TWI717432B

TWI717432B - 抗體和使用彼之方法

Info

Publication number: TWI717432B
Application number: TW105139958A
Authority: TW
Inventors: 尼可拉斯威爾森; 傑若米偉特; 蓋德瑞特; 大衛薛爾; 丹尼爾賀希賽默曼; 塔哈默格豪伯; 艾卡特莉娜布瑞歐尼斯; 沃克賽伯特; 辻武正; 奧利維爾列格; 丹尼斯安德伍; 馬克德克
Original assignee: 美商艾吉納斯公司; 紀念斯隆凱特琳癌症中心; 盧德威格癌症研究協會
Priority date: 2015-12-02
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2021-02-01
Also published as: JP2023105024A; EP3383430A1; AU2016364889B2; US20230406946A1; TW202134282A; US20210171648A1; JP2019501883A; IL259495B2; CN108883173B; EP3383430A4; US11447557B2; US20230399413A1; SG11201804265XA; TW201734046A; SG10201912984WA; CA3007233A1; JP2022079549A; US10836830B2; IL259495A; MX2018006477A

Abstract

本發明提供特異性結合人類GITR及/或人類OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體及包含該等抗體之組合物。在一個特定態樣中，該等多特異性抗體特異性結合人類GITR及OX40且調節GITR及/或OX40活性，例如增強、活化或誘導GITR及/或OX40活性、或降低、去活化或抑制GITR及/或OX40活性。本發明亦提供用於治療諸如癌症之病症的方法，該等方法係藉由投予多特異性抗體，該多特異性抗體特異性結合人類GITR及/或OX40且調節GITR及/或OX40活性，例如增強、活化或誘導GITR及/或OX40活性。本發明亦提供用於治療自體免疫或發炎性疾病或病症之方法，該等方法係藉由投予多特異性抗體，該多特異性抗體特異性結合人類GITR及/或OX40且調節GITR及/或OX40活性，例如降低、去活化或抑制GITR及/或OX40活性。

Description

抗體和使用彼之方法

[相關申請案]

本申請案主張2015年12月2日提出申請之美國臨時申請案第62/262,369號及2016年11月9日提出申請之美國臨時申請案第62/419,911號之優先權，該等美國臨時申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文。

[序列表]

本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子檔方式提交且在此以全文引用之方式併入本文(該於2016年12月1日建立之ASCII複本係命名為3617_016PC02_SeqListing.txt且大小具有274,675位元組)。

本發明關於特異性結合人類糖皮質素誘導TNFR家族相關受體(GITR)及/或人類OX40受體(「OX40」)之多特異性抗體，例如雙特異性抗體；包含該等抗體之組合物；及，產生和使用該等抗體之方法。

先天性免疫反應及適應性免疫反應在控制人體腫瘤生長之作用係經良好表徵(Vesely MD等人，(2011)Annu Rev Immunol 29：235-271)。因此，基於抗體之策略已出現，該等策略旨在增強用於癌症治療目的之T細胞反應，諸如使用促效劑抗體靶向T細胞表現之刺激性受體、或使用功能性拮抗劑靶向T細胞表現之抑制性受體(Mellman I等人，(2011)Nature 480：480-489)。抗體介導之促效劑及拮抗劑方法已顯示臨床前活性及近期之臨床活性。

免疫反應之兩種重要之刺激因子為糖皮質素誘導TNFR相關蛋白(GITR)及OX40受體(「OX40」)。GITR及OX40皆為腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)之成員。

GITR(亦稱為活化誘導型TNFR家族受體(AITR)、GITR-D、CD357及腫瘤壞死因子受體超家族成員18(TNFRSF18))表現於先天性免疫系統及適應性免疫系統之許多組分且刺激後天免疫及先天免疫兩者(Nocentini G等人，(1994)PNAS 94：6216-6221；Hanabuchi S等人，(2006)Blood 107：3617-3623；Nocentini G及Riccardi C(2005)Eur J Immunol 35：1016-1022；Nocentini G等人， (2007)Eur J Immunol 37：1165-1169)。GITR表現於若干細胞及組織，彼等包括T細胞、B細胞、樹突細胞(DC)及自然殺手細胞(NK)，且係由其配體GITRL活化，該配體GITRL主要表現於抗原呈現細胞(APC)、內皮細胞及腫瘤細胞。GITR/GITRL系統參與自體免疫/發炎反應之發展且加強對感染及腫瘤之反應。舉例而言，使用GITR-Fc融合蛋白治療動物改善自體免疫/發炎性疾病，而GITR觸發係有效治療病毒感染、細菌感染及寄生物感染且增強對抗腫瘤之免疫反應(Nocentini G等人，(2012)Br J Pharmacol 165：2089-99)。該等作用歸因於若干個並行機制，該等機制包括：效應T細胞之共活化、對調節性T(Treg)細胞之抑制、NK細胞共活化、巨噬細胞之活化、樹突細胞功能之調節及外滲過程之調節。在T細胞活化之後，GITR之膜表現增加(Hanabuchi S等人，(2006)(同上)；Nocentini G及Riccardi C(同上))。GITR觸發會共活化效應T淋巴球(McHugh R S等人，(2002)Immunity 16：311-323；Shimizu J等人，(2002)Nat Immunol 3：135-142；Roncheti S等人，(2004)Eur J Immunol 34：613-622；Tone M等人，(2003)PNAS 100：15059-15064)。GITR活化增加對腫瘤及病毒感染之抵抗力，涉及自體免疫/發炎過程且調節白血球外滲(Nocentini G及Riccardi C(2005)(同上)；Cuzzocrea S等人，(2004)J Leukoc Biol 76：933-940；Shevach E M及Stephens G L(2006)Nat Rev Immunol 6： 613-618；Cuzzocrea S等人，(2006)J Immunol 177：631-641；Cuzzocrea S等人，(2007)FASEB J 21：117-129)。

人類GITR係以極低之量表現於周邊(未活化)T細胞。在T細胞活化之後，在CD4⁺細胞及CD8⁺細胞兩者中，GITR經強烈上調達數日(Kwon B等人，(1999)J Biol Chem 274：6056-6061；Gurney AL等人，(1999)Curr Biol 9：215-218；Ronchetti S等人，(2004)(同上)；Shimizu J等人，(2002)(同上)；Ji H B等人，(2004)(同上)；Ronchetti S等人，(2002)Blood 100：350-352；Li Z等人，(2003)J Autoimmun 21：83-92)，CD4⁺細胞比CD8⁺ 細胞具有更高之GITR表現(Kober J等人，(2008)Eur J Immunol 38(10)：2678-88；Bianchini R等人，(2011)Eur J Immunol 41(8)：2269-78)。

OX40(亦稱為CD134、腫瘤壞死因子受體超家族成員4(TNFRSF4)、TXGP1L、ACT35及ACT-4)調節T細胞、自然殺手T(NKT)細胞及NK細胞功能(Sugamura K等人，(2004)Nat Rev Immunol 4：420-431)。OX40可由抗原特異性T細胞在顯示負載同源肽之MHC I類或II類分子之專職抗原呈現細胞(APC)刺激T細胞受體(TCR)之後上調(Sugamura K等人，(2004)Nat Rev Immunol 4：420-431)。在成熟時，諸如樹突細胞(DC)之APC上調刺激性B7家族成員(例如CD80及CD86)及包括OX40配體(OX40L)之輔助共刺激分子，該上調有助於塑造T細胞免疫反應之動力學及量級以及有效之記憶細胞分化。值得注意的是，其他細胞類型亦可表現組成性及/或誘導性OX40L之含量，諸如B細胞、血管內皮細胞、肥大細胞及在一些情況下經活化之T細胞(Soroosh P等人，(2006)J Immunol 176：5975-5987)。咸信OX40：OX40L共接合驅動受體三聚體之更高層級之簇集及後續之信號轉導(Compaan DM等人，(2006)Structure 14：1321-1330)。

已在鼠類及人類腫瘤組織中觀測到在腫瘤微環境內T細胞表現OX40(Bulliard Y等人，(2014)Immunol Cell Biol 92：475-480；及Piconese S等人，(2014)Hepatology 60：1494-1507)。相對於習知之T細胞群體，調節性T細胞(Treg)之腫瘤內群體高度表現OX40，此為歸因於腫瘤內Treg群體之增殖狀態特徵(Waight J D等人，(2015)J Immunol 194：878-882；及Bulliard Y等人，(2014)Immunol Cell Biol 92：475-480)。早期研究證實OX40促效劑抗體能夠在小鼠模型中引出腫瘤排斥反應(Weinberg A D等人，(2000)J Immunol 164：2160-2169；及Piconese S等人，(2008)J Exp Med 205：825-839)。促效人類OX40信號傳導之小鼠抗體亦已顯示可增強癌症患者之免疫功能(Curti B D等人，(2013)Cancer Res 73：7189-7198)。

OX40與OX40L之相互作用亦已與發炎性及自體免疫性疾病及病症之免疫反應相關，該等疾病及病症包括氣喘/特異反應、腦脊髓炎、類風濕性關節炎、結腸炎/發炎性腸病、移植物抗宿主病(例如移植排斥反應)、非肥胖糖尿病小鼠之糖尿病及動脈粥樣硬化之小鼠模型(Croft M等人，(2009)Immunol Rev 229(1)：173-191及其中引用之參考文獻)。已報導在OX40及OX40L缺陷型小鼠、接受負載細胞抑制藥物之抗OX40脂質體之小鼠及使用抗OX40L阻斷抗體或與人類免疫球蛋白之Fc部分融合之重組OX40阻斷OX40與OX40L之相互作用的小鼠中與該等疾病及病症相關之症狀減少(Croft M等人；Boot EPJ等人，(2005)Arthritis Res Ther 7：R604-615；Weinberg A D等人，(1999)J Immunol 162：1818-1826)。亦顯示使用阻斷性抗OX40L抗體之治療可抑制恆河猴氣喘模型之Th2發炎(Croft M等人；Seshasayee D等人，(2007)J Clin Invest 117：3868-3878)。此外，OX40L之多態性已與狼瘡相關(Croft M等人)。

鑒於人類GITR及OX40在調節免疫反應之角色，本發明提供特異性結合GITR及/或OX40之抗體及該等抗體調節GITR及/或OX40活性之用途。

在一個態樣中，本發明提供結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體。在一種情況下，分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含特異性結合 OX40(例如人類OX40)之第一抗原結合域及特異性結合GITR(例如人類GITR)之第二抗原結合域。

在一種情況下，抗體包含特異性結合人類OX40之第一抗原結合域及TNF超家族蛋白質。在一種情況下，抗體包含TNF超家族蛋白質及特異性結合人類GITR之第二抗原結合域。TNF超家族蛋白質可置換本發明提供之任何多特異性(例如雙特異性)抗體之第一抗原結合域或第二抗原結合域。

在一種情況下，特異性結合人類OX40的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)特異性結合人類OX40之第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：(i)包含胺基酸序列GSAMH(SEQ ID NO：47)之重鏈可變域(VH)互補決定區(CDR)1；(ii)包含胺基酸序列RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：48)之VH-CDR2；(iii)包含胺基酸序列GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：49)之VH-CDR3；(iv)包含胺基酸序列RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：50)之輕鏈可變域(VL)-CDR1；(v)包含胺基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO：51)之VL-CDR2；及(vi)包含胺基酸序列MQGSKWPLT(SEQ ID NO：52)或MQALQTPLT(SEQ ID NO：53)之VL-CDR3；以及(b)第二抗原結合域。

在一種情況下，特異性結合人類OX40的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)與抗體特異性結合人類OX40之相同表位之第一抗原結合域，該抗體包含VH和VL，該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：54且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：55或56；以及(b)第二抗原結合域。

在一種情況下，特異性結合人類OX40的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)第一抗原結合域，該第一抗原結合域特異性結合人類OX40且相較於與SEQ ID NO：72之人類OX40序列之結合，表現與SEQ ID NO：72相同但存在胺基酸突變之蛋白質的減少或缺少之結合，該胺基酸突變選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A及彼等之組合，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：72；及(b)第二抗原結合域。

在一種情況下，特異性結合人類OX40的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)包含VH及VL之特異性結合人類OX40之第一抗原結合域，其中該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：54；及(b)第二抗原結合域。

在一種情況下，特異性結合人類OX40的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)包含VH及VL之特異性結合人類OX40之第一抗原結合域，其中該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56；及(b)第二抗原結合域。

在一種情況下，特異性結合人類GITR的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)第一抗原結合域；及(b)特異性結合人類GITR之第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：(i)包含胺基酸序列X₁YX₂MX₃(SEQ ID NO：87)之VH-CDR1，其中X₁為D、E或G；X₂為A或V；且X₃為Y或H；(ii)包含胺基酸序列X₁IX₂TX₃SGX₄X₅X₆YNQKFX₇X₈(SEQ ID NO：88)之VH-CDR2，其中X₁為V或L；X₂為R、K或Q；X₃為Y或F；X₄為D、E或G；X₅為V或L；X₆為T或S；X₇為K、R或Q；且X₈為D、E或G；(iii)包含胺基酸序列SGTVRGFAY(SEQ ID NO：3)之VH-CDR3；(iv)包含胺基酸序列KSSQSLLNSX₁NQKNYLX₂(SEQ ID NO：90)之VL-CDR1，其中X₁為G或S；且X₂為T或S；(v)包含胺基酸序列WASTRES(SEQ ID NO：5)之VL-CDR2；及(vi)包含胺基酸序列QNX₁YSX₂PYT(SEQ ID NO：92)之VL-CDR3，其中X₁為D或E；且X₂為Y、F或S。

在一種情況下，特異性結合人類GITR的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)第一抗原結合域；及(b)與抗體特異性結合人類GITR之相同表位之第二抗原結合域，該抗體包含VH和VL，該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：18且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：19。

在一種情況下，特異性結合人類GITR的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)第一抗原結合域；及(b)第二抗原結合域，該第二抗原結合域特異性結合人類GITR之表位，該表位包含SEQ ID NO：41之殘基60至63中至少一個胺基酸。

在一種情況下，特異性結合人類GITR的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)第一抗原結合域；及(b)第二抗原結合域，該第二抗原結合域特異性結合以下每一者：i)包含SEQ ID NO：41之殘基26至241之人類GITR及ii)石蟹獼猴GITR之變異體，該變異體包含SEQ ID NO：46之殘基26至234，其中該抗體不特異性結合包含SEQ ID NO：44之殘基26至234之石蟹獼猴GITR。

在一種情況下，特異性結合人類GITR的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)第一抗原結合域；及(b)第二抗原結合域，該第二抗原結合域特異性結合人類GITR且相較於與SEQ ID NO：41之殘基26至241之人類GITR序列之結合，表現與SEQ ID NO：41之殘基26至241相同但存在D60A或G63A胺基酸取代之蛋白質的減少或缺少之結合，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：41。

在一種情況下，特異性結合人類GITR的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)第一抗原結合域；及(b)第二抗原結合域，該第二抗原結合域特異性結合人類GITR且包含VH及VL，其中該VH包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、20、22、24 及25。

在一種情況下，特異性結合人類GITR的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含：(a)第一抗原結合域；及(b)第二抗原結合域，該第二抗原結合域特異性結合人類GITR且包含VH及VL，其中該VL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：19、21、23及26。

在一種情況下，特異性結合人類OX40的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含第二抗原結合域。在一種情況下，該第二抗原結合域特異性結合TNFR超家族蛋白質。在一種情況下，該TNFR超家族蛋白質選自由以下組成之群：GITR、OX40(例如其中該第二抗原結合域與該第一抗原結合域結合不同之OX40表位)、CD137、DR3、CD40、BAFFR、CD27及HVEM。

在一種情況下，特異性結合人類GITR的分離之多特異性(例如雙特異性)抗體包含第一抗原結合域。在一種情況下，該第一抗原結合域特異性結合TNFR超家族蛋白質。在一種情況下，該TNFR超家族蛋白質選自由以下組成之群：GITR(例如其中該第一抗原結合域與該第二抗原結合域結合不同之GITR表位)、OX40、CD137、DR3、CD40、BAFFR、CD27及HVEM。

在一種情況下，該第二抗原結合域特異性結合TNFR超家族蛋白質人類GITR。在一種情況下，該結合人類GITR之第二抗原結合域包含：(i)包含胺基酸序列X₁YX₂MX₃(SEQ ID NO：87)之VH-CDR1，其中X₁為D、E或G；X₂為A或V；且X₃為Y或H；(ii)包含胺基酸序列X₁IX₂TX₃SGX₄X₅X₆YNQKFX₇X₈(SEQ ID NO：88)之VH-CDR2，其中X₁為V或L；X₂為R、K或Q；X₃為Y或F；X₄為D、E或G；X₅為V或L；X₆為T或S；X₇為K、R或Q；且X₈為D、E或G；(iii)包含胺基酸序列SGTVRGFAY(SEQ ID NO：3)之VH-CDR3；(iv)包含胺基酸序列KSSQSLLNSX₁NQKNYLX₂(SEQ ID NO：90)之VL-CDR1，其中X₁為G或S；且X₂為T或S；(V)包含胺基酸序列WASTRES(SEQ ID NO：5)之VL-CDR2；及(vi)包含胺基酸序列QNX₁YSX₂PYT(SEQ ID NO：92)之VL-CDR3，其中X₁為D或E；且X₂為Y、F或S。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域與抗體結合人類GITR之相同表位，該抗體包含VH和VL，該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：18且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：19。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域結合人類GITR之表位，該表位包含SEQ ID NO：41之殘基60至63中至少一個胺基酸。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域結合以下每一者：i)包含SEQ ID NO：41之殘基26至241之人類GITR及ii)石蟹獼猴GITR之變異體，該變異體包含SEQ ID NO：46之殘基26至234，其中該第二抗原結合域不特異性結合包含SEQ ID NO：44之殘基26至234之石蟹獼猴GITR。在一種情況下，相較於與SEQ ID NO：41之殘基26至241之人類GITR序列的結合，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域表現與SEQ ID NO：41之殘基26至241相同但存在D60A或G63A胺基酸取代之蛋白質的減少或缺少之結合，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：41。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH及VL，其中該VH包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、20、22、24及25。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH及VL，其中該VL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：19、21、23及26。

在一種情況下，該第一抗原結合域特異性結合TNFR超家族蛋白質人類OX40。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含：(i)包含胺基酸序列GSAMH(SEQ ID NO：47)之VH-CDR1；(ii)包含胺基酸序列RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：48)之VH-CDR2；(iii)包含胺基酸序列GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：49)之VH-CDR3；(iv)包含胺基酸序列RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：50)之VL-CDR1；(v)包含胺基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO：51)之VL-CDR2；及(vi)包含胺基酸序列MQGSKWPLT(SEQ ID NO：52)或MQALQTPLT(SEQ ID NO：53)之VL-CDR3。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域與抗體結合人類OX40之相同表位，該抗體包含VH和VL，該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：54且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：55或56。在一種情況下，相較於與SEQ ID NO：72之人類OX40序列的結合，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域表現與SEQ ID NO：72相同但存在胺基酸突變之蛋白質的減少或缺少之結合，該胺基酸突變選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A及彼等之組合，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：72。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VH及VL，且該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：54。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VH及VL，且該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含：(i)包含胺基酸序列X₁YAMX₂(SEQ ID NO：1)之VH-CDR1，其中X₁為D、G或E；且X₂為Y或H；(ii)包含胺基酸序列X₁IRTYSGX₂VX₃YNQKFX₄X₅(SEQ ID NO：2)之VH-CDR2，其中X₁為V或L；X₂為D或G；X₃為T或S；X₄為K、R或Q；且X₅為D、E或G；(iii)包含胺基酸序列SGTVRGFAY(SEQ ID NO：3)之VH-CDR3；(iv)包含胺基酸序列KSSQSLLNSX₁NQKNYLT(SEQ ID NO：4)之VL-CDR1，其中X₁為G或S；(v)包含胺基酸序列WASTRES(SEQ ID NO：5)之VL-CDR2；及(vi)包含胺基酸序列QNX₁YSX₂PYT(SEQ ID NO：6)之VL-CDR3，其中X₁為D或E；且X₂為Y或F。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH-CDR1，該VH-CDR1包含選自由SEQ ID NO：7至9組成之群的胺基酸序列。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH-CDR2，該VH-CDR2包含選自由SEQ ID NO：10至13組成之群的胺基酸序列。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VL-CDR1，該VL-CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO：14或15。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VL-CDR3，該VL-CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO：16或17。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3序列，該等序列分別以SEQ ID NO：7、10及3、SEQ ID NO：8、11及3、SEQ ID NO：9、12及3、或SEQ ID NO：9、13及3示出；及/或VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3序列，該等序列分別以SEQ ID NO：14、5及16或SEQ ID NO：15、5及17示出。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含分別以SEQ ID NO：7、10、3、14、5及16示出之VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、 VL-CDR2及VL-CDR3序列。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH，該VH包含以SEQ ID NO：25示出之胺基酸序列。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH，該VH包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：18、20、22及24。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH，該VH包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、20、22及24。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH，該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：18。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含選自由SEQ ID NO：29至36組成之群的胺基酸序列。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含選自由SEQ ID NO：74至81組成之群的胺基酸序列。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：31。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：76。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：32。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：34。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：79。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：35。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：80。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH，該VH包含源自於人類IGHV1-2生殖系序列之胺基酸序列。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VL，該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：26。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VL，該VL包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：19、21及23。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VL，該VL包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：19、21及23。在一種情況下，該特異性結合人類 GITR之第二抗原結合域包含VL，該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：19。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含輕鏈，該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含輕鏈，該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：38。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VL，該VL包含源自於人類IGKV4-1生殖系序列之胺基酸序列。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH及VL序列，該等序列分別以SEQ ID NO：18及19、SEQ ID NO：20及21、SEQ ID NO：22及23或SEQ ID NO：24及23示出。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含VH和VL，該VH包含以SEQ ID NO：18示出之序列且該VL包含以SEQ ID NO：19示出之序列。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：31且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：76且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：32且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：77且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：34且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：79且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：35且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：80且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：29且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：74且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR 之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：30且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：75且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：37。

在一種情況下，該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區具有源自於人類IGHV1-2生殖系序列之胺基酸序列且該輕鏈可變區具有源自於人類IGKV4-1生殖系序列之胺基酸序列。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VH，該VH包含與胺基酸序列SEQ ID NO：54至少75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VH，該VH包含胺基酸序列SEQ ID NO：54。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含選自由SEQ ID NO：59至66組成之群的胺基酸序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含選自由SEQ ID NO：118至125組成之群的胺基酸序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：61。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：120。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：62。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：121。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：64。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：123。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：65。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：124。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VH，該VH包含源自於人類IGHV3-73生殖系序列之胺基酸序列。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VL，該VL包含與胺基酸序列SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56至少75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VL-CDR3，該VL- CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO：52。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VL，該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：55。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含輕鏈，該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含輕鏈，該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：68。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VL-CDR3，該VL-CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO：53。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VL，該VL包含胺基酸序列SEQ ID NO：56。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含輕鏈，該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含輕鏈，該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：70。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VL，該VL包含源自於人類IGKV2-28生殖系序列之胺基酸序列。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含分別以SEQ ID NO：54及55或SEQ ID NO：54及56示出之VH及VL序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：59且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：118且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：64且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：123且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：65且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：124且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：61且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：120且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：62且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：121且該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含VH和VL，該VH包含源自於人類IGHV3-73生殖系序列之胺基酸序列且該VL包含源自於人類IGKV2-28生殖系序列之胺基酸序列。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：54示出之VH序列及以SEQ ID NO：55或56示出之VL序列，且該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：18示出之VH序列及以SEQ ID NO：19示出之VL序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：59示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：29示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：118示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且其中該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：74示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：61示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：31示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：120示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且其中該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：76示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：62示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：32示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：121示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且其中該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：77示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：64示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：34示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：123示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且其中該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：79示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：65示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：35示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：124示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：67或69示出之輕鏈序列，且其中該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含以SEQ ID NO：80示出之重鏈序列及以SEQ ID NO：37示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：67示出之輕鏈序列。在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含以SEQ ID NO：69示出之輕鏈序列。

在一種情況下，該特異性結合人類OX40之第一抗原結合域包含源自於人類IGHV3-73生殖系序列之VH及源自於人類IGKV2-28生殖系序列之VL，且該特異性結合人類GITR之第二抗原結合域包含源自於人類 IGHV1-2生殖系序列之VH及源自於人類IGKV4-1生殖系序列之VL。

在一種情況下，該抗體為κ-λ體、雙親和重靶向分子(DART)、杵入臼型抗體、股交換工程改造結構域體(SEED體)或雙特異性抗體DuoBody^®抗體(Genmab A/S)。

在一種情況下，該第一抗原結合域包含選自由以下組成之群的重鏈恆定區：人類IgG₁、人類IgG₂、人類IgG₃、人類IgG₄、人類IgA₁及人類IgA₂，且該第二抗原結合域包含選自由以下組成之群的重鏈恆定區：人類IgG₁、人類IgG₂、人類IgG₃、人類IgG₄、人類IgA₁及人類IgA₂。在一種情況下，該第一抗原結合域之重鏈恆定區為人類IgG₁，且該第二抗原結合域之重鏈恆定區為人類IgG₁。

在一種情況下，(a)該第一抗原結合域包含第一重鏈恆定區，該第一重鏈恆定區包含F405L胺基酸突變；且(b)該第二抗原結合域包含第二重鏈恆定區，該第二重鏈恆定區包含K409R胺基酸突變，該等胺基酸編號係根據EU編號系統。在一種情況下，(a)該第一抗原結合域包含第一重鏈恆定區，該第一重鏈恆定區包含K409R胺基酸突變；且(b)該第二抗原結合域包含第二重鏈恆定區，該第二重鏈恆定區包含F405L胺基酸突變，該等胺基酸編號係根據EU編號系統。在一種情況下，該第一抗原結合域之重鏈恆定區為IgG₁。在一種情況下，該第二抗原結合域之重鏈恆定區為IgG₁。

在一種情況下，該第一抗原結合域包含選自由人類IgG_κ及IgG_λ組成之群的輕鏈恆定區，且該第二抗原結合域包含選自由人類IgG_κ及IgG_λ組成之群的輕鏈恆定區。

在一種情況下，相較於與SEQ ID NO：41之殘基26至241之人類GITR序列的結合，該第二抗原結合域表現與SEQ ID NO：41之殘基26至241相同但存在D60A胺基酸取代之蛋白質的減少或缺少之結合，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：41。在一種情況下，相較於與SEQ ID NO：41之殘基26至241之人類GITR序列的結合，該第二抗原結合域表現與SEQ ID NO：41之殘基26至241相同但存在G63A胺基酸取代之蛋白質的減少或缺少之結合，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：41。在一種情況下，該結合人類GITR之第二抗原結合域結合選自由SEQ ID NO：41之殘基60、62及63組成之群的至少一個殘基。在一種情況下，該結合人類GITR之第二抗原結合域結合選自由SEQ ID NO：41之殘基62及63組成之群的至少一個殘基。在一種情況下，該結合人類GITR之第二抗原結合域結合選自由SEQ ID NO：41之殘基60及63組成之群的至少一個殘基。在一種情況下，該結合人類GITR之第二抗原結合域結合包含SEQ ID NO：41之殘基 60至63之表位。

在一種情況下，該抗體(i)相較於結合人類GITR且與該結合人類GITR之第二抗原結合域含有相同之VH及VL的單特異性二價抗體，顯示與表現人類GITR及人類OX40之細胞增加的結合；及/或(ii)相較於結合人類OX40且與該結合人類OX40之第一抗原結合域含有相同之VH及VL的單特異性二價抗體，顯示與表現人類GITR及人類OX40之細胞增加的結合。

在一種情況下，該抗體(i)相較於結合人類GITR且與該結合人類GITR之第二抗原結合域含有相同之VH及VL的單特異性二價抗體，顯示與GITR陽性、OX40陰性細胞減少之結合；及/或(ii)相較於結合人類OX40且與該結合人類OX40之第一抗原結合域含有相同之VH及VL的單特異性二價抗體，顯示與GITR陰性、OX40陽性細胞減少之結合。

在一種情況下，該抗體(i)相較於結合人類GITR且與該結合人類GITR之第二抗原結合域含有相同之VH及VL的單特異性二價抗體，誘導對調節性T細胞更強之自然殺手細胞介導之細胞毒性；及/或(ii)相較於結合人類OX40且與該結合人類OX40之第一抗原結合域含有相同之VH及VL的單特異性二價抗體，誘導對調節性T細胞更強之自然殺手細胞介導之細胞毒性。

在一種情況下，該抗體抑制人類GITR配體與人類GITR結合。在一種情況下，該抗體抑制人類OX40配體與人類OX40結合。

在一種情況下，該抗體當結合經活化之調節性T細胞時與選自由CD16、CD32A及CD64組成之群的活化性Fcγ受體之結合程度大於該抗體當結合經活化之效應T細胞時與選自由CD16、CD32A及CD64組成之群的活化性Fcγ受體之結合程度。在一種情況下，該活化性Fcγ受體表現於選自由骨髓衍生之效應細胞及淋巴球衍生之效應細胞組成之群的細胞上。

在一種情況下，該抗體對人類GITR及/或人類OX40具有促效性。在一種情況下，該抗體誘導、活化或增強人類GITR之活性。在一種情況下，該抗體誘導、活化或增強人類OX40之活性。

在一種情況下，該第一抗原結合域包含人類IgG₁重鏈恆定區，該人類IgG₁重鏈恆定區包含N297A突變或N297Q突變及/或該第二抗原結合域包含人類IgG₁重鏈恆定區，該人類IgG₁重鏈恆定區包含N297A突變或N297Q突變，該等胺基酸編號係根據EU編號系統。

在一種情況下，該抗體對人類GITR及/或人類OX40具有拮抗性。在一種情況下，該抗體去活化、降低或抑制人類GITR之活性。在一種情況下，該抗體去活化、降低或抑制人類OX40之活性。在一種情況下，該抗體抑制或減少人類GITR信號傳導。在一種情況下，該抗體抑制或減少人類OX40信號傳導。在一種情況下，該抗體抑制或減少由人類GITR配體誘導之人類GITR信號傳導。在一種情況下，該抗體抑制或減少由人類OX40配體誘導之人類OX40信號傳導。

在一種情況下，該抗體減少由來自類風濕性關節炎患者之滑液誘導之CD4+ T細胞增殖。在一種情況下，該抗體增加接受人類PBMC移植之NOG小鼠之存活率。在一種情況下，該抗體增加GVHD模型中調節性T細胞之增殖。

在一種情況下，該抗體進一步包含可偵測之標記。

本發明亦提供組合物。在一種情況下，該組合物包含(i)編碼本發明提供之抗體之第一抗原結合片段之輕鏈可變區或輕鏈之核酸分子；(ii)編碼本發明提供之抗體之第一抗原結合片段之重鏈可變區或重鏈之核酸分子；(iii)編碼本發明提供之抗體之第二抗原結合片段之輕鏈可變區或輕鏈之核酸分子；及(iv)編碼本發明提供之抗體之第二抗原結合片段之重鏈可變區或重鏈之核酸分子。

本發明亦提供宿主細胞。在一種情況下，宿主細胞包含(i)編碼本發明提供之抗體之第一抗原結合片段之輕鏈可變區或輕鏈之核酸分子；(ii)編碼本發明提供之抗體之第一抗原結合片段之重鏈可變區或重鏈之核酸分子；(iii)編碼本發明提供之抗體之第二抗原結合片段之輕鏈可變區或輕鏈之核酸分子；及(iv)編碼本發明提供之抗體之第二抗原結合片段之重鏈可變區或重鏈之核酸分子。在一種情況下，該宿主細胞係選自由以下組成之群：大腸桿菌、假單孢菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、鏈黴菌(Streptomyces)、酵母菌、CHO、YB/20、NS0、PER-C6、HEK-293T、NIH-3T3、HeLa、BHK、Hep G2、SP2/0、R1.1、B-W、L-M、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40、BMT10細胞、植物細胞、昆蟲細胞及組織培養之人類細胞。本發明亦提供製備結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體之方法。在一種情況下，該方法包括培養本發明提供之宿主細胞以使該等核酸分子表現且產生該抗體。

本發明亦提供使用與GITR及/或OX40結合之多特異性(例如雙特異性)抗體之方法。在一種情況下，在樣品中偵測表現GITR及OX40之細胞的方法包括使該樣品與本發明提供之抗體接觸。

本發明亦提供醫藥組合物。在一種情況下，該醫藥組合物包含本發明提供之抗體及醫藥學上可接受之賦形劑。

本發明亦提供套組。在一種情況下，該套組包含本發明提供之抗體或醫藥組合物及a)偵測試劑、b)GITR及/或OX40抗原、c)反映批准用於人類投藥之使用或銷售的註記或d)彼等之組合。

本發明亦提供使用本發明提供之抗體及醫藥組合物之方法。在一種情況下，調節個體之免疫反應的方法包含對該個體投予有效量之本發明提供之抗體或醫藥組合物。在一種情況下，用於增強或誘導個體之免疫反應的方法包含對該個體投予有效量之本發明提供之抗體或醫藥組合物。

在一種情況下，治療個體之癌症的方法包含對該個體投予有效量之本發明提供之抗體或醫藥組合物。在一種情況下，該癌症選自由黑素瘤、腎癌、前列腺癌、結腸癌及肺癌組成之群。在一種情況下，該方法進一步包含對該個體投予吲哚胺-2,3-二氧化酶(IDO)之抑制劑。在一種情況下，該抑制劑為埃帕多塔(epacadostat)。在一種情況下，該抑制劑為F001287。在一種情況下，該抑制劑為吲哚西莫(indoximod)。在一種情況下，該抑制劑為NLG919。在一種情況下，該方法進一步包含對該個體投予疫苗。在一種情況下，該疫苗包含熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)，該HSPPC包含與抗原肽複合之熱休克蛋白。在一種情況下，該熱休克蛋白為hsp70或hsc70且與腫瘤相關抗原肽複合。在一種情況下，該熱休克蛋白為gp96蛋白且與腫瘤相關抗原肽複合，其中該HSPPC源自於自個體獲得之腫瘤。在一種情況下，該方法進一步包含對該個體投予查核點靶向劑。在一種情況下，該查核點靶向劑選自由以下組成之群：拮抗劑抗PD-1抗體、拮抗劑抗PD- L1抗體、拮抗劑抗PD-L2抗體、拮抗劑抗CTLA-4抗體、拮抗劑抗TIM-3抗體、拮抗劑抗LAG-3抗體、拮抗劑抗CEACAM1抗體、促效劑抗GITR抗體及促效劑抗OX40抗體。

在一種情況下，治療感染性疾病之方法包含對該個體投予有效量之本發明提供之抗體或醫藥組合物。

在一種情況下，減少或抑制個體之免疫反應的方法包含對該個體投予有效量之本發明提供之抗體或醫藥組合物。

在一種情況下，治療個體之自體免疫性或發炎性疾病或病症的方法包含對該個體投予有效量之本發明提供之抗體或醫藥組合物。在一種情況下，該自體免疫性或發炎性疾病或病症係選自由以下組成之群：移植排斥反應、移植物抗宿主病、血管炎、氣喘、類風濕性關節炎、皮炎、發炎性腸病、葡萄膜炎、狼瘡、結腸炎、糖尿病、多發性硬化及氣管發炎。

在一種情況下，該個體為人類。

圖1A及1B：圖1A為一組直方圖，該等直方圖顯示在來自子宮內膜癌腫瘤組織、腎細胞癌(RCC)腫瘤組織及非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤組織之腫瘤內效應T細胞(Teff：CD4+ CD127+ CD25+/- FOXP3-)及調節性T細胞 (Treg：CD4+ CD127- CD25+ FOXP3+)上GITR及OX40之表現。圖1B為一組條形圖，該等條形圖顯示在來自卵巢癌腫瘤組織、結腸直腸癌(CRC)腫瘤組織、子宮內膜癌腫瘤組織、RCC腫瘤組織及NSCLC腫瘤組織之Treg及Teff細胞之表面上GITR受體及OX40受體之預測數目。

圖2A、2B及2C為顯示測試抗體與共表現GITR及OX40之活化之Hut102細胞(圖2A)、表現GITR之Jurkat細胞(圖2B)及表現OX40之Jurkat細胞(圖2C)之結合的圖表。繪製平均螢光強度(MFI)對抗體濃度範圍之曲線。所使用之測試抗體為DuoBody pab1876×pab2049(圖2A至2C)、二價單特異性抗體pab1876(圖2A及2B)、二價單特異性抗體pab2049(圖2A及2C)、DuoBody pab1876×同型(圖2A)、DuoBody pab2049×同型(圖2A)及同型對照抗體(圖2A至2C)。

圖3A為一組直方圖，該等直方圖顯示在活化之自然調節性T(nTreg)細胞上GITR及OX40之表現。圖3B為報導子分析之結果，其中檢驗測試抗體在當該等抗體結合活化之nTreg時活化表現FcγRIIIA^V158之報導細胞株的能力。所使用之測試抗體為DuoBody pab1876×pab2049、二價單特異性抗體pab1876、二價單特異性抗體pab2049及同型對照抗體。將相對光單位(RLU)相對於經所測試之最高濃度之同型對照抗體處理之樣品之RLU值正規化且繪製對抗體濃度之劑量滴定曲線。圖3C及3D 為類似之報導子分析之結果，其中檢驗測試抗體在當該等抗體結合表現GITR之Jurkat細胞(圖3C)或表現OX40之Jurkat細胞(圖3D)時活化表現FcγRIIIAV158之報導細胞的能力。所使用之測試抗體為DuoBody pab1876×pab2049、二價單特異性抗體pab1876(F405L/F405L)、二價單特異性抗體pab2049(K409R/K409R)及同型對照抗體。繪製RLU對抗體濃度範圍的曲線。圖3E、3F、及3G為量測在同型對照抗體、pab1876、pab2049、DuoBody pab1876×pab2049、或pab1876與pab2049之組合存在下活化之效應T細胞或活化之Treg之NK細胞介導之裂解的分析結果。圖3E為一對直方圖，該等直方圖顯示藉由流動式細胞量測術所量測之活化之效應T細胞或Treg上GITR(左側)或OX40(右側)之表現。在圖3F及3G中，繪製細胞毒性%對抗體濃度之滴定曲線。

圖4A及4B為描繪在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激後DuoBody pab1876×pab2049對來自兩個供者之原生人類T細胞之功能活性的圖表。繪製在DuoBody pab1876×pab2049、DuoBody pab2049×同型及同型對照抗體之劑量滴定下IL-2之濃度曲線。

圖5A及5B：圖5A為報導子分析之結果，其中測試DuoBody pab1876×pab2049、三聚體GITRL及同型對照抗體活化Jurkat-huGITR-NF-κB-螢光素酶報導細胞之能力。繪製相對光單位(RLU)對抗體或GITRL濃度範圍之曲線。圖5B為報導子分析之結果，其中檢驗DuoBody pab1876×pab2049及同型對照抗體阻斷GITRL誘導之NF-κB信號傳導之能力。在該報導子分析中，將Jurkat-huGITR-NF-κB-螢光素酶報導細胞與DuoBody pab1876×pab2049或同型對照抗體一起預培育，之後由三聚體GITRL活化。顯示在抗體濃度之劑量滴定存在下之GITRL活性%。

圖6A及6B：圖6A描繪由多聚體OX40L、DuoBody pab1876×pab2049或同型對照抗體觸發之Jurkat-huOX40-NF-κB-螢光素酶報導細胞之NF-κB-螢光素酶信號。繪製RLU對OX40L或抗體濃度之劑量滴定曲線。圖6B為報導子分析之結果，其中將Jurkat-huOX40-NF-κB-螢光素酶報導細胞與DuoBody pab1876×pab2049或同型對照抗體一起預培育，之後由多聚體OX40L活化。繪製OX40L活性%對抗體濃度範圍之曲線。

圖7為直方圖，該直方圖顯示當將生物素化之GITR(GITR-bio)與嵌合親本231-32-15、pab1875或pab1876抗體一起預培育時，表現嵌合親本231-32-15抗體之1624-5前B細胞與GITR-bio之結合損失。圖7右側曲線描繪表現嵌合親本231-32-15抗體之1624-5前B細胞與GITR-bio之結合。然而，在左側曲線中，在將GITR-bio與嵌合親本231-32-15、pab1875或pab1876抗體一起預培育後，表現嵌合親本231-32-15抗體之1624-5 細胞與GITR-bio之結合損失。

圖8顯示藉由表面電漿共振(BIAcore^® T100/200)所量測之表位競爭分析的結果。將GITR抗原固定在CM5感應器晶片上且以300nM之濃度施加抗GITR抗體。首先施加嵌合親本231-32-15抗體，繼而施加鼠類抗體6C8。

圖9A及9B為使用表現由易錯PCR產生之GITR變異體之細胞庫的表位定位實驗之結果。圖9A及9B顯示結合多株抗GITR抗體但不結合抗GITR嵌合親本231-32-15抗體之GITR變異體的序列比對。

圖10A及10B為使用丙胺酸掃描之表位定位實驗之結果。分別使人類GITR之下列位置(根據SEQ ID NO：41編號)突變成丙胺酸：P28A、T29A、G30A、G31A、P32A、T54A、T55A、R56A、C57A、C58A、R59A、D60A、Y61A、P62A、G63A、E64A、E65A、C66A、C67A、S68A、E69A、W70A、D71A、C72A、M73A、C74A、V75A及Q76A。圖10A所示之實驗所測試之抗體包括：單株抗GITR抗體pab1876、pab1967、pab1975、pab1979及m6C8以及多株抗GITR抗體(AF689，R&D systems公司)。圖10A為彙總pab1876、pab1967、pab1975、pab1979及參考抗體m6C8與表現人類GITR丙胺酸突變體之1624-5細胞結合的表。圖10B為一組流動式細胞量測術圖，該等圖顯示使用單株抗體 231-32-15、pab1876或m6C8或多株抗體對表現野生型人類GITR、D60A突變體或G63A突變體之1624-5細胞的染色。在各圖中表示GITR陽性細胞之百分比。

圖11A為突顯位置62及63之人類GITR、V1M石蟹獼猴GITR及V1M/Q62P/S63G石蟹獼猴GITR之序列比對，在該等位置處來自石蟹獼猴GITR之兩個胺基酸(GlnSer)經人類GITR之對應殘基(ProGly)置換。圖11B為一組流動式細胞量測術圖，該等圖顯示使用單株抗體231-32-15、pab1876或m6C8或多株抗GITR抗體對表現人類GITR、V1M石蟹獼猴GITR或V1M/Q62P/S63G石蟹獼猴GITR之1624-5細胞的染色。

圖12為彙總單株抗OX40抗體pab1949w、pab2049及pab1928與表現人類OX40丙胺酸突變體之1624-5細胞結合之表。

本發明提供特異性結合GITR(例如人類GITR)及/或OX40(例如人類OX40)之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。

舉例而言，本發明提供之多特異性(例如雙特異性)抗體可含有結合OX40之第一抗原結合域、及第二抗原結合域。該第二抗原結合域可不同於該第一抗原結合域。該第二抗原結合域可與該第一抗原結合域結合不同之抗原(亦即不為OX40之抗原)。該第二抗原結合域可與該第一抗原結合域結合不同之表位。在一種情況下，本發明提供之抗體含有特異性結合OX40(例如人類OX40)之第一抗原結合域及特異性結合TNFR超家族蛋白質之第二抗原結合域。該TNFR超家族蛋白質可為例如GITR、OX40、CD137、DR3、CD40、BAFFR、CD27或HVEM。在一種情況下，本發明提供之抗體含有特異性結合OX40(例如人類OX40)之第一抗原結合域及特異性結合GITR(例如人類GITR)之第二抗原結合域。

在另一個實施例中，本發明提供之抗體可含有第一抗原結合域及結合GITR之第二抗原結合域。該第一抗原結合域可不同於該第二抗原結合域。該第一抗原結合域可與該第一抗原結合域結合不同之抗原(亦即不為GITR之抗原)。該第二抗原結合域可與該第一抗原結合域結合不同之表位。在一種情況下，本發明提供之抗體含有特異性結合TNFR超家族蛋白質之第一抗原結合域及特異性結合GITR(例如人類GITR)之第二抗原結合域。該TNFR超家族蛋白質可為例如GITR、OX40、CD137、DR3、CD40、BAFFR、CD27或HVEM。在另一個實施例中，本發明提供之抗體含有結合OX40之第一抗原結合域及結合GITR之第二抗原結合域。在一種情況下，本發明提供之抗體含有特異性結合OX40(例如人類OX40)之第一抗原結合域及特異性結合GITR(例如人類GITR)之第二抗原結合域。

本發明亦提供包含特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域及TNF超家族蛋白質之抗體。該等抗體可結合表現OX40(例如人類OX40)及TNF超家族蛋白質受體的細胞。本發明亦提供包含TNF超家族蛋白質及特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域的抗體。該等抗體可結合表現TNF超家族蛋白質受體及GITR(例如人類GITR)的細胞。該TNF超家族蛋白質可為例如GITR配體、OX40配體、CD137配體、DR3配體、CD40配體、BAFFR配體、CD27配體或HVEM配體。TNF超家族蛋白質可置換本發明提供之任何多特異性(例如雙特異性)抗體之第一抗原結合域或第二抗原結合域。

在一個態樣中，本發明提供一種特異性結合GITR及OX40且增強、誘導或增加一或多種GITR及/或OX40活性之多特異性(例如雙特異性)抗體。在另一個態樣中，本發明提供一種特異性結合GITR及OX40且降低、抑制或減少一或多種GITR或OX40活性之多特異性(例如雙特異性)抗體。在一個特定具體實例中，該抗體經分離。

亦提供編碼該等抗體之分離之核酸(聚核苷酸)，諸如互補DNA(cDNA)。進一步提供載體(例如表現載體)及細胞(例如宿主細胞)，其包含編碼該等抗體之核酸(聚核苷酸)。亦提供製備該等抗體之方法。在其他態樣中，本發明提供誘導、增加或增強GITR及/或OX40活性及治療某些病況(諸如癌症)之方法及用途。進一步提供抑制、減少或降低GITR及/或OX40活性及治療某些病況(諸如發炎性或自體免疫性疾病及病症)之方法及用途。亦提供相關組合物(例如醫藥組合物)、套組及偵測方法。

7.1 術語

如本文所用之術語「約」及「大致」在用於修飾數值或數值範圍時表明比該值或範圍高5%至10%及低5%至10%之偏差仍在所述值或範圍之預期含義內。

如本文所用，若例如在既定實驗中，或使用來自多次實驗之平均值，B實質上隨A在指定範圍內增加而增加，則B為在A值之指定範圍內A之「實質上遞增函數」。此定義允許對應於A之指定值的B之值相對於對應於A之任何下限值之B的值低至多1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%或20%。

如本文所用，若例如在既定實驗中，或使用來自多次實驗之平均值，B實質上隨A在指定範圍內增加而減少，則B為在A值之指定範圍內A之「實質上遞減函數」。此定義允許對應於A之指定值的B之值相對於對應於A之任何下限值之B的值高至多1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%或20%。

如本文所用之術語「抗體(antibody)」及「抗體(antibodies)」為此技術之術語且在本文可互換使用且係指具有特異性結合抗原之抗原結合位點的分子。

抗體可包括例如單株抗體、重組產生之抗體、人類抗體、人類化抗體、表面重整抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚體抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、內抗體、異源結合抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)、駱駝化抗體、親和體、Fab片段、F(ab')₂片段、二硫鍵連接之Fv(sdFv)、抗遺傳型(抗Id)抗體(包括例如抗抗Id抗體)、雙特異性抗體及多特異性抗體。在某些具體實例中，本文所述之抗體係指多株抗體群體。抗體可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何類別(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂)或任何子類(例如IgG_2a或IgG_2b)之免疫球蛋白分子。在某些具體實例中，本文所述之抗體為IgG抗體或其類別(例如人類IgG₁、IgG₂或IgG₄)或子類。在一個特定具體實例中，該抗體為人類化單株抗體。在另一個特定具體實例中，該抗體為人類單株抗體，例如其為免疫球蛋白。在某些具體實例中，本文所述之抗體為IgG₁、IgG₂或IgG₄抗體。

「多特異性」抗體為具有至少兩個不同之抗原結合位點的抗體。多特異性抗體包括含有兩個不同抗原結合位點(不包括Fc區)之雙特異性抗體。多特異性抗體可包括例如重組產生之抗體、人類抗體、人類化抗體、表面重整抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚體抗體、抗體輕鏈單體、異源結合抗體、連接之單鏈抗體或連接之單鏈Fv(scFv)、駱駝化抗體、親和體、連接之Fab片段、F(ab')₂片段、化學連接之Fv及二硫鍵連接之Fv(sdFv)。多特異性抗體可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何類別(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂)或任何子類(例如IgG_2a或IgG_2b)之免疫球蛋白分子。在某些具體實例中，本文所述之多特異性抗體為IgG抗體或其類別(例如人類IgG₁、IgG₂或IgG₄)或子類。

如本文所用之術語「抗原結合域」、「抗原結合區」、「抗原結合位點」及類似術語係指抗體分子所包含賦予該抗體分子以對抗原之特異性的胺基酸殘基(例如互補決定區(CDR))之部分。抗原結合區可源自於任何動物物種，諸如囓齒類動物(例如小鼠、大鼠或倉鼠)及人類。

如本文所用之術語「抗GITR/OX40」抗體係指含有結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域及結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。

如本文所用之術語「可變區」或「可變域」可互換使用且為此技術常見的。可變區通常係指抗體之一部分，一般為輕鏈或重鏈之一部分，其通常為成熟重鏈之約胺基末端110至125個胺基酸及成熟輕鏈之約90至115個胺基酸，其在序列上在抗體之間廣泛不同且用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列變異性集中在稱作互補決定區(CDR)之彼等區域中，而可變域中較高度保守之區域係稱作構架區(FR)。不希望受任何特定機制或理論所束縛，咸信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之相互作用及特異性。在某些具體實例中，可變區為人類可變區。在某些具體實例中，可變區包含囓齒類動物或鼠類CDR及人類構架區(FR)。在特定具體實例中，可變區為靈長類動物(例如非人類靈長類動物)可變區。在某些具體實例中，可變區包含囓齒類動物或鼠類CDR及靈長類動物(例如非人類靈長類動物)構架區(FR)。

術語「VL」及「VL結構域」可互換使用以指抗體之輕鏈可變區。

術語「VH」及「VH結構域」可互換使用以指抗體之重鏈可變區。

術語「Kabat編號」及類似術語為此技術公認且係指對抗體之重鏈及輕鏈可變區或其抗原結合部分之胺基酸殘基進行編號之系統。在某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統確定(參見例如Kabat EA及Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190：382-391；及Kabat EA等人， (1991)《免疫學相關蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第五版，美國衛生及人類服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版號：91-3242)。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子之CDR通常存在於胺基酸位置31至35處，其視情況可在35後包括一或兩個額外之胺基酸(在Kabat編號方案中稱作35A及35B)(CDR1)；胺基酸位置50至65處(CDR2)；及胺基酸位置95至102處(CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子之CDR通常存在於胺基酸位置24至34處(CDR1)；胺基酸位置50至56處(CDR2)；及胺基酸位置89至97處(CDR3)。在一個特定具體實例中，本文所述之抗體之CDR已根據Kabat編號方案。

如本文所用之術語「恆定區」或「恆定域」為可互換的且具有此技術常見之含義。恆定區為抗體部分，例如輕鏈及/或重鏈之羧基末端部分，其不直接參與抗體與抗原之結合但可表現出各種效應功能，諸如與Fc受體相互作用。相對於免疫球蛋白可變域，免疫球蛋白分子之恆定區一般具有較保守之胺基酸序列。

如本文所用之術語「重鏈」在用於提及抗體時可指基於恆定域之胺基酸序列之任何不同類型，例如α、δ、ε、γ及μ，其分別產生IgA、IgD、IgE、IgG及IgM類別之抗體，包括IgG之子類，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃及IgG₄。

如本文所用之術語「輕鏈」在用於提及抗體時可指基於恆定域之胺基酸序列的任何不同類型，例如κ或λ。輕鏈胺基酸序列為此技術所習知。在特定具體實例中，輕鏈為人類輕鏈。

如本文所用之術語「EU編號系統」係指用於抗體之恆定區之EU編號慣例，如Edelman,G.M.等人，Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)；及Kabat等人，《免疫學相關蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，美國衛生及人類服務部，第5版，1991中所述，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。

「結合親和力」一般指分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合伴(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如抗體及抗原)之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其伴Y之親和力可一般由解離常數(K_D)表示。親和力可以此技術習知之許多方式量測及/或表示，該等方式包括(但不限於)平衡解離常數(K_D)及平衡締合常數(K_A)。K_D係由k_解離/k_締合之商數計算，而K_A係由k_締合/k_解離之商數計算。k_締合係指例如抗體與抗原之締合速率常數，且k_解離係指例如抗體與抗原之解離。k_締合及k_解離可藉由一般技術者已知之技術(諸如BIAcore^®或KinExA)測定。

如本文所用之「保守胺基酸取代」為其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基所置換的胺基酸取代。具有側鏈之胺基酸殘基之家族已在此技術中加以定義。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電荷之極性側鏈的胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β-分支鏈側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。在某些具體實例中，抗體之CDR內或構架區內之一或多個胺基酸殘基可經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。

如本文所用之「表位」為此技術之術語且係指抗原之可由抗體特異性結合之局部區域。表位可為例如多肽之連續胺基酸(線性或連續表位)或表位可例如自一個多肽或多個多肽之兩個或多於兩個非連續區域會合在一起(構形、非線性、不連續或非連續表位)。在某些具體實例中，與抗體結合之表位可藉由例如NMR光譜學、X射線繞射結晶學研究、ELISA分析、氫/氘交換聯同質譜分析(例如液相層析電噴霧質譜分析)、基於陣列之寡肽掃描分析及/或突變誘發定位(例如定點突變誘發定位)確定。對於 X射線結晶學，結晶可使用此技術已知方法中任一者來實現(例如Giegé R等人，(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303)。抗體：抗原晶體可使用習知之X射線繞射技術來研究且可使用電腦軟體來精修，該電腦軟體諸如X-PLOR(耶魯大學(Yale University),1992，由Molecular Simulations公司經銷；參見例如Meth Enzymol(1985)第114卷及第115卷，Wyckoff HW等人編；U.S.2004/0014194)及BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1)：37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423,Carter CW編；Roversi P等人(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10)：1316-1323)。突變誘發定位研究可使用熟習此技術者已知之任何方法來實現。參見例如Champe M等人，(1995)J Biol Chem 270：1388-1394；及Cunningham BC及Wells JA(1989)Science 244：1081-1085中對包括丙胺酸掃描突變誘發技術之突變誘發技術之描述。在一個特定具體實例中，抗體之表位係使用丙胺酸掃描突變誘發研究來確定。

如本文所用之術語「免疫特異性結合」、「免疫特異性識別」、「特異性結合」及「特異性識別」在抗體之背景下為類似術語且係指結合抗原(例如表位或免疫複合物)之分子，因為該結合係由熟習此技術者所理解。舉例而言，特異性結合抗原之分子可一般以較低之親和力結合其他肽或多肽，如藉由例如免疫分析、BIAcore^®、KinExA 3000儀器(愛達荷州波夕之Sapidyne Instruments公司)或此技術已知之其他分析所測定。在一個特定具體實例中，免疫特異性結合抗原之分子結合該抗原之K_A比該等分子非特異性結合另一抗原時之K_A大至少2倍log、2.5倍log、3倍log、4倍log或大於4倍log。在多特異性(例如雙特異性)抗體之背景下，術語「免疫特異性結合」、「免疫特異性識別」、「特異性結合」及「特異性識別」係指對多於一個抗原或對單個抗原上之多於一個表位具有不同特異性之抗體。舉例而言，雙特異性抗體可例如以不同之抗原結合域特異性結合例如人類OX40及人類GITR中每一者。

在另一個特定具體實例中，免疫特異性結合抗原之抗原結合域在相似之結合條件下不與其他蛋白質交叉反應。在另一個特定具體實例中，免疫特異性結合GITR抗原之抗原結合域不與其他非GITR蛋白質交叉反應。在另一個特定具體實例中，免疫特異性結合OX40抗原之抗原結合域不與其他非OX40蛋白質交叉反應。在一個特定具體實例中，本發明提供一種含有抗原結合域之抗體，相較於對另一無關抗原之親和力，該抗原結合域以較高之親和力結合GITR或OX40。在某些具體實例中，本發明提供一種含有抗原結合域之抗體，該抗原結合域結合GITR或OX40(例如人類GITR或人類OX40)之親和力比對另一無關抗原之親和力高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或高於95%，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿共振或動力學排除分析所量測。在一個特定具體實例中，本文所述之抗GITR抗原結合域與無關非GITR蛋白質之結合程度小於該抗原結合域與GITR蛋白質之結合的10%、15%或20%，如藉由例如放射免疫分析所量測。在一個特定具體實例中，本文所述之抗OX40抗原結合域與無關非OX40蛋白質之結合程度小於該抗原結合域與OX40蛋白質之結合的10%、15%或20%，如藉由例如放射免疫分析所量測。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種抗體，該抗體含有結合人類GITR之親和力高於對另一種GITR之親和力的抗原結合域及/或結合人類OX40之親和力高於對另一種OX40之親和力的抗原結合域。在某些具體實例中，本發明提供含有抗原結合域之抗體，該抗原結合域結合人類GITR之親和力比對另一種GITR之親和力高5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或高於70%，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿共振或動力學排除分析所量測；及/或結合人類OX40之親和力比對另一種OX40之親和力高5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或高於70%，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿共振或動力學排除分析所量測。在一個特定具體實例中，本文所述之結合人類GITR及人類OX40之抗體與另一種GITR及/或OX40蛋白質之結合將小於該抗體與人類GITR及/或OX40蛋白質之結合的10%、15%或20%，如藉由例如放射免疫分析、表面電漿共振或動力學排除分析所量測。

如本文所用之術語「糖皮質素誘導TNFR家族相關受體」或「GITR」或「GITR多肽」係指GITR，其包括(但不限於)天然GITR、GITR之同功型或GITR之種間GITR同源物。GITR亦稱為活化誘導型TNFR家族受體(AITR)、GITR-D、CD357及腫瘤壞死因子受體超家族成員18(TNFRSF18)。GenBank^TM登錄號BC152381及BC152386提供人類GITR核酸序列。Swiss-Prot登錄號Q9Y5U5-1(TNR18_HUMAN；SEQ ID NO：41)及GenBank^TM登錄號NP_004186提供同功型1之例示性人類GITR胺基酸序列。此胺基酸序列具有241個胺基酸之長度，前25個胺基酸殘基編碼信號序列。同功型1為I型膜蛋白。人類GITR之例示性成熟胺基酸序列係作為SEQ ID NO：40提供。相反地，同功型2為人類GITR之分泌形式且具有約255個胺基酸之長度。Swiss-Prot登錄號Q9Y5U5-2及GenBank^TM登錄號NP_683699提供同功型2之例示性人類 GITR胺基酸序列。人類GITR之同功型3具有約234個胺基酸之長度。Swiss-Prot登錄號Q9Y5U5-3及GenBank^TM登錄號NP_683700(同功型3前驅體)提供同功型3之例示性人類GITR胺基酸序列。在一個特定具體實例中，該GITR為人類GITR。在另一個特定具體實例中，該GITR為人類GITR同功型1(SEQ ID NO：41)。在某些具體實例中，該GITR為人類同功型2(SEQ ID NO：42)或同功型3(SEQ ID NO：43)。人類GITR係由Entrez Gene指定為GeneID：8784。SEQ ID NO：44提供石蟹獼猴GITR胺基酸序列，且SEQ ID NO：44之胺基酸26-234表示石蟹獼猴GITR之成熟形式。如本文所用之術語「人類GITR」係指包含多肽序列SEQ ID NO：40之GITR。

如本文所用之術語「GITR配體」及「GITRL」係指糖皮質素誘導TNFR相關蛋白配體。GITRL另外稱為活化誘導TNF相關配體(AITRL)及腫瘤壞死因子配體超家族成員18(TNFSF18)。GenBank^TM登錄號AF125303提供例示性人類GITRL核酸序列。GenBank^TM登錄號NP_005083及Swiss-Prot登錄號Q9UNG2提供例示性人類GITRL胺基酸序列。

如本文所用之術語「OX40受體」或「OX40」或「OX40多肽」係指OX40，其包括(但不限於)天然OX40、OX40之同功型或OX40之種間OX40同源物。OX40亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員 4(TNFRSF4)、ACT35、CD134、IMD16及TXGP1L。GenBank^TM登錄號BC105070及BC105072提供人類OX40核酸序列。Refseq號NP_003318.1提供人類OX40之胺基酸序列。人類OX40之未成熟胺基酸序列係作為SEQ ID NO：73提供。人類OX40之成熟胺基酸序列係作為SEQ ID NO：72提供。人類OX40由Entrez Gene指定為GeneID：7293。RefSeq號XM_005545122.1及XP_005545179.1分別提供預測之石蟹獼猴OX40核酸序列及胺基酸序列。亦已報導人類OX40之可溶性同功型(Taylor L等人，(2001)J Immunol Methods 255：67-72)。如本文所用之術語「人類OX40」係指包含多肽序列SEQ ID NO：72之OX40。

如本文所用之術語「OX40配體」及「OX40L」係指腫瘤壞死因子配體超家族成員4(TNFSF4)。OX40L另外稱為CD252、GP34、TXGP1及CD134L。GenBank^TM登錄號D90224.1及AK297932.1提供例示性人類OX40L核酸序列。RefSeq號NP_003317.1及Swiss-Prot登錄號P23510-1提供同功型1之例示性人類OX40L胺基酸序列。RefSeq號NP_001284491.1及Swiss-Prot登錄號P23510-2提供同功型2之例示性人類OX40L胺基酸序列。人類OX40L由Entrez Gene指定為GeneID：7292。

如本文所用之術語「宿主細胞」可為任何類型之細胞，例如原生細胞、培養物中之細胞或來自細胞株之細胞。在特定具體實例中，術語「宿主細胞」係指經核酸分子轉染之細胞及該細胞之後代或潛在後代。該細胞之後代未必與經核酸分子轉染之母細胞相同，此係例如歸因於可能在後代或核酸分子向宿主細胞基因組中之整合中出現之突變或環境影響。

如本文所用之術語「有效量」在對個體投予治療之背景下係指達成所需之預防或治療作用之治療量。

如本文所用之術語「個體」及「患者」可互換使用。個體可為動物。在一些具體實例中，個體為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如猴或人類)，最佳為人類。在一些具體實例中，個體為石蟹獼猴。在某些具體實例中，該等術語係指非人類動物(例如非人類動物，諸如豬、馬、牛、貓或狗)。在一些具體實例中，該等術語係指寵物或農畜。在特定具體實例中，該等術語係指人類。

如本文所用，若測試抗體與第一抗原之間的結合相對於測試抗體與第二抗原之間的結合減少至少30%、40%、50%、60%、70%或80%，則相對於測試抗體與第二抗原之間的結合，測試抗體與第一抗原之間的結合「實質上減弱」，如在例如流動式細胞量測術分析中、或在既定實驗中、或使用來自多次實驗之平均值所量測，如藉由例如包括下列步驟之分析所評定：(a)使第一抗原或第二抗原在細胞(例如1624-5細胞)之表面上表現；(b)在流動式細胞量測術分析中使用例如2μg/ml之測試抗體或多株抗體對表現第一抗原或第二抗原之細胞進行染色且記錄例如作為來自多於一次量測之平均值的平均螢光強度(MFI)值，其中該多株抗體識別第一抗原及第二抗原兩者；(c)將測試抗體對表現第二抗原之細胞的MFI值除以多株抗體對表現第二抗原之細胞的MFI值(MFI比率₂)；(d)將測試抗體對表現第一抗原之細胞的MFI值除以多株抗體對表現第一抗原之細胞的MFI值(MFI比率₁)；及(e)藉由計算100%×(1-(MFI比率₁/MFI比率₂))來確定結合之減少百分比。

亦可使用數學演算法來確定兩個序列(例如胺基酸序列或核酸序列)之間的「一致性百分比」。用於比較兩個序列之數學演算法之特定非限制性實例為Karlin S及Altschul SF(1990)PNAS 87：2264-2268之演算法，其如在Karlin S及Altschul SF(1993)PNAS 90：5873-5877中所修改。該演算法併入Altschul SF等人，(1990)J Mol Biol 215：403之NBLAST及XBLAST程式中。可進行BLAST核苷酸搜尋，其中NBLAST核苷酸程式參數係設定為例如得分=100、字長=12以獲得與本文所述之核酸分子同源之核苷酸序列。可進行BLAST蛋白質搜尋，其中XBLAST程式參數係設定為例如得分=50、字長=3以獲得與本文所述之蛋白質分子同源之胺基酸序列。為獲得用於比較目的之空隙比對，可利用空隙BLAST，如Altschul SF等人，(1997)Nuc Acids Res 25：3389 3402中所述。或者，可使用PSI BLAST來進行重複搜尋，該搜尋偵測分子之間的遠源關係(同上)。當利用BLAST、空隙BLAST及PSI Blast程式時，可使用對應程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數(參見例如全球資訊網上之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用於比較序列之數學演算法之另一特定非限制性實例為Myers及Miller,1988,CABIOS 4：11 17之演算法。該演算法併入作為GCG序列比對套裝軟體之一部分的ALIGN程式(第2.0版)中。當利用ALIGN程式比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表、12之空隙長度罰分及4之空隙罰分。

兩個序列之間的一致性百分比可使用類似於上文所述之技術，在允許或不允許空隙之情況下確定。在計算一致性百分比時，通常僅對精確匹配進行計數。

7.2 結合GITR及/或OX40之多特異性抗體

在一個特定態樣中，本發明提供特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及人類OX40)之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。舉例而言，本發明提供之多特異性(例如雙特異性)抗體可包含結合OX40之第一抗原結合域、及第二抗原結合域。本發明提供之多特異性(例如雙特異性)抗體亦可包含第一抗原結合域及結合GITR之第二抗原結合域。該等多特異性(例如雙特異性)抗體亦可結合其他腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族蛋白質，例如與GITR及/或OX40共調節之彼等蛋白質。與僅結合一種TNFR超家族蛋白質之單特異性二價抗體相比，此等多特異性抗體有利地對含有靶蛋白組合之某些免疫細胞子集顯示出較大之特異性。

舉例而言，本發明提供抗體，該等抗體包含結合OX40之第一抗原結合域及結合腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族蛋白質(諸如GITR、OX40、CD137或DR3)之第二抗原結合域。在另一個實施例中，本發明提供抗體，該等抗體包含結合TNFR超家族蛋白質(諸如GITR、OX40、CD137或DR3)之第一抗原結合域及結合GITR之第二抗原結合域。

本發明亦提供多特異性(例如雙特異性)抗體，該等抗體包含結合OX40之第一抗原結合域及結合GITR之第二抗原結合域。

與例如結合GITR且含有相同之GITR抗原結合域之單特異性二價抗體相比及/或與結合OX40且含有相同之OX40抗原結合域之單特異性二價抗體相比，本發明提供之含有OX40抗原結合域及GITR抗原結合域之抗體可顯示與表現GITR及OX40之細胞(例如T調節性細胞)增加之結合。

相較於結合GITR且含有相同之GITR抗原結合域之單特異性二價抗體，本發明提供之含有OX40抗原結合域及GITR抗原結合域之抗體亦可顯示與GITR陽性、OX40陰性細胞減少之結合(例如在低濃度下)。

相較於結合OX40且含有相同之OX40抗原結合域之單特異性二價抗體，本發明提供之含有OX40抗原結合域及GITR抗原結合域之抗體亦可顯示與GITR陰性、OX40陽性細胞減少之結合(例如在低濃度下)。

在某些具體實例中，本文所述之特異性結合GITR及OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體可結合人類CD4+ T細胞及人類CD8+ T細胞。在某些具體實例中，本文所述之抗體結合人類CD4+細胞及石蟹獼猴CD4+ T細胞。相較於與效應T細胞之結合，本發明提供之特異性結合GITR及OX40之抗體可顯示與調節性T細胞增強之結合。在一些情況下，相較於與腫瘤內效應T細胞之結合，本發明提供之特異性結合GITR及OX40之抗體顯示與腫瘤內調節性T細胞增強之結合。

本發明提供之特異性結合GITR及OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體可抑制人類GITR配體與人類GITR結合及/或抑制人類OX40配體與人類OX40結合。

在一種情況下，本發明提供之特異性結合GITR及OX40之抗體含有下表1之單列中所示之CDR組合。

在一種情況下，本發明提供之特異性結合GITR及OX40之抗體含有下表2之單列中所示之兩個重鏈可變域及兩個輕鏈可變域之組合。

在一種情況下，本發明提供之特異性結合GITR及OX40之抗體含有下表3之單列中所示之兩個重鏈及兩個輕鏈之組合。

如本發明所提供之結合GITR及/或OX40之多特異性抗體，例如雙特異性抗體，可藉由以化學方式連接兩種不同之單株抗體或藉由使兩種融合瘤細胞株融合以產生雜交融合瘤來製備。可使用之其他多價形式包括例如Kλ體、dAb、雙功能抗體、TandAb、奈米抗體、SMIP、 DNL、股交換工程改造結構域體(SEED體)、親和體、Fynomer、Kunitz結構域、Albu-dab、DART、DVD-IG、Covx體、肽體、scFv-Ig、SVD-Ig、dAb-Ig、杵入臼型抗體、DuoBody抗體及三功能抗體(triomAb)。例示性雙特異性形式論述於Garber等人，Nature Reviews Drug Discovery 13：799-801(2014)中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。

本發明之例示性雙特異性抗體分子包括(i)具有包含不同之抗原結合區之兩個臂之單一抗體，其中一個臂對第一抗原(諸如OX40)具有特異性且一個臂對第二抗原(諸如GITR)具有特異性；(ii)具有對第一抗原(諸如OX40)具有特異性之一個抗原結合區或臂及對第二抗原(諸如GITR)具有特異性之第二抗原結合區或臂之單一抗體；(iii)具有對第一抗原(諸如OX40)之第一特異性及對第二抗原(諸如GITR)之第二特異性的單鏈抗體，例如經由藉由額外之肽連接子串聯連接之兩個scFv；(iv)雙可變域抗體(DVD-Ig)，其中各輕鏈及重鏈含有經由短肽鍵串聯之兩個可變域(Wu等人，《雙可變域免疫球蛋白(DVD-Ig.TM.)分子之產生及表徵(Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig.TM.)Molecule)》,《抗體工程改造(Antibody Engineering)》,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(v)化學連接之雙特異性(Fab')₂片段；(vi)Tandab，其為兩個單鏈雙功能抗體之融合體，從而產生對於靶抗原中之每一者具有兩個結合位點的四價雙特異性抗體；(vii)可撓性體(flexibody)，其為scFv與雙功能抗體之組合，從而產生多價分子；(viii)基於蛋白激酶A中之「二聚化及停泊結構域(docking domain)」之所謂之「塢與鎖(dock and lock)」分子，其在應用於Fab時可產生由連接至不同Fab片段之兩個相同之Fab片段組成之三價雙特異性結合蛋白；(ix)所謂之Scorpion分子，其包含例如與人類Fab臂之兩個末端融合之兩個scFv；及(x)雙功能抗體。

不同類別之雙特異性抗體之實例包括(但不限於)IgG樣分子，其具有互補之CH3結構域以迫使異二聚化；重組IgG樣雙重靶向分子，其中分子之兩側各自含有至少兩種不同抗體之Fab片段或Fab片段之一部分；IgG融合分子，其中全長IgG抗體與額外之Fab片段或Fab片段之部分融合；Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定化之雙功能抗體與重鏈恆定域、Fc區或其部分融合；Fab融合分子，其中不同Fab片段融合於一起；基於ScFv之抗體及基於雙功能抗體之抗體以及重鏈抗體(例如結構域抗體、奈米抗體)，其中不同之單鏈Fv分子或不同之雙功能抗體或不同之重鏈抗體(例如結構域抗體、奈米抗體)彼此融合或與另一蛋白質或載體分子融合。

Fab融合雙特異性抗體之實例包括(但不限於)F(ab)₂(Medarex公司/AMGEN公司)、Dual-Action或 Bis-Fab(Genentech公司)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics公司)、Bivalent Bispecific(Biotecnol公司)以及Fab-Fv(UCB-Celltech公司)。基於ScFv之抗體、基於雙功能抗體之抗體以及結構域抗體之實例包括(但不限於)雙特異性T細胞接合劑(Bispecific T Cell Engager)(BITE)(Micromet公司)、串聯雙功能抗體(Tandab)(Affimed公司)、雙親和重靶向技術(DART)(MacroGenics公司)、單鏈雙功能抗體(Academic公司)、TCR樣抗體(AIT，ReceptorLogics公司)、人血清白蛋白ScFv融合體(Merrimack公司)以及COMBODY(Epigen Biotech公司)、雙重靶向奈米抗體(Ablynx公司)及雙重靶向僅重鏈結構域抗體。

在特定具體實例中，多特異性(例如雙特異性)抗體可為嵌合抗體或人類化抗體。在某些具體實例中，多特異性(例如雙特異性)抗體可為F(ab')₂片段。

在某些具體實例中，結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體為DuoBody抗體。

在某些具體實例中，如本文所述之結合OX40之第一抗原結合域包含人類IgG₁重鏈恆定區，該人類IgG₁重鏈恆定區包含F405L突變，且如本文所述之結合GITR之第二抗原結合域包含人類IgG₁重鏈恆定區，該人類IgG₁重鏈恆定區包含K409R突變，彼等係根據EU編號系統編號。

在某些具體實例中，如本文所述之結合OX40之第一抗原結合域包含人類IgG₁重鏈恆定區，該人類IgG₁重鏈恆定區包含K409R突變，且如本文所述之結合GITR之第二抗原結合域包含人類IgG₁重鏈恆定區，該人類IgG₁重鏈恆定區包含F405L突變，彼等係根據EU編號系統編號。

如本發明所提供者，結合GITR及/或OX40之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)可促效或拮抗GITR及/或OX40活性。促效GITR及/或OX40功能之抗體包括使GITR及/或OX40簇集之抗體。簇集可例如由於Fc-Fc受體(FcR)相互作用而產生。因此，促效GITR及/或OX40之抗體包括具有增加之Fc受體結合之抗體。增加Fc受體結合之突變為此技術所習知且包括例如具有無海藻糖基化之Fc的抗體以及具有諸如S267E/L328F(SELF突變體)及S239D/A330L/I332E之突變的抗體，彼等係根據EU編號系統編號。在一些具體實例中，結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)促效劑抗體包含IgG2恆定區，該IgG2恆定區含有C127S，其係根據Kabat編號。拮抗GITR及/或OX40功能之抗體包括具有減少之Fc受體結合的抗體。減少Fc受體結合之突變為此技術所習知且包括例如N297A；N297Q；D265A；L234F/L235E；L234F/L235E/N297Q；L234F/L235E/P331S；D265A/N297Q；及L234F/L235E/D265A/N297Q/P331S，彼等係根據EU編號系統編號。在一些具體實例中，結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)拮抗劑抗體包含IgG1恆定區，該IgG1恆定區含有N297A，其係根據EU編號系統編號。在一些具體實例中，結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)拮抗劑抗體包含IgG1恆定區，該IgG1恆定區含有N297Q，其係根據EU編號系統編號。在一些具體實例中，結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)拮抗劑抗體包含IgG1恆定區，該IgG1恆定區含有D265A，其係根據EU編號系統編號。在一些具體實例中，結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)拮抗劑抗體包含IgG1恆定區，該IgG1恆定區含有L234F/L235E/D265A，彼等係根據EU編號系統編號。在一些具體實例中，結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)拮抗劑抗體包含IgG1恆定區，該IgG1恆定區含有選自由D265A、P329A及其組合組成之群的突變，彼等係根據EU編號系統編號。

在一些具體實例中，將一個、兩個或多於兩個突變(例如胺基酸取代)引入本文所述之抗體的Fc區(例如CH2結構域(人類IgG₁之殘基231至340)及/或CH3結構域(人類IgG₁之殘基341至447)及/或鉸鏈區)中(其係根據EU編號系統編號)以例如增加或減少抗體對效應細胞之表面上的Fc受體(例如活化之Fc受體)的親和力。抗體之Fc區中減少或增加抗體對Fc受體之親和力的突變及將此等突變引入至Fc受體或其片段中之技術為熟習此技術者所習知。抗體之Fc受體可進行改變抗體對Fc受體之親和力的突變之實例描述於例如Smith P等人，(2012)PNAS 109：6181-6186；美國專利第6,737,056號；及國際公開案第WO 02/060919號；第WO 98/23289號；及第WO 97/34631號中，該等文獻以引用的方式併入本文中。

在一個特定具體實例中，將一個、兩個或多於兩個胺基酸突變(亦即取代、插入或缺失)引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈-Fc結構域片段)以改變(例如縮短或延長)抗體在活體內之半衰期。參見例如國際公開案第WO 02/060919號；第WO 98/23289號；及第WO 97/34631號；以及美國專利第5,869,046號、第6,121,022號、第6,277,375號及第6,165,745號中例如將改變(例如縮短或延長)抗體在活體內之半衰期的突變。在一些具體實例中，將一個、兩個或多於兩個胺基酸突變(亦即取代、插入或缺失)引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈-Fc結構域片段)以縮短抗體在活體內之半衰期。在其他具體實例中，將一個、兩個或多於兩個胺基酸突變(亦即取代、插入或缺失)引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈-Fc結構域片段)以延長抗體在活體內之半衰期。在一個特定具體實例中，抗體可在第二恆定(CH2)域(人類IgG₁之殘基231至340)及/或第三恆定(CH3)域(人類IgG₁之殘基341至447)中具有一或多個胺基酸突變(例如取代)，彼等係根據EU編號系統編號。在一個特定具體實例中，本文所述之抗體之IgG₁之恆定區包含位置252處甲硫胺酸(M)經酪胺酸(Y)之取代、位置254處絲胺酸(S)經蘇胺酸(T)之取代及位置256處蘇胺酸(T)經麩胺酸(E)之取代，彼等係根據EU編號系統編號。參見美國專利第7,658,921號，其以引用的方式併入本文中。已顯示稱為「YTE突變體」之此類型之突變型IgG顯示出半衰期延長至該相同抗體之野生型型式之四倍(參見Dall'Acqua WF等人，(2006)J Biol Chem 281：23514-24)。在某些具體實例中，抗體包含IgG恆定域，該IgG恆定域包含位置251至257、285至290、308至314、385至389及428至436處胺基酸殘基之一個、兩個、三個或多於三個胺基酸取代，彼等係根據EU編號系統編號。

在另一個具體實例中，將一個、兩個或多於兩個胺基酸取代引入IgG恆定域Fc區中以改變抗體之效應功能。舉例而言，選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之一或多個胺基酸(彼等係根據EU編號系統編號)可經不同胺基酸殘基置換以使得該抗體具有改變之對效應配體之親和力但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。在一些具體實例中，恆定區結構域之缺失或失活(經由點突變或其他方式)可減少循環抗體之Fc受體結合，從而增加腫瘤定位。參見例如美國專利第5,585,097號及第8,591,886號中對使恆定域缺失或失活且從而增加腫瘤定位之突變的描述。在某些具體實例中，可將一或多個胺基酸取代引入本文所述之抗體之Fc區中以移除Fc區上潛在之糖基化位點，此可減少Fc受體結合(參見例如Shields RL等人，(2001)J Biol Chem 276：6591-604)。在各種具體實例中，可進行本文所述之抗體之恆定區中下列突變中之一或多者：N297A取代；N297Q取代；L235A取代及L237A取代；L234A取代及L235A取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236缺失；P238A取代；D265A取代；A327Q取代；或P329A取代，彼等係根據EU編號系統編號。

在一個特定具體實例中，本文所述之抗體包含具有N297Q或N297A胺基酸取代之IgG₁恆定域，彼等係根據EU編號系統編號。

在某些具體實例中，本文所述之抗體之恆定區中選自胺基酸殘基329、331及322之一或多個胺基酸(彼等係根據EU編號系統編號)可經不同胺基酸殘基置換以使得該抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於美國專利第6,194,551號(Idusogie等人)中。在一些具體實例中，使本文所述之抗體之CH2結構域之N末端區域中胺基酸位置231至238內之一或多個胺基酸殘基改變，從而改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於國際公開案第WO 94/29351號中。在某些具體實例中，藉由使下列位置處之一或多個胺基酸突變(例如引入胺基酸取代)來修飾本文所述之抗體之Fc區以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加抗體對Fcγ受體之親和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，彼等係根據EU編號系統編號。此方法進一步描述於國際公開案第WO 00/42072號中。

在某些具體實例中，本文所述之抗體包含在位置267、328或彼等之組合處具有突變(例如取代)之IgG₁恆定域，彼等係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，本文所述之抗體包含具有選自由S267E、L328F及彼等之組合組成之群的突變(例如取代)之IgG₁恆定域，彼等係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，本文所述之抗體包含具有S267E/L328F突變(例如取代)之IgG₁恆定域，其係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，本文所述之包含具有S267E/L328F突變(例如取代)之IgG₁恆定域的抗體具有增加之對FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIA及FcγRIIB之結合親和力，彼等係根據EU編號系統編號。

在某些具體實例中，本文所述之抗體包含IgG₄抗體之恆定區，且重鏈之胺基酸殘基228處之絲胺酸(其係根據EU編號系統編號)經脯胺酸取代。

在某些具體實例中，本文所述之抗體包含IgG₂抗體之恆定區且重鏈之胺基酸殘基127處之半胱胺酸(其係根據Kabat編號)經絲胺酸取代。

已報導具有降低之海藻糖含量之抗體具有增加之對Fc受體(諸如FcγRIIIa)之親和力。因此，在某些具體實例中，本文所述之抗體具有降低之海藻糖含量或無海藻糖含量。此等抗體可使用熟習此技術者習知之技術產生。舉例而言，可使抗體在海藻糖基化之能力有缺陷或缺乏海藻糖基化之能力的細胞中表現。在一個特定實施例中，可使用具有α1,6-海藻糖基轉移酶之兩個對偶基因之基因剔除之細胞株產生具有降低之海藻糖含量的抗體。Potelligent^®系統(Lonza公司)為此種可用於產生具有降低之海藻糖含量之抗體之系統之實例。或者，具有降低之海藻糖含量或無海藻糖含量之抗體可藉由例如以下來產生：(i)在防止或減少海藻糖基化之條件下培養細胞；(ii)轉譯後移除海藻糖(例如用海藻糖苷酶)；(iii)例如在重組表現非糖基化醣蛋白之後，轉譯後添加所需之碳水化合物；或(iv)純化醣蛋白以選擇其未海藻糖基化之抗體。參見例如Longmore GD及Schachter H(1982)Carbohydr Res 100：365-92；及Imai-Nishiya H等人，(2007)BMC Biotechnol.7：84中用於產生其無海藻糖含量或具有降低之海藻糖含量的抗體之方法。

工程改造之醣型(glycoform)可用於多種目的，其包括(但不限於)增強或降低效應功能。用於產生本文所述之抗體之工程改造之醣型的方法包括(但不限於)例如以下文獻中所揭示之彼等方法：Umaña P等人，(1999)Nat Biotechnol 17：176-180；Davies J等人，(2001)Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields RL等人，(2002)J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa T等人，(2003)J Biol Chem 278：3466-3473；Niwa R等人，(2004)Clin Cancer Res 1：6248-6255；Presta LG等人，(2002)Biochem Soc Trans 30：487-490；Kanda Y等人，(2007)Glycobiology 17：104-118；美國專利第6,602,684號；第6,946,292號；及第7,214,775號；美國專利公開案第US 2007/0248600號；第2007/0178551號；第2008/0060092號；及第2006/0253928號；國際公開案第WO 00/61739號；第WO 01/292246號；第WO 02/311140號；及第WO 02/30954號；Potillegent^TM技術(新澤西州普林斯頓之Biowa公司)；及GlycoMAb®糖基化工程改造技術(瑞士蘇黎世之Glycart biotechnology AG公司)。亦參見例如Ferrara C等人，(2006)Biotechnol Bioeng 93：851-861；國際公開案第WO 07/039818號；第WO 12/130831號；第WO 99/054342號；第WO 03/011878號；及第WO 04/065540號。

在某些具體實例中，用於工程改造本文所述之抗體之Fc結構域之技術為Xencor公司(加利福尼亞州之蒙羅維亞(Monrovia,CA))之Xmab^®技術。參見例如美國專利第8,367,805號；第8,039,592號；第8,124,731號；第8,188,231號；美國專利公開案第2006/0235208號；國際公開案第WO 05/077981號；第WO 11/097527號；及Richards JO等人，(2008)Mol Cancer Ther 7：2517-2527。

在某些具體實例中，本文所述之抗體之恆定區中對應於人類IgG1重鏈中之位置L234、L235及D265之位置處之胺基酸殘基(彼等係根據EU編號系統編號)分別不為L、L及D。此方法詳細描述於國際公開案第WO 14/108483號中。在一個特定具體實例中，對應於人類IgG1重鏈中之位置L234、L235及D265之胺基酸分別為F、E及A；或A、A及A，彼等係根據EU編號系統編號。

在某些具體實例中，將一個、兩個或多於兩個突變(例如胺基酸取代)引入本文所述之抗體的Fc區(例如CH2結構域(人類IgG₁之殘基231至340)及/或CH3結構域(人類IgG₁之殘基341至447)及/或鉸鏈區)中(彼等係根據EU編號系統編號)以例如改變該抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。

在某些具體實例中，將一個、兩個或多於兩個突變(例如胺基酸取代)引入Fc區(CH1結構域)之鉸鏈區中以使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目改變(例如增加或減少)，如例如美國專利第5,677,425號中所述。可以改變CH1結構域之鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目以例如促成輕鏈及重鏈之組裝或改變(例如增加或降低)抗體之穩定性。

在某些具體實例中，相對於不存在任何抗體之情況下或存在無關抗體(例如非免疫特異性結合GITR或OX40之抗體)之情況下的GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)活性，免疫特異性結合GITR及OX40(例如人類GITR及OX40)之多特異性(例如雙特異性)抗體使GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)活性增加至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文所述及/或熟習此技術者所習知之方法評定。舉例而言，相對於不存在任何抗體之情況下或存在無關抗體(例如非免疫特異性結合GITR或OX40之抗體)之情況下的GITR及/或 OX40(例如人類GITR及/或OX40)活性，結合GITR及OX40之抗體，例如結合GITR及OX40且包含本文所指定之CDR序列之組合、與本文所指定之VH及/或VL序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之VH及/或VL序列、或本文所指定之重鏈及/或輕鏈之抗體可使GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)活性增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由本文所述及/或熟習此技術者所習知之方法評定。GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)活性之非限制性實例可包括GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)信號傳導、細胞增殖、細胞存活及細胞激素產生(例如IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10及/或IL-13)。

如本發明所提供者，結合GITR及/或OX40之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)可促效GITR及/或OX40功能，例如藉由在SEA分析中刺激IL-2釋放，例如如下文實施例所例示者。舉例而言，在例如37℃、5% CO₂及97%濕度下刺激例如5天時，結合GITR及OX40之抗體，例如結合GITR及OX40且包含本文所指定之CDR序列之組合、與本文所指定之VH及/或VL序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之VH及/或VL序列、或本文所指定之重鏈及/或輕鏈之抗體可與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如100ng/ml)組合誘導例如PBMC中IL-2之產生，如藉由例如電致化學發光所量測。在一些具體實例中，IL-2產生為在以下範圍內抗體濃度之實質上遞增函數：例如0.08μg/ml至20μg/ml、0.25μg/ml至20μg/ml、0.74μg/ml至20μg/ml、2.2μg/ml至20μg/ml或6.7μg/ml至20μg/ml。在某些具體實例中，結合GITR及OX40之抗體，例如結合GITR及OX40且包含本文所指定之CDR序列之組合、與本文所指定之VH及/或VL序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之VH及/或VL序列、或本文所指定之重鏈及/或輕鏈之抗體可與葡萄球菌腸毒素A(SEA)組合誘導例如PBMC中IL-2之產生，其中IL-2產生為在以下範圍內抗體濃度之實質上遞增函數：例如0.08μg/ml至20μg/ml、0.25μg/ml至20μg/ml、0.74μg/ml至20μg/ml、2.2μg/ml至20μg/ml或6.7μg/ml至20μg/ml，如例如在包括下列步驟之分析中所評定：(a)在例如37℃、5% CO₂及97%濕度下，在不存在或存在不同濃度(例如20μg/ml、46.7μg/ml、2.2μg/ml、0.74μg/ml、0.25μg/ml及0.08μg/ml)之抗體及例如100ng/ml之SEA的情況下將PBMC(例如每孔中10⁵個細胞)培養例如5天；及(b)收集澄清之上清液且藉由例如電致化學發光量測IL-2之力價。

在某些具體實例中，在例如37℃、5% CO₂及97%濕度下刺激例如5天時，結合GITR及OX40之抗體，例如結合GITR及OX40且包含本文所指定之CDR序列之組合、與本文所指定之VH及/或VL序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之VH及/或VL序列、或本文所指定之重鏈及/或輕鏈之抗體可與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如100ng/ml)組合誘導例如PBMC中IL-2之產生，如藉由例如電致化學發光所量測。在一些具體實例中，當抗體為例如0.08μg/ml至20μg/ml、0.25μg/ml至20μg/ml、0.74μg/ml至20μg/ml、2.2μg/ml至20μg/ml或6.7μg/ml至20μg/ml時，IL-2產生顯示S形劑量反應曲線。在某些具體實例中，結合GITR及OX40之抗體，例如結合GITR及OX40且包含本文所指定之CDR序列之組合、與本文所指定之VH及/或VL序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之VH及/或VL序列、或本文所指定之重鏈及/或輕鏈之抗體可與葡萄球菌腸毒素A(SEA)組合誘導例如PBMC中IL-2之產生，其中當抗體為例如0.08μg/ml至20μg/ml、0.25μg/ml至20μg/ml、0.74μg/ml至20 μg/ml、2.2μg/ml至20μg/ml或6.7μg/ml至20μg/ml時，IL-2產生顯示S形劑量反應曲線，如例如在包括下列步驟之分析中所評定：(a)在例如37℃、5% CO₂及97%濕度下，在不存在或存在不同濃度(例如20μg/ml、6.7μg/ml、2.2μg/ml、0.74μg/ml、0.25μg/ml及0.08μg/ml)之抗體及例如100ng/ml之SEA的情況下將PBMC(例如每孔中10⁵個細胞)培養例如5天；及(b)收集澄清之上清液且藉由例如電致化學發光量測IL-2之力價。在某些具體實例中，在例如37℃、5% CO₂及97%濕度下刺激例如5天時，結合GITR及OX40之抗體，例如結合GITR及OX40且包含本文所指定之CDR序列之組合、與本文所指定之VH及/或VL序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之VH及/或VL序列、或本文所指定之重鏈及/或輕鏈之抗體可與葡萄球菌腸毒素A(SEA)(例如100ng/ml)組合誘導例如PBMC中IL-2之產生，如藉由例如電致化學發光所量測，其中IL-2產生為在以下範圍內抗體濃度之實質上遞增函數：例如0.08μg/ml至20μg/ml、0.25μg/ml至20μg/ml、0.74μg/ml至20μg/ml、2.2μg/ml至20μg/ml或6.7μg/ml至20μg/ml。在某些具體實例中，結合GITR及OX40之抗體，例如結合GITR及OX40且包含本文所指定之CDR序列之組合、與本文所指定之VH及/或VL序列具有至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之VH及/或VL序列、或本文所指定之重鏈及/或輕鏈之抗體可與葡萄球菌腸毒素A(SEA)組合誘導例如PBMC中IL-2之產生，其中IL-2產生為在以下範圍內抗體濃度之實質上遞增函數：例如0.08μg/ml至20μg/ml、0.25μg/ml至20μg/ml、0.74μg/ml至20μg/ml、2.2μg/ml至20μg/ml或6.7μg/ml至20μg/ml，如例如在包括下列步驟之分析中所評定：(a)在例如37℃、5% CO₂及97%濕度下，在不存在或存在不同濃度(例如20μg/ml、6.7μg/ml、2.2μg/ml、0.74μg/ml、0.25μg/ml及0.08μg/ml)之抗體及例如100ng/ml之SEA的情況下將PBMC(例如每孔中10⁵個細胞)培養例如5天；及(b)收集澄清之上清液且藉由例如電致化學發光量測IL-2之力價。

在一個特定態樣中，本發明提供免疫特異性結合GITR及OX40(例如人類GITR及OX40)之多特異性(例如雙特異性)拮抗性抗體。

在一個特定態樣中，如本文所述之免疫特異性結合GITR及OX40(例如人類GITR及OX40)之多特異性(例如雙特異性)抗體包含人類免疫球蛋白IgG₁重鏈恆定區，其中該IgG₁重鏈恆定區之胺基酸序列包含選自由以下組成之群的突變：N297A、D265A、L234F、L235E、N297Q及P331S，其係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，突變為N297A或D265A，其係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，突變為L234F及L235E，其係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，突變為L234F、L234E及D265A，其係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，突變為L234F、L234E及N297Q，其係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，突變為L234F、L235E及P331S，其係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，突變為D265A及N297Q，其係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，突變為L234F、L235E、D265A、N297Q及P331S，其係根據EU編號系統編號。在一個特定態樣中，如本文所述之免疫特異性結合GITR及OX40(例如人類GITR及OX40)之多特異性(例如雙特異性)抗體包含人類免疫球蛋白IgG₁重鏈恆定區，其中該IgG₁重鏈恆定區之胺基酸序列包含選自由D265A、P329A及彼等之組合組成之群的突變，彼等係根據EU編號系統編號。在某些具體實例中，該抗體具有拮抗性。

在某些具體實例中，相對於不存在任何抗體之情況下或存在無關抗體(例如非免疫特異性結合GITR或OX40之抗體)之情況下的GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)活性，本文所述之免疫特異性結合GITR及OX40(例如人類GITR及OX40)之拮抗劑多特異性(例如雙特異性)抗體使GITR及/或OX40(例如人類 GITR及/或OX40)活性降低至少約1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍，如藉由本文所述及/或熟習此技術者所習知之方法評定。在某些具體實例中，相對於不存在任何抗體之情況下或存在無關抗體(例如非免疫特異性結合GITR或OX40之抗體)之情況下的GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)活性，本文所述之免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)之拮抗劑多特異性(例如雙特異性)抗體使GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)活性降低至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由本文所述及/或熟習此技術者所習知之方法評定。GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)活性之非限制性實例可包括GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)信號傳導、細胞增殖、細胞存活及細胞激素產生(例如IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10及/或IL-13)。在特定具體實例中，如下文實施例中所述來評定GITR及/或OX40活性。

如本發明所提供者，結合GITR及/或OX40之拮抗劑多特異性抗體(例如雙特異性抗體)可拮抗GITR及/或OX40功能，例如藉由中和GITRL誘導之信號傳導，例如如下文實施例中所例示者。舉例而言，結合 GITR及OX40之拮抗劑抗體，例如結合GITR及OX40且包含本文所指定之CDR序列之組合、與本文所指定之VH及/或VL序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之VH及/或VL序列、或本文所指定之重鏈及/或輕鏈之拮抗劑抗體可中和GITRL誘導之信號傳導，如藉由例如螢光素酶分析所量測。在某些具體實例中，結合GITR及OX40之拮抗劑抗體，例如結合GITR及OX40且包含本文所指定之CDR序列之組合、與本文所指定之VH及/或VL序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之VH及/或VL序列、或本文所指定之重鏈及/或輕鏈之拮抗劑抗體可中和GITRL誘導之信號傳導，如例如在包括下列步驟之螢光素酶分析中所評定：(a)在37℃及5% CO₂下在補充10%熱滅活FBS之RPMI培養基中，在不存在或存在不同濃度之抗體(例如12點劑量滴定，0.05ng/ml至10,000ng/ml)及三聚體GITRL之情況下，將Jurkat-huGITR-NF-κB-螢光素酶細胞培養2小時；及(b)偵測螢光素酶活性。

在某些具體實例中，本文所述之結合GITR及/或OX40之拮抗劑多特異性抗體(例如雙特異性抗體)阻斷GITR及/或OX40與GITRL及/或OX40L之相互作用(例如阻斷GITRL與GITR及/或OX40L與OX40彼此結合)。在某些具體實例中，本文所述之結合GITR及/或OX40之拮抗劑多特異性抗體(例如雙特異性抗體)降低由GITRL及/或OX40L誘導之GITR及/或OX40活性(例如GITR及/或OX40信號傳導)。在某些具體實例中，本文所述之結合GITR及/或OX40之拮抗劑多特異性抗體(例如雙特異性抗體)抑制T細胞增殖。在某些具體實例中，本文所述之結合GITR及/或OX40之拮抗劑多特異性抗體(例如雙特異性抗體)抑制細胞激素(例如IL-2、TNFα、IFNγ、IL-4、IL-10、IL-13或彼等之組合)之產生。

本發明提供之結合GITR及/或OX40之抗體可融合或結合(例如共價或非共價連接)可偵測標記或物質。該可偵測標記或物質之實例包括酶標記，諸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、銦(¹²¹In)及鎝(⁹⁹Tc)；發光標記，諸如魯米諾(luminol)；及螢光標記，諸如螢光素及若丹明(rhodamine)；及生物素。此等標記之抗體可用於偵測OX40(例如人類OX40)蛋白質。參見例如下文之部分7.5.2。

7.2.1 OX40抗原結合域

在一個特定具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之OX40抗原結合域包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含如表4中所示： (a)VL CDR1，其包含以下胺基酸序列、由以下胺基酸序列組成或基本上由以下胺基酸序列組成：胺基酸序列RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO：50)；(b)VL CDR2，其包含以下胺基酸序列、由以下胺基酸序列組成或基本上由以下胺基酸序列組成：胺基酸序列LGSNRAS(SEQ ID NO：51)；及(c)VL CDR3，其包含以下胺基酸序列、由以下胺基酸序列組成或基本上由以下胺基酸序列組成：胺基酸序列MQALQTPLT(SEQ ID NO：52)或MQALQTPLT(SEQ ID NO：53)。

在一些具體實例中，OX40抗原結合域包含本文所述之VL構架區。

在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含如表4中所示：(a)VH CDR1，其包含以下胺基酸序列、由以下胺基酸序列組成或基本上由以下胺基酸序列組成：胺基酸序列GSAMH(SEQ ID NO：47)；(b)VH CDR2，其包含以下胺基酸序列、由以下胺基酸序列組成或基本上由以下胺基酸序列組成：胺基酸序列RIRSKANSYATAYAASVKG(SEQ ID NO：48)；及(c)VH CDR3，其包含以下胺基酸序列、由以下胺基酸序列組成或基本上由以下胺基酸序列組成：胺基酸序列 GIYDSSGYDY(SEQ ID NO：49)。

在一些具體實例中，OX40抗原結合域包含本文所述之VH構架。在特定具體實例中，OX40抗原結合域包含本文所述之抗體之VH構架區。

在某些具體實例中，本發明提供一種抗原結合域，其特異性結合OX40(例如人類OX40)且包含pab1949w或pab2049w之輕鏈可變區(VL)CDR及重鏈可變區(VH)CDR，其係例如如表4及5中所示出(亦即SEQ ID NO：47至52或SEQ ID NO：47至51及53)。

在某些具體實例中，OX40抗原結合域包含源自於人類IGKV2-28生殖系序列之輕鏈可變構架區(例如IGKV2-28*01，其例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：58)。

在某些具體實例中，OX40抗原結合域包含源自於人類IGHV3-73生殖系序列之重鏈可變構架區(例如 IGHV3-73*01，其例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：57)。

在一個特定具體實例中，特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VL結構域，該VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：55或56。在一個特定具體實例中，特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VL結構域，該VL結構域由胺基酸序列SEQ ID NO：55或56組成或基本上由胺基酸序列SEQ ID NO：55或56組成。

在某些具體實例中，特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VH結構域，該VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：54。在一些具體實例中，特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VH結構域，該VH結構域由胺基酸序列SEQ ID NO：54組成或基本上由胺基酸序列SEQ ID NO：54組成。

在某些具體實例中，特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VH結構域及VL結構域，其中該VH結構域及該VL結構域分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55或56。在某些具體實例中，特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VH結構域及VL結構域，其中該VH結構域及該VL結構域分別由胺基酸序列SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55或56組成或基本上由胺基酸序列SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55或56組成，例如如表6中所示。

在特定態樣中，本發明提供一種抗原結合域，其包含輕鏈及重鏈，例如各別輕鏈及重鏈。對於輕鏈，在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域之輕鏈為κ輕鏈。在另一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域之輕鏈為λ輕鏈。在另一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域之輕鏈為人類κ輕鏈或人類λ輕鏈。在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40多肽(例如人類OX40)之抗原結合域包含輕鏈，其中VL結構域之胺基酸序列包含以SEQ ID NO：55或56示出之序列，且其中輕鏈之恆定區包含人類κ輕鏈恆定區之胺基酸序列。在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含輕鏈，其中VL結構域之胺基酸序列包含以SEQ ID NO：55或56示出之序列，且其中輕鏈之恆定區包含人類λ輕鏈恆定區之胺基酸序列。在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含輕鏈，其中VL結構域之胺基酸序列包含以SEQ ID NO：55或56示出之序列，且其中輕鏈之恆定區包含人類κ或λ輕鏈恆定區之胺基酸序列。人類恆定區序列之非限制性實例在此技術中已被描述，例如參見美國專利第5,693,780號及Kabat EA等人(1991)(同上)。

在一個特定具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含輕鏈，該輕鏈包含以SEQ ID NO：67或69示出之胺基酸序列。

對於重鏈，在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域之重鏈可為α重鏈、δ重鏈、ε重鏈、γ重鏈或μ重鏈。在另一個特定具體實例中，所述之抗原結合域之重鏈可包含人類α重鏈、δ重鏈、ε重鏈、γ重鏈或μ重鏈。在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含重鏈，其中VH結構域之胺基酸序列可包含以SEQ ID NO：54示出之序列且其中重鏈之恆定區包含人類γ重鏈恆定區之胺基酸序列。在一個特定具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含重鏈，其中VH結構域之胺基酸序列包含以SEQ ID NO：54示出之序列，且其中重鏈之恆定區包含本文所述或此技術已習知之人類重鏈之胺基酸。人類恆定區序列之非限制性實例在此技術中已被描述，例如參見美國專利第5,693,780號及Kabat EA等人(1991)(同上)。

在一個特定具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：61示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：62示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：63示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：64示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：65示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：71示出之胺基酸序列。

在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VL結構域及VH結構域，該VL結構域及VH結構域包含本文所述之任何胺基酸序列，其中恆定區包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、或人類IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列。在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VL結構域及VH結構域，該VL結構域及VH結構域包含本文所述之任何胺基酸序列，其中恆定區包含IgG、IgE、 IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何類別(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂)或任何子類(例如IgG_2a及IgG_2b)之免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列。在一個特定具體實例中，恆定區包含人類IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何類別(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂)或任何子類(例如IgG_2a及IgG_2b)之免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VL結構域及VH結構域，該VL結構域及VH結構域包含本文所述之任何胺基酸序列，其中恆定區包含人類IgG₁(例如同種異型G1m3、G1m17,1或G1m17,1,2)、人類IgG₂或人類IgG₄之恆定區之胺基酸序列。在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含VL結構域及VH結構域，該VL結構域及VH結構域包含本文所述之任何胺基酸序列，其中恆定區包含人類IgG₁(同種異型G1m3)之恆定區之胺基酸序列。人類恆定區之非限制性實例在此技術中被描述，例如參見Kabat EA等人(1991)(同上)。

在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含輕鏈和重鏈，該輕鏈包含以SEQ ID NO：67示出之胺基酸序列且該重鏈包含以SEQ ID NO：61、62、63、64、65或71示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含輕鏈和重鏈，該輕鏈包含以SEQ ID NO：69示出之胺基酸序列且該重鏈包含以SEQ ID NO：61、62、63、64、65或71示出之胺基酸序列。

在某些具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含與pab1949w或pab2049w之VL結構域之胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：55或56)具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性之VL結構域，例如其中該抗原結合域包含與pab1949w或pab2049w之VL CDR相同之VL CDR。

在某些具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含與pab1949w或pab2049w之VH結構域之胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：54)具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性之VH結構域，例如其中該抗原結合域包含與pab1949w或pab2049w之VH CDR相同之VH CDR。

在某些具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域包含：(i)與pab1949w或pab2049w之VL結構域之胺基酸序列(亦即 SEQ ID NO：55或56)具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性之VL結構域；及(ii)與pab1949w或pab2049w之VH結構域之胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：54)具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性之VH結構域，例如其中該抗體包含與pab1949w或pab2049w之VL CDR及VH CDR相同之VL CDR及VH CDR。

在特定態樣中，本發明提供一種抗原結合域，其與包含具有以SEQ ID NO：55或56示出之胺基酸序列之VL結構域及具有以SEQ ID NO：54示出之胺基酸序列之VH結構域之抗原結合域競爭(例如以劑量依賴性方式)特異性結合OX40(例如人類OX40)。

在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域為被與OX40(例如人類OX40)之特異性結合由包含具有以SEQ ID NO：55或56示出之胺基酸序列之VL結構域及具有以SEQ ID NO：54示出之胺基酸序列之VH結構域的抗原結合域競爭性阻斷(例如以劑量依賴性方式)之抗原結合域。

可使用熟習此技術者已知或本文所述之分析(例如X射線結晶學、氫/氘交換聯同質譜分析(例如液相層析電噴霧質譜分析)、丙胺酸掃描、ELISA分析等)以確定兩種抗體是否結合相同之表位。

在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域免疫特異性結合與由pab1949w或pab2049w所結合之表位相同之表位或與該表位重疊之表位。

在一個特定態樣中，相對於本文所述之抗原結合域與SEQ ID NO：72之人類OX40序列之間的結合，該抗原結合域與變異型OX40之間的結合實質上減弱，其中除了胺基酸突變(例如取代)之外，該變異型OX40包含SEQ ID NO：72之序列，該胺基酸突變選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A及彼等之組合，或選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A及P93A，彼等係根據SEQ ID NO：72編號。

在一些具體實例中，除了任一個突變之外，該變異型OX40包含SEQ ID NO：72之序列，該突變選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A及P115A，或選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A及P93A，彼等係根據SEQ ID NO：72編號。在一些具體實例中，除了任何兩個、三個、四個、五個、六個或七個突變之外，該變異型OX40包含SEQ ID NO：72之序列，該等突變選自由以下組成之群：W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A及P115A，或選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A及P93A，彼等係根據SEQ ID NO：72編號。在一些具體實例中，除了胺基酸突變W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A及P115A之外或除了胺基酸突變N60A、R62A、R80A、L88A及P93A之外，變異型OX40包含SEQ ID NO：72之序列，該等胺基酸編號係根據SEQ ID NO：72。

在一個特定態樣中，本文所述之抗原結合域結合人類OX40序列之表位，該表位包含SEQ ID NO：72之殘基、基本上由SEQ ID NO：72之殘基組成或由SEQ ID NO：72之殘基組成，該殘基選自由以下組成之群：58、60、62、80、88、93、99、115及彼等之組合，或選自由以下組成之群：60、62、80、88、93及彼等之組合。在一些具體實例中，該表位包含任一個殘基、或任何兩個、三個、四個、五個、六個或七個殘基；由任一個殘基、或任何兩個、三個、四個、五個、六個或七個殘基組成；或基本上由任一個殘基、或任何兩個、三個、四個、五個、六個或七個殘基組成，該(等)殘基選自由以下組成之群：SEQ ID NO：72之58、60、62、80、88、93、99及115，或選自由以下組成之群：SEQ ID NO：72之60、62、80、88及93。在一些具體實例中，該表位包含以下殘基、基本上由以下殘基組成或由以下殘基組成：SEQ ID NO：72之殘基58、60、62、80、88、93、99及115；或包含SEQ ID NO：72之殘基60、62、80、88及93。

在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域結合SEQ ID NO：72之表位，該表位包含以下殘基、基本上由以下殘基組成或由以下殘基組成，該殘基選自由以下組成之群：58、60、62、80、88、93、99、115及彼等之組合；或SEQ ID NO：72之表位，該表位包含以下殘基、基本上由以下殘基組成或由以下殘基組成，該殘基選自由以下組成之群：60、62、80、88、93及彼等之組合。在一些具體實例中，該表位包含任一個殘基、或任何兩個、三個、四個、五個、六個或七個殘基，該或該等殘基選自由以下組成之群：SEQ ID NO：72之58、60、62、80、88、93、99及115，或選自由以下組成之群：SEQ ID NO：72之60、62、80、88及93。在一些具體實例中，該表位包含以下殘基、由以下殘基組成或基本上由以下殘基組成：SEQ ID NO：72之殘基58、60、62、80、88、93、99及115，或包含SEQ ID NO：72之殘基60、62、80、88及93。

在一個特定態樣中，本文所述之抗原結合域結合SEQ ID NO：72之至少一個殘基，該殘基選自由以下組成之群：58、60、62、80、88、93、99、115及彼等之組合，或選自由以下組成之群：60、62、80、88、93及彼等之組合。在一些具體實例中，本文所述之抗原結合域結合任一個殘基、或任何兩個、三個、四個、五個、六個或七個殘基，該(等)殘基選自由以下組成之群：SEQ ID NO：72之58、60、62、80、88、93、99及115，或選自由以下組成之群：SEQ ID NO：72之60、62、80、88及93。在一些具體實例中，本文所述之抗原結合域結合SEQ ID NO：72之殘基58、60、62、80、88、93、99及115。在一些具體實例中，本文所述之抗原結合域結合SEQ ID NO：72之殘基60、62、80、88及93。

在一個特定態樣中，相較於與SEQ ID NO：72之人類OX40序列之結合，本文所述之抗原結合域表現與SEQ ID NO：72相同但存在胺基酸突變(例如取代)之蛋白質的減少或缺少之結合，該胺基酸突變選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A、P115A及彼等之組合，或選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A及彼等之組合，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：72。在一些具體實例中，除存在胺基酸突變之外，該蛋白質與SEQ ID NO：72相同，該胺基酸突變包括任一個突變，該突變選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A及P115A，或選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A及P93A，彼等係根據SEQ ID NO：72編號。在一些具體實例中，除存在任何兩個、三個、四個、五個、六個或七個突變之外，該蛋白質與SEQ ID NO：72相同，該等突變選自由以下組成之群：W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A及P115A，或選自由以下組成之群：N60A、R62A、R80A、L88A及P93A，彼等係根據SEQ ID NO：72編號。在一些具體實例中，除存在胺基酸取代W58A、N60A、R62A、R80A、L88A、P93A、P99A及P115A之外或除存在胺基酸取代N60A、R62A、R80A、L88A及P93A之外，該蛋白質與SEQ ID NO：72相同，該等胺基酸編號係根據SEQ ID NO：72。

在某些具體實例中，本文所述之抗原結合域之表位用作免疫原以產生抗體。參見例如下文部分7.3中用於產生抗體之方法。

在特定態樣中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域在以單特異性二價形式存在時用作促效劑。

在某些具體實例中，相對於不存在任何抗體之情況下或存在無關抗體(例如非免疫特異性結合OX40之抗體)之情況下的OX40(例如人類OX40)活性，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域在以單特異性二價形式存在時使OX40(例如人類OX40)活性增加至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文所述及/或熟習此技術者所習知之方法評定。在某些具體實例中，相對於不存在任何抗體之情況下或存在無關抗體(例如非免疫特異性結合OX40之抗體)之情況下的OX40(例如人類OX40)活性，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域在以單特異性二價形式存在時使OX40(例如人類OX40)活性增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由本文所述及/或熟習此技術者所習知之方法評定。OX40(例如人類OX40)活性之非限制性實例可包括OX40(例如人類OX40)信號傳導、細胞增殖、細胞存活及細胞激素產生(例如IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10及/或IL-13)。在某些具體實例中，本文所述之免疫特異性結合OX40(例如人類OX40)之抗原結合域在以單特異性二價形式存在時誘導、增強或增加OX40(例如人類OX40)活性。在特定具體實例中，OX40活性之增加係如下文實施例所述評定。

在某些具體實例中，本發明提供之多特異性(例如雙特異性)抗體包含如美國申請案第62/161,198號所述之結合OX40之抗原結合域，該美國申請案以全文引用之方式併入本文中。

7.2.2 GITR抗原結合域

在一個特定具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含如表7中所示： (a)包含胺基酸序列KSSQSLLNSX₁NQKNYLX₂(SEQ ID NO：90)之VL-CDR1，其中X₁為G或S；且X₂為T或S；(b)包含胺基酸序列WASTRES(SEQ ID NO：5)之VL-CDR2；及(c)包含胺基酸序列QNX₁YSX₂PYT(SEQ ID NO：92)之VL-CDR3，其中X₁為D或E；且X₂為Y、F或S。

在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之GITR抗原結合域包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含如表8中所示：(a)包含胺基酸序列X₁YX₂MX₃(SEQ ID NO：87)之VH-CDR1，其中X₁為D、E或G；X₂為A或V；且X₃為Y或H；(b)包含胺基酸序列X₁IX₂TX₃SGX₄X₅X₆YNQKFX₇X₈(SEQ ID NO：88)之VH-CDR2，其中X₁為V或L；X₂為R、K或Q；X₃為Y或F；X₄為D、E或G；X₅為V或L；X₆為T或S；X₇為K、R或Q；且X₈為D、E或G；(c)包含胺基酸序列SGTVRGFAY(SEQ ID NO：3)之VH-CDR3。

在另一個特定具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含如表7中所示：(a)包含胺基酸序列KSSQSLLNSX₁NQKNYLT(SEQ ID NO：4)之VL-CDR1，其中X₁為G或S；(b)包含胺基酸序列WASTRES(SEQ ID NO：5)之VL-CDR2；及(c)包含胺基酸序列QNX₁YSX₂PYT(SEQ ID NO：6)之VL-CDR3，其中X₁為D或E；且X₂為Y或F。

在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之GITR抗原結合域包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含如表8中所示：(a)包含胺基酸序列X₁YAMX₂(SEQ ID NO：1)之VH-CDR1，其中X₁為D、G或E；且X₂為Y或H；(b)包含胺基酸序列X₁IRTYSGX₂VX₃YNQKFX₄X₅(SEQ ID NO：2)之VH-CDR2，其中X₁為V或L；X₂為D或G；X₃為T或S；X₄為K、R或Q；且X₅為D、E或G；及包含胺基酸序列SGTVRGFAY(SEQ ID NO：3)之VH-CDR3。

在某些具體實例中，本發明提供一種抗原結合域，其特異性結合GITR(例如人類GITR)且包含pab1876、pab1967、pab1975或pab1979之輕鏈可變區(VL)CDR及重鏈可變區(VH)CDR，例如如表1及2中所示(亦即SEQ ID NO：14、5、16、7、10及3；SEQ ID NO：15、5、17、8、11及3；SEQ ID NO：14、5、16、9、12及3；或SEQ ID NO：14、5、16、9、13及3)。

在某些具體實例中，GITR抗原結合域包含源自於人類IGKV4-1生殖系序列之輕鏈可變構架區(例如IGKV4-1*01，其例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：28)。

在某些具體實例中，GITR抗原結合域包含源自於人類IGHV1-2生殖系序列之重鏈可變構架區(例如IGHV1-2*02，其例如具有胺基酸序列SEQ ID NO：27)。

在一個特定具體實例中，特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VL結構域，該VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：19、21、23或26。在一個特定具體實例中，特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VL結構域，該VL結構域由胺基酸序列SEQ ID NO：19、21、23或26組成或基本上由胺基酸序列SEQ ID NO：19、21、23或26組成。

在某些具體實例中，特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VH結構域，該VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：18、20、22、24或25。在一些具體實例中，特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VH結構域，該VH結構域由胺基酸序列SEQ ID NO：18、20、22、24或25組成或基本上由胺基酸序列SEQ ID NO：18、20、22、24或25組成。

在某些具體實例中，特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VH結構域及VL結構域，其中該VH結構域及該VL結構域分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：18及19；SEQ ID NO：20及21；SEQ ID NO：22及23；SEQ ID NO：24及23；或SEQ ID NO：25及26。在某些具體實例中，特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VH結構域及VL結構域，其中該VH結構域及該VL結構域分別由以下胺基酸序列組成或基本上由以下胺基酸序列組成：胺基酸序列SEQ ID NO：18及19；SEQ ID NO：20及21；SEQ ID NO：22及23；SEQ ID NO：24及23；或SEQ ID NO：25及26，例如如表9中所示。

在特定態樣中，本發明提供一種抗原結合域，其包含輕鏈及重鏈，例如各別輕鏈及重鏈。對於輕鏈，在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域之輕鏈為κ輕鏈。在另一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域之輕鏈為λ輕鏈。在另一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域之輕鏈為人類κ輕鏈或人類λ輕鏈。在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR 多肽(例如人類GITR)之抗原結合域包含輕鏈，其中VL結構域之胺基酸序列包含以SEQ ID NO：19、21、23或26示出之序列且其中輕鏈之恆定區包含人類κ輕鏈恆定區之胺基酸序列。在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含輕鏈，其中VL結構域之胺基酸序列包含以SEQ ID NO：19、21、23或26示出之序列且其中輕鏈之恆定區包含人類λ輕鏈恆定區之胺基酸序列。在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含輕鏈，其中VL結構域之胺基酸序列包含以SEQ ID NO：19、21、23或26示出之序列且其中輕鏈之恆定區包含人類κ或λ輕鏈恆定區之胺基酸序列。人類恆定區序列之非限制性實例在此技術中已被描述，例如參見美國專利第5,693,780號及Kabat EA等人(1991)(同上)。

在一個特定具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含輕鏈，該輕鏈包含以SEQ ID NO：37或38示出之胺基酸序列。

對於重鏈，在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域之重鏈可為α重鏈、δ重鏈、ε重鏈、γ重鏈或μ重鏈。在另一個特定具體實例中，所述之抗原結合域之重鏈可包含人類α重鏈、δ重鏈、ε重鏈、γ重鏈或μ重鏈。在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含重鏈，其中 VH結構域之胺基酸序列可包含以SEQ ID NO：18、20、22、24或25示出之序列且其中重鏈之恆定區包含人類γ重鏈恆定區之胺基酸序列。在一個特定具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含重鏈，其中VH結構域之胺基酸序列包含以SEQ ID NO：18、20、22、24或25示出之序列，且其中重鏈之恆定區包含本文所述或此技術中已知之人類重鏈之胺基酸。人類恆定區序列之非限制性實例在此技術中已被描述，例如參見美國專利第5,693,780號及Kabat EA等人(1991)(同上)。

在一個特定具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：31示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：32示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：33示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：34示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：35示出之胺基酸序列。在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含重鏈，該重鏈包含以SEQ ID NO：39示出之胺基酸序列。

在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VL結構域及VH結構域，該VL結構域及VH結構域包含本文所述之任何胺基酸序列，其中恆定區包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、或人類IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列。在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VL結構域及VH結構域，該VL結構域及VH結構域包含本文所述之任何胺基酸序列，其中恆定區包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何類別(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂)或任何子類(例如IgG_2a及IgG_2b)之免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列。在一個特定具體實例中，恆定區包含人類IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何類別(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂)或任何子類(例如IgG_2a及IgG_2b)之免疫球蛋白分子之恆定區之胺基酸序列。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VL 結構域及VH結構域，該VL結構域及VH結構域包含本文所述之任何胺基酸序列，其中恆定區包含人類IgG₁(例如同種異型G1m3、G1m17,1或G1m17,1,2)、人類IgG₂或人類IgG₄之恆定區之胺基酸序列。在一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含VL結構域及VH結構域，該VL結構域及VH結構域包含本文所述之任何胺基酸序列，其中恆定區包含人類IgG₁(同種異型G1m3)之恆定區之胺基酸序列。人類恆定區之非限制性實例在此技術中被描述，例如參見Kabat EA等人(1991)(同上)。

在另一個具體實例中，本文所述之特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含輕鏈和重鏈，該輕鏈包含以SEQ ID NO：37示出之胺基酸序列且該重鏈包含以SEQ ID NO：31、32、33、34、35或39示出之胺基酸序列。

在某些具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含與pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之VL結構域之胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：19、21或23)具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性之VL結構域，例如其中該抗原結合域包含與pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之VL CDR相同之VL CDR。

在某些具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含與pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之VH結構域之胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：18、20、22或24)具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性之VH結構域，例如其中該抗原結合域包含與pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之VH CDR相同之VH CDR。

在某些具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域包含：(i)與pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之VL結構域之胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：19、21或23)具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性之VL結構域；及(ii)與pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之VH結構域之胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：18、20、22或24)具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性之VH結構域，例如其中該抗體包含與pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之VL CDR及VH CDR相同之VL CDR及VH CDR。

在特定態樣中，本發明提供一種抗原結合域，其與包含VH結構域及VL結構域之抗原結合域競爭 (例如以劑量依賴性方式)特異性結合GITR(例如人類GITR)，該VH結構域及該VL結構域分別具有以SEQ ID NO：18及19；SEQ ID NO：20及21；SEQ ID NO：22及23；或SEQ ID NO：24及23示出之胺基酸序列。

在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域為被與GITR(例如人類GITR)之特異性結合由包含VH結構域及VL結構域之抗原結合域競爭性阻斷(例如以劑量依賴性方式)之抗原結合域，該VH結構域及該VL結構域分別具有以SEQ ID NO：18及19；SEQ ID NO：20及21；SEQ ID NO：22及23；或SEQ ID NO：24及23示出之胺基酸序列。

在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域免疫特異性結合與由pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w所結合之表位相同之表位或與該表位重疊之表位。

在一個特定態樣中，相對於本文所述之抗原結合域與SEQ ID NO：41之殘基26至241之人類GITR序列之間的結合，該抗原結合域與變異型GITR之間的結合實質上減弱，其中除了存在D60A或G63A突變之外，該變異型GITR包含SEQ ID NO：41之殘基26至241之序列，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：41。在一些具體實例中，除了存在D60A及G63A突變之外，該變異型GITR包含SEQ ID NO：41之殘基26至241之序列，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：41。

在一個特定態樣中，本文所述之抗原結合域結合人類GITR序列之表位，該表位包含SEQ ID NO：41之胺基酸60至63中之至少一個殘基、基本上由SEQ ID NO：41之胺基酸60至63中之至少一個殘基組成或由SEQ ID NO：41之胺基酸60至63中之至少一個殘基組成。在一些具體實例中，該表位包含SEQ ID NO：41之胺基酸60至63、基本上由SEQ ID NO：41之胺基酸60至63組成或由SEQ ID NO：41之胺基酸60至63組成。

在一個特定具體實例中，本文所述之抗原結合域結合人類GITR之表位，該表位包含以下殘基、基本上由以下殘基組成或由以下殘基組成，該殘基選自由以下組成之群：SEQ ID NO：41之殘基60、62及63、及彼等之組合。在一些具體實例中，該表位包含任一個殘基或任何兩個或三個殘基、基本上由任一個殘基或任何兩個或三個殘基組成或由任一個殘基或任何兩個或三個殘基組成，該或該等殘基選自由以下組成之群：SEQ ID NO：41之殘基60、62及63。

在一個特定態樣中，相較於與SEQ ID NO：41 之殘基26至241之人類GITR序列之結合，本文所述之抗原結合域表現與SEQ ID NO：41之殘基26至241相同但存在D60A或G63A胺基酸突變(例如取代)之蛋白質的減少或缺少之結合，該胺基酸突變選自由以下組成之群：D60A及G63A，該胺基酸編號係根據SEQ ID NO：41。在一些具體實例中，該取代為D60A，其係根據SEQ ID NO：41編號。在一些具體實例中，該取代為G63A，其係根據SEQ ID NO：41編號。

在特定態樣中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域在以單特異性二價形式存在時用作促效劑。

在某些具體實例中，相對於不存在任何抗體之情況下或存在無關抗體(例如非免疫特異性結合GITR之抗體)之情況下的GITR(例如人類GITR)活性，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域在以單特異性二價形式存在時使GITR(例如人類GITR)活性增加至少約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如藉由本文所述及/或熟習此技術者已知之方法評定。在某些具體實例中，相對於不存在任何抗體之情況下或存在無關抗體(例如非免疫特異性結合GITR之抗體)之情況下的GITR(例如人類GITR)活性，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域在以單特異性二價形式存在時使GITR(例如人類GITR)活性增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%，如藉由本文所述及/或熟習此技術者已知之方法評定。GITR(例如人類GITR)活性之非限制性實例可包括GITR(例如人類GITR)信號傳導、細胞增殖、細胞存活及細胞激素產生(例如IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10及/或IL-13)。在某些具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR(例如人類GITR)之抗原結合域在以單特異性二價形式存在時誘導、增強或增加GITR(例如人類GITR)活性。在特定具體實例中，GITR活性之增加係如下文實施例中所述評定。

在某些具體實例中，本發明提供之多特異性(例如雙特異性)抗體包含如國際申請案第PCT/US2015/032895號中所述之結合GITR之抗原結合域，該國際申請案以全文引用之方式併入本文中。

7.2.3 抗原結合域

在某些態樣中，本文所述之抗原結合域可單獨由其VL結構域、或單獨由其VH結構域、或單獨由其3個VL CDR、或單獨由其3個VH CDR來描述。參見例如Rader C等人(1998)PNAS 95：8910-8915，該文獻以全文引用之方式併入本文中，其描述藉由分別自人類輕鏈或重鏈庫識別互補輕鏈或重鏈以對小鼠抗αvβ3抗體進行人類化，從而產生具有與原始抗體之親和力同樣高或比該親和力高之親和力的人類化抗體變異體。亦參見Clackson T等人(1991)Nature 352：624-628，該文獻以全文引用之方式併入本文中，其描述產生結合特定抗原之抗體的方法，該等方法係藉由使用特定VL結構域(或VH結構域)且在庫中篩選互補可變域。該篩選產生特定VH結構域之14個新伴及特定VL結構域之13個新伴，其為強結合劑，如由ELISA所測定。亦參見Kim S J及Hong H J,(2007)J Microbiol 45：572-577，該文獻以全文引用之方式併入本文中，其描述產生結合特定抗原之抗體之方法，該等方法係藉由使用特定VH結構域且在庫(例如人類VL庫)中篩選互補VL結構域；進而可使用所選擇之VL結構域以指導額外之互補(例如人類)VH結構域之選擇。

在某些態樣中，抗原結合域之CDR可根據Chothia編號方案確定，其係指免疫球蛋白結構環之位置(參見例如Chothia C及Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196：901-917；Al-Lazikani B等人(1997)J Mol Biol 273：927-948；Chothia C等人，(1992)J Mol Biol 227：799-817； Tramontano A等人，(1990)J Mol Biol 215(1)：175-82；及美國專利第7,709,226號)。通常，當使用Kabat編號慣例時，Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33或34處，Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56處，且Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102處，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34處，Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56處，且Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97處。當使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-H1環之末端在H32與H34之間變動，視環之長度而定(此係因為Kabat編號方案在H35A及H35B處置放插入物；若既不存在35A，亦不存在35B，則該環終止於32；若僅存在35A，則該環終止於33；若存在35A及35B兩者，則該環終止於34)。

在某些態樣中，本發明提供抗原結合域，其特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)且包含pab1876w、pab1967w、pab1975w、pab1979w、pab2049w或pab1949w之VL之Chothia VL CDR。在某些態樣中，本發明提供抗原結合域，其特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)且包含pab1876、pab1967、pab1975、pab1979、pab2049或pab1949之VH之Chothia VH CDR。在某些態樣中，本發明提供抗原結合域，其特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)且包含pab1876、pab1967、pab1975w、pab1979w、 pab2049w或pab1949w之VL之Chothia VL CDR，且包含pab1876w、pab1967w、pab1975w、pab1979w、pab2049w或pab1949w之VH之Chothia VH CDR。在某些具體實例中，特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含一或多個CDR，其中Chothia CDR與Kabat CDR具有相同之胺基酸序列。在某些具體實例中，本發明提供抗原結合域，其特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)且包含Kabat CDR與Chothia CDR之組合。

在某些態樣中，抗原結合域之CDR可根據IMGT編號系統確定，如以下文獻中所述：Lefranc M-P,(1999)The Immunologist 7：132-136；及Lefranc M-P等人，(1999)Nucleic Acids Res 27：209-212。根據IMGT編號方案，VH-CDR1處於位置26至35處，VH-CDR2處於位置51至57處，VH-CDR3處於位置93至102處，VL-CDR1處於位置27至32處，VL-CDR2處於位置50至52處，且VL-CDR3處於位置89至97處。在一個特定具體實例中，本文提供抗原結合域，其特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)且包含pab1876w、pab1967w、pab1975w、pab1979w、pab2049w或pab1949w之如藉由IMGT編號系統確定之CDR，例如如Lefranc M-P(1999)(同上)及Lefranc M-P等人(1999)(同上)中所述。

在某些態樣中，抗原結合域之CDR可根據MacCallum RM等人，(1996)J Mol Biol 262：732-745確定。亦參見例如Martin A.「抗體可變域之蛋白質序列及結構分析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)」,《抗體工程改造(Antibody Engineering)》,Kontermann及Dübel編，第31章，第422-439頁，Springer-Verlag,Berlin(2001)。在一個特定具體實例中，本發明提供抗原結合域，其特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)且包含pab1876w、pab1967w、pab1975w、pab1979w、pab2049w或pab1949w之如由MacCallum RM等人之方法所確定之CDR。

在某些態樣中，抗體之CDR可根據AbM編號方案確定，其涉及AbM高變區，該等AbM高變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體(Oxford Molecular Group公司)所使用。在一個特定具體實例中，本發明提供抗原結合域，其特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)且包含pab1876w、pab1967w、pab1975w、pab1979w、pab2049w或pab1949w之如由AbM編號方案確定之CDR。

在一個特定具體實例中，沿本文所述之抗原結合域之VH區(例如CDR1、CDR2或CDR3)及/或VL區 (例如CDR1、CDR2或CDR3)之一或多個CDR之位置可變化一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸位置，只要維持(例如實質上維持例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合即可。舉例而言，在一個具體實例中，界定本文所述之抗原結合域之CDR的位置可藉由使CDR之N末端及/或C末端邊界相對於本文所述之抗原結合域之CDR位置移動一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸而變化，只要維持(例如實質上維持例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合即可。在另一個具體實例中，沿本文所述之抗原結合域之VH區(例如CDR1、CDR2或CDR3)及/或VL區(例如CDR1、CDR2或CDR3)之一或多個CDR之長度可變化(例如更短或更長)一個、兩個、三個、四個、五個或多於五個胺基酸，只要維持(例如實質上維持例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合即可。

在一個具體實例中，本文所述之VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2及/或VH CDR3可比本文所述之一或多個CDR(例如SEQ ID NO：1至6；SEQ ID NO：87、88、3、90、5及92；SEQ ID NO：7、10、3、14、5及16；SEQ ID NO：8、11、3、15、5及17；SEQ ID NO：9、12、3、14、5及16；SEQ ID NO：9、13、3、14、5及16；SEQ ID NO：47至52；或SEQ ID NO：47至51及53)短一個、兩個、三個、四個、五個或多於五個胺基酸，只要維持(例如實質上維持例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合即可。在另一個具體實例中，本文所述之VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2及/或VH CDR3可比本文所述之一或多個CDR(例如SEQ ID NO：1至6；SEQ ID NO：87、88、3、90、5及92；SEQ ID NO：7、10、3、14、5及16；SEQ ID NO：8、11、3、15、5及17；SEQ ID NO：9、12、3、14、5及16；SEQ ID NO：9、13、3、14、5及16；SEQ ID NO：47至52；或SEQ ID NO：47至51及53)長一個、兩個、三個、四個、五個或多於五個胺基酸，只要維持(例如實質上維持例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合即可。在另一個具體實例中，相較於本文所述之一或多個CDR(例如SEQ ID NO：1至6；SEQ ID NO：87、88、3、90、5及92；SEQ ID NO：7、10、3、14、5及16；SEQ ID NO：8、11、3、15、5及17；SEQ ID NO：9、12、3、14、5及16；SEQ ID NO：9、13、3、 14、5及16；SEQ ID NO：47至52；或SEQ ID NO：47至51及53)，本文所述之VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2及/或VH CDR3之胺基末端可延長一個、兩個、三個、四個、五個或多於五個胺基酸，只要維持(例如實質上維持例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合即可。在另一個具體實例中，相較於本文所述之一或多個CDR(例如SEQ ID NO：1至6)，本文所述之VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2及/或VH CDR3之羧基末端可延長一個、兩個、三個、四個、五個或多於五個胺基酸，只要維持(例如實質上維持例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合即可。在另一個具體實例中，相較於本文所述之一或多個CDR(例如SEQ ID NO：1至6)，本文所述之VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2及/或VH CDR3之胺基末端可縮短一個、兩個、三個、四個、五個或多於五個胺基酸，只要維持(例如實質上維持例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合即可。在一個具體實例中，相較於本文所述之一或多個CDR(例如SEQ ID NO：1至6；SEQ ID NO：87、88、3、90、5及92；SEQ ID NO：7、10、3、14、5及16；SEQ ID NO：8、11、3、15、5及17；SEQ ID NO：9、12、3、14、5及16；SEQ ID NO：9、13、3、14、5及16；SEQ ID NO：47至52；或SEQ ID NO：47至51及53)，本文所述之VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2及/或VH CDR3之羧基末端可縮短一個、兩個、三個、四個、五個或多於五個胺基酸，只要維持(例如實質上維持例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%)與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合即可。可使用此技術中已知之任何方法以確定是否維持與GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之免疫特異性結合，例如本文提供之「實施例」部分(部分8)中所述之結合分析及條件。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含重鏈及輕鏈，其中(i)該重鏈及輕鏈分別包含VH結構域及VL結構域，其中該VH結構域及VL結構域之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含以SEQ ID NO：1至6；SEQ ID NO：87、88、3、90、5及92；SEQ ID NO：7、10、3、14、5及16；SEQ ID NO：8、11、3、15、5及17；SEQ ID NO：9、12、3、14、5及16；SEQ ID NO：9、13、3、 14、5及16；SEQ ID NO：47至52；或SEQ ID NO：47至51及53示出之胺基酸序列；(ii)該輕鏈進一步包含輕鏈恆定域，其包含人類κ輕鏈之恆定域之胺基酸序列；及(iii)該重鏈進一步包含重鏈恆定域，其包含人類IgG₁(視情況為IgG₁(同種異型G1m3))重鏈之恆定域之胺基酸序列。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含重鏈及輕鏈，其中(i)該重鏈及輕鏈分別包含VH結構域及VL結構域，該VH結構域及VL結構域分別包含以SEQ ID NO：18及19；SEQ ID NO：20及21；SEQ ID NO：22及23；SEQ ID NO：24及23；SEQ ID NO：25及26；SEQ ID NO：54及55；或SEQ ID NO：54及56示出之胺基酸序列；(ii)該輕鏈進一步包含恆定域，其包含人類κ輕鏈之恆定域之胺基酸序列；及(iii)該重鏈進一步包含恆定域，其包含人類IgG₁(視情況為IgG₁(同種異型G1m3))重鏈之恆定域之胺基酸序列。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含重鏈及輕鏈，其中(i)該重鏈及輕鏈分別包含VH結構域及VL結構域，其中該VH結構域及VL結構域之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含以SEQ ID NO：1至6；SEQ ID NO：87、88、3、90、5及92；SEQ ID NO：7、10、3、 14、5及16；SEQ ID NO：8、11、3、15、5及17；SEQ ID NO：9、12、3、14、5及16；SEQ ID NO：9、13、3、14、5及16；SEQ ID NO：47至52；或SEQ ID NO：47至51及53示出之胺基酸序列；(ii)該輕鏈進一步包含輕鏈恆定域，其包含人類κ輕鏈之恆定域之胺基酸序列；及(iii)該重鏈進一步包含重鏈恆定域，其包含人類IgG₄重鏈之恆定域之胺基酸序列。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含重鏈及輕鏈，其中(i)該重鏈及輕鏈分別包含VH結構域及VL結構域，該VH結構域及VL結構域分別包含以SEQ ID NO：18及19；SEQ ID NO：20及21；SEQ ID NO：22及23；SEQ ID NO：24及23；SEQ ID NO：25及26；SEQ ID NO：54及55；或SEQ ID NO：54及56示出之胺基酸序列；(ii)該輕鏈進一步包含恆定域，其包含人類κ輕鏈之恆定域之胺基酸序列；及(iii)該重鏈進一步包含恆定域，其包含人類IgG₄重鏈之恆定域之胺基酸序列。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含重鏈及輕鏈，其中(i)該重鏈及輕鏈分別包含VH結構域及VL結構域，其中該VH結構域及VL結構域之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含以SEQ ID NO：1至6；SEQ ID NO：87、88、3、90、5及92；SEQ ID NO：7、10、3、14、5及16；SEQ ID NO：8、11、3、15、5及17；SEQ ID NO：9、12、3、14、5及16；SEQ ID NO：9、13、3、14、5及16；SEQ ID NO：47至52；或SEQ ID NO：47至51及53示出之胺基酸序列；(ii)該輕鏈進一步包含輕鏈恆定域，其包含人類κ輕鏈之恆定域之胺基酸序列；及(iii)該重鏈進一步包含重鏈恆定域，其包含人類IgG₂重鏈之恆定域之胺基酸序列。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含重鏈及輕鏈，其中(i)該重鏈及輕鏈分別包含VH結構域及VL結構域，該VH結構域及VL結構域分別包含以SEQ ID NO：18及19；SEQ ID NO：20及21；SEQ ID NO：22及23；SEQ ID NO：24及23；SEQ ID NO：25及26；SEQ ID NO：54及55；或SEQ ID NO：54及56示出之胺基酸序列；(ii)該輕鏈進一步包含恆定域，其包含人類κ輕鏈之恆定域之胺基酸序列；及(iii)該重鏈進一步包含恆定域，其包含人類IgG₂重鏈之恆定域之胺基酸序列。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含重鏈及輕鏈，其中(a)包含在胺基酸位置297處具有N經A或Q之胺基酸取代之胺基酸序列SEQ ID NO：59的重鏈；及(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或 69之輕鏈。

在另一個特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含(a)包含具有選自由以下組成之群的胺基酸取代之胺基酸序列SEQ ID NO：59或29之重鏈：胺基酸位置267處S經E之取代、胺基酸位置328處L經F之取代、及胺基酸位置267處S經E之取代及胺基酸位置328處L經F之取代兩者；及(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：67或69或SEQ ID NO：37之輕鏈。

在特定具體實例中，本文所述之免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之抗原結合域包含構架區(例如VL結構域及/或VH結構域之構架區)，該等構架區為人類構架區或源自於人類構架區。人類構架區之非限制性實例在此技術中被描述，例如參見Kabat EA等人(1991)(同上)。在某個具體實例中，本文所述之抗原結合域包含構架區(例如VL結構域及/或VH結構域之構架區)，該等構架區為靈長類動物(例如非人類靈長類動物)構架區或源自於靈長類動物(例如非人類靈長類動物)構架區。

舉例而言，將來自抗原特異性非人類抗體(通常為囓齒類動物來源(例如小鼠或大鼠))之CDR移植至同源人類或非人類靈長類動物接受體構架上。在一個具體實例中，非人類靈長類動物接受體構架來自舊世界猿。在一個特定具體實例中，舊世界猿接受體構架來自黑猩猩(Pan troglodytes)、侏儒黑猩猩(Pan paniscus)或大猩猩(Gorilla gorilla)。在一個特定具體實例中，非人類靈長類動物接受體構架來自黑猩猩。在一個特定具體實例中，非人類靈長類動物接受體構架為舊世界猴接受體構架。在一個特定具體實例中，舊世界猴接受體構架來自獼猴屬(Macaca)。在某個具體實例中，非人類靈長類動物接受體構架源自於石蟹獼猴(Macaca cynomolgus)。非人類靈長類動物構架序列描述於美國專利申請公開案第US 2005/0208625號中。

在另一個態樣中，本發明提供含有抗原結合域之抗體，該等抗原結合域與本文所述之抗體(例如pab1949w、pab2049w或pab1876w)結合GITR或OX40之相同或重疊表位(例如人類GITR或OX40之表位)。在某些具體實例中，抗體之表位可藉由例如NMR光譜學、X射線繞射結晶學研究、ELISA分析、氫/氘交換聯同質譜分析(例如液相層析電噴霧質譜分析)、基於陣列之寡肽掃描分析及/或突變誘發定位(例如定點突變誘發定位)確定。對於X射線結晶學，結晶可使用此技術中已知方法中之任一者實現(例如Giegé R等人，(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303)。抗體：抗原晶體可使用習知之X射線繞射技術來研究且可使用電腦軟體來精修，該電腦軟體諸如X-PLOR(耶魯大學，1992，由Molecular Simulations公司經銷；參見例如Meth Enzymol(1985)第114卷及第115卷，Wyckoff HW等人編；美國專利申請案第2004/0014194號)及BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1)：37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423,Carter CW編；Roversi P等人，(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10)：1316-1323)。突變誘發定位研究可使用熟習此技術者已知之任何方法來實現。參見例如Champe M等人(1995)(同上)；及Cunningham BC及Wells JA(1989)(同上)中對包括丙胺酸掃描突變誘發技術之突變誘發技術之描述。在一個特定具體實例中，抗原結合片段之表位係使用丙胺酸掃描突變誘發研究確定。此外，識別且結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)之相同或重疊表位之抗原結合片段可使用諸如免疫分析之常規技術，例如藉由顯示一種抗體阻斷另一種抗體與靶抗原結合之能力(亦即競爭結合分析)來識別。競爭結合分析亦可用於確定兩種抗體是否對表位具有相似之結合特異性。競爭結合可在其中所測試之免疫球蛋白抑制參考抗體與共同抗原(諸如GITR或OX40)之特異性結合之分析確定。許多類型之競爭結合分析為已知，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析 (參見Stahli C等人，(1983)Methods Enzymol 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland TN等人，(1986)J Immunol 137：3614-9)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow E及Lane D,(1988)《抗體：實驗室手冊(Antibodies：A Laboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel GA等人，(1988)Mol Immunol 25(1)：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung RC等人，(1990)Virology 176：546-52)；及直接標記RIA(Moldenhauer G等人，(1990)Scand J Immunol 32：77-82)。通常，此種分析涉及使用結合至固體表面之純化抗原(例如GITR或OX40，諸如人類GITR或OX40)或帶有此等抗原中之任一者之細胞、未標記之測試免疫球蛋白及標記之參考免疫球蛋白。競爭性抑制可藉由測定在測試免疫球蛋白存在下結合至固體表面或細胞之標記的量來量測。通常，測試免疫球蛋白以過量存在。通常，當競爭性抗體以過量存在時，其將參考抗體與共同抗原之特異性結合抑制至少50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%、70%至75%或大於75%。競爭結合分析可使用標記抗原或標記抗體組態成許多不同形式。在此分析之常見型式中，將抗原固定在96孔盤上。接著使用放射性標記或酶標記量測未標記之抗體阻斷標記之抗體與抗原結合之能力。對於另外之細節，參見例如Wagener C等人， (1983)J Immunol 130：2308-2315；Wagener C等人，(1984)J Immunol Methods 68：269-274；Kuroki M等人，(1990)Cancer Res 50：4872-4879；Kuroki M等人，(1992)Immunol Invest 21：523-538；Kuroki M等人，(1992)Hybridoma 11：391-407；及《抗體：實驗室手冊(Antibodies：A Laboratory Manual)》,Harlow E及Lane D編(同上)，第386-389頁。

在一個具體實例中，競爭分析係使用表面電漿共振(BIAcore^®)，例如藉由『串聯方法』，諸如Abdiche YN等人，(2009)Analytical Biochem 386：172-180所述之方法來進行，藉此將GITR或OX40抗原固定於晶片表面(例如CM5感應器晶片)上，且接著使抗GITR或OX40抗體在該晶片上通過。為確定抗體是否與本文所述之抗GITR或OX40抗原結合域競爭，首先使含有該抗GITR或OX40抗原結合域之抗體在晶片表面上通過以達成飽和，且接著添加潛在之競爭性抗體。接著可測定競爭性抗體之結合且相對於非競爭性對照定量。

在某些態樣中，當兩種抗體在諸如競爭ELISA分析之競爭結合分析中識別相同或空間上重疊之表位時，可使用競爭結合分析來確定其中一種抗體是否由其中作為參考抗體之另一種抗體(例如結合基本上相同之表位或重疊表位之抗體)例如以劑量依賴性方式競爭性阻斷，該等競爭結合分析可使用標記之抗原或標記之抗體組態成許多不同形式。在一個特定具體實例中，可在競爭結合分析中用本文所述之抗體(例如抗體pab1949w、pab2049w或pab1876w)、或其嵌合或Fab抗體、或包含本文所述之抗體(例如pab1949w、pab2049w或pab1876w)之VH CDR及VL CDR之抗體來測試抗體。

在另一個態樣中，本發明提供抗原結合域，其與本文所述之抗原結合域競爭(例如以劑量依賴性方式)結合GITR或OX40(例如人類OX40)，如使用熟習此技術者已知或本文所述之分析(例如ELISA競爭分析或表面電漿共振)確定。在另一個態樣中，本發明提供抗原結合域，其競爭性抑制(例如以劑量依賴性方式)本文所述之抗原結合域(例如pab1949w、pab2049w或pab1876w)結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)，如使用熟習此技術者已知或本文所述之分析(例如ELISA競爭分析、或懸浮陣列或表面電漿共振分析)確定。在特定態樣中，本文提供抗原結合片段，其與包含本文所述之胺基酸序列(例如pab1949w、pab2049w或pab1876w之VL及/或VH胺基酸序列)之抗體競爭(例如以劑量依賴性方式)特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)，如使用熟習此技術者已知或本文所述之分析(例如ELISA競爭分析、或懸浮陣列或表面電漿共振分析)確定。

在某些具體實例中，本發明提供抗原結合片段，其與本文所述之抗原結合片段競爭結合GITR或 OX40(例如人類GITR或OX40)，該競爭程度與本文所述之抗原結合片段自我競爭結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之程度相同。在一些具體實例中，本發明提供第一抗原結合抗體片段，其與本文所述之抗原結合抗體片段競爭結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)，其中該第一抗原結合抗體片段在包括下列步驟之分析中競爭結合：(a)將GITR及/或OX40轉染之細胞與呈未標記形式之第一抗原結合抗體片段在容器中培育；及(b)在該容器中添加呈標記形式之本文所述之抗原結合抗體片段且在該容器中培育細胞；及(c)偵測呈標記形式之本文所述之抗原結合抗體片段與細胞之結合。在某些具體實例中，本發明提供第一抗原結合抗體片段，其與本文所述之抗原結合抗體片段競爭結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)，其中該競爭表現為該第一抗原結合抗體片段與GITR或OX40之結合減少超過80%(例如85%、90%、95%、或98%、或80%至85%、80%至90%、85%至90%或85%至95%)。

7.3 抗體產生

免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及人類OX40)之多特異性(例如雙特異性)抗體可藉由此技術中已知用於合成抗體之任何方法，例如藉由化學合成或藉由重組表現技術產生。除非另外指示，否則本文所述之方法使用分子生物學、微生物學、遺傳分析、重組DNA、有機化學、生物化學、PCR、寡核苷酸合成及修飾、核酸雜交及此技術內相關領域之習知技術。此等技術描述於例如本文引用之參考文獻中且在文獻中加以充分解釋。參見例如Maniatis T等人，(1982)《分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人，(1989),《分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人，(2001)《分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM等人，《最新分子生物學方案(Current Protocols in Molecular Biology)》,John Wiley & Sons(1987年及每年更新)；《最新免疫學方案(Current Protocols in Immunology)》,John Wiley & Sons(1987年及每年更新)；Gait(編)(1984)《寡核苷酸合成：實用方法(Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach)》,IRL Press；Eckstein(編)(1991)《寡核苷酸及類似物：實用方法(Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach)》,IRL Press；Birren B等人(編)(1999)《基因組分析：實驗室手冊(Genome Analysis：A Laboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Laboratory Press。

在一個特定具體實例中，本文所述之多特異性(例如雙特異性)抗體為藉由任何方式製備、表現、形成或分離之多特異性(例如雙特異性)抗體(例如重組抗體)，該方式涉及例如經由DNA序列之合成、遺傳工程改造形成。在某些具體實例中，此種多特異性(例如雙特異性)抗體包含在動物或哺乳動物(例如人類)之活體內抗體生殖系譜系內非天然存在之序列(例如DNA序列或胺基酸序列)。

雙特異性二價抗體及製備彼之方法描述於例如美國專利第5,731,168號、第5,807,706號、第5,821,333號及美國申請公開案第2003/020734號及第2002/0155537號中，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。雙特異性四價抗體及製備彼之方法描述於例如國際申請公開案第WO02/096948號及第WO00/44788號中，此兩者之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。一般參見國際申請公開案第WO93/17715號、第WO92/08802號、第WO91/00360號及第WO92/05793號；Tutt等人，J.Immunol.147：60-69(1991)；美國專利第4,474,893號；第4,714,681號；第4,925,648號；第5,573,920號；及第5,601,819號；及Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。

如本文所述之雙特異性抗體可根據DuoBody技術平台(Genmab A/S公司)來產生，如例如國際公開案第WO 2011/131746號、第WO 2011/147986號、第WO 2008/119353號及第WO 2013/060867號；以及Labrijn AF等人，(2013)PNAS 110(13)：5145-5150中所述。DuoBody技術可用於將含有兩個重鏈及兩個輕鏈之第一單特異性抗體之一半與含有兩個重鏈及兩個輕鏈之第二單特異性抗體之一半組合。所得之異二聚體含有與來自第二抗體之一個重鏈及一個輕鏈配對之來自第一抗體之一個重鏈及一個輕鏈。當該兩種單特異性抗體識別不同抗原上之不同表位時，所得之異二聚體為雙特異性抗體。

DuoBody技術要求該等單特異性抗體各自包括在CH3結構域中具有單點突變之重鏈恆定區。該等點突變允許所得之雙特異性抗體中之CH3結構域之間的相互作用強於該等單特異性抗體中之任一者中之CH3結構域之間的相互作用。各單特異性抗體中之單點突變處於重鏈恆定區之CH3結構域中之殘基366、368、370、399、405、407或409處，該胺基酸編號係根據EU編號系統，如例如國際公開案第WO 2011/131746號中所述。此外，在一種單特異性抗體中，相較於另一種單特異性抗體，該單點突變位於不同之殘基處。舉例而言，一種單特異性抗體可包含突變F405L(亦即在殘基405處苯丙胺酸突變成白胺酸)，而另一種單特異性抗體可包含突變K409R(亦即在殘基409處離胺酸突變成精胺酸)，該胺基酸編號係根據EU編號系統。單特異性抗體之重鏈恆定區可為IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄同型(例如人類IgG₁同型)，且藉由DuoBody技術產生之雙特異性抗體可保留Fc介導之效應功能。

另一種產生雙特異性抗體之方法已稱作「杵入臼」策略(參見例如國際公開案WO2006/028936)。在此技術中藉由使IgG中形成CH3結構域之界面之所選胺基酸突變來減少Ig重鏈之錯配。在CH3結構域內兩個重鏈直接相互作用之位置處，將具有小側鏈之胺基酸(臼)引入一個重鏈之序列中，且將具有大側鏈之胺基酸(杵)引入另一個重鏈上之對應相互作用殘基位置中。在一些具體實例中，本發明之組合物具有免疫球蛋白鏈，其中已藉由使在兩個多肽之間的界面處相互作用之所選胺基酸突變以優先形成雙特異性抗體來修飾CH3結構域。雙特異性抗體可由同一子類(例如IgG1或IgG3)或不同子類(例如IgG1及IgG3、或IgG3及IgG4)之免疫球蛋白鏈構成。

在一個具體實例中，結合GITR及/或OX40之雙特異性抗體包含「杵鏈」中之T366W突變及「臼鏈」中之T366S、L368A、Y407V突變以及視情況存在之在CH3結構域之間額外之鏈間二硫橋，該二硫橋係藉由例如將Y349C突變引入至「杵鏈」中且將E356C突變或S354C突變引入至「臼鏈」中而形成；「杵鏈」中之 R409D、K370E突變及「臼鏈」中之D399K、E357K突變；「杵鏈」中之R409D、K370E突變及「臼鏈」中之D399K、E357K突變；「杵鏈」中之T366W突變及「臼鏈」中之T366S、L368A、Y407V突變；「杵鏈」中之R409D、K370E突變及「臼鏈」中之D399K、E357K突變；一個鏈中之Y349C、T366W突變及對應鏈中之E356C、T366S、L368A、Y407V突變；一個鏈中之Y349C、T366W突變及對應鏈中之S354C、T366S、L368A、Y407V突變；一個鏈中之Y349C、T366W突變及對應鏈中之S354C、T366S、L368A、Y407V突變；以及一個鏈中之Y349C、T366W突變及對應鏈中之S354C、T366S、L368A、Y407V突變(該等胺基酸編號係根據EU編號系統)。

結合GITR及/或OX40之雙特異性抗體在一些情況下可含有IgG4與IgG1、IgG4與IgG2、IgG4與IgG2、IgG4與IgG3、或IgG1與IgG3鏈異二聚體。此等異二聚體重鏈抗體可常規地藉由例如修飾人類IgG4及IgG1或IgG3中形成CH3結構域之界面的所選胺基酸以有利於異二聚體重鏈形成經工程改造。

在特定具體實例中，多特異性(例如雙特異性)抗體可為嵌合抗體或人類化抗體。在某些具體實例中，多特異性(例如雙特異性)抗體可為F(ab')₂片段。F(ab')₂片段含有四聚體抗體分子之由鉸鏈區中之二硫鍵連接的兩個抗原結合臂。

本文所述之多特異性(例如雙特異性)抗體可藉由熟習此技術者已知之任何技術產生。舉例而言，本文所述之F(ab')₂片段可藉由使用諸如胃蛋白酶之酶對免疫球蛋白分子進行蛋白水解裂解產生。

在某個態樣中，本文提供一種製備免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)之抗體或抗原結合片段的方法，其包括培養本文所述之一種細胞或多種細胞。在某個態樣中，本文提供一種製備免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)之抗體或抗原結合片段之方法，其包括使用本文所述之細胞或宿主細胞(例如包含編碼本文所述之抗體之聚核苷酸之細胞或宿主細胞)使該抗體或抗原結合片段表現(例如重組表現)。在一個特定具體實例中，該細胞為分離之細胞。在一個特定具體實例中，已將外源性聚核苷酸引入該細胞中。在一個特定具體實例中，該方法進一步包括純化獲自該細胞或宿主細胞之抗體或抗原結合片段之步驟。

抗體之抗原結合片段可例如自單株抗體並使用此技術中已知之多種技術製備，該等技術包括使用融合瘤、重組體及噬菌體呈現技術或彼等之組合。舉例而言，單株抗體可使用融合瘤技術產生，該等技術包括此技術中已知及教示之彼等技術，例如Harlow E及Lane D,《抗體：實驗室手冊(Antibodies：A Laboratory Manual)》, (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling GJ等人，《單株抗體及T細胞融合瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)》,563 681(Elsevier,N.Y.,1981)。如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。舉例而言，單株抗體可由外源表現本文所述之抗體的宿主細胞重組產生。本文所述之單株抗體可例如藉由如Kohler G及Milstein C(1975)Nature 256：495中所述之融合瘤方法來製備，或可例如使用例如如本文所述之技術自噬菌體庫分離。用於製備純系細胞株及由其所表現之單株抗體的其他方法為此技術中所習知(參見例如《精編分子生物學實驗指南(Short Protocols in Molecular Biology)》,(2002)第5版，Ausubel FM等人(同上)中之第11章)。

此外，本文所述之抗體或其抗原結合片段亦可使用此技術中已知之各種噬菌體呈現方法產生。在噬菌體呈現方法中，使蛋白質呈現於攜帶編碼彼之聚核苷酸序列之噬菌體顆粒之表面上。特定而言，自動物cDNA庫(例如受影響之組織之人類或鼠類cDNA庫)擴增編碼VH結構域及VL結構域之DNA序列。用scFv連接子藉由PCR將編碼VH結構域及VL結構域之DNA重組在一起且選殖至噬菌粒載體中。將該載體在大腸桿菌中電穿孔且用輔助噬菌體感染大腸桿菌。此等方法中所用之噬菌體通常為包括fd及M13之絲狀噬菌體，且VH結構域及VL結構域通常重組融合至噬菌體基因III或基因VIII。可用抗原，例如使用標記之抗原或結合或捕捉至固體表面或珠粒之抗原，以選擇或識別表現結合特定抗原之抗體或片段之噬菌體。可用於製備本文所述之抗體之噬菌體呈現方法之實例包括以下文獻中所揭示之彼等方法：Brinkman U等人，(1995)J Immunol Methods 182：41-50；Ames RS等人，(1995)J Immunol Methods 184：177-186；Kettleborough CA等人，(1994)Eur J Immunol 24：952-958；Persic L等人，(1997)Gene 187：9-18；Burton DR及Barbas CF(1994)Advan Immunol 57：191-280；PCT申請案第PCT/GB91/001134號；國際公開案第WO 90/02809號、第WO 91/10737號、第WO 92/01047號、第WO 92/18619號、第WO 93/1 1236號、第WO 95/15982號、第WO 95/20401號、及第WO 97/13844號；及美國專利第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743號、及第5,969,108號。

如上述參考文獻中所述，在噬菌體選擇之後，可分離來自噬菌體之抗體編碼區且用於產生抗體(包括人類抗體)且使其表現於任何所需之宿主中，該宿主包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌，例如如下文所述。亦可使用此技術中已知之方法以利用重組產生抗體(諸如Fab、Fab'及F(ab')₂片段)之技術，該等方法諸如以下文獻中所揭示之彼等方法：PCT公開案第WO 92/22324號；Mullinax RL等人，(1992)BioTechniques 12(6)：864-9；Sawai H等人，(1995)Am J Reprod Immunol 34：26-34；及Better M等人，(1988)Science 240：1041-1043。

在一個態樣中，為產生抗體，可使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位點及保護該限制性位點之側接序列的PCR引子來自模板(例如scFv純系)擴增VH或VL序列。利用熟習此技術者已知之選殖技術，可將PCR擴增之VH結構域選殖至表現VH恆定區之載體中，且可將PCR擴增之VL結構域選殖至表現VL恆定區(例如人類κ或λ恆定區)之載體中。亦可將VH結構域及VL結構域選殖至表現必需之恆定區的一個載體中。接著使用熟習此技術者已知之技術將重鏈轉化載體及輕鏈轉化載體共轉染至細胞株中以產生表現抗體(例如IgG)之穩定或瞬時細胞株。

嵌合抗體為如下分子，其中抗體之不同部分源自於不同免疫球蛋白分子。舉例而言，嵌合抗體可含有小鼠或大鼠單株抗體之可變區，其融合至人類抗體之恆定區。用於產生嵌合抗體之方法為此技術中已知的。參見例如Morrison SL(1985)Science 229：1202-7；Oi VT及 Morrison SL(1986)BioTechniques 4：214-221；Gillies SD等人，(1989)J Immunol Methods 125：191-202；及美國專利第5,807,715號、第4,816,567號、第4,816,397號及第6,331,415號。

人類化抗體能夠結合預定抗原且包含實質上具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列之構架區及實質上具有非人類免疫球蛋白(例如鼠類免疫球蛋白)之胺基酸序列之CDR。在特定具體實例中，人類化抗體亦包含免疫球蛋白(通常為人類免疫球蛋白)恆定區(Fc)之至少一部分。抗體亦可包括重鏈之CH1區、鉸鏈區、CH2區、CH3區及CH4區。人類化抗體可選自任何類別之免疫球蛋白，其包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE；及任何同型，其包括IgG₁、IgG₂、IgG₃及IgG₄。人類化抗體可使用此技術中已知之多種技術產生，該等技術包括(但不限於)CDR移植(歐洲專利第EP 239400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)；鑲飾或表面重整(歐洲專利第EP 592106號及第EP 519596號；Padlan EA(1991)Mol Immunol 28(4/5)：489-498；Studnicka GM等人，(1994)Prot Engineering 7(6)：805-814；及Roguska MA等人，(1994)PNAS 91：969-973)；鏈改組(美國專利第5,565,332號)；及例如以下文獻中所揭示之技術：美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、國際公開案第WO 93/17105號；Tan P等人，(2002)J Immunol 169：1119-25；Caldas C等人，(2000)Protein Eng.13(5)：353-60；Morea V等人，(2000)Methods 20(3)：267-79；Baca M等人，(1997)J Biol Chem 272(16)：10678-84；Roguska MA等人，(1996)Protein Eng 9(10)：895 904；Couto JR等人，(1995)Cancer Res.55(23增刊)：5973s-5977s；Couto JR等人，(1995)Cancer Res 55(8)：1717-22；Sandhu JS(1994)Gene 150(2)：409-10；及Pedersen JT等人，(1994)J Mol Biol 235(3)：959-73。亦參見美國申請公開案第US 2005/0042664 A1號(2005年2月24日)，其以全文引用之方式併入本文中。

在特定具體實例中，人類抗體包含本文所述之抗原結合域，該抗原結合域與本文所述之其抗GITR或OX40抗原結合片段結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)之相同表位。在特定具體實例中，人類抗體包含抗原結合片段，該抗原結合片段競爭性阻斷(例如以劑量依賴性方式)本文所述之抗原結合片段中之任一者(例如pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w)結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)。人類抗體可使用此技術中已知之任何方法產生。舉例而言，可使用不能表現功能性內源性免疫球蛋白但可表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠。特定而言，可隨機或藉由同源重組將人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因複合物引入至小鼠胚胎幹細胞中。或者，除人類重鏈及輕鏈基因之外，亦可將人類可變區、恆定區及多樣性區域引入至小鼠胚胎幹細胞中。可與藉由同源重組引入人類免疫球蛋白基因座分開或同時使小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因變成非功能性的。特定而言，J_H區之同型接合缺失防止內源性抗體產生。使經修飾之胚胎幹細胞擴增且顯微注射至胚泡中以產生嵌合小鼠。接著使嵌合小鼠繁殖以產生表現人類抗體之同型接合後代。以正常方式用所選抗原，例如抗原(例如OX40)之全部或一部分對轉殖基因小鼠進行免疫接種。可使用習知之融合瘤技術自接受免疫接種之轉殖基因小鼠獲得針對該抗原之單株抗體。由轉殖基因小鼠所帶有之人類免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化期間重排，且隨後進行類別轉換及體細胞突變。因此，使用該技術，有可能產生治療上可用之IgG、IgA、IgM及IgE抗體。對於此種用於產生人類抗體之技術之概述，參見Lonberg N及Huszar D(1995)Int Rev Immunol 13：65-93。對於此種用於產生人類抗體及人類單株抗體之技術及用於產生此等抗體之方案的詳細論述，參見例如國際公開案第WO 98/24893號、第WO 96/34096號及第WO 96/33735號；及美國專利第5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號及第5,939,598號。能夠產生人類抗體之小鼠之實例包括Xenomouse^TM(Abgenix公司；美國專利第6,075,181號及第6,150,184號)、HuAb-Mouse^TM(Mederex公司/Gen Pharm公司；美國專利第5,545,806號及第5,569,825號)、Trans Chromo Mouse^TM(Kirin公司)及KM Mouse^TM(Medarex公司/Kirin公司)。

特異性結合GITR或OX40(例如人類GIT或OX40)之人類抗體或抗原結合片段可藉由此技術中已知之多種方法製備，該等方法包括上文所述之使用源自於人類免疫球蛋白序列之抗體庫之噬菌體呈現方法。亦參見美國專利第4,444,887號、第4,716,111號、及第5,885,793號；及國際公開案第WO 98/46645號、第WO 98/50433號、第WO 98/24893號、第WO 98/16654號、第WO 96/34096號、第WO 96/33735號及第WO 91/10741號。

在一些具體實例中，人類抗體可使用小鼠-人類融合瘤產生。舉例而言，可使經埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)轉型之人類周邊血淋巴球與小鼠骨髓瘤細胞融合以產生分泌人類單株抗體之小鼠-人類融合瘤，且可篩選此等小鼠-人類融合瘤以確定分泌免疫特異性結合靶抗原(例如OX40(例如人類OX40))之人類單株抗體之融合瘤。此等方法在此技術中為已知且被描述，參見例如Shinmoto H等人，(2004)Cytotechnology 46：19-23；Naganawa Y等人，(2005)Human Antibodies 14：27-31。

7.3.1 聚核苷酸

在某些態樣中，本發明提供聚核苷酸，其包含編碼本文所述之免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)抗原之抗體或其片段(例如輕鏈可變區及/或重鏈可變區)之核苷酸序列；及載體，例如包含此等聚核苷酸之用於在宿主細胞(例如大腸桿菌及哺乳動物細胞)中重組表現之載體。本文提供包含編碼本文提供之任何抗體之核苷酸序列的聚核苷酸及包含此等聚核苷酸序列之載體，例如用於使其在宿主細胞(例如哺乳動物細胞)中有效表現之表現載體。

如本文所用之「分離」之聚核苷酸或核酸分子為與存在於核酸分子之天然來源中(例如小鼠或人類中)之其他核酸分子分離之聚核苷酸或核酸分子。此外，「分離」之核酸分子(諸如cDNA分子)在藉由重組技術產生時可實質上不含其他細胞物質或培養基或在化學合成時實質上不含化學前驅體或其他化學品。舉例而言，措辭「實質上不含」包括具有少於約15%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%(特定而言少於約10%)之其他物質之聚核苷酸或核酸分子之製備物，該其他物質例如細胞物質、培養基、其他核酸分子、化學前驅體及/或其他化學品。在一個特定具體實例中，編碼本文所述之抗體之核酸分子經分離或純化。

在特定態樣中，本文提供包含編碼以下抗體之核苷酸序列之聚核苷酸：免疫特異性結合GITR及/或OX40多肽(例如人類GITR及/或OX40)且包含如本文所述之胺基酸序列的抗體；及與此等抗體競爭結合GITR及/或OX40多肽(例如以劑量依賴性方式)或與此等抗體結合相同之表位之抗體。

在某些態樣中，本文提供聚核苷酸，其包含編碼本文所述之抗體之輕鏈或重鏈的核苷酸序列。該等聚核苷酸可包含編碼包含本文所述之抗體之VL CDR(參見例如表1、4及7)之輕鏈或輕鏈可變域之核苷酸序列。該等聚核苷酸可包含編碼包含本文所述之抗體之VH CDR(參見例如表1、5及8)之重鏈或重鏈可變域之核苷酸序列。在特定具體實例中，本文所述之聚核苷酸編碼包含以SEQ ID NO：19、21、23、26、55或56示出之胺基酸序列之VL結構域。在特定具體實例中，本文所述之聚核苷酸編碼包含以SEQ ID NO：18、20、22、24、25及54示出之胺基酸序列之VH結構域。

在特定具體實例中，本文提供包含編碼抗GITR或OX40抗原結合域之核苷酸序列之聚核苷酸，該抗GITR或OX40抗原結合域包含三個VL鏈CDR，例如含有本文所述之抗體中任一者之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3(例如參見表1、4及7)。在特定具體實例中，本文提供聚核苷酸，該等聚核苷酸包含三個VH鏈CDR，例如含有本文所述之抗體中任一者之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3(例如參見表1、5及8)。在特定具體實例中，本文提供包含編碼抗GITR或OX40抗原結合域之核苷酸序列之聚核苷酸，該抗GITR或OX40抗原結合域包含三個VH鏈CDR，例如含有本文所述之抗體中任一者之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3(例如參見表1、4及7)；及三個VH鏈CDR，例如含有本文所述之抗體中任一者之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3(例如參見表1、5、及8)。

在某些具體實例中，本文所述之聚核苷酸包含編碼本文提供之抗體或抗原結合域之核苷酸序列，該抗體或抗原結合域包含含有本文所述之胺基酸序列(例如SEQ ID NO：19、21、23、26、55或56)之輕鏈可變區，其中該抗體或抗原結合域免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)。

在某些具體實例中，本文所述之聚核苷酸包含編碼本文提供之抗體或抗原結合域之核苷酸序列，該抗體或抗原結合域包含重鏈可變區，該重鏈可變區含本文所述之胺基酸序列(例如SEQ ID NO：18、20、22、24、25或54)，其中該抗體或抗原結合域免疫特異性結合GITR或OX40(例如人類GITR或OX40)。

在特定態樣中，本文提供一種聚核苷酸，該聚核苷酸包含編碼包含輕鏈及重鏈(例如各別輕鏈及重鏈) 之抗體的核苷酸序列。對於輕鏈，在一個特定具體實例中，本文所述之聚核苷酸包含編碼κ輕鏈之核苷酸序列。在另一個特定具體實例中，本文所提供之聚核苷酸包含編碼λ輕鏈之核苷酸序列。在另一個特定具體實例中，本文提供之聚核苷酸包含編碼本文所述之包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈之抗體的核苷酸序列。在一個特定具體實例中，本文提供之聚核苷酸包含編碼免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)之抗體的核苷酸序列，其中該抗體包含輕鏈，其中VL結構域之胺基酸序列可包含以SEQ ID NO：19、21、23、26、55或56示出之胺基酸序列且其中該輕鏈之恆定區包含人類κ輕鏈恆定區之胺基酸序列。在另一個特定具體實例中，本文提供之聚核苷酸包含編碼免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)且包含輕鏈之抗體的核苷酸序列，其中VL結構域之胺基酸序列可包含以SEQ ID NO：19、21、23、26、55或56示出之胺基酸序列且其中該輕鏈之恆定區包含人類λ輕鏈恆定區之胺基酸序列。舉例而言，人類恆定區序列可為美國專利第5,693,780號中所述之序列。

在一個特定具體實例中，本文提供之聚核苷酸包含編碼本文所述之免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)之抗體的核苷酸序列，其中該抗體包含重鏈，其中VH結構域之胺基酸序列可包含以SEQ ID NO：18、20、22、24、25或54示出之胺基酸序列且其中該重鏈之恆定區包含人類γ重鏈恆定區之胺基酸序列。

在某個具體實例中，本文提供之聚核苷酸包含核苷酸序列，其編碼本文所述之免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類OX40)之抗體的VH結構域及/或VL結構域(諸如VH結構域之SEQ ID NO：18、20、22、24、25或54及/或VL結構域之SEQ ID NO：19、21、23、26、55或56)。

在另一個特定具體實例中，本文提供之聚核苷酸包含編碼本文所述之免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類OX40)之抗體的核苷酸序列，其中該抗體包含含有本文所述之任何胺基酸序列之VL結構域及VH結構域，其中恆定區包含人類IgG₁(例如同種異型1、17或3)、人類IgG₂或人類IgG₄之恆定區之胺基酸序列。

在一個特定具體實例中，本文提供包含核苷酸序列之聚核苷酸，該核苷酸序列編碼本文所指定之抗OX40抗體或其結構域，參見例如表1至9。

本文亦提供編碼抗GITR及/或OX40抗體或其片段之聚核苷酸，其例如藉由密碼子/RNA最佳化、用異源信號序列置換及消除mRNA不穩定性元件來最佳化。可藉由相應地調適例如以下文獻中所述之最佳化方法來進行藉由引入密碼子變化及/或消除mRNA中之抑制區以產生用於重組表現之經最佳化之編碼抗GIR及/或OX40抗體或其片段(例如輕鏈、重鏈、VH結構域或VL結構域)之核酸的方法：美國專利第5,965,726號；第6,174,666號；第6,291,664號；第6,414,132號；及第6,794,498號。舉例而言，可使RNA內之潛在剪接位點及不穩定性元件(例如富含A/T或A/U之元件)突變而不改變由核酸序列編碼之胺基酸以增加用於重組表現之RNA的穩定性。該等改變利用遺傳密碼之簡併，例如使用用於相同胺基酸之替代性密碼子。在一些具體實例中，可能需要改變一或多個密碼子以編碼保守突變，例如與原始胺基酸具有相似之化學結構及特性及/或功能之相似胺基酸。

在某些具體實例中，最佳化之編碼本文所述之抗GITR及/或OX40抗體或其片段(例如VL結構域或VH結構域)之聚核苷酸序列可與未最佳化之編碼本文所述之抗GITR及/或OX40抗體或其片段(例如VL結構域或VH結構域)之聚核苷酸序列之反義(例如互補)聚核苷酸雜交。在特定具體實例中，最佳化之編碼本文所述之抗GITR及/或OX40抗體或片段之核苷酸序列在高嚴格度條件下與未最佳化之編碼本文所述之抗GITR及/或OX40抗體或其片段之聚核苷酸序列之反義聚核苷酸雜交。在一個特定具體實例中，最佳化之編碼本文所述之抗GITR及/或OX40抗體或其片段之核苷酸序列在高嚴格度、中等嚴格度或較低嚴格度雜交條件下與未最佳化之編碼本文所述之抗GITR及/或OX40抗體或其片段之核苷酸序列之反義聚核苷酸雜交。關於雜交條件之資訊已被描述，參見例如美國專利申請公開案第US 2005/0048549號(例如第72-73段)，該美國專利申請公開案以引用的方式併入本文中。

DNA亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代鼠類序列、或藉由使免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽之編碼序列的全部或一部分共價連接來修飾。

亦提供在高嚴格度、中等或較低嚴格度雜交條件下與編碼本文所述之抗體的聚核苷酸雜交之聚核苷酸。在特定具體實例中，本文所述之聚核苷酸在高嚴格度、中等或較低嚴格度雜交條件下與編碼本文提供之VH結構域(例如SEQ ID NO：18、20、22、24、25或54)及/或VL結構域(例如SEQ ID NO：19、21、23、25、55或56)之聚核苷酸雜交。

雜交條件已在此技術中被描述且為熟習此技術者已知。舉例而言，在嚴格條件下雜交可包括在約45℃下在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與過濾器結合之DNA雜交，繼而在約50℃至65℃下在0.2×SSC/0.1% SDS中進行一或多次洗滌；在高度嚴格條件下雜交可包括在約45℃下在6×SSC中與過濾器結合之核酸雜交，繼而在約68℃下在0.1×SSC/0.2% SDS中進行一或多次洗滌。在其他嚴格雜交條件下之雜交為熟習此技術者已知且已被描述，參見例如Ausubel FM等人編，(1989)《最新分子生物學方案(Current Protocols in Molecular Biology)》，第I卷，紐約之Green Publishing Associates公司及John Wiley & Sons公司中之第6.3.1-6.3.6頁及第2.10.3頁。

7.3.2 細胞及載體

在某些態樣中，本文提供細胞(例如宿主細胞)，該等細胞表現(例如重組)本文所述之特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)之抗體以及相關聚核苷酸及表現載體。本文提供用於在宿主細胞中，較佳在哺乳動物細胞中重組表現之載體(例如表現載體)，該等載體包含含有編碼抗GITR及/或OX40抗體或片段之核苷酸序列的聚核苷酸。本文亦提供用於重組表現本文所述之抗GITR及/或OX40抗體(例如人類或人類化抗體)之宿主細胞，該等宿主細胞包含此等載體。在一個特定態樣中，本文提供用於產生本文所述之抗體的方法，其包括在宿主細胞中表現此種抗體。

本文所述之特異性結合GITR及/或OX40(例如人類OX40)之抗體或其片段(例如本文所述之抗體之重鏈或輕鏈)之重組表現涉及構築含有編碼該抗體或片段之聚核苷酸的表現載體。一旦已獲得編碼本文所述之抗體或其片段(例如重鏈可變域或輕鏈可變域)之聚核苷酸，即可藉由重組DNA技術，使用此技術中習知之技術以產生用於產生該抗體分子之載體。因此，藉由表現含有編碼抗體或抗體片段(例如輕鏈或重鏈)之核苷酸序列之聚核苷酸來製備蛋白質的方法描述於本文中。可使用熟習此技術者習知之方法來構築表現載體，該等表現載體含有抗體或抗體片段(例如輕鏈或重鏈)編碼序列及適當之轉錄及轉譯控制信號。此等方法包括例如試管內重組DNA技術、合成技術及活體內遺傳重組。亦提供可複製之載體，該等載體包含編碼本文所述之抗體分子、抗體之重鏈或輕鏈、抗體之重鏈可變域或輕鏈可變域或其片段或重鏈或輕鏈CDR之可操作連接至啟動子之核苷酸序列。此等載體可例如包括編碼抗體分子之恆定區之核苷酸序列(參見例如國際公開案第WO 86/05807號及第WO 89/01036號；及美國專利第5,122,464號)，且可將抗體之可變域選殖至此種載體中以表現整個重鏈、整個輕鏈、或整個重鏈及輕鏈兩者。

可藉由習知技術將表現載體轉移至細胞(例如宿主細胞)中，且接著可藉由習知技術培養所得之細胞以產生本文所述之抗體(例如包含pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR的抗體)或其片段。因此，本文提供宿主細胞，其含有編碼本文所述之抗體(例如包含pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR之抗體)或其片段(例如其重鏈或輕鏈或其片段)之聚核苷酸，該聚核苷酸可操作地連接至啟動子以在宿主細胞中表現此等序列。在某些具體實例中，為表現雙鏈抗體，可使個別地編碼重鏈及輕鏈兩者之載體共表現於宿主細胞中以表現整個免疫球蛋白分子，如下文所詳述。在某些具體實例中，宿主細胞含有載體，該載體包含編碼本文所述之抗體(例如包含pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR之抗體)之重鏈及輕鏈兩者或其片段之聚核苷酸。在特定具體實例中，宿主細胞含有兩種不同之載體，即第一載體，其包含編碼本文所述之抗體(例如包含pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR之抗體)之重鏈或重鏈可變區或其片段之聚核苷酸；及第二載體，其包含編碼本文所述之抗體(例如包含pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR之抗體)之輕鏈或輕鏈可變區或其片段之聚核苷酸。在其他具體實例中，第一宿主細胞包含第一載體，其包含編碼本文所述之抗體(例如包含pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR之抗體)之重鏈或重鏈可變區或其片段之聚核苷酸，且第二宿主細胞包含第二載體，其包含編碼本文所述之抗體(例如包含pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR之抗體)之輕鏈或輕鏈可變區之聚核苷酸。在特定具體實例中，由第一細胞表現之重鏈/重鏈可變區與第二細胞之輕鏈/輕鏈可變區締合以形成本文所述之抗GITR及/或OX40抗體(例如包含 pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR之抗體)。在某些具體實例中，本文提供包含此種第一宿主細胞及此種第二宿主細胞之宿主細胞群體。

在一個特定具體實例中，本文提供載體之群體，該群體包含第一載體，其包含編碼本文所述之抗GITR及/或OX40抗體(例如包含pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR之抗體)之輕鏈/輕鏈可變區之聚核苷酸；及第二載體，其包含編碼本文所述之抗OX40抗體(例如包含pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w之CDR之抗體)之重鏈/重鏈可變區之聚核苷酸。

可利用多種宿主表現載體系統來表現本文所述之抗體分子(參見例如美國專利第5,807,715號)。此等宿主表現系統代表可用來產生且隨後純化相關編碼序列之運載體，且亦代表在用適當之核苷酸編碼序列轉型或轉染時可原位表現本文所述之抗體分子的細胞。此等系統包括(但不限於)微生物，諸如細菌(例如大腸桿菌及枯草芽孢桿菌(B.subtilis))，其經含有抗體編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型；經含有抗體編碼序列之重組酵母表現載體轉型之酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia))；經含有抗體編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；植物細胞系統(例如綠藻，諸如萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))，其經重組病毒表現載體(例如花椰菜花葉病毒(CaMV)；煙草花葉病毒(TMV))感染或經含有抗體編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型；或哺乳動物細胞系統(例如COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa、及NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20及BMT10細胞)，其帶有含有源自於哺乳動物細胞之基因組(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自於哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)之啟動子的重組表現構築體。在一個特定具體實例中，用於表現本文所述之抗體(例如包含抗體pab1949w、pab2049w、pab1876w、pab1967w、pab1975w或pab1979w中任一者之CDR之抗體)之細胞為CHO細胞，例如來自CHO GS System^TM(Lonza公司)之CHO細胞。在一個特定具體實例中，用於表現本文所述之抗體之細胞為人類細胞，例如人類細胞株。在一個特定具體實例中，哺乳動物表現載體為pOptiVEC^TM或pcDNA3.3。在一個特定具體實例中，使用尤其用於表現整個重組抗體分子之諸如大腸桿菌之細菌細胞或真核細胞(例如哺乳動物細胞)來表現重組抗體分子。舉例而言，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞之哺乳動物細胞結合諸如來自人類巨細胞病毒之主要中間早期基因啟動子元件的載體為抗體之有效表現系統(Foecking MK及Hofstetter H(1986)Gene 45：101-105；及Cockett MI等人，(1990)Biotechnology 8：662-667)。在某些具體實例中，本文所述之抗體由CHO細胞或NS0細胞產生。在一個特定具體實例中，編碼本文所述之免疫特異性結合GITR及/或OX40(例如人類GITR及/或OX40)之抗體之核苷酸序列之表現由組成型啟動子、誘導型啟動子或組織特異性啟動子調節。

此外，可選擇宿主細胞株，其以所需之特定方式調節插入之序列之表現、或修飾及加工基因產物。此等對蛋白質產物之修飾(例如糖基化)及加工(例如裂解)對於蛋白質之功能而言可尤為重要。不同之宿主細胞具有轉譯後加工及修飾蛋白質及基因產物之特徵性及特定機制。可選擇適當之細胞株或宿主系統以確保正確修飾及加工所表現之外來蛋白。為此，可使用具有基因產物之適當初級轉錄物加工、糖基化及磷酸化之細胞機制的真核宿主細胞。此等哺乳動物宿主細胞包括(但不限於)CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0(不內源性產生任何免疫球蛋白鏈之鼠類骨髓瘤細胞株)、CRL7O3O、COS(例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10及HsS78Bst細胞。在某些具體實例中，本文所述之抗GITR及/或OX40抗體係在哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)中產生。

在一個特定具體實例中，本文所述之抗體具有降低之海藻糖含量或無海藻糖含量。此等抗體可使用熟習此技術者已知之技術產生。舉例而言，可使抗體在海藻糖基化之能力有缺陷或缺乏海藻糖基化之能力的細胞中表現。在一個特定實施例中，可使用具有α1,6-海藻糖基轉移酶之兩個對偶基因之基因剔除之細胞株產生具有降低之海藻糖含量的抗體。Potelligent^®系統(Lonza公司)為此種可用於產生具有降低之海藻糖含量之抗體之系統之實例。

為長期高產率產生重組蛋白，可產生穩定表現細胞。舉例而言，可工程改造穩定表現本文所述之抗GITR及/或OX40抗體之細胞株。

一旦已藉由重組表現產生本文所述之抗體分子，即可將其藉由此技術中已知用於純化免疫球蛋白分子之任何方法來純化，例如藉由層析(例如離子交換層析；親和層析，尤其藉由在蛋白A之後對特定抗原之親和力；及篩分管柱層析)、離心、差異溶解度、或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術。此外，本文所述之抗體可融合至本文所述或此技術中另外已知之異源性多肽序列以促成純化。

在特定具體實例中，本文所述之抗體經分離或純化。一般而言，分離之抗體為實質上不含與該分離之抗體具有不同之抗原特異性之其他抗體的抗體。舉例而言，在一個特定具體實例中，本文所述之抗體的製劑實質上不含細胞物質及/或化學前驅體。措辭「實質上不含細胞物質」包括抗體之製劑，其中該抗體與用於分離出或重組產生其之細胞之細胞組分相分離。因此，實質上不含細胞物質之抗體包括具有少於約30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%(以乾重計)之異源蛋白質(在本文亦稱為「污染蛋白」)及/或抗體之變異體(例如抗體之不同轉譯後修飾形式)的抗體製劑。當重組產生抗體或片段時，其亦一般實質上不含培養基，亦即培養基佔蛋白質製劑之體積的少於約20%、10%、2%、1%、0.5%或0.1%。當藉由化學合成來產生抗體或片段時，其一般實質上不含化學前驅體或其他化學品，亦即其與參與合成蛋白質之化學前驅體或其他化學品分離。因此，抗體或片段之此等製劑具有少於約30%、20%、10%或5%(以乾重計)之除相關抗體或片段以外的化學前驅體或化合物。在一個特定具體實例中，本文所述之抗體經分離或純化。

7.4 醫藥組合物

本文提供組合物，其在生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(《雷明頓醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,(1990)，賓夕法尼亞州伊斯頓之Mack Publishing公司)中包含具有所需純度之本文所述之抗體。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用之劑量及濃度下對接受者無毒。

本文所述之包含本文所述之促效性抗體之醫藥組合物可用於增強、誘導或活化GITR及/或OX40活性且治療諸如癌症或感染性疾病之病況。可根據本文所述之方法治療之癌症的實例包括(但不限於)B細胞淋巴瘤(例如B細胞慢性淋巴球性白血病、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(B cell non-Hodgkin's lymphoma)、皮膚B細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤)、基底細胞癌、膀胱癌、母細胞瘤、腦轉移、乳癌、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、癌瘤(例如腺癌(例如胃食管連接部腺癌))、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌(結腸癌及直腸癌)、子宮內膜癌、食管癌、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、濾泡性淋巴瘤、胃癌、胃食管連接部癌、胃腸癌、膠質母細胞瘤(例如多形性膠質母細胞瘤，例如新診斷或復發)、膠質瘤、頭頸部癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌)、肝轉移、霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、腎癌(例如腎細胞癌及韋爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor))、喉癌、白血病(例如慢性髓細胞性白血病、毛細胞白血病)、肝臟癌症(例如肝癌及肝細胞瘤)、肺癌(例如非小細胞肺癌及小細胞肺癌)、淋巴母細胞性淋巴瘤、淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、轉移性腦腫瘤、轉移癌、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、神經母細胞瘤、眼部黑素瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌(例如胰臟導管腺癌)、前列腺癌(例如激素難治性(例如去勢抗性)、轉移性、轉移性激素難治性(例如去勢抗性、非雄激素依賴性))、腎細胞癌(例如轉移性)、唾液腺癌、肉瘤(例如橫紋肌肉瘤)、皮膚癌(例如黑素瘤(例如轉移性黑素瘤))、軟組織肉瘤、實體腫瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、甲狀腺癌、移行細胞癌(尿路上皮細胞癌)、葡萄膜黑素瘤(例如轉移性)、疣狀癌、陰道癌及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)。

本文所述之包含本文所述之拮抗性抗體之醫藥組合物可用於降低、抑制或去活化GITR及/或OX40活性且治療諸如發炎性或自體免疫疾病或病症或感染性疾病之病況。

本文所述之包含本文所述之拮抗性抗體之醫藥組合物可用於降低、去活化或抑制GITR及/或OX40活性且治療選自由以下組成之群的病況：感染(病毒、細菌、真菌及寄生物)、與感染相關之內毒素性休克、關節炎、類風濕性關節炎、氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、盆腔發炎性疾病、阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)、發炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛疾病、腹膜炎、銀屑病、血管炎、手術黏連、中風、第I型糖尿病、萊姆病(lyme disease)、關節炎、腦膜腦炎、葡萄膜炎、自體免疫葡萄膜炎、中樞及周邊神經系統之免疫介導之發炎性病症(諸如多發性硬化)、狼瘡(諸如全身性紅斑狼瘡)及吉蘭-巴利症候群(Guillain-Barr syndrome)、皮炎、異位性皮炎、自體免疫肝炎、纖維性肺泡炎、格雷氏病(Grave's disease)、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜、美尼爾氏病(Meniere's disease)、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮病、韋格納肉牙腫病(Wegener's granulomatosis)、胰臟炎、創傷(手術)、移植物抗宿主病、移植排斥反應、心臟病(亦即心血管疾病)，包括缺血性疾病，諸如心肌梗塞以及動脈粥樣硬化、血管內凝血；骨骼再吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周炎、胃酸過少症及視神經脊髓炎。

欲用於活體內投藥之組合物可無菌。此係容易地藉由經由例如無菌濾膜過濾來實現。

7.5 用途及方法 7.5.1 治療用途及方法

在一個態樣中，本文提供用於調節個體之一或多種免疫功能或反應之方法，其包括對有需要之個體投予本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或包含此種抗體之組合物。在一個特定態樣中，本文提供用於活化、增強或誘導個體之一或多種免疫功能或反應之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或包含此種抗體之組合物。在一個特定具體實例中，本文提供用於預防及/或治療需要活化或增強一或多種免疫功能或反應之疾病的方法，其包括對有需要之個體投予本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。在某個具體實例中，本文提供治療感染性疾病之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。在某個具體實例中，本文提供治療癌症之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。該癌症可選自由黑素瘤、腎癌及前列腺癌組成之群。該癌症可選自由黑素瘤、腎癌、前列腺癌、結腸癌及肺癌組成之群。在某個具體實例中，本文提供治療黑素瘤之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。在某個具體實例中，本文提供治療腎癌之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。在某個具體實例中，本文提供治療前列腺癌之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。在某些具體實例中，本文提供治療結腸癌之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。在某些具體實例中，本文提供治療肺癌之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。在某些具體實例中，本文提供治療非小細胞肺癌(NSCLC)之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。

在某個具體實例中，本文提供治療選自由以下組成之群的癌症之方法：B細胞淋巴瘤(例如B細胞慢性淋巴球性白血病、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚B細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤)、基底細胞癌、膀胱癌、母細胞瘤、腦轉移、乳癌、伯基特淋巴瘤、癌瘤(例如腺癌(例如胃食管連接部腺癌))、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌(結腸癌及直腸癌)、子宮內膜癌、食管癌、尤文氏肉瘤、濾泡性淋巴瘤、胃癌、胃食管連接部癌、胃腸癌、膠質母細胞瘤(例如多形性膠質母細胞瘤，例如新診斷或復發)、膠質瘤、頭頸部癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌)、肝轉移、霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、腎癌(例如腎細胞癌及韋爾姆斯氏腫瘤)、喉癌、白血病(例如慢性髓細胞性白血病、毛細胞白血病)、肝臟癌症(例如肝癌及肝細胞瘤)、肺癌(例如非小細胞肺癌及小細胞肺癌)、淋巴母細胞性淋巴瘤、淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、轉移性腦腫瘤、轉移癌、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、神經母細胞瘤、眼部黑素瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌(例如胰臟導管腺癌)、前列腺癌(例如激素難治性(例如去勢抗性)、轉移性、轉移性激素難治性(例如去勢抗性、非雄激素依賴性))、腎細胞癌(例如轉移性)、唾液腺癌、肉瘤(例如橫紋肌肉瘤)、皮膚癌(例如黑素瘤(例如轉移性黑素瘤))、軟組織肉瘤、實體腫瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、甲狀腺癌、移行細胞癌(尿路上皮細胞癌)、葡萄膜黑素瘤(例如轉移性)、疣狀癌、陰道癌及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症。

在另一個具體實例中，向經診斷患有癌症之患者投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體以增加該患者之一或多個免疫細胞群體(例如T細胞效應細胞，諸如CD4⁺及CD8⁺ T細胞)之增殖及/或效應功能。

在一個特定具體實例中，使用此技術中習知之分析(例如ELISPOT、ELISA及細胞增殖分析)，相對於未接受本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體投藥之個體的免疫功能，本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體將個體之一或多種免疫功能或反應活化或增強或誘導至少99%、至少98%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、或至少10%、或10%至25%、25%至50%、50%至75%或75%至95%之範圍。在一個特定具體實例中，免疫功能為細胞激素產生(例如IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10及/或IL-13產生)。在另一個具體實例中，免疫功能為T細胞增殖/擴增，其可例如藉由流動式細胞量測術來分析以偵測表現T細胞標誌物(例如CD3、CD4或CD8)之細胞數目。在另一個具體實例中，免疫功能為抗體產生，其可例如藉由ELISA來分析。在一些具體實例中，免疫功能為效應功能，其可例如藉由細胞毒性分析或此技術中習知之其他分析來分析。在另一個具體實例中，免疫功能為Th1反應。在另一個具體實例中，免疫功能為Th2反應。在另一個具體實例中，免疫功能為記憶反應。

在特定具體實例中，可由結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體增強或誘導之免疫功能之非限制性實例為效應淋巴球之增殖/擴增(例如效應T淋巴球數目增加)及對效應淋巴球(例如效應T淋巴球)之細胞凋亡之抑制。在特定具體實例中，由本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體增強或誘導之免疫功能為以下細胞之數目的增殖/擴增或活化：CD4⁺ T細胞(例如Th1及Th2輔助T細胞)、CD8⁺ T細胞(例如細胞毒性T淋巴球、α/β T細胞、及γ/δ T細胞)、B細胞(例如漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、腫瘤駐留T細胞、CD122⁺ T細胞、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、單核球、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或多形核白血球。在一個具體實例中，本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體活化或增強淋巴球祖細胞之增殖/擴增或數目。在一些具體實例中，相對於陰性對照(例如未用本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體處理、培養或接觸之對應細胞之數目)，本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體使以下細胞之數目增加約至少99%、至少98%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、或至少10%、或10%至25%、25%至50%、50%至75%或75%至95%之範圍：CD4⁺ T細胞(例如Th1及Th2輔助T細胞)、CD8⁺ T細胞(例如細胞毒性T淋巴球、α/β T細胞、及γ/δ T細胞)、B細胞(例如漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、腫瘤駐留T細胞、CD122⁺ T細胞、自然殺手細胞(NK細胞)、巨噬細胞、單核球、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或多形核白血球。

在一些具體實例中，對個體投予本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體與靶向免疫調節酶之化合物的組合，該(等)免疫調節酶諸如IDO(吲哚胺-(2,3)-二氧化酶)及TDO(色胺酸2,3-二氧化酶)。在特定具體實例中，此種化合物選自由以下組成之群：埃帕多塔(Incyte公司)、F001287(Flexus Biosciences公司)、吲哚西莫(NewLink Genetics公司)及NLG919(NewLink Genetics公司)。在一個具體實例中，該化合物為埃帕多塔。在另一個具體實例中，該化合物為F001287。在另一個具體實例中，該化合物為吲哚西莫。在另一個具體實例中，該化合物為NLG919。

在一些具體實例中，對個體投予本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體與疫苗之組合。

在一些具體實例中，對個體投予本文所述之結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體與基於熱休克蛋白之腫瘤疫苗或基於熱休克蛋白之病原體疫苗之組合。在一個特定具體實例中，對個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體與基於熱休克蛋白之腫瘤疫苗的組合。熱休克蛋白(HSP)為所有物種中普遍存在之高度保守蛋白質之家族。其表現可由於熱休克或其他形式之應激而強有力地誘導至較高之程度，該應激包括暴露於毒素、氧化應激或葡萄糖剝奪。已根據分子量分為五個家族：HSP-110、HSP-90、HSP-70、HSP-60及HSP-28。HSP經由交叉呈現途徑在抗原呈現細胞(APC)(諸如巨噬細胞及樹突細胞(DC))中傳遞免疫原性肽，從而引起T細胞活化。HSP用作形成能夠誘導腫瘤特異性免疫之複合物的腫瘤相關抗原肽之伴侶載體。在由垂死之腫瘤細胞釋放時，HSP-抗原複合物由抗原呈現細胞(APC)攝取，其中抗原係加工成結合MHC I類及II類分子之肽，從而引起抗腫瘤CD8+及CD4+ T細胞活化。由源自於腫瘤製劑之HSP複合物引出之免疫特異性針對由各個體之癌症所表現之獨特抗原肽譜系。

熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)為由與抗原肽非共價複合之熱休克蛋白組成之蛋白質肽複合物。HSPPC引出先天免疫反應及適應性免疫反應兩者。在一個特定具體實例中，該(等)抗原肽呈現所治療之癌症的抗原性。HSPPC由APC經由膜受體(主要為CD91)或藉由結合至Toll樣受體而有效捕獲。HSPPC內化引起APC之功能成熟，趨化因子及細胞激素產生引起自然殺手細胞(NK)、單核球及Th1及Th-2介導之免疫反應的活化。在一些具體實例中，用於本文所揭示之方法中的HSPPC包含與抗原肽複合之來自應激蛋白之hsp60、hsp70、或hsp90家族之一或多種熱休克蛋白。在一些具體實例中，HSPPC包含hsc70、hsp70、hsp90、hsp110、grp170、gp96、鈣網蛋白或彼等之兩者或多於兩者之組合。

在一個特定具體實例中，對個體投予結合GITR及/或OX40之多特異性(例如雙特異性)抗體與熱休克蛋白肽複合物(HSPPC)(例如熱休克蛋白肽複合物-96(HSPPC-96))之組合以治療癌症。HSPPC-96包含與抗原肽複合之96kDa熱休克蛋白(Hsp)gp96。HSPPC-96為由個體之腫瘤製成之癌症免疫治療且含有癌症之抗原「指紋」。在一些具體實例中，此指紋含有僅存在於該特定個體之特定癌細胞中之獨特抗原且注射疫苗意欲刺激個體之免疫系統來識別且攻擊帶有該特定癌症指紋之任何細胞。

在一些具體實例中，例如HSPPC-96之HSPPC由個體之腫瘤組織產生。在一個特定具體實例中，HSPPC(例如HSPPC-96)由所治療之癌症或其轉移之類型的腫瘤產生。在另一個特定具體實例中，HSPPC(例如HSPPC-96)為所治療之受試者自體的。在一些具體實例中，腫瘤組織為非壞死腫瘤組織。在一些具體實例中，使用至少1公克(例如至少1公克、至少2公克、至少3公克、至少4公克、至少5公克、至少6公克、至少7公克、至少8公克、至少9公克或至少10公克)之非壞死腫瘤組織產生疫苗方案。在一些具體實例中，在手術切除之後，在用於疫苗製備之前，將非壞死腫瘤組織冷凍。在一些具體實例中，例如HSPPC-96之HSPPC係藉由純化技術自腫瘤組織分離，過濾且製備用於可注射之疫苗。在一些具體實例中，對個體投予6至12次劑量之HSPPC，例如HSPCC-96。在此等具體實例中，HSPPC(例如HSPPC-96)劑量可每週一次投予前4次劑量，且接著每兩週一次投予2至8次額外之劑量。

可根據本文所述之方法使用之HSPPC之其他實例揭示於以下專利及專利申請案中，該等專利及專利申請案出於所有目的以全文引用的方式併入本文中：美國專利第6,391,306號、第6,383,492號、第6,403,095號、第6,410,026號、第6,436,404號、第6,447,780號、第6,447,781號及第6,610,659號。

在一個態樣中，如本文所提供之用於調節個體之一或多種免疫功能或反應之方法為去活化、降低或抑制個體之一或多種免疫功能或反應之方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。在一個特定具體實例中，本文提供用於預防及/或治療需要去活化、降低或抑制一或多種免疫功能或反應之疾病的方法，其包括對有需要之個體投予結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。

在某個具體實例中，本文提供治療自體免性疫或發炎性疾病或病症之方法，其包括對有需要之個體投予有效量之結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體或其組合物。在某些具體實例中，該疾病或病症選自由以下組成之群：感染(病毒、細菌、真菌及寄生物)、與感染相關之內毒素性休克、關節炎、類風濕性關節炎、氣喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、盆腔發炎性疾病、阿茲海默氏病、發炎性腸病、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏病、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛疾病、腹膜炎、銀屑病、血管炎、手術黏連、中風、第I型糖尿病、萊姆病、關節炎、腦膜腦炎、葡萄膜炎、自體免疫葡萄膜炎、中樞及周邊神經系統之免疫介導之發炎性病症(諸如多發性硬化)、狼瘡(諸如全身性紅斑狼瘡)及吉蘭-巴利症候群、皮炎、異位性皮炎、自體免疫肝炎、纖維性肺泡炎、格雷氏病、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜、美尼爾氏病、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮病、韋格納肉牙腫病、胰臟炎、創傷(手術)、移植物抗宿主病、移植排斥反應、心臟病(亦即心血管疾病)，包括缺血性疾病，諸如心肌梗塞以及動脈粥樣硬化、血管內凝血；骨骼再吸收、骨質疏鬆症、骨關節炎、牙周炎、胃酸過少症、及視神經脊髓炎。在某些具體實例中，該自體免疫或發炎性疾病或病症為移植排斥反應、移植物抗宿主病、血管炎、氣喘、類風濕性關節炎、皮炎、發炎性腸病、葡萄膜炎、狼瘡、結腸炎、糖尿病、多發性硬化或氣管發炎。在某些具體實例中，該個體為人類。

在另一個具體實例中，向經診斷患有自體免疫性或發炎性疾病或病症之患者投予結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體以減少該患者之一或多個免疫細胞群體(例如T細胞效應細胞，諸如CD4⁺及CD8⁺ T細胞)之增殖及/或效應功能。在某些具體實例中，該自體免疫性或發炎性疾病或病症為移植排斥反應、移植物抗宿主病、血管炎、氣喘、類風濕性關節炎、皮炎、發炎性腸病、葡萄膜炎、狼瘡、結腸炎、糖尿病、多發性硬化或氣管發炎。

在一個特定具體實例中，使用此技術中習知之分析(例如ELISPOT、ELISA及細胞增殖分析)，相對於未接受本文所述之結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體投藥之個體的免疫功能，本文所述之結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體將個體之一或多種免疫功能或反應去活化或降低或抑制至少99%、至少98%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、或至少10%、或10%至25%、25%至50%、50%至75%或75%至95%之範圍。在一個特定具體實例中，免疫功能為細胞激素產生(例如IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10及/或IL-13產生)。在另一個具體實例中，免疫功能為T細胞增殖/擴增，其可例如藉由流動式細胞量測術來分析以偵測表現T細胞標誌物(例如CD3、CD4、或CD8)之細胞數目。在另一個具體實例中，免疫功能為抗體產生，其可例如藉由ELISA來分析。在一些具體實例中，免疫功能為效應功能，其可例如藉由細胞毒性分析或此技術中習知之其他分析來分析。在另一個具體實例中，免疫功能為Th1反應。在另一個具體實例中，免疫功能為Th2反應。在另一個具體實例中，免疫功能為記憶反應。

在特定具體實例中，可由結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體降低或抑制之免疫功能之非限制性實例為效應淋巴球之增殖/擴增(例如效應T淋巴球數目減少)及對效應淋巴球(例如效應T淋巴球)之細胞凋亡之刺激。在特定具體實例中，由本文所述之結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體降低或抑制之免疫功能為以下細胞之數目之增殖/擴增或活化：CD4⁺ T細胞(例如Th1及Th2輔助T細胞)、CD8⁺ T細胞(例如細胞毒性T淋巴球、α/β T細胞、及γ/δ T細胞)、B細胞(例如漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、腫瘤駐留T細胞、CD122⁺ T細胞、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、單核球、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或多形核白血球。在一個具體實例中，本文所述之結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體去活化或減少淋巴球祖細胞之增殖/擴增或數目。在一些具體實例中，相對於陰性對照(例如未用本文所述之結合GITR及/或OX40抗體之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體處理、培養或接觸之對應細胞之數目)，本文所述之結合GITR及/或OX40之拮抗性多特異性(例如雙特異性)抗體使以下細胞之數目減少約至少99%、至少98%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少 25%、至少20%、或至少10%、或10%至25%、25%至50%、50%至75%或75%至95%之範圍：CD4⁺ T細胞(例如Th1及Th2輔助T細胞)、CD8⁺ T細胞(例如細胞毒性T淋巴球、α/β T細胞、及γ/δ T細胞)、B細胞(例如漿細胞)、記憶T細胞、記憶B細胞、腫瘤駐留T細胞、CD122⁺ T細胞、自然殺手細胞(NK細胞)、巨噬細胞、單核球、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或多形核白血球。

7.5.1.1 投藥途徑及劑量

本文所述之抗體或組合物可藉由多種途徑向個體投遞。

將有效治療及/或預防病況之抗體或組合物之量將視疾病之性質而定，且可藉由標準臨床技術確定。

欲用於組合物中之精確劑量亦將視投藥途徑及疾病之嚴重程度而定，且應當根據專業人員之判斷及各受試者之情況來決定。舉例而言，有效劑量亦可視投藥方式、靶向部位、患者之生理狀態(包括年齡、體重及健康情況)、患者為人類還是動物、投予之其他藥物或治療為預防性還是治療性而不同。通常，患者為人類，但亦可治療非人類哺乳動物，包括轉殖基因哺乳動物。最佳對治療劑量進行滴定以最佳化安全性及功效。

在某些具體實例中，使用試管內分析來幫助識別最佳劑量範圍。有效劑量可自由試管內或動物模型測試系統獲得之劑量反應曲線外推。

一般而言，與來自其他物種之抗體相比，由於對外來多肽之免疫反應，因此人類抗體在人體內具有較長之半衰期。因此，人類抗體之較低劑量及不太頻繁之投藥常常為可能的。

7.5.2 偵測及診斷用途

本文所述之抗OX40抗體(參見例如部分7.2)可用於使用熟習此技術者已知之典型免疫組織學方法分析生物樣品中之OX40蛋白含量，該等方法包括免疫分析，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、免疫沈澱或西方印漬術。適合之抗體分析標記為此技術中已知的且包括酶標記，諸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，諸如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、銦(¹²¹In)及鎝(⁹⁹Tc)；發光標記，諸如魯米諾；及螢光標記，諸如螢光素及若丹明；及生物素。此等標記可用於標記本文所述之抗體。或者，識別本文所述之抗OX40抗體之二級抗體可經標記且與抗OX40抗體組合用於偵測OX40蛋白含量。

分析OX40蛋白質之表現含量意欲包括直接(例如藉由測定或估計絕對蛋白含量)或相對(例如藉由與第二生物樣品中之疾病相關蛋白含量相比)定性或定量量測或估計第一生物樣品中OX40蛋白質之含量。可量測或估計第一生物樣品中之OX40多肽表現含量且將其與標準OX40蛋白含量相比，該標準係取自獲自未患該病症之個體的第二生物樣品或藉由計算來自未患該病症之個體之群體的含量之平均值來確定。如此項技術中所將瞭解，一旦已知「標準」OX40多肽含量，即可將其反復用作標準以進行比較。

如本文所用之術語「生物樣品」係指獲自潛在表現OX40之個體、細胞株、組織或其他細胞來源之任何生物樣品。自動物(例如人類)獲得組織活檢及體液之方法為此技術所習知。生物樣品包括周邊單核血球。

本文所述之抗OX40抗體可用於預後、診斷、監測及篩選應用，其包括熟習此技術者習知及標準且基於本發明描述之試管內及活體內應用。用於試管內評定及評估免疫系統狀態及/或免疫反應之預後、診斷、監測及篩選分析及套組可用於預測、診斷及監測以評估患者樣品，該等樣品包括已知有或疑似有免疫系統功能障礙或與預期或所需之免疫系統反應、抗原反應或疫苗反應相關之樣品。評定及評估免疫系統狀態及/或免疫反應亦可用於確定患者對於藥物臨床試驗或相比於不同藥劑或抗體，對於特定化學治療劑或抗體(包括其組合)之投藥之適合性。此種類型之預後及診斷監測及評定已在實踐中利用針對乳癌中之HER2蛋白質之抗體(HercepTest^TM，Dako公司)，其中該分析亦用於評估患者以使用Herceptin^®進行抗體治療。活體內應用包括定向細胞治療及免疫系統調節以及免疫反應之放射性成像。

在一個具體實例中，抗OX40抗體可以用於活檢樣品之免疫組織化學。

在另一個具體實例中，抗OX40抗體可用於偵測OX40之含量或在膜表面上含有OX40之細胞之含量，接著可使該等含量與某些疾病症狀相關聯。本文所述之抗OX40抗體可攜帶可偵測標記或功能標記。當使用螢光標記時，可利用此項技術中已知之目前可用之顯微術及螢光活化細胞分選儀分析(FACS)或該兩種方法程序之組合來識別及定量特異性結合成員。本文所述之抗OX40抗體可攜帶螢光標記。例示性螢光標記包括例如反應性及結合之探針，例如胺基香豆素、螢光素、德克薩斯紅(Texas red)、Alexa Fluor染料、Cy染料及DyLight染料。抗OX40抗體可攜帶放射性標記，諸如同位素³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹¹⁷Lu、¹²¹I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁹⁸Au、²¹¹At、²¹³Bi、²²⁵Ac及¹⁸⁶Re。當使用放射性標記時，可利用此技術中已知之目前可用之計數程序來識別及定量抗OX40抗體與OX40(例如人類OX40)之特異性結合。在標記為酶之情況下，偵測可藉由此技術中已知之任何目前利用之比色、分光光度、螢光分光光度、電流滴定或氣體定量技術來實現。此可藉由使樣品或對照樣品與抗OX40抗體在允許形成抗體與OX40之間的複合物之條件下接觸。在樣品及對照中偵測抗體與OX40之間形成之任何複合物且比較。鑒於本文所述之抗體對OX40之特異性結合，其抗體可用於特異性偵測細胞表面上之OX40表現。本文所述之抗體亦可用於經由免疫親和純化來純化OX40。

本文亦包括分析系統，其可製備成測試套組之形式，該測試套組用於定量分析例如OX40或OX40/OX40L複合物之存在程度。該系統或測試套組可包括標記之組分，例如標記之抗體；及一或多種額外之免疫化學試劑。有關套組之更多資訊，參見例如下文部分7.6。

7.6 套組

本文提供套組，其包括本文所述之一或多種抗體或其結合物。在一個特定具體實例中，本文提供一種醫藥包裝或套組，其包括填充有本文所述之醫藥組合物之一或多種成分(諸如本文提供之一或多種抗體)之一或多個容器。在一些具體實例中，該等套組含有本文所述之醫藥組合物及任何預防劑或治療劑，諸如本文所述之彼等藥劑。在某些具體實例中，該等套組可含有T細胞有絲分裂原，諸如植物血球凝集素(PHA)及/或佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、或TCR複合物刺激抗體，諸如抗CD3抗體及抗CD28抗體。註記可視情況與該(等)容器締合，該註記呈由監管醫藥製品或生物製品之製造、使用或銷售之政府機構規定之形式，該註記反映用於人類投藥之製造、使用或銷售由該機構批准。

本文亦提供可用於上述方法中之套組。在一個具體實例中，套組在一或多個容器中包括本文所述之抗體，較佳為純化之抗體。在一個特定具體實例中，本文所述之套組含有實質上分離之OX40抗原(例如人類OX40)，其可用作對照。在另一個特定具體實例中，本文所述之套組進一步包括對照抗體，其不與OX40抗原反應。在另一個特定具體實例中，本文所述之套組含有用於偵測抗體與OX40抗原之結合的一或多種元件(例如抗體可結合至可偵測之受質，諸如螢光化合物、酶受質、放射性化合物或發光化合物、或識別一級抗體之二級抗體可結合至可偵測之受質)。在特定具體實例中，本文提供之套組可包括重組產生或化學合成之OX40抗原。套組中所提供之OX40抗原亦可連接至固體載體。在一個更特定具體實例中，上述套組之偵測裝置包括與OX40抗原連接之固體載體。此種套組亦可包括非連接之報導子標記之抗人類抗體或抗小鼠/大鼠抗體。在此具體實例中，抗體與OX40抗原之結合可藉由該報導子標記之抗體之結合來偵測。

以說明方式而非以限制方式提供以下實施例。

8. 實施例

該部分(亦即部分8)中之實施例係以說明方式，而非以限制方式提供。

8.1 實施例1：腫瘤內調節性T細胞上GITR及OX40表現之表徵

使用流動式細胞量測術來表徵腫瘤內調節性T細胞(Treg)及效應T細胞(Teff)上GITR及OX40之表現。簡言之，來自多種腫瘤類型(卵巢，IIC期；結腸直腸，IIIB期；子宮內膜，IB期；腎，III期；及非小細胞肺癌，II期)之冷凍保存之腫瘤細胞係獲自Conversant Bio有限責任公司。該等腫瘤細胞係在治療介入之前經分離。在解凍之後，在室溫下用人類Fc受體阻斷劑(FcR阻斷劑，Biolegend®)將細胞處理15分鐘以減少非特異性結合。將樣品洗滌兩次。將抗體混合物在FACS緩衝液(PBS、2mM EDTA、0.5% BSA，pH 7.2)中稀釋且添加至各樣品中，該抗體混合物含有識別CD4(BV605，OKT4，批號：B185762)、CD127(APC，A019D5，批號：B193084)及CD25(PECy7，M-A251，批號：B190207)之抗體、Zombie Green^TM可固定活力染料(FITC，批號：B201900)以及抗OX40抗體(PE，BER-ACT35，批號：B203538)、抗GITR抗體(PE，110416，批號：LAV0614061)、或同源同型對照抗體(PE，MOPC-21，批號：B197832)，全部均為2.5μg/ml。在4℃下將樣品培育30分鐘。在染色之前，留出額外之樣品以用於單染色補償對照(CD45-FITC、CD45-PE、CD45-PECy7、CD45-APC、及CD45-BV605；全部為純系H130)。接著將樣品在FACS緩衝液中洗滌三次且在室溫下在暗處在1×固定-透化緩衝液(Foxp3染色套組，eBioscience公司)中培育45分鐘。在固定後，將細胞在1×透化緩衝液(Foxp3染色套組，eBioscience公司)中洗滌三次且在4℃下與在1×透化緩衝液中稀釋之2.5μg/ml之抗FOXP3或大鼠IgG2a抗體一起培育45分鐘。將樣品在1×透化緩衝液中洗滌兩次，再懸浮於FACS緩衝液中，且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences公司)分析。使用FACS DIVA及WEHI Weasel軟體之組合分析FACS圖。

效應T細胞係限定為CD4+ CD127+ CD25+/- FOXP3-。調節性T細胞係限定為CD4+ CD127- CD25+ FOXP3+。如圖1A中所示，來自子宮內膜癌腫瘤組織、腎細胞癌(RCC)腫瘤組織、及非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤組織之腫瘤內調節性T細胞顯示GITR及OX40之表現升高，而來自相同腫瘤組織之腫瘤內效應T細胞並非如此。

對於受體定量，使用確定之儀器設置來分析具有預定數目之PE分子之珠粒(Quantum^TM R-PE MESF；Bangs Laboratories公司)。使用珠粒及先前分析之GITR/OX40抗體兩者之平均螢光強度(MFI)，計算腫瘤內調節性T細胞及效應T細胞之GITR及OX40受體之預測數目。

來自卵巢腫瘤組織、結腸直腸癌(CRC)腫瘤組織、子宮內膜癌腫瘤組織、RCC腫瘤組織及NSCLC腫瘤組織之調節性T細胞均比來自相同腫瘤組織之效應T細胞顯示更高之GITR及OX40表現(圖1B)。

8.2 實施例2：抗GITR/OX40雙特異性抗體之表徵

在此實施例中，研究使用Genmab DuoBody技術構築之抗GITR/OX40雙特異性抗體之結合及功能特徵。DuoBody pab1876×pab2049及DuoBody pab1876×pab1949兩者均包含GITR結合臂(pab1876)及OX40結合臂(pab2049或pab1949)。使用三種其他DuoBody抗體作為對照：DuoBody pab1876×同型、DuoBody pab2049×同型及DuoBody pab1949×同型。對應於此等DuoBody抗體之重鏈及輕鏈序列之SEQ ID NO列於表10中。此外，在一些實驗中亦使用二價單特異性抗體pab1876、pab2049及pab1949w。pab1876w為包含SEQ ID NO：29之重鏈及SEQ ID NO：37之輕鏈的IgG₁抗體。pab1876與pab1876w包含相同之重鏈及輕鏈序列，不同之處在於pab1876在輕鏈恆定域中含有T109S取代(亦即相對於野生型輕鏈恆定域，在位置109處蘇胺酸經絲胺酸取代)(根據Kabat來編號)，該取代促成可變區在框內選殖至恆定區。該突變為不影響抗體結合或功能之保守修飾。pab2049w為包含SEQ ID NO：59之重鏈及SEQ ID NO：67之輕鏈的IgG₁抗體。除輕鏈恆定區中之T109S突變(根據Kabat編號)之外，pab2049與pab2049w包含相同之重鏈及輕鏈序列。pab1949w為包含SEQ ID NO：59之重鏈及SEQ ID NO：69之輕鏈的IgG₁抗體。除輕鏈恆定區中之T109S突變(根據Kabat編號)之外，pab1949與pab1949w包含相同之重鏈及輕鏈序列。

8.2.1 抗GITR/OX40雙特異性抗體之選擇性

使用懸浮陣列技術評定DuoBody pab1876×pab2049對GITR及OX40相對於對TNFR超家族之其他成員的選擇性。使用山羊抗人類IgG F(ab')₂(Jackson Immuno Research公司，COOH偶聯，100μg/ml，pH 5.0)使TNFR超家族之許多重組蛋白偶聯至Luminex^®珠粒，該等重組蛋白包括重組人類GITR-His(Sino Biological公司，50μg/ml)、重組人類OX40-His(Sino Biological公司，50μg/ml)、重組人類淋巴毒素β受體(LTBR)-Fc(AcroBiosystems公司，65μg/ml)、重組人類死亡受體6(DR6)-bio(Sino Biological公司，50μg/ml)、重組人類腫瘤壞死因子樣弱細胞凋亡誘導因子受體(TWEAKR)-Fc(Sino Biological公司，50μg/ml)、重組人類CD137-Fc(SrtA-bio公司，50μg/ml)、及重組人類B細胞活化因子受體(BAFFR)-Fc(R&D Systems公司，50μg/ml)。接著在20℃下將多個濃度(最終8333ng/ml、833.3ng/ml、83.3ng/ml及8.33ng/ml)之DuoBody pab1876×pab2049與抗原偶聯之珠粒一起培育1小時(650RPM，在暗處)。在洗滌以移除非特異性結合(在PBS中兩次)後，在20℃下將珠粒與偵測抗體(藻紅蛋白包被之山羊抗huIgG F(ab')₂，最終2.5μg/ml)一起培育1小時(650RPM，在暗處)。接著將珠粒洗滌兩次且在Luminex 200^®上讀取。藉由截止偵測值(基於LX200對照)來確定高於(+)或低於(-)臨限值之結合。

DuoBody pab1876×pab2049顯示與人類GITR及OX40之特異性結合，且在測試濃度下未觀測到與其他TNFR家族成員之顯著結合(表11)。

8.2.2 抗GITR/OX40雙特異性抗體與表現GITR及OX40之細胞的結合

藉由流動式細胞量測術研究DuoBody pab1876×pab2049與共表現GITR及OX40之細胞、僅表現GITR之細胞及僅表現OX40之細胞的結合。

在37℃及5% CO₂下將Hut102細胞(人類T細胞淋巴瘤，ATCC)在補充有1μg/ml植物血球凝集素(PHA)及10%熱滅活FBS之RPMI培養基中培育72小時以誘導GITR及OX40表現。藉由將慢病毒載體(EF1a啟動子)轉導至Jurkat細胞中來產生異位表現GITR或OX40之細胞。經由單細胞分選(FACS ARIA Fusion)產生穩定純系。藉由流動式細胞量測術驗證表現。對於結合分析，在4℃下將穩定之Jurkat細胞或活化之Hut102細胞與在FACS緩衝液(PBS、2mM EDTA、0.5% BSA，pH 7.2)中稀釋之測試抗體(12點劑量滴定，0.01至10,000ng/ml)一起培育30分鐘。將樣品在FACS緩衝液中洗滌兩次且接著在4℃下與APC結合之小鼠抗人類κ偵測抗體(Life Technologies公司，HP6062)一起培育30分鐘。接著將樣品洗滌兩次且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences公司)分析。使用FACS DIVA及WEHI Weasel軟體之組合分析FACS圖。用Graphpad Prism軟體對數據進行作圖。

如圖2A中所示，相較於二價單特異性抗體pab1876及pab2049，DuoBody pab1876×pab2049顯示增強之與共表現GITR及OX40之細胞的結合。增強之與共表現GITR及OX40之細胞的結合由兩個臂所促成，此係因為用兩種對照DuoBody抗體pab1876×同型及pab2049×同型中之同型臂置換任一臂引起與活化之Hut102細胞之結合減少。如所預期，對於僅表現GITR或OX40而非表現兩者之細胞，在所測試之除最高濃度以外之所有濃度下，DuoBody pab1876×pab2049之結合弱於二價單特異性抗體pab1876及pab2049之結合(圖2B及2C)。

8.2.3 抗GITR/OX40雙特異性抗體對FcγRIIIA報導細胞株之作用

隨後，使用表現FcγRIIIA之報導細胞株(Promega公司)以及共表現GITR及OX40之靶細胞來評估DuoBody pab1876×pab2049接合GITR及OX40且經由FcγRIIIA進行信號傳導之能力。使用穩定表現FcγRIIIA V158變異體及驅動螢火蟲螢光素酶表現之NFAT反應元件之工程改造之Jurkat細胞作為效應細胞。抗體/抗原複合物(其中該抗原位於靶細胞之表面上)與FcγRIIIA之結合向效應細胞之啟動子/報導子構築體進行信號傳導且引起螢光素酶基因轉錄。

活化自然調節性T細胞(nTreg)以產生共表現GITR及OX40之靶細胞。經由Ficoll梯度(Research Blood Components有限責任公司)自健康供者白細胞層分離PBMC且對其進行基於磁性之nTreg增濃(Mitenyi Biotec公司，130-093-631，批號：5150629039)。接著在37℃及5% CO₂下使用Miltenyi Biotec公司之Treg擴增套組(130-095-345，批號：5150420196)在補充有10%熱滅活FBS之RPMI培養基中將細胞活化8天。每3天-4天將含有Treg擴增套組之新鮮培養基添加至分離之nTreg中。在第8天，藉由流動式細胞量測術確認GITR及OX40之細胞表現。簡言之，在室溫下用人類Fc受體阻斷劑處理20,000個細胞15分鐘以減少非特異性結合(FcR阻斷劑，Biolegend公司)。將樣品洗滌兩次且將抗體混合物在FACS緩衝液(PBS、2mM EDTA、0.5% BSA，pH 7.2)中稀釋，添加至各樣品中且在4℃下培育30分鐘，該抗體混合物含有識別CD4(BV605，OKT4，批號：B185762)、CD127(APC，A019D5，批號：B193084)、及CD25(PECy7，M-A251，批號：B195168)之抗體及Zombie Green^TM可固定活力染料(FITC，批號：B201900)以及抗OX40抗體(PE，BER-ACT35，批號：B203538)、抗GITR抗體(PE，110416，批號：LAV0614061)或同源同型對照抗體(PE，MOPC-21，批號：B197832)，全部均為2.5μg/ml。在染色之前，留出額外之樣品以用於單染色補償對照(CD45-FITC、CD45-PE、CD45-PECy7、CD45-APC及CD45-BV605；全部為純系H130)。接著將樣品在FACS緩衝液中洗滌三次且在室溫下在暗處在1×固定-透化緩衝液(Foxp3染色套組，eBioscience公司，批號：E00029-1691)中培育45分鐘。在固定後，將細胞在1×透化緩衝液(Foxp3染色套組，eBioscience公司)中洗滌三次且在4℃下與在1×透化緩衝液中稀釋之2.5μg/ml之抗FOXP3(eFluor450，PCH101，批號：E11056-1635)或大鼠IgG2a(eFluor450，eBR2a，批號：E08519-1633)抗體一起培育45分鐘。將樣品在1×透化緩衝液中洗滌兩次，再懸浮於FACS緩衝液中，且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences公司)分析。

如圖3A中所示，活化之nTreg在細胞表面上表現GITR及OX40兩者。

為了評定對FcγRIIIA報導細胞之影響，將活化8天之125,000個nTreg與遞增濃度(6點劑量滴定，0.04μg/ml至10μg/ml)之DuoBody pab1876×pab2049、二價單特異性抗體pab1876、二價單特異性抗體pab2049、或同型對照抗體一起培育。在37℃及5% CO₂下將表現FcγRIIIA^V158之NFAT報導細胞於補充有4%熱滅活低IgG FBS之RPMI培養基中以1：1比率(125,000個細胞)添加至抗體-nTreg混合物中。在20小時培育之後，將Bio-Glo^TM螢光素酶分析受質(Promega公司，G720A)添加至各樣品中(1：1 v/v)。使用EnVision^®多標記盤讀取器(Perkin-Elmer公司)量測發光。使用FACS DIVA及WEHI Weasel軟體之組合分析FACS圖。用Graphpad Prism軟體對數據進行作圖。

與相較於二價單特異性抗體pab1876及pab2049，DuoBody pab1876×pab2049顯示增強之與共表現GITR及OX40之細胞的結合之觀測結果(圖2A)相一致，在結合共表現GITR及OX40之nTreg時，與pab1876及pab2049相比，DuoBody pab1876×pab2049表現出較強之FcγRIIIA活化(圖3B)。

此外，使用上文所述之表現FcγRIIIA之報導細胞株以及表現GITR或OX40而非表現兩者之靶細胞來評估DuoBody pab1876×pab2049接合GITR或OX40且經由FcγRIIIA進行信號傳導之能力。簡言之，對表現GITR或OX40之Jurkat靶細胞進行計數且將其以6×10⁶個細胞/毫升之濃度再懸浮於含4%低IgG FBS之RPMI-1640中。向多個96孔白色分析盤之內部60個孔中，向各孔中添加25μl之細胞懸浮液。以10μg/ml之起始最終濃度用3倍稀釋液連續稀釋測試抗體。在兩個重複孔中，將25μl之各抗體稀釋液添加至靶細胞中。最終，將表現FcγRIIIA^V158之NFAT報導細胞以6×10⁶個細胞/毫升之濃度再懸浮於含4%低IgG FBS之RPMI-1640中。將25μl之此等報導細胞添加至各孔中，從而產生1：1之效應細胞與靶細胞之比率。在37℃及5% CO₂下將盤培育20小時。在此培育後，將Bio-Glo螢光素酶分析試劑(Promega公司)在室溫下解凍且將75μl添加至96孔白色分析盤之各孔中。在5分鐘-10分鐘內，使用EnVision多標記盤讀取器(PerkinElmer公司)量測發光。將背景發光(空白外部孔)自各樣品讀數中扣除且記錄調整之相對光單位(RLU)。用Graphpad Prism軟體對數據進行作圖。所測試之抗體為：DuoBody pab1876×pab2049、二價抗GITR抗體pab1876(F405L/F405L)、二價抗OX40抗體pab2049(K409R/K409R)、DuoBody pab1876×同型、DuoBody pab2049×同型及同型對照抗體。抗體pab1876(F405L/F405L)在兩個重鏈恆定區中包含F405L取代且抗體pab2049(K409R/K409R)在兩個重鏈恆定區中包含K409R取代，其係根據EU編號系統來編號。

對於僅表現GITR或OX40而非表現兩者之細胞，與DuoBody pab1876×pab2049之結合弱於pab1876及pab2049之結合的觀測結果(圖2B及2C)相一致，當結合表現GITR或OX40而非表現兩者之Jurkat細胞時，與pab1876(F405L/F405L)及pab2049(K409R/K409R)相比，在所測試之除最高濃度以外之所有濃度下，DuoBody pab1876×pab2049表現出較弱之FcγRIIIA活化(圖3C及 3D)。

8.2.4 抗GITR/OX40雙特異性抗體對NK細胞介導之ADCC活性之作用

在此實施例中，研究DuoBody pab1876×pab2049誘導對共表現GITR及OX40之細胞的自然殺手(NK)細胞介導之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力。

使用磁性珠粒分離(MACS，Miltenyi公司，130-094-775)將經由ficoll梯度(Research Blood Components有限責任公司)自健康供者白細胞層分離之人類PBMC針對效應T細胞或自然Treg進一步增濃。在37℃及5% CO₂下在補充有10%熱滅活FBS之RPMI培養基中用CD3-CD28微珠(1：1珠粒：細胞，Invitrogen公司，11132D)及重組人類IL-2(20U/ml用於效應T細胞；100U/ml用於Treg)(Peprotech公司，200-02)將增濃之效應T細胞或Treg活化7天。在刺激後，經由流動式細胞量測術評估細胞之GITR及OX40表現。為了減少非特異性結合，在環境溫度下將細胞與FcγR阻斷抗體(Biolegend公司，422302)一起培育15分鐘。接著將樣品洗滌兩次且在4℃下與CD3、CD4、CD8、及CD25之譜系抗體組以及可固定之活/死標記一起培育30分鐘。對於Treg劃分，接著將樣品洗滌兩次，固定，透化，且在4℃下與抗FOXP3 抗體(eBiosciences公司，純系# PCH101)一起培育30分鐘。接著將樣品洗滌兩次且使用LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences公司)分析。使用FACS DIVA及WEHI Weasel軟體之組合分析流動式細胞量測術圖。為了評估ADCC活性，經由磁性珠粒分離(MACS，Miltenyi公司，130-092-657)自健康供者PBMC中分離原生NK細胞。將NK細胞與20U/ml之重組人類IL-2(Peprotech公司，200-02)一起靜置隔夜。將NK細胞與靶細胞(效應T細胞或Treg)一起共培養且在補充有熱滅活0.5% FBS之RPMI 1640無酚紅培養基中以10：1之E：T比率與抗體(滴定範圍：0.0004至1.9μg/ml)一起培育4小時。存在五個處理組：同型對照、單獨pab1876、單獨pab2049、DuoBody pab1876×pab2049及pab1876與pab2049之組合。在最後一組中，將pab1876與pab2049以等莫耳濃度添加以達成與其他組相同之最終濃度。在各孔中以100μl之總體積添加總共2×10⁵個靶細胞(效應T細胞或Treg)及2×10⁶個NK細胞。在培育後，使用CytoTox 96非放射性細胞毒性分析(Promega公司，G1780)，根據製造商之說明書來量測如由乳酸脫氫酶(LDH)釋放所證實之細胞裂解。細胞毒性(細胞裂解%)係使用下式來確定：細胞毒性%=(實驗-效應細胞自發-靶細胞自發)/(靶細胞最大-靶細胞自發)×100。

如圖3E中所示，與活化之效應T細胞相比，活化之Treg表現較高含量之GITR及OX40。與該差異表現模式相一致，針對GITR及/或OX40之抗體未誘導高於背景水準之顯著的活化效應T細胞裂解(圖3F)，而相同抗體以劑量依賴性方式誘導對活化之Treg強烈之NK細胞介導之ADCC活性(圖3G)。值得注意的是，與單獨pab1876、單獨pab2049或pab1876及pab2049之組合相比，DuoBody pab1876×pab2049誘導較高程度之活化Treg裂解。

8.2.5 在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激後抗GITR/OX40雙特異性抗體對人類T細胞之作用

在葡萄球菌腸毒素A(SEA)刺激後評估DuoBody pab1876×pab2049對原生人類T細胞之功能活性。簡言之，在37℃及5% CO₂下將經由Ficoll梯度(Research Blood Components有限責任公司)自健康供者白細胞層分離之PBMC在補充有100ng/ml SEA超抗原(Sigma-Aldrich公司)及10%熱滅活FBS以及遞增濃度之測試抗體(7點劑量滴定，0.02至20μg/ml)之RPMI培養基中培育5天。在培育後，使用AlphaLISA免疫分析(Perkin-Elmer公司)分析無細胞上清液中之IL-2產生。使用EnVision^®多標記盤讀取器(Perkin-Elmer公司)收集數據且使用IL-2標準曲線確定IL-2之濃度。將值使用Graphpad Prism軟體內插及作圖。

DuoBody pab1876×pab2049在該使用來自兩個供者之細胞的原生人類PBMC分析中誘導IL-2產生(圖4A及4B)。重要的是，DuoBody pab1876×pab2049能夠以藥理學相關抗體濃度誘導高度之IL-2產生。由DuoBody pab1876×pab2049誘導之IL-2產生為在較寬之抗體濃度範圍(例如圖4A中之0.08μg/ml至20μg/ml及圖4B中之0.009μg/ml至20μg/ml)內抗體濃度之實質上遞增函數。

8.3 實施例3：作為拮抗劑抗體之抗GITR/OX40雙特異性抗體

GITR及OX40信號傳導之活化依賴於受體簇集以形成較高級之受體複合物，其有效募集頂端銜接蛋白以驅動細胞內信號轉導。不受理論所束縛，部分8.2.4中所示之DuoBody pab1876×pab2049之促效活性之一個可能之機制係藉由經由輔助骨髓或淋巴樣細胞(例如樹突細胞、單核球、巨噬細胞、自然殺手(NK)細胞及/或B細胞)上Fc-Fc受體(FcR)之共接合以使GITR受體及/或OX40受體簇集。表現FcR之一些腫瘤細胞亦可介導抗體簇集，例如血液學癌症(急性骨髓性白血病(AML)、漿細胞癌及非霍奇金氏淋巴瘤(NHL))以及某些實體(上皮)腫瘤細胞(例如黑素瘤)。因此，研發抗GITR/OX40雙特異性拮抗劑抗體之一種方法為選擇與GITR配體(GITRL)及OX40配體(OX40L)競爭結合其對應受體之雙特異性抗體且減少或消除雙特異性抗體之Fc區與Fc受體之結合。在此實施例中，研發兩種報導子分析以首先確認在不存在FcR相互作用之情況下DuoBody pab1876×pab2049之促效活性的損失，且其次研究DuoBody pab1876×pab2049拮抗GITRL及OX40L經由GITR及OX40受體誘導之信號傳導的能力。

8.3.1 抗GITR/OX40雙特異性抗體對GITR NF-κB-螢光素酶報導細胞之作用

首先，使用GITR報導子分析評估DuoBody pab1876×pab2049對GITR之促效活性。該報導子分析係使用表現最少量(若存在)之FcR之Jurkat細胞來構建，從而減小FcR介導之GITR分子簇集之可能性。

藉由將慢病毒載體(EF1a啟動子)轉導至Jurkat細胞中來產生異位表現GITR及NF-κB-螢光素酶(奈米螢光素酶，NanoLuc^®)報導子之細胞。經由單細胞分選(FACS ARIA Fusion)產生穩定純系。藉由流動式細胞量測術驗證GITR之表現。為評估促效活性，在37℃及5% CO₂下在補充有10%熱滅活FBS之RPMI培養基中將Jurkat-huGITR-NF-κB-螢光素酶細胞與遞增濃度之DuoBody pab1876×pab2049或三聚體GITRL(12點劑量滴定，0.05至10,000ng/ml)一起培育2小時。對於偵測螢光素酶活性，在室溫下在被動裂解緩衝液中將樣品與所製備之Nano-Glo^®螢光素酶分析受質(Promega公司，1：1 v/v)一起培育5分鐘。使用EnVision®多標記盤讀取器(Perkin-Elmer公司)收集數據。將值使用Graphpad Prism軟體作圖。

與誘導高度之如由RLU(相對螢光素酶單位)所表示之NF-κB-螢光素酶活性的三聚體GITRL相反，DuoBody pab1876×pab2049甚至在所測試之最高濃度下亦顯示最低之GITR報導細胞促效活性(圖5A)。

隨後，研究DuoBody pab1876×pab2049中和GITRL誘導之NF-κB信號傳導之能力，該能力為DuoBody之配體阻斷活性之替代結果。

簡言之，將Jurkat-huGITR-NF-κB-螢光素酶細胞與遞增濃度之DuoBody pab1876×pab2049或同型對照抗體(10點劑量滴定，0.5至10,000ng/ml)一起培育30分鐘。接著將樣品用RPMI洗滌兩次，再懸浮於1μg/ml之三聚體GITRL中且在37℃下再培育2小時。如上文所述偵測且分析螢光素酶活性。為確定GITRL活性%，將在不添加抗體之情況下GITRL(1μg/ml)之RLU值確定為100%活性。相應計算DuoBody pab1876×pab2049及同型對照之相對值。

如圖5B中所示，Jurkat-huGITR-NF-κB-螢光素酶報導細胞與遞增濃度之DuoBody pab1876×pab2049預培育以劑量依賴性方式顯著降低GITRL誘導之NF-κB-螢光素酶活性。

8.3.2 抗GITR/OX40雙特異性抗體對OX40 NF-κB-螢光素酶報導細胞之作用

類似地，研發OX40報導子分析以測試DuoBody pab1876×pab2049對表現OX40之細胞的促效活性。此OX40報導子分析亦使用FcR表現最低之Jurkat細胞來構築。

藉由將慢病毒載體(EF1a啟動子)轉導至Jurkat細胞中來產生異位表現OX40及NF-κB-螢光素酶(奈米螢光素酶，NanoLuc^®)報導子之細胞。經由單細胞分選(FACS ARIA Fusion)產生穩定純系。藉由流動式細胞量測術驗證OX40之表現。為評估促效活性，在37℃及5% CO₂下在補充有10%熱滅活FBS之RPMI培養基中將Jurkat-huOX40-NF-κB-螢光素酶細胞與遞增濃度之多聚體OX40L、DuoBody pab1876×pab2049或同型對照抗體(10點劑量滴定，0.5至10,000ng/ml)一起培育2小時。對於偵測螢光素酶活性，在室溫下在被動裂解緩衝液中將樣品與所製備之Nano-Glo^®螢光素酶分析受質(Promega公司，1：1 v/v)一起培育5分鐘。使用EnVision^®多標記盤讀取器(Perkin-Elmer公司)收集數據。將值使用Graphpad Prism軟體作圖。

雖然多聚體OX40L在較寬之濃度範圍內誘導 NF-κB-螢光素酶活性，但在與DuoBody pab1876×pab2049一起培育之後觀測到最小之螢光素酶信號(圖6A)。

隨後，評定DuoBody pab1876×pab2049阻斷OX40L誘導之NF-κB信號傳導之能力。將Jurkat-huOX40-NF-κB-螢光素酶細胞與遞增濃度之DuoBody pab1876×pab2049或同型對照抗體(10點劑量滴定，0.5至10,000ng/ml)一起培育30分鐘。接著將樣品用RPMI洗滌兩次，再懸浮於1μg/ml之多聚體OX40L中且在37℃下再培育2小時。如上文所述偵測且分析螢光素酶活性。為確定OX40L活性%，將在不添加抗體之情況下OX40L(1μg/ml)之RLU值確定為100%活性。相應計算DuoBody pab1876×pab2049及同型對照之相對值。

如圖6B中所示，Jurkat-huOX40-NF-κB-螢光素酶報導細胞與遞增濃度之DuoBody pab1876×pab2049預培育以劑量依賴性方式顯著降低OX40L誘導之NF-κB-螢光素酶活性。

8.4 實施例4：抗GITR抗體之表位定位

此實施例表徵下列抗GITR抗體之結合表位：嵌合親本231-32-15抗體及其人類化型式(pab1876、pab1875、pab1967、pab1975及pab1979)。此外，在一些研究中亦使用命名為m6C8之參考抗GITR抗體來進行比較。抗體m6C8係基於PCT申請公開案第WO 2006/105021號(以引用方式併入本文)中所提供之抗體6C8之可變區來產生。對應於此等抗GITR抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之SEQ ID NO列於表12中。

8.4.1 表位競爭──細胞結合分析

為確認人類化變異抗體保留嵌合231-32-15親本抗體之表位特異性，進行細胞結合分析。收集表現嵌合親本231-32-15抗體之1624-5前B細胞且將1×10⁶個細胞再懸浮於200μl FACS緩衝液加上以下物質中：i)與2μg嵌合親本231-32-15抗體預培育15分鐘之生物素化之GITR(GITR-bio)(1：1000)；ii)與2μg pab1875預培育15分鐘之GITR-bio(1：1000)；iii)與2μg pab1876預培育15分鐘之GITR-bio(1：1000)；或iv)GITR-bio(1：1000)。將細胞在4℃下培育20分鐘且接著用4ml FACS緩衝液洗滌且在4℃下以300g離心5分鐘。將細胞沈澱物再懸浮於200μl FACS緩衝液加上鏈黴親和素-PE(1：1000)中且接著如前所述培育及洗滌。接著將細胞再懸浮於200μl FACS緩衝液中以使用FACS-AriaII(BD Biosciences公司)分析。

圖7顯示人類化變異抗體保留嵌合親本231-32-15抗體之表位特異性。右側曲線顯示GITR-bio與表現嵌合親本231-32-25抗體之1624-5前B細胞之結合。然而，當將GITR-bio與嵌合親本231-32-15、pab1875或pab1876抗體預培育時，存在GITR-bio與1624-5細胞之結合損失(左側曲線)。重疊之FACS曲線表明人類化變異體亦彼此且與嵌合親本231-32-15抗體顯示極相似之GITR結合特性。

8.4.2 表位競爭──懸浮陣列技術

將抗GITR抗體(25μl)在分析緩衝液(Roche公司，11112589001)中稀釋至2μg/ml且在暗處在振盪條件下在0.5ml LoBind管(Eppendorf公司，0030108.116)中與偶聯抗人類IgG(F(ab)₂特異性，JIR公司，105-006-097)之1500個Luminex^®珠粒(5μl，Luminex公司，編號：5 LC10005-01)一起培育隔夜。接著將此混合物轉移至預潤濕之96孔過濾盤(Millipore公司，MABVN1250)中。將盤用200微升/孔PBS洗滌兩次以移除未結合之抗體。同時，在暗處以650rpm將20μg/ml之相同抗GITR抗體、不同抗GITR抗體、或分析緩衝液與20μl(1μg/ml)R-PE標記之GITR抗原(R&D systems公司，二硫鍵連接之同二聚體；689-GR；內部用AbDSerotec公司之LYNX套組(LNK022RPE)標記)一起培育1小時。將珠粒混合物與抗原/抗體混合物1：1混合(各20μl)且在振盪條件(20℃、650rpm)下再培育一小時。在量測之前直接將40μl之分析緩衝液添加至各孔中且使用Luminex^® 200系統(Millipore公司)及48μl樣品體積中100個珠粒之讀數進行分析。使用非競爭對照(100%結合，僅分析緩衝液作為競爭化合物)之MFI值來確定結合。

當使用嵌合親本231-32-15抗體作為捕捉抗體時，觀測到與人類化抗體pab1875及pab1876兩者之完全結合競爭。當使用抗GITR抗體m6C8作為捕捉抗體時，未觀測到與嵌合親本231-32-15抗體或兩種人類化變異體pab1875及pab1876之結合競爭(數據未示)。此等結果表明m6C8與本文所述之抗GITR抗體識別人類GITR上之不同表位。

8.4.3 表位競爭──表面電漿共振

對於使用表面電漿共振之表位框併(epitope binning)，使用「串聯方法」(Abdiche YN等人，(2009)Analytical Biochemistry,386：172-180)。為了該目的，使用不同密度之GITR抗原(R&D systems公司，二硫鍵連接之同二聚體；689-GR)之固定在CM5感應器晶片(GE Healthcare公司，S CM5系列，BR-1005-30)上產生不同晶片表面。流槽2容納低密度(667RU)之GITR抗原，在流槽3中評定中等密度(1595RU)且在流槽4中，達成高密度(4371RU)。在流槽1中，固定卵白蛋白(1289RU，Pierce ThermoFisher公司，77120)用於參考。根據來自製造商(GE Healthcare公司)之用於胺偶聯之標準方案(用0.4M EDC及0.1M NHS活化表面，GE Healthcare胺偶聯套組，BR-1000-50)來進行固定。用1M乙醇-胺-HCl(pH 8.5)使未反應基團失活。之後，使300nM(45μg/ml)濃度之抗GITR抗體以5微升/分鐘通過不同表面，持續240秒。使用此等條件，應已達到GITR表面之飽和。在添加競爭性抗體(300nM，5微升/分鐘)之前包括60秒之解離時間。使用10mM甘胺酸(pH 2.0)(GE Healthcare公司，BR-1003-55)以10微升/分鐘進行晶片表面之再生，持續60秒。使用非競爭對照(100%結合，飽和條件)之反應單位(RU)數進行框併。

如圖8中所示，當嵌合親本231-32-15抗體首先結合至GITR時，不存在此抗體之進一步結合。然而，當嵌合親本231-32-15抗體首先結合至GITR且施加抗體m6C8時，此抗體仍能結合至GITR。

8.4.4 表位定位──PCR突變誘發及丙胺酸掃描

為了定位GITR上與本文所述之抗GITR抗體結合之表位，使用易錯PCR產生人類GITR抗原之變異體。使變異型GITR蛋白表現在細胞庫中細胞之表面上且針對抗GITR抗體之結合篩選此等細胞。作為陽性對照，使用多株抗GITR抗體確認GITR蛋白質之正確摺疊。對於存在減少之抗體結合或不存在抗體結合之人類GITR抗原變異體，進行丙胺酸掃描突變誘發以確定為由本文所述之抗GITR抗體結合所需之精確表位殘基。

8.4.4.1 人類GITR變異體之產生

使用易錯PCR突變誘發以產生在細胞外結構域中具有隨機突變之人類GITR變異體。對於易錯PCR，根據製造商之說明書使用GeneMorphII隨機突變誘發套組(Stratagene公司)。簡言之，使用作為模板之內部構築體(13ng，構築體編號：4377 pMA-T-huGITR)、0.05U/μl Mutazyme II DNA聚合酶、1×Mutazyme II反應緩衝液、0.2μM之各引子及0.2mM各去氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)以50μl之體積進行20個PCR循環。使用下列程序藉由PCR(德國Eppendorf公司)擴增樣品：95℃持續2分鐘；95℃持續30秒、56℃持續30秒、72℃持續1分鐘之20個循環；及72℃持續10分鐘之最終延伸步驟。使用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行凝膠純化，將對應於720bp之預期尺寸之DNA條帶剪出且使用NucleoSpin凝膠及PCR淨化套組(Macherey&Nagel公司)根據產品手冊進行凝膠提取。使用T4 DNA連接酶及1：3 之比率(載體：插入物)經由XhoI/EcoRI位點將純化之DNA連接至內部表現載體中。在2小時之後用在65℃下進行10分鐘之熱變性步驟停止連接(25℃)。使用酵母t-RNA使來自連接反應之DNA進行EtOH沈澱。使用標準消化及連接技術。將連接反應物電穿孔至DH10B細胞(大腸桿菌ElectroMax DH10B電感受態細胞，Invitrogen公司；1900V/5ms)中。將電穿孔之細菌接種至LB瓊脂+100μg/ml安比西林(ampicillin)平板上且獲得約1.9×10⁸個菌落。

接著自平板刮下所有電穿孔之細菌且用於根據製造商之說明書進行大規模DNA質體製備(Macherey&Nagel公司，NucleoBond Xtra Maxi Plus套組)以產生DNA庫。使用XhoI/EcoRI及BsrGI/EcoRI進行限制酶消化以對庫進行品質控制。挑取單個純系且送去定序以確定最終之庫多樣性。

8.4.4.2 具有人類GITR變異體之細胞庫之產生

使用先轉染，繼而轉導之標準技術以在1624-5細胞表面上表現人類GITR突變體。對於反轉錄病毒顆粒之產生，使用X-tremeGENE 9 DNA轉染試劑(德國Roche Diagnostics有限公司)將DNA庫及表現反轉錄病毒蛋白質Gag、Pol及Env之載體轉染至反轉錄病毒包裝細胞株(HEK細胞)中。所得之反轉錄病毒顆粒在反轉錄病毒包裝細胞之細胞培養上清液中積聚。在轉染後兩天時，收集無細胞之含有病毒載體顆粒之上清液且對1624-5細胞進行旋轉感染(spin-infection)。獲得約4%之轉導效率(表現人類GITR之細胞%)。在再連續培養至少一天時，使用嘌呤黴素(1.5μg/ml)選擇細胞。未轉導之細胞用作陰性對照(NC)。在抗生素選擇之後，大部分細胞在細胞表面上穩定表現人類GITR抗原庫。經由Ficoll分離步驟移除非存活細胞。

使用FACS以使用多株抗GITR抗體選擇表現正確摺疊之人類GITR突變體之細胞且隨後選擇表現不結合抗GITR嵌合親本231-32-15抗體之人類GITR變異體之個別細胞。簡言之，藉由FACS分析抗體結合細胞且藉由製備型高速FACS(FACSAriaII，BD Biosciences公司)將表現出特異性抗體結合之細胞與非結合細胞群體分離。在組織培養中再次擴增抗體反應性或非反應性細胞池且由於反轉錄病毒轉導之細胞的穩定表現表型，重複抗體導向細胞分選及組織培養擴增之循環，直至獲得明確可偵測之抗GITR抗體(嵌合親本231-32-15)非反應性細胞群體之時為止。對此抗GITR抗體(嵌合親本231-32-15)非反應性細胞群體進行最終之單細胞分選步驟。在細胞擴增數日之後，在FACSCalibur(BD Biosciences公司)上使用96孔盤分析再次測試單細胞分選之細胞與抗GITR嵌合親本231-32-15抗體之非結合及與多株抗GITR抗體之結合。

8.4.4.3 表位分析

為了使表型(多株抗GITR+、嵌合親本231-32-15-)與基因型相關聯，對單細胞分選之huGITR變異體進行定序。圖9A及9B顯示來自此等變異體之序列之比對。圖9A及9B中之胺基酸殘基係根據人類GITR之未成熟胺基酸序列(SEQ ID NO：41)來編號。定序識別出具有增加之突變或「熱點」(例如P62及G63)之區域，從而提供有關人類GITR上由抗GITR嵌合親本231-32-15抗體識別之表位的指示。

為了確認人類GITR之參與結合抗GITR抗體之精確胺基酸，對熱點胺基酸進行丙胺酸置換。分別將下列位置(根據SEQ ID NO：41編號)突變成丙胺酸：P28A、T29A、G30A、G31A、P32A、T54A、T55A、R56A、C57A、C58A、R59A、D60A、Y61A、P62A、G63A、E64A、E65A、C66A、C67A、S68A、E69A、W70A、D71A、C72A、M73A、C74A、V75A及Q76A。使用先轉染，繼而轉導之標準技術以在1624-5細胞表面上表現此等人類GITR丙胺酸突變體。

最終，在流動式細胞量測術(FACSCalibur；BD Biosciences公司)中測試1624-5細胞上表現之丙胺酸突變體與抗GITR人類化抗體pab1876、pab1967、pab1975及pab1979以及參考抗體m6C8之結合。簡言之，在4℃下將表現個別人類GITR丙胺酸突變體之1624- 5細胞與在100μl FACS緩衝液(PBS+2% FCS)中稀釋之2μg/ml之單株抗GITR抗體pab1876、pab1967、pab1975、pab1979或m6C8；或與APC結合之多株抗GITR抗體(AF689，R&D systems公司)、及Fc受體阻斷劑(1：200；BD公司，目錄號：553142)一起培育20分鐘。在洗滌後，若需要偵測，則在4℃下將細胞與在100μl FACS緩衝液(PBS+2% FCS)中稀釋之二級抗IgG抗體(與APC結合；BD公司，目錄號：109-136-097)一起培育20分鐘。接著洗滌細胞且使用流式細胞儀(BD Biosciences公司)獲得該等細胞。將測試之單株抗體之平均螢光強度(MFI)值除以多株抗體之MFI值，從而產生個別GITR丙胺酸突變體之MFI比率(單株抗體/多株抗體)。基於所有突變體之個別MFI比率計算平均MFI比率(「AMFI比率」)。圖10A為彙總pab1876、pab1967、pab1975、pab1979及參考抗體m6C8與表現人類GITR丙胺酸突變體之1624-5細胞之結合的表。認為高於AMFI比率之60%之個別MFI比率指示在正規化之後與多株抗體相似之結合且在圖10A中由「+」表示。介於AMFI比率之30%與60%之間的個別MFI比率在圖10A中由「+/-」表示。低於AMFI比率之30%之個別MFI比率在圖10A中由「-」表示。

如圖10A中所示，D60A突變體及G63A突變體(根據SEQ ID NO：41來編號)特異性破壞或減弱pab1876、pab1967、pab1975及pab1979之結合，而不破壞或減弱參考抗體m6C8之結合。C58A突變體破壞所有五種抗體之結合且可能為結構突變，而非表位特異性突變。C74A突變體具有較弱之表現且不能用於結合比較。

此外，比較抗GITR抗體231-32-15、pab1876及m6C8與野生型或突變型人類GITR之結合。簡言之，如上文所述使野生型人類GITR及兩種GITR丙胺酸突變體(D60A突變體及G63A突變體，其係根據SEQ ID NO：41編號)在1624-5細胞表面上表現且如上文所述在流動式細胞量測術分析中測試，其中將細胞首先使用2μg/ml之單株抗體231-32-15、pab1876及m6C8、或與APC結合之多株抗體染色，且接著若需要偵測，則使用二級抗IgG抗體(與APC結合；1：1000；BD公司，目錄號：109-136-097)染色。將所有平均螢光強度(MFI)值計算為兩次量測之平均值。將所測試之單株抗體對特定細胞類型之MFI值除以多株抗體對相同細胞類型之MFI值，從而產生總共九個MFI比率(單株抗體/多株抗體)：MFI比率_231-32-15,WT、MFI比率_pab1876,WT、MFI比率_m6C8,WT、MFI比率_{231-32-15,D60A}、MFI比率_pab1876,D60A、MFI比率_m6C8,D60A、MFI比率_{231-32-15,G63A}、MFI比率_pab1876,G63A及MFI比率_m6C8,G63A。藉由將GITR丙胺酸突變體之特定MFI比率除以野生型之相應MFI比率(例如用MFI比率_pab1876,D60A除以MFI比率_pab1876,WT)來計算相對於與野生型GITR之結合，抗體與GITR丙胺酸突變體之結合百分比。結合減少百分比係藉由計算例如100%×(1-(MFI比率_pab1876,D60A/MFI比率_pab1876,WT))來確定。

如圖10B中所示，D60A突變體及G63A突變體特異性破壞或減弱231-32-15及pab1876之結合，而不破壞或減弱m6C8之結合。圖10B中所示之百分比為各圖中GITR陽性細胞之百分比。當使用表現GITR D60A之細胞測試時，231-32-15及pab1876之抗體結合分別減少82%及88%，相比之下，m6C8之抗體結合減少10%。類似地，當使用表現GITR G63A之細胞測試時，231-32-15及pab1876之結合分別減少37%及59%，而m6C8之結合增加62%。

作為抗GITR抗體之結合特徵之進一步證據，比較該等抗體與石蟹獼猴GITR之結合。石蟹獼猴GITR之未成熟蛋白質包含胺基酸序列SEQ ID NO：44。為了增加蛋白質表現，將石蟹獼猴GITR之信號肽之第一個殘基置換為甲硫胺酸，從而產生V1M石蟹獼猴GITR。接著產生突變型石蟹獼猴GITR V1M/Q62P/S63G，其中位置62及63處之胺基酸殘基(GlnSer)(根據SEQ ID NO：44編號)經人類GITR中之相應殘基(ProGly)置換。圖11A為人類GITR、V1M石蟹獼猴GITR、及V1M/Q62P/S63G石蟹獼猴GITR之間的序列比對。如上文所述使圖11A中所示之三種蛋白質在1624-5細胞表面上表現且如上文所述在流動式細胞量測術分析中測試，其中將細胞首先使用2 μg/ml之單株抗體231-32-15、pab1876及m6C8、或與APC結合之多株抗體染色，且接著使用二級抗IgG抗體(與APC結合；1：1000；BD公司，目錄號：109-136-097)染色。

如圖11B中所示，抗GITR抗體231-32-15及pab1876顯示僅與表現V1M/Q62P/S63G石蟹獼猴GITR之細胞結合，而不與表現V1M石蟹獼猴GITR之細胞結合。

8.5 實施例5：抗OX40抗體之表位定位

此實施例表徵抗OX40抗體pab1949w、pab2049及參考抗OX40抗體pab1928之表位。抗體pab1928係基於美國專利公開案第US 2013/0280275號(以引用之方式併入本文中)中所提供之抗體Hu106-122之可變區而產生。pab1928包含胺基酸序列SEQ ID NO：106之重鏈及胺基酸序列SEQ ID NO：107之輕鏈。

8.5.1 表位定位──丙胺酸掃描

藉由丙胺酸掃描評定pab1949w、pab2049及參考抗體pab1928之結合特徵。簡言之，使用QuikChange HT蛋白質工程改造系統(Agilent Technologies公司，G5901A)產生在細胞外結構域中具有丙胺酸取代之人類OX40突變體。如上文所述使用先轉染，繼而轉導之標準技術使人類OX40突變體在1624-5細胞表面上表現。

在如由在流動式細胞量測術中與多株抗OX40抗體之結合所證實的表現正確摺疊之人類OX40突變體之細胞中進一步選擇表現不結合單株抗OX40抗體pab1949w、pab2049或pab1928之人類OX40突變體的子群。藉由製備型高速FACS(FACSAriaII，BD Biosciences公司)將表現出特異性抗體結合之細胞與非結合細胞群體分離。在組織培養中再次擴增抗體反應性或非反應性細胞池且由於反轉錄病毒轉導之細胞的穩定表現表型，重複抗體導向細胞分選及組織培養擴增之循環直至獲得明確可偵測之抗OX40抗體(pab1949w、pab2049或pab1928)非反應性細胞群體之時為止。對此抗OX40抗體非反應性細胞群體進行最終之單細胞分選步驟。在細胞擴增數日之後，再次使用流動式細胞量測術來測試單細胞分選之細胞與多株抗OX40抗體之結合及與單株抗體pab1949w、pab2049或pab1928之非結合。簡言之，將表現個別人類OX40丙胺酸突變體之1624-5細胞與單株抗OX40抗體pab1949w、pab2049或pab1928一起培育。對於各抗體，測試兩個抗體濃度(pab1949w：2μg/ml及0.5μg/ml；pab2049：1.8μg/ml及0.3μg/ml；pab1928：1.1μg/ml及0.4μg/ml)。以1：2000稀釋與APC結合之多株抗OX40抗體(AF3388，R&D systems公司)。添加Fc受體阻斷劑(1：200；BD公司，目錄號：553142)，且在4℃下將樣品培育20分鐘。在洗滌後，若需要偵測，則在4℃下將細胞與二級抗IgG抗體(與PE結合；BD公司，目錄號：109-116-097)一起培育20分鐘。接著洗滌細胞且使用流式細胞儀(BD Biosciences公司)獲得該等細胞。

為使表型(多株抗OX40抗體+、單株抗OX40抗體-)與基因型相關聯，對單細胞分選之人類OX40突變體進行定序。圖12為顯示仍結合多株抗OX40抗體，但不結合單株抗OX40抗體pab1949w、pab2049或pab1928之人類OX40丙胺酸突變體的表。所有殘基係根據人類OX40之成熟胺基酸序列(SEQ ID NO：72)編號。基於流動式細胞量測術分析，「+」指示結合且「-」指示結合損失。

***

本發明之範疇不受本文所述之特定具體實例限制。實際上，除所述之修改之外，對本發明之各種修改對於熟習此項技術者而言亦因上述描述及隨附圖式而將變得顯而易見。此等修改意欲落入隨附申請專利範圍之範疇內。

本文引用之所有參考文獻(例如公開案或專利或專利申請案)出於所有目的以全文引用的方式併入本文中，其引用程度就如同特定且個別指示各個別參考文獻(例如公開案或專利或專利申請案)出於所有目的以全文引用之方式併入本文中一般。

其他具體實例落入下列申請專利範圍內。

<110> 艾吉納斯公司(Agenus) 紀念斯隆凱特琳癌症中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) 盧德威格癌症研究協會(Ludwig Institute for Cancer Research Ltd.)

<120> 抗體和使用彼之方法

<140> TW 105139958

<141> 2016-12-02

<150> US 62/419,911

<151> 2016-11-09

<150> US 62/262,369

<151> 2015-12-02

<160> 136

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR HCDR1共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Asp、Gly或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Tyr或His

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR HCDR2共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Val或Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa為Asp或Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa為Thr或Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa為Lys、Arg或Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa為Asp、Glu或Gly

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR HCDR3共同序列(pab1876/pab1967/pab1975/pab1979 HCDR3)

<400> 3

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR LCDR1共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa為Gly或Ser

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR LCDR2共同序列(pab1876/pab1967/pab1975/pab1979 LCDR2)

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR LCDR3共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa為Asp或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa為Tyr或Phe

<400> 6

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HCDR1

<400> 7

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1967 HCDR1

<400> 8

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1975/pab1979 HCDR1

<400> 9

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HCDR2

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1967 HCDR2

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1975 HCDR2

<400> 12

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1979 HCDR2

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876/pab1975/pab1979 LCDR1

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1967 LCDR1

<400> 15

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876/pab1975/pab1979 LCDR3

<400> 16

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1967 LCDR3

<400> 17

<210> 18

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 VH

<400> 18

<210> 19

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 VL

<400> 19

<210> 20

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1967 VH

<400> 20

<210> 21

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1967 VL

<400> 21

<210> 22

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1975 VH

<400> 22

<210> 23

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1975/pab1979 VL

<400> 23

<210> 24

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1979 VH

<400> 24

<210> 25

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR VH共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)..(24)

<223> Xaa為Gly或Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> Xaa為Asp、Gly或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa為Tyr或His

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (48)..(48)

<223> Xaa為Ile或Met

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (50)..(50)

<223> Xaa為Val或Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (57)..(57)

<223> Xaa為Asp或Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (59)..(59)

<223> Xaa為Thr或Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (65)..(65)

<223> Xaa為Lys、Arg或Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (66)..(66)

<223> Xaa為Asp、Glu或Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (68)..(68)

<223> Xaa為Ala或Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (74)..(74)

<223> Xaa為Lys或Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (114)..(114)

<223> Xaa為Val或Ile

<400> 25

<210> 26

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR VL共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa為Gly或Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (69)..(69)

<223> Xaa為Ser或Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (84)..(84)

<223> Xaa為Leu或Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (93)..(93)

<223> Xaa為His或Tyr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (97)..(97)

<223> Xaa為Asp或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (100)..(100)

<223> Xaa為Tyr或Phe

<400> 26

<210> 27

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR VH生殖系IGHV1-2＊02

<400> 27

<210> 28

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR VL生殖系IGKV4-1＊01

<400> 28

<210> 29

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1

<400> 29

<210> 30

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 N297A

<400> 30

<210> 31

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 F405L

<400> 31

<210> 32

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 F405L N297A

<400> 32

<210> 33

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 F405L L234F L235E D265A

<400> 33

<210> 34

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 K409R

<400> 34

<210> 35

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 K409R N297A

<400> 35

<210> 36

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG4 S228P

<400> 36

<210> 37

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876w LC

<400> 37

<210> 38

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 LC T109S

<400> 38

<210> 39

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 K409R L234F L235E D265A

<400> 39

<210> 40

<211> 216

<212> PRT

<213> 智人

<400> 40

<210> 41

<211> 241

<212> PRT

<213> 智人

<400> 41

<210> 42

<211> 255

<212> PRT

<213> 智人

<400> 42

<210> 43

<211> 234

<212> PRT

<213> 智人

<400> 43

<210> 44

<211> 234

<212> PRT

<213> 石蟹獼猴

<400> 44

<210> 45

<211> 234

<212> PRT

<213> 石蟹獼猴

<400> 45

<210> 46

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> V1M/Q62P/S63G石蟹獼猴GITR未成熟蛋白

<400> 46

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HCDR1

<400> 47

<210> 48

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HCDR2

<400> 48

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HCDR3

<400> 49

<210> 50

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 LCDR1

<400> 50

<210> 51

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 LCDR2

<400> 51

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049 LCDR3

<400> 52

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1949 LCDR3

<400> 53

<210> 54

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 VH

<400> 54

<210> 55

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049 VL

<400> 55

<210> 56

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1949 VL

<400> 56

<210> 57

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40 HC生殖系IGHV3-73＊01

<400> 57

<210> 58

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40 LC生殖系IGKV2-28＊01

<400> 58

<210> 59

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG1

<400> 59

<210> 60

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG1 N297A

<400> 60

<210> 61

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG1 K409R

<400> 61

<210> 62

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG1 K409R N297A

<400> 62

<210> 63

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC K409R L234F L235E D265A

<400> 63

<210> 64

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC F405L

<400> 64

<210> 65

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC F405L N297A

<400> 65

<210> 66

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG4 S228P

<400> 66

<210> 67

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049w LC

<400> 67

<210> 68

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049 LC T109S

<400> 68

<210> 69

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Pab1949w LC

<400> 69

<210> 70

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Pab1949 LC T109S

<400> 70

<210> 71

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC F405L L234F L235E D265A

<400> 71

<210> 72

<211> 249

<212> PRT

<213> 智人

<400> 72

<210> 73

<211> 277

<212> PRT

<213> 智人

<400> 73

<210> 74

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1

<400> 74

<210> 75

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 N297A

<400> 75

<210> 76

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 F405L

<400> 76

<210> 77

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 F405L N297A

<400> 77

<210> 78

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 F405L L234F L235E D265A

<400> 78

<210> 79

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 K409R

<400> 79

<210> 80

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 K409R N297A

<400> 80

<210> 81

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG4 S228P

<400> 81

<210> 82

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1876 HC IgG1 K409R L234F L235E D265A

<400> 82

<210> 83

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC F405L L234F L235E D265A

<400> 83

<210> 84

<400> 84 000

<210> 85

<400> 85 000

<210> 86

<400> 86 000

<210> 87

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR1抗GITR共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Asp、Glu或Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa為Ala或Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Tyr或His

<400> 87

<210> 88

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H-CDR2抗GITR共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Val或Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa為Arg、Lys或Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Tyr或Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa為Asp、Glu或Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa為Val或Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa為Thr或Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa為Lys、Arg或Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa為Asp、Glu或Gly

<400> 88

<210> 89

<400> 89 000

<210> 90

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR1抗GITR共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa為Gly或Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa為Thr或Ser

<400> 90

<210> 91

<400> 91 000

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L-CDR3抗GITR共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa為Asp或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa為Tyr、Phe或Ser

<400> 92

<210> 93

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG1恒定區共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (97)..(97)

<223> Xaa為Lys或Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (239)..(239)

<223> Xaa為Asp或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (241)..(241)

<223> Xaa為Leu或Met

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (314)..(314)

<223> Xaa為Gly或Ala

<400> 93

<210> 94

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG1 G1m3同種異型

<400> 94

<210> 95

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG1 G1m17,1同種異型

<400> 95

<210> 96

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG1 G1m17,1,2同種異型

<400> 96

<210> 97

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG4野生型恒定區

<400> 97

<210> 98

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4恒定區S228P修飾

<400> 98

<210> 99

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG2野生型恒定區

<400> 99

<210> 100

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG2恒定區C127S修飾

<400> 100

<210> 101

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 231-32-15 VH

<400> 101

<210> 102

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 231-32-15 VL

<400> 102

<210> 103

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab1875 VL

<400> 103

<210> 104

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> m6C8 VH

<400> 104

<210> 105

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> m6C8 VL

<400> 105

<210> 106

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Pab1928(Hu106-122)HC

<400> 106

<210> 107

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Pab1928(Hu106-122)LC T109S

<400> 107

<210> 108

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 108

<210> 109

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 109

<210> 110

<400> 110 000

<210> 111

<400> 111 000

<210> 112

<400> 112 000

<210> 113

<400> 113 000

<210> 114

<400> 114 000

<210> 115

<400> 115 000

<210> 116

<400> 116 000

<210> 117

<400> 117 000

<210> 118

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG1

<400> 118

<210> 119

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG1 N297A

<400> 119

<210> 120

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG1 K409R

<400> 120

<210> 121

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG1 K409R N297A

<400> 121

<210> 122

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC K409R L234F L235E D265A

<400> 122

<210> 123

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC F405L

<400> 123

<210> 124

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC F405L N297A

<400> 124

<210> 125

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pab2049/pab1949 HC IgG4 S228P

<400> 125

<210> 126

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG1恒定區共同序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (97)..(97)

<223> Xaa可為Lys或Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (239)..(239)

<223> Xaa可為Asp或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (241)..(241)

<223> Xaa可為Leu或Met

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (314)..(314)

<223> Xaa可為Gly或Ala

<400> 126

<210> 127

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG1 G1m3同種異型

<400> 127

<210> 128

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG1 G1m17,1同種異型

<400> 128

<210> 129

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG1 G1m17,1,2同種異型

<400> 129

<210> 130

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG4野生型恒定區

<400> 130

<210> 131

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4恒定區S228P修飾

<400> 131

<210> 132

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類IgG2野生型恒定區

<400> 132

<210> 133

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG2恒定區C127S修飾

<400> 133

<210> 134

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Pab1928(Hu106-122)HC

<400> 134

<210> 135

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含F405L突變之IgG1恒定區

<400> 135

<210> 136

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含K409R突變之IgG1恒定區

<400> 136

Claims

一種分離之多特異性抗體，其包含：(a)特異性結合人類OX40之第一抗原結合區，該第一抗原結合區包含第一重鏈可變區(VH)和第一輕鏈可變區(VL)，該第一VH包含VH互補決定區(CDR)1、VH CDR2及VH CDR3，且該第一VL包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該第一VH包含SEQ ID NO：54之VH胺基酸序列的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之胺基酸序列，且該第一VL包含SEQ ID NO：55之VL胺基酸序列的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之胺基酸序列；及(b)特異性結合人類GITR之第二抗原結合區，該第二抗原結合區包含第二VH和第二VL，該第二VH包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，且該第二VL包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，其中該第二VH包含SEQ ID NO：18之VH胺基酸序列的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之胺基酸序列，且該第二VL包含SEQ ID NO：19之VL胺基酸序列的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項之多特異性抗體，其中：(a)該第一抗原結合區之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52之胺基酸序列；且(b)該第二抗原結合區之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別包含SEQ ID NO：7、10、3、14、5及16之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項之多特異性抗體，其中該第一抗原結合區包含VH和VL，其中該VH包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項之多特異性抗體，其中該第二抗原結合區包含VH和VL，其中該VH包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。
如申請專利範圍第4項之多特異性抗體，其中該第一抗原結合區包含VH和VL，其中該VH包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項之多特異性抗體，其中該第一抗原結合區及/或該第二抗原結合區包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區係選自由人類κ輕鏈恆定區和人類λ輕鏈恆定區組成之群。
如申請專利範圍第1項之多特異性抗體，其中該第一抗原結合區及/或該第二抗原結合區包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區係選自由人類IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂組成之群。
如申請專利範圍第7項之多特異性抗體，其中該重鏈恆定區係人類IgG₁重鏈恆定區。
如申請專利範圍第1項之多特異性抗體，其中該第二抗原結合區包含輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列；且，該第一抗原結合區包含輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列。
如申請專利範圍第5項之多特異性抗體，其中該第二抗原結合區包含重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；且，該第一抗原結合區包含重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之多特異性抗體，其中該多特異性抗體為κ-λ體、雙親和重靶向分子(DART)、杵入臼型抗體或股交換工程改造結構域體(SEED體)。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之多特異性抗體，其中引入T366W突變至該多特異性抗體之一重鏈的胺基酸序列且引入T366S、L368A及Y407V突變至該多特異性抗體之另一重鏈的胺基酸序列，其中該等胺基酸位置係根據EU編號系統編號。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之多特異性抗體，其中該多特異性抗體包含於一重鏈之S239D/A330L/I332E突變，其中該等胺基酸位置係根據EU編號系統編號。
一種組合物，該組合物包含(i)編碼如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之多特異性抗體之第一抗原結合區之輕鏈可變區(VL)或輕鏈之核酸分子；(ii)編碼如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之多特異性抗體之第一抗原結合區之重鏈可變區(VH)或重鏈之核酸分子；(iii)編碼如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之多特異性抗體之第二抗原結合區之VL或輕鏈之核酸分子；及(iv)編碼如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之多特異性抗體之第二抗原結合區之VH或重鏈之核酸分子。
一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之多特異性抗體及醫藥學上可接受之賦形劑。
一種如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之多特異性抗體或如申請專利範圍第15項之醫藥組合物於製備藥物之用途，該藥物係用於治療個體之癌症。
如申請專利範圍第16項之用途，其中該癌症係選自由黑素瘤、腎癌、前列腺癌、結腸癌及肺癌組成之群。
一種如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之多特異性抗體或如申請專利範圍第15項之醫藥組合物於製備藥物之用途，該藥物係用於治療個體之感染性疾病。