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TWI731654B - 治療性hpv16疫苗 - Google Patents

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TWI731654B
TWI731654B TW109113009A TW109113009A TWI731654B TW I731654 B TWI731654 B TW I731654B TW 109113009 A TW109113009 A TW 109113009A TW 109113009 A TW109113009 A TW 109113009A TW I731654 B TWI731654 B TW I731654B
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Abstract

本發明提供了可以被用作針對HPV16的治療性疫苗的設計的核酸構建體及多肽。

Description

治療性HPV16疫苗
本發明涉及醫學領域並且更具體的是涉及可以被用於抵抗人類乳突病毒類型16的治療性疫苗之核酸構建體及多肽。
人類乳突病毒(HPV)家族由大於100種類型(也稱為亞型)組成，該等類型能夠感染皮膚或黏膜的角質細胞。超過40種類型的HPV典型地藉由性接觸進行傳播，並且肛殖區的HPV感染在無論男女中都非常常見。一些性傳播的HPV類型可以引起生殖器疣。持續感染“高危”型HPV(例如16、18、31、45型)-不同於引起皮膚疣的那些-可以發展成癌前病變和浸潤性癌，例如子宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌和肛門癌。在感染後的一至兩年內，大部分的HPV感染將自發清除。在健康個體中，當抗原激發時，特異性針對HPV-16的病毒早期蛋白E2、E6和E7的循環的Th1-和Th2-型CD4+ T-細胞連同E6特異性的CD8+ T細胞遷移到皮膚中，表明針對針對HPV-16感染的成功防禦通常與該等病毒早期抗原的系統效應T-細胞應答有關。在小部分(~1%)的感染個體中，HPV感染持續，最終導致生殖器腫瘤病變。在高危HPV中，HPV16和HPV18係子宮頸癌之主要原因，一起造成了約70%的病例，並且這兩種類型還在其他HPV誘導的癌症例如肛門癌和口咽癌中起到了主要作用。在世界範圍內，HPV係引起癌症的最重要的傳染性病原體之一。 抵抗HPV的疫苗接種被視為減少HPV感染發病率或影響的可行策略(凡德伯格(van der Burg)和梅列夫(Melief)，2011，免疫學當今觀點(Curr Opinion Immunol)23: 252-257)。 基於由HPV16和18型的蛋白L1(包膜蛋白)所形成的病毒樣顆粒(VLP)的預防性HPV疫苗在預防HPV16和HPV18的持續感染和相關疾病的方面中非常有效。該等疫苗被認為是藉由誘導抵抗L1蛋白的中和抗體提供了無菌免疫。添加來自另外的高危HPV類型的基於L1的VLP可以進一步增加此類疫苗賦予的保護寬度。 然而，當此類疫苗可以預防初始感染(即，它們引起了預防)時，不存在對由HPV16和HPV18引起的已形成的生殖器病變的有益作用的證明，因此它們不被認為是抵抗HPV的治療性疫苗(希爾德斯海姆(Hildesheim)等人，2007，美國醫學會雜誌(JAMA)298: 743-53)。 儘管引入了該等預防性疫苗，但是大量人群已經獲得或仍處於獲得持久性高危的HPV感染之風險，並且因此處於患上癌症的風險。用於根除已形成的HPV感染和相關疾病的治療性疫苗係一項緊急未滿足的醫療需要。 已經描述了一些解決這項需要的嘗試。例如，已經用各種不同的疫苗接種策略進行臨床試驗，例如，由來自牛結核桿菌(Mycobacterium bovis )和HPV-16 E7的熱休克蛋白(Hsp)組成的或由來自HPV-16和HPV-18的E6、E7和L2的融合蛋白組成的融合蛋白，嵌合的L1-E7VLP VLP，表現HPV-16和HPV-18的E6和E7或牛乳突病毒(bovine papilloma virus)E2的重組牛痘病毒，表現HPV-16和HPV-18的E6和E7的CTL表位的DNA疫苗，分泌HPV-16 E7抗原的減活單核細胞增生李斯特菌(Lm)，以及包括HPV-16 E6和E7肽的合成長肽(SLP)。雖然該等方法中的一些顯示出了一些但有限的臨床療效，但大多數失敗了，證實了需要改善當前的策略。 整合早期HPV蛋白E6和E7係從感染到癌症的過程中一項必要的步驟，並且針對保持子宮頸癌細胞的腫瘤表型，需要E6和E7的連續表現。因此，E6和E7被認為是針對治療性疫苗接種的良好的靶標。如提到的一些研究已經顯示了感染了高危HPV的女性的治療性疫苗接種可以誘導現有病變的消退。肯特爾(Kenter)等人顯示了使用衍生自HPV16 E6和E7蛋白的SLP以及佐劑作為一種治療性疫苗的在患有外陰上皮內瘤樣病變(VIN)的47%患者中的持久並完全消退(肯特爾(Kenter)等人，2009，新英格蘭醫學雜誌(N Engl J Med)361: 1838-47)。類似地，一項研究，其中在VIN 2/3患者中將基於蛋白的疫苗(TA-CIN，由HPV16 E6、E7和L2的融合蛋白組成)與局部免疫調控結合，顯示出了在63%患者中的完全消退(戴雅娜(Daayana)等人，2010，英國癌症雜誌(Br J Cancer)102: 1129-36)。作為疫苗的合成長肽的可能缺陷包括大規模的生產及其相關成本、對潛在反應佐劑的需要以及與免疫接種相關的有關不良反應(尤其是疼痛和腫脹)。由於高度不適，當自發清除率仍然很高的時候，SLP將不可能被用於早期階段疾病。類似地，由於在TA-CIN治療的情況下針對局部咪喹莫特治療的需要，耐受性係重要問題，因為大部分女性經歷了持續咪喹莫特(imiquimod)治療期間的局部或全身性副作用，這可能影響日常活動。 可能的替代方案係使用基於核酸疫苗接種例如編碼用於疫苗接種的HPV E6和/或E7蛋白的DNA疫苗或病毒疫苗。 然而，HPV E6和E7蛋白具有致癌的潛力，並且因此由於抗原的拖延表現的可能性，用包括編碼該等蛋白的核酸的疫苗接種造成了誘導細胞轉化的風險。 因此，在基因疫苗接種的情況下，可以使用無毒的/脫毒版本的E6和/或E7，以便排除因為疫苗接種的任何細胞轉化風險。通常藉由針對該等蛋白功能已知重要的殘基的缺失和/或取代來獲得野生型E6和E7的致癌潛能喪失(例如，斯馬海爾(Smahel)等人，2001，病毒學(Virology)281: 231-38；揚(Yan)等人，2009，疫苗(Vaccine)27: 431-40；威金(Wieking)等人，2012，癌症基因治療(Cancer Gene Ther)19: 667-74；WO 2009/106362)。然而，該等方法的缺點係它們會帶來從蛋白去除重要T-細胞表位和/或將新的不希望的T-細胞表位導入蛋白中，並且因此可能不會引起所希望的免疫應答。 在去除HPV16 E6和E7的致癌潛能的可替代策略中，已經構建了E6和E7蛋白的改組版本(即，多肽，其中重新排序野生型蛋白的片段)(例如，Öhlschläger等人，2006，疫苗(Vaccine)24: 2880-93；奧斯特惠斯(Oosterhuis)等人，2011，國際癌症雜誌(Int J Cancer)129: 397-406；奧斯特惠斯(Oosterhuis)等人，2012，人類基因治療(Hum Gen Ther)23: 1301-12)。然而，該等方法將仍需要生產、配製並且給予多種分子以確保包括E6和E7蛋白的所有可能性表位，這導致了次優的邏輯和相對的高成本，並且此外所描述的策略引入了不存在於E6和E7中的潛在強大的非天然表位，並且由於免疫應答可以源自與此類非天然表位相關的E6/E7表位，因此所述構建體可以不具有最優的免疫學特性。 因此，本領域仍需要抵抗HPV的治療性疫苗，較佳的是具有較少上述方法缺點的那些。
本發明提供了編碼多肽的核酸分子，該多肽基本上包括HPV16癌基因蛋白E6和E7的所有可能的T-細胞表位，然而該核酸分子，藉由包括已經重新排序的E6和E7蛋白的片段，同時還包含最小化數量的不希望的新表位，具有大幅降低的(與wt E6和E7相比)直至不能檢測到的轉化活性。這係與之前由其它所表示的分子相反。 本發明提供了編碼多肽的核酸分子，該多肽包括如SEQ ID NO: 1所示的序列。 所編碼的多肽可以進一步包括前導序列。 在某些實施方式中，所編碼的多肽進一步包括人類乳突病毒(HPV)E2蛋白的至少一個表位，例如HPV16 E2蛋白。可以使該E2蛋白突變以降低DNA結合，例如藉由在它的DNA結合域中的缺失或突變。在某些實施方式中，所編碼的多肽包括如SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5所示的序列。 在某些實施方式中，將該核酸序列進行密碼子優化，例如，用於人類細胞中的表現。 在某些實施方式中，該核酸序列包括如SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、或SEQ ID NO: 6中所示的序列。 本發明還提供了包括根據本發明的核酸分子之載體，其中該編碼多肽的序列可操作地連接至啟動子。 在某些實施方式中，該載體係DNA載體例如質粒。在其他實施方式中，該載體係病毒栽體，例如，MVA載體或重組腺病毒載體。在某些較佳的實施方式中，該載體係重組腺病毒。 在某些實施方式中，載體中的啟動子可操作地偶聯到阻遏物操縱基因序列上，阻遏蛋白可以結合至該阻遏物操縱基因序列上，以便在所述阻遏蛋白的存在下阻遏啟動子的表現。在某些實施方式中，該阻遏物操縱基因序列係TetO序列或CuO序列。 本發明還提供了疫苗組成物，該疫苗組成物包括根據本發明之載體、和藥學上可接受之賦形劑。 本發明還提供了在受試者中誘導抵抗HPV(具體的是HPV16)的免疫應答之方法，該方法包括向受試者給予根據本發明之疫苗組成物。本發明還提供了根據本發明之疫苗，用於誘導抵抗HPV(具體的是HPV16)的免疫應答。 在某些實施方式中，向受試者不止一次給予該疫苗。 本發明還提供了一種方法，用於治療受試者的以下任一項：持續性HPV感染(具體是持續性HPV16感染)、外陰上皮內瘤樣病變(intraepithelial neoplasia)(VIN)、子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)、陰道上皮內瘤樣病變(VaIN)、肛門上皮內瘤樣病變(AIN)、子宮頸癌(例如子宮頸鱗狀細胞癌(SCC))、口咽癌、陰莖癌、陰道癌或肛門癌，該方法包括向受試者給予根據本發明之疫苗。本發明還提供了根據本發明之疫苗，用於治療受試者的以下任一項：持續性HPV感染(具體是持續性HPV16感染)、外陰上皮內瘤樣病變(VIN)、子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)、陰道上皮內瘤樣病變(VaIN)、肛門上皮內瘤樣病變(AIN)、子宮頸癌(例如子宮頸鱗狀細胞癌(SCC))、口咽癌、陰莖癌、陰道癌或肛門癌。 本發明還提供了包括如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5所示序列的多肽。
本發明在以下實例中進一步解釋。該等實例不以任何方式限制本發明。它們僅僅用以闡明本發明。 實例實例 1 ：構建設計的多肽，該多肽基本上包括所有的 HPV16 E6 和 E7 CTL 表位 我們設計了新穎的、非致瘤的多肽(和編碼這種多肽的核酸)，該多肽基本上包含所有的HPV16 E6和E7蛋白的所有的表位，並且具有最小數量的預計的/預測的強大的新表位(新表位意指不存在於野生型HPV16 E6和E7蛋白中的表位)。本發明的多肽(有時還在此稱為‘E6E7SH’)包括如在SEQ ID NO: 1中所提供的序列。以SEQ ID NO: 2提供編碼該多肽的密碼子優化的核酸。 本發明的分子係單分子，該單分子提供了超過了使用多分子的策略的生產優點。此外，本發明的多肽包括存在於HPV16的野生型E6和E7中的基本上所有假定的CTL表位，並且同時具有最小數量的預期的/預測的強大的新表位，該等新表位可以潛在地可能是免疫顯性的並且因此可以從相關的野生型CTL表位轉移免疫應答。因此本發明之構建體係比其他人所描述的分子(缺少可能的CTL表位和/或包含更多或更強的新表位)在免疫學上更有利。 例如，SEQ ID NO: 1的構建體針對如下各項包含具有預測結合親和力 ＜ 50 nM的九個胺基酸長度的僅一個新表位：20種最常見的HLA-A、20種最常見的HLA-B和20種最常見的HLA-C等位基因(HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*02:03、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*23:01、HLA-A*24:02、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*30:02、HLA-A*31:01、HLA-A*32:01、HLA-A*33:01、HLA-A*33:03、HLA-A*34:01、HLA-A*68:01、HLA-A*68:02、HLA-B*07:02、HLA-B*07:04、HLA-B*08:01、HLA-B*13:01、HLA-B*15:01、HLA-B*18:01、HLA-B*35:01、HLA-B*37:01、HLA-B*39:01、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-B*40:06、HLA-B*44:02、HLA-B*44:03、HL-B*46:01、HLA-B*48:01、HLA-B*51:01、HLA-B*52:01、HLA-B*53:01、HLA-B*58:01、HLA-C*07:02、HLA-C*04:01、HLA-C*03:04、HLA-C*01:02、HLA-C*07:01、HLA-C*06:02、HLA-C*03:03、HLA-C*08:01、HLA-C*15:02、HLA-C*12:02、HLA-C*02:02、HLA-C*05:01、HLA-C*14:02、HLA-C*03:02、HLA-C*16:01、HLA-C*08:02、HLA-C*12:03、HLA-C*04:03、HLA-C*17:01、HLA-C*14:03)，如在IEDB網站(http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_binding.html，2009-09-01B版)針對HLA-A和HLA-B使用ANN(倫德高(Lundegaard)等人，2008，核酸研究(Nucl Acids Res)36: W509-12)SMM方法(彼得斯(Peters)等人，2003，生物資訊學(Bioinformatics)19: 1765-72)以及針對用於肽結合至MHC類別I分子的預測工具的HLA-C的NetMHCpan方法(霍夫(Hoof)等人，2009，免疫遺傳學(Immunogenetics)61: 1-13)。 作為非限制性實例，使用在IEDB網站的SMM預測工具，描述於Oosterhuis et al., 2011, Int J Cancer 129: 397-406及Öhlschläger et al., 2006, Vaccine 24: 2880–9的改組的E6和E7序列在核心部分分別含有20種常見之HLA-A和-B的九個潛在、強大的獨特的新表位(ANN或SMM IC50 ＜ 50 nM)。這甚至不包括用於該途徑的附加物(其中附加物將進一步造成另外的新表位，並且可能由於限制長度的‘重疊’而遺漏更多的天然MHC II表位)。事實上，據報導，含有改組之E6和E7蛋白之變體的改良分子(描述於WO 2013/083287中)包含針對20種最常見的HLA-A、20種最常見的HLA-B和20種最常見的HLA-C等位基因的22個獨特的新表位，其具有預測IC50 ＜ 50 nM的九個胺基酸長度(ANN、SMM或NetMHCPan)。 因此，本發明的設計的分子相比於改組的E6和E7以去除功能性的其他已公佈之方法，顯然有利於具有更低數量的預測的新表位。 合成編碼我們由此設計的HPV16 E6E7SH分子(即，具有如在SEQ ID NO: 1中所提供的胺基酸序列的多肽)的核酸，該核酸序列包括SEQ ID NO: 2，並且側翼為在5’端的HindIII位點和Kozak序列和在3’位點的XbaI位點(在英傑生命技術公司(Invitrogen Life technologies)的委託合成以及標準分子克隆，德國)。 使用HindIII和XbaI將該合成的片段克隆到標準表現載體，pCDNA2004.Neo中，該載體具有細菌抗藥性標誌物(氨比西林(Ampiciline))和哺乳類動物抗藥性標誌物(新黴素(Neomycine))，以獲得編碼本發明分子之質粒載體，例如用於基於(暫態)轉染的試驗。 可以按照這樣使用該等分子，但是還可以用作為包含附加特徵的另外的分子的基礎。作為非限制性實例，如下描述製備一些另外的變體。 可以將HPV16 E6E7SH融合蛋白質序列與其他HPV16早期蛋白的序列結合，以靶向患有持續感染的個體，並且以擴展免疫個體中的免疫系統全部。已經提出，抵抗E2的免疫應答在清除HPV16感染中起到了重要作用(德容(de Jong)等人，2002，癌症研究(Cancer Res)62: 472-479)。E2與E6E7SH的融合將給出疫苗組分，該疫苗組分具有抵抗從持續感染到浸潤性癌或在Leep手術後的復發/難治性疾病的HPV相關癌症的各階段的抗原。因此，作為此類實施方式的非限制性實例，我們製備了編碼E6E7SH與E2在它的N-端的融合蛋白的序列。在E2序列中，可以使修飾廢止DNA結合活性，該DNA結合活性可能在表現融合蛋白的細胞中影響基因表現。我們使wt HPV16 E2蛋白的位置293的甘胺酸、位置299的賴胺酸和位置300的半胱胺酸分別突變成纈胺酸、蛋胺酸和精胺酸。每個突變在於其自身已經完全廢止了E2與具有E2的結合域的DNA序列的結合(普拉卡什(Prakash)等人，1992，基因與發育(Genes Dev)6: 105-16)。 所產生的多肽稱為HPV16 E2E6E7SH並且包括SEQ ID NO: 3。製備編碼該多肽的密碼子優化序列並且在SEQ ID NO: 4中提供。 我們還構建了變體，其中將相同的E2突變蛋白融合至HPV16 E6E7SH融合多肽的C-端，產生了稱為HPV16 E6E7E2SH的多肽，該多肽包括SEQ ID NO: 5。將編碼該構建體的序列提供為SEQ ID NO: 6。 出於對照的目的，我們還構建了編碼多肽的序列，該序列包含針對作為融合蛋白的全長HPV16 E6和E7的野生型序列(將從aa 1至158的E6直接融合到從aa 1至98的E7，在此命名為E6E7wt)。 我們還測試了向該多肽添加前導序列的影響。作為非限制性實例，在該等構建體中的一些的N-端處融合編碼IgE前導序列的序列(參見例如US 6,733,994)[前導肽的序列提供於SEQ ID NO: 7]，例如在E6E7wt構建體中，該E6E7wt構建體導致了LSE6E7wt，並且在E2E6E7SH構建體中，該E2E6E7SH構建體導致了LSE2E6E7SH。在免疫小鼠中如藉由E7四聚體分析所測的，相比於不具有LS序列的相同抗原，其作用顯著(p ＜ 0.05)提高了免疫原性(例如，如在圖9中所見)。 在具有或不具有E2的情況下，編碼本發明E6E7SH多肽的序列可以，例如從DNA構建體、從RNA或從病毒載體進行表現。圖1證實了當如上所述用表現轉基因的DNA載體暫態轉染後在HEK-293T細胞中的表現。在轉染之後，收穫細胞並且用抵抗HPV16 E7的抗體藉由SDS-PAGE和西方印漬術分析細胞提取物。該試驗證實了當表現載體轉染後，適當大小的預期融合蛋白的表現。 在具有或不具有E2的情況下，並且在具有或不具有增強所編碼的融合蛋白的免疫原性的附加序列的情況下，可以使用腺病毒載體來表現E6E7。 由基因藝術公司(Geneart)，將編碼HPV16 E6E7 wt對照的基因或上述的HPV設計序列針對人類表現進行基因優化並且合成。Kozak序列(5’ GCCACC 3’)直接包含於ATG起始密碼子的前面，並且將兩個終止密碼子(5’ TGA TAA 3’)添加至各自的編碼序列的末端。將該等基因藉由HindIII和XbaI位點插入pAdApt35BSU質粒和pAdApt26質粒中(哈文格(Havenga)等人，2006，普通病毒學雜誌(J Gen Virol)87, 2135-43)。 藉由單同源重組，所有的腺病毒生產於PER.C6細胞中，並且如之前所述進行生產(針對rAd35：(Havenga)等人，2006，普通病毒學雜誌(J Gen Virol)87: 2135-43；針對rAd26：阿賓克(Abbink)等人，2007，病毒學雜誌(J Virol)81: 4654-63)。將PER.C6細胞(法勞科斯(Fallaux)等人，1998，人類基因治療(Hum Gene Ther)9: 1909-17)維持在具有10%胎牛血清(FBS)、補充以10 mM MgCl2的杜氏改良培養基(DMEM)中。 簡言之，根據製造商(美國生命技術公司(Life Technologies))提供的說明書使用脂質體轉染，用Ad載體質粒轉染PER.C6細胞。在到達完全的細胞病變效應(CPE)後一天收穫細胞，凍融，在3,000 rpm下離心5 min，並且存儲在-20°C下。將病毒進行噬斑純化並且在培養於多孔24組織培養板的單孔中的PER.C6細胞中進行擴增。進一步擴增在培養於T25組織培養燒瓶並隨後養於T175組織培養燒瓶中的PER.C6細胞中進行。將從在T175燒瓶後所獲得的細胞製備的粗裂解物的3到5 ml用來接種包含PER.C6細胞的70%融合層的24 × T1000五層組織培養燒瓶。使用兩步CsCl淨化法純化該病毒。最終，將該病毒以等分儲存在-85°C下。 Ad35.HPV16-E6E7wt、和Ad35.HPV16-E6E7SH係組合腺病毒血清型35(Ad35)載體，該等載體包括密碼子優化的核苷酸序列，分別用於表現野生型HPV16 E6和E7蛋白(E6E7wt)的融合蛋白、以及如上所述的設計的融合蛋白變體(E6E7SH，具有提供於SEQ ID NO: 1中的胺基酸序列)。該組合的E6和E7序列置於E1、E3缺失的腺病毒基因組的E1區域中的CMV啟動子控制下。Ad26.HPV16-E6E7wt、和Ad26.HPV16-E6E7SH係基於重組腺病毒血清型26的等效載體。 類似地，產生基於Ad26和Ad35的重組腺病毒載體，該等載體編碼HPV16 E2E6E7SH(SEQ ID NO: 3)變體。類似地，產生編碼HPV16 E6E7E2SH(SEQ ID NO: 5)變體的Ad26和Ad35。此外，產生編碼在N-端具有IgE前導序列的E2E6E7SH融合蛋白的Ad35載體，該載體命名為Ad35.HPV16-LSE2E6E7SH。還生產具有在N-端融合至IgE前導序列的E6E7wt的對照腺病毒。 用PER.C6細胞產生重組腺病毒，並且在氯化銫梯度上藉由離心進行純化。 在以下實例中提供了偶聯至阻遏物系統的本發明的構建體的另外的實例。實例 2. 缺少設計的構建體之轉化活性 野生型HPV16 E6和E7蛋白具有致瘤潛能，該致瘤潛能在某些測定中表現為轉化活性，例如在軟瓊脂測定中的菌落形成(馬西斯米(Massimi)和班克斯(Banks)，2005，分子醫學方法(Methods Mol Med)119: 381-395)。如在實例1中所描述的E6E7SH多肽包括以重新排序方式的E6和E7蛋白的片段。與在此類測定中wt E6和E7蛋白之一相比，預測這可以去除致瘤潛能(例如藉由顯著降低的轉化活性測量的)。 其他文獻報導了HPV16 E6和E7的基因改組變體確實已經失去了它們的致癌潛能(Öhlschläger等人，2006，疫苗(Vaccine)24: 2880-93；漢肯(Henken)等人，2012，疫苗(Vaccine)30: 4259-66)，證實了基因改組破壞了E6和E7蛋白的野生型功能。 為了評估致瘤性的喪失，我們評估了我們的E6E7SH構建體賦予NIH 3T3細胞在軟瓊脂中生長能力的能力(由例如Massimi和班克斯(Banks)，2005，分子醫學方法(Methods Mol Med)119: 381-395所描述的)。具有表現野生型HPV16 E7的質粒的NIH3T3細胞的轉染一致地導致菌落形成。在該等測定中，僅野生型HPV16 E6的表現不引起在背景上的菌落形成。這與所公佈的觀察一致，在該測定中E7wt比E6wt更有效(賽德曼(Sedman)等人，1991，病毒學雜誌(J Virol)65: 4860-66)。在四個獨立的試驗中用我們的E6E7SH構建體進行的轉染並不會導致在軟瓊脂(圖2)中細胞的菌落的生長，證實了編碼本發明多肽的核酸E6E7SH已經失去了與E7相關的轉化能力。 E6和E7的致瘤潛能分別是與他們降低細胞蛋白p53和pRb水平的能力有關。進行p53和pRb降解測定來證實編碼本發明多肽的核酸E6E7SH構建體不具有與野生型E6和E7有關的、處於分子水平的生物活性。簡言之，HPV16 E6wt和我們的E6E7SH構建體表現於NCI-H1299細胞中，該等NCI-H1299細胞針對於p53降解測定缺少內源p53。針對pRb降解測定，HPV16 E7wt和E6E7SH構建體表現於pRb失效Saos-2細胞中。正如在圖3中可見的，p53與E6wt但不是與E6E7SH的共同表現，導致了p53水平的降低(圖A和B)。類似地，圖3C和3D顯示出了pRb與E7wt但不是與E6E7SH的共同表現，導致了pRB水平的降低。該等數據證實了編碼本發明多肽的核酸沒有能力在軟瓊脂中形成菌落並且不包含野生型E6和E7多肽的主要生物活性，即p53和pRb的分別失活。 為了進一步證實編碼本發明多肽的核酸構建體的安全性，我們使用了原代人類包皮角質形成細胞,該原代人類包皮角質形成細胞係HPV介導的轉化的天然靶細胞。原代人類角質形成細胞的永生化需要E6和E7二者野生型的作用(芒格(Munger)等人，1989，病毒學雜誌(J Virol)63: 4417-21)。這種測定可能是生理學上最相關的體外測定，來證實我們構建體的安全性(馬西斯米(Massimi)和班克斯(Banks)，2005，分子醫學方法(Methods Mol Med)119: 381-395)。與非轉導的對照細胞(圖4)和活化hTERT、端粒酶催化亞單位(數據未示出)相比，用表現來自HPV16(E6E7wt)的野生型E6和E7的慢病毒所轉導的細胞誘導了原代角質形成細胞的永生化，如藉由它們壽命的延長所表明的。與GFP轉導的或非轉導的角質形成細胞相比，本發明多肽(E6E7SH)的表現不能延長壽命。在兩個另外獨立的供體中獲得相似的結果(數據未顯示)。總之，該等數據證實了我們的構建體已經失去了誘導原代人類角質形成細胞永生化的能力，該等原代人類角質形成細胞被認為是高度具有生理意義的模型。 HPV16 E6和E7的片段以另一種順序重組的另一種構建體也不能夠永生化原代人類包皮角質形成細胞。然而，針對那種構建體觀察到了長達約120-150天的延長的壽命。這表明了這一領域的一些不可預測性，並且證實了在安全性相關的方面中根據本發明的設計的分子的優越性。 該實例中的所有實驗一起提供了編碼根據本發明多肽的核酸缺少轉化活性的強有力的證據，並且因此比HPV16 E6和E7 wt構建體大大提高了安全性。實例 3. 對 E6E7SH 設計構建體之免疫應答 如在實例1中所述，我們已經製備了DNA載體和腺病毒載體。 基於小鼠用編碼野生型E2、或者E6或E7的DNA質粒免疫的初始試驗，我們使用CB6F1小鼠菌株用於測量免疫應答，並且用HPV16 E2、E6和E7抗原進行免疫在CB6F1中比在C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠中誘導出更廣泛的細胞免疫應答。在單獨的實驗中，將小鼠用編碼本發明分子的DNA載體進行免疫，並且測量細胞免疫應答。可以在用表現E6E7SH的DNA質粒免疫的小鼠中測量HPV16 E7特異性免疫應答(圖5)。 示於該實例中的以下數據係來自用腺病毒載體進行的小鼠實驗。 為了評估疫苗誘導的免疫原性，用表現E6E7wt、LSE6E7wt、E6E7SH的腺病毒載體(Ad35)或不編碼轉基因的腺病毒載體(空白)對CB6F1小鼠進行免疫。測試向小鼠給予的兩種劑量：5*109 病毒顆粒(vp)和1*1010 vp。免疫接種後兩週和八週，處死該等小鼠並且用HPV16 E7 15mer肽池刺激分離的脾細胞過夜。藉由IFNγ ELISPOT分析兩週和八週的E7特異性應答。數據見圖6。 這顯示了用Ad35.HPV16-E6E7SH免疫小鼠誘導了如藉由ELISPOT分析所測量的E7特異性免疫應答。此外，圖6中的結果證實了藉由向轉基因添加N-端前導序列提高抵抗腺病毒表現的轉基因的免疫應答的可能性。 其次，對於免疫原性，測試向E6E7SH多肽添加E2的作用。Ad35載體編碼具有融合至N-端(E2E6E7SH)或融合至C-端(E6E7E2SH)的E2的多肽。將CB6F1小鼠用1 x 1010 vp的劑量進行免疫。圖7(E7四聚體染色)和圖8(圖C，IFNγ ELISPOT)顯示了抵抗E7的免疫應答，儘管差異並不是統計學上有義意的，但是相比於不具有E2的構建體，包括E2的設計的構建體的免疫應答往往更高。相比於具有融合至E6E7SH設計多肽的E2的腺病毒載體的應答，針對只編碼E2的腺病毒載體具有更高的對E2的應答，其中E2與E2E6E7SH和E2與E6E7E2SH的差異係顯著的(p值：＜ 0.05)。 可以推斷進一步包括E2的設計的構建體仍可以提供抵抗E7的免疫應答，並且此外還提供了對E2的免疫應答，因此比不包括E2的構建體增大了免疫應答的寬度。 當融合至野生型E6和E7的融合蛋白的N-端的時候，顯示出了前導序列的添加導致更高的E7特異性應答(圖6C)。類似地，確定前導序列對E2E6E7SH融合蛋白的免疫原性的作用。因此，在具有或不具有N-端E2的情況下，將編碼設計的多肽的Ad35載體和編碼LSE2E6E7SH的Ad35載體用來對小鼠進行免疫，並且每隔兩週取血液樣品來測量E7特異性之免疫應答(圖9)。如圖7和8所示，存在N-或C-端融合至E6E7SH的E2往往增加了免疫應答。IgE前導序列的添加進一步增加了E7特異性應答(圖9B)。隨著時間，針對所有三種編碼根據本發明的設計的分子的腺病毒載體，觀察到了持續免疫應答，並且在免疫之後的最高應答與在試驗期間的最高應答一致。 可以推斷可以藉由添加特異性序列可以增加設計的構建體(該構建體進一步包括N-端E2)所誘導的應答，例如，IgE前導序列，該IgE前導序列係將所編碼的蛋白靶向特異性細胞區室。 可以用不同類型的腺病毒載體誘導抵抗本發明肽的細胞免疫應答。在先前的實驗中，我們使用了Ad35載體，然而在圖10的試驗中，用表現E2E6E7SH的Ad26腺病毒載體對小鼠進行免疫。數據顯示了用基於Ad26的疫苗的免疫也誘導了E7特異性T細胞。此外，該等結果證實了用表現E2E6E7SH的Ad35腺病毒載體的第二次免疫進一步增強了細胞免疫應答(圖10)。實例 4. 恆河獼猴中設計的構建體之免疫原性 為了評估表現本發明的設計的序列的腺病毒載體誘導非人類靈長動物中免疫應答的能力，以1*1011 vp的劑量，用表現E2E6E7SH的腺病毒載體(Ad26)或不編碼轉基因的腺病毒載體(空白)藉由肌肉注射對恆河獼猴進行免疫。在免疫後八週，用表現相同抗原的Ad26載體藉由免疫加強該免疫應答。在第16週時，該動物接受了又一次的表現相同抗原的Ad35的注射。在若干時間點取血液樣品並且用對應於HPV16 E2、E6或E7的肽池刺激分離的白細胞過夜。藉由IFNγ ELISPOT測量特異性應答。數據見圖11。此外，在首次免疫後的第10週和第18週，評估對本發明中的跨新穎連接的肽具有特異性的細胞免疫應答。在所有的動物中IFNγ應答的誘導係在 ＜ 50 SFU/1*106 PBMC的檢測極限以下進行的(數據未顯示)。 數據顯示了用Ad26.HPV16-E2E6E7SH的非人類靈長動物的免疫導致了針對出現於編碼轉基因中的所有三種HPV16蛋白的細胞免疫應答，但是不是針對新穎的連接。可以用Ad26.HPV16-E2E6E7SH藉由另外的免疫加強應答，並且在第16週用對應Ad35載體的另外加強進一步增加了HPV16 E2、E6和E7特異性免疫應答。 在第72週再一次用Ad26.HPV16-E2E6E7SH的後期加強給藥導致了HPV16細胞免疫應答的增加，該增加在幾週後下降(未顯示)。 在單獨的實驗中(未顯示)，用兩種腺病毒載體(一種表現HPV16 E6E7SH並且另一種表現HPV16 L1蛋白)的組合藉由陰道給藥對恆河獼猴進行免疫。在外週血單核細胞中測量到針對E6和E7的低的但是可測量的細胞應答。在該等試驗中，檢測到了針對L1的強大的細胞免疫應答。實例 5. 在小鼠腫瘤模型中的治療效果 本發明的多肽能夠誘導動物中的HPV16特異性細胞免疫應答，該細胞免疫應答可以對表現HPV16 E6和/或E7的細胞施加治療效果。治療性免疫，即在腫瘤已經開始生長後的免疫，可以被用來證實治療性HPV疫苗候選物的效果。在注射有TC-1細胞(表現HPV16 E6和E7的小鼠細胞)的小鼠中測試Ad26和Ad35載體的治療效果(林(Lin)等人，1996，癌症研究(Cancer Res)56: 21-6)。在小鼠中經皮下注射後的幾天至幾週內TC-1細胞將形成實體瘤。在沒有疫苗的情況下，腫瘤快速生長並且在30天內達到1000 mm3 的預定大小(圖D和E)。當達到這種大小時，出於倫理原因處死小鼠。 在具有SLP(被用作陽性對照；肯特爾(Kenter)等人，2009，新英格蘭醫學雜誌(N Engl J Med)361: 1838-47；茲韋弗令(Zwaveling)等人，2002，免疫學雜誌(J Immunol)169: 350-8)或表現HPV16-E2E6E7SH的腺病毒載體的初次-加強免疫接種時間表下，觀察到了TC-1誘導的腫瘤生長的明顯降低(圖12，圖B和C)。在初次免疫後的第一個30天的仔細檢查(圖F和G)顯示出了用表現E2E6E7SH的腺病毒載體的免疫比用SLP的免疫對腫瘤生長具有本質上更大的影響。起始生長速率更低並且在大多數情況下該等腫瘤縮小了。在用腺病毒載體免疫的小鼠中的11隻中的3隻中，完全消除了腫瘤，這體現在生存圖中(圖H)。 結論，在良好建立的激發模型中，針對HPV16誘導的癌症，用表現本發明多肽的腺病毒載體進行免疫顯著降低了腫瘤生長或完全消除了已形成的腫瘤。實例 6 ：使用阻遏物系統來改進表現 HPV 衍生抗原的腺病毒載體的生產率和遺傳穩定性 之前已經報導了在強大組成型活性啟動子的控制下，插入的腺病毒載體的轉基因取決於轉基因產物的性質，可以負面影響載體生產(吉田(Yoshida)&山田(Yamada)，1997，生物化學與生物物理學集刊(Biochem Biophys Res Commun)230: 426-30；魯賓琪珂(Rubinchik)等人，2000，基因治療(Gene Ther)7: 875-85；馬修斯(Matthews)等人，1999，普通病毒學雜誌(J Gen Virol)80: 345-53；艾德爾摩(Edholm)等人，2001，病毒學雜誌(J Virol)75: 9579-84；加爾(Gall)等人，2007，分子生物技術(Mol Biotechnol)35: 263-73)。轉基因依賴型載體生產率問題的實例包括低效載體挽救和生長，低最終載體產量，和，在嚴重的情況下，具有缺陷轉基因盒的病毒突變體的快速過度生長。為了解決該等問題，多項研究探索了在生產細胞中，在載體複製期間，沈默載體轉基因表現的可能性(馬修斯(Matthews)等人，1999，普通病毒學雜誌(J Gen Virol)80: 345-53；艾德爾摩(Edholm)等人，2001，病毒學雜誌(J Virol)75: 9579-84；加爾(Gall)等人，2007，分子生物技術(Mol Biotechnol)35: 263-73；柯丁罕(Cottingham)等人，2012，生物技術與生物工程(Biotechnol Bioeng)109: 719-28；吉伯特(Gilbert)等人，2014，病毒學方法雜誌(J Virol Methods)208: 177-88)。在此方面，在Ad載體的背景下，之前已經執行了不同的阻遏系統，並且事實上已經顯示出了改進了編碼不同類型的(抑制)的載體生產率和遺傳穩定性。 已經觀察到在此描述的腺病毒載體中的一些，連同一些編碼某些HPV抗原變體的其他腺病毒載體顯示出了在此所述的轉基因依賴型載體生產率問題中的一些，並且因此可能在這一方面進一步改善。因此，我們力圖調研使用系統來阻遏載體轉基因表現是否可以如在此所述的那些改進表現HPV衍生抗原的Ad載體的生產特性。為此目的，我們實施了兩種存在的阻遏物操縱基因系統，即TetR/TetO(堯(Yao)&埃裡克松(Eriksson)，1999，人類基因治療(Hum Gene Ther)10: 419-22，EP 0990041 B1)和CymR/CuO(穆裡克(Mullick)等人，2006，BMC生物技術(BMC Biotechnol)6: 43)，進入我們的腺病毒載體平臺。之前已經有其他人使用TetR/TetO和CymR/CuO系統在載體複製期間藉由載體轉基因沈默來改善腺病毒載體生產率(加爾(Gall)等人，2007，分子生物技術(Mol Biotechnol)35: 263-73；柯丁罕(Cottingham)等人，2012，生物技術與生物工程(Biotechnol Bioeng)109: 719-28；吉伯特(Gilbert)等人，2014，病毒學方法雜誌(J Virol Methods)208: 177-88)。這兩種系統的實施涉及了在包含TetO或CuO序列的CMV啟動子的控制下產生表現感興趣基因的腺病毒載體。此外，該實施需要產生穩定表現各自同源阻遏物蛋白(即，TetR或CymR)的細胞系。 產生若干E1缺失、基於Ad26-和Ad35-的載體，其中編碼異源多肽的序列可操作地連接至包含TetO或CuO操縱基因序列的CMV啟動子。首先，將某些包含TetO-或CuO-的序列(分別是SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12)插入pAdapt26和pAdapt35.Bsu質粒的CMV啟動子(EQ ID NO: 13)的轉錄起始位點(TSS)附近(阿賓克(Abbink)等人，2007，病毒學雜誌(J Virol)81: 4654-63；哈文格(Havenga)等人，2006，普通病毒學雜誌(J Gen Virol)87: 2135-43)。針對兩種系統，將包含操縱基因的序列插入之前所述的CMV啟動子的完全相同的位置(堯(Yao)&埃裡克松(Eriksson)，1999，人類基因治療(Human Gene Ther )10: 419-22；EP 0990041 B1； 穆裡克(Mullick)等人，2006，BMC生物技術(BMC Biotechnol )6: 43；EP 1385946 B1)。確切地，相對於TSS(按原設計；斯坦伯格(Stenberg)等人，1984，病毒學雜誌(J. Virol.)49: 190-9)，分別將包含TetO-和CuO-的序列直接插入位置-20和+7的下游。在SEQ ID NO: 13中，這兩個位置分別對應於位置716和742。分別將得到的包含操縱基因的CMV啟動子稱為CMVTetO和CMVCuO。其次，使用HindIII和XbaI限制性位點，將不同的轉基因插入得到的構建體的(修改的)CMV啟動子的下游。該等轉基因包括編碼綠色螢光蛋白和螢蟲素酶(GFP-Luc)、來自本發明的LSE2E6E7SH、和另一種具有與LSE2E6E7SH一些類似性的的多肽(在該實例中構建體稱為‘HPVAg’)的融合蛋白的基因。HPVAg包括呈現於LSE2E6E7SH中的相同的前導序列，連同HPV16的E2、E6、和E7序列。使用在此所述之方法，在CMVTetO或CMVCuO啟動子的控制下，將得到的修飾的pAdapt26和pAdapt35.Bsu質粒用於產生表現上述報告基因和HPV轉基因的腺病毒載體。 藉由PER.C6®細胞的穩定轉染，分別使用質粒pcDNATM 6/TR(生命技術公司(LifeTechnologies)，V1025-20)和pcDNATM 6/TR的衍生物產生表現TetR或CymR的細胞系，在pcDNATM 6/TR的衍生物中TetR編碼序列(SEQ ID NO: 14，編碼多肽SEQ ID NO: 15)被密碼子優化的CymR編碼序列(SEQ ID NO: 16，編碼多肽SEQ ID NO: 17)替代。如藉由pcDNATM 6/TR的供應商所述的，使用基於瞬間轉染的測定大規模產生穩定的細胞系，來篩選能夠阻遏CMVTetO-或CMVCuO驅動的基因的表現的細胞克隆。在該等細胞中，在載體複製期間，針對其阻遏轉基因表現的能力，分析得到的PER.C6/TetR和PER.C6/CymR細胞系。在包含操縱基因的CMV啟動子的控制下，在表現對應於各自操縱基因序列的阻遏物的細胞系中，用表現GFP-Luc的載體進行的實驗顯示了整個完整的病毒複製週期中螢光素酶基因表現減少至少10倍(數據未顯示)。這證實了在複製腺病毒載體的背景下PER.C6/TetR和PER.C6/CymR細胞系能夠阻遏載體轉基因表現。 針對表現HPVAg的基於Ad35的載體，調研腺病毒載體轉基因表現的TetR-和CymR-介導的阻遏對載體產量的影響(圖13A)。為此，藉由從CMVTetO或CMVCuO啟動子表現HPVAg的載體，以1000病毒顆粒/細胞並且持續三小時的持續時間，使於在24孔板中以3*105 細胞/孔接種的PER.C6、PER.C6/TetR、和PER.C6/CymR細胞系經受一式四份感染。作為對照，用表現GFP-Luc而不是HPVAg的對應載體進行平行感染。在感染後四天，藉由使孔的內容物(即，受感染細胞和介質)經受兩次凍融循環來製備粗病毒裂解物。隨後藉由基於Ad35六鄰體序列特異性定量PCR方案確定腺病毒載體效價，該方案用已知的病毒顆粒效價作為標準使用純化的Ad35載體。結果顯示出包含TetO-和CuO-的編碼HPVAg的Ad35載體，相比於表現GFP-Luc的對照載體，顯示出了在正常PER.C6細胞上降低的載體產量。相比之下，當在表現它們同源阻遏物的細胞上生產時(即分別是TetR和CymR)，該等相同的載體給出了與用對照載體所獲得的那些一樣高的產量。該等數據表明，在載體生產期間，在生產細胞中，轉基因表現的阻遏針對攜帶作為轉基因的HPVAg的Ad35載體的生產是有益的。 針對源自腺病毒血清型26(Ad26)的載體，還調研了阻遏腺病毒載體轉基因表現可能對載體產量具有的影響(圖13B)。在基本上如針對Ad35載體所述進行的測定中，將攜帶CMVTetO啟動子控制的轉基因(該轉基因編碼GFP-Luc、HPVAg、或LSE2E6E7SH)以1500病毒顆粒/細胞用來感染PER.C6和PER.C6/TetR細胞。三天后獲得感染，並且藉由基於Ad26六鄰體序列特異性定量PCR方法確定病毒顆粒效價。該等結果顯示出了對於PER.C6細胞，編碼HPVAg和LSE2E6E7SH的載體的產量比用編碼GFP-Luc的對照載體所獲得的更低。相比之下，對於PER.C6/TetR細胞，這兩種載體顯示出了與對照載體所獲得的一樣高的效價。與以上結果一起(針對Ad35載體)，該等數據表明在腺病毒載體生產期間遏制轉基因表現增加了表現HPVAg和LSE2E6E7SH的載體的產量。 我們已經觀察到了關於腺病毒載體的遺傳穩定性的主要問題，該腺病毒載體攜帶了針對HPVAg的CMV啟動子驅動的轉基因。例如，已經觀察到在PER.C6上該載體的若干傳代後，大部分的載體群由突變載體組成，該突變載體攜帶在HPVAg編碼序列中的大的缺失(數據未顯示)。 我們推斷使用轉基因表現阻遏系統，例如上述兩種之一，可以防止與轉基因有關的遺傳穩定性問題，例如抑制載體生長的HPVAg。為了測試這一項，當在PER.C6或PER.C6/CymR細胞上的載體生長後，針對轉基因盒穩定性評估具有CMVCuO啟動子驅動的HPVAg表現的基於Ad35的載體(圖14)。簡言之，將載體DNA轉染到兩種不同的細胞系中，並且允許得到的病毒噬斑生長在瓊脂糖層下。從兩種轉染中的每個，分離五個病毒噬斑，並且分別在相同細胞系(即，用於轉染)上進一步傳代，持續連續10次病毒傳代。在病毒傳代數10(VPN10)時，藉由轉基因盒的PCR擴增評估轉基因完整性，並且產生的PCR產物的進一步分析係藉由凝膠電泳和桑格測序進行。此外，在VPN7時，針對它們表現HPVAg的能力評估傳代的病毒克隆。這藉由使用傳代的病毒分離株來進行，以1000病毒顆粒/細胞來感染A549細胞，在感染後的48小時裂解該等細胞，並且隨後使用針對HPV16 E7(聖克魯斯生物技術(Santa-Cruz Biotechnology))的單克隆抗體藉由西方印漬術分析HPVAg的表現。凝膠電泳和序列分析的結果顯示了已經在PER.C6上傳代的所有五種病毒分離株每種在轉基因盒內攜帶了小移碼缺失或過早終止突變。相比之下，此類缺失或突變不能在任何已經在表現CymR(PER.C6/CymR)的細胞系上傳代的載體分離株中檢測到。與該等數據相同，所有的PER.C6/CymR繁殖的載體分離株能夠表現HPVAg，然而所有的PER.C6生長的載體完全丟失了這項能力，暗示該等載體的缺陷轉基因盒。總之，我們的數據證實了使用阻遏物系統，舉例來說CymR/CuO系統，在載體增殖期間來阻遏載體轉基因表現係有效的手段來防止嚴重的轉基因盒不穩定性，例如針對攜帶表現HPVAg的轉基因的載體所見到的那種。參考文獻 阿賓克(Abbink)P，萊姆科特(Lemckert)AA，埃瓦爾德(Ewald)BA，林奇(Lynch)DM，丹霍茲(Denholtz)M，史密茨(Smits)S，霍特曼(Holterman)L，達曼(Damen)I，沃格爾(Vogels)R，索納(Thorner)AR，奧布賴恩(O’Brien KL)，卡維爾(Carville)A，曼斯費爾德(Mansfield)KG，古德斯密特(Goudsmit)J，哈文格(Havenga)MJ，巴魯什(Barouch)DH(2007)來自亞組B和D的六種罕見血清型組合腺病毒疫苗載體的比較血清陽性率和免疫原性(Comparative seroprevalence and immunogenicity of six rare serotype recombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups B and D)。病毒學雜誌(J Virol)81: 4654-4663 奧蘇貝爾(Ausubel)FM(1995)分子生物學的短方案：來自分子生物學的實驗指南之方法概要(Short protocols in molecular biology : a compendium of methods from Current protocols in molecular biology)。威利(Wiley)，[奇賈斯特] 柯丁罕(Cottingham)MG，卡羅爾(Carroll)F，莫里斯(Morris)SJ，特納(Turner)AV，沃恩(Vaughan)AM，卡普路(Kapulu)MC，科洛卡(Colloca)S，夏尼(Siani)L，吉伯特(Gilbert)SC，希爾(Hill)AV(2012)在腺病毒載體的轉基因盒中防止自發性基因重排(Preventing spontaneous genetic rearrangements in the transgene cassettes of adenovirus vectors)。生物技術與生物工程(Biotechnol Bioeng)109: 719-728 戴雅娜(Daayana)S，艾克德(Elkord)E，溫特斯(Winters)U，鮑力塔(Pawlita)M，羅登(Roden)R，斯特恩(Stern)PL，基奇納(Kitchener)HC(2010)在患有外陰上皮內瘤樣病變的患者中咪喹莫特和HPV治療性疫苗接種的II期試驗(Phase II trial of imiquimod and HPV therapeutic vaccination in patients with vulval intraepithelial neoplasia)。英國癌症雜誌(Br J Cancer)102: 1129-1136 德容(de Jong)A，凡德伯格(van der Burg)SH，誇本伯格(Kwappenberg)KM，凡德赫爾斯特(van der Hulst)JM，弗蘭肯(Franken)KL，格魯派(Geluk)A，凡梅加登(van Meijgaarden)KE，德瑞胡特(Drijfhout)JW，肯特爾(Kenter)G，韋梅耶(Vermeij)P，梅列夫(Melief)CJ，奧夫倫加(Offringa)R(2002)在健康受試者中頻繁檢測人類乳突病毒16 E2特異性T-輔助細胞免疫(Frequent detection of human papillomavirus 16 E2-specific T-helper immunity in healthy subjects)。癌症研究(Cancer Res)62: 472-479 艾德爾摩(Edholm)D，莫林(Molin)M，巴耶克(Bajak)E，阿庫斯賈維(Akusjarvi)G(2001)針對毒性蛋白表現涉及的腺病毒載體(Adenovirus vector designed for expression of toxic proteins)。病毒學雜誌(J Virol)75: 9579-9584 埃文斯(Evans)RK、拿羅基(Nawrocki)DK、伊索皮(Isopi)LA、威廉姆斯(Williams)DM、凱西米羅(Casimiro)DR、金(Chin)S、陳(Chen)M、朱(Zhu)DM、希弗(Shiver)JW、沃金(Volkin)DB(2004)基於腺病毒載體疫苗的穩定液體配製物的發展(Development of stable liquid formulations for adenovirus-based vaccines)。藥學科學雜誌(J Pharm Sci)93: 2458-2475 法勞科斯(Fallaux)FJ，布特(Bout)A，凡德威爾德(van der Velde)I，凡德沃倫伯格(van den Wollenberg)DJ，海赫(Hehir)KM，基根(Keegan)J，奧格(Auger)C，克拉默(Cramer)SJ，凡奧蒙德(van Ormondt)H，凡德愛博(van der Eb)AJ，瓦萊裡奧(Valerio)D，胡本(Hoeben)RC(1998)新輔助細胞和早期匹配區域1-缺失的腺病毒載體預防產生有複製能力的腺病毒(New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses)。人類基因治療(Hum Gene Ther)9: 1909-1917 Frøkjær S，霍夫高(Hovgaard)L(2000)肽和蛋白的藥學配製物發展(Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins)。泰勒 法蘭西斯(Taylor & Francis)，倫敦 加爾(Gall)JG，利奧諾拉(Lizonova)A，埃蒂雷迪(EttyReddy)D，麥克威(McVey)D，朱伯(Zuber)M，科夫斯迪(Kovesdi)I，奧特曼(Aughtman)B，金(King)CR，布拉夫(Brough)DE(2007)挽救並生產表現抑制轉基因的疫苗和治療性腺病毒載體(Rescue and production of vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressing inhibitory transgenes)。分子生物技術(Mol Biotechnol)35: 263-273 高(Gao)GP，恩達爾(Engdahl)RK，威爾遜(Wilson)JM(2000)用於大量生產沒有出現複製能力的病毒的E1缺失的腺病毒載體的細胞系(A cell line for high-yield production of E1-deleted adenovirus vectors without the emergence of replication-competent virus)。人類基因治療(Hum Gene Ther)11: 213-219 熱納羅(Gennaro)AR(1990)雷明頓藥學大全(Remington’s pharmaceutical sciences)。克出版公司(Mack) 吉伯特(Gilbert)R，吉爾博特(Guilbault)C，加尼翁(Gagnon)D，伯尼爾(Bernier)A，布林熱(Bourget)L，伊拉希(Elahi)SM，卡門(Kamen)A，馬西(Massie)B(2014)在無血清懸浮培養中用於生產E1缺失的腺病毒載體的新補充細胞的建立與評價(Establishment and validation of new complementing cells for production of E1-deleted adenovirus vectors in serum-free suspension culture)。病毒學方法雜誌(J Virol Methods)208: 177-188 哈米德(Hamid)O，卡瓦哈爾(Carvajal)RD(2013)在癌症治療中的抗程序性死亡-1和抗程序性死亡-配位基1抗體(Anti-programmed death-1 and anti-programmed death-ligand 1 antibodies in cancer therapy)。生物治療專家意見(Expert Opin Biol Ther)13: 847-861 哈洛(Harlow)E，拉內(Lane)D(1988)抗體：實驗手冊(Antibodies : a laboratory manual)。冷泉港實驗室，紐約 哈文格(Havenga)M，沃格爾(Vogels)R，祖迪吉斯特(Zuijdgeest)D，拉托塞維克(Radosevic)K，繆勒(Mueller)S，蘇沃特(Sieuwerts)M，韋肖爾德(Weichold)F，達曼(Damen)I，卡斯帕斯(Kaspers)J，萊姆科特(Lemckert)A，凡米倫登克(van Meerendonk)M，凡德魯格(van der Vlugt)R，霍特曼(Holterman)L，霍恩(Hone)D，史凱奇(Skeiky)Y，敏塔喬(Mintardjo)R，吉利森(Gillissen)G，巴魯什(Barouch)D，薩多夫(Sadoff)J，古德斯密特(Goudsmit)J(2006)新穎沒有複製能力的腺病毒B組載體：PER.C6細胞中高載體穩定性和產量(Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells)。普通病毒學雜誌(J Gen Virol)87: 2135-2143 漢肯(Henken)FE，奧斯特惠斯(Oosterhuis)K，奧施拉格(Ohlschlager)P，博世(Bosch)L，霍伊柏格(Hooijberg)E，哈能(Haanen)JB，史丁柏根(Steenbergen)RD(2012)編碼修飾的HPV16 E6和E7的DNA疫苗的臨床前安全評價(Preclinical safety evaluation of DNA vaccines encoding modified HPV16 E6 and E7)。疫苗(Vaccine)30: 4259-4266 希爾德斯海姆(Hildesheim)A，埃雷羅(Herrero)R，瓦肖爾德(Wacholder)S，羅德里格斯(Rodriguez)AC，所羅門(Solomon)D，布拉蒂(Bratti)MC，席勒(Schiller)JT，岡薩雷斯(Gonzalez)P，杜賓(Dubin)G，波拉斯(Porras)C，吉梅內斯(Jimenez)SE，羅伊(Lowy)DR(2007)在患有事先存在的感染的青年女性中人類乳突病毒16/18 L1病毒樣顆粒疫苗的作用：隨機試驗(Effect of human papillomavirus 16/18 L1 viruslike particle vaccine among young women with preexisting infection: a randomized trial)。美國醫學會雜誌(JAMA)298: 743-753 霍根森(Hoganson)DK，馬(Ma)JC，阿薩多(Asato)L，翁(Ong)M，普林茨(Printz)MA，惠格(Huyghe)BG，索斯諾施(Sosnowshi)BA，D安德里亞(D’Andrea)MJ(2002)研發穩定腺病毒載體配製物(Development of a stable adenoviral vector formulation)。生物工藝雜誌(Bioprocess J)1: 43-48 霍夫(Hoof)I，彼得斯(Peters)B，西德尼(Sidney)J，佩德森(Pedersen)LE，塞特(Sette)A，隆德(Lund)O，布斯(Buus)S，尼耳森(Nielsen)M(2009)NetMHCpan，一種超越人類用於MHC類別I結合預測之方法(a method for MHC class I binding prediction beyond humans)。免疫遺傳學(Immunogenetics)61: 1-13 霍維茨(Horwitz)MS(1996)腺病毒(Adenoviruses)。其中：菲爾茨(Fields)BN，奈普(Knipe)DM，貝恩斯(Baines)JD(編輯)病毒學(Virology)。雷文出版社有限公司(Raven Press Ltd)，紐約 肯特爾(Kenter)GG，沃爾特斯(Welters)MJ，瓦倫坦泰因(Valentijn)AR，盧威克(Lowik)MJ，貝蘭德-凡德米爾(Berends-van der Meer)DM，沃魯(Vloon)AP，伊斯薩撒(Essahsah)F，法瑟斯(Fathers)LM，奧夫倫加(Offringa)R，德瑞胡特(Drijfhout)JW，韋弗曼(Wafelman)AR，奧斯滕多普(Oostendorp)J，弗雷倫(Fleuren)GJ，凡德伯格(van der Burg)SH，梅列夫(Melief)CJ(2009)針對外陰上皮內瘤樣病變的抵抗HPV-16癌基因蛋白類的疫苗接種(Vaccination against HPV-16 oncoproteins for vulvar intraepithelial neoplasia)。新英格蘭醫學雜誌(N Engl J Med)361: 1838-1847 凱博(Kibbe)AH(2000)藥用輔料手冊(Handbook of pharmaceutical excipients)。(Pharmaceutical Press)，倫敦 科夫斯迪(Kovesdi)I，赫德利(Hedley)SJ(2010)腺病毒生產細胞(Adenoviral producer cells)。病毒(Viruses)2: 1681-1703 林(Lin)KY，瓜尼埃裡(Guarnieri)FG，士迪佛立-O’卡羅爾(Staveley-O’Carroll)KF，列維茨基(Levitsky)HI，奧古斯特(August)JT，帕多爾(Pardoll)DM，吳(Wu)TC(1996)用新穎的疫苗治療以形成的腫瘤，該疫苗提高腫瘤抗原的主要組織相容性類型II的呈遞(Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen)。癌症研究(Cancer Res)56: 21-26 倫德高(Lundegaard)C，蘭伯思(Lamberth)K，哈恩達爾(Harndahl) M，布斯(Buus)S，隆德(Lund)O，尼耳森(Nielsen)M (2008) NetMHC-3.0：精確網站可以預測人、小鼠和猴子MHC類型I的長度為8-11的肽的親和力(accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11)。核酸研究(Nucleic Acids Res)36: W509-512 馬西斯米(Massimi)P，班克斯(Banks)L(2005)針對HPV癌基因蛋白的轉化測定(Transformation Assays for HPV Oncoproteins)。其中：大衛(Davy)C，道芭(Doorbar)J(編輯)人類乳突病毒：方法和方案(Human Papillomaviruses : Methods and Protocols)。第119卷：分子醫學施普林格中之方法(Methods in Molecular Medicine Springer)，柏林，pp 381-395 馬修斯(Matthews)DA，卡明斯(Cummings)D，伊芙莉(Evelegh)C，格雷厄姆(Graham)FL，普瑞夫斯(Prevec)L(1999)開發和利用表現乳糖阻遏物的293細胞系用於挽救表現高水平狂犬病毒糖蛋白的重組腺病毒(Development and use of a 293 cell line expressing lac repressor for the rescue of recombinant adenoviruses expressing high levels of rabies virus glycoprotein)，普通病毒學雜誌(J Gen Virol)80 (Pt 2): 345-353 麥克弗森(McPherson)MJ，黑姆斯(Hames)BD，泰勒(Taylor)GR (1995)PCR 2：實用方法(PCR 2 : a practical approach)。在牛津大學出版社的IRL出版社，牛津 梅爾曼(Mellman)I，古科斯(Coukos)G，德拉諾夫(Dranoff)G (2011)癌症免疫療法的年齡(Cancer immunotherapy comes of age)。自然(Nature)480: 480-489 穆裡克(Mullick)A，許(Xu)Y，沃倫(Warren)R，考徹曼尼斯(Koutroumanis)M，吉爾博特(Guilbault)C，布魯薩(Broussau)S，馬朗方(Malenfant)F，布林熱(Bourget)L，拉穆勒(Lamoureux)L，洛(Lo)R，卡洛(Caron)AW，碧洛媞(Pilotte)A，馬西(Massie)B(2006)cumate基因開關：在哺乳動物細胞中用於可調型表現的系統(The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells)。BMC生物技術(BMC Biotechnol)6: 43 芒格(Munger)K，費爾普斯(Phelps)WC，巴布(Bubb)V，豪利(Howley)PM，施萊格爾(Schlegel)R(1989)針對原代人類角質形成細胞的轉化人類乳突病毒16型的E6和E7一起是必需的並且是足夠的(The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes)。病毒學雜誌(J Virol)63: 4417-4421 奧貢(Ogun)SA，杜蒙-賽格諾非特(Dumon-Seignovert)L，馬錢德(Marchand)JB，霍爾德(Holder)AA，希爾(Hill)F(2008)C4結合蛋白(C4bp)的低聚反應域作為一種佐劑，並且由與小鼠C4bp域融合的19千道爾頓裂體性孢子表面蛋白1組成的融合蛋白保護小鼠抵抗瘧疾(The oligomerization domain of C4-binding protein (C4bp) acts as an adjuvant, and the fusion protein comprised of the 19-kilodalton merozoite surface protein 1 fused with the murine C4bp domain protects mice against malaria)。感染與免疫(Infect Immun)76: 3817-3823 奧斯特惠斯(Oosterhuis)K，艾麗迪(Aleyd)E，傅裡蘭德(Vrijland)K，舒馬赫(Schumacher)TN，(哈能(Haanen)JB(2012a)用於誘導人類乳突病毒16型E6-和E7-特異性細胞毒性T-細胞應答的DNA疫苗的理性設計(Rational Design of DNA Vaccines for the Induction of Human Papillomavirus Type 16 E6- and E7-Specific Cytotoxic T-Cell Responses)。人類基因治療(Hum Gene Ther)23: 1301-1312 奧斯特惠斯(Oosterhuis)K，奧施拉格(Ohlschlager)P，凡德伯格(van den Berg)JH，托貝斯(Toebes)M，戈麥斯(Gomez)R，舒馬赫(Schumacher)TN，哈能(Haanen)JB(2011)針對HPV 16 E6和E7的高效性和高安全性的DNA疫苗的臨床前發展(Preclinical development of highly effective and safe DNA vaccines directed against HPV 16 E6 and E7)。國際癌症雜誌(Int J Cancer)129: 397-406 奧斯特惠斯(Oosterhuis)K，凡德伯格(van den Berg)JH，舒馬赫(Schumacher)TN，哈能(Haanen)JB(2012b)DNA疫苗和藉由紋身的皮內疫苗接種(DNA vaccines and intradermal vaccination by DNA tattooing)。微生物學和免疫學的當前主題(Curr Top Microbiol Immunol) 351: 221-250 彼得斯(Peters)B，唐(Tong)W，西德尼(Sidney)J，塞特(Sette)A，翁(Weng)Z(2003)檢測針對肽與MHC-I分子結合的獨立結合假設(Examining the independent binding assumption for binding of peptide epitopes to MHC-I molecules)。生物資訊學(Bioinformatics)19: 1765-1772 普拉卡什(Prakash)SS，格羅斯曼(Grossman)SR，比賓斯基(Pepinsky)RB，萊米恩斯(Laimins)LA，安德羅非(Androphy)EJ(1992)在乳突病毒E2反式啟動蛋白中針對接觸新穎基序的DNA和蘊涵新穎基序的二聚作用必須的胺基酸(Amino acids necessary for DNA contact and dimerization imply novel motifs in the papillomavirus E2 trans-activator)。基因與發育(Genes Dev)6: 105-116 魯賓琪珂(Rubinchik)S，丁(Ding)R，邱(Qiu)AJ，張(Zhang)F，董(Dong)J(2000)遞送由tet-誘導表現型系統調節的FasL-GFP融合蛋白的腺病毒載體(Adenoviral vector which delivers FasL-GFP fusion protein regulated by the tet-inducible expression system)。基因治療(Gene Ther)7: 875-885 薩姆布魯克(Sambrook)JFEFMT(1989)分子克隆：實驗手冊(Molecular cloning : a laboratory manual)。冷泉港實驗室，冷泉港，紐約 賽德曼(Sedman)SA，巴爾博薩(Barbosa)MS，瓦什(Vass)WC，哈伯特(Hubbert)NL，哈斯(Haas)JA，羅伊(Lowy)DR，席勒(Schiller) JT(1991)人類乳突病毒16型的全長E6蛋白具有轉化和反式啟動活性並且與E7合作來永生化培養物中的角質形成細胞(The full-length E6 protein of human papillomavirus type 16 has transforming and trans-activating activities and cooperates with E7 to immortalize keratinocytes in culture)。病毒學雜誌(J Virol)65: 4860-4866 申克(Shenk)T(1996)腺病毒及其複製(Adenoviridae and their Replication)。其中：菲爾茨(Fields)BN，奈普(Knipe)DM，貝恩斯(Baines)JD(編輯)病毒學(Virology)。雷文出版社有限公司(Raven Press Ltd)，紐約 斯馬海爾(Smahel)M，西瑪(Sima)P，路得維科瓦(Ludvikova)V，馮卡(Vonka)V(2001)自拍問哦DNA疫苗抵抗包含E7的致癌細胞的修飾HPV16 E7基因(Modified HPV16 E7 Genes as DNA Vaccine against E7-Containing Oncogenic Cells)。病毒學(Virology)281: 231-238 凡德伯格(van der Burg)SH，梅列夫(Melief)CJ(2011)抵抗人類乳突病毒誘導的惡性腫瘤的治療性疫苗接種(Therapeutic vaccination against human papilloma virus induced malignancies)。免疫學目前的觀點(Curr Opin Immunol)23: 252-257 沃森(Watson)JD(1992)重組DNA(Recombinant DNA)。科學美國人書刊(Scientific American Books)，紐約 威金(Wieking)BG，維梅爾(Vermeer)DW，諾斯(Spanos)WC，李(Lee)KM，維梅爾(Vermeer)P，李(Lee)WT，許(Xu)Y，蓋彼茨(Gabitzsch) ES，拜耳凱提斯(Balcaitis)S，巴林特(Balint) JP，Jr.，鐘斯(Jones)FR，李(Lee)JH(2012)一種非致瘤HPV 16 E6/E7疫苗提高表現腫瘤的HPV的治療(A non-oncogenic HPV 16 E6/E7 vaccine enhances treatment of HPV expressing tumors)。癌症基因治療(Cancer Gene Ther)19: 667-674 揚(Yan)J，賴興巴赫(Reichenbach)DK，科比特(Corbitt)N，胡奇(Hokey)DA，拉馬納坦(Ramanathan)MP，麥金尼(McKinney)KA，魏納(Weiner)DB，休厄爾(Sewell)D(2009)隨著編碼E6/E7融合蛋白的新穎HPV-16 DNA疫苗的遞送誘導體內抗腫瘤免疫(Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen)。疫苗(Vaccine)27: 431-440 堯(Yao)F，埃裡克松(Eriksson)E(1999)一種新穎的四環素誘導的病毒複製開關(A novel tetracycline-inducible viral replication switch)。人類基因治療(Hum Gene Ther)10: 419-427 吉田(Yoshida)Y，哈馬達(Hamada)H(1997)藉由四環素控制的具有核定位信號的反式啟動蛋白腺病毒調節的可誘導的基因表現(Adenovirus-mediated inducible gene expression through tetracycline-controllable transactivator with nuclear localization signal)。生物化學與生物物理學集刊(Biochem Biophys Res Commun)230: 426-430 湯川村(Yugawa)T，清野(Kiyono)T(2009)藉由高危人類乳突病毒的子宮頸腫瘤發生的分子機制：E6和E7癌蛋白質的新穎功能(Molecular mechanisms of cervical carcinogenesis by high-risk human papillomaviruses: novel functions of E6 and E7 oncoproteins)。醫學病毒學評論(Rev Med Virol)19: 97-113 茲韋弗令(Zwaveling)S，費詹森雷拉 莫塔(Ferreira Mota)SC，諾塔(Nouta)J，(Johnson)M，利普福德(Lipford)GB，奧夫倫加(Offringa)R，凡德伯格(van der Burg)SH，梅列夫(Melief CJ(2002)隨著長肽的疫苗接種有效消除了已形成的人類乳突病毒16型表現的腫瘤(Established human papillomavirus type 16-expressing tumors are effectively eradicated following vaccination with long peptides)。免疫學雜誌(J Immunol)169: 350-358表 I. 序列SEQ ID NO: 1(HPV16-E6E7SH ，HPV16 E6/E7 設計多肽之胺基酸序列) MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKPGT TLEQQYNKPL CDLLIRCINC QKPLCPEEKQ RHLDKKQRFH NIRGRWTGRC MSCCRSSRTR RETQMHGDTP TLHEYMLDLQ PETTDLYCYE QLNDSSEEED EIDGPAGQAE PDRAHYNIVT FCCQLCTELQ TTIHDIILEC VYCKQQLLRR EVYDFAFRDL CIVYRDGNPY AVCDKCLKFY SKISEYRHYC YSLYGTTLEQ QYNKPLCDLL IRCINCQKSEQ ID NO: 2(HPV16-E6E7SH ，編碼HPV16 E6/E7 設計多肽的胺基酸序列之核苷酸序列) ATGCACCAGA AACGGACCGC CATGTTCCAG GACCCCCAGG AACGGCCCAG AAAGCTGCCC CAGCTGTGCA CCGAGCTGCA GACCACCATC CACGACATCA TCCTGGAATG CGTGTACTGC AAGCAGCAGC TGGAAGATGA GATCGACGGC CCTGCTGGCC AGGCCGAACC CGACAGAGCC CACTACAATA TCGTGACCTT CTGCTGCAAG TGCGACAGCA CCCTGCGGCT GTGCGTGCAG AGCACCCACG TGGACATCCG GACCCTGGAA GATCTGCTGA TGGGCACCCT GGGCATCGTG TGCCCCATCT GCAGCCAGAA GCCCGGCACC ACCCTGGAAC AGCAGTACAA CAAGCCCCTG TGCGACCTGC TGATCCGGTG CATCAACTGC CAGAAACCCC TGTGCCCCGA GGAAAAGCAG CGGCACCTGG ACAAGAAGCA GCGGTTCCAC AACATCCGGG GCAGATGGAC AGGCAGATGC ATGAGCTGCT GCAGAAGCAG CCGGACCAGA CGGGAAACCC AGATGCACGG CGACACCCCC ACCCTGCACG AGTACATGCT GGACCTGCAG CCCGAGACAA CCGACCTGTA CTGCTACGAG CAGCTGAACG ACAGCAGCGA GGAAGAGGAC GAGATTGACG GACCCGCTGG ACAGGCCGAG CCTGACCGGG CTCACTATAA CATCGTGACA TTTTGCTGTC AGCTCTGTAC TGAACTCCAG ACAACAATTC ACGATATTAT TCTCGAATGT GTGTATTGTA AACAGCAGCT CCTGCGGAGA GAGGTGTACG ACTTCGCCTT CCGGGACCTC TGCATCGTGT ATCGGGACGG CAACCCCTAC GCCGTGTGCG ACAAGTGCCT GAAGTTCTAC AGCAAGATCA GCGAGTACCG GCACTACTGC TACAGCCTGT ACGGAACAAC ACTCGAACAG CAGTATAACA AACCACTCTG TGATCTGCTG ATTCGCTGTA TCAATTGTCA GAAGTGATAASEQ ID NO: 3(HPV16 E2E6E7SH ， HPV16 E2/E6/E7 設計多肽之胺基酸序列 ) METLCQRLNVCQDKILTHYENDSTDLRDHIDYWKHMRLECAIYYKAREMGFKHINHQVVPTLAVSKNKALQAIELQLTLETIYNSQYSNEKWTLQDVSLEVYLTAPTGCIKKHGYTVEVQFDGDICNTMHYTNWTHIYICEEASVTVVEGQVDYYGLYYVHEGIRTYFVQFKDDAEKYSKNKVWEVHAGGQVILCPTSVFSSNEVSSPEIIRQHLANHPAATHTKAVALGTEETQTTIQRPRSEPDTGNPCHTTKLLHRDSVDSAPILTAFNSSHKGRINCNSNTTPIVHLKVDANTLMRLRYRFKKHCTLYTAVSSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQFLSQVKIPKTITVSTGFMSIMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKSEQ ID NO: 4(HPV16 E2E6E7SH ，編碼 HPV16 E2/E6/E7 設計多肽之核苷酸序列 ) ATGGAAACCCTGTGCCAGCGGCTGAACGTGTGCCAGGACAAGATCCTGACCCACTACGAGAACGACAGCACCGACCTGCGGGACCACATCGACTACTGGAAGCACATGCGGCTGGAATGCGCCATCTACTACAAGGCCAGAGAGATGGGCTTCAAGCACATCAACCACCAGGTGGTGCCCACCCTGGCCGTGTCCAAGAACAAGGCCCTGCAGGCCATCGAGCTGCAGCTGACCCTGGAAACCATCTACAACAGCCAGTACAGCAACGAGAAGTGGACCCTGCAGGACGTGTCCCTGGAAGTGTACCTGACCGCTCCCACCGGCTGCATCAAGAAACACGGCTACACCGTGGAAGTGCAGTTCGACGGCGACATCTGCAACACCATGCACTACACCAACTGGACCCACATCTACATCTGCGAAGAGGCCAGCGTGACCGTGGTGGAAGGCCAGGTGGACTACTACGGCCTGTACTACGTGCACGAGGGCATCCGGACCTACTTCGTGCAGTTCAAGGACGACGCCGAGAAGTACAGCAAGAACAAAGTGTGGGAGGTGCACGCTGGCGGCCAGGTCATCCTGTGCCCCACCAGCGTGTTCAGCAGCAACGAGGTGTCCAGCCCCGAGATCATCCGGCAGCACCTGGCCAATCACCCTGCCGCCACCCACACAAAGGCCGTGGCCCTGGGCACCGAGGAAACCCAGACCACCATCCAGCGGCCCAGAAGCGAGCCCGACACCGGCAATCCCTGCCACACCACCAAGCTGCTGCACCGGGACAGCGTGGACAGCGCCCCTATCCTGACCGCCTTCAACAGCAGCCACAAGGGCCGGATCAACTGCAACAGCAACACCACCCCCATCGTGCACCTGAAGGTGGACGCCAACACCCTGATGCGGCTGCGGTACAGATTCAAGAAGCACTGCACCCTGTACACCGCCGTGTCCTCCACCTGGCACTGGACCGGCCACAACGTGAAGCACAAGAGCGCCATCGTGACCCTGACCTACGACAGCGAGTGGCAGCGGGACCAGTTCCTGAGCCAGGTCAAAATCCCCAAGACCATCACCGTGTCCACCGGCTTCATGAGCATCATGCACCAGAAACGGACCGCCATGTTCCAGGACCCCCAGGAACGGCCCAGAAAGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTGGAAGATGAGATCGACGGCCCTGCTGGCCAGGCCGAACCCGACAGAGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCCGGACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCTGCAGCCAGAAGCCCGGCACCACCCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCCGGTGCATCAACTGCCAGAAACCCCTGTGCCCCGAGGAAAAGCAGCGGCACCTGGACAAGAAGCAGCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGATGGACAGGCAGATGCATGAGCTGCTGCAGAAGCAGCCGGACCAGACGGGAAACCCAGATGCACGGCGACACCCCCACCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCCGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATTGACGGACCCGCTGGACAGGCCGAGCCTGACCGGGCTCACTATAACATCGTGACATTTTGCTGTCAGCTCTGTACTGAACTCCAGACAACAATTCACGATATTATTCTCGAATGTGTGTATTGTAAACAGCAGCTCCTGCGGAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGACCTCTGCATCGTGTATCGGGACGGCAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGAGTACCGGCACTACTGCTACAGCCTGTACGGAACAACACTCGAACAGCAGTATAACAAACCACTCTGTGATCTGCTGATTCGCTGTATCAATTGTCAGAAGTGATAASEQ ID NO: 5(HPV16 E6E7E2SH ，編碼 HPV16 E6/E7/E2 設計多肽之胺基酸序列 ) MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKMETLCQRLNVCQDKILTHYENDSTDLRDHIDYWKHMRLECAIYYKAREMGFKHINHQVVPTLAVSKNKALQAIELQLTLETIYNSQYSNEKWTLQDVSLEVYLTAPTGCIKKHGYTVEVQFDGDICNTMHYTNWTHIYICEEASVTVVEGQVDYYGLYYVHEGIRTYFVQFKDDAEKYSKNKVWEVHAGGQVILCPTSVFSSNEVSSPEIIRQHLANHPAATHTKAVALGTEETQTTIQRPRSEPDTGNPCHTTKLLHRDSVDSAPILTAFNSSHKGRINCNSNTTPIVHLKVDANTLMRLRYRFKKHCTLYTAVSSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQFLSQVKIPKTITVSTGFMSISEQ ID NO: 6(HPV16 E6E7E2SH ，編碼 HPV16 E6/E7/E2 設計多肽之核苷酸序列 ) ATGCACCAGAAACGGACCGCCATGTTCCAGGACCCCCAGGAACGGCCCAGAAAGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTGGAAGATGAGATCGACGGCCCTGCTGGCCAGGCCGAACCCGACAGAGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCCGGACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCTGCAGCCAGAAGCCCGGCACCACCCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCCGGTGCATCAACTGCCAGAAACCCCTGTGCCCCGAGGAAAAGCAGCGGCACCTGGACAAGAAGCAGCGGTTCCACAACATCCGGGGCAGATGGACAGGCAGATGCATGAGCTGCTGCAGAAGCAGCCGGACCAGACGGGAAACCCAGATGCACGGCGACACCCCCACCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCCGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATTGACGGACCCGCTGGACAGGCCGAGCCTGACCGGGCTCACTATAACATCGTGACATTTTGCTGTCAGCTCTGTACTGAACTCCAGACAACAATTCACGATATTATTCTCGAATGTGTGTATTGTAAACAGCAGCTCCTGCGGAGAGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGGGACCTCTGCATCGTGTATCGGGACGGCAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGAGTACCGGCACTACTGCTACAGCCTGTACGGAACAACACTCGAACAGCAGTATAACAAACCACTCTGTGATCTGCTGATTCGCTGTATCAATTGTCAGAAGATGGAAACCCTGTGCCAGCGGCTGAACGTGTGCCAGGACAAGATCCTGACCCACTACGAGAACGACAGCACCGACCTGCGGGACCACATCGACTACTGGAAGCACATGCGGCTGGAATGCGCCATCTACTACAAGGCCAGAGAGATGGGCTTCAAGCACATCAACCACCAGGTGGTGCCCACCCTGGCCGTGTCCAAGAACAAGGCCCTGCAGGCCATCGAGCTGCAGCTGACCCTGGAAACCATCTACAACAGCCAGTACAGCAACGAGAAGTGGACCCTGCAGGACGTGTCCCTGGAAGTGTACCTGACCGCTCCCACCGGCTGCATCAAGAAACACGGCTACACCGTGGAAGTGCAGTTCGACGGCGACATCTGCAACACCATGCACTACACCAACTGGACCCACATCTACATCTGCGAAGAGGCCAGCGTGACCGTGGTGGAAGGCCAGGTGGACTACTACGGCCTGTACTACGTGCACGAGGGCATCCGGACCTACTTCGTGCAGTTCAAGGACGACGCCGAGAAGTACAGCAAGAACAAAGTGTGGGAGGTGCACGCTGGCGGCCAGGTCATCCTGTGCCCCACCAGCGTGTTCAGCAGCAACGAGGTGTCCAGCCCCGAGATCATCCGGCAGCACCTGGCCAATCACCCTGCCGCCACCCACACAAAGGCCGTGGCCCTGGGCACCGAGGAAACCCAGACCACCATCCAGCGGCCCAGAAGCGAGCCCGACACCGGCAATCCCTGCCACACCACCAAGCTGCTGCACCGGGACAGCGTGGACAGCGCCCCTATCCTGACCGCCTTCAACAGCAGCCACAAGGGCCGGATCAACTGCAACAGCAACACCACCCCCATCGTGCACCTGAAGGTGGACGCCAACACCCTGATGCGGCTGCGGTACAGATTCAAGAAGCACTGCACCCTGTACACCGCCGTGTCCTCCACCTGGCACTGGACCGGCCACAACGTGAAGCACAAGAGCGCCATCGTGACCCTGACCTACGACAGCGAGTGGCAGCGGGACCAGTTCCTGAGCCAGGTCAAAATCCCCAAGACCATCACCGTGTCCACCGGCTTCATGAGCATCTGATAASEQ ID NO: 7(IgE 前導肽胺基酸序列 ) MDWTWILFLVAAATRVHSSEQ ID NO: 8( 編碼 IgE 前導肽的核苷酸序列 ) ATGGACTGGACCTGGATCCTGTTCCTGGTGGCTGCCGCAACCCGGGTGCACAGCSEQ ID NO: 9(aa HAVT20 前導肽胺基酸序列 ) MACPGFLWALVISTCLEFSMASEQ ID NO: 10( 編碼 HAVT20 前導肽之核苷酸序列 ) ATGGCCTGCCCCGGCTTTCTGTGGGCCCTGGTCATCAGCACCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCSEQ ID NO: 11( 包含 2xTetO 的序列 ) GAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACSEQ ID NO: 12( 包含CuO 的序列) AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTA SEQ ID NO: 13( 存在於pAdApt26 和pAdApt35 質粒中的CMV 啟動子) TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGA SEQ ID NO: 14(TetR ，編碼由pcDNATM 6/TR 表現的TetR 多肽的胺基酸序列之核苷酸序列) ATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCCGCGTACAGCGGATCCCGGGAATTCAGATCTTATTAA SEQ ID NO: 15(TetR ，由pcDNATM 6/TR 表現的TetR 多肽之胺基酸序列) MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGSAYSGSREFRSY SEQ ID NO: 16(CymR ，編碼CymR 多肽的胺基酸序列之核苷酸序列) ATGTCTCCCAAACGACGGACTCAAGCGGAAAGGGCAATGGAAACTCAGGGTAAGCTGATTGCCGCGGCTCTGGGAGTGCTGCGAGAGAAAGGGTATGCCGGGTTTCGCATAGCCGACGTTCCTGGAGCTGCAGGCGTAAGCAGAGGAGCCCAATCTCATCACTTTCCGACCAAGCTGGAGCTTTTGCTGGCTACCTTCGAATGGCTGTACGAGCAGATCACGGAAAGGAGTCGTGCTAGGCTGGCCAAGCTGAAACCCGAGGATGATGTCATTCAGCAGATGCTGGACGATGCAGCCGAGTTCTTCCTGGACGACGACTTCAGCATCAGTCTCGACCTCATCGTAGCCGCAGATCGCGATCCAGCTTTGCGCGAGGGCATACAGAGAACAGTCGAGCGGAATCGGTTTGTGGTGGAGGACATGTGGCTTGGTGTTCTGGTGAGCAGAGGCCTCTCACGGGATGATGCCGAGGACATCCTGTGGCTGATCTTTAACTCCGTCAGAGGGTTGGCAGTGAGGTCCCTTTGGCAGAAGGACAAAGAACGGTTTGAACGTGTGCGAAACTCAACACTCGAGATTGCTAGGGAACGCTACGCCAAGTTCAAGAGATGA SEQ ID NO: 17(CymR ，CymR 多肽之胺基酸序列) MSPKRRTQAERAMETQGKLIAAALGVLREKGYAGFRIADVPGAAGVSRGAQSHHFPTKLELLLATFEWLYEQITERSRARLAKLKPEDDVIQQMLDDAAEFFLDDDFSISLDLIVAADRDPALREGIQRTVERNRFVVEDMWLGVLVSRGLSRDDAEDILWLIFNSVRGLAVRSLWQKDKERFERVRNSTLEIARERYAKFKRSEQ ID NO: 18(HPV16 E6 ，aa41-65) KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNSEQ ID NO: 19(HPV16 E7 aa 43-77) GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR
圖 1. HPV16 E6 和 E7 的融合蛋白的表現。 將HEK-293T細胞用DNA載體進行暫態轉染，該DNA載體表現圖之上所指示的轉基因。在轉染後24 hr，收穫細胞並且藉由SDS-PAGE和西方印漬術用HPV16 E7的抗體(上圖)分析細胞抽提物。顯示了NF-kB的負載對照(下圖)確認了所有泳道中細胞裂解物的相似的負載。分子量標記在左側表明。融合蛋白的預期大小：E6E7SH約38 kDa；E2E6E7SH和E6E7E2SH約75 kDa，LSE2E6E7SH約78 kDa。圖 2. 軟瓊脂中的菌落形成。 A) 軟瓊脂測定設置的示意圖。B) 在接種後六週的瓊脂中以細胞40x放大率的代表性顯微圖像。白色箭頭強調在E7wt轉染細胞中所觀察到的菌落。C) 接種後六週，在瓊脂中使用GelcountTM 和相關的軟體的菌落量化。*：P ＜ 0.05(泊松回歸模型)；**：非劣性(具有非劣性界限為5%的廣義線性模型)。圖 3. E6E7SH 已經失去了 E6 和 E7 活性。 A) 代表性蛋白質印跡證實了缺乏E6E7SH對p53的降解。將人類p53失效NCI-H1299細胞用表現p53的質粒連同表現HPV16 E6野生型、E6E7SH的質粒或空載體進行共轉染。非-TF表示非轉染細胞。在轉染後24小時，製備細胞裂解物，並且將30 µg的總蛋白裝載到凝膠上。上圖-p53染色，中圖-E6染色，下圖-NF-kB染色(裝載對照)。(B) 在四種獨立的測定中p53水平的量化。將該p53信號標準化至NF-κB信號。C) 蛋白質印跡證實了E6E7SH對pRb的降解的缺乏，將pRb失效Saos-2細胞用表現pRb的質粒連同表現HPV16 E7野生型、E6E7SH的質粒或空載體進行轉染。非-TF表示非轉染細胞。在轉染後24小時，製備細胞裂解物，並且將10 µg的總蛋白裝載到凝膠上。上圖-pRb染色，中圖-E7染色，下圖-NF-κB染色(裝載對照)。D) 在四種獨立的測定中pRb水平的量化。將該pRb信號標準化至NF-κB信號。*：p ＜ 0.05(ANOVA模型)；**：非劣性(試驗係基於源自ANOVA模型的95% CI’s。非劣效性界限被設為75%)。圖 4. E6E7SH 不永生化原代人類表皮角質形成細胞。 將原代人類表皮角質形成細胞用編碼HPV16(E6E7wt)的野生型E6-和E7-編碼開放閱讀框、E6E7SH序列或eGFP的慢病毒進行轉導。非轉導供體細胞被用作對照。如藉由約200天的延長壽命和的hTERT啟動(未顯示)所示的，僅有E6E7wt的表現誘導原代角質形成細胞的永生化。十字架標誌表示細胞在衰老過程中死亡並且不能進一步培養。關於詳情，參見實例2。在兩個另外的供體中獲得相似的結果(未顯示)。圖 5. 在 DNA 免疫之後由 E6E7SH 誘導的免疫應答 -IFNγ ELISPOT 分析 A.免疫接種方案。將CB6F1小鼠用表現E6E7SH的DNA質粒或表現非轉基因的質粒(對照)進行免疫。免疫接種後兩週，處死該小鼠並且用對應於E7的15mer 肽池刺激分離的脾細胞過夜。B.給出了以點形成單位(SFU)/106 脾細胞的如藉由IFNγ ELISPOT測定所測量的個體小鼠中E7-特異性免疫應答。圖 6. E6E7SH 的免疫原性 -IFNγ ELISPOT 分析 (A).免疫接種方案。將小鼠用具有如所示的插入片段的腺病毒載體進行免疫。藉由IFNγ ELISPOT分析處於兩週 (B) 和處於八週 (C) 的E7-特異性應答(表示為點形成單位(SFU)/106 脾細胞)。閉環代表用1*1010 vp的劑量進行免疫的小鼠，並且開環代表用5*109 vp進行免疫的小鼠。黑條代表應答的幾何均數。點狀線表示在ELISPOT測定中的檢測下限。ANOVA事後邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)統計分析係在對數轉換數據上進行的。*：p ＜ 0.05。關於詳情，參見實例3。圖 7. E2E6E7SH 的免疫原性 -E7- 四聚體染色。 (A).免疫接種方案。將CB6F1小鼠用1*1010 vp的表現如所表示的轉基因的腺病毒載體進行免疫。免疫接種後兩週，處死該小鼠並且針對能夠與E749-57 -H2-Db四聚體 (B) 相互作用的CD8+ 細胞的存在分析分離的脾細胞。E7-四聚體陽性的CD8+ T-細胞的百分比表示在y軸上。ANOVA事後邦弗朗尼分析係在對數轉換數據上進行的，在不同的E6E7SH變體之間的差異無統計學意義。圖 8. E2E6E7SH 的免疫原性 -IFNγ ELISPOT 分析 (A).免疫接種方案。將CB6F1小鼠用表現圖B和C下方所表示的轉基因的腺病毒載體進行免疫。免疫接種後兩週，處死該小鼠並且用對應於E2 (B)、E6(未顯示)或E7 (C)的15 mer肽池刺激分離的脾細胞過夜。以SFU/106 脾細胞給出應答。ANOVA事後邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)統計分析係在對數轉換數據上進行的。由僅編碼E2的腺病毒載體所誘導的E2應答高於包括E6和E7片段的本發明多肽所誘導的應答。差異對E2與E2E6E7SH和E2與E6E7E2SH係顯著的(*：p ＜ 0.05)。ANOVA事後邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)統計分析係在對數轉換數據上進行的。圖 9. 在免疫的小鼠中的持續應答。 (A) 免疫接種方案。將CB6F1小鼠用1*1010 vp的表現變體LSE2E6E7SH、E2E6E7SH、E6E7SH的Ad35載體、或用不表現轉基因的腺病毒載體(空白)進行免疫。每兩週取血液樣品以利用四聚體染色確定E7-特異性的CD8+ T-細胞的百分比。(B) 免疫接種後兩週的免疫應答。包括前導序列的載體誘導了比沒有前導序列的載體更高的應答；LSE2E6E7SH與E2E6E7SH(*：p ＜ 0.05)。(C) 應答的動力學。ANOVA事後邦弗朗尼(Post-hoc Bonferroni)統計分析係在第2週數據集的對數轉換數據上進行的。儘管該等結果無統計學意義，但相比於沒有E2的分子，由包括E2的分子誘導的E7應答傾向於更高。圖 10. 使用不同的腺病毒載體加強免疫應答。 (A).免疫接種方案。將CB6F1小鼠用表現HPV16 E2E6E7SH(HPV16-Tx)的Ad26載體或用不表現轉基因的Ad26載體(空白)進行免疫。兩週後，用如圖的下方所表示的基於Ad35的載體重複該免疫接種。在第二次免疫接種後四週，處死小鼠並且用血液樣品利用四聚體染色 (B) 來確定E7-特異性CD8+ T-細胞的百分比。* 表示Ad26.HPV16-Tx/Ad35.HPV16-Tx與Ad26.HPV16-Tx/Ad35.空白的比較，p ＜ 0.05(在對數轉換數據上的學生t-檢驗，針對多重比較，α = 0.01)。圖 11. 在恆河獼猴中的 E2E6E7SH 的細胞免疫原性。 (A) 免疫接種方案。在第0天將恆河獼猴進行免疫。藉由肌肉注射免疫接種(i.m)八隻動物獲得了Ad26.HPV16-E2E6E7SH並且兩隻對照動物獲得了Ad26.空白。在8週時給予加強免疫接種(Ad26.HPV16-E2E6E7SH或Ad26.空白)。在16週，動物接受了具有表現相同E2E6E7SH的Ad35載體的第二次加強免疫接種，同時對照動物接受了Ad35.空白。腺病毒載體的劑量為1*1011 vp/免疫接種。在若干時間點進行抽血。(B) 藉由IFNγ ELISPOT測量PBMC中的細胞免疫應答。用對應於HPV16 E2、E6或E7的肽池刺激PBMC，並且描繪在1*106 PBMC中點形成單位(SFU)的數量。空白對照動物(n = 2)顯示了沒有可檢測到的應答。關於詳情，參見實例4。圖 12. 表現 HPV16-E2E6E7SH 的腺病毒載體的治療效果。 (A) TC-1注射和免疫接種方案。在第0天用1*105 TC-1細胞經皮下注射CB6F1小鼠。在六天后，當腫瘤明顯時，以在200 µl 0.9%鹽水(該鹽水補充以5 nmol ODN1826-CpG (B)或Ad26.HPV16-E2E6E7SH (C))的最終體積中的150 µg，將小鼠用覆蓋HPV16 E6和E7免疫顯性表位(即，HPV16 E6，aa41-65 (KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN；SEQ ID NO: 18)和HPV16 E7 aa 43-77(GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR；SEQ ID NO: 19))的兩個SLP進行免疫。對照小鼠接收單獨的CpG (D)或Ad26.空白 (E)。在第20天，所有的小鼠接收了加強免疫接種。將在初次免疫接種中接收Ad26載體的小鼠隨後用對應的Ad35載體進行免疫。如在初次免疫接種中一樣，其他小鼠接收以單獨的CpG或CpG為佐劑的SLP。(B-E) 在注射了TC-1的小鼠中的腫瘤測量。腫瘤體積計算為(寬度2 * 長度)/2。當腫瘤體積超過1000 mm3 時，處死小鼠。由於大於20%的重量損失，必須處死小鼠(用星號表示)。(F-G) 針對頭35天的圖B和C的特寫。(H) 在TC-1注射後的生存期。相比於用SLP和CpG進行免疫的小鼠，用Ad.HPV16-E2E6E7SH治療的小鼠的生存期顯著增加(對數秩檢驗p ＜ 0.05)。在試驗結束時(在第92天)，三隻用Ad.HPV16-E2E6E7SH進行免疫的小鼠係無腫瘤的。圖 13. 攜帶編碼 HPV Ag 或 LSE2E6E7SH 的轉基因的腺病毒載體顯示了關於在能夠阻遏轉基因表現的細胞的增加的病毒產量。 A) 針對Ad35載體的病毒產量測定。用攜帶編碼GFP-Luc或HPVAg的轉基因的Ad35載體感染PER.C6、PER.C6/CymR、和PER.C6/TetR細胞。用包含CuO或TetO的CMV啟動子驅動該等轉基因。在感染後四天藉由基於Ad35六鄰體特異性qPCR之方法確定病毒產量。B) 針對Ad26載體的病毒產量測定。用攜帶編碼GFP-Luc、HPVAg、或LSE2E6E7SH的轉基因的Ad26載體感染PER.C6和PER.C6/TetR細胞，所有該等轉基因都藉由包含TetO的CMV啟動子進行驅動。在感染後三天藉由基於Ad26六鄰體特異性qPCR之方法確定病毒產量。關於詳情，參見實例6。圖 14. 在載體生產過程中，使用阻遏轉基因表現的阻遏物系統防止攜帶編碼 HPVAg 的轉基因的腺病毒載體中轉基因盒的不穩定。 藉由對PER.C6或PER.C6/CymR細胞系的DNA轉染，拯救在CMVCuO的控制下的表現HPVAg的Ad35載體。挑選所得的病毒噬斑-每細胞系五個-並且用於對各細胞系的連續感染循環。A) 在10次病毒傳代後藉由PCR分析載體轉基因盒區域的整合。將從PER.C6和PER.C6/CymR傳代的病毒分離株獲得的PCR產物分別示於中圖和右圖中。藉由桑格(Sanger DNA)DNA測序分析針對PER.C6傳代的病毒分離株1、2、4、和5所獲得的看似全長的PCR產物，以及針對PER.C6/CymR傳代的分離株1至5所見到的那些。色譜圖跡線(未顯示)的分析揭示了在PER.C6上生長的所有的分離株，而不是在PER.C6/CymR上生長的那些，包含在HPVAg的編碼序列內的移碼小缺失或過早終止突變。B) 在七次病毒傳代後分析載體表現HPVAg的能力。用生長在PER.C6和PER.C6/CymR上的病毒分離株轉導A549細胞，並且藉由西方印漬術使用HPV16 E7-特異性抗體分析HPVAg表現。針對HPVAg的預測大小為83 kDa。關於詳情，參見實例6。發明詳細說明 本發明提供了編碼多肽的核酸分子，該多肽包括SEQ ID NO: 1。該多肽係融合多肽，並且有時在此稱為本發明的多肽，或本發明之融合多肽。使用該多肽產生對HPV16的E6和E7蛋白的免疫應答，並且因此該核酸分子可以被用作預防持續性HPV16感染、以及其相關疾病的治療性疫苗。 本發明的多肽係精心設計的分子，該分子事實上包含以片段形式的HPV16的完整的E6和E7胺基酸序列(它只缺少一個來自天然HPV16 E6蛋白C-端的胺基酸)，該片段係重新排序的並且部分重疊的，這樣使得(實質上)HPV16 E6和E7蛋白的所有的T-細胞表位出現。已經由其他人描述了具有一些作為HPV疫苗的潛能的早期分子(例如，肯特爾(Kenter)等人2009，新英格蘭醫學雜誌(N Engl J Med )361: 1838-47；戴雅娜(Daayana)等人，2010，英國癌症雜誌(Br J Cancer)102: 1129-36；斯馬海爾(Smahel)等人，2001，病毒學(Virology )281: 231-38；揚(Yan)等人，2009，(Vaccine )27: 431-40；Öhlschläger等人，2006，疫苗(Vaccine )24: 2880-93；奧斯特惠斯(Oosterhuis)等人，2011，國際癌症雜誌(Int J Cancer )129: 397-406；EP 1183368，WO 2013/083287)，但是該等分子中的每個具有一個或多個缺點。在至少一個並且典型的是若干方面中，相對於早期描述之方法，本發明由設計師專門設計的多肽分子係有利的。具體而言，本發明的分子和/或載體的優點包括：(i) 它們具有所希望的安全譜，因為該核酸具有大幅降低的(與天然E6和E7蛋白質相比)直到不能檢測到的轉化活性；(ii) 它們係單一核酸分子，該單核酸分子容易在工業規模上以經濟上可行的手段進行生產，並且不像多分子方法，不會造成邏輯上的挑戰；(iii) 該編碼多肽基本上包括天然HPV16 E6和E7蛋白的所有T-細胞表位；(iv) 編碼多肽的設計已經最小化所不希望的潛在強大的新表位的引入(即，即不存在於天然E6和E7蛋白的表位)；和 (v) 在某些實施方式中，它們不依賴於高度反應性的佐劑以提升所希望的免疫應答。因此，藉由將各種有利特點結合在單一設計中，本發明的分子代表了一大步邁進，並且是主要針對抵抗HPV16的治療性疫苗的優秀的候選對象。該等分子還可能作為抵抗HPV16的預防性疫苗，意指它們可能預防已接種疫苗的受試者的HPV16持續感染。 在某些實施方式中，藉由精心設計，將針對20種最常見的HLA-A等位基因、20種最常見的HLA-B等位基因和20種最常見的HLA-C等位基因具有 ＜ 50 nM的預計結合親和力的具有九個胺基酸長度的新表位的數量最小化至僅一個。這係超越其他人所描述的構建體的顯著改進，該改進針對單次改組的E6蛋白已經包含了超過30個此類新表位，並且改進的構建體將高度可能在序列中包括甚至更多的新表位，該等序列附加至該等構建體以防止表位的丟失(Öhlschläger等人，2006，疫苗(Vaccine)24: 2880-93)。因此，相比於其他人描述之方法，由於相比於天然E6和E7，改變的免疫應答的偶然性已經在本發明的分子中最小化，因此本發明之構建體具有顯著改進的免疫學譜。 熟習該項技術者可以使用常規的技術進行核苷酸取代，該等取代不影響多核苷酸編碼的多肽序列，該等多核苷酸被描述以反映有待表現該等多肽的任何具體的宿主生物體的密碼子使用。因此，除非另外說明，否則“編碼胺基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈簡並型式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質和RNA的核苷酸序列可以包含內含子。 在較佳的實施方式中，對編碼根據本發明的多肽的核酸進行密碼子優化，以在哺乳動物細胞、較佳的是人類細胞中表現。密碼子優化之方法已知並且已經在先前描述(例如WO 96/09378)。如與野生型序列相比，如果至少一個非較佳的密碼子被更佳的密碼子置換，那麼認為序列係密碼子優化的。在此，非較佳的密碼子係在生物體中不如另一個編碼相同胺基酸的密碼子經常地使用的密碼子，並且更佳的密碼子係在生物體中比非較佳的密碼子更經常地使用的密碼子。對於特定生物體的密碼子使用的頻率可見於密碼子頻率表中，比http://www.kazusa.or.jp/codon如中。較佳的是超過一個非較佳的密碼子，例如，超過10%、40%、60%、80%的非較佳的密碼子，較佳的是最多的(例如，至少90%)或所有非較佳的密碼子，由更佳的密碼子替代。較佳的是，在生物體中最經常使用的密碼子用於密碼子優化序列。被較佳的密碼子置換一般引起更高表現。 核酸序列可以使用常規的分子生物學技術克隆，或藉由DNA合成重新產生，這可以藉由在DNA合成和/或分子克隆領域具有業務的服務公司(例如基因藝術公司(GeneArt)、基斯奎思公司(GenScripts)、英傑公司(Invitrogen)、歐陸公司(Eurofins))使用常規程序執行。 熟習該項技術者將理解，可以改變蛋白質，例如，藉由胺基酸取代、缺失、添加、等等，例如使用常規的分子生物學程序。一般來說，可以在多肽的功能性或免疫原性沒有損耗地應用保守性胺基酸取代。這可以根據熟習該項技術者所熟知常規程序進行檢測。 在某些實施方式中，根據本發明的編碼的多肽進一步包括前導序列，又稱為訊息序列或訊息肽。它係存在於大部分註定去往分泌通路的新合成的蛋白質的N-末端的短(典型地5-30個胺基酸長)肽。此種序列的存在可以導致表現和免疫原性的增加。可以使用的非限制性實例係IgE前導肽(參見，例如，US 6,733,994；例如具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO: 7))或HAVT20前導肽(例如，具有序列MACPGFLWALVISTCLEFSMA(SEQ ID NO: 9))。可以將該等中的一個可隨意地添加至本發明多肽的N-端。在其他實施方式中，根據本發明的多肽不包括前導序列。 存在不同類型的HPV(已經識別了超過120種類型並且以編號進行指代)，並且儘管針對某些抗原可能存在一些交叉反應性，但是一般針對每種需要被疫苗覆蓋的類型，類型特異性抗原可能需要被摻入疫苗中。類型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、和82係致癌“高危”的性傳播HPV，並且可以導致發展為如下各項：子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)、外陰上皮內瘤樣病變(VIN)、陰道上皮內瘤樣病變(VaIN)、陰莖上皮內瘤病變(PIN)和/或肛門上皮內瘤樣病變(AIN)。根據本發明的HPV(即，編碼的多肽中的E6和E7片段所源自的HPV)係HPV16。它可以被用於感染有HPV16的患者。在某些實施方式中，它還可以適合與抵抗其他HPV類型的疫苗結合。在某些實施方式中，該結合係與如上鑒定的抵抗高危類型的HPV的疫苗結合，例如與抵抗HPV18的疫苗結合。在其他實施方式中，本發明的疫苗與抵抗HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73、或HPV-82中的一種或多種的疫苗結合。例如，如果還不確定HPV感染的具體類型，或如果希望具有預防作用的免疫應答抵抗不止一種HPV類型，那麼可以使用此類結合。還設想了將本發明之疫苗與抵抗引起生殖器疣的HPV類型的疫苗之組合，例如HPV6和/或HPV11。該等HPV類型的序列和由其編碼的蛋白(例如E6、E7、E2)可在公用資料庫中提供給技術人員，例如，由國家技術資訊中心(National Center for of technology Information)(NCBI)所提供的GenBank序列資料庫。 根據本發明的多肽包括SEQ ID NO: 1，並且在一個實施方式中，根據本發明的核酸分子包括SEQ ID NO: 2。 在此提供了從5’至3’方向的或從N-端至C-端的序列，如本領域中所習慣的。 根據本發明的多肽包括HPV16 E6和E7蛋白的表位。在某些實施方式中，根據本發明的多肽進一步包括(並且因此編碼該多肽的核酸進一步編碼)至少一種另外的抗原或此類另外的抗原的表位。此類另外的抗原較佳的是HPV抗原，較佳的是屬於在多肽中作為E6和E7蛋白的相同HVP類型。因此，此種另外的抗原可以是HPV蛋白或其免疫原片段，並且在某些實施方式中，包括E2蛋白或其包括HPV(較佳的是HPV16)的E2的至少一個表位的片段。此類另外的抗原或表位可以內置於包括SEQ ID NO: 1的多肽中的E6和/或E7的兩個片段之間，但是較佳的是使N-端或C-端融合至包括SEQ ID NO: 1的E6/E7多肽。可替代地或此外，可以存在刺激免疫應答的胺基酸序列。因此，在某些實施方式中，本發明提供了根據本發明的核酸分子，該核酸分子編碼包括SEQ ID NO: 1的多肽，並且其中該多肽進一步包括至少一種其他抗原，例如，HPV E2蛋白或其至少一個表位，但是較佳的是更多個表位。針對本發明，添加E2蛋白的優點係已知在感染期間/在E6和E7表現仍然非常低的低度病變中E2係早期表現的。在向子宮頸癌發展期間，失去了E2表現並且其結果係E6和E7水平的提高(湯川村(Yugawa)和清野(Kiyono)，2009，醫學病毒學評論(Rev Med Virol)19: 97-113)。將來自E2、E6和E7中的表位結合於疫苗中允許在廣泛標靶群體的患者中治療，該患者範圍為患有持續感染至患有浸潤性子宮頸癌(或其他HPV16引起的癌症)。在某些實施方式中，該E2蛋白係野生型E2蛋白。在某些其他實施方式中，該E2蛋白在其DNA結合域中具有已缺失或一個或多個突變(相比於野生型E2蛋白)。HPV16 E2蛋白的序列(NP_041328.1)可以發現於NCBI蛋白資料庫中(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)在編號NP_041328.1下。已知該蛋白的C-端部分中的E2中若干單個胺基酸變化例如G293V、K299M、或C300R廢止了DNA結合。使用缺少DNA結合能力的E2的變體或片段的優點係它能夠在其表現的細胞中藉由直接結合至宿主細胞DNA防止不可預測的轉錄變化。可以內部添加該E2蛋白或其部分或片段，但是較佳的是添加至具有SEQ ID NO: 1的本發明的多肽的N-端或C-端。在一個實施方式中，本發明的核酸分子編碼包括SEQ ID NO: 3的多肽。在其一個實施方式中，本發明的核酸分子包括SEQ ID NO: 4。在另一個實施方式中，本發明的核酸分子編碼包括SEQ ID NO: 5的多肽。在其一個實施方式中，本發明的核酸分子包括SEQ ID NO: 6。 還可以進一步使本發明由設計師專門設計的多肽與另外的蛋白融合，例如，所謂的載體蛋白，例如鈣網蛋白、結核分枝桿菌熱休克蛋白-70、IP10、或破傷風毒素片段C(參見奧斯特惠斯(Oosterhuis)等人，人類基因治療(Human Gene Ther)，2012，見上文，如需更多實例)，該等另外的蛋白可以進一步提高對HPV E6和E7(和可隨意地E2)表位的免疫應答。因此本發明還提供了此類另外的融合蛋白，以及對其進行編碼的核酸。 在某些實施方式中，將根據本發明的核酸分子摻入載體中。如在此使用的“載體”典型地是人工運載外源遺傳物質到另一個細胞中的運載體，其中可以對它進行複製和/或表現，並且根據本發明它可以是任何包括根據本發明核酸分子的核酸分子。該等可以藉由常規分子生物學技術例如克隆進行製備。典型地，此類載體可以在至少一種類型的適合宿主中進行繁殖，例如細菌、酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、以及類似物。載體的四種主要類型係質粒、病毒載體、黏粒(cosmid)、和人工染色體。載體本身一般是由插入片段(轉基因；在本發明中編碼本發明融合多肽的核酸)和序列(該序列作為載體的“骨架”)組成的DNA序列。轉移遺傳信息至另一個細胞的載體的目的典型地是為了分離、擴增、或表現靶細胞中的插入片段。較佳的是，編碼多肽的序列可操作地連接至載體中的啟動子。術語“可操作地連接”意指感興趣的核苷酸序列以一種方式連接至啟動子，該方式允許該核苷酸序列(例如，當該載體導入宿主細胞時，在宿主細胞中)表現。表現調節序列可以可操作地連接至轉基因上。在某些實施方式中，設計載體用來在靶細胞中表現轉基因，並且該載體一般具有驅動該轉基因表現的啟動子序列。在某些實施方式中，可以存在常規使用的載體元件(例如轉錄終止子序列、聚腺苷尾序列、Kozak序列、UTR、複製原點、多克隆位點、遺傳標記、抗生素抗性、和另外的序列)中的一種或多種，並且熟習該項技術者可以設計一載體，這樣使得其具有所希望的性質，例如用於在某些細胞中複製以繁殖並擴增載體，並且在引入該載體的靶細胞中用於載體中的轉基因的表現。包括編碼根據本發明的融合多肽的核酸的載體，較佳的是被設計用於在哺乳動物細胞中表現的載體，適於作為根據本發明的疫苗。在某些實施方式中，根據本發明之載體係質粒、黏粒、酵母人工染色體、細菌人工染色體、病毒載體、或諸如此類。熟習該項技術者知道不同的啟動子可以用於獲得宿主細胞中一種基因的表現。在真核細胞中用於表現的一些熟知的並且常用的啟動子包括源自病毒的啟動子，如腺病毒，例如E1A啟動子；源自巨細胞病毒(CMV)的啟動子，如CMV立即早期(IE)啟動子(在此稱為CMV啟動子)(例如可從pcDNA獲得，英傑公司(Invitrogen))，源自猿猴病毒40(SV40)的啟動子(例如可從pIRES獲得，目錄號631605，BD科學)；以及類似物。適合的啟動子還可以源自真核細胞，如金屬硫蛋白(MT)啟動子、延長因數1α(EF-1α)啟動子、泛素C或UB6啟動子、肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子、以及類似物(參見例如WO 2006/048459)。用於獲得在真核細胞中的表現的適合的啟動子的非限制性實例係CMV-啟動子(US 5,385,839)，例如CMV立即早期啟動子，例如包括來自CMV立即早期基因增強子/啟動子的nt.-735到+95，例如如在此所提供的具有如SEQ ID NO: 13所示的序列的CMV啟動子。聚腺苷酸化信號，例如牛生長激素polyA信號(US 5,122,458)可以存在於該(該等)轉基因後面。 還可以添加其他調節序列。在此可以將術語“調節序列”與“調節元件”互換地使用，並且是指核酸的區段，典型地但不限於DNA，該核酸的區段調節它可操作地連接的核酸序列的轉錄，並且因此作為轉錄調諧子。調節序列通常包括作為轉錄結合域的核酸序列，該轉錄結合域被轉錄蛋白和/或轉錄因數、增強子或阻遏物等等的核酸結合域進行識別。例如，可能使阻遏物序列與啟動子可操作地偶聯，該阻遏物序列可以被阻遏蛋白限制，該阻遏蛋白可以降低或阻止表現該阻遏蛋白的生產細胞系中的轉基因之表現。當傳代時和/或當其在生產細胞系中大量生產時，這可以改進核酸分子的遺傳穩定性和/或表現水平。本領域已經描述了此類系統。例如，調節序列可以包括一種或多種四環素操縱基因操縱基因序列(tetO)，這樣使得在四環素操縱基因阻遏蛋白(tetR)存在下抑制表現。在四環素的不存在下，該tetR蛋白能夠結合至tetO位點並且阻遏可操作地連接至tetO位點的基因的轉錄。然而，在四環素的存在下，tetR蛋白質中構象變化阻止其結合至操縱基因序列，允許發生可操作連接的基因的轉錄。在某些實施方式中，本發明之核酸分子，例如當存在於重組腺病毒載體中，可以可隨意地包括可操作地連接至啟動子的tetO，這樣使得在重組腺病毒中抑制了一種或多種轉基因之表現，該等重組腺病毒產生在表現tetR蛋白的生產細胞系中。隨後，如果將重組腺病毒引入受試者或不表現tetR蛋白的細胞中，那麼將不能抑制表現(例如，國際專利申請WO 07/073513)。在某些其他實施方式中，本發明的核酸分子，例如當存在於重組腺病毒中時，可以可隨意地包括cumate基因開關系統，其中調節表現係藉由將阻遏物(CymR)結合至操縱基因位點(CuO)，置於啟動子下游進行介導(例如，穆立克(Mullick)等人，BMC生物技術(BMC Biotechnol.)2006 6: 43)。在此使用的，術語“阻遏物”係指具有抑制、干擾、延遲和/或阻遏重組表現載體的異源蛋白產物的產生的能力的實體(例如，蛋白或其他分子)。例如，藉由干擾表現載體中(如在表現盒中)處於適當位置的結合位點。阻遏物的實例包括tetR、CymR、乳糖阻遏物、trp阻遏物、半乳糖阻遏物、λ阻遏物、以及其他本領域中已知的適當的阻遏物。在此提供了使用tetO/tetR操縱基因/阻遏物系統和使用CuO/CymR操縱基因/阻遏物系統的實例。阻遏在載體繁殖期間載體轉基因表現可以防止轉基因的不穩定性，並且可以在生產期間增加具有本發明轉基因的載體的產量。因此，在一些實施方式中，本發明載體具有啟動子，該啟動子可以藉由阻遏蛋白的結合被阻遏，例如藉由具有可操作地偶聯到阻遏物操縱基因序列上的啟動子(例如，在非限制性實施方式中，包含TetO的序列，例如表示為SEQ ID NO: 11的序列，或者包含CuO的序列，例如例如表示為SEQ ID NO: 12的序列)，阻遏蛋白(例如，TetR蛋白，例如具有表示為SEQ ID NO: 15的胺基酸序列，或著CymR蛋白，例如具有表示為SEQ ID NO: 17的胺基酸序列)可以結合至該阻遏物操縱基因序列。 在某些實施方式中，該載體係質粒DNA分子，或其片段。該等可以用於DNA疫苗接種。其他平臺可以用作載體，例如減毒活雙缺失的單核細胞增生李斯特菌菌株。 在其他實施方式中，該載體係組合病毒載體，該組合病毒載體可以是可複製型或複製缺陷型的。在某些實施方式中，病毒載體包括重組DNA基因組。在某些實施方式中，根據本發明的載體例如是重組腺病毒、重組反轉錄病毒、重組痘病毒如牛痘病毒(例如修飾的安卡拉(Ankara)痘苗(MVA))、重組α病毒如塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、重組副黏病毒，如重組麻疹病毒(measles virus)、或其他重組病毒。在某些實施方式中，根據本發明的載體係MVA載體。 在較佳的實施方式中，根據本發明的載體係重組腺病毒。腺病毒用作疫苗的優點包括操作簡單、優良的大規模可製造性、以及良好的安全記錄，該良好的安全記錄基於使用已經報導過的多種腺病毒載體在研究、開發、生產和臨床試驗中的多年經驗。被用作疫苗的腺病毒載體通常提供了對轉基因所編碼的蛋白的良好的免疫應答，該免疫應答包括細胞免疫應答。根據本發明的腺病毒載體可以基於任何類型的腺病毒，並且在某些實施方式中，是可以為任何血清型的人類腺病毒。在其他實施方式中，它係猿猴腺病毒，例如可以為任何血清型的黑猩猩或大猩猩腺病毒。在某些實施方式中，根據本發明的載體係人類腺病毒血清型5、26或35的。重組腺病毒載體的製備在本領域中是熟知的。在某些實施方式中，根據本發明的腺病毒載體在腺病毒基因組的E1區域(例如，E1a區域和/或E1b區域)的至少一個必需基因功能中是有缺陷的，E1區域屬於對病毒複製的必需腺病毒基因組。在某些實施方式中，根據本發明的腺病毒載體在非必須E3區域的至少部分中是有缺陷的。在某些實施方式中，該載體在E1區域的至少一個必需基因功能中以及在非必須E3區域的至少部分中是有缺陷的。 腺病毒載體、其構建方法和其繁殖方法係本領域所熟知的，並且被描述於，例如，美國專利案號5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191、和6,113,913，和湯瑪斯 申克(Thomas Shenk)，“(腺病毒及其複製)Adenoviridae and their Replication”，M. S.霍維茨(Horwitz)，“腺病毒(Adenoviruses)”，分別第67和68章，在病毒學(Virology)中，B. N.菲爾茨(Fields)等人，編輯，第3版，雷文出版社有限公司(Raven Press, Ltd.)，紐約(1996)，以及在此提及的其他參考資料。典型地，腺病毒載體的構建涉及使用標準分子生物技術，如在以下描述的那些，例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，分子克隆，實驗室手冊(Molecular Cloninga, Laboratory Manual)，第2版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港，紐約，(1989)，沃森(Watson)等人，重組DNA(Recombinant DNA)，第2版，科學美國人書刊(Scientific American Books)(1992)，和奧蘇貝爾(Ausubel)等人，分子生物學現代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，威利國際科學出版社(Wiley Interscience Publishers)，紐約(1995)，和在此提及的其他參考資料。 針對重組腺病毒的具體較佳的血清型係人類血清型35或人類血清型36。例如在WO 2007/104792中和在阿賓克(Abbink)等人，2007病毒學(Virology)81: 4654-63中描述了rAd26載體的製備。Ad26的示例性基因組序列發現於GenBank登錄號EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO: 1中。例如，在美國專利案號7,270,811中、在WO 00/70071中、和在沃格爾(Vogels)等人，2003，病毒學雜誌(J Virol )77: 8263-71中，描述了rAd35載體的製備。Ad35的示例性基因組序列發現於GenBank登錄號AC_000019中和WO 00/70071的圖6中。 在某些實施方式中，該腺病毒係複製缺陷的，例如，因為它包含在基因組的E1區域中的缺失。正如熟習該項技術者已知的，在缺失來自腺病毒基因組的必須區域的情況下，由該等區域編碼的功能必須由菌株反式提供，較佳的是由生產細胞提供，即，當E1、E2和/或E4區域的部分或全部從腺病毒中刪除時，該等必須存在於生產細胞中，例如整合到其基因組中，或以所謂的輔助腺病毒或輔助質粒形式。該等腺病毒還可以具有在E3區域中的缺失，該缺失針對複製是非必要的，並且因此不必補充此種缺失。 可以使用的生產細胞(有時在本領域中以及在此還稱為‘包裝細胞’或‘補充細胞’)可以是任何生產細胞，其中可以繁殖所希望的腺病毒。例如，在生產細胞中完成重組腺病毒載體的繁殖，該生產細胞補充了腺病毒中的缺陷。此類生產細胞較佳的是在其基因組中具有至少一個腺病毒E1序列，並且從而能夠補充在E1區域中具有缺失的重組腺病毒。可以使用任何補充E1的生產細胞，如由E1永生化的人類網膜細胞，例如911或PER.C6細胞(參見美國專利5,994,128)、E1轉化的羊水細胞(參見歐洲專利1230354)、E1轉化的A549細胞(參見例如WO 98/39411，美國專利5,891,690)、GH329：海拉細胞(高(Gao)等人，2000，人類基因治療(Hum Gene Ther)11: 213-19)、293、以及類似物。在某些實施方式中，該生產細胞例如是HEK293細胞、或PER.C6細胞、或911細胞、或IT293SF細胞、以及類似物。在(科夫斯迪(Kovesdi)等人，2010，病毒2: 1681-703)中評論了生產細胞中腺病毒載體的生產。 在某些實施方式中，E1缺陷的腺病毒包括亞組C的腺病毒(Ad5)的E4-orf6編碼序列。這允許在表現Ad5的E1基因的熟知的補充細胞系中此類腺病毒的繁殖，如例如293細胞或PER.C6細胞(參見，例如哈文格(Havenga)等人，2006，普通病毒學雜誌(J Gen Virol )87: 2135-43；WO 03/104467，將其藉由引用以其全文結合在此)。 在本發明的載體中“異源核酸”(在此還稱為‘轉基因’)是非天然存在於載體中的核酸，並且根據本發明，編碼本發明融合多肽的核酸當存在於載體中時被認為是異源核酸。例如，藉由標準分子生物學技術將其引入載體中。例如，可以將其克隆至腺病毒載體的缺失的E1或E3區域，或在E4區域和rITR之間的區域中。轉基因通常可操作地連接到表現控制序列。在較佳的實施方式中，將轉基因克隆至腺病毒載體的E1區域中。 可以根據熟習該項技術者熟知的各種方法進行載體生產，如DNA載體、或重組腺病毒載體。一般來說，生產需要在培養細胞中繁殖來產生大量的載體材料，隨後從細胞培養物中獲得載體，並且典型的是隨後進一步純化載體以去除其他物質並且獲得純化的載體，可以將該載體配製到藥用組成物中(例如，霍根森(Hoganson)等人，2002，生物工藝雜誌(BioProcessing J)1: 43-8；埃文斯(Evans)等人，2004，藥物科學雜誌(J Pharm Sci)93: 2458-75)。例如，用於從生產細胞的培養物中獲得腺病毒之方法已經例如廣泛描述於WO 2005/080556中。例如WO 2010/060719、和WO 2011/098592，二者藉由引用結合在此，描述了用於獲得並純化大量重組腺病毒的適合之方法。 在某些方面，本發明還提供了由根據本發明所述之核酸分子編碼的多肽。此種多肽包括SEQ ID NO: 1。在某些實施方式中，此種多肽可以包括SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5。此種多肽的特徵如上所述。此種多肽可以例如直接用作抵抗HPV的疫苗。 本發明進一步提供了包括根據本發明的核酸分子、載體或多肽的疫苗，其中針對該等方面中的每個的實施方式可以包括如以上所描述的那些。在較佳的實施方式中，根據本發明所述之疫苗包括根據本發明所述之核酸分子。在本發明的其他較佳的實施方式中，該疫苗包括根據本發明所述之載體，較佳的是DNA載體、MVA載體、或重組腺病毒載體。 在某些實施方式中，根據本發明所述之疫苗進一步包括活性成分，例如，編碼不同於HPV16的至少一種HPV類型的E6和/或E7蛋白的至少一個表位的核酸，例如高危的HPV類型如HPV18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73、或HPV-82。 術語“疫苗”指示試劑或組成物，該試劑或組成物包含在受試者中有效誘導預防程度和/或治療程度的免疫性抵抗某種病原體或疾病的活性組分，在此是治療性地針對HPV。根據本發明，該疫苗典型地包括核酸分子、或載體、以及藥學上可接受之賦形劑。當向受試者給予的時候，由根據本發明的核酸分子所編碼的多肽將在該受試者中表現，該表現將導致對存在於該多肽中的E6和/或E7抗原片段的免疫應答。暫態分子(instant molecule)的優點係HPV16 E6和E7的基本上所有T-細胞表位係存在的，並且因此存在於野生型E6或E7中的任何表位的T-細胞應答可以配備到疫苗中。此外，針對根據本發明的核酸分子該疫苗具有如上所述的安全性和有效性的優點。 針對向受試者給予，本發明可以使用包括載體和藥學上可接受的載體或賦形劑之藥用組成物。在本上下文中，術語“藥學上可接受的”意指該載劑或賦形劑在所採用的劑量和濃度下不會在它們給予的受試者中引起任何不必要或不良的影響。該等藥學上可接受之賦形劑係本領域中眾所週知的(參見雷明登氏製藥科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版，A. R.熱納羅(Gennaro)編，馬克出版社(Mack Publishing Company)[1990]；肽和蛋白質的醫藥配製物發展(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins)，弗羅加爾(S. Frokjaer)和霍夫高(L. Hovgaard)編，泰勒法蘭西斯集團(Taylor & Francis)[2000]；以及醫藥賦形劑手冊(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第3版，A.凱博(Kibbe)編，醫藥出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。賦形劑通常是用藥物的活性成分配製的藥學上無活性的物質。賦形劑通常被用來增大包含有效活性成分(因此通常稱為“膨脹劑”、“填料”、“稀釋劑”)的配製物，以允許當生產劑型時方便並準確的分配藥品。它們還可以服務各種增強治療的目的，如促進藥物吸收或溶解、或其他藥物動力學考慮。賦形劑還可以在製造過程中使用，除幫助體外穩定性如在預期的保質期中防止變性以外，還來幫助處理所關心的活性物質如藉由促進粉末流動性或不黏性。適當的賦形劑的選擇還取決於給藥途徑和劑型，連同活性成分及其他因素。 儘管還可以運用凍乾製品，但該純化的核酸分子、載體或多肽較佳的是作為無菌溶液進行配製和給予。無菌溶液係藉由無菌過濾或藉由本領域中自身已知的其他方法製備。該等溶液接著凍乾或填充到醫藥劑量容器中。溶液的pH值一般在pH 3.0到9.5的範圍內，例如pH 5.0到7.5。該核酸分子或載體或多肽典型地是在具有適合緩衝液的溶液中，並且該載體的溶液還可以包含鹽。可隨意地穩定劑可以存在，比如白蛋白。在某些實施方式中，添加清潔劑。在某些實施方式中，疫苗可以被配製為可注射製品。該等配製物包含有效量的核酸分子、載體或多肽(該等有效量的核酸分子、載體或多肽係無菌液體溶液、液體懸浮液或凍乾的版本)，並且可隨意地包含穩定劑或賦形劑。 例如，重組腺病毒載體可以儲存於緩衝液中，該緩衝液還可以用於腺病毒世界標準(Adenovirus World Standard)(霍根森(Hoganson)等人，2002，生物工藝雜誌(Bioprocessing J)1: 43-8)：20 mM Tris pH 8，25 mM NaCl，2.5%甘油。適用於向人類給予的另一種有用的配製物緩衝液係20 mM Tris、2 mM MgCl2 、25 mM NaCl、蔗糖10% w/v、聚山梨酯-80 0.02% w/v。適用於重組腺病毒的另一種配製物緩衝液包括10-25 mM檸檬酸鹽緩衝劑pH 5.9-6.2，4-6%(w/w)羥丙基-β-環糊精(HBCD)、70-100 mM NaCl、0.018-0.035%(w/w)聚山梨酯-80、以及可隨意地包括0.3-0.45%(w/w)乙醇。顯而易見地，可以使用許多其他緩衝液，並且已知針對存儲和針對純化載體的藥用給藥的適合的配製物的若干實例。 在某些實施方式中，包括載體的組成物進一步包括一種或多種佐劑。佐劑在本領域中已知來進一步提高對所施加的抗原決定簇的免疫反應。術語“佐劑”和“免疫刺激劑”在此可互換地使用，並且被定義為引起免疫系統刺激的一種或多種物質。在此上下文中，佐劑用來增強對由本發明載體中核酸分子編碼的多肽的免疫應答。適合佐劑的實例包括鋁鹽，比如氫氧化鋁和/或磷酸鋁和/或磷酸鋁鉀；油-乳液組成物(或水包油型組成物)，包括角鯊烯-水乳液，比如MF59(參見例如WO 90/14837)；皂苷配製物，比如例如QS21和免疫刺激複合物(ISCOMS)(參見例如US 5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；細菌或微生物衍生物，其實例係單磷醯基脂質A(MPL)、3-O-脫醯基MPL(3dMPL)、含有CpG-基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化細菌毒素或其突變體，比如大腸桿菌熱不穩定的腸毒素LT、霍亂毒素CT等等。還可以使用載體編碼的佐劑，例如，藉由使用編碼感興趣的抗原與C4-結合蛋白(C4bp)的低聚反應域的融合物的異源核酸(例如，索拉波米(Solabomi)等人，2008，感染與免疫(Infect Immun)76: 3817-23)，或藉由使用編碼感興趣的轉基因和TLR-3激動劑如異源性dsRNA(例如WO 2007/100908)的載體，或諸如此類。 在其他實施方式中，本發明之組成物不包括佐劑。 可以將藥用組成物給予受試者，例如人類受試者。在一次給藥期間向受試者提供的疫苗活性組分的總劑量可以按照技術從業人員已知的進行改變，並且針對腺病毒通常是在1 x 107 病毒顆粒(vp)和1 x 1012 vp之間，較佳的是在1 x 108 vp和1 x 1011 vp之間，例如在3 x 108 和5 x 1010 vp之間，例如在109 和3 x 1010 vp之間。針對DNA疫苗，每次給藥的DNA的總量可以例如是在1 µg和10 mg之間。如果將基因槍用於給藥，典型的是使用低劑量，例如10 µg。針對肌肉注射，典型地是使用較高劑量，例如高達5 mg。 藥用組成物的給藥可以使用標準給藥途徑執行。非限制性實施方式包括不經腸給予，比如藉由注射，例如皮內、肌肉內、等、或者皮下或經皮、或黏膜給予，例如鼻內、經口、陰道內、直腸、等等。在一個實施方式內，藉由肌肉注射給予組成物，例如向手臂的三角肌、或大腿的股外側肌。在某些實施方式中，該疫苗係DNA疫苗，並且這可以例如經皮內給予，例如藉由DNA紋身法(DNA tattooing)(參見，例如，奧斯特惠斯(Oosterhuis)等人，2012，微生物學和免疫學的當前主題(Curr Top Microbiol Immunol)351: 221-50)。該途徑還可用於腺病毒載體。在某些實施方式中，根據本發明的組成物包括腺病毒載體並且是藉由肌肉注射給予。熟習該項技術者已知給予一種組成物，例如一種疫苗的不同的可能性，以誘發對疫苗中的一種或多種抗原的免疫反應。 如在此所使用的受試者較佳的是哺乳動物，例如齧齒動物，例如小鼠、或非人類靈長類動物或人類。較佳的是，該受試者為人類受試者。 可以將本發明之疫苗用來治療患有由HPV引起的疾病的各種階段之一的患者(特別是類型16)，從這樣的事件和持續性HPV感染(例如，如藉由HPV DNA測試所檢測的)，因此在形成(預)癌病變之前，連同子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN；又稱子宮頸非典型增生和子宮頸間質瘤，該CIN係在子宮頸表面上扁平細胞的可能癌變前轉換和異常生長(發育異常))至多且包括子宮頸癌(例如子宮頸鱗狀細胞癌(SCC))。此外，可以靶向其他HPV誘導的瘤形成，例如外陰上皮內瘤樣病變(VIN)、陰道上皮內瘤樣病變(VaIN)、陰莖上皮內瘤病變(PIN)、肛門上皮內瘤樣病變(AIN)，連同口咽癌(又稱頭頸癌)、陰莖癌、陰道腫瘤、外陰癌以及肛門癌的晚期。因此，本發明之疫苗可以靶向廣泛的HPV誘導的病變，並且可能對HPV誘導的疾病的癌前階段最有效，例如在(持續)感染和/或瘤形成階段，其中E2、E6和/或E7的表現最高。還可以將使用本發明之疫苗來的治療與在晚期癌細胞中可以抵消或克服免疫逃逸機制之化合物(例如，抗PD1/PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體如伊匹木單抗、抗LAG-3抗體、抗CD25抗體、IDO抑制劑、CD40激動性抗體、CD137激動性抗體、等等)結合(參見例如哈米德(Hamid)和卡瓦哈爾(Carvajal)，2013，生物治療專家意見(Expert Opinion Biol Ther)13: 847-861；梅爾曼(Mellman)等人，2011，自然綜述 (Nature Rev)480: 480-89)。治療性疫苗接種方法還可以在原則上，在疫苗進一步包括引起外生殖器疣的HPV類型的(序列編碼的)E6和/或E7的情況下，用來治療外生殖器疣或其前體，並且向由此種HPV類型感染的受試者給予。 在此使用的，‘治療’意指給予疫苗來誘導患者中對表現(HPV16 E6和/或E7的表位)HPV16 E6和/或E7的細胞的治療性免疫應答，該免疫應答導致至少降低HPV16感染的水平並且較佳的是完全去除HPV16感染，這導致了至少減緩並較佳的是停止HPV16引起的疾病(如瘤形成和/或其症狀)的進展。較佳的是，用疫苗治療也導致了HPV誘導的癌症的更晚期階段的緩和。較佳的是向患有已經分型的已形成的HPV感染的患者給予疫苗，這樣使得可以給予編碼對應的HPV類型的多肽疫苗。在篩選不存在下，該疫苗還可以在部分可能被HPV感染的人群中給予，即性行為活躍的人。還可能向沒有被HPV16感染的受試者給予本發明之疫苗，例如用於預防性使用，可以與抵抗患者已經感染的另一種HPV類型的疫苗結合，或可替代地在非感染的受試者中。本發明之疫苗還可以向藉由其他方法經受過另外的治療的受試者給予，例如外科手術(去除了由HPV16感染引起的病變部位)、或用咪喹莫特治療(包括TLR-7/8激動劑，參見例如戴雅娜(Dayaana)等人，2010，英國癌症雜誌(Br J Cancer)102: 1129-36)。可以藉由細胞學或藉由HPV測試測量治療的效果。 疫苗接種包括向受試者或患者至少給予一次本發明之疫苗。還可以提供一種或多種另外疫苗的一次或多次的加強給予。如果執行一種加強疫苗接種，那麼典型地，此類加強疫苗接種將在具有相同抗原的免疫原性組成物第一次給予受試者(在該等情況下這被稱為‘初免接種’)後一週與一年之間，較佳的是在兩週與四個月之間的時刻給予相同的受試者。在可替代的加強方案中，還可以向受試者給予不同的載體，例如一種或多種不同血清型的腺病毒、或其他載體例如MVA、或DNA、或蛋白，作為初次和增強疫苗接種。在某些實施方式中，在初次-加強方案中向同一位患者給予至少兩次本發明相同形式的疫苗，例如，用根據本發明的相同的組合腺病毒(例如Ad26)。在某些實施方式中，在初次-加強方案中至少給予兩次本發明的疫苗，但是疫苗的載體不同，例如使用兩種不同血清型的腺病毒載體，例如用重組Ad26初免並且用重組Ad35加強，或反之亦然；或用DNA初免並且用腺病毒載體加強，或反之亦然；或用腺病毒載體初免並且用MVA載體加強，或反之亦然。在某些實施方式中，在初次-加強-加強方案中，至少給予三次根據本發明之疫苗。可以將另外的加強給藥添加至方案中。 本發明的一個方面還在受試者中誘導了抵抗HPV16的CTL應答，該方面包括向受試者給予根據本發明之疫苗。 本發明還提供了以下非限制性實施方式： 1) 編碼多肽的核酸分子，該多肽包括SEQ ID NO: 1； 2) 根據實施方式1所述之核酸，其中該多肽進一步包括至少部分的HPV E2蛋白； 3) 根據實施方式2所述之核酸，其中該至少部分的HPV E2蛋白係來自HPV16的E2蛋白； 4) 根據實施方式2所述之核酸，其中該多肽包括融合到具有SEQ ID NO: 1的多肽的N-端側的至少部分的E2蛋白； 5) 根據實施方式2所述之核酸，其中該多肽包括融合到具有SEQ ID NO: 1的多肽的C-端側的至少部分的E2蛋白； 6) 根據實施方式3所述之核酸，其中該多肽包括融合到具有SEQ ID NO: 1的多肽的N-端側的至少部分的E2蛋白； 7) 根據實施方式3所述之核酸，其中該多肽包括融合到具有SEQ ID NO: 1的多肽的C-端側的至少部分的E2蛋白； 8) 根據實施方式2所述之核酸，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 9) 根據實施方式3所述之核酸，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 10) 根據實施方式4所述之核酸，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 11) 根據實施方式5所述之核酸，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 12) 根據實施方式6所述之核酸，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 13) 根據實施方式7所述之核酸，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 14) 一種包括根據實施方式1所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 15) 一種包括根據實施方式2所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 16) 一種包括根據實施方式3所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 17) 一種包括根據實施方式4所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 18) 一種包括根據實施方式5所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 19) 一種包括根據實施方式6所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 20) 一種包括根據實施方式7所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 21) 一種包括根據實施方式8所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 22) 一種包括根據實施方式9所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 23) 一種包括根據實施方式10所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 24) 一種包括根據實施方式11所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 25) 一種包括根據實施方式12所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 26) 一種包括根據實施方式13所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 27) 根據實施方式14所述之載體，其中該載體係腺病毒； 28) 根據實施方式15所述之載體，其中該載體係腺病毒； 29) 根據實施方式16所述之載體，其中該載體係腺病毒； 30) 根據實施方式17所述之載體，其中該載體係腺病毒； 31) 根據實施方式18所述之載體，其中該載體係腺病毒； 32) 根據實施方式19所述之載體，其中該載體係腺病毒； 33) 根據實施方式20所述之載體，其中該載體係腺病毒； 34) 根據實施方式21所述之載體，其中該載體係腺病毒； 35) 根據實施方式22所述之載體，其中該載體係腺病毒； 36) 根據實施方式23所述之載體，其中該載體係腺病毒； 37) 根據實施方式24所述之載體，其中該載體係腺病毒； 38) 根據實施方式25所述之載體，其中該載體係腺病毒； 39) 根據實施方式26所述之載體，其中該載體係腺病毒； 40) 根據實施方式27所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 41) 根據實施方式28所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 42) 根據實施方式29所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 43) 根據實施方式30所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 44) 根據實施方式31所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 45) 根據實施方式32所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 46) 根據實施方式33所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 47) 根據實施方式34所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 48) 根據實施方式35所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 49) 根據實施方式36所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 50) 根據實施方式37所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 51) 根據實施方式38所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 52) 根據實施方式39所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 53) 根據實施方式28所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 54) 根據實施方式29所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 55) 根據實施方式30所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 56) 根據實施方式31所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 57) 根據實施方式32所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 58) 根據實施方式33所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 59) 根據實施方式34所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 60) 根據實施方式35所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 61) 根據實施方式36所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 62) 根據實施方式37所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 63) 根據實施方式38所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 64) 根據實施方式39所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 65) 包括根據實施方式14所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 66) 包括根據實施方式15所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 67) 包括根據實施方式16所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 68) 包括根據實施方式17所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 69) 包括根據實施方式18所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 70) 包括根據實施方式19所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 71) 包括根據實施方式20所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 72) 包括根據實施方式21所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 73) 包括根據實施方式22所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 74) 包括根據實施方式23所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 75) 包括根據實施方式24所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 76) 包括根據實施方式25所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 77) 包括根據實施方式26所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 78) 包括根據實施方式27所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 79) 包括根據實施方式28所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 80) 包括根據實施方式29所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 81) 包括根據實施方式30所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 82) 包括根據實施方式31所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 83) 包括根據實施方式32所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 84) 包括根據實施方式33所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 85) 包括根據實施方式34所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 86) 包括根據實施方式35所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 87) 包括根據實施方式36所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 88) 包括根據實施方式37所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 89) 包括根據實施方式38所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 90) 包括根據實施方式39所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 91) 包括根據實施方式40所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 92) 包括根據實施方式41所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 93) 包括根據實施方式42所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 94) 包括根據實施方式43所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 95) 包括根據實施方式44所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 96) 包括根據實施方式45所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 97) 包括根據實施方式46所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 98) 包括根據實施方式47所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 99) 包括根據實施方式48所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 100) 包括根據實施方式49所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 101) 包括根據實施方式50所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 102) 包括根據實施方式51所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 103) 包括根據實施方式52所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 104) 包括根據實施方式53所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 105) 包括根據實施方式54所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 106) 包括根據實施方式55所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 107) 包括根據實施方式56所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 108) 包括根據實施方式57所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 109) 包括根據實施方式58所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 110) 包括根據實施方式59所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 111) 包括根據實施方式60所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 112) 包括根據實施方式61所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 113) 包括根據實施方式62所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 114) 包括根據實施方式63所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 115) 包括根據實施方式64所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 116) 用於在受試者中誘導抵抗HPV的免疫應答之方法，該方法包括向受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗組成物； 117) 用於治療持續性HPV(類型16)感染之方法，該方法包括向受到持續性HPV感染的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 118) 用於治療外陰上皮內瘤樣病變(VIN)(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有VIN的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 119) 用於治療外陰癌(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有外陰癌的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 120) 用於治療子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有CIN的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 121) 用於治療子宮頸癌(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有子宮頸癌的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 122) 用於治療口咽癌(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有口咽癌的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 123) 用於治療陰莖上皮內瘤病變(PIN)(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有PIN的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 124) 用於治療陰莖癌(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有陰莖癌的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 125) 用於治療陰道上皮內瘤樣病變(VaIN)(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有VaIN的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 126) 用於治療陰道癌(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有陰道癌的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 127) 用於治療肛門上皮內瘤樣病變(AIN)(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有AIN的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 128) 用於治療肛門癌(具有潛在的HPV類型16感染)之方法，該方法包括向患有肛門癌的受試者給予根據實施方式65-115中任一項所述之疫苗； 129) 一種包括SEQ ID NO: 1的多肽； 130) 根據實施方式129所述的多肽，其中該多肽進一步包括至少部分的HPV E2蛋白； 131) 根據實施方式130所述的多肽，其中該至少部分的HPV E2蛋白係來自HPV16的E2蛋白； 132) 根據實施方式130所述的多肽，其中至少部分的E2蛋白融合到具有SEQ ID NO: 1的多肽的N-端側； 133) 根據實施方式130所述的多肽，其中至少部分的E2蛋白融合到具有SEQ ID NO: 1的多肽的C-端側； 134) 根據實施方式131所述的多肽，其中至少部分的E2蛋白融合到具有SEQ ID NO: 1的多肽的N-端側； 135) 根據實施方式131所述的多肽，其中至少部分的E2蛋白融合到具有SEQ ID NO: 1的多肽的C-端側； 136) 根據實施方式130所述的多肽，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 137) 根據實施方式131所述的多肽，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 138) 根據實施方式132所述的多肽，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 139) 根據實施方式133所述的多肽，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 140) 根據實施方式134所述的多肽，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 141) 根據實施方式135所述的多肽，其中該至少部分的E2蛋白包括具有突變的E2蛋白變體，該突變廢止了E2的DNA結合； 142) 根據實施方式3所述之核酸，該核酸編碼根據SEQ ID NO: 3的多肽； 143) 根據實施方式3所述之核酸，該核酸編碼根據SEQ ID NO: 5的多肽； 144) 編碼根據實施方式142所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 145) 編碼根據實施方式143所述之核酸之載體，其中編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子； 146) 根據實施方式144所述之載體，其中該載體係腺病毒； 147) 根據實施方式145所述之載體，其中該載體係腺病毒； 148) 根據實施方式146所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 149) 根據實施方式147所述之載體，其中該腺病毒係血清型26的人類腺病毒； 150) 根據實施方式146所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 151) 根據實施方式147所述之載體，其中該腺病毒係血清型35的人類腺病毒； 152) 包括根據實施方式144所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 153) 包括根據實施方式145所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 154) 包括根據實施方式146所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 155) 包括根據實施方式147所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 156) 包括根據實施方式148所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 157) 包括根據實施方式149所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 158) 包括根據實施方式150所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 159) 包括根據實施方式151所述之載體、和藥學上可接受之賦形劑之疫苗組成物； 160) 用於在受試者中誘導抵抗HPV的免疫應答之方法，該方法包括向該受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗組成物； 161) 用於治療外陰上皮內瘤樣病變(VIN)之方法，該方法包括向患有VIN的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 162) 用於治療外陰癌之方法，該方法包括向患有外陰癌的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 163) 用於治療子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)之方法，該方法包括向患有CIN的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 164) 用於治療子宮頸癌之方法，該方法包括向患有子宮頸癌的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 165) 用於治療口咽癌之方法，該方法包括向患有口咽癌的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 166) 用於治療陰莖上皮內瘤病變(PIN)之方法，該方法包括向患有PIN的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 167) 用於治療陰莖癌之方法，該方法包括向患有陰莖癌的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 168) 用於治療陰道上皮內瘤樣病變(VaIN)之方法，該方法包括向患有VaIN的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 169) 用於治療陰道癌之方法，該方法包括向患有陰道癌的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 170) 用於治療肛門上皮內瘤樣病變(AIN)之方法，該方法包括向患有AIN的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗； 171) 用於治療肛門癌之方法，該方法包括向患有肛門癌的受試者給予根據實施方式152-159中任一項所述之疫苗。 除非另有說明，本發明之實踐採用免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、和重組DNA的常規技術，該等在本領域的技能之內。參見例如薩姆布魯克(Sambrook)、弗裡奇(Fritsch)和馬尼亞蒂斯(Maniatis)，分子克隆：實驗手冊(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL)，第2次編輯，1989；分子生物學現代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，奧蘇貝爾(Ausubel)FM等人編輯，1987；酶學方法(Methods in Enzymology)系列(學術出版社有限公司(Academic Press, Inc.))；PCR2：實用之方法(PCR2: A Practical Approach)，麥克弗森(MacPherson)MJ、海姆斯(Hams)BD、泰勒(Taylor)GR編輯，1955；抗體：實驗手冊(Antibodies: A Laboratory Manual)，哈洛(Harlow)和拉內(Lane)編輯，1988。
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Claims (15)

  1. 一種載體，其包含編碼包含SEQ ID NO：1之多肽的核酸分子，其中該載體選自以下組成之群：(i)質粒(plasmid)DNA分子或其片段；(ii)重組病毒載體；(iii)重組痘病毒載體；及(iv)重組人類腺病毒血清型26。
  2. 如請求項1之載體，其中該多肽進一步包含人類乳突病毒(HPV)E2蛋白的至少一個表位。
  3. 如請求項2之載體，其中該多肽包含HPV16 E2蛋白，該HPV16 E2蛋白在其DNA結合域具有缺失或突變。
  4. 如請求項3之載體，其中該多肽包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5。
  5. 如請求項1-4中任一項之載體，其中該載體為牛痘病毒載體。
  6. 如請求項1-4中任一項之載體，其中該載體為重組人類腺病毒血清型26。
  7. 如請求項6之載體，其中該重組人類腺病毒血清型26為E1缺陷的。
  8. 如請求項1-4中任一項之載體，其中該編碼該多肽的序列可操作地連接至啟動子。
  9. 如請求項8之載體，其中該啟動子可操作地偶聯到抑制物操縱子(repressor operator)序列。
  10. 如請求項9之載體，其中該抑制物操縱子序列為四環素操縱組操縱子序列(TetO)。
  11. 如請求項8之載體，其中該啟動子為CMV立即早期啟動子。
  12. 如請求項6之載體，其包含SEQ ID NO：2。
  13. 一種疫苗組成物，其包含如請求項1-12中任一項之載體，及藥學上可接受之賦形劑。
  14. 一種如請求項13之疫苗組成物之用途，其係用於製備在個體中誘導針對HPV的免疫應答之藥物。
  15. 一種如請求項13之疫苗組成物之用途，其係用於製備治療持續性HPV感染之藥物。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3421046A1 (en) 2014-11-04 2019-01-02 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic hpv16 vaccines
MY195389A (en) 2015-08-20 2023-01-18 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic HPV18 Vaccines
WO2017192418A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 Janssen Vaccine & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
CN112574317B (zh) * 2017-01-24 2023-12-05 南京益康生物医药有限公司 一种重组蛋白及药物组合物与应用
TW201923084A (zh) 2017-09-23 2019-06-16 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 副黏液病毒科(paramyxoviridae)表現系統
WO2019164970A1 (en) * 2018-02-20 2019-08-29 Emory University Hpv proteins, antibodies, and uses in managing abnormal epithelial cell growth
CN112105383A (zh) * 2018-03-12 2020-12-18 Sqz生物技术公司 用于治疗hpv相关疾病的方法
EP3810277A1 (en) * 2018-07-20 2021-04-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenoviral vector expressing zika antigen with improved productivity
CN108939064B (zh) * 2018-08-06 2021-12-10 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
CN108992665B (zh) * 2018-08-06 2021-11-19 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒单增李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
JP2022523564A (ja) 2019-03-04 2022-04-25 アイオーカレンツ， インコーポレイテッド 機械学習を使用するデータ圧縮および通信
CA3155090A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Transgene Combination of a poxvirus encoding hpv polypeptides and il-2 with an anti-pd-l1 antibody
WO2021202949A2 (en) * 2020-04-02 2021-10-07 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating vulvar dysplasia
US20210315986A1 (en) 2020-04-13 2021-10-14 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
EP4149530A1 (en) * 2020-05-12 2023-03-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Administration of homologous adenoviral vectors
AU2021385555B2 (en) * 2020-11-24 2024-05-23 MA, Muchou, Joe Dna vaccine for human palillomavirus and method for using the same
KR20240099266A (ko) * 2021-10-22 2024-06-28 이노비오 파마수티컬즈, 인크. 항문 고등급편평상피내병변(hsil)을 치료하기 위한 조성물 및 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013083287A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-13 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öffentlichen Rechtes Hpv derived polynucleic acids for therapy

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3584341D1 (de) 1984-08-24 1991-11-14 Upjohn Co Rekombinante dna-verbindungen und expression von polypeptiden wie tpa.
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
NZ230747A (en) 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
ATE336587T1 (de) 1994-06-10 2006-09-15 Genvec Inc Adenoviren-vektor systeme und zelllinien
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
US5559099A (en) 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5965541A (en) 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
KR100449181B1 (ko) 1995-06-15 2005-01-24 크루셀 홀란드 비.브이. 유전자요법에사용할수있는사람의재조합아데노바이러스패키징시스템
US5837511A (en) 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
US5891690A (en) 1996-04-26 1999-04-06 Massie; Bernard Adenovirus E1-complementing cell lines
EP0973866A4 (en) 1997-03-04 2000-04-19 Baxter Int ADENOVIRUS E1-COMPLEMENTING CELL LINES
US6020191A (en) 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US5972650A (en) 1997-06-26 1999-10-26 Brigham And Women's Hospital Tetracycline repressor regulated mammalian cell transcription and viral replication switch
US5981225A (en) 1998-04-16 1999-11-09 Baylor College Of Medicine Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same
US6113913A (en) 1998-06-26 2000-09-05 Genvec, Inc. Recombinant adenovirus
DK1054064T4 (da) 1999-05-17 2010-05-03 Crucell Holland Bv Vehikler til adenovirus afledt genafgivelse omfattende mindst et element af adenovirus type 35
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
FR2794370B1 (fr) 1999-06-03 2003-10-17 Biovector Therapeutics Fragments proteiques polyepitopiques, leur obtention et leurs utilisations notamment en vaccination
CA2384987A1 (en) * 1999-09-16 2001-03-22 Zycos Inc. Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides
DE19955558C2 (de) 1999-11-18 2003-03-20 Stefan Kochanek Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren
AU2002211524B2 (en) 2000-10-04 2007-03-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Highly expressible genes
CZ295808B6 (cs) 2000-11-23 2005-11-16 Bavarian Nordic A/S Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara
EP1385946B1 (en) 2001-05-01 2009-12-23 National Research Council Of Canada A system for inducible expression in eukaryotic cells
KR101021387B1 (ko) 2002-04-25 2011-03-14 크루셀 홀란드 비.브이. 아데노바이러스 벡터를 생산하기 위한 수단 및 방법
SE0202110D0 (sv) 2002-07-05 2002-07-05 Isconova Ab Iscom preparation and use thereof
SE0301998D0 (sv) 2003-07-07 2003-07-07 Isconova Ab Quil A fraction with low toxicity and use thereof
AU2005222776A1 (en) * 2003-12-31 2005-09-29 Genimmune N.V. Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
WO2005080556A2 (en) 2004-02-23 2005-09-01 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
EP1809750B1 (en) 2004-11-08 2012-03-21 ChromaGenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
WO2007073513A2 (en) 2005-11-10 2007-06-28 Genvec, Inc. Method for propagating adenoviral vectors encoding inhibitory gene products
CN103122360A (zh) 2006-02-28 2013-05-29 瓦克萨特公司 嵌合腺病毒载体
US20100143302A1 (en) 2006-03-16 2010-06-10 Crucell Holland B.V. Recombinant Adenoviruses Based on Serotype 26 and 48, and Use Thereof
WO2008092854A2 (en) * 2007-01-30 2008-08-07 Transgene S.A. Papillomavirus e2 polypeptide used for vaccination
DE102008010954A1 (de) 2008-02-25 2009-08-27 Cichon, Günter, Prof.Dr. DNA-Vakzine zur Therapie und Prophylaxe von Gebärmutterhalskrebs und seinen prämalignen Vorstufen
DK2350268T3 (en) 2008-11-03 2015-03-23 Crucell Holland Bv PROCEDURE FOR PRODUCING ADENOVIRUS VECTORS
GB0823497D0 (en) 2008-12-24 2009-01-28 Isis Innovation Immunogenic composition and use thereof
CA2786835C (en) 2010-02-15 2021-08-31 Crucell Holland B.V. Method for the production of ad26 adenoviral vectors
WO2012020871A1 (ko) * 2010-08-13 2012-02-16 주식회사 제넥신 사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물
US20130122038A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US9125870B2 (en) 2012-03-22 2015-09-08 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
CN106999565B (zh) 2014-09-03 2021-03-05 巴法里安诺迪克有限公司 重组修饰的痘苗病毒安卡拉(mva)丝状病毒疫苗
EP3421046A1 (en) 2014-11-04 2019-01-02 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic hpv16 vaccines
MY195389A (en) * 2015-08-20 2023-01-18 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic HPV18 Vaccines
WO2017192418A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 Janssen Vaccine & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013083287A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-13 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öffentlichen Rechtes Hpv derived polynucleic acids for therapy

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ÖHLSCHLAGER PETER, "An improved rearranged Human Papillomavirus Type 16 E7 DNA vaccine candidate (HPV-16 E7SH) induces and E7 wildtype-specific T cell response", Vaccine, Vol3 24, No. 15, 5 April, 2006, pages 2880-2893.
ÖHLSCHLAGER PETER, "An improved rearranged Human Papillomavirus Type 16 E7 DNA vaccine candidate (HPV-16 E7SH) induces and E7 wildtype-specific T cell response", Vaccine, Vol3 24, No. 15, 5 April, 2006, pages 2880-2893. OOSTERHUIS KOEN, "Preclinical development of highly effective and safe DNA vaccines directed against HPV 16 E6 and E7", International Journal of Cancer, Vol. 129, No. 2, 15 July, 2011, pages 397-406. *
OOSTERHUIS KOEN, "Preclinical development of highly effective and safe DNA vaccines directed against HPV 16 E6 and E7", International Journal of Cancer, Vol. 129, No. 2, 15 July, 2011, pages 397-406.

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