有3至10個環碳原子且更佳3至8個環碳原子且視情況在環上含有烷基取代基之飽和或部分不飽和環狀碳基團。環烷基之實例包括但不限於環丙基、環丙烯基、環丁基、環戊基、環己基、2-環己烯-1-基及其類似基團。

如本文所用，術語「芳族」、「芳族基」或「芳基」係指具有芳族性之基團，其可具有6至12個環成員且可具有單環或多環(稠合)環。芳族基之實例包括但不限於苯基、苯甲基、聯苯、萘、茀等。

如本文所用，術語「雜芳基」係指具有芳族性之基團，其可具有5至12個環成員及至少一個較佳選自氮、氧及硫之雜原子作為環成員且可具有單環或多環(稠合)環。芳族基之實例包括但不限於吡咯、吡啶、噻吩、㗁唑、呋喃、嘧啶、二唑、三唑、噻二唑、噻唑并苯、苯并哌𠯤等。

如本文所用，術語「鹵素」或「鹵基」表示氟、氯、溴或碘。

如本文所用，如本文所用之術語「胺基」意謂式-NR'R"之官能基，其中R'及R"各自獨立地表示氫、如上文所定義之脂族基或芳族基。

如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指在合理醫學判斷範疇內適用於與人類及低等動物之組織接觸而無不當毒性、刺激、過敏反應及其類似者且與合理益處/風險比相稱的彼等鹽。醫藥學上可接受之鹽為此項技術中所熟知。本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽包括衍生自適合無機及有機酸及鹼之彼等鹽。醫藥學上可接受之無毒性酸加成鹽之實例為胺基與無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及過氯酸)或與有機酸(諸如乙酸、草酸、順丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、丁二酸或丙二酸)形成之鹽，或藉由使用此項技術中已知之其他方法(諸如離子交換)形成之鹽。其他醫藥學上可接受之鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酯酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似鹽。衍生自適當鹼之鹽包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及銨鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及其類似鹽。適當時，另外的醫藥學上可接受之鹽包括無毒銨、四級銨及胺陽離子使用諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳數烷基磺酸根及芳基磺酸根之相對離子形成。

術語「溶劑合物」係指通常藉由溶劑分解反應與溶劑締合之化合物之形式。此物理/化學締合可包括氫鍵結。習知溶劑包含水(亦即，形成水合物)、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、二乙醚以及類似物。本文所描述之化合物可例如以結晶形式製備且可溶劑化。適合的溶劑合物包括醫藥學上可接受之溶劑合物且進一步包括化學計量溶劑合物及非化學計量溶劑合物兩者。在某些情況下，例如當一或多個溶劑分子併入結晶固體之晶格時，溶劑合物將能夠分離。「溶劑合物」涵蓋溶液相與可分離溶劑合物。代表性溶劑合物包括水合物、乙醇合物及甲醇合物。

術語「前藥」係指具有可裂解基團且藉由溶劑分解或在生理條件下變成在活體內具有醫藥活性之本文所描述之化合物的化合物，包括本文所描述之化合物的衍生物。此類實例包括但不限於膽鹼酯衍生物及其類似物、N-烷基𠰌啉酯及其類似物。本發明化合物之其他衍生物的酸及酸衍生物形式皆具有活性，但酸敏感形式通常提供在哺乳動物生物體中之溶解度、組織相容性或延緩釋放之優勢。前藥包括熟習此項技術者熟知之酸衍生物，諸如藉由母體酸與適合醇反應製備之酯，或藉由母體酸化合物與經取代或未經取代之胺反應製備之醯胺，或酸酐或混合酸酐。

如本文所用，術語「投與(administer)」、「投與(administering)」或「投與(administration)」係指將本發明化合物或其醫藥組合物植入、吸收、攝入、注入、吸入或以其他方式引入個體體內或體表。

如本文所用，術語「病狀」、「疾病」及「病症」可互換使用。

本文所描述之化合物的「有效量」係指足以引起所需生物反應，亦即治療病狀的量。如一般熟習此項技術者將瞭解，本文所描述之化合物的有效量可視諸如所需生物學終點、化合物之藥物動力學、所治療之病狀、投與模式以及個體之年齡及健康狀況等因素而變化。有效量涵蓋治療性及預防性治療。

本文所描述之化合物的「治療有效量」為足以在病狀之治療中提供治療益處或足以延緩或使與病狀相關之一或多個症狀減至最小的量。化合物之治療有效量意謂單獨或與其他療法組合，在病狀之治療中提供治療效益之治療劑的量。術語「治療有效量」可涵蓋改善整體療法、減少或避免病狀之症狀或病因及/或增強另一治療劑之治療功效的量。

如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指此項技術中習知的用於與治療劑一起投與個體之固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料、調配助劑或載劑。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且與調配物之其他成分相容。醫藥學上可接受之載劑部分由所投與之特定組合物以及用於投與組合物之特定方法決定。

如本文所用，術語「個體」在本文中定義為包括動物，諸如哺乳動物，包括但不限於靈長類動物(例如人類)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠及其類似動物。在特定實施例中，個體為人類。術語「個體」及「患者」在本文中關於例如哺乳動物個體(諸如人類)時可互換使用。

如本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treating)」及「治療(treatment)」係指疾病或病症或者與疾病或病症相關之一或多種症狀的根除或改善。在某些實施例中，該等術語係指使由向患有此類疾病或病症之個體投與一或多種預防劑或治療劑產生之疾病或病症擴散或惡化減至最小。在一些實施例中，該等術語係指在特定疾病之診斷或症狀發作之後投與本文所提供之化合物或劑型，伴隨或不伴隨一或多種額外活性劑。

如本文所用，術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」及「預防(prevention)」係指預防疾病或病症或其一或多種症狀的發作、復發或擴散。在某些實施例中，該等術語係指在症狀發作之前，尤其對處於本文所提供之疾病或病症風險下之患者，用本文所提供之化合物或抗體或劑型治療或投與本文所提供之化合物或抗體或劑型，伴隨或不伴隨一或多種其他額外活性劑。該等術語涵蓋特定疾病之症狀之抑制或減少。

如本文所用，除非另外指示，否則術語「共同投與」及「與……組合」包括在無特定時間限制情況下同時、並行、分開或依序投與兩種或更多種治療劑。在一個實施例中，治療劑在同一組合物或單位劑型中。在其他實施例中，治療劑在單獨組合物或單位劑型中。

本發明人發現，特定吲哚啉衍生化合物可展現優良的抑制CDK8之作用及治療CDK8相關疾病之潛力。因此，在一個態樣中，本發明係關於式(I)化合物：

，

或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥、水合物或溶劑合物，其中環A、環B、連接子L、R ¹、R ^2a、R ^2b、R ³及R ⁴之定義如上文所定義。

在各種實施例中，基團之定義如上文所定義。

在一個實施例中，式(I)化合物選自由以下組成之群： N-(4-(4-硝基苯氧基)苯基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺， 2-側氧基-N-(4-(苯胺基)苯基)-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺， N-(4-((2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉)-5-磺醯胺基)苯基)苯甲醯胺， N-(4-苯甲醯基苯基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺， 2-側氧基-N-(5-苯基-1H-吡唑-3-基)-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺， 2-側氧基-3-(丙-2-亞基)-N-(5-(對甲苯基)-1H-吡唑-3-基)吲哚啉-5-磺醯胺， 2-側氧基-N-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基)-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺， N-(苯并[d]噻唑-2-基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺， N-(4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺， N-甲基-4-(4-((2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉)-5-磺醯胺基)苯氧基)吡啶甲醯胺， 4-(3-氟-4-((2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉)-5-磺醯胺基)苯氧基)-N-甲基吡啶甲醯胺， 2-氟-N-甲基-4-((2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉)-5-磺醯胺基)苯甲醯胺， N-(4-甲基-3-((4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)胺基)苯基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺，及 N-(1,4-二側氧基-1,2,3,4-四氫呔𠯤-5-基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺， 或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥、水合物或溶劑合物。

式(I)化合物可根據各種化學合成方法製備。在一個實施例中，化合物可經由以下描繪之流程1製備： ， 其中R ¹、R ^2a、R ^2b、R ³、R ⁴、R ⁵、R ⁶、環A、環B及L如上文所定義。

本文所描述之化合物可藉由常用的方法，使用本領域中常用之賦形劑(亦即醫藥賦形劑、醫藥載劑或其類似者)來製備醫藥組合物。

作為用於經口投與之固體組合物，使用錠劑、散劑、顆粒及其類似者。在此種固體組合物中，將一種或兩種或更多種活性成分與至少一種惰性賦形劑混合。利用常用方法，組合物可含有惰性添加劑，例如潤滑劑、崩解劑、穩定劑、增溶劑及其類似者。

經口投與之液體組合物包括醫藥學上可接受之乳液、溶液製劑、懸浮液、糖漿或酏劑及其類似者，且包括通常使用之惰性稀釋劑，例如純化水或乙醇。除惰性稀釋劑以外，液體組合物可含有佐劑，諸如增溶劑、濕潤劑及懸浮液、甜味劑、香料、芳香劑或防腐劑。

固體組合物或液體組合物亦可經囊封以形成膠囊，包括(但不限於)軟膠囊或硬膠囊。

醫藥組合物亦可經由向個體注射使用。非經腸投與之注射包括無菌水溶液或非水溶液製劑、懸浮液或乳液。作為水溶劑，例如包括注射用蒸餾水或生理鹽水。作為非水溶劑，例如包括醇，諸如乙醇。此類組合物可進一步包括張力劑、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、穩定劑或增溶劑。此等藉由例如經由細菌截留過濾器過濾，混合殺菌劑或照射來殺菌。另外，此等亦可以製備無菌固體組合物，且在使用之前將其溶解或懸浮於無菌水或注射用無菌溶劑中的方式來使用。

經黏膜劑(諸如經鼻劑及其類似者)以固體、液體或半固體形式使用，且可根據相關技術中已知之方法製備。舉例而言，可適當地添加已知賦形劑、pH調節劑、防腐劑、界面活性劑、潤滑劑、穩定劑、增稠劑及其類似者。在投與中，可使用用於吸入或吹入之適當裝置。

在另一態樣中，本發明係關於一種預防或治療發炎性病狀或纖維化疾病之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所定義的化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥、水合物及溶劑合物。

可使用CDK8抑制劑治療之示例發炎性病狀或纖維化疾病包括但不限於第1型糖尿病移植物抗宿主病、發炎性腸病、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、食物過敏、HCV血管炎、斑禿、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化症、類風濕性關節炎；皮膚纖維化、肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、腸纖維化、囊腫纖維化、心肌纖維化、子宮平滑肌瘤及子宮腺肌症。

在某些實施例中，肺纖維化為特發性肺纖維化(IPF)。

在另一態樣中，本發明係關於一種預防或治療腫瘤或細胞增生疾病之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物、鏡像異構物、前藥、水合物及溶劑合物。

在某些實施例中，腫瘤或細胞增生疾病或癌症轉移選自由以下組成之群的至少一者：上皮癌、表皮樣癌、梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)、肝癌、子宮頸癌、肛門癌、陰莖癌、外陰癌、陰道癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、皮膚癌、黑色素瘤、口腔癌、結腸癌、頸癌、腎癌(renal cancer)、腎癌(kidney cancer)、肝癌、結腸直腸癌、食道癌、甲狀腺癌、葡萄膜癌、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)、頭癌、眼癌、慢性骨髓性白血病、骨髓細胞白血病、神經膠質瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)或人類喉鱗狀細胞癌、白血病、鼻咽癌、間皮瘤、骨癌、腦癌、前列腺癌、睪丸癌、胰臟癌、肝細胞癌、肺癌、鱗狀細胞癌及淋巴瘤。在一些實施例中，癌症經鑑別為過度表現CDK8。在某些實施例中，癌症為結腸癌、乳癌及前列腺癌(CRC)。

現已藉助於書面描述來描述本發明，熟習此項技術者將認識到本發明可在多種實施例中實踐，且前述描述及下文實例係出於說明而非限制以下申請專利範圍之目的。 實例

材料及方法

材料

針對N-鈣黏蛋白、Snail、p-Smad2 (Ser465/467)、Smad3、p-RNA Pol II (Ser2/5)、Akt、p-Akt (Ser473)、p-GSK3β (Ser9)、活性形式β-連環蛋白、組蛋白3之初級抗體及經標記二級抗體抗兔IgG-HRP係購自Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)。針對STAT1、p-STAT1 (Ser727)之初級抗體來自Abcam (Cambridge, MA, USA)，而針對E-鈣黏蛋白、波形蛋白、p-Smad3 (Thr179)、β-肌動蛋白之初級抗體來自ABclonal (Woburn, MA, USA)。CDK8、β-SMA、GSK3β-微管蛋白初級抗體及抗兔IgG二級抗體DyLight 594係購自GeneTexInc. (Hsinchu, Taiwan)。pcDNA3 CDK8 HA (P#634)係來自Matija Peterlin之禮品(Addgene plasmid #14649; http://n2t. net/addgene:14649; RRID:Addgene_14649)；7TFP CDH1報導體係來自Bob Weinberg之禮品(Addgene plasmid #91704; http://n2t. net/addgene:91704; RRID:Addgene_91704)。TurboFect轉染試劑來自Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)。

激酶抑制分析

使用Thermo Fisher SelectScreen服務(www.thermofisher.com/ selectscreen)測試化合物之激酶抑制活性。對於CDK8，使用LanthaScreen Eu結合分析。簡言之，所用分析利用針對給定激酶之螢光示蹤劑。此用於偵測抗標籤抗體之添加。當示蹤劑及抗體結合至靶向激酶時，量測福斯特共振能量轉移(Forster resonance energy transfer)。當激酶抑制劑添加至分析中時，示蹤劑/激酶結合將被破壞，產生低FRET偵測且指示激酶抑制活性。其他激酶目標之激酶活性的評估利用由Thermo Fisher SelectScreen服務提供之LanthaScreen結合分析或Z'-Lyte活性分析。使用連續劑量確定IC ₅₀值，且抑制曲線由Thermo Fisher Scientific提供。

細胞培養

人類A549肺泡上皮細胞、人類前列腺癌細胞株PC-3及DU145獲自生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center) (Hsinchu City, Taiwan)。人類A549肺泡上皮細胞維持在補充有10%胎牛血清(v/v) (Invitrogen Life Technologies, USA)、青黴素(100單位/mL)及鏈黴素(100 μg/mL) (Biological Industries, Israel)之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM；Invitrogen Life Technologies, USA)中。人類前列腺癌細胞株PC-3及DU145在補充有10%胎牛血清(v/v)、青黴素(100單位/mL)及鏈黴素(100 μg/mL)之洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI) 1640培養基或最低必需伊格爾培養基(Minimum essential medium Eagle)中培養。所有細胞維持在37℃下，在含有5% CO ₂之潮濕氛圍中。

細胞毒性分析

人類A549肺泡上皮細胞

藉由比色MTT分析量測細胞毒性。將96孔盤中1 mL培養基中之細胞(10 ⁴個)與媒劑(對照)或含有測試化合物之媒劑一起培育48小時。在各種處理之後，添加1 mg/mL MTT，且將盤在37℃下再培育2小時。隨後使細胞沈澱(pelleted)且用含0.01 M HCl之10%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解，且在微量盤讀取器上量測570 nm處之吸光度。

人類前列腺癌細胞株PC-3及DU145

使用MTT分析評估細胞毒性。將96孔盤中100 μL培養基中之細胞用媒劑或測試化合物處理24小時。隨後，添加0.5 mg/mL MTT，且將盤在37℃下再培育2小時。隨後使細胞沈澱且溶解於100 μL二甲亞碸中，且用微量盤讀取器量測550 nm處之吸光度。

RNA 提取及即時聚合酶鏈反應 ( PCR )

人類A549肺泡上皮細胞

使用TRIzol及Direct-zol™ RNA MiniPrep套組(ZYMO Research, USA)遵循製造商說明書分離總RNA。使用隨機引子及M-MLRT反轉錄為互補(c)DNA。簡言之，使用1 μg信使(m)RNA與隨機引子在65℃下一起培育5分鐘且隨後與M-MLRT在37℃下反應1小時來合成第一股cDNA。對於即時PCR，cDNA在SYBR綠色PCR主混合物(Life Technologies, USA)中擴增，且用Applied Biosystems StepOnePlus™ Q-PCR偵測系統(Thermo Fisher Scientific, USA)偵測。相對基因表現以GAPDH標準化且藉由使用2( ^{- ΔΔCT})方法計算。

人類前列腺癌細胞株PC-3及DU145

使用TRIzol試劑(Invitrogen)自細胞分離總RNA。使用隨機引子及莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)反轉錄酶(Promega)由5 μg總RNA合成聚合酶鏈反應模板之單股cDNA。定量PCR使用TaqMan一步RT-PCR主混合物(ABI)以每反應20 μL之總反應體積進行，由10 μL SYBR綠色PCR主混合物(Applied Biosystems)、5 pmol各正向/反向引子及2 μL cDNA組成。用於擴增之寡核苷酸引子如下：對於E-鈣黏蛋白，5'-AAAGGCCCATTTCCTAAAAACCT-3' (正向)及5'-TGCGTTCTCTATCCAGAGGCT-3' (反向)；Snail，5'-GAGGACAGTGGGAAAGGCTC-3' (正向)及5'-TGGCTTCGGATGTGCATCTT-3' (反向)；α-SMA，5'-AAAAGACAGCTACGTGGGTGA-3' (正向)及5'-GCCATGTTCTATCGGGTACTTC-3' (反向)；GAPDH，5'-CCATCACCATCTTCCAGGAGCG-3' (正向)及5'-AGAGATGATGACCCTTTTGGC-3' (反向)。GAPDH充當內源對照以將各樣本中總RNA含量之變化標準化。偵測擴增之指數期中的臨限循環(Ct)，藉由計算ΔΔCt值確定相對mRNA表現量，且變化倍數表示為2 ^{- ΔΔCt}。各對照樣本之值設定為1且用於計算目標基因表現之變化倍數。

免疫墨點及免疫沈澱分析

人類A549肺泡上皮細胞

將細胞(10 ⁶個)在溶解緩衝液(pH 7.4之20 mM HEPES，2 mM EGTA，50 mM β-甘油磷酸鹽，0.1% Triton X-100，10%甘油，1 mM DTT，1 μg/mL亮抑酶肽(leupeptin)，5 μg/mL抑肽酶(aprotinin)，1 mM苯甲基磺醯氟及1 mM原釩酸鈉)中在4℃下培育10分鐘，刮下，在冰上再培育10分鐘，且在4℃下以17,000 g離心30分鐘。隨後將蛋白質樣本(20 μg)在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)凝膠上電泳且轉移至硝化纖維素膜，隨後藉由與5%牛血清白蛋白(BSA)一起在含0.1% Tween-20之Tris緩衝生理鹽水(TBST)中在室溫下培育30分鐘來阻斷。免疫墨點法如下進行：與初級抗體一起在TBST中在4℃下培育隔夜，接著與辣根過氧化酶(HRP)結合之二級抗體一起在室溫下培育1小時。結合抗體使用增強化學冷光(ECL)試劑(GE Healthcare, UK)來量測且暴露於照相軟片。

人類前列腺癌細胞株PC-3及DU145

將細胞在溶解緩衝液中在4℃下培育10分鐘，刮下，在冰上再培育10分鐘且隨後在4℃下以17,000 g離心30分鐘。蛋白質樣本在SDS-PAGE凝膠上電泳，轉移至PVDF膜且在室溫下用含5%脫脂牛乳之PBS阻斷30分鐘。免疫墨點法如下進行：用含初級抗體之PBS在4℃下隔夜，接著與HRP結合之二級抗體在室溫下一起培育1小時。結合抗體將使用ECL試劑來量測且暴露於照相軟片。在免疫沈澱分析中，細胞溶解產物用1 μg抗體及A/G瓊脂糖珠粒在4℃下免疫沈澱隔夜。在用1 mL冰冷細胞溶解緩衝液洗滌沈澱珠粒三次之後，將結合之免疫複合物藉由10% SDS-PAGE分離，且用免疫墨點法進行分析。

免疫螢光染色

人類前列腺癌細胞株PC-3及DU145

將細胞接種於24孔盤中，用藥物處理12小時，且用含8%多聚甲醛之PBS固定15分鐘。用PBS洗滌兩次(每次洗滌10分鐘)之後，用含0.1% Triton X-100之PBS滲透細胞10分鐘。將細胞用PBS沖洗兩次，每次10分鐘，用含5% BSA之PBS阻斷1小時，且隨後與初級抗體一起培育隔夜，接著與FITC結合之抗兔IgG抗體一起培育2小時。將含有DAPI染色劑之封固劑滴至載玻片上，且將蓋玻片重新覆蓋至載玻片上。藉由ZEISS ApoTome.2顯微鏡偵測影像。

傷口癒合分析

人類A549肺泡上皮細胞

將細胞接種於六孔盤中且培養至90%滿度，此時用無菌10 μL移液管尖端損傷細胞單層且用培養基洗滌以移除分離之細胞。將細胞在存在或不存在測試化合物之情況下培育24小時且拍照。隨後使用ImageJ軟體(美國國家衛生研究院(National Institutes of Health, USA))確定傷口閉合百分比。

細胞解剖方法

人類A549肺泡上皮細胞

細胞核/細胞溶質分級分離套組(Biovision, USA)用於分離細胞溶質及細胞核部分。簡言之，收集細胞且將其以600 g離心5分鐘，移除上清液，且將溶解產物再懸浮於細胞溶質提取緩衝液-A中，劇烈渦旋15秒，且置於冰上10分鐘。隨後將細胞溶質提取緩衝液-B添加至混合物中，渦旋5秒，在冰上培育1分鐘，且以14,500 rpm離心以獲取細胞溶質部分。將剩餘沈澱物再懸浮於細胞核提取緩衝液中，渦旋15秒，且隨後冰凍10分鐘。在重複此程序四次之後，將樣本以14,500 rpm離心以獲取細胞核提取物。

氧化壓力之估計

人類A549肺泡上皮細胞

根據分析方案(Cell Biolabs, USA)，使用丙二醛雙(二甲縮醛)作為標準物，藉由分光光度法在532 nm之波長處量測脂質過氧化之最終產物丙二醛(MDA)。

免疫組織化學分析

人類前列腺癌細胞株PC-3及DU145

組織切片經受脫蠟及復水。藉由將載玻片在Trilogy溶液(Cell Marque, Hot Springs, AR)中在121℃下高壓處理10分鐘來進行抗原修復。將載玻片用3% H ₂O ₂及5%胎牛血清阻斷，與初級抗體一起在4℃培育隔夜，且隨後用聚合物-HRP試劑(Dako Cytomation, Glostrup, Denmark)處理。使用二胺基-聯苯胺四鹽酸鹽溶液(DAKO)觀測過氧化酶活性，且用蘇木精對切片進行對比染色。深棕色核染色定義為陽性，無染色定義為陰性。

資料分析及統計分析

資料表示為平均值±平均值之標準誤差(SEM)，且使用單因子變異數分析(ANOVA)進行分析。當ANOVA顯示組之間的顯著差異時，使用杜凱氏事後檢定(Tukey's post hoctest)來確定顯示統計顯著差異之組對。 p＜0.05之參數視為統計顯著。

對於個別基因之差異表現分析，利用兩個線上資料庫儲存庫cBioPortal (www.cbioportal.org)及Gene Expression Omnibus (GEO; www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)來存取臨床總轉錄本資料集。下載資料集(TCGA，n=494；GSE74685，n=171)且分析跨不同前列腺癌患者組中之查詢基因的mRNA含量。統計顯著性之計算以及盒狀圖之建構係使用SigmaPlot軟體進行。用KM繪圖器線上工具(www.kmplot.com)產生卡本-麥爾圖。獲自cBioPortal及GEO資料庫之資料集含有關於直至癌症進展(TCGA，n=492)及生物化學復發(GSE70769，n=92)之時間的資訊，被轉移至用於曲線繪製之站點。藉由考克斯比例風險回歸分析(Cox proportional hazards regression analysis)確定定義低及高表現組之基因表現截止值，且選擇最佳截止值用於最終分析。經由基因集富集分析(GSEA)軟體版本4.2.2評估整個信號路徑或蛋白質複合物之表現模式。將獲自cBioPortal (Abida等人)及GEO資料庫(GSE68882、GSE16560)之資料集中的患者樣本首先手動分選成兩組(根據格里森評分或轉移事件)，且隨後導入程式中進行基因排序。

合成程序

用於合成化合物 a - n 之通用程序

使用Bruker Fourier 300 MHz、JEOL 400 MHz、AVIII 500 MHz及Agilent 600 MHz譜儀用標準附加程式獲得核磁共振(NMR)譜(1H及13C NMR)。化學位移以百萬分率(ppm， δ)呈現，其中TMS作為內標。在Finnigan Mat TSQ-7000質譜儀(HRESIMS)上量測質譜(MS)資料。使用C18管柱(250×4.6 mm, Waters)及L-2130 (Hitachi, Japan)/LC-20AT (Shimadzu, Japan)泵進行HPLC。在矽膠(70-230目，Merck, Germany)上進行管柱層析。在矽膠板(KG60-F254, Merck)上進行薄層層析(TLC)分析。除非另外提及，否則所有化學品及材料按自商業供應商接收到的原樣不經純化即使用。在N ₂下，自氫化鈣中蒸餾出無水二氯甲烷。

實例 1 ： 合成化合物庫 ( 化合物 a 至 n )

實例1之例示性通用途徑展示如下： 。

製備 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 2 - 酮(化合物2)

向化合物 1(100 mg，0.75 mmol)於CH ₃H ₆O (3 mL，0.25 M)中之攪拌溶液中添加𠰌啉(65 mg，0.75 mmol)。將溶液在回流溫度下攪拌22小時，且隨後真空濃縮。用蒸餾H ₂O稀釋殘餘物。藉由過濾收集固體且用蒸餾H ₂O洗滌，得到呈固體狀之化合物 2(154 mg，89%)。 ¹H NMR (300 MHz, CDCl ₃) δ8.22 (s,1H), 7.52 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.19 (m, 1H), 7.01 (m, 1H), 6.86 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 2.62 (s, 3H), 2.38 (s, 3H)。 ¹³C NMR (125 MHz, CDCl ₃) δ169.9, 155.7, 139.5, 127.7, 124.5, 123.8, 123.2, 121.7, 109.5, 25.4, 23.3

製備 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯氯(化合物3)

將氯磺酸(269 mg，2.31mmol)緩慢逐滴添加至化合物2 (100 mg，0.58 mmol)中。在冰浴下攪拌溶液2小時。遵循針對化合物2所描述之程序，得到呈固體狀之3 (153 mg，98%)。 ¹H NMR (300 MHz, CDCl ₃) δ 8.33 (s,1H), 8.14 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 1.9, 8.4 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 2.68 (s, 3H), 2.50 (s, 3H)。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆) δ 168.8, 161.2, 147.4, 137.2, 128.9, 125.7, 122.7, 121.9, 110.4, 25.5, 23.2

本文所描述之化合物，例如以下例示性化合物，可以類似於如上文所描述之程序用市售且適當的起始材料或如本文所描述製備之中間物合成。

製備 N -( 4 -( 4 - 硝基苯氧基 ) 苯基 )- 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 a )

向化合物 3(100 mg，0.37 mmol)於THF-H ₂O (5:3，16 mL)中之溶液中添加K ₂CO ₃(102 mg，0.74 mmol)及4-(4-硝基苯氧基)苯胺(85 mg，0.37 mmol)。將所得溶液在室溫(RT)下攪拌5小時，且隨後真空濃縮。將殘餘物用蒸餾H ₂O (10 mL)稀釋，用1 N HCl _{( aq )}中和至pH 7，且用EtOAc (30 mL×3)萃取。有機層經Na ₂SO ₄乾燥，且隨後在過濾之後真空移除。藉由矽膠層析(MeOH/CH ₂Cl ₂=1:99)純化殘餘物，得到呈固體狀之化合物a (146 mg，40%)。 ¹H NMR (300 MHz, DMSO- d ₆) δ 10.90 (s, 1 H, H-1), 10.19 (s, 1 H, H-9), 8.15 (m, 2 H, H-19, 21), 7.82 (s, 1 H, H-4), 7.58 (dd, J = 1.3, 8.3 Hz, 1 H, H-6), 7.17 (d, J = 8.9 Hz, 2 H, H-11, 15), 7.08 (d, J = 8.9 Hz, 2 H, H-12, H-14), 7.01 (m, 2 H, H-18, 22), 6.93 (d, J = 8.2 Hz, 1 H, H-7), 2.53 (s, 3 H, H-1'), 2.30 (s, 3 H, H- 3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆) δ 168.3 (C-2), 165.0 (C-20), 162.9 (C-2'), 158.0 (C-13), 143.9 (C-7a), 142.1 (C-17), 135.3 (C-10), 133.7 (C- 5), 127.2 (C-6), 126.1 (C-19, 21), 123.7 (C-4a), 122.6 (C-11, 15), 121.5 (C-3, 4), 121.4 (C-12, 14), 117.0 (C-18, 22), 108.8 (C-7), 24.9 (C-3'), 22.6 (C-1')。HRMS-ESI：C ₂₃H ₂₀O ₆N ₃S之m/z [M+H] ⁺計算值466.1067，實驗值466.1070。

製備 2 - 側氧基 - N -( 4 -( 苯胺基 ) 苯基 )- 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 b )

向 N1-苯基苯-1,4-二胺(68 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N ₂下攪拌3小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 a所描述之程序，得到呈固體狀之 b(159 mg，99%)。 ¹H NMR (600 MHz, DMSO- d ₆) δ10.84 (s, 1 H, H-1), 9.67 (s, 1 H, H-9), 8.03 (s, 1 H, H-16), 7.72 (m, 1 H, H-4), 7.54 (dd, J= 1.8, 8.2 Hz, 1 H, H-6), 7.18 (m, 2 H, H-19, 21), 6.95 (dd, J= 1.1, 8.6 Hz, 2 H, H-18, 22), 6.93 (m, 4 H, H-11, 12, 14, 15), 6.90 (d, J= 8.2 Hz, 1 H, H-7), 6.77 (m, 1 H, H-20), 2.51 (s, 3 H, H-1'), 2.26 (s, 3 H, H-3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.3 (C-2), 157.6 (C-2'), 143.6 (C-7a), 143.5 (C-17), 140.5 (C-10), 131.6 (C-5), 129.7 (C-13), 129.1 (C- 14, 19, 21), 127.1 (C-4a, 6), 123.5 (C-11, 15), 121.6 (C-3), 121.5 (C-4), 119.4(C-20), 117.5 (C-12), 116.2 (C-18, 22), 108.7 (C-7), 24.9 (C-3'), 22.5 (C-1')。HRMS-ESI：C ₂₃H ₂₂O ₃N ₃S之 m/z[M+H] ⁺計算值420.1376，實驗值420.1377。

製備 N -( 4 -(( 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 )- 5 - 磺醯胺基 ) 苯基 ) 苯甲醯胺 ( 化合物 c )

向 N-(4-胺基苯基)苯甲醯胺(78 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N ₂下攪拌5小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 a所描述之程序，得到呈固體狀之 c(169 mg，99%)。 ¹H NMR (600 MHz, DMSO- d ₆) δ10.85 (s, 1 H, H-1), 10.16 (s, 1 H, H-16), 10.00 (s, 1 H, H-9), 7.90 (m, 2 H, H-19, 23), 7.82 (m, 1 H, H-4), 7.61 (d, J= 8.8 Hz, 2 H, H-11, 15), 7.57 (m, 2 H, H- 6, 21), 7.50 (t, J= 7.5 Hz, 2 H, H-20, 22), 7.07 (m, 2 H, H-12, 14), 6.90 (d, J= 8.2 Hz, 1 H, H-7), 2.52 (s, 3 H, H-1'), 2.30 (s, 3 H, H-3') ^{。 13}C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆) δ168.3 (C-2), 165.3 (C-17), 157.8 (C-2'), 143.7 (C-7a), 135.7 (C-18), 134.8 (C-10), 133.4 (C-5), 131.5 (C-13), 131.4 (C- 21), 128.3 (C-20, 22), 127.5 (C-19, 23), 127.2 (C-6), 123.6 (C-4a), 121.5 (C-3), 121.4 (C-4), 121.2 (C-11, 15), 121.1 (C-12, 14), 108.8 (C-7), 24.9 (C-3'), 22.5 (C-1')。HRMS-ESI：C ₂₄H ₂₂O ₄N ₃S之 m/z[M+H]+計算值448.1326，實驗值448.1325。

製備 N -( 4 - 苯甲醯基苯基 )- 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 d )

向(4-胺基苯基)(苯基)甲酮(58 mg，0.29 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(47 mg，0.59 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N ₂下攪拌6小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 a所描述之程序，得到呈固體狀之 d(137 mg，86%)。 ¹H NMR (600 MHz, DMSO- d ₆) δ10.90 (s, 1 H, H-1), 10.76 (s, 1 H, H-9), 7.91 (m, 1 H, H-4), 7.71 (dd, J= 1.8, 8.2 Hz, 1 H, H-6), 7.65 (d, J= 8.7 Hz, 2 H, H-12, 14), 7.64 (dt, J= 1.8, 3.2 Hz, 1 H, H-20), 7.63 (q, J= 1.8 Hz, 2 H, H-18, 22), 7.52 (m, 2 H, H-19, 21), 7.28 (m, 2 H, H-11, 15), 6.95 (d, J= 8.2 Hz, 1 H, H-7), 2.52 (s, 3 H, H- 1'), 2.32 (s, 3 H, H-3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ194.4 (C-16), 168.3 (C-2), 158.3 (C-2'), 144.1 (C-7a), 142.3 (C-10), 137.3 (C-17), 132.3 (C-13), 131.6 (C-5), 131.4 (C-12, 14), 131.3 (C-20), 129.3 (C-19, 21), 128.4 (C-18, 22), 127.3 (C-6), 123.8 (C-4a), 121.4 (C-3), 121.3 (C- 4), 118.0 (C-14, 15), 109.0 (C-7), 24.9 (C-3'), 22.6 (C-1')。HRMS-ESI：C ₂₄H ₂₁O ₄N ₂S之 m/z[M+H]+計算值433.1217，實驗值433.1212。

製備 2 - 側氧基 - N -( 5 - 苯基 - 1H - 吡唑 - 3 - 基 )- 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 e )

向5-苯基-1 H-吡唑-3-胺(59 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N ₂下攪拌4小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 a所描述之程序，藉由矽膠層析(MeOH/CH ₂Cl ₂=1:33)純化殘餘物，得到呈固體狀之 e(112 mg，30%)。 ¹H NMR (600 MHz, DMSO- d ₆) δ12.81 (s, 1 H, H-12), 10.84 (s, 1 H, H-1), 10.32 (s, 1 H, H-9), 7.91 (s, 1 H, H-4), 7.67 (t, J= 1.5 Hz, 2 H, H-16, 20), 7.66 (m, 2 H, H-17, 19), 7.42 (t, J= 7.5 Hz, 1 H, H-6), 7.34 (d, J= 7.3 Hz, 1 H, H-18), 6.92 (d, J= 8.2 Hz, 1 H, H-7), 6.44 (s, 1 H, H-14), 2.51 (s, 3 H, H-1'), 2.27 (s, 3 H, H- 3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.4 (C-2), 157.5 (C-2'), 147.0 (C-10), 143.7 (C-7a), 142.5 (C-13), 132.3 (C-5), 128.9 (C-18), 128.3 (C- 15), 127.1 (C-6, 17, 19), 124.9 (C-16, 20), 123.5 (C-4a), 121.7 (C-21), 121.5 (C-3), 108.7 (C-7), 94.6 (C-14), 24.8 (C-3'), 22.5 (C-1')。HRMS-ESI：C ₂₀H ₁₉O ₃N ₄S之 m/z[M+H]+計算值395.1172，實驗值395.1171。

製備 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 )- N -( 5 -( 對甲苯基 )- 1H - 吡唑 - 3 - 基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 f )

向5-(對甲苯基) 1 H-吡唑-3-胺(64 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N ₂下攪拌6小時，且隨後真空濃縮。藉由過濾收集固體且用CH ₂Cl ₂洗滌，得到呈固體狀之化合物 f(91 mg，61%)。 ¹H NMR (300 MHz, DMSO- d ₆) δ12.72 (s, 1 H, H-12), 10.85 (s, 1 H, H-1), 10.31 (s, 1 H, H-9), 7.90 (s, 1 H, H-4), 7.65 (dd, J= 1.6, 8.2 Hz, 1 H, H-6), 7.54 (d, J= 8.1 Hz, 2 H, H-16, 20), 7.22 (d, J= 8.0 Hz, 2 H, H-17, 19), 6.92 (d, J= 8.2 Hz, 1 H, H-7), 6.36 (s, 1 H, H-14), 2.49 (s, 3 H, H-1'), 2.31 (s, 3 H, H-21), 2.27 (s, 3 H, H-3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.4 (C-2), 157.5 (C-2'), 147.0 (C-10), 143.7 (C-7a), 142.7 (C-13), 137.7 (C-18), 132.3 (C- 5), 129.5 (C-15, 17, 19), 127.1 (C-6), 124.9 (C-16, 20), 123.5 (C-4a), 121.7 (C-3), 121.5 (C-4), 108.7 (C-7), 94.2 (C-14), 24.8 (C-3'), 22.5 (C- 1'), 20.8 (C-21)。HRMS-ESI：C ₂₁H ₂₁O ₃N ₄S之 m/z[M+H]+計算值409.1329，實驗值409.1325。

製備 2 - 側氧基 - N -( 5 - 苯基 - 1 , 3 , 4 - 噻二唑 - 2 - 基 )- 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 g )

向5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-胺(65 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N2下攪拌6小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 f所描述之程序，得到呈固體狀之 g(95 mg，26%)。 ¹H NMR (300 MHz, DMSO- d ₆) δ10.88 (s, 1 H, H-1), 10.48 (s, 1 H, H-9), 7.91 (d, J= 1.4 Hz, 1 H, H-4), 7.82 (m, 1 H, H- 17), 7.70 (dd, J= 1.7, 8.3 Hz, 1 H, H-6), 7.55 (m, 2 H, H-18, 19), 7.45 (dd, J= 1.4, 8.0 Hz, 1 H, H-16), 6.97 (d, J= 8.3 Hz, 1 H, H-7), 6.75 (d, J= 8.0 Hz, 1 H, H-20), 52 (s, 3 H, H-1'), 2.32 (s, 3 H, H-3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.7 (C-2), 168.4 (C-10), 157.8 (C-2'), 155.2 (C-15), 143.7 (C-7a), 141.5 (C-13),134.1 (C-5), 131.4 (C-18), 129.4 (C- 17), 126.3 (C-19), 126.2 (C-6), 125.4 (C-16), 123.6 (C-4a), 121.5 (C-3), 120.6 (C-4), 109.1 (C-7), 107.8 (C-20), 24.7 (C-3'), 22.2 (C-1')。HRMS-ESI：C ₁₉H ₁₅O ₃N ₄S ₂之 m/z[M+H]+計算值411.0580，實驗值411.0590。

製備 N -( 苯并 [ d ] 噻唑 - 2 - 基 )- 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 h )

向苯并[ d]噻唑-2-胺(55 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N ₂下攪拌24小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 f所描述之程序，得到呈固體狀之 h(84 mg，59%)。 ¹H NMR (300 MHz, DMSO- d ₆) δ10.48 (s, 1 H, H-1), 7.87 (d, J= 7.9 Hz, 1 H, H-4), 7.78 (s, 1 H, H-6), 7.46 (m, 2 H, H-13, 14), 7.42 (m, 1 H, H-15), 7.29 (t, J= 7.5 Hz, 1 H, H-12), 6.75 (d, J= 7.9 Hz, 1 H, H-7), 2.50 (s, 3 H, H-1'), 2.31 (s, 3 H, H-3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.9 (C-2), 168.7 (C-10), 154.4 (C-2'), 140.4 (C-7a), 134.2 (C-5), 127.4 (C-15), 125.3 (C-13), 124.0 (C-12), 123.5 (C-4a), 122.9 (C- 4), 122.6 (C-3, 12a), 122.5 (C-15a), 120.9 (C-6), 114.5 (C-14), 107.9 (C- 7), 24.7 (C-3'), 22.2 (C-1')。HRMS-ESI：C18H14O3N3S2之 m/z[M+H] ⁺計算值384.0471，實驗值384.0482。

製備 N -( 4 -( 1H - 咪唑 - 1 - 基 ) 苯基 )- 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 i )

向4-(1 H-咪唑-1-基)苯胺(41 mg，0.26 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N ₂下攪拌20小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 f所描述之程序，得到呈固體狀之 i(100 mg，68%)。 ¹H NMR (600 MHz, DMSO- d ₆) δ10.90 (s, 1 H, H-1), 10.51 (s, 1 H, H-9), 8.91 (s, 1 H, H-17), 7.90 (d, J= 10.6 Hz, 2 H, H-19, 20), 7.64 (dd, J= 1.6, 8.2 Hz, 1 H, H-6), 7.58 (m, 2 H, H-12, 14), 7.50 (s, 1 H, H-4), 7.27 (dd, J= 2.5, 9.4 Hz, 2 H, H-11, 15), 6.93 (d, J= 8.2 Hz, 1 H, H-7), 2.52 (s, 3 H, H-1'), 2.32 (s, 3 H, H-3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.3 (C-2), 158.2 (C-2'), 144.0 (C-7a), 138.0 (C-10), 134.8 (C-17), 131.2 (C-5), 127.3 (C-6), 124.8 (C-13), 123.8 (C- 4a), 122.4 (C-12, 14), 121.4 (C-19), 121.3 (C-3), 121.0 (C-4), 120.7 (C- 11, 15), 119.6 (C-20), 108.9 (C-7), 25.0 (C-3'), 22.6 (C-1')。HRMS-ESI：C ₂₀H ₁₉O ₃N ₄S之 m/z[M+H] ⁺計算值395.1172，實驗值395.1169。

製備 N - 甲基 - 4 -( 4 -(( 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 )- 5 - 磺醯胺基 ) 苯氧基 ) 吡啶甲醯胺 ( 化合物 j )

向4-(4-胺基苯氧基)- N-甲基吡啶甲醯胺(90 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N2下攪拌2小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 a所描述之程序，得到呈固體狀之 j(174 mg，97%)。 ¹H NMR (600 MHz, DMSO- d ₆) δ10.88 (s, 1 H, H-1), 10.21 (s, 1 H, H-9), 8.73 (m, 1 H, H-24), 8.47 (d, J= 5.7 Hz, 1 H, H-21), 7.84 (s, 1 H, H-4), 7.58 (dd, J= 1.7, 8.1 Hz, 1 H, H-6), 7.31 (d, J= 2.3 Hz, 1 H, H-18), 7.20 (m, 2 H, H-11, 15), 7.12 (m, 2 H, H-12, 14), 7.04 (dd, J= 5.7, 2.6 Hz, 1 H, H-22), 6.94 (d, J= 8.1 Hz, 1 H, H-7), 2.78 (d, J= 4.8 Hz, 3 H, H-25), 2.53 (s, 3 H, H-1'), 2.31 (s, 3 H, H-3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.3 (C-2), 165.5 (C-19), 163.7 (C-23), 158.0 (C-2'), 152.5 (C-17), 150.4 (C-21), 149.6 (C- 13), 143.9 (C-7a), 135.6 (C-10), 131.3 (C-5), 127.2 (C-6), 123.7 (C-4a), 122.6 (C-11, 15), 121.8 (C-12, 14), 121.4 (C-3, 4), 114.0 (C-22), 108.9 (C-7), 108.8 (C-18), 26.0 (C-25), 24.9 (C-3'), 22.5 (C-1')。HRMS-ESI：C ₂₄H ₂₃O ₅N ₄S之 m/z[M+H] ⁺計算值479.1384，實驗值479.1382。

製備 4 -( 3 - 氟 - 4 -(( 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 )- 5 - 磺醯胺基 ) 苯氧基 )- N - 甲基吡啶甲醯胺 ( 化合物 k )

向4-(4-胺基-3-氟苯氧基)- N-甲基吡啶甲醯胺(96 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N ₂下攪拌6小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 a所描述之程序，得到呈固體狀之 k(178 mg，97%)。 ¹H NMR (500 MHz, DMSO- d ₆) δ10.92 (s, 1 H, H-1), 10.10 (s, 1 H, H-9), 8.78 (q, J= 4.7 Hz, 1 H, H-24), 8.52 (d, J= 5.5 Hz, 1 H, H-21), 7.84 (d, J= 1.3 Hz, 1 H, H- 4), 7.54 (dd, J= 1.7, 8.2 Hz, 1 H, H-6), 7.38 (d, J= 2.5 Hz, 1 H, H-18), 7.34 (t, J= 8.8 Hz, 1 H, H-15), 7.22 (dd, J= 2.7, 10.9 Hz, 1 H, H-12), 7.13 (dd, J= 2.7, 5.5 Hz, 1 H, H-22), 7.04 (m, 1 H, H-14), 6.95 (d, J= 8.2 Hz, 1 H, H-7), 2.79 (d, J= 4.9 Hz, 3 H, H-25), 2.54 (s, 3 H, H-1'), 2.31 (s, 3 H, H-3')。13C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.4 (C-2), 164.9 (C-19), 163.6 (C-23), 158.0 (C-2'), 157.3 (C-10), 155.3 (C-11), 152.5 (C- 17), 151.6 (C-13), 150.5 (C-21), 143.9 (C-7a), 131.7 (C-6), 128.4 (C-15), 127.1 (C-7), 123.7 (C-5), 122.3 (C-12), 121.5 (C-3), 121.4 (C-4), 117.1 (C-14), 114.4 (C-22), 109.3 (C-18), 108.8 (C-7), 26.0 (C-25), 24.9 (C-3'), 22.5 (C-1')。HRMS-ESI：C ₂₄H ₂₂O ₅N ₄FS之 m/z[M+H] ⁺計算值497.1289，實驗值497.1290。

製備 2 - 氟 - N - 甲基 - 4 -(( 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 )- 5 - 磺醯胺基 ) 苯甲醯胺 ( 化合物 l )

向4-胺基-2-氟- N-甲基苯甲醯胺(62 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N ₂下攪拌4小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 a所描述之程序，得到呈固體狀之 l(120 mg，81%)。 ¹H NMR (300 MHz, DMSO- d ₆) δ10.91 (s, 1 H, H-1), 10.75 (s, 1 H, H-9), 8.01 (m, 1 H, H-17), 7.89 (s, 1 H, H-4), 7.68 (dd, J= 1.7, 8.2 Hz, 1 H, H-6), 7.51 (t, J= 8.5 Hz, 1 H, H-12), 6.97 (m, 2 H, H-11, 15), 6.92 (m, 1 H, H-7), 2.71 (d, J= 4.6 Hz, 3 H, H-18), 2.52 (s, 3 H, H-1'), 2.33 (s, 3 H, H-3')。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.3 (C-2), 163.3 (C-16), 160.4 (C-13), 158.4 (C-2'), 144.2 (C-7a), 141.7 (C-14), 133.2 (C-5), 131.3 (C-10), 130.9 (C-12), 127.3 (C- 6), 123.9 (C-4a), 121.4 (C-3), 121.3 (C-4), 114.4 (C-11), 109.0 (C-7), 105.7 (C-15), 26.2 (C-18), 25.0 (C-3'), 22.6 (C-1')。HRMS-ESI：C ₁₉H ₁₉O ₄N ₃FS之 m/z[M+H] ⁺計算值404.1075，實驗值404.1074。

製備 N -( 4 - 甲基 - 3 -(( 4 -( 吡啶 - 3 - 基 ) 嘧啶 - 2 - 基 ) 胺基 ) 苯基 )- 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 m )

向6-甲基- N1-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)苯-1,3-二胺(102 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT下在N2下攪拌3小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 f所描述之程序，得到呈固體狀之 m(64 mg，34%)。 ¹H NMR (300 MHz, DMSO- d ₆) δ10.80 (s, 1 H, H-1), 10.05 (s, 1 H, H-9), 9.24 (d, J= 1.5 Hz, 1 H, H-25), 8.87 (s, 1 H, H-17), 8.72 (dd, J= 1.5, 4.9 Hz, 1 H, H-22), 8.49 (m, 1 H, H-29), 8.46 (m, 1 H, H-27), 7.80 (s, 1 H, H-4), 7.60 (m, 2 H, H-6, 28), 7.44 (m, 2 H, H-11, 21), 7.07 (d, J= 8.4 Hz, 1 H, H- 14), 6.88 (d, J= 8.2 Hz, 1 H, H-7), 6.81 (dd, J= 2.3, 8.1 Hz, 1 H, H-15), 2.45 (s, 3 H, H-1'), 2.17 (s, 3 H, H-3'), 2.12 (s, 3 H, H-16)。 ¹³C NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.3 (C-2), 160.9 (C-18), 160.8 (C-20), 159.5 (C-27), 157.6 (C-2'), 149.7 (C-22), 146.6 (C-25), 143.7 (C-7a), 138.1 (C- 12), 136.1 (C-29), 135.9 (C-10), 132.7 (C-24), 131.6 (C-5), 130.6 (C-14), 127.6 (C-13), 127.1 (C-6), 124.5 (C-28), 123.5 (C-4a), 121.6 (C-4), 121.4 (C-3), 116.7 (C-11), 116.4 (C-15), 108.9 (C-7), 107.8 (C-21), 24.7 (C-3'), 22.5 (C-1'), 17.4 (C-16)。HRMS-ESI：C ₂₇H ₂₅O ₃N ₆S之 m/z[M+H] ⁺計算值513.1703，實驗值513.1703。

製備 N -( 1 , 4 - 二側氧基 - 1 , 2 , 3 , 4 - 四氫呔 𠯤 - 5 - 基 )- 2 - 側氧基 - 3 -( 丙 - 2 - 亞基 ) 吲哚啉 - 5 - 磺醯胺 ( 化合物 n )

向5-胺基-2,3-二氫-1,4-呔𠯤二酮(73 mg，0.37 mmol)於無水CH ₂Cl ₂(10 mL)中之攪拌溶液中依序添加吡啶(58 mg，0.74 mmol)及化合物 3(100 mg，0.37 mmol)。將溶液在RT在N ₂下攪拌5小時，且隨後真空濃縮。遵循針對化合物 a所描述之程序，藉由矽膠層析(MeOH/CH ₂Cl ₂=1:20-1:5)純化殘餘物，得到呈固體之 n(25 mg，17%)。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ13.06 (s, 1 H, H-9), 11.79 (s, 2 H, H-15, 16), 10.83 (s, 1 H, H-1), 7.84 (d, J= 1.6 Hz, 1 H, H-4), 7.77 (m, 2 H, H- 11, 12), 7.68 (dd, J= 1.6, 8.0 Hz, 1 H, H-6), 7.54 (dd, J= 2.8, 6.4 Hz, 1 H, H-13), 6.92 (d, J= 8.0 Hz, 1 H, H-7), 2.49 (s, 3 H, H-1'), 2.28 (s, 3 H, H-3')。 ¹³C NMR (100 MHz, DMSO- d ₆ ) δ168.0 (C-2), 160.3 (C-17), 158.0, (C-2'), 151.8 (C-14), 144.1 (C-7a), 140.2 (C-10), 134.3 (C-12), 130.9 (C-5), 127.2 (C-6), 126.3 (C-14a), 123.7 (C-4a), 121.2 (C-3, 4), 119.2 (C-11), 117.9 (C-13), 114.8 (C-17a), 109.0 (C-7), 24.6 (C-3'), 22.4 (C-1')。HRMS-ESI：C19H17O5N4S之 m/z[M+H]+計算值413.0914，實驗值413.0911。

實例 2 . 評估合成化合物

在此研究中，使用基於片段之藥物設計策略以最佳化參考CDK8抑制劑 E966 - 0539， N-(3-乙醯基苯基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)-吲哚啉-5-磺醯胺，其先前經由基於結構之虛擬篩選(structure-based virtual screening，SBVS)活動發現。於酶分析中 E966 - 0530之50%抑制濃度(IC50)值為1,684 nM。 E966 - 0530結構含有具有磺醯胺基團之吲哚啉-2-酮主鏈。磺醯胺為有機化學中之關鍵官能基，具有高水解穩定性及胺基酸相互作用能力(A. Ovung等人, 2021 Biophys. Rev. 13 (2) 259-272)。吲哚啉-2-酮為天然產物及藥理活性化合物中持續出現之特權核心骨架之一(Y.M. Khetmalis等人, 2021 Biomed. Pharmacother. 141, 111842)。以上實驗及分析表明 E966 - 0530係用於進一步最佳化之有前景的起點。最佳化包括設計及合成一系列2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺衍生物。

此研究中基於片段之藥物設計策略產生具有前景結果之最佳化CDK8抑制劑。使用ThermoFisher Scientific之SelectScreen激酶服務測試藉由此基於片段之藥物設計策略設計的化合物( a - n)之CDK8抑制活性。在10 μM之濃度測試14種化合物及參考化合物之抑制作用。結果展示於下表1中：

表1

化合物編號	R 之結構	在10 μM 下之CDK8 抑制百分比	CDK8 抑制IC 50 (nM )
a		48%	未確定
b		76%	1567
c		33%	未確定
d		99%	380
e		82%	1639
f		89%	798
g		99%	338
h		91%	870
i		92%	945
j		85%	1235
k		102%	129
l		92%	652
m		46%	未確定
n		74%	3004
參考化合物		87%	1684

如自 表 1可見，結果表明11種化合物展現≥50%抑制。進一步測試表明化合物展現129與3,004 nM之間的IC50值。七種化合物展示在數百nM範圍內之IC50值。值得注意的是，三種化合物以＜400 nM之IC50值抑制CDK8。彼等化合物為 d、 g及 k，各別IC50值為380、338及129 nM。與原始化合物 E966 - 0530相比，化合物 k展示CDK8抑制活性提高13倍。實驗結果表明，化合物 k係合成化合物中最強效的。

實例 3 . 化合物 a - n 之對接及 SAR 分析

圖1展示化合物k之2D相互作用位姿。

為了研究可促進CDK8抑制之相互作用，將化合物 k分子對接至CDK8結合位點中( 圖 1)。

化合物 k之結構分為三個基團(G1、G2及G3)。對接結果表明，G1基團之羥吲哚環佔據腺嘌呤位置且與鉸鏈殘基之殘基D98及A100形成氫鍵。此等相互作用由位於羥吲哚環上之氮及氧原子產生，被鑑別為結合相互作用。在G1基團內亦觀測到與殘基F97之額外π-π T形相互作用。G2基團為磺醯胺結構。殘基K52與氧原子形成氫鍵且與胺形成吸引電荷。最後，G3基團為4-(4-胺基-3-氟苯氧基)- N-甲基吡啶甲醯胺。殘基M174與苯氧基吡啶之芳環之間發生π-烷基相互作用。亦觀測到氟原子與殘基N156之額外鹵素相互作用。總體而言，此等相互作用表明化合物 k展現針對CDK8之有利相互作用。

此外，使用化合物 a - n進行SAR分析。總之，分析展示對於強效CDK8抑制可能很重要的有利的官能基及相互作用。

首先，與化合物 k相比具有單一部分差異的化合物 j隨後被選擇用於分析。根據抑制活性，發現化合物 k由於鹵素原子之取代而具有高幾乎1.5倍的抑制效力。另外，探索胺基處於C5-C6或C6-C5之化合物 e - i的作用。C5之組成包括吡唑、噻二唑及噻唑。其中，由噻二唑構成之化合物 g展示良好抑制活性且亦為此系列化合物中第二有效的。對接分析揭露化合物 g藉由其磺醯胺及噻二唑與殘基K52形成π-陰離子相互作用，此可在CDK8抑制中發揮重要作用。

藉由將具有不同鍵聯原子之二苯基結構連接至磺醯胺而獲得化合物 a - d。其中，化合物 d展現抑制活性，IC50值為380 nM。根據結構分析，發現化合物 d之二苯甲酮與殘基V27、V35、Y99及W105形成額外疏水相互作用，且化合物具有較佳抑制活性。

實例 4 . 以顯著選擇性抑制 CDK8 活性

圖2A至圖2D展示對化合物k之CDK8抑制的評估。

評估化合物 k之激酶選擇性。選擇來自不同家族之一組54種激酶，且在150 nM下篩選化合物 k之激酶抑制。如 圖 2A中所示，在所有激酶中，僅CDK8受化合物 k抑制，抑制百分比＞60% (64%)。化合物 k對CDK19 (CDK8之旁系同源物)之抑制略微弱於對CDK8之抑制(40%)，且該化合物對其他CDK及激酶無顯著作用。化合物之較高選擇性可降低不良副作用之風險，且化合物 k之選擇性可增強其安全性且避免不良副作用。隨後在DU145及PC-3細胞(分別自患有腦轉移及骨轉移之患者分離的人類前列腺癌細胞株)中評估化合物 k之細胞毒性。如 圖 2B中所示，在兩種細胞株中之化合物 k之IC50大於30 μM持續24小時，且維持72小時。此等結果表明，自24小時至72小時以低於30 μM之濃度投與的化合物 k在任一細胞株中均未導致顯著細胞毒性。為了進一步檢驗化合物 k是否仍抑制細胞中之CDK8/19抑制，吾人評估DU145/PC-3非雄激素依賴性前列腺癌細胞中之化合物處理是否可抑制STAT1-S727磷酸化。由於STAT1為CDK8/19之受質，因此STAT1-S727磷酸化常用於量測CDK8/19激酶活性(J. Bancerek等人, 2013 Immunity 38 (2) 250-262)。如所示，化合物 k處理以濃度依賴性方式抑制已知CDK8受質STAT1在Ser727殘基處之磷酸化( 圖 2C 至圖 2D)。為了進一步證實化合物之CDK8抑制作用，細胞用pcDNA3 CDK8 HA質體轉染以過度表現CDK8。在兩種細胞株中，化合物 k以濃度依賴性方式顯著抑制STAT1在Ser727處之磷酸化，而不影響CDK8表現( 圖 2C 至圖 2D)。此等結果表明化合物 k可抑制細胞中之CDK8/19活性。

實例 5 . 在前列腺癌進展期間 CDK8 表現及轉形生長因子 β ( TGF - β ) 信號增加

圖3A至圖3H展示CDK8表現及TGF-β信號在轉移性前列腺癌中增加且與患者存活率不良相關。

為了檢驗CDK8與前列腺癌進展之間的關係，經由GEO資料庫及cBioPortal存取臨床樣本之公共資料集。如所示，在轉移性前列腺癌樣本中發現比原發性前列腺癌樣本中更高的CDK8 RNA表現( 圖 3A)，且當樣本根據淋巴結轉移之存在分選時，在獨立系列中注意到類似趨勢( 圖 3B)。自94名根除性前列腺切除術患者樣本收集之表現陣列資料用於分析直至復發之時間，且發現在100個月時段內高CDK8 RNA含量與較早生物化學復發顯著相關( 圖 3C)。鑒於CDK8與介體複合物之隸屬關係，在探索性嘗試中進行基因集富集分析(GSEA)以分析多蛋白複合物整體之表現(GSE68882)。分析揭露介體複合物之組分，包括CDK8/19、MED12及MED13，在轉移性前列腺癌中亦上調( 圖 3D)。此等觀測到的趨勢與先前研究之發現相呼應，且促使吾人探索可解釋此類相關性之因果模型(I.B. Roninson等人, 2019 Cells 8 (8)821；J. Bragelmann等人, 2017 Clin. Cancer Res 23 (7) 1829-1840)。另外，TGF-β為癌症轉移之重要誘導因子，且先前研究已表明，TGF-β之過度產生與前列腺癌中之轉移、雄激素受體抑制抗性及不良臨床結果有關(T. Trivedi等人, 2021 Biomolecules 11 (11) 1643)。此外，格里森評分為用以確定前列腺癌之侵襲性的定級系統。評分高於7指示可能更快速擴散之癌症。使用格里森評分7 (中間級別)作為截點，分析TGF-β/Smad信號之變化。資料庫富集分析表明具有高病理格里森評分之樣本中TGF-β/Smad信號傳導增強( 圖 3E 、圖 3F)。高TGF-β/Smad信號表現與較差的10年無進展存活率有關( 圖 3G)，且在轉移性前列腺癌樣本中觀測到高TGFBR1轉錄本含量( 圖 3H)。此等結果表明TGF-β/Smad路徑在前列腺癌轉移中發揮關鍵作用，且CDK8/介體複合物可為此信號之極重要的調節因子。

實例 6 . 對細胞遷移及 EMT 蛋白表現之抑制圖4A至圖4B展示CDK8抑制劑對人類肺泡上皮細胞中上皮-間質轉化蛋白表現之抑制。

圖5A至圖5B展示化合物k抑制A549細胞之遷移。

圖6A至圖6D展示前列腺癌細胞之細胞遷移及EMT特徵受化合物 k顯著抑制。

圖7A至圖7F展示化合物 k顯著抑制TGF-β1誘導之EMT蛋白及基因表現。

先前研究表明，肺纖維化之EMT為肺泡上皮細胞失去接觸黏附、改變其形狀、轉化為肌纖維母細胞，且展現侵入、遷移及ECM產生之特徵的過程(L. Richeldi等人, 2017 Lancet 389 (10082 1941-1952))。

TGF-β1為最強效的促纖維發生細胞介素之一。先前研究鑑別出TGF-β1可觸發Smad依賴性信號以增加EMT蛋白表現及上皮遷移，最終導致肺纖維化(N.G. Frangogiannis等人, 2020 J. Exp. Med. 217 (3), e20190103)。研究此研究中之CDK8抑制劑以確定其將如何調節TGF-β1信號傳導。吾人發現，TGF-β1處理顯著增加人類肺泡上皮A549細胞中肌纖維母細胞標記物，諸如膠原蛋白I、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及Snail的表現；同時，用TGF-β1處理亦下調上皮細胞標記物E-鈣黏蛋白的含量( 圖 4A)。此等結果表明TGF-β1處理在吾人之模型中觸發EMT進展。賽尼辛A (CDK8抑制劑)及吡非尼酮(治療特發性肺纖維化之臨床藥物)用於參考化合物，兩者均顯示對EMT蛋白含量之輕微抑制。引起關注的是，當用化合物 k處理A549上皮細胞時，觀測到對觸發EMT蛋白表現之TGF-β1的顯著抑制。相比之下，化合物 b在A549細胞中顯示略微減少，而化合物 a顯示EMT蛋白含量無顯著減少( 圖 4A)。

在所測試之化合物中，化合物 k顯示與其他測試化合物及參考試劑相比最大的效力。此似乎與其CDK8抑制活性一致。此外，亦評估化合物 k對A549細胞之細胞存活率的影響。如所示，當用化合物 k處理12、24及48小時時，經處理細胞之細胞存活率未顯著變化( 圖 4B)。當化合物濃度增加至10 μM時亦觀測到此情況。此表明化合物 k對EMT蛋白表現之抑制並非歸因於細胞毒性。

另外，當用CDK8抑制劑處理時評估細胞遷移。經TGF-β1處理之A549肺泡上皮細胞24小時展示更清晰的外觀及細胞遷移；處理48小時之後，觀測到更顯著的細胞遷移( 圖 5A 至圖 5B)。化合物 k展現對細胞遷移之強效抑制；相比之下，輕度( a)及中度( b) CDK8抑制劑以及兩種參考試劑顯示對細胞遷移之抑制較小。此表明化合物 k為此肺纖維化模型中EMT之更強效調節劑。( 圖 5A 至圖 5B)

此外，TGF-β亦為癌症轉移之重要誘導因子。TGF-β之過度表現與前列腺癌轉移中之較差臨床結果顯著相關(T. Trivedi等人, 2021 Biomolecules 11 (11) 1643)。因此，對前列腺癌細胞進行功能分析以探索CDK8抑制對腫瘤細胞轉移之潛在影響。回應於TGF-β1 (10 ng/mL)刺激24小時，在DU145細胞中觀測到自聚集卵石狀形狀轉變為分散細長形態特徵( 圖 6A)。化合物 k處理似乎逆轉此等作用。接下來，吾人檢驗化合物 k是否抑制前列腺癌細胞之遷移。結果表明回應於TGF-β1處理48小時，傷口閉合顯著增強，且化合物 k顯著抑制前列腺癌細胞中TGF-β1誘導之遷移( 圖 6B 至圖 6C)。另外，進行傳斯維爾分析(transwell assay)以確認化合物對遷移之抑制作用。結果表明化合物 k處理顯著抑制兩種前列腺癌細胞中TGF-β1觸發之細胞遷移。吾人進一步研究化合物抑制細胞遷移之機制。如所示，暴露於TGF-β1之前列腺癌細胞增加若干上皮間質轉化(EMT)蛋白，諸如N-鈣黏蛋白、Snail及波形蛋白，且減少上皮標記物E-鈣黏蛋白含量( 圖 6D 及圖 7A 至圖 7D)。化合物 k處理藉由上調上皮標記物E-鈣黏蛋白且下調間質標記物N-鈣黏蛋白、Snail及波形蛋白而減弱TGF-β1之作用( 圖 6D 及圖 7A 至圖 7D)。為了確定此類結果是否為轉錄抑制之結果，亦進行即時PCR實驗。mRNA含量變化反映蛋白質變化( 圖 7E 至圖 7F)。商業CDK8抑制劑賽尼辛A (IC50=280 nM)用作參考化合物。化合物 k展現比賽尼辛A更強效的EMT蛋白抑制作用( 圖 6D 及圖 7A 至圖 7F)。此等結果表明化合物 k顯著抑制前列腺癌細胞中TGF-β1誘導之EMT基因表現及遷移。

實例 7 . 化合物 k 經由抑制 RNA 聚合酶 II 及 Smad 連接子磷酸化來抑制 TGF - β 1 / Smad 信號傳導

圖8A至圖8B展示用化合物 k處理之後對TGF-β1誘導之p-Smad3 T179、RNA聚合酶II pS2/S5及Smad3之細胞分佈的抑制作用。

圖9A至圖9G展示化合物 k顯著抑制TGF-β/Smad/RNA聚合酶II信號傳導。

已知TGF-β1主要誘導Smad路徑以增強EMT蛋白及氧化還原不平衡，其皆促成肺纖維化之發病機制(Y. Park等人, 2021 Sci. Rep. 11 (1) 4318)。在TGF-β1結合至其受體之後，Smad3與Smad4結合，隨後易位至細胞核，且結合至DNA。CDK8在T179處使Smad3磷酸化，引起RNA聚合酶II之活化及ECM蛋白轉錄之調節(J. Massague等人, 2012 Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (10) 616-630；E. Aragon等人, 2011 Genes Dev. 25 (12) 1275-1288)。當用CDK8抑制劑處理時，評估Smad3磷酸化及RNA聚合酶II活化之影響。用各種化合物處理之後，將細胞分級分離成細胞質及細胞核部分，α-微管蛋白及組蛋白H3分別用作其標記物。如所預期，在靜息狀態下總Smad3主要分佈於細胞質部分中；在細胞核部分中僅觀測到少量Smad3蛋白( 圖 8A 至圖 8B)。此外，在細胞質及細胞核部分中均偵測到少量磷酸化Smad3 T179表現。相比之下，當與對照組相比時，TGF-β1處理不僅顯著增加細胞核中之總Smad3含量，而且顯著增強細胞核中p-Smad3 T179及RNA聚合酶II pSer2/5之表現。此等結果表明在肺泡上皮A549細胞中，經由TGF-β處理，Smad3蛋白易位至細胞核，在Thr179位點處磷酸化，且隨後活化RNA聚合酶II。化合物 k處理顯著逆轉p-Smad3 T179及RNA Pol II pSer2/5之磷酸化；相比之下，兩種參考試劑賽尼辛A及吡非尼酮對p-Smad3及RNA Pol II之磷酸化產生較弱的抑制( 圖 8A 至圖 8B)。

此外，CDK8經由轉錄因子之磷酸化來促進配位體誘導之轉錄活性(I. Menzl等人, 2019 Pharmaceuticals 12 (2) 92)。為了更好地理解化合物對遷移之抑制是否涉及抑制CDK8之轉錄調節，吾人進一步檢驗化合物對TGF-β/Smad典型路徑之影響。在TGF-β1活化受體後，Smad家族信號轉導子Smad2及Smad3在C端域磷酸化(例如Ser465/467)，且此等尾部磷酸化Smad隨後與易位至細胞核之共介體Smad4複合。在細胞核中，CDK8/介體複合物在Thr179處使Smad3磷酸化，此產生共活化因子Pin1及其他轉錄搭配物之高親和力結合位點，接著使活性RNA聚合酶II S2/S5磷酸化以達成峰值轉錄作用且促進EMT及轉移(C. Alarcon等人, 2009 Cell 139 (4) 757-769)。經由與不同轉錄因子、輔因子及RNA聚合酶II相互作用(2013 Cell 153 (6) 1327-13)。如所示，p-Smad2 (Ser465/467)及間質標記物N-鈣黏蛋白及Snail之含量回應於由TGF-β1進行之24小時後續干預(postintervention)而增加；化合物 k處理顯著下調間質標記物之表現( 圖 9A 至圖 9B)。

為了證實CDK8參與此互相作用，過度表現CDK8以抵消化合物 k之抑制作用。引起關注的是，化合物之抑制作用在過度表現CDK8之DU145細胞中恢復( 圖 9A 至圖 9B)，表明化合物對CDK8之抑制作用。接下來，檢驗化合物處理之後的下游信號變化。進行細胞核提取方案以分離細胞溶質及細胞核部分，且α-微管蛋白及組蛋白H3分別用作細胞質及細胞核標記物( 圖 9C 至圖 9D)。TGF-β1處理顯著增加細胞核部分中之p-Smad3 T179及p-RNA聚合酶II S2/5含量，且化合物 k顯著抑制Smad3及RNA聚合酶II之磷酸化( 圖 9C 至圖 9D)。吾人亦藉由免疫沈澱而重新確認了作為對化合物 k處理之回應的CDK8、轉錄因子、RNA聚合酶II及Pin1共活化因子之間的相互作用。

TGF-β1處理顯著增加CDK8與RNA聚合酶II(Ser2/5)、Smad3及Pin1之結合，且此等相互作用受化合物 k處理抑制( 圖 9E 至圖 9F)。此外，為了鑑別化合物對EMT之抑制作用，吾人用編碼關鍵上皮蛋白標記物E-鈣黏蛋白之CDH1報導子轉染DU145細胞，且評估CDH1驅動之螢光素酶表現。如所預期，TGF-β1處理顯著減少CDH1驅動之螢光素酶表現，且化合物 k將此作用逆轉至對照量( 圖 9G)。此等結果表明化合物k經由CDK8抑制來抑制EMT信號。

實例 8 . 化合物降低 TGF - β 1 誘導之氧化壓力

圖10A至圖10B展示CDK8抑制降低TGF-β1誘導之氧化壓力。

愈來愈多的證據亦表明，TGF-β1藉由經由導致氧化還原不平衡之Smad路徑損害粒線體功能且誘導NADPH氧化酶(NOX) (主要為NOX4)來增加活性含氧物(ROS)產生。氧化還原不平衡亦誘導TGF-β1表現且促進纖維發生作用，形成惡性循環(R.M. Liu等人, 2015 Redox Biol. (6) 565-577)。如 圖 10A 至圖 10B中所示，TGF-β1處理顯著增加氧化壓力，其特徵為肺泡上皮A549細胞中丙二醛(MDA)及NOX4含量增加，且化合物 k顯著降低TGF-β1引起的氧化壓力。相比之下，所鑑別之抑制劑化合物 b及 a對MDA及Nox4表現產生較弱抑制( 圖 10A 至圖 10B)。總之，此等結果表明化合物 k為強效CDK8抑制劑且可潛在地調節與纖維發生反應相關之信號傳導路徑。

實例 9 . 化合物 k 阻礙 TGF - β 1 誘導之 β - 連環蛋白信號傳導

圖11A至圖11L展示化合物 k阻礙TGF-β1誘導之β-連環蛋白信號傳導。

另外，TGF-β/Akt/糖原合酶激酶3β (GSK3β)/β-連環蛋白非典型路徑亦在多種癌症轉移中發揮作用，且最近的研究證明CDK8激酶活性為β-連環蛋白驅動之轉錄所需(R. Firestein等人, 2008 Nature 455 (7212) 547-551；A. Hamidi等人, 2017 Sci. Signal. 10 (486), eaal4186)。因此，吾人研究 β-連環蛋白信號傳導是否亦在處理中發揮作用，在DU145前列腺癌細胞中顯著增加Akt在Ser473、GSK3 β在Ser9處之磷酸化(非活性形式)，及 β-連環蛋白之活性形式( 圖 11A 至圖 11B)。在免疫沈澱分析中， β-連環蛋白之活性形式與CDK8之間的相互作用程度TGF- β處理後增加，且受化合物處理顯著抑制( 圖 11C 至圖 11D)，表明CDK8亦在 β-連環蛋白信號調節中發揮作用。引起關注的是，在TCGA資料庫中之498名前列腺癌患者中CDK8及β-連環蛋白基因表現亦展現正相關( 圖 11E)。由於LiCl可顯著增加GSK3 β在Ser9處之磷酸化量(非活性形式) ( 圖 11F 至圖 11G)，因此吾人用LiCl使GSK3 β失活且評估β-連環蛋白信號及下游蛋白質回應於化合物處理之變化。如所示，與對照細胞相比，經LiCl處理之DU145細胞展示 β-連環蛋白之活性形式及Snail下游蛋白之含量顯著增加；CDK8抑制(利用化合物 k及利用賽尼辛A)降低此等因子之含量，且化合物 k展現比賽尼辛A更佳的功效( 圖 11H 至圖 11I)。此外，在PC-3細胞之基礎條件下觀測到顯著p-Akt (Ser473)/p-GSK3β (Ser9)表現( 圖 11J)，表明PC-3細胞中不需要活化劑處理來刺激此信號。化合物 k處理顯著抑制PC-3細胞中之Snail表現( 圖 11K 至圖 11L)。此等結果支持化合物經由CDK8抑制來抑制 β-連環蛋白信號傳導及下游蛋白質。

實例 10 . 活體內抗轉移特性

圖12A至圖12G展示化合物 k展現活體內抗侵入作用。

進一步評估化合物 k在PC-3 SCID小鼠模型中之活體內功效。結果表明經口投與化合物(50 mg/kg，q.d.)未誘導明顯體重變化( 圖 12A)。此外，檢驗所收穫腫瘤之邊緣侵入周圍組織的情況以鑑別轉移。在H&E染色結果中，對照組顯示連續腫瘤邊緣，表明腫瘤細胞浸潤周圍組織( 圖 12B)；然而，在化合物 k處理組中，在腫瘤與正常細胞之間觀測到明顯的邊界( 圖 12B)。值得注意的是，在化合物處理組中，腫瘤包膜之完整性得到保留，且在臨床研究中，腫瘤包膜侵入與較差預後及較高復發風險有關(A. Buhmeida等人, 2006 Diagn. Pathol. 1:4)。根據IHC染色結果，關鍵EMT蛋白波形蛋白、N-鈣黏蛋白及Snail在對照組中過度表現，而此等蛋白質之含量在化合物 k處理組中顯著降低( 圖 12C)。另外，腫瘤樣本之免疫墨點展示化合物處理顯著抑制EMT蛋白(例如波形蛋白)、肌纖維母細胞標記物α-SMA、p-Smad3 (Thr179)、β-連環蛋白之活性形式、CDK8活性標記物(例如p-STAT1 Ser727)的表現，且增加上皮細胞標記物(例如E-鈣黏蛋白)的表現( 圖 12D 至圖 12E)。此外，進行免疫沈澱分析以研究化合物是否抑制CDK8與介體複合物之合作以調節轉移信號。如所示，在未處理組中觀測到CDK8、MED12及p-Smad3 (Thr179)之間的顯著相互作用( 圖 12F 至圖 12G)。化合物 k處理顯著抑制CDK8與p-Smad3 (Thr179)之結合，但不影響CDK8與MED12之相互作用。總體而言，此等結果支持化合物 k經由CDK8抑制來抑制前列腺癌轉移。

鑒於以上揭示內容，本文所描述之化合物在醫藥及醫療應用中，尤其在CDK8介導之疾病的治療中可能具有巨大潛力。

應理解，前述實例僅說明本發明。可對所採用之物件及/或方法進行某些修改且仍達成本發明之目標。此類修飾涵蓋在所主張發明之範疇內。

圖1展示化合物 k之2D相互作用位姿。化合物k之2D相互作用位姿。紅色虛線表示氫鍵。疏水相互作用表示為綠色線。2D相互作用係在LeadIT中產生。

圖2A至圖2D展示對化合物 k之CDK8抑制的評估。圖2A展示化合物 k針對來自不同激酶家族之一組54種激酶的抑制效率。圖2B展示DU145及PC-3細胞與或不與不同濃度(0.1、0.3、1、3、10、30 μM)之化合物 k一起培育24及72小時。藉由MTT分析量測細胞存活率，且藉由S形劑量反應方程計算50%抑制濃度(IC50)值。圖2C及圖2D展示DU145及PC-3細胞用或不用pcDNA3 CDK8-HA質體(1 μg)轉染24小時，且隨後用指定濃度之化合物 k再處理24小時。用指定抗體對全細胞溶解產物進行西方墨點法。結果展示為來自至少三次獨立實驗之平均值±SEM (相對於對照組，* p＜0.05，** p＜0.01，且*** p＜0.001；相對於相關對照，# p＜0.05)。

圖3A至圖3H展示CDK8表現及TGF-β信號在轉移性前列腺癌中增加且與患者存活率不良相關。圖3A展示比較來自GSE74685資料集之原發性及轉移性前列腺癌樣本中之CDK8 mRNA表現的盒狀圖。圖3B展示來自癌症基因體圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)資料庫之淋巴結陽性與淋巴結陰性前列腺癌樣本中CDK8 mRNA轉錄本含量的比較。圖3C展示卡本-麥爾(Kaplan-Meier)曲線，其描繪基於GSE70769資料集之資料，具有高與低CDK8表現之根除性前列腺切除術樣本中直至生物化學復發之時間。圖3D展示來自GSE68882資料集之轉移性與原發性前列腺癌樣本中介體複合物組分的基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)。圖3E及圖3F展示使用由Abida等人提供之患者樣本及GSE16560資料集進行根據格里森評分(Gleason score)截止值7 (中等級別)分組之前列腺癌患者中TGF-β/Smad信號傳導路徑基因的GSEA。圖3G展示卡本-麥爾曲線，其繪示基於TCGA資料集具有高與低TGFB1表現之前列腺癌患者的10年無進展存活率。圖3H展示使用來自GSE74685資料集之樣本比較原發性與轉移性前列腺癌患者中之TGFBR1 mRNA表現的盒狀圖。

圖4A至圖4B展示CDK8抑制劑對人類肺泡上皮細胞中上皮-間質轉化蛋白表現之抑制。圖4A展示A549細胞用測試化合物(2 μM)、賽尼辛(senexin) A (5 μM)或吡非尼酮(pirfenidone) (1 mM)處理1小時且用TGF-β1 (10 ng/mL)再刺激1小時。使用指定抗體對細胞溶解產物進行西方墨點分析。結果展示為來自三次獨立實驗之平均值±SEM。與對照組相比，* p＜0.05，且*** p＜0.001；與TGF-β1處理組相比，# p＜0.05，## p＜0.01，且### p＜0.001。圖4B展示細胞與或不與指定濃度之化合物k一起培育12、24或48小時。藉由MTT分析確定細胞存活率。結果展示為三次獨立實驗之平均值±SEM。

圖5A至圖5B展示化合物 k抑制A549細胞之遷移。A549細胞在六孔盤中培育直至達到90%滿度(confluency)，用移液管尖端刮擦，且立即拍照(0小時)。細胞與或不與化合物k (2 μM)、賽尼辛A (5 μM)或吡非尼酮(1 mM)一起培育1小時，隨後用TGF-β1 (10 ng/mL)處理且使其遷移至傷口區域24或48小時，且拍照。使用ImageJ軟體定量細胞向傷口之遷移；實線指示時間零。全淨帶中細胞之平均數目的定量評估表示為來自三次獨立實驗之平均值±SEM。與對照組相比，** p＜0.01；與TGF-β1處理組相比，## p＜0.01且### p＜0.001。

圖6A至圖6D展示前列腺癌細胞之細胞遷移及EMT特徵受化合物 k顯著抑制。圖6A展示在TGF-β1 (10 ng/mL)存在下，用或不用指定濃度之化合物 k處理DU145細胞24小時。細胞形態之影像以×100放大率拍攝。圖6B展示DU145細胞在6孔盤中培育直至達到90%滿度，用移液管尖端刮擦，且立即拍照(0小時)。細胞與或不與TGF-β1 (10 ng/mL)及化合物 k(2.5及10 μM)一起培育，使其移轉至傷口區域48小時且拍照。使用ImageJ軟體定量進入傷口之細胞遷移；白色實線指示時間零。刮擦區域中細胞之平均數目的定量評估表示為來自至少三次獨立實驗之平均值±SEM (相對於對照組，*** p＜0.001；相對於TGF-β1處理組，## p＜0.01且### p＜0.001)。(C) PC-3細胞與10 μM化合物k/賽尼辛A一起培育1小時，隨後用TGF-β1 (10 ng/mL)處理24小時且與指定抗體及DAPI一起培育。免疫螢光影像由ZEISS ApoTome.2顯微鏡拍攝。影像以600×放大率拍攝。

圖7A至圖7F展示化合物 k顯著抑制TGF-β1誘導之EMT蛋白及基因表現。在存在或不存在TGF-β1 (10 ng/mL)之情況下，使細胞暴露於指定濃度之化合物 k或賽尼辛A (10 μM) 24小時，藉由西方墨點(A)或即時PCR (B)確定E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、Snail、波形蛋白(vimentin)、α-SMA之蛋白質及mRNA含量。結果展示為來自至少三次獨立實驗之平均值±SEM (相對於對照組，** p＜0.01，*** p＜0.001；相對於TGF-β1處理組，# p＜0.05，## p＜0.01，且### p＜0.001)。

圖8A至圖8B展示用化合物 k處理之後對TGF-β1誘導之p-Smad3 T179、RNA聚合酶II pS2/S5及Smad3之細胞分佈的抑制作用。人類肺泡上皮A549細胞與化合物 k(5 μM)、賽尼辛A (5 μM)或吡非尼酮(1 mM)一起培育1小時，接著用TGF-β1 (10 ng/mL)刺激3小時。使用指定抗體對細胞質及細胞核部分中之蛋白質表現進行西方墨點分析。α-微管蛋白及組蛋白H3分別充當細胞質及細胞核部分之負載對照。結果展示為三次獨立實驗之平均值±SEM。與對照組相比，** p＜0.01且*** p＜0.001；與TGF-β1處理組相比，# p＜0.05且## p＜0.01。

圖9A至圖9G展示化合物 k顯著抑制TGF-β/Smad/RNA聚合酶II信號傳導。圖9A至圖9B展示人類前列腺癌DU145細胞用pcDNA3 CDK8-HA質體(1 μg)轉染24小時，用化合物 k(10 μM)處理1小時且隨後與TGF-β1 (10 ng/mL)一起再培育24小時。用指定抗體對全細胞溶解產物進行西方墨點法。圖9C至圖9D展示DU145細胞在存在或不存在化合物 k(10 μM)之情況下用TGF-β1 (10 ng/mL)處理1小時且隨後進行細胞核-細胞溶質分級分離。藉由西方墨點法分析偵測細胞溶質及細胞核中之蛋白質，且定量細胞核中之蛋白質表現。圖9E至圖9F展示DU145細胞在存在或不存在TGF-β1 (10 ng/mL)之情況下與化合物 k(10 μM)一起培育1小時，且總細胞溶解產物用抗體免疫沈澱且進行免疫墨點法。圖9G展示DU145細胞用7TFP CDH1報導質體(1 μg)轉染24小時，接著用TGF-β1 (10 ng/mL)伴隨或不伴隨化合物k及賽尼辛A (10 μM)進行後續處理24小時，且隨後確定螢光素酶表現。結果展示為至少三次獨立實驗之平均值±SEM (相對於對照組，* p＜0.05，** p＜0.01，且*** p＜0.001；相對於TGF-β1處理組，# p＜0.05，## p＜0.01，且### p＜0.001；相對於指定組，§ p＜0.05，§§ p＜0.01)。

圖10A至圖10B展示CDK8抑制降低TGF-β1誘導之氧化壓力。A549細胞與化合物 k、 b、 a(2 μM)、賽尼辛A (5 μM)或吡非尼酮(1 mM)一起培育1小時，接著用10 ng/mL TGF-β1再處理24小時。偵測丙二醛(MDA) ( 圖 10A)及Nox4 ( 圖 10B)含量。與對照組相比，*** p＜0.001；與TGF-β1處理組相比，# p＜0.05，## p＜0.01，且### p＜0.001。

圖11A至圖11L展示化合物 k阻礙TGF-β1誘導之β-連環蛋白信號傳導。圖11A至圖11B展示DU145細胞與TGF-β1 (10 ng/mL)一起培育24小時，且收集全細胞溶解產物且用於蛋白質濃度評估，如所指示。圖11C至圖11D展示細胞與化合物 k(10 μM)一起培育12小時，且與或不與TGF-β1 (10 ng/mL)一起再培育2小時，且細胞核溶解產物用抗體免疫沈澱且進行免疫墨點法。圖11E展示藉由TCGA資料庫分析(n=498)前列腺癌患者中CDK8與β-連環蛋白之間的基因表現比較。圖11F至圖11G展示DU145細胞與20 mM LiCl一起培育6小時。經由西方墨點法評估GSK3β之抑制性磷酸化。圖11H至圖11I展示DU145細胞用指定濃度之化合物 k及賽尼辛A (10 μM)處理20小時且隨後與或不與LiCl (20 mM)一起再培育6小時。用指定抗體對全細胞溶解產物進行西方墨點法。圖11J至圖11K展示PC-3與DU145細胞之間Akt/GSK3β軸之基礎活性的比較。圖11L展示在用化合物 k處理24小時之後化合物 k對PC-3細胞中β-連環蛋白目標蛋白之濃度依賴性抑制。結果展示為來自至少三次獨立實驗之平均值±SEM (相對於對照組，* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001；相對於相關對照，# p＜0.05，## p＜0.01，且### p＜0.001)。

圖12A至圖12G展示化合物 k展現活體內抗侵入作用。將PC-3細胞(1×107個細胞)皮下注射至7週齡雄性SCID小鼠之側腹中且用媒劑或化合物 k(50 mg/kg) q.d.處理31天。圖12A展示隨後在化合物處理期間記錄體重變化(n=7，平均值±SEM)。31天處理後，自各小鼠切除腫瘤。圖12B至圖12C展示腫瘤之石蠟切片用蘇木精及曙紅以及所指示之抗體染色。長度由所指示之比例尺表示。圖12D至圖12G展示用所指示之抗體分析腫瘤樣本之免疫墨點及免疫沈澱分析。

Claims (20)

1. 一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物，

   

   其中：R¹為氫、C_1-6烷基、C_1-6鹵烷基、C_1-6烷氧基或C_1-6鹵烷氧基；R^2a及R^2b各自獨立地為C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_2-6炔基，其視情況經鹵素取代，R³、R⁵及R⁶各獨立地為H、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、鹵基、氰基、硝基、OR_a、SR_a、S(O)R_a、SO₂R_a、SO₂NR_bR_c、OC(O)R_a、C(O)NR_bR_c、NR_bRc、NHC(O)R_a或NHC(S)R_b，其中R_a、R_b及R_c各獨立地為H、羥基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基、C_2-6烯基或C_2-6炔基；且R⁴為氫或C_1-10脂族基，其視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、羥基、硝基、氰基或胺基；且其中：(1)環A為視情況經一或多個選自由鹵素及C_1-6烷基組成之群的取代基取代之苯基；L為-O-、-NH-、-C(=O)-或-C(=O)-NR^a-，其中當L為-C(=O)-NR^a-時環A連接至L之N原子；且環B為苯基或吡啶，視情況經一或多個選自由硝基、鹵素、C_1-6烷基及C_1-3烷基 胺基羰基組成之群的取代基取代；(2)環A為苯基、二唑或噻二唑，其經一或多個選自由苯基或二唑組成之群的取代基取代，且該取代基苯基及二唑視情況進一步經C_1-3烷基取代；且-L-B不存在；(3)環A為噻唑并苯或苯并哌

   

   ，其視情況經一或多個選自由側氧基、鹵素及C_1-6烷基組成之群的取代基取代；且-L-B不存在；或(4)環A為苯基，其視情況經一或多個選自由鹵素及C_1-6烷基組成之群的取代基取代；-L-為-NH-；且環B為吡啶，視情況經一或多個選自由鹵素及C_1-6烷基組成之群的取代基取代。
2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物，其中R¹為氫，且R^2a及R^2b各自獨立地為甲基。
3. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物，其中環A經鹵素取代。
4. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物，其中環A為經鹵素取代之苯基；-L-為-O-；環B為經C_1-3烷基胺基羰基取代之吡啶。
5. 一種具有式(II)之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物，其中式(II)為：

   

   其中R係選自由以下組成之群：

   

   
6. 一種下列之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物，：N-(4-(4-硝基苯氧基)苯基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺，2-側氧基-N-(4-(苯胺基)苯基)-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺，N-(4-((2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉)-5-磺醯胺基)苯基)苯甲醯胺，N-(4-苯甲醯基苯基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺，2-側氧基-N-(5-苯基-1H-吡唑-3-基)-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺，2-側氧基-3-(丙-2-亞基)-N-(5-(對甲苯基)-1H-吡唑-3-基)吲哚啉-5-磺醯胺，2-側氧基-N-(5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基)-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺， N-(苯并[d]噻唑-2-基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺，N-(4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺，2-(N-甲基甲醯胺)-4-(4-((2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉)-5-磺醯胺基)苯氧基)-吡啶，2-(N-甲基甲醯胺)-4-(3-氟-4-((2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉)-5-磺醯胺基)苯氧基)-吡啶，2-氟-N-甲基-4-((2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉)-5-磺醯胺基)苯甲醯胺，N-(4-甲基-3-((4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)胺基)苯基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺，及N-(1,4-二側氧基-1,2,3,4-四氫呔

   

   -5-基)-2-側氧基-3-(丙-2-亞基)吲哚啉-5-磺醯胺。
7. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物，及醫藥學上可接受之載劑。
8. 如請求項7之醫藥組合物，其進一步包含另外治療劑。
9. 如請求項8之醫藥組合物，其中該另外治療劑係選自由以下組成之群：抗纖維化劑；激素或激素拮抗劑；激酶抑制劑；靶向信號轉導劑；生物反應調節劑；抗癌劑；及其任何組合。
10. 如請求項8之醫藥組合物，其中該另外治療劑係選自由以下組成之群：烷化劑；抗生素；抗代謝物；抗血管生成劑；及其任何組合。
11. 如請求項8之醫藥組合物，其中該另外治療劑係選自由以下組成之群：抗體治療劑；化學治療劑；及其任何組合。
12. 如請求項8之醫藥組合物，其中該另外治療劑係選自由以下組成之群：紫杉烷；類視色素；生物鹼；拓樸異構酶抑制劑；Hsp90抑制劑；法呢基(farnesyl)轉移酶抑制劑；芳香酶抑制劑；吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)抑制劑；組蛋白乙醯基轉移酶(HAT)抑制劑；組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑；長壽蛋白(sirtuin，SIRT)抑制劑；溴域及額外末端模體(Bromodomain and Extra-Terminal motif，BET)抑制劑；及其任何組合。
13. 一種如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物的用途，其係用於製造用以抑制個體之CDK8的藥劑。
14. 一種如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物的用途，其係用於製造用以預防或治療發炎性病狀或纖維化疾病之藥劑。
15. 如請求項14之用途，其中該發炎性病狀或纖維化疾病係選自由以下組成之群：第1型糖尿病、移植物抗宿主病、發炎性腸病、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、食物過敏、HCV 血管炎、斑禿、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化症、類風濕性關節炎、皮膚纖維化、肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、腸纖維化、囊腫纖維化、心肌纖維化、子宮平滑肌瘤、子宮腺肌症，及其任何組合。
16. 如請求項15之用途，其中該肺纖維化為特發性肺纖維化。
17. 一種如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物的用途，其係用於製造用以預防或治療腫瘤或細胞增生疾病之藥劑。
18. 如請求項17之用途，其中該腫瘤或細胞增生疾病係選自由以下組成之群：腦癌、肺癌、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、膀胱癌、胃癌、胰臟癌、乳癌、頭癌、頸癌、腎癌(renal cancer)、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸直腸癌、子宮癌、食道癌、睪丸癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、骨髓細胞白血病、神經膠質瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)，及其任何組合。
19. 如請求項17之用途，其中該腫瘤或細胞增生疾病係選自由以下組成之群：結腸癌、直腸癌、葡萄膜黑色素瘤、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)、慢性骨髓性白血病、人類喉鱗狀細胞癌，及其任何組合。
20. 如請求項18之用途，其中該腫瘤或細胞增生疾病為前列腺癌。