KR20230127306A - NKp46 및 CD123에 결합하는 다기능성 자연살해(NK)세포 관여자 - Google Patents
NKp46 및 CD123에 결합하는 다기능성 자연살해(NK)세포 관여자 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 다기능성 결합 단백질에 관한 것이되, 제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고, 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하며, 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 특이적으로 결합한다. 본 개시내용은 또한 상기 결합 단백질의 제조 방법, 이의 조성물, 및 급성 골수성 백혈병(AML) 및 골수 이형성 증후군(MDS)을 포함하는 증식성 장애의 치료 또는 예방을 비롯한 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
본 개시내용은 제1 및 제2 항원 결합 도메인(antigen binding domain: ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 다작용성 결합 단백질에 관한 것이되, 제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고, 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하며, 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 특이적으로 결합한다.
본 개시내용은 또한 상기 결합 단백질의 제조 방법, 이의 조성물, 및 급성 골수성 백혈병(AML) 및 골수 이형성 증후군(MDS)을 포함하는, 증식성 장애의 치료 또는 예방을 비롯한 이들의 용도에 관한 것이다.
급성 골수성 백혈병(AML) 및 골수 이형성 증후군(MDS)은 백혈병 줄기 세포의 하위집단으로부터 생기는 것으로 여겨지고, 통상적인 화학요법에 내성이 있는 경향이 있고, 추가로 질환 재발을 초래할 수 있는 이질적 클론 신생물 질환이다.
자연살해(NK) 세포는 비통상적인 면역에 관련된 림프구의 하위집단이다. NK 세포는 원치 않는 세포, 예컨대, 종양- 또는 바이러스-감염 세포가 제거될 수 있는 효율적인 면역감시 메커니즘을 제공한다. NK 세포의 특징적 및 생물학적 특성은 CD16, CD56 및/또는 CD57을 포함하는 표면 항원의 발현, 세포 표면 상의 α/β 또는 γ/δ TCR 복합체의 부재, MHC-비제한적 방식으로 세포, 특히 특정 세포용해효소의 활성화에 의해 "자기(self)" MHC/HLA 항원을 발현시키지 못하는 세포에 결합하고 사멸시키는 능력, NK 활성화 수용체에 대해 리간드를 발현시키는 종양 세포 또는 다른 질환 세포를 사멸시키는 능력, 및 면역 반응을 자극하는 사이토카인으로 불리는 단백질 분자를 방출하는 능력을 포함한다.
또한 이들의 잠재적인 항-종양 특성으로 인해 자연살해(NK) 세포에 관심이 집중되었다.
여전히 급성 골수성 백혈병(AML) 및 골수 이형성 증후군(MDS)과 같은 증식성 장애를 치료 또는 예방하기 위한 활성제에 대한 긴급한 요구가 있다.
또한 치료 효과를 갖는 신규한 NK 관여자에 대한 요구가 있다.
또한 부작용이 없거나 감소되면서, 제조 및/투여가 더 용이한 신규한 화합물에 대한 요구가 있다. 특히, 환자에서 사이토카인 방출 증후군의 위험이 없거나 감소된(예를 들어, IL-6 관련 사이토카인 방출이 없거나 감소된) 신규한 화합물에 대한 요구가 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL
을 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 아래에 규정된 바와 같은, 2개의 ABD를 형성하는 3개의 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 포함하고:
여기서,
V1A 및 V1B는 결합쌍 V1(VH1/VL1)을 형성하고;
V2A 및 V2B는 결합쌍 V2(VH2/VL2)를 형성하며;
C1A 및 C1B는 C1(CH1/CL)쌍을 형성하고, C2A 및 C2B는 C2(CH1/CL) 쌍을 형성하되, CH1은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1이고, CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
힌지1, 힌지2 및 힌지3은 동일 또는 상이하고, 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역에 상응하고;
(CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 동일 또는 상이하고, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하며;
L1은 아미노산 링커이다.
특정 실시형태에서, C1B는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1)이고; C2A는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1)이며; CL은 면역글로불린 카파 경쇄 불변 도메인(Cκ)에 상응하고; (CH2-CH3)A는 서열번호 69의 아미노산 서열에 상응하며; (CH2-CH3)B는 서열번호 70의 아미노산 서열에 상응하고; 힌지1은 서열번호 74의 아미노산 서열에 상응하며; 힌지2는 서열번호 75의 아미노산 서열에 상응하고; 힌지3은 서열번호 77의 아미노산 서열에 상응하며; L1은 서열번호 76의 아미노산 서열에 상응한다.
특정 실시형태에서, EU 넘버링에 따른 Fc 영역 또는 이의 변이체의 잔기 N297은 N-연결 글리코실화를 포함한다.
특정 실시형태에서, 모든 또는 일부의 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 CD16A(FcγRIII) 폴리펩타이드에 결합한다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 적어도 1개의 디설파이드 브리지에 의해 연결된 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄 (I) 및 (II)는 C1A와 힌지2 사이에 적어도 1개의 디설파이드 브리지에 의해 연결되고/되거나 폴리펩타이드 쇄 (II) 및 (III)은 힌지3과 C2B 사이에 적어도 1개의 디설파이드 브리지에 의해 연결된다.
특정 실시형태에서, V1A는 VL1이고, V1B는 VH1이다. 특정 실시형태에서, V2A는 VH2이고, V2B는 VL2이다.
특정 실시형태에서, (a) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; (b) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; VL2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; (c) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; (d) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; (e) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; (f) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; (g) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; (h) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; (i) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; 또는 (j) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
특정 실시형태에서, (a) VH1 및 VL1은 각각 서열번호 41 및 43의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 42 및 44의 아미노산 서열에 상응하고;
그리고/또는 (b) VH2 및 VL2는 각각 서열번호 45 및 53의 아미노산 서열; 각각 서열번호 46 및 54의 아미노산 서열; 각각 서열번호 47 및 55의 아미노산 서열; 각각 서열번호 48 및 56의 아미노산 서열; 각각 서열번호 49 및 57의 아미노산 서열; 각각 서열번호 50 및 58의 아미노산 서열; 각각 서열번호 51 및 59의 아미노산 서열; 또는 각각 서열번호 52 및 60의 아미노산 서열에 상응한다.
특정 실시형태에서,
(a)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하며;
(b)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하며;
(c)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하며;
(d)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며;
(e)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하며;
(f)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하며;
(g)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하며;
(h)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하며;
(i)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하며;
(j)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하며;
(k)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하며;
(l)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며;
(m)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하며;
(n)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하며;
(o)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하며;
(p)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 (I)은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고; 폴리펩타이드 (II)는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하며; 폴리펩타이드 (III)은 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 (I)은 서열번호 64의 아미노산 서열로 이루어지고; 폴리펩타이드 (II)는 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어지며; 폴리펩타이드 (III)은 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 정의된 결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 정의된 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 정의된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 정의된 핵산 분자를 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 정의된 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은, (a) 위에 정의된 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; (b) 결합 단백질을 발현시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양시키는 단계; 및 (c) 선택적으로 발현된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 위에 정의된 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 정의된 바와 같은 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이고, 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하되, 상기 ABD의 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하며;
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 정의한 바와 같은 결합 단백질의 더 많은 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은,
(a) 복수의 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (ii) 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (iii) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 단계;
(b)
선택적으로 발현된 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 혈액암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 위에 정의된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 골수 이형성 증후군(MDS) 또는 림프구 증식 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 위에 정의된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 급성 골수성 백혈병(AML)을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 위에 정의된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 CD64-양성 및 CD64-음성 급성 골수성 백혈병(AML)을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 위에 정의된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 CD64-양성 급성 골수성 백혈병(AML)을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고, 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하며, 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용의 결합 단백질은 표준 용법 및 관례에 따라, 좌측의 아미노 말단 방향("N-말단 단부" 또는 "N-말단") 및 우측의 카복실-말단 방향("C-말단 단부" 또는 "C-말단")으로 배향된다.
도 1. 1개의 인간 NKp46 결합 부위 및 1개의 인간 CD123 결합 부위를 포함하는 이중특이성 F5 형식의 변이체인 F25 형식의 3차원 개략도. 도 1에서, 폴리펩타이드의 C-말단은 좌측에 있고, N-말단은 우측에 있다.
도 2a 내지 도 2d는 각각의 폴리펩타이드 쇄에 대해 관련 도메인을 포함하는 각각 F25, F5, F26 및 F6 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. 도 2a 내지 도 2d에서, 폴리펩타이드의 C-말단은 좌측에 있고, N-말단은 우측에 있다. 인간 NKp46 결합 도메인은 좌측 상에서 VH/VL 쌍에 의해 형성된다. 인간 CD123 결합 도메인은 우측 상에서 VH/VL 쌍에 의해 형성된다.
도 2a는 F25 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. 이 표현은 특허청구된 "NKp46-CD123_F25" 결합 단백질을 나타낸다.
도 2b는 F5 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. F25와 비교할 때, F5는 NKp46 결합 도메인의 CL 및 CH 쌍이 교환되고, 제3 폴리펩타이드 쇄가 CH1 도메인 및 VL 도메인을 포함한다는 점에서 다르다.
도 2c는 F26 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. 이 F26은 각각의 CH2 도메인 상의 Fc-침묵 N297S 돌연변이를 포함한다는 점에서 도 2a의 F25와 다르다.
도 2d는 F6 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. 이 F6은 각각의 CH2 도메인 상의 Fc-침묵 N297S 돌연변이를 포함한다는 점에서 도 2b의 F5와 다르다.
도 2e는 F25 형식의 변이체의 2차원의 상세한 표현을 나타낸다. 이런 F25 형식 표현은 도 2a의 표현에 상응한다.
도 3은 CD123을 발현시키는 종양 세포(즉, AML 세포주; 즉, MOLM-13) 및 NKp46 및 Fcγ 수용체(CD16a)를 발현시키는 NK 세포의 결합 후, 사멸을 위한 NK 세포 관여자(NKCE)의 제안된 작용 메커니즘을 나타낸다. Gauthier, L. 등("Multifunctional natural killer cell engagers targeting NKp46 trigger protective tumor immunity". Cell 177, 1701-1713 (2019))으로부터 재현 및 적합화된다.
도 4a 내지 도 4b는 각각 AML 세포주(MOLM-13) 또는 1차 AML 아세포에 대해 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 시험관내 세포독성을 보고한다. 도 4a는 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 시험관내 세포독성 및 AML 세포주(MOLM-13)에 대한 형식 F25 결합 NKp46 단독(NKp46-IC_F25)의 음성 아이소타입 대조군 변이체를 나타낸다. 도 4b는 NKp46에 대해 특이성을 갖지 않는 NKp46-CD123_F25, NKp46-IC_F25, 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1) 및 증가된 ADCC 활성을 갖고 NKp46에 대해서도 CD123에 대해서도 선택성을 갖지 않는 음성 아이소타입 대조군 Fc-최적화 항체(IC-hIgG1-ADCC-enh)의 세포독성을 1차 AML 아세포에 대해 평가한 생체외 환자 샘플과 동일한 실험을 재현한다.
도 5는 NKp46과 CD16a 둘 다에 관여함으로써 인간 NK 세포를 활성화시킬 수 있고 Fc 적격 형식(F25)을 갖는 ADCC 활성을 유도하는 NKp46-CD123_F25 결합 단백질, 및 NKp46에만 관여하고 CD16a에는 관여하지 않음으로써 인간 NK 세포를 활성화시키고 Fc 침묵 형식(F6)을 갖는 감소된 ADCC-활성을 유도하는 NKp46-CD123_F6 결합 단백질의 MOLM-13 AML 세포주(EC50 데이터)에 대해 신선한 건강한 공여자 NK 세포를 이용하는 시험관내 세포독성 데이터를 제공한다.
도 6a 내지 도 6b 상부 패널은 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질, NKp46에 대해 결합을 갖지 않는 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1) 및 상이한 AML 세포주에 대해 NKp46에 대해서도 CD123에 대해서도 특이성을 갖지 않는 증가된 ADCC 활성을 갖는 음성 아이소타입 대조군 Fc-최적화 항체(IC_hIgG1-ADCC-enh)의 시험관내 세포독성을 보고한다. 시험한 AML 세포주는: CD64(+) 및 CD32(+)를 발현시키는 세포주인 THP-1(도 6a); CD64(-)를 발현시키지 않지만 CD32(+)를 발현시키는 세포주인 MOLM-13(도 6a), CD32(+)를 발현시키기 위한 CD64(-)에 대한 넉아웃 세포주인 THP-1 CD64KO(도 6b); 및 CD64(+)를 발현시키고 CD32(-)에 대한 넉아웃 세포주인 THP-1 CD32KO(도 6b)이다. 도 6a 및 도 6b 하부 패널은 악성 AML 세포주 및 서브 클론의 표현형 및 세포 분석기 분석에 의한 CD123, CD64, CD32a/b의 발현을 보고한다. 마우스-IgG2a(IC_마우스 IgG2a) 및 마우스-IgG1(IC_마우스 IgG1) 아이소타입 대조군에 의한 AML 세포의 배경 염색을 또한 나타낸다.
도 7a 내지 도 7b는 두 상이한 공여자로부터의 1차 AML 아세포에 대해 CD107a-양성 NK 세포 백분율을 통해 측정된 NK 탈과립의 생체외 유도를 보고한다. 공여자 #1로부터의 1차 AML 아세포는 CD64(+)이고(도 7a) 공여자 #2로부터의 1차 AML 아세포는 CD64(-)이다(도 7b). 시험한 결합 단백질은 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질, NKp46에 대해 특이성을 갖지 않는 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1), CD123에 결합하지 않지만 NKp46 및 CD16a에 결합하는 F25의 음성 아이소타입 대조군 변이체(NKp46-IC_F25) 및 NKp46에 대해서도 CD123에 대해서도 특이성을 갖지 않는 증가된 ADCC 활성을 갖는 음성 아이소타입 대조군 Fc-최적화 항체(IC_hIgG1-ADCC-enh)이다.
도 8은 중증 복합 면역결핍 마우스(SCID) 마우스 모델에서 MOLM-13 인간 세포에 대해 muNKp46-huCD123_F25 결합 단백질(항-뮤린NKp46 및 항-인간CD123 결합 도메인을 지니고 moNKp46-huCD123으로도 알려짐)에 대해 용량-의존적 항-종양 활성을 보고한다.
도 9a 내지 도 9c는 3000 ㎍/㎏ 또는 3 ㎎/㎏에서(도 9a), 3 ㎍/㎏에서(도 9b), 그리고 0.5 ㎍/㎏에서(도 9c) 비인간 영장류(M1, M2, M3, M4 및 M6)에서 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 투여 후 최대 28일 동안 CD123-양성 호염기구 고갈을 보고한다.
도 10a 내지 도 10b는 NK 세포 건강한 공여자 샘플(D648)의 존재 하에 2종의 AML 세포주, 즉, MOLM-13(도 10a) 및 THP-1(도 10b)에 대해 본 개시내용의 2종의 NKp46-CD123 NKCE Fc-적격 결합 단백질(본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 및 NKp46-CD123_F5) 및 CD123 및 CD16a에 결합하지만 NKp46에는 결합하지 않는 형식 F5(CD123-IC_F5)의 대조군 변이체의 시험관내 세포독성을 보고한다.
도 11 좌측 패널은 NKp46-CD123_F25(CD123-NKCE; 용량 범위 0.001 내지 10 ㎍/㎖), NKCE 아이소타입 대조군 NKp46-IC_F25(IC-NKCE; CD123에 결합하지 않지만 NKp46 및 CD16a에 결합함)(용량 범위 0.001 내지 10 ㎍/㎖), 또는 CD3-CD123 이중특이성 T-세포 관여자(CD123-TCE 도구(tool); 0.001 내지 0.1 ㎍/㎖)에 의한 처리에 의해 시험관내에서 유도된 건강한 공여자 PBMC(N=10)에서의 CD123-양성 호염기구 고갈을 보고한다. 중앙 패널은 시험한 가장 고용량(10 ㎍/㎖, 68 nM)에서의 NKp46-CD123_F25 최대 고갈 활성을 보고한다. 우측 패널은 6명의 건강한 공여자의 PBMC에 대해 NKp46-CD123_F25 용량 반응으로부터 계산된 CD123-양성 호염기구 고갈에 대한 EC50(pM)을 보고한다.
도 12는 0.1, 1 및 10 ㎍/㎖의 용량에서 NKp46-CD123_F25, NKCE 아이소타입 대조군 NKp46-IC_F25(CD123에 결합하지 않지만 NKp46 및 CD16a에 결합함) 또는 0.1 ㎍/㎖ 용량에서 CD123 및 CD3 결합 부위를 공동 표적화하는 이중특이성 T 세포 관여자 도구(TCE 도구)에 의한 처리 후 건강한 공여자 PBMC(N=10)에 의한 시험관내 IL-1β, TNF-α, IFN-γ(그래프 상에서 INFg로 기재됨) 및 IL-6 사이토카인 방출을 나타낸다.
도 13a 내지 도 13f는 6마리의 수컷 사이노몰거스 원숭이(M1 내지 M6)에 대해 3000 ㎍/㎏(도 13a 및 도 13b), 3 ㎍/㎏(도 13c 및 도 13d), 0.5 ㎍/㎏(도 13E) 및 0.5 ㎍/㎏ 미만(도 13f)의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질 농도와 상관관계가 있는 시간 프로파일에 대한 개개 IL-6 및 IL-10 혈장 농도를 나타낸다.
도 14a는 NKp46에 대해 특이성을 갖지 않는 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1) 및 CD64를 발현시키는 환자로부터의 AML 아세포(#AML5, #AML6) 또는 CD64를 발현시키지 않는 환자로부터의 AML 아세포(#AML1, #AML2)에 대해 NKp46에 대해서도 또는 CD123에 대해서도 특이성을 갖지 않고 증가된 ADCC 활성을 갖는 음성 아이소타입 대조군 Fc-최적화 항체(IC-hIgG1-ADCC-enh)와 비교되는 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 세포독성을 나타낸다. AML 환자로부터의 악성 세포를 표적으로서 사용하였고, 정제된 건강한 공여자 NK 세포를 효과기로서 사용하였다. 시험한 모든 건강한 공여자 NK 세포에 대해 결과를 나타낸다.
도 14b는 유세포 분석기 분석에 의한 CD33, CD123, CD32a/b 및 CD64의 발현을 나타내는 도 14a에서 사용되는 환자로부터의 악성 AML 세포의 표현형을 보고한다.
도 15a는 CD16a 단독(IC-CD123_F25) 또는 NKp46 단독(NKp46-CD123_F6) 또는 공동 관여하는 NKp46+CD16(NKp46-CD123_F25)에 의해 종양 세포 상의 CD123을 표적화하고 NK 세포(IC-CD123_F6)에 관여하지 않거나 또는 NK 세포를 관여하는 NKCE의 세포독성 비교이다. MOLM-13 세포를 표적 세포로서 사용하였고, 휴지 중인 건강한 공여자 NK 세포를 효과기로서 정제하였다. 2명의 NK 공여자를 나타낸다.
도 15b는 AML 세포주 MOLM-13에 대해 CD123(NKp46-IC_F25)에 결합하지 않는 음성 아이소타입 대조군 NKCE 분자와 비교되는 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 세포독성을 보고한다. 5명의 건강한 NK-세포 공여자에 대한 결과를 나타낸다.
도 16a는 AML 환자(AML #8 내지 #10)로부터의 NK 및 악성 세포의 유세포분석이다. 상단 패널은 AML 아세포 상의 CD123(CD33-양성 집단에 개폐)을 나타내고; 중간 패널은 CD123-양성 AML 아세포 상의 CD64(검정색의 CD64 염색 및 회색의 아이소타입 대조군)의 발현을 나타내며; 하단 패널은 NK AML 샘플 NK 세포 상에서의 NKp46 및 CD16a의 발현을 나타낸다.
도 16b는 아세포 세포 표면에서 CD64를 발현시키는 AML 환자 샘플(AML #8 및 #9) 및 CD64를 발현시키지 않는 AML 환자 샘플(AML #10)로부터의 PBMC 상의 NKp46-CD123_F25(CD123-NKCE), NKp46에 대해 특이성을 갖지 않는 항-CD123 ADCC-향상 항체(그래프에서 참조-1 또는 CD123-IgG1+), CD123에 결합하지 않지만 NKp46 및 CD16a(600 및 120 ng/㎖)에 결합하는 대조군 아이소타입 NKp46-IC_F25(IC-NKCE) 및 IgG1 아이소타입 대조군(600 ng/㎖)(IC-IgG1+)으로 밤새 처리 후 NK 세포에 의한 CD107a/b 발현의 분석이다.
도 17은 MOLM-13 세포와 함께 공동 배양시킨 NK 세포 또는 공동배양시키지 않은 MOLM-13 세포(NK + MOLM-13 대 NK 단독)를 이용한 실험 설정에서 하나의 관여 NKp46 및 CD16 단독(NKp46-IC_F25)을 포함하는 대조군에 비해 증가된 농도의 NKp46-CD123_F25로 처리된 NK 세포에 의한 마커 발현(CD107, CD69, TNF-α, IFN-γ 및 MIP-1β) 발현 백분율을 나타낸다. 3명의 NK 세포 공여자에 대한 결과를 나타낸다.
도 18은 SCID 마우스에서 파종성 인간 AML인 MOLM-13에 대해 대리(surrogate) muNKp46-huCD123_F25 이중특이성 항체(moNKp46-huCD123으로도 알려짐)의 활성을 나타낸다. MOLM-13 세포를 단일 투여에서 제0일에 정맥내로 주사하였다. 종양 이식 후 제1일에 복강내 경로에 의해 처리를 투여하였다. muNKp46 및 뮤린 FcγR에는 결합하지만 huCD123에는 결합하지 않는 아이소타입 대조군 항체(muNKp46-IC)를 0.5 ㎎/㎏. muNKp46-huCD123_F25로 투여하였고, 참조-1을 5, 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏으로 투여하였다. 대조군을 비처리로 두었다. 그래프는 5, 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏의 muNKp46-huCD123_F25 이중특이성 항체, 참조-1 및 대조군으로 처리한 동물에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 나타낸다. ***: 대조군에 대해 p<0.001; **: 대조군에 대해 p<0.01; *: 대조군에 대해 p<0.05; ###: 참조-1에 대해 p<0.001; #: 참조-1에 대해 p<0.05. n = 5 내지 10마리 마우스/그룹.
도 19는 파종성 인간 MOLM-13 종양 세포를 보유하는 SCID 마우스에서 대리 muNKp46-huCD123_F25 이중특이성 항체의 생체내 효능에 대한 NK 고갈의 영향을 평가한다. NK 고갈은 종양 세포 이식 1일 전 및 이식 5일 후에 항-아시알로 GM1 혈청의 2회의 복강내 투여에 의해 유도되었다. MOLM-13 세포를 단일 투여에서 제0일에 정맥내로 주사하였다. 종양 이식 후 제1일에 복강내로 처리를 투여하였다. muNKp46 및 뮤린 FcγR에는 결합하지만 huCD123에는 결합하지 않는 아이소타입 대조군 항체(muNKp46-IC) 및 huCD123 및 뮤린 FcγR에 결합하지만 뮤린 NKp46에는 결합하지 않는 제2 아이소타입 대조군 항체(IC-huCD123)를 포함하는 대조군을 또한 평가하였다. 그래프는 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏의 muNKp46-huCD123_F25 이중특이성 항체 및 대조군(muNKp46-IC, IC-huCD123)으로 처리한 동물에 대한 카플란-마이어 곡선을 나타낸다. n = 10마리 마우스/그룹. ***: 대조군에 대해 p<0.001; **: 대조군에 대해 p<0.01; ###: 동일한 처리 + NK 고갈에 대해 p<0.001; #: 동일한 처리 + NK 고갈에 대해 p<0.05.
도 20a는 단일 1-시간 정맥내 주입으로서 저용량의 3 ㎍/㎏으로 처리한 원숭이 M3 및 M4의 혈액으로부터의 CD123-양성 호염기구 고갈을 도시한다. 투약 전(용량 전) 및 주입 시작 후 24시간에 혈액 샘플을 수집하고, 유세포 분석기로 분석하였다. CD123-양성 호염기구를 게이트에 나타낸다.
도 20b는 단일 1-시간 정맥내 주입으로서 3 ㎎/㎏으로 처리된 원숭이 M1(오렌지) 및 M2(보라색), 및 단일 1-시간 정맥내 주입으로서 3 ㎍/㎏으로 처리한 원숭이 M3(적색) 및 M4(청색)의 연구 시 순환 CD123-양성 호염기구(속이 빈 기호) 및 총 CD123-양성 백혈구(속이 찬 기호)의 수를 나타낸다.
도 20c는 각각 단일 1-시간 정맥내 주입으로서 고용량 및 저용량의 3 ㎎/㎏ 및 3 ㎍/㎏으로 처리한 사이노몰거스 원숭이에서의 사이토카인 생성을 보고한다. 투약 전(0), 및 처리 시작 후 1.5, 5 및 24시간의 혈장 IL-6 및 IL-10 농도를 나타낸다.
도 20d는 고용량 및 저용량의 3 ㎎/㎏ 및 3 ㎍/㎏으로 처리한 사이노몰거스 원숭이의 1시간 주입 시작 후 1.5, 5, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 504 및 672시간(즉, 0.04, 0.06, 0.21, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21 및 28일)에 모니터링한 혈장 NKp46-CD123_F25(CD123-NKCE) 농도를 보고한다. 정량하한(LLOQ; 0.25 ng/㎖)은 수평 점선으로 나타낸다.
도 21a는 4주(제1일, 제8일, 제15일 및 제22일) 동안 3 ㎎/㎏/투여의 용량으로 매주 처리한 수컷 원숭이 M5에서 NKp46-CD123_F25(CD123-NKCE) 분자의 독성동태학(TK)을 나타낸다. 혈장 CD123-NKCE 농도를, 투약 전(용량 전) 및 제1일, 제8일, 제15일에 1시간 주입의 시작 후 1, 1.5, 5, 24 및/또는 72시간 및 투약 전 및 제22일에 마지막 네 번째 1시간 주입의 시작 후 1, 1.5, 5, 24 및 168시간에 결정하였다. 정량하한(LLOQ: 0.25 ng/㎖) 미만의 값을 그래프에 보고하지 않는다. 주입일을 수직 점선으로 나타낸다.
도 21b는 4주 동안 고용량의 3 ㎎/㎏/투여로 매주 처리한 원숭이 M5에서의 인터류킨-6 생성의 분석이다. 혈장 IL-6 농도를, 투약 전 및 제1일, 제8일, 제15일에 1시간 주입의 시작 후 1, 1.5, 5 및 24시간 및 투약 전 및 제22일에 마지막 네 번째 1시간 주입의 시작 후 1, 1.5, 5, 24 및 168시간에 모니터링하였다.
도 21c는 3 ㎎/㎏/주 용량으로 처리한 원숭이 M5에 대해 연구 시점에 따른 혈액(좌측 패널) 또는 골수(우측 패널)에서의 순환 CD123-양성 호염기구(속이 빈 기호) 및 총 CD123-양성 백혈구(속이 찬 기호)의 수를 정량화한다.
도 22는 2명의 건강한 공여자(HD)로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용한 분석에서의 THP1 세포독성 활성을 그래프로 도시한다. NK 세포 및 THP1 GFP 표적 세포를 CD123에 관여하고 감소된 ADCC-활성을 유도하는 NKp46-CD123_F25 또는 이의 아이소타입 대조군 IC-CD123_F6의 존재 하에서 이의 0.1, 1, 10 및 100 ng/㎖의 Fc 침묵 형식(F6)과 함께 인큐베이션시켰다.
도 1. 1개의 인간 NKp46 결합 부위 및 1개의 인간 CD123 결합 부위를 포함하는 이중특이성 F5 형식의 변이체인 F25 형식의 3차원 개략도. 도 1에서, 폴리펩타이드의 C-말단은 좌측에 있고, N-말단은 우측에 있다.
도 2a 내지 도 2d는 각각의 폴리펩타이드 쇄에 대해 관련 도메인을 포함하는 각각 F25, F5, F26 및 F6 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. 도 2a 내지 도 2d에서, 폴리펩타이드의 C-말단은 좌측에 있고, N-말단은 우측에 있다. 인간 NKp46 결합 도메인은 좌측 상에서 VH/VL 쌍에 의해 형성된다. 인간 CD123 결합 도메인은 우측 상에서 VH/VL 쌍에 의해 형성된다.
도 2a는 F25 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. 이 표현은 특허청구된 "NKp46-CD123_F25" 결합 단백질을 나타낸다.
도 2b는 F5 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. F25와 비교할 때, F5는 NKp46 결합 도메인의 CL 및 CH 쌍이 교환되고, 제3 폴리펩타이드 쇄가 CH1 도메인 및 VL 도메인을 포함한다는 점에서 다르다.
도 2c는 F26 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. 이 F26은 각각의 CH2 도메인 상의 Fc-침묵 N297S 돌연변이를 포함한다는 점에서 도 2a의 F25와 다르다.
도 2d는 F6 형식의 2차원 개략적 표현을 나타낸다. 이 F6은 각각의 CH2 도메인 상의 Fc-침묵 N297S 돌연변이를 포함한다는 점에서 도 2b의 F5와 다르다.
도 2e는 F25 형식의 변이체의 2차원의 상세한 표현을 나타낸다. 이런 F25 형식 표현은 도 2a의 표현에 상응한다.
도 3은 CD123을 발현시키는 종양 세포(즉, AML 세포주; 즉, MOLM-13) 및 NKp46 및 Fcγ 수용체(CD16a)를 발현시키는 NK 세포의 결합 후, 사멸을 위한 NK 세포 관여자(NKCE)의 제안된 작용 메커니즘을 나타낸다. Gauthier, L. 등("Multifunctional natural killer cell engagers targeting NKp46 trigger protective tumor immunity". Cell 177, 1701-1713 (2019))으로부터 재현 및 적합화된다.
도 4a 내지 도 4b는 각각 AML 세포주(MOLM-13) 또는 1차 AML 아세포에 대해 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 시험관내 세포독성을 보고한다. 도 4a는 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 시험관내 세포독성 및 AML 세포주(MOLM-13)에 대한 형식 F25 결합 NKp46 단독(NKp46-IC_F25)의 음성 아이소타입 대조군 변이체를 나타낸다. 도 4b는 NKp46에 대해 특이성을 갖지 않는 NKp46-CD123_F25, NKp46-IC_F25, 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1) 및 증가된 ADCC 활성을 갖고 NKp46에 대해서도 CD123에 대해서도 선택성을 갖지 않는 음성 아이소타입 대조군 Fc-최적화 항체(IC-hIgG1-ADCC-enh)의 세포독성을 1차 AML 아세포에 대해 평가한 생체외 환자 샘플과 동일한 실험을 재현한다.
도 5는 NKp46과 CD16a 둘 다에 관여함으로써 인간 NK 세포를 활성화시킬 수 있고 Fc 적격 형식(F25)을 갖는 ADCC 활성을 유도하는 NKp46-CD123_F25 결합 단백질, 및 NKp46에만 관여하고 CD16a에는 관여하지 않음으로써 인간 NK 세포를 활성화시키고 Fc 침묵 형식(F6)을 갖는 감소된 ADCC-활성을 유도하는 NKp46-CD123_F6 결합 단백질의 MOLM-13 AML 세포주(EC50 데이터)에 대해 신선한 건강한 공여자 NK 세포를 이용하는 시험관내 세포독성 데이터를 제공한다.
도 6a 내지 도 6b 상부 패널은 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질, NKp46에 대해 결합을 갖지 않는 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1) 및 상이한 AML 세포주에 대해 NKp46에 대해서도 CD123에 대해서도 특이성을 갖지 않는 증가된 ADCC 활성을 갖는 음성 아이소타입 대조군 Fc-최적화 항체(IC_hIgG1-ADCC-enh)의 시험관내 세포독성을 보고한다. 시험한 AML 세포주는: CD64(+) 및 CD32(+)를 발현시키는 세포주인 THP-1(도 6a); CD64(-)를 발현시키지 않지만 CD32(+)를 발현시키는 세포주인 MOLM-13(도 6a), CD32(+)를 발현시키기 위한 CD64(-)에 대한 넉아웃 세포주인 THP-1 CD64KO(도 6b); 및 CD64(+)를 발현시키고 CD32(-)에 대한 넉아웃 세포주인 THP-1 CD32KO(도 6b)이다. 도 6a 및 도 6b 하부 패널은 악성 AML 세포주 및 서브 클론의 표현형 및 세포 분석기 분석에 의한 CD123, CD64, CD32a/b의 발현을 보고한다. 마우스-IgG2a(IC_마우스 IgG2a) 및 마우스-IgG1(IC_마우스 IgG1) 아이소타입 대조군에 의한 AML 세포의 배경 염색을 또한 나타낸다.
도 7a 내지 도 7b는 두 상이한 공여자로부터의 1차 AML 아세포에 대해 CD107a-양성 NK 세포 백분율을 통해 측정된 NK 탈과립의 생체외 유도를 보고한다. 공여자 #1로부터의 1차 AML 아세포는 CD64(+)이고(도 7a) 공여자 #2로부터의 1차 AML 아세포는 CD64(-)이다(도 7b). 시험한 결합 단백질은 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질, NKp46에 대해 특이성을 갖지 않는 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1), CD123에 결합하지 않지만 NKp46 및 CD16a에 결합하는 F25의 음성 아이소타입 대조군 변이체(NKp46-IC_F25) 및 NKp46에 대해서도 CD123에 대해서도 특이성을 갖지 않는 증가된 ADCC 활성을 갖는 음성 아이소타입 대조군 Fc-최적화 항체(IC_hIgG1-ADCC-enh)이다.
도 8은 중증 복합 면역결핍 마우스(SCID) 마우스 모델에서 MOLM-13 인간 세포에 대해 muNKp46-huCD123_F25 결합 단백질(항-뮤린NKp46 및 항-인간CD123 결합 도메인을 지니고 moNKp46-huCD123으로도 알려짐)에 대해 용량-의존적 항-종양 활성을 보고한다.
도 9a 내지 도 9c는 3000 ㎍/㎏ 또는 3 ㎎/㎏에서(도 9a), 3 ㎍/㎏에서(도 9b), 그리고 0.5 ㎍/㎏에서(도 9c) 비인간 영장류(M1, M2, M3, M4 및 M6)에서 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 투여 후 최대 28일 동안 CD123-양성 호염기구 고갈을 보고한다.
도 10a 내지 도 10b는 NK 세포 건강한 공여자 샘플(D648)의 존재 하에 2종의 AML 세포주, 즉, MOLM-13(도 10a) 및 THP-1(도 10b)에 대해 본 개시내용의 2종의 NKp46-CD123 NKCE Fc-적격 결합 단백질(본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 및 NKp46-CD123_F5) 및 CD123 및 CD16a에 결합하지만 NKp46에는 결합하지 않는 형식 F5(CD123-IC_F5)의 대조군 변이체의 시험관내 세포독성을 보고한다.
도 11 좌측 패널은 NKp46-CD123_F25(CD123-NKCE; 용량 범위 0.001 내지 10 ㎍/㎖), NKCE 아이소타입 대조군 NKp46-IC_F25(IC-NKCE; CD123에 결합하지 않지만 NKp46 및 CD16a에 결합함)(용량 범위 0.001 내지 10 ㎍/㎖), 또는 CD3-CD123 이중특이성 T-세포 관여자(CD123-TCE 도구(tool); 0.001 내지 0.1 ㎍/㎖)에 의한 처리에 의해 시험관내에서 유도된 건강한 공여자 PBMC(N=10)에서의 CD123-양성 호염기구 고갈을 보고한다. 중앙 패널은 시험한 가장 고용량(10 ㎍/㎖, 68 nM)에서의 NKp46-CD123_F25 최대 고갈 활성을 보고한다. 우측 패널은 6명의 건강한 공여자의 PBMC에 대해 NKp46-CD123_F25 용량 반응으로부터 계산된 CD123-양성 호염기구 고갈에 대한 EC50(pM)을 보고한다.
도 12는 0.1, 1 및 10 ㎍/㎖의 용량에서 NKp46-CD123_F25, NKCE 아이소타입 대조군 NKp46-IC_F25(CD123에 결합하지 않지만 NKp46 및 CD16a에 결합함) 또는 0.1 ㎍/㎖ 용량에서 CD123 및 CD3 결합 부위를 공동 표적화하는 이중특이성 T 세포 관여자 도구(TCE 도구)에 의한 처리 후 건강한 공여자 PBMC(N=10)에 의한 시험관내 IL-1β, TNF-α, IFN-γ(그래프 상에서 INFg로 기재됨) 및 IL-6 사이토카인 방출을 나타낸다.
도 13a 내지 도 13f는 6마리의 수컷 사이노몰거스 원숭이(M1 내지 M6)에 대해 3000 ㎍/㎏(도 13a 및 도 13b), 3 ㎍/㎏(도 13c 및 도 13d), 0.5 ㎍/㎏(도 13E) 및 0.5 ㎍/㎏ 미만(도 13f)의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질 농도와 상관관계가 있는 시간 프로파일에 대한 개개 IL-6 및 IL-10 혈장 농도를 나타낸다.
도 14a는 NKp46에 대해 특이성을 갖지 않는 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1) 및 CD64를 발현시키는 환자로부터의 AML 아세포(#AML5, #AML6) 또는 CD64를 발현시키지 않는 환자로부터의 AML 아세포(#AML1, #AML2)에 대해 NKp46에 대해서도 또는 CD123에 대해서도 특이성을 갖지 않고 증가된 ADCC 활성을 갖는 음성 아이소타입 대조군 Fc-최적화 항체(IC-hIgG1-ADCC-enh)와 비교되는 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 세포독성을 나타낸다. AML 환자로부터의 악성 세포를 표적으로서 사용하였고, 정제된 건강한 공여자 NK 세포를 효과기로서 사용하였다. 시험한 모든 건강한 공여자 NK 세포에 대해 결과를 나타낸다.
도 14b는 유세포 분석기 분석에 의한 CD33, CD123, CD32a/b 및 CD64의 발현을 나타내는 도 14a에서 사용되는 환자로부터의 악성 AML 세포의 표현형을 보고한다.
도 15a는 CD16a 단독(IC-CD123_F25) 또는 NKp46 단독(NKp46-CD123_F6) 또는 공동 관여하는 NKp46+CD16(NKp46-CD123_F25)에 의해 종양 세포 상의 CD123을 표적화하고 NK 세포(IC-CD123_F6)에 관여하지 않거나 또는 NK 세포를 관여하는 NKCE의 세포독성 비교이다. MOLM-13 세포를 표적 세포로서 사용하였고, 휴지 중인 건강한 공여자 NK 세포를 효과기로서 정제하였다. 2명의 NK 공여자를 나타낸다.
도 15b는 AML 세포주 MOLM-13에 대해 CD123(NKp46-IC_F25)에 결합하지 않는 음성 아이소타입 대조군 NKCE 분자와 비교되는 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 세포독성을 보고한다. 5명의 건강한 NK-세포 공여자에 대한 결과를 나타낸다.
도 16a는 AML 환자(AML #8 내지 #10)로부터의 NK 및 악성 세포의 유세포분석이다. 상단 패널은 AML 아세포 상의 CD123(CD33-양성 집단에 개폐)을 나타내고; 중간 패널은 CD123-양성 AML 아세포 상의 CD64(검정색의 CD64 염색 및 회색의 아이소타입 대조군)의 발현을 나타내며; 하단 패널은 NK AML 샘플 NK 세포 상에서의 NKp46 및 CD16a의 발현을 나타낸다.
도 16b는 아세포 세포 표면에서 CD64를 발현시키는 AML 환자 샘플(AML #8 및 #9) 및 CD64를 발현시키지 않는 AML 환자 샘플(AML #10)로부터의 PBMC 상의 NKp46-CD123_F25(CD123-NKCE), NKp46에 대해 특이성을 갖지 않는 항-CD123 ADCC-향상 항체(그래프에서 참조-1 또는 CD123-IgG1+), CD123에 결합하지 않지만 NKp46 및 CD16a(600 및 120 ng/㎖)에 결합하는 대조군 아이소타입 NKp46-IC_F25(IC-NKCE) 및 IgG1 아이소타입 대조군(600 ng/㎖)(IC-IgG1+)으로 밤새 처리 후 NK 세포에 의한 CD107a/b 발현의 분석이다.
도 17은 MOLM-13 세포와 함께 공동 배양시킨 NK 세포 또는 공동배양시키지 않은 MOLM-13 세포(NK + MOLM-13 대 NK 단독)를 이용한 실험 설정에서 하나의 관여 NKp46 및 CD16 단독(NKp46-IC_F25)을 포함하는 대조군에 비해 증가된 농도의 NKp46-CD123_F25로 처리된 NK 세포에 의한 마커 발현(CD107, CD69, TNF-α, IFN-γ 및 MIP-1β) 발현 백분율을 나타낸다. 3명의 NK 세포 공여자에 대한 결과를 나타낸다.
도 18은 SCID 마우스에서 파종성 인간 AML인 MOLM-13에 대해 대리(surrogate) muNKp46-huCD123_F25 이중특이성 항체(moNKp46-huCD123으로도 알려짐)의 활성을 나타낸다. MOLM-13 세포를 단일 투여에서 제0일에 정맥내로 주사하였다. 종양 이식 후 제1일에 복강내 경로에 의해 처리를 투여하였다. muNKp46 및 뮤린 FcγR에는 결합하지만 huCD123에는 결합하지 않는 아이소타입 대조군 항체(muNKp46-IC)를 0.5 ㎎/㎏. muNKp46-huCD123_F25로 투여하였고, 참조-1을 5, 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏으로 투여하였다. 대조군을 비처리로 두었다. 그래프는 5, 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏의 muNKp46-huCD123_F25 이중특이성 항체, 참조-1 및 대조군으로 처리한 동물에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 나타낸다. ***: 대조군에 대해 p<0.001; **: 대조군에 대해 p<0.01; *: 대조군에 대해 p<0.05; ###: 참조-1에 대해 p<0.001; #: 참조-1에 대해 p<0.05. n = 5 내지 10마리 마우스/그룹.
도 19는 파종성 인간 MOLM-13 종양 세포를 보유하는 SCID 마우스에서 대리 muNKp46-huCD123_F25 이중특이성 항체의 생체내 효능에 대한 NK 고갈의 영향을 평가한다. NK 고갈은 종양 세포 이식 1일 전 및 이식 5일 후에 항-아시알로 GM1 혈청의 2회의 복강내 투여에 의해 유도되었다. MOLM-13 세포를 단일 투여에서 제0일에 정맥내로 주사하였다. 종양 이식 후 제1일에 복강내로 처리를 투여하였다. muNKp46 및 뮤린 FcγR에는 결합하지만 huCD123에는 결합하지 않는 아이소타입 대조군 항체(muNKp46-IC) 및 huCD123 및 뮤린 FcγR에 결합하지만 뮤린 NKp46에는 결합하지 않는 제2 아이소타입 대조군 항체(IC-huCD123)를 포함하는 대조군을 또한 평가하였다. 그래프는 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏의 muNKp46-huCD123_F25 이중특이성 항체 및 대조군(muNKp46-IC, IC-huCD123)으로 처리한 동물에 대한 카플란-마이어 곡선을 나타낸다. n = 10마리 마우스/그룹. ***: 대조군에 대해 p<0.001; **: 대조군에 대해 p<0.01; ###: 동일한 처리 + NK 고갈에 대해 p<0.001; #: 동일한 처리 + NK 고갈에 대해 p<0.05.
도 20a는 단일 1-시간 정맥내 주입으로서 저용량의 3 ㎍/㎏으로 처리한 원숭이 M3 및 M4의 혈액으로부터의 CD123-양성 호염기구 고갈을 도시한다. 투약 전(용량 전) 및 주입 시작 후 24시간에 혈액 샘플을 수집하고, 유세포 분석기로 분석하였다. CD123-양성 호염기구를 게이트에 나타낸다.
도 20b는 단일 1-시간 정맥내 주입으로서 3 ㎎/㎏으로 처리된 원숭이 M1(오렌지) 및 M2(보라색), 및 단일 1-시간 정맥내 주입으로서 3 ㎍/㎏으로 처리한 원숭이 M3(적색) 및 M4(청색)의 연구 시 순환 CD123-양성 호염기구(속이 빈 기호) 및 총 CD123-양성 백혈구(속이 찬 기호)의 수를 나타낸다.
도 20c는 각각 단일 1-시간 정맥내 주입으로서 고용량 및 저용량의 3 ㎎/㎏ 및 3 ㎍/㎏으로 처리한 사이노몰거스 원숭이에서의 사이토카인 생성을 보고한다. 투약 전(0), 및 처리 시작 후 1.5, 5 및 24시간의 혈장 IL-6 및 IL-10 농도를 나타낸다.
도 20d는 고용량 및 저용량의 3 ㎎/㎏ 및 3 ㎍/㎏으로 처리한 사이노몰거스 원숭이의 1시간 주입 시작 후 1.5, 5, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 504 및 672시간(즉, 0.04, 0.06, 0.21, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21 및 28일)에 모니터링한 혈장 NKp46-CD123_F25(CD123-NKCE) 농도를 보고한다. 정량하한(LLOQ; 0.25 ng/㎖)은 수평 점선으로 나타낸다.
도 21a는 4주(제1일, 제8일, 제15일 및 제22일) 동안 3 ㎎/㎏/투여의 용량으로 매주 처리한 수컷 원숭이 M5에서 NKp46-CD123_F25(CD123-NKCE) 분자의 독성동태학(TK)을 나타낸다. 혈장 CD123-NKCE 농도를, 투약 전(용량 전) 및 제1일, 제8일, 제15일에 1시간 주입의 시작 후 1, 1.5, 5, 24 및/또는 72시간 및 투약 전 및 제22일에 마지막 네 번째 1시간 주입의 시작 후 1, 1.5, 5, 24 및 168시간에 결정하였다. 정량하한(LLOQ: 0.25 ng/㎖) 미만의 값을 그래프에 보고하지 않는다. 주입일을 수직 점선으로 나타낸다.
도 21b는 4주 동안 고용량의 3 ㎎/㎏/투여로 매주 처리한 원숭이 M5에서의 인터류킨-6 생성의 분석이다. 혈장 IL-6 농도를, 투약 전 및 제1일, 제8일, 제15일에 1시간 주입의 시작 후 1, 1.5, 5 및 24시간 및 투약 전 및 제22일에 마지막 네 번째 1시간 주입의 시작 후 1, 1.5, 5, 24 및 168시간에 모니터링하였다.
도 21c는 3 ㎎/㎏/주 용량으로 처리한 원숭이 M5에 대해 연구 시점에 따른 혈액(좌측 패널) 또는 골수(우측 패널)에서의 순환 CD123-양성 호염기구(속이 빈 기호) 및 총 CD123-양성 백혈구(속이 찬 기호)의 수를 정량화한다.
도 22는 2명의 건강한 공여자(HD)로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용한 분석에서의 THP1 세포독성 활성을 그래프로 도시한다. NK 세포 및 THP1 GFP 표적 세포를 CD123에 관여하고 감소된 ADCC-활성을 유도하는 NKp46-CD123_F25 또는 이의 아이소타입 대조군 IC-CD123_F6의 존재 하에서 이의 0.1, 1, 10 및 100 ng/㎖의 Fc 침묵 형식(F6)과 함께 인큐베이션시켰다.
본 개시내용은 면역 NK 세포, 즉, NKp46 상의 하나의 표면 바이오마커 및 종양 표적 세포, 즉, CD123 상에서의 관심의 하나의 항원에 결합하는 다기능성 결합 단백질을 제공하고, CD123 표면 바이오마커를 발현시키는 표적 세포를 용해시키기 위해 NK 세포를 다시 보낼 수 있다. 본 개시내용의 다기능성 결합 단백질은 Fc-γ 수용체(FcγR), 특히, 활성화 Fc-γ 수용체(FcγR), 예를 들어, CD16a로도 불리는 FcγRIIIa에 결합하는 모든 또는 일부의 Fc 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 예시된 다기능성 결합 단백질은 또한 N-연결 글리코실화를 포함하고 활성화 Fc-γ 수용체(FcγR), 예컨대, 수용체 CD16a에 결합하여 유리한 면역 향상 활성을 제공하는 이량체 Fc 도메인을 갖는다.
본 발명자들은 최적의 NK 세포 조절, 특히 NK 세포 활성화가 AML 세포주 MOLM-13 및 THP1 상의 시험관외에서 그리고 NKp46, FcγR, 예컨대, CD16a 및 세포 표면 바이오마커 CD123과 관여함으로써 AML 환자로부터의 1차 샘플(예를 들어, AML 환자로부터의 말초 혈액 림프구) 상의 생체외에서 더 양호한 안전성 프로파일에 의해 달성될 수 있다는 실험 증거를 제공한다.
중요하게는, 본 명세서에서 "F25"로 보고되는 형식을 특징으로 하고 인간 CD16 폴리펩타이드에 결합하는 중앙의 결정화 단편(Fragment crystallizable: Fc) 영역을 포함하는 본 개시내용의 NKp46-CD123 결합 단백질의 시험관내 세포독성 활성을 생체외에서 재현하였다.
따라서, 본 발명자들은 특히 AML 및 다른 증식 장애를 치료 및 예방하는 데 사용하기 위한 이중특이성 NKp46/CD16-CD123 결합 단백질의 치료 특성의 실험 근거를 제공한다.
본 발명자들은 NKp46-CD123 결합 단백질이 이들의 CD64 발현 상태와 상관없이 AML 환자로부터의 1차 샘플에서의 NK 세포를 활성화시킨다는 실험 증거를 추가로 제공한다.
따라서, 세포 표면 마커 NKp46/CD16의 결합을 통한 NK 세포의 관여는 의약으로서 사용하기 위한 강하고 재현 가능한 전략으로서 입증된다.
I.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같은 " CD123 " 마커, 또는 " 분화 클러스터 123 "은 " 인터류킨 3 수용체, 알파(IL3RA) " 또는 " IL3R ", " IL3RX ", " IL3RY ", " IL3RAY ", " hlL-3Ra "로도 알려져 있으며, 이형이량체 사이토카인 수용체의 인터류킨 3 특이적 서브유닛을 나타낸다. 작용성 인터류킨 3 수용체는 특이적인 알파 쇄(IL-3A; CD123), 및 과립 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 및 인터류킨 5(IL-5)에 대한 수용체와 공유되는 IL-3 수용체 베타 쇄(βθ; CD131)를 포함하는 이형이량체이다. CD123은 IL-3 결합에 수반되는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 약 50개 아미노산의 짧은 세포질 꼬리를 포함하는 약 43 kDa의 추정되는 분자량을 갖는 I형 내재 막관통 단백질이다. 세포외 도메인은 2개의 영역으로 구성된다: 약 100개의 아미노산의 N-말단 영역, GM-CSF 및 IL-5 수용체 알파쇄의 동등한 영역에 유사성을 나타내는 서열; 및 이런 사이토카인 수용체 패밀리의 다른 구성원에 공통적인 4개의 보존된 시스테인 잔사 및 모티프를 포함하는 막관통 도메인에 근위인 영역. IL-3 결합 도메인은 2개의 Ig-유사 폴딩 도메인으로 구성된 약 200개 아미노산 잔기의 사이토카인 수용체 모티프(CRM)를 포함한다. CD123의 세포외 도메인은 고도로 당화되며, N-당화는 리간드 결합 및 수용체 신호전달 둘 모두에 필요하다. 단백질 패밀리는 3가지 구성원을 모은다: IL3RA(CD123A), CSF2RA 및 IL5RA. 3가지 구성원 간에 전체 구조는 널리 보존되어 있지만, 서열 상동성은 매우 낮다. 현재까지, CD123의 하나의 300개 아미노산 길이의 아이소폼이 발견되었지만, Getentry 데이터베이스로부터 수탁 번호 ACM241 16.1 하에 이용 가능한 RNA 수준으로만 발견되었다. 신호 펩타이드를 포함하는 전장 인간 CD123 단백질의 참조 서열은 NCBI 데이터베이스로부터 수탁 번호 NP_002174.1 하에, 그리고 Uniprot 수탁 번호 P26951 하에 이용 가능하다. 인간 CD123(ECD)의 세포외 도메인은 서열번호 86의 아미노산 서열로 이루어진다. CD123(인터류킨-3 수용체 알파 사슬 IL-3Ra)은 다양한 혈액학적 신생물에서 과발현되는 종양 항원이다. 대다수의 AML 아세포는 표면 CD123을 발현하며, 이러한 발현은 AML의 하위유형에 따라 달라지지 않는다. 진단 시 AML에서의 더 높은 CD123의 발현은 더욱 불량한 예후와 관련이 있는 것으로 보고되었다. CD123 발현은 척수형성이상증, 전신 비만세포증, 모구성 형질세포 모양 수지상 세포 신생물(BPDCN), ALL 및 모양 세포 백혈병을 포함하는 다른 혈액 악성종양에서 보고되었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "자연살해" 또는 " NK 세포 "는 비통상적인 면역과 관련된 림프구의 하위 집단을 지칭한다. NK 세포는 특정 특징 및 생물학적 특성, 예컨대, 인간 NK 세포에 대해 CD16, CD56 및/또는 CD57, NKp46을 포함하는 특정 표면 항원의 발현, 세포 표면 상의 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 복합체의 부재, 특정 세포용해 기작의 활성화에 의해 "자기" MHC/HLA 항원을 발현시키지 않는 세포에 결합하고 사멸시키는 능력, NK 활성화 수용체에 대한 리간드를 발현시키는 종양 세포 또는 다른 질환 세포를 사멸시키는 능력, 및 면역 반응을 자극 또는 저해하는 사이토카인으로 불리는 단백질 분자를 방출하는 능력에 의해 확인될 수 있다. 임의의 이들 특징 및 활성은 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 NK 세포를 확인하는 데 사용될 수 있다. NK 세포의 임의의 하위집단은 또한 용어 NK 세포에 의해 포괄될 것이다. 본 명세서의 문맥 내에서, "활성" NK 세포는 표적 세포를 용해시키거나 다른 세포의 면역 기능을 향상시키는 능력을 갖는 NK 세포를 포함하는 생물학적으로 활성인 NK 세포를 나타낸다. NK 세포는 당업계에 공지된 다양한 기법, 예컨대, 혈액 샘플로부터의 단리, 혈구제거요법, 조직 또는 세포 수집 등에 의해 얻을 수 있다. NK 세포를 수반하는 분석을 위한 유용한 프로토콜은 자연살해 세포 프로토콜(Campbell KS 및 Colonna M에 의해 편집)에서 찾을 수 있다. Human Press. pp. 219-238 (2000).
본 명세서에 사용되는 바와 같은, " CD335 " 또는 " NKP46 " 또는 " NK-p46 " 또는 " LY94 "로도 알려진 " NKp46 " 마커 또는 " 천연 세포독성 촉발 수용체 1 "은 Ncr1 유전자에 의해 암호화된 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 전장 인간 NKp46 단백질의 참조 서열은 NCBI 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_004820 하에 이용 가능하다. 인간 NKp46 세포외 도메인(ECD)은 서열번호 84의 아미노산 서열에 상응한다. 인간 NKp46 mRNA 서열은 NCBI 수탁번호 NM_004829에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " Fc-γ 수용체 " 또는 " FcγR " 또는 " Fc-감마 수용체 "는 활성화와 저해 FcγR을 둘 다 지칭할 수 있다. Fc-감마 수용체(FcγR)는 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 영역에 대한 세포 수용체이다. 복합체화된 IgG의 결합 시, FcγR은 세포의 면역 효과기 기능을 조절하여, ADCC-매개 면역 반응을 포함하는 적응 및 선천성 면역계를 연결할 수 있다. 인간에서, 6종의 고전적 FcγR이 현재 보고된다: 1종의 고친화도 수용체(FcγRI) 및 5종의 낮은 내지 중간 친화도 FcγR(FcγRIIA, -B 및 -C, FcγRIIIA 및 -B). 모든 FcγR은 IgG Fc 상의 동일한 영역에 결합하지만, 친화도는 높음(FcgRI)과 낮음(FcgRII 및 FcgRIII)으로 다르다. 작용성 수준에 대해, 대부분의 FcγR은 ADCC-매개 면역 반응을 포함하는 위에 언급한 세포 반응을 유도할 수 있는 활성화 수용체이다. FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc 및 FcγRIIIa는 세포내 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 특징으로 하는 활성화 수용체이지만, FcγRIIb는 저해 모티프(ITIM)이고, 따라서 저해성이다. 달리 구체화되지 않는 한, 용어 FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32a), FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIIb(CD16b), 바람직하게는 FcγRIIIa(CD16a)를 포함하는 활성화 수용체를 포괄한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " FcγRIIIa(CD16a) " 또는 " FcγRIIIa " 또는 " CD16a " 또는 " CD16 " 또는 " 분화 클러스터 16 "은 비만세포, 대식세포 및 자연살해 세포 상에서 막관통 수용체로서 발현된 50 내지 65 kDa 세포 표면 분자를 지칭할 수 있다. FcγRIIIa는 관련된 FcR γ-쇄에 면역수용체 타이로신 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 활성화 수용체이며, ITAM은 수용체 발현, 표면 조립 및 신호전달에 필수적이다. CD16a는 IgG에 대한 저친화도 수용체이고, NK 세포에 의해 ADCC(항체 의존적 세포 매개 세포독성)를 매개하는 중요한 수용체이다. 고친화도 수용체 CD16a는 NK 세포 및 단핵구 상에서 우선적으로 발견되고, IgG 결합 시 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 유도한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " FcγRII CD32 ", " FcγRII ", " FCGR2 " 또는 " CD32a " 또는 " CD32A " 또는 " CD32 " 또는 " 분화 클러스터 32 "는 Ig 유전자 슈퍼패밀리에 속하는 표면 수용체 당단백질이다. CD32A는 모든 골수성 세포 상에서 발현되지만 림프구 상에서는 발현되지 않는다. CD32는 단량체 형태의 IgG 항체의 Fc 영역에 대해 저친화도를 갖지만, IgG 면역 복합체에 대해 고친화도를 갖는다. CD32는 2가지 주요 기능을 갖는다: 세포 반응 조절, 및 면역 복합체의 흡수. CD32에 의해 조절된 세포 반응은 식세포작용, 사이토카인 자극 및 식작용 수송을 포함한다. 조절장애 CD32는 전신 홍반성 루푸스를 포함하는 상이한 형태의 자가면역과 관련된다. 인간에서, 3가지 주요 CD32 서브타입이 있다: CD32A, CD32B 및 CD32C. CD32A 및 CD32C는 세포 반응의 활성화에 관련되지만, CD32B는 저해성이며, CD32A의 활성화 특성과 균형을 이룬다. CD32A는 다양한 면역 세포 상에서 발견될 수 있는 CD32의 활성화 서브유닛이다. 특히, CD32A(FcγRIIA)는 응집된 IgG의 저친화도 결합에 따라서 과립구, 단핵구, B 세포, 혈소판 및 수지상 세포의 효과기 기능을 매개한다. IgG 면역 복합체에 결합될 때, 세포액 ITAM은 호중구 및 대식세포에서의 식세포 활성 및 사이토카인 분비를 촉진시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " hFcγRICD64 ", " hFcγRI " 또는 " CD64 " 또는 " 분화 클러스터 64 "는 단핵구 및 대식세포 상에서만 구성적으로 발현된 표면 수용체이고, 사이토카인 자극 시 과립구 상에서 상향조절된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 형식 5 " 또는 "F5" , "형식 25" 또는 " F25 ", "형식 F6" 또는 " F6 " 및 "형식 26" 또는 " F26 "은 다중 항원 결합 도메인을 단일 항체 분자로 조작하도록 특별히 설계된 이중특이성 또는 다중특이성 항체의 특이적 결합 단백질 입체배치를 지칭한다. NKp46-결합 도메인 및 CD123-결합 도메인을 포함하는 본 개시내용의 다기능성 결합 단백질은 도 1 및 도 2에 예시된 바와 같은 F25 형식에 기반하여 생성된다. F25 및 형식 F26은 각각 제2 폴리펩타이드 쇄와 제3 폴리펩타이드 쇄 사이에 1개의 CH1/CL이 교환되어 CL/CH1 쌍을 형성한다는 점에서 형식 F5 및 F6과 상이하다. F5 및 F6 형식은 본 명세서에 참조에 의해 원용된 국제 특허 출원 WO2017114694에 이전에 기재되었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 이중특이성 결합 단백질 "은 2개의 별개의 항원-결합 도메인(ABD)을 통해 2개의 상이한 항원 표적(예를 들어, 인간 NKp46 및 인간 CD123)에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " ~에 특이적으로 결합한다 " 또는 " 특이적으로 ~에 결합한다 "는 적어도 약 1×10-6 M, 1×10-7 M, 1×10-8 M, 1×10-9 M, 1×10-10 M, 1×l0-11 M, 1×10-12 M 이상의 Kd로 에피토프를 포함하는 항원(예를 들어, 인간 NKp46 및/또는 인간 CD123)에 결합하고/하거나, 비특이적 항원에 대한 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인(ABD)의 능력을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 인간 NK46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다 "는 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 대한 특이적 결합을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다 "는 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 대한 특이적 결합을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 특이적으로 "는 서열번호 87 또는 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 대한 결합을 지칭할 수 있다.
경쟁적 결합 분석 및 특이적 결합을 결정하기 위한 기타 방법은 아래에 추가로 기재하며, 당업계에 잘 공지되어 있다. "~에 특이적으로 결합한다" 또는 "~에 대한 특이성을 갖는"과 같은 표현은 상호 호환적으로 사용된다. 해당 용어는 열거된 표적/결합 상대에 실제로 결합하는 해당 항체, 폴리펩타이드 및/또는 다중쇄 폴리펩타이드뿐만 아니라, 비결합 형태로 제공된다고 해도, 열거된 표적에 대해 특이성을 보유하는 것을 지칭하는 것으로 해석되지 않는다. 결합 특이성은 친화도 상수 KA(또는 KA) 및 해리 상수 KD(또는 KD)에 의해 정량적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 친화도 ", 농도(EC50) 또는 평형 해리 상수(KD)는 에피토프에 대한 항체 또는 폴리펩타이드의 결합 강도를 의미한다. 항체의 친화도는 [Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]로 정의되는 해리 상수 KD인 특이적 유형의 평형 상수에 의해 주어지며, 여기서, [Ab-Ag]는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, [Ab]는 비결합 항체의 몰 농도이며, [Ag]는 비결합 항원을 몰 농도이다. 친화도 상수 KA는 1/KD로 정의된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 바람직한 방법은 문헌[Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), 및 Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)]에서 찾을 수 있으며. 이들 참고문헌은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 당업계에 잘 공지된 하나의 바람직한 표준 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR) 선별(예컨대, BIAcore™ SPR 분석 장치를 이용하는 분석에 의함)의 사용이다. 비제한적 방식으로, SPR에 의해, 생리적 조건 하에(예를 들어, 정상 완충제 조건 하에 6 내지 8 범위의 pH에서) 결정된 50 nM 미만의 KD는 일반적으로 항원-항원 결합 도메인(ABD) 상호작용에 대한 결합 특이성을 나타내는 것으로 간주될 수 있다:
예로서, 일부 특정 및 예시된 실시형태에 따르면, 본 명세서에 보고된 결합 단백질은:
-
SPR에 의해, 생리 조건 하에서 결정할 때, 10 nM 미만의 KD, 특히 0.5 nM 미만의 KD로 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인;
-
SPR에 의해, 생리 조건 하에서 결정할 때, 50 nM 미만의 KD, 특히 20 nM 미만의 KD로 인간 NKp46에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인
을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는"은 문법적인 접속사로서, 그것이 연결하는 사례 중 하나 이상이 발생할 수 있음을 포괄하는 것으로 해석될 것이다. 예를 들어, 표현 "이러한 천연 서열 단백질은 표준 재조합 및/또는 합성 방법을 사용하여 생성될 수 있다"는 천연 서열 단백질이 표준 재조합 및 합성 방법을 사용하여 생성될 수 있거나, 천연 서열 단백질이 표준 재조합 방법을 사용하여 생성될 수 있거나, 천연 서열 단백질이 합성 방법을 사용하여 생성될 수 있음을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는"은 (즉, 주어진 질환을 갖는 대상체에서의) 치료적 용도를 지칭하며, 그러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 반전, 경감, 진행의 저해를 의미한다. 따라서, 치료는 완전한 질환의 치유를 야기하는 치료뿐만 아니라, 질환의 진행을 늦추고/거나 대상체의 생존을 연장하는 치료를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, " 예방하는 "은 (즉, 주어진 질환이 발생하기 쉬운 대상체에 대한) 예방적 용도를 의미하며, 재발된 AML 환자의 치료를 포괄한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 다기능성 결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물의 " 치료적 유효량 "은 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 유해/유익비로 상기 암 질환을 치료하기 위한 항체-유사 다기능성 결합 단백질의 충분량을 의미한다. 그러나 본 개시내용의 폴리펩타이드 및 조성물의 전체적인 1일 사용량은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 치료적으로 유효한 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 이용된 특정 폴리펩타이드의 활성; 이용된 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 이용된 특정 폴리펩타이드의 배출 속도; 치료 지속기간; 이용된 특정 폴리펩타이드와 조합하여 또는 동시에 이용된 약물; 및 의학 분야에 잘 알려져 있는 유사 인자들을 포함하는 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 수준보다 더 낮은 수준에서 화합물의 용량을 시작하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당해 기술 분야의 통상적인 지식 내에서 잘 알려져 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 대상체 " 또는 "개체" 또는 " 환자 "는 상호 호환적으로 사용되고, 인간 또는 비인간 포유류, 설치류 또는 비설치류를 포괄할 수 있다. 상기 용어는 포유류, 예를 들어, 남성, 여성 및 아동을 포함하는 인간, 기타 영장류(원숭이), 돼지, 설치류, 예컨대, 마우스 및 래트, 토끼, 기니피그, 햄스터, 소, 말, 고양이, 개, 양 및 염소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 단수형태는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 복수의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포괄하며 이들의 혼합물을 포함한다.
따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, " 복수의 "는 ≪둘≫ 또는 ≪둘 이상≫을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, " 항체 " 또는 " 면역글로불린 "은 2개의 중쇄가 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄가 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된 천연 또는 통상적인 항체를 지칭할 수 있다. 두 가지 유형의 경쇄, 람다(λ) 및 카파(κ)가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 다음의 5가지의 주요 중쇄 클래스(또는 아이소타입)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 사슬은 별개의 서열 도메인을 포함한다. 경쇄는 두 개의 도메인 또는 영역, 즉 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 포함한다. 중쇄는 일반적으로 네 개의 도메인, 즉 하나의 가변 도메인(VH) 및 세 개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3, CH로 총칭됨)을 포함한다. 특히, IgG, IgA 및 IgD 분류는 CH1 CH2 및 CH3으로 표기되는 3개의 중쇄 불변 영역 도메인을 갖고; IgM 및 IgE는 4개의 중쇄 불변 영역 도메인, 즉, CH1, CH2, CH3 및 CH4를 갖는다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 둘 다의 가변 영역은 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(CH)의 불변 영역 도메인은 항체 사슬 회합, 분비, 경태반 이동성, 보체 결합, 및 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 항원-결합 단편(Fab)의 N-말단 부분이고, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변부로 이루어진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 일반적으로, " IgG " 또는 " 면역글로불린 G "를 지칭할 때, 달리 정의되지 않는 한, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 포함된다. 특히, IgG는 IgG1이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체-유사" 또는 "면역글로불린-유사" 폴리펩타이드는 또한 단일 도메인 항체 및 이의 단편, 특히 단일 도메인 항체의 가변 중쇄, 및 키메라, 인간화, 이중특이성 또는 다량체 항체를 포함하는 비통상적인 또는 합성 항원-결합 폴리펩타이드 또는 결합 단백질을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 다기능성 결합 단백질 "은 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 가변 영역(예를 들어, 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)) 및 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제2 가변 영역(예를 들어, 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL))을 포함하는 항체-유사 폴리펩타이드 또는 단백질 형식을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다중-쇄 단백질을 포괄한다. 특정 유형의 작제물에 특이적으로 제한되지는 않지만, 한 가지 일반적인 실시형태가 특히 명세서 전체적으로 고려된다: 각각 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO2015197593 및 WO2017114694에 보고된 폴리펩타이드 작제물. 특히, 다기능성 결합 단백질, 예컨대, WO2015197593 및 WO2017114694에 보고된 것은 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 임의의 작제물을 포괄할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, " 인간화된 항체 "에서와 같은 용어 " 인간화된 "은 전체적 또는 부분적으로 비인간 유래이고, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화하기 위해 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역에서, 특정 아마노산을 대체하도록 변형된 폴리펩타이드(즉, 항체 또는 항체-유사 폴리펩타이드)를 지칭한다. 인간화 항체의 불변 도메인은 대부분의 경우 인간 CH 및 CL 도메인이다. 항체 서열의 인간화를 위한 다수의 방법이 당업계에 알려져 있으며; 예를 들어, 문헌[Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633]에 의한 검토를 참조한다. 한 가지의 통상적으로 사용되는 방법은 CDR 접합, 또는 항체 재형상화(antibody reshaping)로, 이는 공여자 항체, 일반적으로 마우스 항체의 CDR 서열을 상이한 특이성의 인간 항체의 프레임워크 스캐폴드에 접합시키는 것이다.
키메라 항체에 있어서, 인간화는 전형적으로 가변 영역 서열의 프레임워크 영역의 변형을 수반한다. CDR의 일부인 아미노산 잔기는 전형적으로 인간화와 관련하여 변경되지 않을 것이지만, 특정 경우에, 개별 CDR 아미노산 잔기를 변경하여, 예를 들어, 당화 부위, 탈아미드화 부위, 또는 원하지 않는 시스테인 잔기를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. N-연결 당화는 올리고당 사슬을 트리펩타이드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 내의 아스파라긴 잔기에 부착시킴으로써 발생하며, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-당화 자리의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기 중 하나를 상이한 잔기로, 특히 보존적 치환의 방식으로 돌연변이화시킴으로써 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 요인에 따라 발생할 수 있다. 아스파라긴 잔기는 주로 서열 Asn-Gly 내에 존재하는 경우, 특히 탈아미드화에 감수성이며, Asn- Ala과 같은 다른 디펩타이드 서열에서는 정도가 덜하다. 이러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly가 CDR 서열에 존재할 때, 이에 따라 전형적으로 관련된 잔기 중 하나를 제거하기 위한 보존적 치환에 의해 그 부위를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 연루되는 잔기 중 하나를 제거하기 위한 CDR 서열 내의 치환도 특허청구되는 다기능성 결합 단백질에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 보존적 아미노산 치환 "은 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환을 지칭한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 공지되어 있으며, 염기성 측쇄(예를 들어, 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 아미노산이 2개의 상이한 부류(즉, 타이로신 및 페닐알라닌)에 속할 때, 둘 다 허용될 수 있다. 참조로서, 다음의 분류는 달리 언급되지 않는 한 본 명세서 전체적으로 따를 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 도메인 "은 구체적인 구조적 또는 기능적 독립체와 관련된 서열 상동성 또는 동일성 기준으로 정의되는, 단백질의 임의의 영역일 수 있다. 따라서, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 용어 " 영역 "은 상응하는 도메인 이후의 추가적인 영역을 포함할 수 있다는 점에서 더 광범위하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 링커 영역 ", " 링커 펩타이드 " 또는 " 링커 폴리펩타이드 " 또는 " 아미노산 링커 " 또는 " 링커 "는 2개의 폴리펩타이드 도메인, 예컨대, 2개의 항원-결합 도메인을 함께 그리고/또는 Fc 영역을 하나 이상의 가변 영역, 예컨대, 하나 이상의 항원-결합 도메인에 공유 결합시키는 데 적합한 임의의 아미노산 서열을 지칭한다. 상기 용어는 특정 크기 또는 폴리펩타이드 길이로 제한되지 않지만, 이러한 아미노산 링커는 일반적으로 50개 미만의 아미노산 길이, 바람직하게는 30개 미만의 아미노산 길이, 예를 들어 20개 또는 20개 미만의 길이, 예를 들어, 15개 또는 15개 미만의 아미노산 길이이다. 이러한 아미노산 링커는 선택적으로 모든 또는 일부의 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄, 예컨대, 모든 또는 일부의 면역글로불린의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 아미노산 링커는 면역글로불린의 힌지 영역으로부터 유래되지 않은, 또는 심지어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드로부터 유래되지 않은 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 단편은 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄로부터 유래된 특정 유형의 링커로서 간주될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 힌지 영역 " 또는 " 힌지 "는 일반적으로 상응하는 중쇄 폴리펩타이드에 의해 보유되고, 면역글로불린의 특정 아이소타입, 더 구체적으로는 IgG, IgA 또는 IgD 아이소타입의 Fc 및 Fab 부분을 분리시키는, 가요성 영역을 지칭한다. 이러한 힌지 영역은 고려되는 면역글로불린의 아이소타입에 따라 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 천연 IgG, IgA 및 IgD 아이소타입의 경우, 힌지 영역은 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 분리시키고, 일반적으로 파파인 분해 시 절단된다. 반면에, IgM 및 IgE 중쇄에서 힌지에 상응하는 영역은 더 낮은 가요성을 갖는 추가적인 불변 도메인에 의해 형성된다. 추가적으로, 힌지 영역은 쇄간 디설파이드 결합에 관련된 하나 이상의 시스테인을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 또한, 적용 가능한 경우 CH2 도메인에 의해 생기는 FcγR 결합 부위에 추가로, Fcγ 수용체에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 추가적으로, 힌지 영역은 하나 이상의 번역 후 변형, 예컨대, 고려되는 아이소타입에 따라서 하나 이상의 글리코실화된 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 용어 " 힌지 "에 대한 언급이 힌지 서열의 특정 세트 또는 구조 상의 특정 위치로 제한되지 않는다는 것이 용이하게 이해될 것이다. 달리 지시되지 않는 한, 또한 특히 고려되는 힌지 영역은 IgG 아이소타입, IgA 아이소타입 및 IgD 아이소타입; 특히 IgG 아이소타입으로부터 선택된 하나의 아이소타입에 속하는 모든 또는 일부의 면역글로불린으로부터의 힌지를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " CH 도메인 ", 또는 " C H 도메인 " 또는 " 불변 도메인 "은 상호 호환적으로 사용될 수 있고 임의의 하나 이상의 중쇄 면역글로불린 불변 도메인(들)을 지칭한다. 이러한 CH 도메인은 면역글로불린-유사 도메인로서 자연적으로 폴딩되지만, 이들은 단리된 형태(예를 들어, 경쇄(CL)의 불변 도메인과 연관되지 않을 때 CH1 도메인)에서 부분적으로 장애가 있을 수 있다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 상기 용어는 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인; 또는 이들의 임의의 조합을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " CH1 도메인 " 또는 " C H 1 도메인 " 또는 " 불변 도메인 1 "은 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 상응하는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인 1을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " CH2 도메인 " 또는 " C H 2 도메인 " 또는 " 불변 도메인 2 "는 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 상응하는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인 2를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " CH3 도메인 " 또는 " C H 3 도메인 " 또는 " 불변 도메인 3 "은 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 상응하는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인 3을 지칭한다.
따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, (CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B에서와 같은 용어 " C H 2-C H 3 "은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " CL 도메인 " 또는 " C L 도메인 "은 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 상응하는 경쇄 면역글로불린 불변 도메인을 지칭한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 이 용어는 모든 알려진 서브타입(예를 들어, λ1, λ2, λ3 및 λ7)을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 카파(κ 또는 K) 또는 람다(λ) 부류의 CL 도메인을 포괄할 수 있다. 특히, CL 도메인이 카파 부류일 때, 이는 또한 본 명세서에서 Cκ 또는 CK 또는 Ck 도메인으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 쌍 C(C H 1/C L ) " 또는 " 짝지어진 C(C H 1/C L ) "는, 공유 또는 비공유 결합, 바람직하게는 비공유 결합에 의해 서로에 대해 결합되어; 이에 의해 이형이량체를 형성하는, 1개의 불변 중쇄 도메인 1 및 1개의 불변 경쇄 도메인(예를 들어, 면역글로불린 경쇄의 카파(κ 또는 K) 또는 람다(λ) 부류)을 지칭한다. 달리 구체화되지 않는 한, 쌍을 형성하는 불변 쇄 도메인이 동일한 폴리펩타이드 쇄 상에 존재하지 않을 때, 따라서 이 용어는 모든 가능한 조합을 포괄할 수 있다. 바람직하게는, 따라서 상응하는 CH1 및 CL 도메인은 이들이 안정적인 쌍 C(CH1/CL)를 형성하도록, 서로에 대해 상보성으로 선택될 것이다.
유리하게는, 결합 단백질이 복수의 짝지어진 C 도메인, 예컨대, 하나의 " 쌍 C 1 (C H 1/C L ) " 및 하나의 " 쌍 C 2 (C H 1/C L ) "를 포함할 때, 쌍을 형성하는 각각의 CH1 및 CL 도메인은, 상보성 CH1과 CL 도메인 사이에 형성되도록 선택될 것이다. 상보성 CH1 및 CL 도메인의 예는 국제 특허 출원 WO2006064136 또는 WO2012089814 또는 WO2015197593A1에서 이전에 기재되었다.
달리 지시되지 않는 한, 용어 " 쌍 C 1 (C H 1/C L ) " 또는 " 쌍 C 2 (C H 1/C L ) "는 동일한 또는 별개의 불변 중쇄 1 도메인(CH1)에 의해 형성된 별개의 불변 쌍 도메인(C1 및 C2) 및 동일 또는 별개의 경쇄 도메인(CL)을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 용어 " 쌍 C 1 (C H 1/C L ) " 또는 " 쌍 C 2 (C H 1/C L ) "는 동일한 불변 중쇄 1 도메인(CH1)에 의해 형성된 별개의 불변 쌍 도메인(C1 및 C2) 및 동일한 경쇄 도메인(CL)을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " Fc 영역 " 또는 " 결정화 단편 영역 " 또는 대안적으로 " Fc 영역 "은 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역(FcγR에 대해 제1 결합 부위를 천연적으로 보유함), 면역글로불린의(예를 들어, IgG, IgA 또는 IgD 면역글로불린의) CH2 도메인(FcγR에 대해 제2 결합 부위를 천연적으로 보유함) 및 CH3 도메인을 포함할 수 있고, 그리고/또는 (예를 들어, IgM 및 IgE에 대해) 면역글로불린의 CH4 도메인을 적용 가능할 때, 모든 또는 일부의 " Fc 도메인 "을 포괄한다. 바람직하게는, Fc 영역은 적어도 모든 또는 일부의 CH2 도메인 및 CH3 도메인, 및 선택적으로 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역을 포함한다. 따라서 상기 용어는 단량체 형태이든지 다량체 형태이든지 간에, 항체의 분해로부터 생기거나 다른 수단에 의해 생성된 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자를 지칭할 수 있으며, 이는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 천연 Fc의 본래의 면역글로불린 공급원은 특히 인간 유래이고, IgG1이 바람직하지만 면역글로불린 중 임의의 것일 수 있다. 천연 Fc 분자는 공유(즉, 디술피드 결합) 및 비-공유 회합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩타이드로 구성된다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 이황화 결합의 수는 부류(예를 들어, IgG, IgA, 및 IgE) 또는 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, lgG3, IgGA1 및 IgGA2)에 따라 1 내지 13개의 범위이다. 천연 Fc의 일례는 IgG의 파파인 분해로부터 생성되는 이황화 결합된 이량체이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "천연 Fc"는 단량체, 이량체 및 다량체 형태의 총칭이다. 따라서, 해당 용어 하에서, "Fc 영역"은 CH2-CH3(예를 들어, (CH2-CH3)A 또는 (CH2-CH3)B 또는 이의 결합쌍, 및 선택적으로 인간 FcγR에 대한 결합 부위를 포함하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역을 포함하거나, 이들로 이루어질 수 있다. 달리 구체화되지 않는 한, 용어 " Fc 영역 "은 천연 또는 변이체 Fc 영역 중 하나를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 " Fc 변이체 "는 천연 Fc로부터 변형되지만 수용체인 FcRn(신생아 Fc 수용체)에 대한 결합 부위를 여전히 포함하는 분자 또는 서열을 나타낸다. 예시적인 Fc 변이체, 및 이와 수용체의 상호작용이 본 기술 분야에 알려져 있다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비-인간 천연 Fc로부터의 인간화된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 천연 Fc는 본 발명의 항체 유사 결합 단백질에 요구되지 않는 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 하나 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기를 결여하거나 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형된 분자 또는 서열을 포함하고, 이는 하기에 영향을 미치거나 관여된다: (1) 이황화 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 비상용성, (3) 선택된 숙주 세포에서 발현 시 N-말단 이종성, (4) 당화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 재생 수용체 이외의 Fc 수용체로의 결합, 또는 (7) 항체-의존성 세포독성(ADCC).
본 개시내용에 따른 결정화 단편(Fc) 영역(예를 들어, 천연 또는 변이체)은 일반적으로 항체 Fc-힌지 영역의 결합을 통해 천연 Fc 영역 상에서 생긴 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드(Fcγ)에 결합하는 능력을 보유한다. 참조로서, IgG1, IgG2 및 IgG4의 전체 구조는 90% 초과의 서열 상동성으로 유사하며, 더 큰 차이가 힌지 영역 및 CH2 도메인에 존재하여, 이는 FcγR에 대한 1차 결합 부위를 형성한다. 힌지 영역은 또한 Fab와 Fc 일부 사이에서 가요성 링커로서 작용한다.
변형이 FcγR(활성화 및 저해 FcγR을 포함)에 대한 변이체 Fc 영역의 친화도 및 결합활성을 증가시키는 하나 이상의 부분에서 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 결실, 삽입)을 갖는 Fc 영역은 추가로 Fc 영역으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 Fc 영역의 친화도를 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 변이체 Fc 영역은 추가로 참조 모 항체(예를 들어, Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 제외하고 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체)의 Fc 영역보다 더 낮은 친화도로 FcγRIIB에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 명세서에서 고려되는 천연 및 변이체 Fc 영역은 일반적으로 인간 CD16, 예를 들어, 아미노산 잔기 N297(EU 넘버링에 따름)에서 N-연결 글리코실화를 포함하는 인간 Fc 도메인에 결합할 수 있는 도메인(즉, CH2 도메인)을 포함한다.
따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " Fc-적격 "은, 특히 활성화 FcγR의 FcγR에, 특히 FcγRI(CD64a), FcγRIIa(CD32a) 및 FcγRIIIa(CD16a)로부터 선택된 것에, 더 구체적으로는 FcγRIIIa(CD16a)에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 단백질을 지칭한다.
대안적으로, 잔기 297(EU 넘버링에 따름) 상의, 또는 대안적으로 더 낮은 힌지 영역 내 잔기 234 및 235(EU 넘버링 시스템에 따름) 상의 돌연변이를 포함하는 여러 변형이 FcγR에 대한 결합에 직접 영향을 미치는 것으로 보고된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " Fc-침묵 "은 Fc 영역을 갖는 결합 단백질을 지칭하되, Fc 영역은 FcγR에 대한 결합 부위(예를 들어, 상기 결합 부위를 갖는 CH2 도메인 및 상기 결합 부위를 갖는 힌지 영역을 결여하는 Fc 영역); 특히 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIIa, 및 더 구체적으로는 FcγRIIIa(CD16a)를 결여한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "가변 도메인"에서와 같은 용어 " 가변 "은 항체들간에 서열이 광범위하게 상이하고 특정 항체의 이의 특정 표적에 대한 특이적인 인식 및 결합에서 이용되는 관련 결합 단백질의 특정한 부분을 나타낸다. 그러나 가변성은 항체의 전체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서의 초가변 영역으로도 공지된 상보성 결정 영역(CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)으로 칭해지는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 프레임워크(FR) 영역 또는 서열이라 불린다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " VH 도메인 " 또는 " V H 도메인 "은 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 상응하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " VL 도메인 " 또는 " V L 도메인 "은 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 상응하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인을 지칭한다.
VH 또는 VL 도메인이 제1 항원-결합 도메인(ABD)에 또는 제2 항원-결합 도메인에 회합될 때, 이들은 또한 각각 본 명세서에서 "V H 1" 및 "V L 1" 또는 "V H 2" 및 "V L 2"로서 지칭될 수 있다.
용어 " 결합쌍 V(VH/VL) ", " V H /VL 쌍 " 또는 "(V H /V L ) 쌍 " 또는 " V L /V H 쌍 " 또는 " (V L /V H ) 쌍 "은 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 나란히 쌍을 이루어 항원 결합 도메인(ABD)을 형성할 수 있다. 각각의 결합쌍은 VH와 VL 영역을 둘 다 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 이들 용어는 면역글로불린 가변 영역이 VH 또는 VL 영역이고 ABD가 면역 효과기 세포 또는 표적 세포(예를 들어, NKp46 및 CD123)의 표면 상에서 발현된 단백질에 특이적으로 결합된다는 것을 명시하지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 명세서에서 사용될 때 용어 " 초가변 영역 '은 항원 결합을 초래하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 이 용어는 " 상보성 결정 영역 " 또는 " CDR "이라는 용어로 치환될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 고유 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 각각은 각각 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3로 표기되는 3개의 CDR을 갖는다. 따라서, 통상적인 항체 항원 결합 도메인은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 또한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프레임워크 영역"(FR)은 CDR들 사이에 개재된 아미노산 서열, 즉, 단일 종에서 상이한 면역글로불린들 중에서 상대적으로 보존된 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 부분을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 4개의 FR을 갖고, 이는 FR-L1, FR-L2, FR-L3, FR-L4 및 FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4로 표기된다. 따라서, 경쇄 가변 도메인은 이렇게 해서 (FR-L1)-(CDR-L1)-(FR-L2)-(CDR-L2)-(FR-L3)-(CDR-L3)-(FR-L4)로 표기될 수 있고, 중쇄 가변 도메인은 이렇게 해서 (FR-H1)-(CDR-H1)-(FR-H2)-(CDR-H2)-(FR-H3)-(CDR-H)-(FR4-H3)으로 표기될 수 있다.
초가변 영역은 일반적으로 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24 내지 34(L1), 50 내지 56(L2) 및 89 내지 97(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 31 내지 35(H1), 50 내지 65(H2) 및 95 내지 102(H3); 문헌[Kabat et al. 1991]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 해당 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2) 및 91 내지 96(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2) 및 96 내지 101(H3); 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917])을 포함한다. 이 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에 기재된 방법에 의해 수행된다. 따라서, 본 명세서에서 "Kabat 위치", "Kabat에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 및 "Kabat에 따른"과 같은 어구는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이런 넘버링 시스템을 지칭한다. Kabat 넘버링 시스템을 이용하여, 펩타이드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 이에 대한 삽입에 상응하는 소수의 또는 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 다음의 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따라 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 다음의 삽입된 잔기(예를 들어, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링 서열을 갖는 항체 서열의 상동성 영역에서 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
선택적으로, CDR은 EU, Kabat, Chotia 또는 IMGT 넘버링에 의해 정의되는 바와 같다. 해당 분류 사이의 상응도는 IMGT®, 또는 international ImMunoGeneTics information system®(CNRS and Montpellier University)에 관해 그리고 Lefranc(Biomolecules; 2014; 4, 1102-1139) 및 Dondelinger(Frontiers in Immunology; 2018; 9, 2278)에 추가로 상술되는 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
달리 지시되지 않는 한, 잔기의 넘버링은 EU, Kabat, Chotia 또는 IMGT 넘버링 협약에 관해 본 명세서에서 고려될 것이다. 참조 서열 내에서 초가변 영역의 정확한 위치에 관해 상충되는 경우에, Kabat 넘버링 협약이 우선할 것이다. 참조 서열 내에서 불변 영역의 정확한 위치에 관해 상충되는 경우에, EU 넘버링 협약이 우선할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 세포독성 "은 종양 세포에 독성이 되는 본 개시내용에 따른 다기능성 결합 단백질과 같은 화합물의 품질을 지칭한다. 세포독성은 상이한 작용 메커니즘에 의해 유도될 수 있으며, 이에 따라, 세포-매개의 세포독성, 세포자멸사, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포의 식세포작용(ADCP) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC)으로 나뉠 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 항체-의존적 세포-매개 세포독성 " 또는 "ADCC"는 면역 시스템의 효과기 세포가, 막-표면 항원이 본 개시내용의 특정 항체 또는 다기능성 결합 단백질에 의해 결합된 표적 세포를 적극적으로 용해시키는 세포-매개 면역 방어의 메커니즘을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 증식성 장애 ", " 과증식성 장애 " 및/또는 " 암 "은 고형 종양, 예컨대, 유방암, 호흡관, 뇌, 생식기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선 및 이들의 원거리 전이를 지칭할뿐만 아니라 조혈 및 림프 조직의 종양, 예컨대, 림프종, 흑색종 및 백혈병을 포함하는 혈액암을 포함한다. 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 털세포 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, " 급성 골수성 백혈병(AML) "은 이종성 미분화 골수 아세포의 증식 증가로서 임상적으로 나타나는 클론 장애이다. 이론으로 구속되는 일 없이, 백혈병 계층은 분명한 자기 재생능을 가지며 백혈병 전구세포로 분화될 수 있는 LSC의 소 집단(백혈병 줄기 세포)(AML-LSC)에 의해 유지된다. 이들 전구세포는 재발 및 진단 시에 환자에서 용이하게 검출 가능한 다수의 백혈병 아세포를 생성하여, 궁극적으로 사망을 야기한다. AML-LSC는 신속하게 분열하는 클론원성 전구세포와 대조적으로 통상적으로 휴지 세포로 보고되어 있다.
AML의 맥락 내에서, 용어 " 재발 "은 특히 완전 관해 후 AML의 재발로서 정의될 수 있다. 해당 의미에서 "완전 관해" 또는 "CR"은 다음과 같이 정의될 수 있다: 호중구에 대한 정상 값(>1.0*109/ℓ), 10 g/㎗의 헤모글로빈 수준 및 혈소판 계수(>100*109/ℓ) 및 적혈구 수혈로부터의 독립성; 5% 미만의 아세포, 클러스터 또는 아세포의 집합의 부재 및 골수 시험에서의 아우어 로드(Auer rod)의 부재; 및 정상적인 혈액 세포의 성숙(형태; 척수조영상) 및 골수외 백혈병의 부재.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이전에 전백혈병으로 알려진 " 골수 이형성 증후군 "("MDS")은 혈액 세포의 골수성 부류의 비효과적인 생산(또는 이형성)과 관련된 혈액학적 병태의 수집이다. 이들은 진행성 골수 부전 및 급성 골수성 백혈병("급성 골수성 백혈병"으로도 알려진 "AML")에 대한 증가된 진행 위험을 특징으로 하는 클론 조혈 줄기 세포 장애의 범주를 나타낸다. 국제 예후 점수 시스템(International Prognostic Scoring System: "IPSS")은 이들의 혈구감소증, 골수 골수아세포 백분율 및 세포유전 이상의 중증도에 기반하여 고위험 특징을 갖는 환자를 확인하는 데 널리 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, " 약제학적으로 허용 가능한 담체 "는 모든 담체(예컨대, 임의의 용매, 분산매, 코팅제, 항박테리아 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등)를 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립 가능하지 않은 경우를 제외하고, 이러한 매질은 본 개시내용의 조성물에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여용 제제는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 비수용성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수용성 담체는, 염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션, 또는 현탁액을 포함한다. 비포괄적 방식으로, 약학적으로 허용가능한 담체는, 이에 제한되지는 않지만, 0.01 내지 0.1 M(예를 들어, 0.05 M) 인산 완충액 또는 0.8% 염수를 포함한다. 다른 흔한 비경구 비히클은 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거액 또는 신전유를 포함한다. 정맥내 비히클은 링거 덱스트로스에 기반한 것 등과 같은 전해질 보충물, 유체 및 영양 보충물 등을 포함한다. 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 보다 구체적으로, 주사용 용도에 적합한 약학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우에, 조성물은 반드시 살균되어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도의 유체여야 한다. 조성물은 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하고, 일정한 실시형태에서는 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존될 것이다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 일정한 실시형태에서, 등장제, 예를 들어, 자당, 폴리알코올(예를 들면, 만니톨, 소르비톨), 또는 염화 나트륨이 조성물 내에 포함된다. 주사용 조성물의 장기간의 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 용어 " 적어도 하나의 "는 " 하나 이상 " 또는 심지어 " 둘 이상 "(또는 " 복수의 ")을 포괄할 수 있다. 예를 들어, 이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 또는 100 초과를 포괄할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 용어 " ...미만 "은 0에서 상응하는 역치까지의 모든 값을 포괄할 수 있으며, 예를 들어, 이는 적용 가능한 경우, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 또는 100보다 적은 수 미만을 포괄할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 " 세포 "는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포괄할 수 있다. 특히 고려되는 세포 유형은 재조합 항체, 또는 이의 단편 또는 폴리펩타이드 쇄의 생성 및/또는 조작에 적합한 것이다. 비포괄적 방식으로, 이러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 비-포유류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
용어 " 숙주 세포 ", " 숙주 세포주 " 및 " 숙주 세포 배양물 "은 상호 호환적으로 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포(이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 1차 형질전환 세포 및 계대 수에 상관없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산이 완전히 동일하지 않을 수도 있지만, 돌연변이를 포함할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 동일한 작용 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본 명세서에 포함된다. 숙주 세포는 본 개시내용의 결합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포계이다. 따라서, 숙주 세포는 배양 세포, 예를 들어, 포유류 배양 세포, 예컨대, 몇 가지만 언급하자면, CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 혼성세포 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함할 수 있다.
" 단리된 " 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 그의 천연 환경으로부터 제거된, 핵산 분자, DNA 또는 RNA가 의도된다. 예를 들어, 벡터에 포함된 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 본 개시내용의 목적상 단리된 것으로 고려된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가의 예는 이종 숙주 세포 내에서 또는 용액 중 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오타이드에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 보통 폴리뉴클레오타이드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하지만, 폴리뉴클레오타이드 분자는 염색체외에 또는 자연적 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 개시내용의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐만 아니라 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 본 개시내용에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성적으로 생산된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.
용어 " 벡터 ' 또는 " 발현 벡터 "는 핵산, 특히 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진시키기 위해 숙주 세포에 도입될 수 있는 비히클을 의미하는 것으로 의도된다.
II.
결합 단백질
일 실시형태에서, 본 개시내용은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고 서열번호 1 내지 서열번호 12, 또는 하나 이상의 보존적 치환(들)을 갖는 이들의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인(ABD);
(ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD),
(ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고 서열번호 13 내지 서열번호 40, 또는 하나 이상의 보존적 치환(들)을 갖는 이들의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인(ABD);
및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체
를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고 서열번호 1 내지 서열번호 12, 또는 하나 이상의 보존적 치환(들)을 갖는 이들의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인(ABD); 및
(ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고 서열번호 13 내지 서열번호 40, 또는 하나 이상의 보존적 치환(들)을 갖는 이들의 변이체로부터 선택된 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인(ABD);
및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고 서열번호 1 내지 서열번호 12, 또는 하나 이상의 보존적 치환(들)을 갖는 이들의 변이체로부터 선택된 3개의 CDR을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인(ABD), 및
(ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고 서열번호 13 내지 서열번호 40, 또는 하나 이상의 보존적 치환(들)을 갖는 이들의 변이체로부터 선택된 3개의 CDR을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인(ABD),
및
(iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고, 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL이 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인(ABD), 및
(ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고, 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL이 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인(ABD),
및
(iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고, 3개의 상보성 결정 영역(적어도 하나는 서열번호 1 내지 서열번호 6으로부터 선택됨)을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)(적어도 하나는 서열번호 7 내지 서열번호 12로부터 선택됨)을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인(ABD);
(ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고, 3개의 상보성 결정 영역(적어도 하나는 서열번호 13 내지 서열번호 26으로부터 선택됨)을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)(적어도 하나는 서열번호 27 내지 서열번호 40으로부터 선택됨)을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인(ABD);
및
(iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고, 3개의 상보성 결정 영역(적어도 2개는 서열번호 1 내지 서열번호 6으로부터 선택됨)을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)(적어도 2개는 서열번호 7 내지 서열번호 12로부터 선택됨)을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인(ABD);
(ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고, 3개의 상보성 결정 영역(적어도 2개는 서열번호 13 내지 서열번호 26으로부터 선택됨)을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)(적어도 2개는 서열번호 27 내지 서열번호 40으로부터 선택됨)을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인(ABD);
및
(iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로부터 선택된 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7 내지 서열번호 12로부터 선택된 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인(ABD);
(ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하고, 서열번호 13 내지 서열번호 26으로부터 선택된 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 27 내지 서열번호 40으로부터 선택된 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인(ABD);
및
(iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 제1 ABD 인간 CD123에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 1 내지 서열번호 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 서열번호 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제1 ABD가 인간 CD123에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 7 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 서열번호 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 13 내지 서열번호 15의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 16 내지 서열번호 18의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 19 내지 서열번호 21의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 22 내지 서열번호 24의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 16, 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 27 내지 서열번호 29의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 30 내지 서열번호 32의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 33 내지 서열번호 35의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 36 내지 서열번호 38의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제1 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 상기 결합 단백질은 제2 ABD 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고, 각각 서열번호 39, 서열번호 31 및 서열번호 40의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고; 여기서,
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 서열번호 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 서열번호 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 서열번호 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 서열번호 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 서열번호 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 서열번호 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 서열번호 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 서열번호 25 및 서열번호 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 서열번호 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 서열번호 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 서열번호 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 서열번호 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 서열번호 31 및 서열번호 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
당업자는 위에 기재된 결합 단백질이 하나의 단일 폴리펩타이드 쇄로 이루어질 수 있거나, 다량체 결합 단백질일 수 있고, 복수의 (둘 이상의) 폴리펩타이드 쇄를 포함한다는 것을 용이하게 이해할 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 결합 단백질은 다량체 결합 단백질이고, 2개의 항원-결합 도메인은 적어도 부분적으로 별개의 폴리펩타이드 쇄에 의해 생성될 수 있다.
선택적으로, 결합 단백질이 복수의 폴리펩타이드 쇄(예를 들어, 2 또는 3개의 폴리펩타이드 쇄)를 포함할 때, 해당 폴리펩타이드 쇄 중 일부는 공유적으로 연결될 수 있다. 2개의 폴리펩타이드 쇄가 공유적으로 연결될 때, 공유 링커(들)는 유리하게는 디설파이드 브리지, 또는 1개의 폴리펩타이드 쇄를 다른 쇄와 가교하는 펩타이드 결합(들), 및/또는 1개의 폴리펩타이드 쇄를 다른 쇄와 가교하는 링커 펩타이드(들)를 포함하는 임의의 다른 공유 링커로부터 선택될 수 있다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 결합 단백질은 2개의 ABD를 형성하는 3개의 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 포함하는 것을 특징으로 한다:
여기서,
V1A 및 V1B는 결합쌍 V1(VH1/VL1)을 형성하고;
V2A 및 V2B는 결합쌍 V2(VH2/VL2)를 형성하며;
C1A 및 C1B는 C1(CH1/CL) 쌍을 형성하고, C2A 및 C2B는 C2(CH1/CL) 쌍을 형성하되, CH1은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1이고, CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
(CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 동일 또는 상이하고, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하며;
L1, L2, L3, L4는 동일 또는 상이할 수 있는 선택적인 독립적 아미노산 링커이다.
일부 실시형태에서, (CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 각각 적어도 하나의 동일한 CH2 도메인, 예컨대, 서열번호 71의 아미노산 서열에 상응하는 CH2 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, (CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 동일 또는 상이하고, 서열번호 69 또는 서열번호 70의 아미노산 서열로부터 선택된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, L1, L2, L3 및 L4 중 일부는 동일 또는 상이할 수 있고, 서열번호 74 내지 서열번호 79로부터 선택된 모든 또는 일부의 아미노산 서열; 예를 들어, 서열번호 74 내지 서열번호 79로부터 선택된 아미노산 서열 중 1개 또는 4개 초과의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 특정 실시형태에 따르면, L1, L2, L3 및 L4 중 일부는 동일 또는 상이할 수 있고, 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역, 예컨대, 아미노산 서열 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 78 및/또는 서열번호 79; 예를 들어, 면역글로불린 힌지 영역의 4개 또는 4개 초과의 연속 아미노산으로부터 선택된 하나, 예컨대, 아미노산 서열 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 78 및/또는 서열번호 79로부터 선택된 하나를 포함할 수 있다.
일부 더 구체적인 실시형태에 따르면, L2, L3 및 L4 중 일부는 동일 또는 상이할 수 있고, 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역, 예컨대, 서열 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 78 및/또는 서열번호 79; 예를 들어, 면역글로불린 힌지 영역의 4개 또는 4개 초과의 연속 아미노산으로부터 선택된 하나의 서열, 예컨대, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 78 및/또는 서열번호 79의 서열로부터 선택된 하나를 포함할 수 있다.
일부 더 구체적인 실시형태에 따르면, L2, L3 및 L4 중 일부는 동일 또는 상이할 수 있고, 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역, 예컨대, 서열 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 78 및/또는 서열번호 79(예를 들어, 면역글로불린 힌지 영역의 4개 또는 4개 초과의 연속 아미노산으로부터 선택된 하나의 서열, 예컨대, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 78 및/또는 서열번호 79)의 서열로부터 선택된 하나를 포함할 수 있고, L1은 서열번호 76의 아미노산 서열에 상응하는 모든 또는 일부의 링커를 포함할 수 있다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 결합 단백질은 아래에 규정된 바와 같은, 2개의 ABD를 형성하는 3개의 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 포함하는 것을 특징으로 한다:
여기서:
V1A 및 V1B는 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 결합쌍 V1 (VH1/VL1)을 형성하고;
V2A 및 V2B는 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 결합쌍 V2 (VH2/VL2)를 형성하며;
C1A 및 C1B는 C1(CH1/CL)쌍을 형성하고, C2A 및 C2B는 C2(CH1/CL) 쌍을 형성하되, CH1은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1이고, CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
(CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 동일 또는 상이하고, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하며;
L1, L2, L3, L4는 동일 또는 상이할 수 있는 선택적인 독립적 아미노산 링커이다.
일 실시형태에서, 결합 단백질은 아래에 규정된 바와 같은, 2개의 ABD를 형성하는 3개의 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 포함하는 것을 특징으로 한다:
여기서,
V1A 및 V1B는 결합쌍 V1 (VH1/VL1)을 형성하고;
V2A 및 V2B는 결합쌍 V2 (VH2/VL2)를 형성하며;
C1A 및 C1B는 C1(CH1/CL)쌍을 형성하고, C2A 및 C2B는 C2(CH1/CL) 쌍을 형성하되, CH1은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1이고, CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
힌지1, 힌지2 및 힌지3은 동일 또는 상이하고, 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역에 상응하고;
(CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 동일 또는 상이하고, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하며;
L1은 아미노산 링커이다.
일 실시형태에서, 결합 단백질은 아래에 규정된 바와 같은, 2개의 ABD를 형성하는 3개의 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 포함하는 것을 특징으로 한다:
여기서,
V1A 및 V1B는 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 결합쌍 V1 (VH1/VL1)을 형성하고;
V2A 및 V2B는 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 결합쌍 V2 (VH2/VL2)를 형성하며;
C1A 및 C1B는 C1(CH1/CL)쌍을 형성하고, C2A 및 C2B는 C2(CH1/CL) 쌍을 형성하되, CH1은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1이고, CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
힌지1, 힌지2 및 힌지3은 동일 또는 상이하고, 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역에 상응하고;
(CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 동일 또는 상이하고, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하며;
L1은 아미노산 링커이다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은,
C1A가 CL 도메인을 포함하고;
C1B가 CH1 도메인을 포함하며;
C2A가 CH1 도메인을 포함하고;
C2B가 CL 도메인을 포함하는
것을 특징으로 한다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III),
C1A가 CH1 도메인을 포함하고;
C1B가 CL 도메인을 포함하며;
C2A가 CL 도메인을 포함하고;
C2B가 CH1 도메인을 포함하는
것을 특징으로 한다.
결합 단백질의 해당 특정 실시형태에 따르면, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은,
C1A가 CH1 도메인을 포함하고;
C1B가 CL 도메인을 포함하며;
C2A가 CH1 도메인을 포함하고;
C2B가 CL 도메인을 포함하는
것을 특징으로 한다.
결합 단백질의 해당 특정 실시형태에 따르면, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은,
C1A가 CL 도메인을 포함하고;
C1B가 CH1 도메인을 포함하며;
C2A가 CL 도메인을 포함하고;
C2B가 CH1 도메인을 포함하는
것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, C1A, C1B, C2A 및 C2B를 형성하는 CL 및 CH1 도메인은 동일 또는 상이할 수 있다. 따라서 결합 단백질의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은,
-
C1A 및 C2A가 동일하고, CL 도메인을 포함하거나; 또는
-
C1A 및 C2B가 동일하고, CL 도메인을 포함하거나; 또는
-
C1B 및 C2A가 동일하고, CL 도메인을 포함하거나; 또는
-
C1B 및 C2B가 동일하고, CL 도메인을 포함하는
것을 특징으로 한다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은,
-
C1A 및 C2A가 동일하고, CH1 도메인을 포함하거나; 또는
-
C1A 및 C2B가 동일하고, CH1 도메인을 포함하거나; 또는
-
C1B 및 C2A가 동일하고, CH1 도메인을 포함하거나; 또는
-
C1B 및 C2B가 동일하고, CH1 도메인을 포함하는
것을 특징으로 한다.
폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)의 일부 실시형태에서: V1A는 VH이고, V1B는 VL이다.
폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)의 일부 실시형태에서: V1A는 VL이고, V1B는 VH이다.
폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)의 일부 실시형태에서: V2A는 VH이고, V2B는 VL이다.
폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)의 일부 실시형태에서: V2A는 VL이고, V2B는 VH이다.
폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)의 일부 실시형태에서: V1A는 VH이고, V1B는 VL이며; 그리고 V2A는 VH이고, V2B는 VL이다.
폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)의 일부 실시형태에서: V1A는 VL이고, V1B는 VH이며; 그리고 V2A는 VH이고, V2B는 VL이다.
폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)의 일부 실시형태에서: V1A는 VH이고, V1B는 VL이며; 그리고 V2A는 VL이고, V2B는 VH이다.
폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)의 일부 실시형태에서: V1A는 VL이고, V1B는 VH이며; 그리고 V2A는 VL이고, V2B는 VH이다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서, V1A는 VL1이고, V1B는 VH1이며; V2A는 VH2이고, V2B는 VL2이다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서, V1A는 VL1이고, V1B는 VH1이다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서, V2A는 VH2이고, V2B는 VL2이다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은,
C1B가 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1)이며;
C2A가 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1)이고;
CL이 면역글로불린 카파 경쇄 불변 도메인(Cκ)에 상응하며;
(CH2-CH3)A가 서열번호 69의 아미노산 서열에 상응하고;
(CH2-CH3)B가 서열번호 70의 아미노산 서열에 상응하며;
L2 또는 힌지1이 서열번호 74의 아미노산 서열에 상응하고;
L3 또는 힌지2가 서열번호 75의 아미노산 서열에 상응하며;
L4 또는 힌지3이 서열번호 77의 아미노산 서열에 상응하고;
L1이 서열번호 76의 아미노산 서열에 상응하는
것을 특징으로 한다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은,
C1B가 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1)이며;
C2A가 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1)이고;
CL이 면역글로불린 카파 경쇄 불변 도메인(Cκ)에 상응하며;
(CH2-CH3)A가 서열번호 69의 아미노산 서열에 상응하고;
(CH2-CH3)B가 서열번호 70의 아미노산 서열에 상응하며;
힌지1이 서열번호 74의 아미노산 서열에 상응하고;
힌지2가 서열번호 75의 아미노산 서열에 상응하며;
힌지3이 서열번호 77의 아미노산 서열에 상응하고;
L1이 서열번호 76의 아미노산 서열에 상응하는
것을 특징으로 한다.
결합 단백질의 일부 실시 형태에서:
(a) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(b) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; VL2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(c) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(d) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(e) VH1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(f) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(g) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(h) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(i) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(j) VH1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서:
(a) VH1 및 VL1은 각각 서열번호 41 및 43의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 42 및 44의 아미노산 서열에 상응하고;
그리고/또는
(b) VH2 및 VL2는
각각 서열번호 45 및 53의 아미노산 서열;
각각 서열번호 46 및 54의 아미노산 서열;
각각 서열번호 47 및 55의 아미노산 서열;
각각 서열번호 48 및 56의 아미노산 서열;
각각 서열번호 49 및 57의 아미노산 서열;
각각 서열번호 50 및 58의 아미노산 서열;
각각 서열번호 51 및 59의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 52 및 60의 아미노산 서열에 상응한다.
결합 단백질의 일부 실시 형태에서:
(a)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하며;
(b)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하며;
(c)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하며;
(d)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며;
(e)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하며;
(f)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하며;
(g)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하며;
(h)
VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하며;
(i)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하며;
(j)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하며;
(k)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하며;
(l)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며;
(m)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하며;
(n)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하며;
(o)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하며;
(p)
VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 적어도 1개의 디설파이드 브리지에 의해 연결된 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
결합 단백질의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은: 폴리펩타이드 쇄 (I)가 폴리펩타이드 쇄 (II)에 공유적으로 연결되고, 특히 1개 이상의 디설파이드 결합에 의해 폴리펩타이드 (II)에 공유적으로 연결되는 것을 특징으로 한다.
결합 단백질의 해당 특정 실시형태 중 일부에 따르면, 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은, 폴리펩타이드 쇄 (II)가 1개 이상의 디설파이드 결합에 의해 폴리펩타이드 쇄 (III)에 공유적으로 연결되는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄 (I) 및 (II)는 C1A와 힌지2 사이에 적어도 1개의 디설파이드 브리지에 의해 연결되고/되거나 폴리펩타이드 쇄 (II) 및 (III)은 힌지3과 C2B 사이에 적어도 1개의 디설파이드 브리지에 의해 연결된다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 Fc 영역 또는 이의 변이체(예를 들어, (CH2-CH3)A 또는 (CH2-CH3)B 또는 힌지1 - (CH2-CH3)A 또는 힌지2 - (CH2-CH3)B)가 EU 넘버링에 따른 잔기 N297에서 N-연결 글리코실화를 갖는 CH2 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 EU 넘버링에 따른 Fc 영역 또는 이의 변이체의 잔기 N297이 N-연결 글리코실화를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 모든 또는 일부의 Fc 영역 또는 이의 변이체가 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 결합 단백질은 모든 또는 일부의 Fc 영역 또는 이의 변이체가 인간 CD16A(FcγRIII) 폴리펩타이드에 결합하는 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 결합 단백질은,
- 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체; 또는
- 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체; 및/또는
- 서열번호 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 62 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 63 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체
를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 결합 단백질은,
- 아미노산 서열 서열번호 61을 포함하는 폴리펩타이드, 아미노산 서열 서열번호 62를 포함하는 폴리펩타이드 및 아미노산 서열 서열번호 63을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체; 또는
- 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체
를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (I), 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (II) 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (III)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 결합 단백질은,
- 서열번호 61의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (I);
- 서열번호 62의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (II); 및
- 서열번호 63의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (III)
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (I), 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (II) 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (III)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 결합 단백질은,
- 서열번호 64의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (I);
- 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (II); 및
- 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (III)
을 포함한다.
해당 실시형태의 일부 변이체에서, 결합 단백질은 면역글로불린 쇄(특히 IgG 유형의 면역글로불린)으로부터 유래된 폴리펩타이드 서열, 및/또는 서열번호 1 내지 서열번호 79 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 따라서 이들은 보존적 치환을 갖는 임의의 변이체 서열 및/또는 참조 서열과 서열 동일성 백분율 정도를 갖는 임의의 변이체; 특히 면역글로불린 쇄로부터 유래된 참조 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 IgG 유형의, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유형의, 바람직하게는 IgG1 유형의 면역글로불린 쇄로부터 유래된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
Fc 및 불변 영역의 변이체 및 가변 영역으로부터의 비-CDR 폴리펩타이드 서열이 본 명세서에서 고려될 때, 이들은 Fc 및 불변 영역, 및 참조 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고; 더 구체적으로는 참조 폴리펩타이드 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖고; 바람직하게는 참조 폴리펩타이드 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 비-CDR 폴리펩타이드 서열로 이루어질 수 있다.
대안적으로, 폴리펩타이드 서열의 변이체가 CDR 폴리펩타이드 서열(예를 들어, VH 또는 VL 도메인 중 하나로부터의 CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함할 때, 해당 변이체가 이들의 CDR 폴리펩타이드 서열에 대해 변형을 갖지 않는다는 것으로 이해될 것이다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 67 내지 73으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 67 내지 73으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 67 내지 73으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 69 내지 73으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 69 내지 73으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 69 내지 73으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 69 또는 70으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 CH2-CH3 도메인을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하고; 또는 대안적으로, 결합 단백질은 서열번호 71로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 CH2 도메인을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하고; 또는 대안적으로, 결합 단백질은 서열번호 72 또는 73으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 69 또는 70으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 CH2-CH3 도메인을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하고; 또는 대안적으로, 결합 단백질은 서열번호 71로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 CH2 도메인을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하고; 또는 대안적으로, 결합 단백질은 서열번호 72 또는 73으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 단백질은 서열번호 69 또는 70으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 CH2-CH3 도메인을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하고; 또는 대안적으로, 결합 단백질은 서열번호 71로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 CH2 도메인을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하고; 또는 대안적으로, 결합 단백질은 서열번호 72 또는 73으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 본 개시내용의 다중특이성 결합 단백질은 이중특이성 결합 단백질이다.
본 개시내용은 추가로 위에 정의된 결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은 결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이며, 상기 결합 단백질은,
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 결정화 단편(Fc) 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은 위에 정의된 결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이고, 상기 결합 단백질은 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
인간 Fc-γ 수용체에 대한 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체.
바람직하게는, 본 개시내용에 따른 결합 단백질, 및 이의 약제학적 조성물은 멸균이고 비경구 용도에 적합하다.
III.
의학적 적용분야
개시된 결합 단백질, 및 이의 조성물은 의약으로서 사용하기에 특히 적합하다. 이러한 의약의 제조를 위한 방법 및 용도는 본 명세서에 추가로 개시된다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은,
의약으로서 사용하기 위한, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 결정화 단편(Fc) 영역을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다.
이런 제3의 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
암의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 결정화 단편(Fc) 영역을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다.
이런 제3의 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
혈액암의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 결정화 단편(Fc) 영역을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다.
이런 제3의 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
골수 이형성 증후군(MDS) 또는 림프구 증식 장애의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 결정화 단편(Fc) 영역을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다.
이런 제3의 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 결정화 단편(Fc) 영역을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다.
이런 제3의 일반적 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
CD64-양성 및 CD64-음성 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 결정화 단편(Fc) 영역을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 의약으로서 사용하기 위한, 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 암의 치료 또는 예방을 위한 방법에서 사용하기 위한 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
이런 제3의 주요 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 혈액암의 치료 또는 예방을 위한 방법에서 사용하기 위한 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 아미노산 서열 서열번호 1 내지 3에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
이런 제3의 주요 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 골수 이형성 증후군(MDS) 또는 림프구 증식 장애의 치료 또는 예방을 위한 방법에서 사용하기 위한 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
이런 제3의 주요 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 또는 예방을 위한 방법에서 사용하기 위한 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 아미노산 서열 서열번호 7 내지 9에 상응하거나 또는 각각 아미노산 서열 서열번호 10 내지 12에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
이런 제3의 주요 대상의 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 CD64-양성 및 CD64-음성 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 또는 예방을 위한 방법에서 사용하기 위한 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i)
제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
본 개시내용은 추가로 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 의약으로서의 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 암의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 표면에서 CD123을 발현시키는 종양 세포를 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 표면에서 CD123 및 CD64를 발현시키는 종양 세포를 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 혈액암의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 표면에서 CD123을 발현시키는 종양 세포를 특징으로 하는 혈액암의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 표면에서 CD123 및 CD64를 발현시키는 종양 세포를 특징으로 하는 혈액암의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 골수 이형성 증후군(MDS) 또는 림프구 증식 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 개시내용은 추가로 CD64-양성 및 CD64-음성 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 위에 언급한 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
일 양상에서, 표면에서 CD123 및 CD64를 발현시키는 종양 세포를 특징으로 하는 암을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질을 이러한 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 표면에서 CD64를 발현시키는 종양 세포를 갖기 쉬운 개체에서 CD123-발현 종양(예를 들어, 혈액 악성종양, AML)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 개체에서 혈액 악성종양(예를 들어, AML)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 개체에서 혈액 악성종양(예를 들어, AML)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 개체로부터의 악성 세포(예를 들어, AML 세포)가 이들의 표면에서 CD64를 발현시키는지를 평가 또는 결정하는 단계; 및 (b) 개체가 표면에서(예를 들어, 사전 결정된 수준에서) CD64를 발현시키는 악성 세포(예를 들어, AML 세포)를 갖는 것으로 결정된다면, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 개체에서 악성 세포를 고갈시키고/시키거나 NK 세포-매개 세포독성을 CD64-발현 악성 세포(예를 들어, AML을 갖는 개체)에 보내는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질을 표면에서 CD64를 발현시키는 악성 세포(예를 들어, AML 세포)를 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, NK 세포가, CD123과 CD64를 둘 다 발현시키는 악성 세포를 제거하게 하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 악성 세포(예를 들어, AML 세포)를, NK 세포의 존재 하에서, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다.
악성 세포(예를 들어, AML 세포)에 의한, 예를 들어, 이들의 표면에서의, CD64의 발현을 평가하는 것은 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 개체로부터의, 예를 들어, 혈액 샘플 또는 적합한 생검으로부터의 생물학적 샘플이 얻어지고, 평가될 수 있으며, 종양 세포에서의 CD64의 발현은 면역조직화학(IHC) 분석, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석, 예를 들어, 정량적 FACS, ELISA, 면역블러팅(예를 들어, 웨스턴 블러팅, 도트 블러팅 또는 세포내 웨스턴 블러팅) 및 기타 면역분석과 같은 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 분석에서 사용하기 위한 항-CD64 항체는 당업계에서 입수 가능하다.
IV.
결합 단백질을 제조하기 위한 수단
시험관내에서 본 개시내용의 결합 단백질의 제조를 위한 수단은 본 명세서에 추가로 개시된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, " 본 개시내용의 결합 단백질 "은 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 다기능성 결합 단백질을 지칭하되, 제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고, 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하며, 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 특이적으로 결합한다. 또한 본 개시내용 전체적으로 기재되는 결합 단백질의 모든 특정 실시형태를 지칭한다.
더 구체적으로는, 제공된 수단은 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질의 제조를 지칭할 수 있되, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i)
상기 제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 핵산 분자를 포함하는 단리된 숙주에 관한 것이다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주에 관한 것이다.
특정 실시형태에 따르면, 세포는 진핵 세포, 특히 곤충 세포 또는 포유류 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 포유류 세포이고, 발현 벡터는 포유류 발현 벡터이다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용은, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a)
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), 및/또는 (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및/또는 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 하나 이상의 재조합 폴리펩타이드(들)를 발현시키는 데 적합한 조건 하에서 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계;
(b)
선택적으로 발현된 재조합 폴리펩타이드(들)를 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a)
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), 및 (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 하나 이상의 재조합 폴리펩타이드(들)를 발현시키는 데 적합한 조건 하에서 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계;
(b)
선택적으로 발현된 재조합 폴리펩타이드(들)를 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a) 복수의 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에서 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), 및 (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는, 단계;
(b)
선택적으로 발현된 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a) 복수의 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (ii) 서열번호 62 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (iii) 서열번호 63 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 단계;
(b)
선택적으로 발현된 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a) 복수의 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (ii) 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (iii) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 단계;
(b)
선택적으로 발현된 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a) 복수의 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 공동 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (ii) 서열번호 62 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (iii) 서열번호 63 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 단계;
(b)
선택적으로 공동 발현된 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a) 복수의 재조합 폴리펩타이드를 공동 발현시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (ii) 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (iii) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 단계;
(b)
선택적으로 발현된 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a) 복수의 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에서 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 제1 폴리펩타이드 쇄 (I), (ii) 제2 폴리펩타이드 쇄 (II), 및 (iii) 2개의 항원-결합 도메인(ABD), 즉, 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 1개의 ABD 및 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 1개의 다른 ABD를 형성하는, 제3 폴리펩타이드 (III)을 포함하고; 3개의 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은 하기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 단계:
(여기서:
V1A 및 V1B는 결합쌍 V1(VH1/VL1)을 형성하고;
V2A 및 V2B는 결합쌍 V2(VH2/VL2)를 형성하며;
C1A 및 C1B는 C1(CH1/CL)쌍을 형성하고, C2A 및 C2B는 C2(CH1/CL) 쌍을 형성하되, CH1은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1이고, CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
(CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 동일 또는 상이하고, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하며;
L1, L2, L3, L4는 동일 또는 상이할 수 있는 선택적인 독립적 아미노산 링커임);
(b)
선택적으로 발현된 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a) 복수의 재조합 폴리펩타이드를 공동 발현시키는 데 적합한 조건 하에서 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 제1 폴리펩타이드 쇄 (I), (ii) 제2 폴리펩타이드 쇄 (II), 및 (iii) 2개의 항원-결합 도메인(ABD), 즉, 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 1개의 ABD 및 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 1개의 다른 ABD를 형성하는, 제3 폴리펩타이드 (III)을 포함하고; 3개의 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)은 하기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 단계:
(여기서:
V1A 및 V1B는 결합쌍 V1(VH1/VL1)을 형성하고;
V2A 및 V2B는 결합쌍 V2(VH2/VL2)를 형성하며;
C1A 및 C1B는 C1(CH1/CL)쌍을 형성하고, C2A 및 C2B는 C2(CH1/CL) 쌍을 형성하되, CH1은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1이고, CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
(CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 동일 또는 상이하고, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하며;
L1, L2, L3, L4는 동일 또는 상이할 수 있는 선택적인 독립적 아미노산 링커임);
(b)
선택적으로 공동 발현된 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
따라서, 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다:
(a)
복수의 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄 (I), (ii) 서열번호 62 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄 (II), 및 (iii) 서열번호 63 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 (III)을 포함하는, 단계;
(b)
선택적으로 발현된 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 회수하는 단계.
따라서, 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a)
복수의 재조합 폴리펩타이드를 공동 발현시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄 (I), (ii) 서열번호 62 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄 (II), 및 (iii) 서열번호 63 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 (III)을 포함하는, 단계;
(b)
선택적으로 공동 발현된 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 결합 단백질, 예컨대, 위에 정의된 것의 제조 방법은 숙주 세포(들)에 상기 모든 또는 일부의 결합 단백질(들)을 암호화하는 핵산, 특히 단리된 핵산(즉, 재조합 핵산)을 제공하는 사전 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특히, 이러한 단계는 숙주 세포(들)를 상기 모든 또는 일부의 결합 단백질(들)을 암호화하는 핵산, 특히 단리된 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하거나, 이것으로 이루어질 수 있다.
따라서, 일부 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용은,
(a)
숙주 세포(들)에 상기 모든 또는 일부의 결합 단백질(들)을 암호화하는 핵산을 제공하는 단계;
(b)
(i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), 및/또는 (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및/또는 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 하나 이상의 재조합 폴리펩타이드(들)를 발현시키는 데 적합한 조건 하에서 상기 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계;
(c)
선택적으로 발현된 재조합 폴리펩타이드(들)를 회수하는 단계
를 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 결합 단백질의 제조 방법은,
(a)
제1 폴리펩타이드 쇄 (I), 제2 폴리펩타이드 쇄 (II) 및 제3 폴리펩타이드 쇄 (III)를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들)을 제공하는 단계;
(b)
숙주 세포(들)를 하나 이상의 핵산(들)으로 형질감염시키는 단계;
(c)
상기 폴리펩타이드 쇄(들)를 발현(또는 공동 발현)시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계; 및
(d)
선택적으로 발현된(또는 공동 발현된) 폴리펩타이드 쇄(들) (I), (II) 및 (III)을 회수하는 단계
를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 결합 단백질의 제조 방법은,
(a) 서열번호 61 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄 (I), 서열번호 62 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄 (II) 및 서열번호 63 또는 66의 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드 쇄 (III)를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들)을 제공하는 단계;
(b)
숙주 세포(들)를 하나 이상의 핵산(들)으로 형질감염시키는 단계;
(c)
상기 폴리펩타이드 쇄(들)를 발현(또는 공동 발현)시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계; 및
(d)
선택적으로 발현된(또는 공동 발현된) 폴리펩타이드 쇄(들) (I), (II) 및 (III)을 회수하는 단계
를 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 결합 단백질의 제조 방법은,
(a) 서열번호 61 또는 64의 아미노산 서열 중 어느 것에 따른 제1 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 제1 핵산, 서열번호 62 또는 65의 아미노산 서열 중 어느 것에 따른 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산, 및 서열번호 63 또는 66의 아미노산 서열 중 어느 것에 따른 제3 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 제3 핵산을 제공하는 단계; 및
(b)
하나 이상의 숙주 세포(들)에서 상기 제1, 제2 및 제3 핵산을 발현시켜 각각 상기 제1, 제2 및 제3 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질을 생성하는 단계;
(c)
선택적으로 생성된 단백질을 친화도 정제 지지체, 선택적으로 단백질-A 지지체 상에 로딩하고, 결합 단백질을 회수하는 단계
를 포함한다.
따라서 당업자는 본 개시내용의 결합 단백질의 이러한 제조 방법이 시험관내 생산 방법의 일부로서, 하나 이상의 숙주 세포(들) 내에서 위에 언급한 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 쇄 및/또는 영역(예를 들어, 가변 영역 및 Fc 영역 또는 이들의 변이체)의 일부 또는 모두의 생산 및 조립체를 포괄할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다.
대안적으로, 상기 방법은 하나 이상의 숙주 세포(들) 내에서의 위에 언급한 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 쇄 및/또는 영역의 일부 또는 모두의 생산, 및 숙주 세포(들) 외부의 이들의 조립을 포괄할 수 있다. 따라서 상기 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 쇄 및/또는 영역과 접촉시키는 단계는 동시에 또는 순차적으로 달성될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 상기 영역 중 하나 이상은 별개의 폴리펩타이드 쇄(들) 또는 이의 단편에 존재할 수 있다.
참고로, 본 명세서에서 실시예 부문에 기재된 결합 단백질의 " F25 " 형식은 4개의 예측된 쇄간 디설파이드 브리지를 갖는다:
-
폴리펩타이드 (I)의 CL 도메인 내의 시스테인을 폴리펩타이드 쇄 (II)의 힌지 영역 내의 제1 시스테인에 연결하는 1개의 디설파이드 브리지;
-
폴리펩타이드 쇄 (I) 및 (II)의 힌지 영역 내의 2개의 시스테인을 연결하는 2개의 디설파이드 브리지;
-
폴리펩타이드 쇄 (III)의 CL 도메인에서 C-말단의 시스테인을 폴리펩타이드 쇄 (II) 상의 C-말단의 시스테인에 연결하는 1개의 디설파이드 브리지.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD)으로서, 상기 가변 영역은 서열번호 1 내지 12로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 1개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인, (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD)으로서, 상기 가변 영역은 서열번호 13 내지 40으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 1개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 제2 항원 결합 도메인, 그리고 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는, 특히 인간 CD16a Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 Fc 영역 또는 이의 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD)으로서, 상기 가변 영역은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 1개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 7 내지 12로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 1개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인, (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 적합한 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD)으로서, 상기 가변 영역은 서열번호 13 내지 26으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 1개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 27 내지 40으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 1개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인, 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는, 특히 인간 CD16a Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD)으로서, 상기 가변 영역은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 2개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 7 내지 12로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 2개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인, (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD)으로서, 상기 가변 영역은 서열번호 13 내지 26으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 2개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 27 내지 40으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 적어도 2개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인, 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는, 특히 인간 CD16 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은, (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD)으로서, 상기 가변 영역은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 7 내지 12로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 제1 항원-결합 도메인, (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD)으로서, 상기 가변 영역은 서열번호 13 내지 26으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 27 내지 40으로 이루어진 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 제2 항원-결합 도메인, 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는, 특히 인간 CD16 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 개시내용과 관련된 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 인간 CD123 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 도메인(ABD), (ii) 인간 NKp46 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 적합한 가변 영역을 포함하는 제2 항원-결합 도메인(ABD), 및 (iii) 인간 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는, 특히 인간 CD16 Fc-γ 수용체 폴리펩타이드에 결합하는 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 개시내용과 관련된 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이며; 상기 영역과 접촉시키는 단계는 아미노산 서열 서열번호 61 내지 66으로부터 선택된 복수의 폴리펩타이드 쇄와 접촉시키는 것을 특징으로 한다.
모든 또는 일부의 위에 언급한 항원-결합 도메인(들) 및 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 단리된 세포 또는 세포 집단에서, 특히 진핵 세포에서, 바람직하게는 포유류 또는 곤충 세포에서 재조합 수단을 통해 시험관내에서 발현될 수 있다. 가장 바람직하게는, 발현 시스템은 포유류 세포에 관한 것이다.
대안의 실시형태에 따르면, 위에 언급한 항원-결합 도메인(들) 및 Fc 영역 또는 이의 변이체의 일부는 단리된 세포의 제1 집단에서 발현될 수 있는 반면, 위에 언급한 항원-결합 도메인(들) 및 Fc 영역 또는 이의 변이체의 다른 일부는 단리된 세포의 제2 집단에서 발현될 수 있다.
대안의 실시형태에 따르면, 위에 언급한 항원-결합 도메인(들) 및 모든 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체의 부분은 단리된 세포의 동일한 집단에서 발현될 수 있고, 이어서, 회수되어, 회수 단계 동안에 또는 회수 단계의 종료 시 접촉되게 된다.
따라서, 결합 단백질의 제조 방법은,
(a)
단리된 세포 또는 세포 집단에서, 가장 바람직하게는 포유류 세포에서 상기 제1 항원-결합 도메인 및/또는 상기 제2 항원-결합 도메인 및/또는 상기 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체 중 적어도 하나를 발현시키는 단계;
(b)
상기 제1 항원-결합 도메인 및/또는 상기 제2 항원-결합 도메인 및/또는 상기 모든 또는 일부의 영역 또는 이의 변이체를 회수하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 바람직한 실시형태 중 하나에 따르면, 본 개시내용은,
(a)
단리된 세포 또는 세포 집단에서, 가장 바람직하게는 포유류 세포에서 상기 제1 항원-결합 도메인 및/또는 상기 제2 항원-결합 도메인 및/또는 상기 모든 또는 일부의 Fc 영역 또는 이의 변이체 중 적어도 하나를 발현시키는 단계;
(b)
상기 제1 항원-결합 도메인 및/또는 상기 제2 항원-결합 도메인 및/또는 상기 모든 또는 일부의 영역 또는 이의 변이체를 회수하는 단계;
(c)
상기 제1 항원-결합 도메인 및/또는 상기 제2 항원-결합 도메인 및/또는 상기 모든 또는 일부의 Fc 영역 또는 이의 변이체를 접촉시키는 단계(단계 (b)와 단계 (c)는 동시에 또는 순차적으로 달성됨)
를 포함하는 본 개시내용과 관련된 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 결합 단백질의 제조 방법은,
(a)
단리된 세포에서 상기 제1 항원-결합 도메인 및 상기 제2 항원-결합 도메인 및 상기 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 발현시키는 단계;
(b)
상기 제1 항원-결합 도메인 및 상기 제2 항원-결합 도메인 및 상기 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 회수하는 단계;
(c)
상기 제1 항원-결합 도메인 및 상기 제2 항원-결합 도메인 및 상기 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 접촉시키는 단계(단계 (b)와 단계 (c)는 동시에 또는 순차적으로 달성됨)
를 포함한다.
유리하게는, 상기 제1 항원-결합 도메인 및 상기 제2 항원-결합 도메인 및 상기 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체가 동일한 단리된 세포 또는 세포 집단 및/또는 이의 동일한 세포 배양물에서 발현될 때, 이들은 회수 단계 동안 접촉되어, 결합 단백질을 제조한다.
대안적으로, 상기 제1 항원-결합 도메인 및/또는 상기 제2 항원-결합 도메인 및/또는 상기 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체가 상이한 단리된 세포 또는 세포 집단에서 발현될 때, 이들은 회수 단계 후에 접촉될 수 있다.
회수하는 단계는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 이루어질 수 있다. 비포괄적 방식으로, 모든 또는 일부의 항원-결합 도메인(들) 및 Fc 영역 또는 이의 변이체(예를 들어, 발현된 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄(들))를 보유하는 발현된 폴리펩타이드의 회수는 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
(b1) 단리된 세포 또는 이의 세포 배양물을 회수하는 단계,
(b2) 선택적으로 단리된 세포 또는 이의 세포 배양물을 원심분리, 심층여과, 막 여과, 한외여과 및/또는 정용여과시키는 단계.
서열목록
본 명세서에서 사용되는 폴리펩타이드 표기법에서, 표준 용법 및 관례에 따르면 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향("N 말단의" 또는 "N-말단")이며, 오른쪽 방향은 카복실 말단 방향("C 말단의" 또는 "C-말단")이다.
실시예
물질 및 방법
A.1. EXPI-293F™ 세포의 일시적 형질감염에 의한 NKp46-CD123 NKCE 발현.
본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 각각의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 서열을 pTT-5 벡터 내로 HindIII과 BamHI 제한 부위 사이에 삽입하였다. 3개의 벡터(무 내독소(endotoxin-free) 미디프렙(midiprep)으로 제조함)를 사용하여 PEI(37℃, 5% CO2, 150 rpm)의 존재 하에서 EXPI-293F 세포(Life Technologies)를 공동형질감염시켰다. 세포를 사용하여 ㎖당 1×106개 세포의 밀도로 배양 플라스크(EXPI293 배지, Gibco)를 파종하였다. 참조로서, NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 경우에, 본 발명자들은 0.1 ㎍/㎖(폴리펩타이드 쇄 I), 0.4 ㎍/㎖(폴리펩타이드 쇄 II) 또는 0.8 ㎍/㎖(폴리펩타이드 쇄 III)의 DNA 비를 사용하였다. 발프론산(최종 농도 0.5 mM), 글루코스(4 g/ℓ) 및 트립톤 N1(0.5%)을 첨가하였다. 0.22 ㎛ 기공을 갖는 Stericup 필터를 통해 통과시키고 6일 후에 상청액을 채취하였다.
A.2. NKCE의 정제.
본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질은, rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare, 참조 17-1279-03)를 이용한 채취 후 상청액으로부터 정제하였다. 이어서, Na2HPO4/KH2PO4 50 mM pH 6.2 인산염 완충제 중 샘플의 투석 후 양이온 교환 크로마토그래피(CIEX) 정제를 수행하였다. GE Healthcare의 2개의 직렬 연결된 HiTrap SP-HP 1 ㎖ 칼럼(참조 17-1151-01)에 주입하기 전에, 샘플을 0.22 ㎛ 장치에서 여과시켰다. 시작 및 용리 완충제는 각각 Na2HPO4/KH2PO4 50 mM pH 6.2 및 Na2HPO4/KH2PO4 25 mM pH 6.2; 1 M NaCl이었다. 100 CV 상의 0% 내지 50%의 선형 구배(용리 완충제)를 이용하여 용리를 수행하였다. 관심 피크를 최종적으로 PBS1X에 대해, 밤새 4℃에서 교반 하에 투석시켰다.
A.3. 생물학적 샘플
건강한 인간 버피 코트는 Etablissement du Sang(EFS, Marseille; AC-2019-3428)에 의해 제공되었다. Ficoll 밀도 구배 원심분리를 이용함으로써 버피 코트로부터 말초 단핵 세포(PBMC)를 단리시켰다. StemCell 또는 Miltenyi로부터 비드-기반 음성 선택 키트를 이용함으로써 PBMC로부터 인간 NK 세포를 정제하였다.
환자로부터의 급성 골수성 백혈병(AML) 샘플은 Institut Paoli-Calmettes(Marseille, SA-IPH-MImAbs Contract)에 의해 제공된다.
A.4. 세포주
CD123 발현 급성 골수성 백혈병(AML) 세포주: MOLM-13 및 THP-1을 ATCC에서 구입하였다. 세포를 완전 RPMI 배지(10% FBS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨 및 비-필수 아미노산 1×를 함유하는 RPMI-1640)에서 배양시켰다. 25 mM HEPES를 THP-1 세포에 대한 배양 배지에 첨가하였다.
CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제를 이용하여 THP-1 CD64KO 및 THP-1 CD32KO 세포를 생성하였다. RPMI-1640, 10%SVF, 2 mM L-Glu, 1 mM 피루브산나트륨, 0.1 mM 비필수 아미노산에서 THP-1 세포를 배양하였다. CD64 결핍 THP-1 세포를 생성하기 위해, 2,5.106개의 세포를 1:9의 CAS9:sgRNA 비(Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, Integrated DNA Technology)로 2개의 sgRNA(CD64.1: CUUGAGGUGUCAUGCGUGGA (서열번호 80); CD64.2: AAGCAUCGCUACACAUCAGC (서열번호 81; Synthego)를 이용하여 뉴클레오펙션시켰다(Neon Transfection System, 100 ㎕ 팁, 1700V, 20ms, 1 펄스). 유세포 분석기에 의해 CD64 발현의 결여를 모니터링하였고, 세포를 분류하거나 서브클로닝하였다.
CD32-넉아웃(KO) THP-1 세포를 생성하기 위해, 2.5.106개의 세포를 1:9의 CAS9:sgRNA 비(Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, Integrated DNA Technology)로 두서너 개의 sgRNA(CD32A: AUGUAUGUCCCAGAAACCUG ; CD32B: AAGCAUAUGACCCCAAGGCU (Integrated DNA Technologies))로 뉴클레오펙션시켰다(Neon Transfection System, 100 ㎕ 팁, 1700 V, 20 ㎳, 1 펄스). THP-1 CD32KO 세포를 단독으로 세포 분류하였다. 세포 분류 후에, CD32 발현의 부재를 유세포 분석기에 의해 모니터링하였다.
A.5. NK 세포-기반 세포독성 분석
환자 샘플로부터의 AML 아세포에 대해 51Cr(MOLM-13, THP-1 또는 THP-1 CD64KO, THP-1 CD32KO 세포의 경우) 또는 CalceinAM(Life technologies, 참조: C3100MP 또는 등가물)를 표적 세포에 로딩하였다. 시험한 항체, 표지된 표적 세포 및 건강한 공여자로부터의 신선한 또는 밤새 휴지된 인간 NK 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰에 연속해서 첨가하여 10:1(E:T) 비를 얻었다. 4시간의 공동 인큐베이션 후에, 상청액을 (51Cr의 경우) 루마플레이트(Lumaplate)에 또는 (CalceinAM의 경우) 편평 바닥 배양 플레이트에 전달하였다.
51Cr-기반 세포독성 분석의 경우, TopCount NXT™(Microplate Scintillation and Luminescence Counter; Perkin Elmer)를 이용하여 사멸 표적 세포로부터 방출된 51Cr을 투여하였다. 각 웰에 대해 60초 동안 γ-방출을 계수함으로써 방사능을 측정하였고, 이들 결과를 cpm(= 분당계수)으로 표현하였다.
칼세인(Calcein)-기반 세포독성 분석의 경우, 루미노터(Luminoter)(EnSpire® Multimode Plate Reader(Perkinelmer): λ = 495 ㎚에서 여기 후 λ = 516 ㎚에서 형광 방출)를 이용하여 상대 형광 단위(RFU)를 측정함으로써 사멸 표적 세포로부터 방출된 CalceinAM을 투여하였다.
분석의 경우, 하기 식을 이용하여 비용해(specific lysis) 백분율을 계산하였다:
Graphpad Prism 소프트웨어를 이용함으로써 적절한 비선형 회귀 곡선("반응에 대한 log(작용제) - 가변 기울기(4모수)" 모델의 선택)을 도출하여 각 항체의 EC50을 결정한다.
표현형 AML 세포
환자 혈액으로부터 유래된 AML 샘플 상에서의 그리고 AML 세포주 상에서의 CD32, CD64 및 CD123의 발현을 항-인간 CD33-BB515(BD Biosciences 564588 클론 WM53), 항-인간 CD45-Viogreen(Miltenyi 130-096-906 클론 5B1), 항-인간 CD123-AF647(BD Biosciences 563599 클론 9F5), 항-인간 CD32-PE(Beckman Coulter IM1935 클론 2E1), 항-인간 CD64-PE(Beckman Coulter IM3601U 클론 22), 항-인간 CD123-PE(Biolegend 306006 클론 6H6), 및 동족 아이소타입 대조군 항체 mIgG1-PE(IC-1; BD Biosciences 555749 클론 MOPC-21) 및 mIgG2a-PE(IC-2a; Beckman Coulter A09142 클론 7T4-1F5)를 이용하여 유세포 분석기에 의해 제어하였다. 염색 완충제(SB) 중 1/10e로 희석시킨 정상 마우스 혈청으로 표적 세포를 포화시켰고, 이어서, 염료와 결합시킨 항체와 혼합하였다. 염색 후 30분 동안 H2O 중 1/10e로 희석시킨 BD Cellfix에서 세포를 고정하고, FACS Canto II를 이용하는 유세포분석기에 의해 분석하였다. (환자 혈액으로부터 유래된 AML 샘플의 경우) FSC-A, FSC-H, SSC-A, SSC-H, FL2-A, FL4-A 및 FL7-A 또는 FSC-A, FSC-H, SSC-A, SSC-H, FL1-A, FL2-A, FL3-A, FL5-A 및 FL8-A 파라미터를 기록하고, FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석을 행하였다. 표현형 결과를 도 6a, 도 6b 및 도 14b에 나타낸다.
A.6. AML 샘플을 이용하는 NK 세포 탈과립 분석
도 7에서와 같이 NK 세포 활성화를 시험하기 위해, 항체, AML 환자로부터의 AML 아세포 및 자가(autologous) NK 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰에 연속해서 첨가하였다. 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질과 함께 밤새 공동인큐베이션시킨 후에, 항-인간 CD107a 및 CD107b 항체를 각 웰에서 4시간 동안 첨가하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 다음의 혼합물로 염색하였다: 생존도 마커, APC-결합 항-인간 CD45, BB515-결합 항-인간 CD33, PeCy7-결합 항-인간 CD56, BV510-결합 항-인간 CD3 항체. 이어서, 세포를 세척하고, 고정시키고, 유세포 분석기에 의해 분석하였다. Flowjo 소프트웨어를 이용함으로써 얻어진 데이터를 분석하여 살아있는 CD45+CD33-CD56+CD3- 세포로서 확인되는 NK 세포 상에서의 CD107의 발현을 통해 NK 세포 탈과립을 분석하였다.
도 17에서와 같이 NKp46-CD123_F25 결합 단백질을 통해 MOLM-13 세포로 향하는 NK 세포 활성화 및 사이토카인/케모카인 생산을 시험하기 위해, 다음의 항체 마커를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다: CD69, CD107a/b, IFNα, TNFα, MIP1β.
첫째로, 3명의 별도의 공여자로부터의 정제된 1차 인간 NK 세포를 증가된 농도의 NKp46-CD123_F25 또는 대조군(NKp46-IC_F25, 및 항체 없음)의 존재 하에서 4시간 동안 37℃에서 MOLM-13 세포와 1:1 비로(50,000개 세포/웰로 파종; U 바닥 96-웰 플레이트) 또는 이것 없이 공동 배양시켰다. 동시에, BD GolgiSTOP™를 각 웰에서 1/6000의 최종 희석으로 실험 샘플과 대조군 샘플 둘 다에 첨가하였다. 웰에 따라 50,000개의 휴지 NK 세포에 첨가한 최종 125 ng/㎖의 PMA 및 최종 1㎍/㎖의 IONO를 이용함으로써 NK 세포 활성화의 양성 대조군을 수행하였다(데이터 미제시).
4시간의 인큐베이션 후에, 세포를 염색 완충제(0.2% BSA, 2 mM EDTA, 및 0.02% 아자이드나트륨이 있는 PBS)로 세척하고, 제조업자의 권장 인큐베이션 및 희석 비에 따라 다음의 세포외 항체 혼합물로 염색하였다: 항-인간 CD3-Pacific Blue, 항-인간 CD56-Pe-Vio770, 항-인간 CD69-FITC, 항-인간 CD107a(LAMP-1)-APC, 항-인간 CD107b-APC. 고정 및 투과 단계 후에, 다음의 세포내 항체 혼합물: 항-인간 IFNγ-BV605, 항-인간 TNFα-BUV395 및 항-인간 MIP1β-PE를 이용하여 세포내 염색을 수행하였다. 응집물을 제거하기 위해, 항체 혼합물을 16,000 g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리시키고, 세척하고 나서, 샘플 완충제 중에서 재현탁시켰다.
FSC-A, FSC-H, SSC-A, SSC-H, FL-1, FL-3, FL-6, FL-7, FL-9, FL-13 및 FL-16 모수를 측정하는 BD FACSDiva 획득 소프트웨어를 구비한 LSR Fortessa™ X-20 상에서 유세포분석을 수행하였다. FlowJo 소프트웨어를 이용하여 모든 데이터를 분석하였다.
GraphPad prism을 이용하여 NK 세포 샘플의 마커 백분율을 행하였다. 활성화 값의 상단은 관측된 최대 활성화에 상응하였다. 다음의 식에 상응하는 4모수 로지스틱 선형 회귀 모델을 이용하여 절반 최대 유효 농도(EC50) 값을 계산하였다:
EC50과 동일한 모델을 이용하여 활성화의 계산된 하단, 활성화의 계산된 상단, 기울기 및 95% 신뢰구간(CI) 값을 계산하였다.
각각의 활성화 마커(CD69, CD107a/b), 사이토카인(IFNα, TNFα) 및 케모카인(MIP1β)에 대해 이들 모수를 계산하였다.
A.7. 인간 재조합 단백질, 클로닝, 생산 및 정제(SPR)
인간 NKp46의 세포외 도메인(ECD)을 암호화하는 서열(Gln22-Asn255, NCBI 참조: NM_004829.5)을 LX192 벡터(Selexis) 내로 HindIII과 XbaI 제한 부위 사이에 삽입하였다. 정제를 위해 C-말단의 6xHis 태그를 첨가하였다. 인간 PBMC에 대한 PCR을 위해 다음의 프라이머를 사용하였다: 5' TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGTCTTCCACACTCCCTGC 3' 및 5' CCGCCCCGACTCTAGATCAATGGTGATGGTGGTGATGATTCTGGGCAGTGTGATCCC 3'. 앰플리콘의 서열을 확인하였다. 이어서, 벡터를 사용하여 CHO 세포주를 형질감염시키고, 단백질을 생성하는 클론을 선택하였다. Ni-NTA 비드(Qiagen, #1018244)를 이용하여 배양물 상청액으로부터 단백질을 정제하였고, 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용하는 결합 동력학의 특성규명 전에 응집물의 제거를 확인하기 위해 S200 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 재조합 인간 NKp46-유래 폴리펩타이드 서열을 본 명세서에서 서열번호 84로서 보고하며; 이는 NKp46의 세포외 도메인의 일부를 포함한다.
사이노몰거스 NKp46(Gln17-Asn254, NP_001271509.1)의 ECD를 암호화하는 서열을 SLX192 벡터 내 HindIII 내지 XbaI 제한 부위에 클로닝하였다. 정제를 위해 C-말단의 Flag-M2 태그를 첨가하였다. 사이노몰거스 PBMC로부터의 예측 서열을 증폭시키기 위해 사용한 프라이머는 다음과 같다: 5' TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGTCTTCCACACTCCGTGC 3' 및 5' CCGCCCCGACTCTAGATCACTTGTCATCGTCATCTTTGTAATCATTCTGGGCAGTGTGGTCC 3'. 서열 확인 후에, 벡터를 사용하여 CHO-K1SV 세포주를 형질감염시키고, 생성 세포 클론을 선택하였다. 재조합 사이노몰거스 NKp46-FlagM2 단백질 서열을 본 명세서에서 서열번호 85로서 보고하고; 이는 NKp46의 세포외 도메인 일부(GenBank number: CAC41080.1)를 포함한다. 처음 3개의 배치(batch)(150602CCe 배치 1, 150618CCe 배치 2 및 150715CCe 배치 3)를 M2 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 비드를 재조합 단백질을 함유하는 상청액과 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서, 비드를 PBS1X로 세척하고, PBS1X 중 150 ng/㎕의 용리 펩타이드로 용리를 수행한다. 이어서, 단백질을 PBS1X에 대해 투석한다. 다음 배치(161003CDe 배치 1 및 161116CDe 배치 2)를 제조업자의 지침(GE Healthcare, #20381, 배치 QB213815)에 따라 AminoLink Coupling Resin에 항-NKp46 항체 HUX1-M-H46-17E1을 결합시킴으로써 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이어서, 비드를 재조합 단백질을 함유하는 상청액과 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서, 비드를 PBS1X로 세척하고, Glycine 0.1M pH2.5를 이용하여 용리를 수행한다. 이어서, 단백질을 TBS 완충제 pH 7.5에 대해 투석하고, 농축시켜 Superdex 200 Increase 10/300 GL 칼럼 상에서 분취 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.
ACRO Biosystems으로부터의 재조합 인간 CD123(카탈로그 번호 ILA-H52H6), 재조합 인간 Fc 감마 RIIIA/CD16a(V176)(Biotechne, 카탈로그 번호 4325-FC) 및 재조합 인간 Fc 감마 RIIIA/CD16a(V176F)(Biotechne, 카탈로그 번호 8894-FC)를 추가로 사용하였다.
A.8. 표면 플라스몬 공명에 의한 다중특이성 결합 단백질의 항원 결합 특성의 결정을 위한 분석 절차.
Series S CM5 센서 칩(Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 29149603)이 있는 Biacore T200 기기(Cytiva, 웁살라, 카탈로그 번호 28975001)를 사용하였다.
NKp46 및 CD123에 의한 결합 동력학 측정을 위해, 100 ㎖ 10x HBS-EP+ 완충제를 900 ㎖의 정제수와 혼합함으로써 HBS-EP+ 완충제(Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 BR1006-69)를 제조하였다. 인간 항체 포획 키트(Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 BR1008-39)를 이용하여 이중특이성 Ab 샘플의 친화도 포획을 달성하였다. 항-Fc 포획 항체를 실행 완충제 중에서 1:20으로 희석시키고, 표준 아민 결합을 이용하여 CM5 칩(Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 29149603)에 결합시켜, 아민 결합 키트(Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 BR-100-50)를 이용하여 대략 8000 반응 단위(RU)를 수득하였다. HBS-EP+ 분석 완충제 중 인간 NKp46(Innate Pharma) 또는 인간 CD123(ACRO Biosystems) 중 하나의 7개의 연속 1:1 희석물을 1.56 n㏖/ℓ, 3.13 n㏖/ℓ, 6.25 n㏖/ℓ, 12.5 n㏖/ℓ, 25 n㏖/ℓ, 50 n㏖/ℓ 및 100 n㏖/ℓ의 농도로 제조하였다. 이중특이성 항체를 HBS-EP+ 완충제를 이용하여 0.06 ㎍/㎖의 농도로 희석시키고, 실험에서 이 농도에서 사용하였다. 항체를 10 ㎕/분의 유속으로 90초 동안 포획하여 대략 30 RU의 최대 반응(Rmax) 값을 수득하였다. 항원 둘 다에 대한 다중주기 동력학 실험에서 측정을 수행하였다. 각각의 다중주기 실험에서, 시리즈 S CM5 센서 칩(인간 항체 포획 키트, Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 BR1008-39) 상에 고정시킨 항-인간 Fc 항체를 통해 항체를 포획하였다. HBS-EP+ 완충제에 희석시킨 인간 및 사이노몰거스 NKp46(Innate Pharma) 또는 인간 CD123(ACRO Biosystems)을 30 ㎕/분 유속에서 240초 동안 1.56 n㏖/ℓ에서 100 n㏖/ℓ까지의 1:1 연속 희석으로 주입한 후, 1200초의 해리 단계가 이어졌다. 모든 분석물 농도는 이중 참조를 위해 여러 완충제 블랭크와 함께 2회 중복하여 실행하였다. 60초 동안 30 ㎕/분에서 재생 용액(3 ㏖/ℓ MgCl2)을 이용하여 포획 표면의 재생을 수행하였다. 질량 수송 제한이 있는 1:1 결합 모델을 이용하여 모든 다른 항체에 대해 Biacore T200 평가 소프트웨어 버전 3.0(Cytiva, 웁살라)으로 결합 동력학 데이터를 평가하였다.
CD16a에 의한 결합 친화도 측정을 위해, 100 ㎖ 10x HBS-EP+ 완충제를 900 ㎖의 정제수와 혼합함으로써 HBS-EP+ 완충제(Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 BR1006-69)를 제조하였다. His 포획 키트(Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 28995056)를 이용하여 인간 CD16a 단백질의 친화도 포획을 달성하였다. 항-His 포획 항체를 실행 완충제 중 1:20으로 희석시키고, 표준 아민 결합을 이용하여 CM5 칩(Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 29149603)에 결합시켜, 아민 결합 키트(Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 BR-100-50)를 이용하여 대략 8000 반응 단위(RU)를 수득하였다. HBS-EP+ 분석 완충제 중 이중특이성 항체의 10개의 연속 1:1 희석물을 5.8 n㏖/ℓ, 11.7 n㏖/ℓ, 23.4 n㏖/ℓ, 46.8 n㏖/ℓ, 93.75 n㏖/ℓ, 187.5 n㏖/ℓ, 375 n㏖/ℓ, 750 n㏖/ℓ, 1500 n㏖/ℓ 및 3000 n㏖/ℓ의 농도로 제조하였다. CD16a(V/F) 단백질을 HBS-EP+ 완충제로 0.1 ng/㎖의 농도까지 희석시키고, 실험에서 이 농도에서 사용하였다. CD16a(V176) 및 CD16a(V176F)를 각각 유동 세포 2 및 4에 대해 30초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 포획하여 대략 30 RU의 최대 반응(Rmax) 값을 수득하였다. 다중주기 동력학 실험에서 측정을 수행하였다. 각각의 다중주기 실험에서, 시리즈 S CM5 센서 칩(인간 항체 포획 키트, Cytiva, 웁살라 소재, 카탈로그 번호 BR1008-39) 상에 고정시킨 항--His 항체를 통해 CD16a를 포획하였다. HBS-EP+ 완충제로 희석시킨 이중특이성 항체를 120초 동안 30 ㎕/분의 유속으로 5.8 n㏖/ℓ에서 3000 n㏖/ℓ까지의 1:1 연속 희석물에 주사한 후 120초의 해리 단계가 이어졌다. 모든 분석물 농도는 이중 참조를 위해 여러 완충제 블랭크와 함께 2회 중복하여 실행하였다. 30초 동안 30 ㎕/분에서 재생 용액(10 m㏖/ℓ 글리신 pH 1.5)의 2회 연속 주사로 포획 표면 상의 재생을 수행하였다. 측정된 항체 농도에 대한 SPR 반응의 정상상태 적합도를 이용하여 Biacore T200 평가 소프트웨어 버전 3.0(Cytiva, 웁살라)으로 인간 CD16a에 대한 이중특이성 항체의 결합 친화도(KD 값)를 평가하였다.
A.9. SCID 마우스에 주사한 MOLM-13 인간 AML에 대한 항-종양 활성.
파종성 인간 MOLM-13 세포를 접합시킨 중증 복합 면역결핍(SCID) 마우스에서 NKp46-CD123_F25의 muNKp46-huCD123_F25 뮤린 대리 버전의 효능을 평가하였다. 이런 대리는 NKp46 단백질을 표적화하는 아암에 대한 NKp46-CD123_F25와 상이하고(인간 단백질 대신에 뮤린 단백질을 표적화하기 때문), 다른 아암에 대한 NKp46-CD123_F25와 유사하다(모든 활성화 뮤린 FcγR에 결합하고, 뮤린 효과기 세포를 보충하며(recruit) 뮤린 NK 세포로 ADCC를 유도할 수 있는 인간 CD123 결합 아암 및 인간 IgG1 적격 Fc 도메인).
muNKp46-huCD123_F25 활성을 뮤린 FcγR에 결합하고 뮤린 효과기 세포를 보충할 수 있는 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1)와 비교하였다. muNKp46-huCD123_F25 활성을 또한 muNKp46 및 뮤린 FcγR의 아이소타입 대조군 결합과 비교하였지만 huCD123에 대한 결합(muNKp46-IC)과는 비교하지 않았다.
제0일에 마우스에 종양 세포(5×106개)를 정맥내로 접종하였다. 종양 이식 후 제1일에 복강내 경로에 의해 처리를 투여하였다.
첫 번째 실험에서(도 8), 마우스를 종양 이식 후 제1일에 4개 그룹(처리군에서 n=10마리 마우스 및 대조군에서 20마리 마우스)으로 무작위화하였다. muNKp46-huCD123_F25를 제1일에 비경구 투여 후 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏으로 투여하였다.
두 번째 실험에서(도 18), muNKp46-IC를 0.5 ㎎/㎏으로 투여하였다. muNKp46-huCD123_F25 및 참조-1을 5, 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏으로 투여하였다. 대조군을 비처리로 두었다.
세 번째 실험에서(도 19), 마우스를 4개의 그룹(비처리 대조군; 비처리 대조군 + 항-아시알로GM1; NKCE 대조군; 또는 NKCE + 항-아시알로GM1)으로 무작위화하였다. 종양 이식 전날(-제1일)뿐만 아니라 종양이식 후 제5일에, 실험 그룹은 NK 세포 고갈 항체, 항-아시알로 GM1을 투여 받았다. 처리(비히클 또는 NKCE)를 0.5 ㎎/㎏의 단일 용량으로 종양 이식 후 제1일에 복강내로 투여하였다. NKCE는 huCD123 및 뮤린 FcγR에 결합하지만 뮤린 NKp46(IC-huCD123)에는 결합하지 않는 아이소타입 대조군 항체인 Nkp46-CD123_F25, muNKp46-IC를 포함하였다.
마우스를 확인하고 임상적 부작용을 기록하였다. 실험이 종료(70일)될 때까지 개별 마우스의 체중을 매일 측정하였다. 동물의 고통을 피하기 위해 사전 정의된 기준에 따라 빈사 상태가 되었을 때 마우스를 안락사시켰다. 중요한 것으로 간주되는 병리와 관련된 임상 징후는 사지 마비, 복수, 만져질 수 있는 내부 종양 덩어리, 이환율 또는 20% 이상의 체중 감소이다.
1차 효능 종점은 일일 중앙값 생존 시간(MST), 증가된 수명 백분율(ILS%) 및 장기간 생존율이었다.
각 마우스의 개개 사망 일수를 (있는 경우) 보고하였다. 각 그룹에 대해 MST를 결정하였고, ILS 비를 계산하였고, 백분율로 표현하였다:
ILS% = 100×(T-C)/C
여기서, T = 처리군의 MST이고, C = 대조군의 MST임.
본 실시예의 목적을 위해, 용량은 ILS%가 25%보다 우수할 때 치료적으로 활성이고, ILS%가 50%보다 우수할 때 고도로 활성인 것으로 간주하였다(Johnson JI, Decker S, Zaharevitz D, Rubinstein LV, Venditti JM, Schepartz S, Kalyandrug S, et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. Cancer. 2001 May;84(10):1424-31).
장기간 생존율은 백분율로 표현되는 그룹 내 마우스의 총 수에 대해 대조군의 MST의 2배보다 우수하거나 동일한 생존 지속기간을 갖는 마우스의 수로서 정의한다.
A.10. 비-인간 영장류(NHP)에서의 항-종양 활성
정량화된 유세포 분석기 패널을 원숭이 사이노몰거스 혈액 샘플, 표현형 및 호염기구 및 총 CD123 면역 세포에서 평가하기 위해 사용하였다. 항원 CD45(클론 D058-1283), CD14(클론 REA599), CD203c(클론 NP4D6), CD193(클론 5E8), IgE(클론 REA1049), CD123(클론 CD123), CD33(클론 AC104.3E3) 및 생존도 마커 Zombie Nir(Biolegend 423106)에 대한 항체에 의해 패널을 구성하였다. 3K-EDTA 항응고 진공 샘플링에 수집한 100 ㎕의 전혈 샘플을 10분 동안 용리 용액(Biocytex CP025)과 함께 인큐베이션시킨 후에, 300 g, 실온에서 5분 동안 DPBS(Sigma D8537)와 함께 원심분리 단계가 이어졌다. 재현탁 세포를 10분 동안 실온에서 항체 및 생존도 마커로 염색하였다. 비고정 항체를 제거하기 위해 세 번째 원심분리 단계를 행하였다. 세포를 250 ㎕의 고정 용액(Biocytex CP026)에 재현탁시키고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 100 ㎕의 유동 계수 비드(Beckman A91346)를 세포관에 첨가하고, 3종의 레이저 및 10종의 색을 구비한 Gallios Beckman coulter 기기 상에서 획득하였다.
A.11. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD123+ 정상 혈액 세포 및 관련된 사이토카인 방출에 대한 시험과내 효과
인간 건강한 공여자(N=10)로부터의 PBMC를 190 ㎕ 완전 배양 배지(웰당 500,000개의 세포) 중 96-웰 U-바닥 플레이트(Ultra low binding Costar ref#CLS7007)에서 파종하였고, 37℃에서 5% CO2의 존재 하에 20시간 동안 CD123-NKCE, IC-NKCE 대조군 및 CD123-TCE 분자의 연속 희석물과 함께 인큐베이션시켰다. TCRαβ 음성, CD14 음성 및 IgE 수용체 양성 생세포로서 정의된 호염기구 집단을 유세포 분석기에 의해 분석하였고, 상청액에서 방출된 사이토카인 절대 농도를 중규모 디스커버리(meso scale discovery: MSD) 분석에 의해 분석하였다.
유세포 분석법-분석
세포 펠릿을 1 ㎕ FcR 차단 시약, 인간(Miltenyi Ref#130-059-901)으로 완성한 차가운 50 ㎕ 염색 완충제(AutoMACS Running Buffer Miltenyi Ref#130-091-221) 중에 현탁시켰다. PBMC 서브세트 특이적 표지 항체와 생존도 시약의 혼합물을 공급업자 권고에 따라 PBMC 현탁액에 첨가하였다. 형광 마이너스 원(Fluorescence Minus One: FMO) 대조군으로서, 각각의 표지 항체를 이에 상응하는 아이소타입 대조군으로 대체한 동일한 혼합물로 PBMC를 표지함으로써 추가 지점을 수행하였다. 항체와 혼합한 세포를 암실 내 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 300 g에서 5분 동안 4℃에서 2회 원심분리시켰고, 상청액을 버리고, 200 ㎕의 염색 완충제를 각 원심분리 사이에 첨가하였다. MACSQuant® Analyser, Miltenyi 유세포분석기를 이용하여 세포를 분석하였다. VenturiOne® 소프트웨어 (AppliedCytometry inc.)를 이용하여 유세포분석기로부터 내보낸 원시 데이터(fcs-파일)의 분석을 수행하였다. 집단을 전방 산란/측방 산란 점도표로부터 게이팅하고, 단세포 및 추가 생세포를 요오드화물 프로피듐 생존 음성 게이트에서 게이팅하였다. 게이트를 FMO 대조군에 따라 설정하였다.
사이토카인 MSD 분석
세포 상청액을 수집하고, 구매자 권고에 따라 MSD 완충제 중에서 희석시켰다. 희석시킨 샘플 또는 사전 희석시킨 다중-분석물 캘리브레이터 샘플을 키트에 공급된 사전 코팅 플레이트에서 첨가한다. 전자화학발광 표지(MSD 설포-태그)로 접합한 검출 항체의 용액을 첨가한 후에, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 전기화학발광(ECL)에 대한 적절한 화학 환경을 생성하는 MSD 완충제를 첨가하였고, 플레이트 전극에 인가된 전압이 포획 표지가 광을 방출하게 하는 MSD 기기에 플레이트를 로딩하였다. 기기는 방출광의 강도를 측정하고, 샘플 내 각 분석물의 정량적 척도를 제공한다.
MSD 기기로부터 내보낸 원데이터의 분석을 Excel 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. IL-6, IL-1b, IFNγ 및 TNFα의 농도는 1/Y2 가중치를 부여한 4-모수 로지스틱 모델을 이용하여 확립한 교정 곡선에 다시 적합화시킴으로써 ECL 신호로부터 결정한다.
A.12. 비-인간 영장류(NHP) 혈장에서의 사이토카인 방출 결정
중규모(MSD) 전염증 패널1(NHP) 키트(참조 K15056D)를 이용한 ECLIA(전기화학발광 분석) 방법을 개발하였고, 원숭이 K3-EDTA 혈장에서 IL-2, IFN-γ, IL-6 및 IL-10을 정량화하는 것으로 입증하였다. 이는 작동 전극 표면 상에 고정된 항-인간 IL-2, IL-6, IL10 및 IFN-γ 항체 및 루테늄 항-인간 IL-2, IL-6, IL-10 및 IFN-γ 항체를 이용한 정량적 샌드위치효소 면역분석이다. 50.0 ㎕의 희석 샘플을 인간 항-인간 IL-2, IL-6, IL-10 및 IFN-γ 항체로 코팅한 96 마이크로플레이트 웰에 제공하였다. 밤새 실온에서 인큐베이션 기간 및 3단계의 세척 후에, 25.0 ㎕의 설포태그 접합 항-인간 IL-2, IL-6, IL-10 및 IFN-γ 항체를 첨가하였다. 3단계의 세척 후에, 전기화학발광을 위한 적절한 화학 환경을 생성하는 150 ㎕의 판독 완충제(2X)를 첨가하였다. 기기는 방출광의 강도를 측정하여 샘플 내 분석물의 정량적 척도를 제공한다. 분석을 2회 중복해서 수행하였다.
비인간 영장류에서의 약물동력학 및 약력학 연구
비히클 중 저장 용액의 희석에 의해 투여를 위한 CD123-NKCE 용액을 즉석에서 제조하였고, 투여 전 및 투여 동안 실온에서 유지하였다. 흡착을 피하기 위해, 희석을 위한 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 또는 PETG 용기를 사용하였고, 이들 용기를 사용 전 100 ppm의 PS80을 함유하는 NaCl 0.9% 용액으로 코팅하였다. 각 정맥내 투약을 위해 사용한 튜빙(주사기/익상침)을 100 ppm의 PS80을 함유하는 NaCl 0.9% 용액으로 연속 플러싱에 의해 코팅하였다.
동물을 각각 0.1 ㎎/㎏/투여로 투약한 수컷에 대해 M1 및 M2, 0.1 ㎎/㎏/투여로 투약한 암컷에 대해 F3 및 F4, 3 ㎎/㎏/투여로 투약한 수컷에 대해 M5 및 M6, 및 0.1 ㎎/㎏/투여로 투약한 암컷에 대해 F7 및 F8로서 확인하였다. 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 투약을 수행하였다. 잠재적 지연 개시 독성 및/또는 잠재적 독성의 가역성을 마지막(4차) 투여 후 1주(제29일) 및 최대 4주(50일)에 평가하였다. M2, F4, M6 및 F8을 안락사시키고, 제29일에 부검하였다.
각 처리 동물에 대해 파라미터를 평가하였다:
- 혈액 중
시험 전(용량 전)
제1일 주입 개시 후 1.5, 5, 24, 72시간에
제8일 주입 개시 후 24시간에
제15일 주입 개시 후 1.5 및 24시간
제22일 주입 개시 후 24시간에
제29일(마지막 투여 후 1주; 모든 동물)
제50일(마지막 투여 후 4주; 회수 동물).
- 골수에서
시험 전(용량 전)
제9일
제29일(마지막 투여 후 1주; 모든 동물)
제50일(마지막 투여 후 4주; 회수 동물).
혈액 샘플(연속 샘플링)을 팔 또는 복재 정맥으로부터 K3-EDTA 폴리프로필렌 관으로 채혈하였다. 혈액 샘플을 젖은 얼음에 두고, 원심분리시켰다. 얻어진 혈장 샘플을 분석이 진행되는 동안 -80℃에서 냉동시켰다. CD123-NKCE 농도를, CD123-NKCE가 바이오틴-결합 CD123 재조합 단백질에 의해 포획되고 원숭이가 흡수한 alexa-염소 항-인간 IgG에 의해 밝혀진 전용 면역분석 방법을 이용하여 혈장에서 결정하였고, 정량하한(LLOQ) 값은 0.250 ng/㎖였다.
결과
B.1. NKp46-CD123_F25 결합 단백질
F25 형식 또는 이의 변이체를 도 1 및 도 2에 도시하고, 3개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. NKp46-CD123_F25 결합 단백질은 폴리펩타이드 서열인 서열번호 1, 2, 3, 7, 8, 9 및 서열번호 13, 14, 15, 27, 28, 29를 포함하는 초가변 영역을 각각 포함하는, 인간 CD123 결합 도메인 및 인간 NKp46 결합 도메인을 포함하는 3개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
각각의 폴리펩타이드 쇄(I, II 및 III)를 조립 전 세포내에서 절단된 신호(또는 "리더") 서열로 발현시킨다.
제1 폴리펩타이드 쇄(또는 "폴리펩타이드 쇄 (I)" 또는 "단편 I" 또는 "단편 1")는 N-말단에서 C-말단까지, 서열번호 43의 아미노산 서열에 상응하는 VL(CD123-결합) 도메인, 인간 IgG1로부터 유래된 천연 CK(또는 Cκ) 도메인, 변형된 인간 IgG1 힌지 영역("DKTHTCPPCP")을 포함하되, 잔기 D(EU 넘버링에 따른 위치)는 인간 CK 도메인의 C-말단 시스테인에 연결된다. Fc 영역 또는 이의 변이체는 추가로 CH2-CH3 도메인을 포함하는 천연 인간 IgG1 항체로부터 유래된다. 디설파이드 브리지는 잠재적으로는 천연 시스테인을 갖는 제2 폴리펩타이드 쇄("쇄 II")에 의해 세포외에서 형성된다.
제2 폴리펩타이드 쇄("폴리펩타이드 쇄 (II)" 또는 "단편 II" 또는 "단편 2")는 N-말단에서 C-말단까지, 서열번호 41의 아미노산 서열에 상응하는 VH(CD123-결합) 도메인, 인간 IgG1로부터 유래된 천연 CH1 도메인, 비변형 인간 IgG1 힌지 영역("EPKSCDKTHTCPPCP") 및 CH2-CH3 도메인을 포함하는 인간 IgG1로부터 유래된 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하되, CH3 도메인의 마지막 잔기를 제거하고, 작은 4개의 아미노산 "STGS" 링커, 서열번호 45의 아미노산 서열에 상응하는 VH(NKp46-결합) 도메인, 제1 폴리펩타이드 쇄의 CH1 도메인과 동일한 제2 천연 CH1 도메인 및 인간 IgG1로부터의 C-말단 힌지 서열로 대체하였다.
제3 폴리펩타이드 쇄("폴리펩타이드 쇄 (III)" 또는 "단편 III" 또는 "단편 3")는 서열번호 53의 아미노산 서열에 상응하는 VL(NKp46-결합) 도메인 및 시스테인으로 종결된 CK 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 Fc 부분의 CH2 도메인은 N297 위치에서 글리코실화되어 CD16(FcγR)에 대한 결합을 보장한다.
전반적으로, NKp46-CD123_F25 결합 단백질은 4개의 예측된 쇄간 디설파이드 브리지를 포함한다:
(i)
제1 폴리펩타이드 쇄의 C-말단 CK 시스테인을 제2 폴리펩타이드 쇄의 제1 힌지 시스테인에 연결하는 1개의 디설파이드 브리지;
(ii)
제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄의 힌지 영역의 2개의 시스테인에 의해 형성된 2개의 디설파이드 브리지;
(iii)
제2 폴리펩타이드 쇄의 마지막 C-말단 시스테인을 제2 폴리펩타이드 쇄의 C-말단 CH1 도메인에 연결하는 1개의 디설파이드 브리지.
B3 내지 B11 부문에서 나타낸 결합, 시험관내, 생체외 및 생체내 활성 및 안전성 프로파일과 관련된 결과는 폴리펩타이드 (I), (II) 및 (III)을 포함하는 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질에 의해 얻었고; 폴리펩타이드 (I)은 서열번호 64의 아미노산 서열로 이루어지고, 폴리펩타이드 (II)는 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어지며, 폴리펩타이드 (III)은 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어진다.
B.3. SPR에 의한 인간 Fc-γ 수용체에 결합하는 NKp46-CD123_F25 결합 단백질 작제물의 특성규명
NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25)은, CD64 및 CD16a 수용체의 2개의 변이체를 포함하는 인간 Fcγ 수용체의 세트에 대한 친화도를 확인하기 위해 SPR에 의해 시험하였다.
인간 CD16a-V 수용체 또는 CD16aV는, 문헌에서 알로타이프 CD16a V158로도 보고된 항체-의존적 세포의 세포독성을 매개하고 158번 위치에서 발린(V)을 보유하는 천연 항체의 Fc 영역에 결합하는 CD16 인간 수용체의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 지칭한다.
인간 CD16a-F 수용체 또는 CD16aF는, 문헌에서 알로타이프 CD16a F158로도 보고된 항체-의존적 세포의 세포독성을 매개하고 158번 위치에서 페닐알라닌(F)을 보유하는 천연 항체의 Fc 영역에 결합하는 CD16 인간 수용체의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 지칭한다.
본 실험의 결론은 NKp46-CD123_F25를 구성하는 불변 영역이 인간 CD16 및 인간 CD64를 포함하는 복수의 인간 Fc-γ 수용체에 대한 이들의 친화도를 보유한다는 것이다.
B.4. SPR에 의한 NKp46 및 CD123에 결합하는 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 특성규명
NKp46의 인간 및 원숭이 버전을 이용하여 동일한 실험을 수행하였다. 본 명세서에서 이후에 2개의 표(표 1 및 표 2)에서 결과를 요약한다.
본 실험의 결론은 본 개시내용과 관련된 NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25)이 인간과 원숭이 아이소폼 둘 다에 적용되는 NKp46 및 CD123 표적에 대한 친화도를 보유한다는 것이다.
B.5. NKp46-CD123_F25 결합 단백질은 AML 세포의 세포독성을 유도한다
도 4는 MOLM-13 AML 세포에 대한 시험관내 세포독성을 보고한다(도 4a). 표적 세포로서 생체외 환자 아세포 샘플에 대해 동일한 실험을 재현한다(도 4b). 세포독성을 실험에서 시험한 NKp46-CD123_F25 결합 단백질 (NKp46-CD123_F25) 농도의 함수로서 평가한다.
전반적으로, 실험은 NKp46-CD123_F25가 시험관내 및 생체외 시험 샘플 모두에서 용량-의존적 세포독성을 초래한다는 것을 나타낸다. 유사한 농도에 대해, 관찰된 세포독성은 또한 NKp46에 대한 특이성 없이 ADCC-향상 항-CD123 항체에 의해 관찰된 것보다 더 높다(참조-1). 대조적으로, NKp46 단독에 결합하는 형식 F25의 음성 대조군 변이체(NKp46-IC_F25)는 시험 조건 하에서 세포독성을 거의 나타내지 않는다. 따라서, 실험은 CD123-양성 종양 세포에 대해 세포독성을 야기하는 Fc-적격 작제물(F25)에서 CD123과 NKp46 둘 다에 대해 이중 결합의 상승 효과를 뒷받침한다.
도 5는 MOLM-13 세포주에 대해 EC50에 기반한 데이터를 제공한다. 시험관내 세포독성의 개선(감소된 EC50으로 해석)은 NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25)에 의해 관찰된다. 대조적으로, NKp46에만 관여하고 CD16a에는 관여하지 않음으로써 활성화하기 때문에, 잔기 297에 대해 N-글리코실화를 결여하는 F6 대조군(NKp46-CD123_F6)은 감소된 세포독성을 제공한다. 따라서, 이 두 번째 실험은 NKp46 및 CD16a NK 세포 마커의 결합 및 활성화를 통해 관찰된 상승 효과의 증거를 제공한다.
따라서, 비용해는, NKp46-CD123_F25에 의해, CD123-양성 MOLM-13 AML 세포에 대해 인간 NK 세포의 존재 하에서 NKp46에 대해 특이성 없이 ADCC-향상 항-CD123 항체(참조-1)에 의해 설명되었다. EC50 값은 결합제 농도보다 더 세포 용해 변형에 기반하여 확립된다. 결과를 본 명세서에서 이후에 나타낸다.
따라서, NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25)이 항-CD123 ADCC-향상 항체(참조-1)와 적어도 동일하거나 더 우수한 세포독성 활성을 나타낸다는 것이 나타난다.
참조-1은 인터류킨 3 수용체의 알파쇄(IL3Rα; CD123으로도 알려짐)를 표적화하고 자연살해 세포를 통해 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)의 향상된 활성화를 위해 최적화된 AML의 치료에 대해 나타난 완전-인간화된 단클론성 항체이다.
B.6. AML에 대한 CD64 발현은 NKCE 세포독성 활성에 영향을 미치지 않지만, 참조-1 활성에 부정적으로 영향을 미친다
NKp46-CD123_F25 및 참조-1 항체의 활성을 추가로 기록하고 비교하기 위해, 표적으로서 CD123을 발현시키는 상이한 AML 세포주를 이용하여 세포독성 실험을 수행하였다. 놀랍게도, THP-1 및 MOLM-13 세포는 세포 표면에서 비슷한 수준의 CD123을 발현시키지만, 참조-1 항체는 MOLM-13 세포를 효율적으로 사멸시키지만, THP-1 세포에 대해서는 활성이 아니었다(도 6a-상단 패널). 참조-1 항체와 대조적으로, NKp46-CD123_F25는 AML 세포주 둘 다에 대해 비슷한 사멸 활성을 입증하였다(도 6a-상단 패널). 도 6a-하단 패널은 MOLM-13 및 THP-1 세포가 유세포 분석기에 의해 분석되는 바와 같이 세포 표면에서의 CD32a/b 및 CD64 FcγR의 발현과 상이하다는 것을 나타낸다. MOLM-13 세포는 THP-1 세포보다 훨씬 더 낮은 CD64 수준, 및 또한 더 낮은 수준의 CD32a/b를 가졌다(도 6a- 하단 패널). CD64(FcγRI)는 건강한 단핵구 및 대식세포 상에서 발현된 인간 IgG에 대한 고친화도 수용체이고, CD64-양성 급성 골수성 백혈병으로 간주될 수 있는 환자의 약 1/3에서 AML 아세포 상에서 발현되는 것이 발견되었다. 인간화된 단클론성 항체 참조-1와 비교되는 NK 세포 관여자(NKCE)에 대한 세포독성에 대해 CD64 발현의 역할을 연구하기 위해, CD32a/b 및 CD64의 발현을 THP-1 세포에서 선택적으로 넉다운시켰다.
CD32a/b를 발현시키지만 CD64를 발현시키지 않거나 또는 CD64를 발현시키지만 CD32a/b를 발현시키지 않는 THP-1 서브클론 상에서 수행한 사멸 실험은(도 6b) 이런 항체의 사멸이 CD64 발현에 대해 비활성화된 서브 클론에 대해서만 회복되었기 때문에 THP-1에 대한 CD64 발현이 참조-1 ADCC 활성의 저해를 초래한다는 것을 입증하였다. 따라서, 이들 결과는 AML 세포 표면에서 FcγR인 CD64의 항체 FC 시스 포획이 NK 세포에 대한 CD16a의 결합과 경쟁함으로써 ADCC를 방해할 가능성이 있다는 것을 나타낸다.
흥미롭게도, NKp46-CD123_F25는 본 개시내용과 관련된 NKp46-CD123_F25 결합 단백질이, 어떤 CD64 발현 상태이든 참조-1에 비해, AML 아세포의 NK 세포-매개 세포독성을 유도하는 데 더 효율적이라는 것을 강조하는 모든 AML 세포주 및 모든 THP-1 서브 클론에 대해 일관된 사멸 활성을 입증하였다.
도 14a 내지 도 14b는 참조-1 활성이 AML 세포 상의 CD64의 발현에 의해 부정적으로 영향받는다는 것을 확인한다.
도 14a는 효과기로서 건강한 공여자 NK 세포를 이용하여 생체외에서 평가한 4명의 대표적인 환자로부터의 1차 악성 AML 아세포(AML#1, #2, #5 및 #6; N=8)의 NKp46-CD123_F25 및 참조-1-매개 세포독성을 보고한다. MOLM-13 및 THP-1 세포주에 의해 관찰되는 바와 같이, 참조-1 항체는 CD64-음성 환자 샘플의 사멸을 매개하였지만(AML#1 및 #2; 도 14a), CD64-양성 AML 환자 샘플로부터의 아세포에 대해 거의 활성이 없었다(AML#5 및 #6; 도 14a). 따라서, AML#5- AML#6(참조-1-비-반응자)은 AML#1 및 AML#2(참조-1 반응자)보다 CD32 및 CD64의 더 높은 염색 수준을 가진다(도 14b, 우측 패널, 그룹 둘 다에서 대조군으로부터의 CD64 및 CD32에서의 피크 이동을 비교).
대조적으로, CD123을 표적화하는 3작용성 NKp46-NKCE는 CD64-양성과 CD64-음성 AML 환자 샘플 둘 다에 대해 강한 항-종양 효과를 가졌다(도 14). 도 6 및 도 14는 FcγR 발현 상태, 더 구체적으로는, 표적 세포 상의 CD64 발현과 상관없이, CD123-NKp46_F25가 모 THP-1 세포주, THP-1 서브클론 및 MOLM-13 세포에 대해 동등하게 강하였다는 것을 입증한다. 또한, 3작용성 NKCE 분자는 또한 모든 1차 악성 AML 세포에 대해 사멸 활성을 나타내고, 참조-1이 완전히 비활성인 CD64-양성 AML 환자 샘플(AML#5 및 6)에서 상당한 항종양 활성을 촉진시킨다(도 14a).
MOLM-13 세포를 이용한 실험과 관련하여, 3작용성 분자(CD123-NKp46_F25)는 NKp46(CD123-NKp46_F6) 또는 CD16a(CD123-IC_F25)를 개별적으로 활성화하는 이중특이성 시약보다 더 강력하였고(도 15a), 강력한 사멸 활성(4.2[95% CI: 2.7, 6.3] pM의 기하 평균 EC50, 71 ± 5%의 평균 관찰 최대 비용해) 및 건강한 NK 세포 공여자 사이의 양호한 일관성(도 15b)을 입증한다.
B.7. NK 세포 관여자에 의한 자가 1차 AML 샘플에서의 NK 세포 활성화
1차 CD64(+) 또는 CD64(-) AML 아세포에 대해 NK 탈과립을 유도하는 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25)의 특성은 CD107-양성 NK 세포의 백분율의 측정을 통해 도 7에서 확립하였다.
전반적으로, 본 실험은 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질이, 예를 들어, 동일한 환자로부터의 1차 아세포 및 NK 세포를 이용하여 자가 분석에서 AML 환자로부터의 1차 샘플에서 NK 세포를 활성화시킬 수 있다는 증거를 제공한다.
이들 결과는 CD64 발현이 없는(샘플 10) 및 발현이 있는(샘플 8 및 샘플 9) 2개의 추가적인 AML 환자 샘플을 이용하는 전용 자가 NK-세포 활성화 분석에서 추가로 강화되었다(도 16a). 또한, NKp46-CD123-NKCE는 아세포 상에서의 CD64 발현 상태와 상관없이 환자 자신의 악성 세포에 대해 환자의 NK 세포의 자가 활성화를 매개한 반면(CD107 염색에서의 이동 참조), 참조-1은 CD64-음성 샘플(샘플 10)에 대해서만 활성이었다(도 16b).
따라서, 본 실험은 CD64(+)와 CD64(-) AML 세포 둘 다에 대해 NK 세포를 활성화시키는 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 능력을 뒷받침한다.
게다가, 본 자가 분석에서, 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질은 참조-1의 존재 하에 관찰된 것보다 훨씬 더 낮은 농도에서 CD64(+) 세포의 존재 하에 NK 세포와 맞물릴 수 있다.
또한, 평균 EC50은 또한 4개의 AML 샘플(2개의 CD64(+) 및 2개의 CD64(-))에 대해 6명의 NK 건강한 공여자를 이용한 아세포 사멸 분석에서 NKp46-CD123_F25 및 참조-1에 대해 정량화하였고, 결과를 본 명세서에서 이하에 재현한다.
전반적으로, 이들 실험은 또한 본 개시내용과 관련된 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 아세포 사멸 활성이 참조-1 항체보다 우수하며, CD64(-) AML 샘플에 대해서조차, 참조-1이 CD64(+) AML 아세포에 대해 비활성이라는 것을 입증한다.
B.8. NKp46-CD123 NK 세포 관여자는 SCID 마우스 모델에서 주사된 MOLM-13 인간 AML에 대해 항-종양 활성을 유도한다
도 8은 SCID 마우스 모델을 이용하여 종양 이식 70일 후에 0.5 ㎎/㎏의 50% 마우스 생존을 유도하는 muNKp46-huCD123_F25 결합 단백질(muNKp46-huCD123_F25)에 의한 용량-의존적 항-종양 활성을 보고한다. 더 구체적으로는, 처리된 대조군은 27.5일의 MST 및 5%의 장기간 생존자를 나타냈다.
X-축은 복강내(i.p.) 경로에 의한 1일차에 단일 화합물 투여를 포함하여, 인간 MOLM-13의 정맥내 주사로 이루어진 종양 이식 후 일수를 표시한다. Y-축은 처리군에 대한 10마리 마우스 및 대조군에 대한 20마리 마우스에 기반한 생존 백분율을 표시한다. ***은 대조군에 대한 p 값 < 0.001을 표시한다.
0.5 ㎎/㎏의 muNKp46-huCD123_F25로 처리한 그룹은 66일의 MST, 140%의 증가된 수명 및 50%의 장기간 생존자를 나타냈고, 0.5 ㎎/㎏의 muNKp46-huCD123_F25는 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 활성이 있었다(p<0.0001). 0.25 ㎎/㎏의 용량에 대해, 그룹은 36일의 MST, 31%의 증가된 수명 및 10%의 장기간 생존자를 나타냈고, 0.25 ㎎/㎏의 유도된 muNKp46-huCD123_F25는 대조군과 통계적으로 다르지 않았다. 0.05 ㎎/㎏의 용량에 대해, 그룹은 33일의 MST, 20%의 증가된 수명 및 장기간 생존자 없음을 나타냈고, 0.05 ㎎/㎏의 muNKp46-huCD123_F25는 대조군과 통계적으로 다르지 않았다.
본 개시내용과 관련된 NKp46-CD123_F25 결합 단백질은 0.5 ㎎/㎏의 강한 활성을 갖는 용량-의존적 항-종양 생체내 활성을 나타냈다. 해당 결과를 다음의 표 3에 요약한다:
따라서, 이는 NK 세포 관여자가 동물 모델에서 증식성 장애의 치료에 효율적이라는 것을 확인한다.
추가적으로, 효능의 추가 평가를 위해, 5 ㎎/㎏의 muNKp46-huCD123_F25 NKCE 또는 대조군을 포함할 뿐만 아니라 참조-1인 추가 투여 그룹을 이용한다는 것을 제외하고는, 위에 기재하고 도 8에서 보고한 실험을 반복하였다. 결과를 도 18에 제시한다.
도 8 연구와 일치되게, 도 18 연구에서, 대리 muNKp46-huCD123_F25는, 5, 0.5 및 0.25 ㎎/㎏ 용량의 경우 100% 및 60%의 장기간 생존자의 대조군과 비교되는 ILS 및 0.05 ㎎/㎏ 용량의 경우 30% 및 10%의 장기간 생존자의 ILS로, 인간 MOLM-13 파종성 모델에서 5, 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏ 용량의 통계적으로 유의미한 활성을 유도하였다.
참조-1은 70%의 ILS 및 40%의 장기간 생존자가 있는 인간 MOLM-13 파종성 모델에서 5 ㎎/㎏의 용량으로 통계적으로 유의미한 활성을 유도하였다. 이는 0.5, 0.25 및 0.05 ㎎/㎏의 용량에서 활성이 아니었다.
muNKp46-huCD123_F25는 0.5 및 0.25 ㎎/㎏의 용량에서 참조-1보다 통계적으로 유의미하게 더 활성이었다.
도 18에 대한 표 결과를 다음과 같이 요약한다:
결론적으로, muNKp46-huCD123_F25 대리는 0.25 ㎎/㎏로부터의 강한 활성과 함께 용량-의존적 활성을 나타냈다. 이들 데이터는 NK 세포를 NKp46/FcγR와 함께 관여시켜 항-CD123 항체(참조-1)에 비해 개선된 생체내 효능을 야기하는 것의 이점을 입증하였다.
B.9. NKp46-CD123 NK 세포 관여자는 비인간 영장류에서의 생체내 항-종양 활성을 유도한다
시험관내 인간 PBMC에서 NKCE의 전염증 사이토카인 방출의 부재를 NHP에서 수행한 2개의 전용 약물동력학, 약력학 및 안전성 연구에서 추가로 확인하였다. 사이노몰거스 원숭이를 전임상 약물동력학, 약력학 및 독성 연구를 위한 관련 종으로서 선택하였는데, 이는 (1) 인간에서와 유사한 NKp46 및 CD123의 조직 분포에 기반하며(문헌[Walzer et al. PNAS; 2007; 104:3384-3398 및 ChiChili et al. Sci Transl Med; 2015; 7:289]), (2) CD123-NKCE 분자를 구성하는 항체 및 Fc 단편이 아래의 표 4에 나타낸 것과 유사한 인간 분자에 대한 친화도로 사이노몰거스 항원 및 FcγR에 결합하기 때문이다. 구체적으로는, CD16a(FcγRIIIA)는 158V 및 158F 아이소폼 각각에 대해 0.46±0.01 μM 및 2.61±0.09 μM의 1가 KD를 갖고, 항-NKp46 및 항-CD123 항체 모이어티는 각각 16.3±2.9 nM 및 0.40±0.04 nM의 1가 KD로 인간 NKp46 및 인간 CD123에 결합한다.
도 9는 추가로 본 개시내용과 관련된 NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25)의 주사 후 최대 20일 동안 그리고 비인간 영장류의 경우 0.5 ㎍/㎏에서 최대 5시간까지 3 ㎍/㎏의 완전하고 지속적인 CD123-양성 호염기구 고갈을 나타낸다.
따라서, 이 결과는 SCID 마우스 모델에서 관찰된 것을 포함하는 앞서 얻은 시험관내, 생체내 및 생체내 결과가 NK 세포 관여자에 대한 비인간 영장류에 외삽될 수 있다는 것을 입증한다.
전반적으로, CD123-양성 면역 세포 고갈은 비인간 영장류에서 NKp46-CD123_F25 결합 단백질의 생체내 활성의 특징이다. 주입 개시로부터 약 1.5시간에 일어나고, 최대 7일간 유지되는 CD123-양성 호염기구의 빠르고 지속적인 고갈이 관찰되며, 세포 수가 제28일에 기준선으로 복귀된다는 것을 발견한다.
B.10. 세포독성 분석에서 Fc-적격 형식, 즉, 각각 F5 대 25 형식의 비교
도 10a 및 도 10b는 NKp46-CD123_F25 및 NKp46-CD123_F5 결합 단백질이 건강한 공여자(D648)로부터의 NK 세포와 맞물림으로써 MOLM-13과 THP-1 AML 세포주 둘 다에 대해 동일한 세포독성 활성을 나타낸다는 것을 도시한다.
MOLM-13과 THP-1 세포 사이의 주된 차이는 CD64 마커의 이들의 발현 수준과 관련된다. MOLM-13 세포는 CD64(-)를 발현시키지 않는 반면, THP-1 세포는 고수준의 CD64(+)를 발현시킨다. 세포 둘 다 CD32a를 발현시킨다.
따라서, 본 실시예는 3종의 별개의 결합 단백질: (i) F5 형식의 NKp46-CD123_F5 결합 단백질(NKp46-CD123_F5), (ii) F25 형식의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25), 및 (iii) 형식 F5 결합 CD123 단독의 음성 아이소타입 대조군 변이체(CD123-IC_F5)에 대한 비용해의 변형을 보고한다.
전반적으로, 해당 결과는 세포독성 활성이 F5 및 F25 형식의 2개의 Fc 적격 NKp46-CD123 결합 단백질에 의해 유지된다는 것을 입증한다. 대조적으로, 음성 대조군은 검출 가능한 세포독성 활성을 야기하지 않는다.
B.11. T-세포 관여자 도구와 비교할 때 NKp46-CD123 NKCEs-유도 CD123-양성 호염기구 고갈은 낮은 사이토카인 방출과 관련된다
강한 세포독성은 환자에서의 독성과 관련될 수 있다. 시험관내 CD123-NKCE에 의해 유도된 인간 PBMC로부터의 사이토카인 방출을 연구하기 위해, 환자에서의 잠재적 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 예측 분석으로서, 다음의 실험을 수행하였다.
인간 PBMC(N=10개의 샘플)를, NKp46-CD123_F25(CD123-NKCE; 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖의 용량; 0.68 내지 68 nM), NKp46 단독에 결합하는 형식 F25의 음성 아이소타입 대조군 변이체(NKp46-IC_F25; 0.1, 1 또는 10 ㎍/㎖의 용량; 0.68 내지 68 nM)의 존재 하에서, 또는 농도 구배(10-3 내지 101 ㎍/㎖)보다 더 CD3에 대한 특이성이 있고 NKp46에 대해 특이성이 없는 항-CD123 T-세포 관여자 항체 도구(CD123-TCE, 참조-1; 0.1 ㎍/㎖; 1.6 nM)와 함께 20시간 동안 배양시켰다.
인간 PBMC에서, CD123은 순환 호염기구 및 형질세포양 수지상 세포(pDC)의 서브세트 상에서 구성적으로 발현된다. 호염기구가 pDC보다 더 높은 CD123+ 발현을 갖는다는 것을 고려하여, 호염기구의 고갈 백분율을 위에 나타낸 각 처리군에 대해 모니터링하였다. 도 11은 CD123-NKCE에 의한 인간 PBMC의 처리가, 10개의 공여자 샘플 중 6개에서 계산한, 37%의 중앙값 최대 고갈[31; 50] 및 38 pM의 기하 평균 EC50 값(95% CI[12.9; 401])을 갖는 CD123+ 호염기구의 용량-의존적인 부분적 고갈을 촉진하였다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 호염기구 고갈은 CD123 결합 부위를 결여하는 F25 결합 분자(NKp46-IC_F25)의 존재 하에서 상당한 양으로 생기지 않았다. 위에 나타난 인간 PBMC 처리군으로부터, 사이토카인 방출의 양을 정량화하기 위해 상청액을 수집하였다. 도 12는 본 개시내용과 관련된 NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25)의 투여와 관련된 시험관내 IL-6 및 IL-1β 전염증 사이토카인 및 TNF-α 및 IFN-γ 사이토카인 방출이 100-배 더 낮은 용량(0.1 ㎍/㎖)에서 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 유도하는 것으로 알려진 양성 대조군인 참조-1의 투여와 관련된 상응하는 IL-6 방출보다 훨씬 더 낮았다는 것을 입증한다.
CD123-NKCE는 42배 더 높은 농도에서조차 CD123-TCE보다 훨씬 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 유도하였다.
도 11 및 도 12는 CD123-NKCE에 의한 PBMC의 처리가 CD123+ 호염기구의 고갈을 촉진시켰지만, CD3-CD123 항체 분자에 의한 처리보다 훨씬 더 낮은 수준의 IL-6, IL-1β, TNF-α 및 IFN-γ 방출을 유도하였다는 것을 입증한다.
결론적으로, 본 개시내용과 관련된 NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25)은 약간의 사이토카인 방출과 관련된 CD123+ 1차 정상 단핵 혈액 세포를 표적화하고 사멸시키는 1차 NK 세포와 맞물리는 능력을 나타냈으며, AML의 치료를 위해 TCE보다 더 양호한 유해/유익 프로파일을 가질 수 있다.
용량 수준과 상관없이 최대 고용량의 3 ㎎/㎏까지, 도 13a 내지 도 13f는 매우 낮은 사이토카인 방출(IL6 및 IL10)이, 임의의 관련 임상 징후 없이 본 개시내용과 관련된 NKp46-CD123_F25 결합 단백질(NKp46-CD123_F25)의 주사의 개시 후 모든 처리 동물(수컷 사이노몰거스 원숭이)에서 관찰되었다는 것을 나타낸다. IL-2도 IFNγ 사이토카인 방출도 검출되지 않았다. 더 구체적으로는, 3 ㎎/㎏에서 F25 작제물의 단일 정맥내 주사 후 비인간 영장류에서 일시적인 IL6 및 IL10 피크가 검출된다. 이런 일시적인 피크는 1시간 내지 5시간에 생기고, 1 또는 2일 이내에 기준선으로 복귀된다.
또한, 매우 저수준의 IL-6 및 IL-10 사이토카인 방출은 최대 3 ㎎/㎏ 용량의 임상 징후와 관련되지 않는다. 이는 이러한 NK 세포 관여자가 비인간 영장류에서 양호한 안전성 프로파일을 갖는다는 것을 나타낸다.
B.12. NKp46-CD123 NK 세포 관여자는 사이토카인/케모카인 생산과 비례하여 시험관내 NK-세포 활성화를 촉진시킨다
도 17에 상응하는 유세포 분석은 NKp46-CD123_F25 결합 단백질이 CD123 발현 표적 세포가 존재할 때에만 NK-세포 활성화를 촉진시켰다는 것을 입증한다.
MOLM-13 표적 세포가 존재할 때, NKp46-CD123_F25의 존재 하에 인큐베이션시킨 1차 공여자 NK 세포(N=3)는 용량 의존적 방식으로 NK 세포 활성화 마커, CD107 및 CD69뿐만 아니라 사이토카인, TNF-α, IFN-γ 및 케모카인, MIP-1β의 보다 높은 발현 수준을 나타냈다(도 17, NK 단독을 NK + MOLM-13 조건과 비교).
전반적으로, 본 실험은 본 개시내용의 NKp46-CD123_F25 결합 단백질이 NK 세포의 비표적 활성화가 없는 CD123+ AML 세포에 대해 1차 NK 세포에서 사이토카인/케모카인 생성을 활성화시키고 비례하여 촉진시킨다는 증거를 제공한다.
B.13. NK 세포는 NKp46-CD123_F25의 항종양 활성을 초래하는 효과기 림프구 서브세트이다
NKp46-CD123_F25의 효능이 SCID 마우스 모델에서 주사된 MOLM-13 인간 AML에 대한 NK 세포 항-종양 활성에 따르는지의 여부를 시험하기 위해, 마우스는 B.8에 약술한 실험 셋업 동안 NK 세포 고갈 요법을 거쳤다.
결과를 도 18 및 도 19에 제시하고 상응하는 표 결과를 아래의 표 5에 나타낸다.
처리한 대조군은 29일의 중앙값 생존 시간(MST) 및 장기간 생존자 없음을 나타냈다.
muNKp46-IC 아이소타입 대조군은 7%의 ILS를 갖는 활성 및 장기간 생존자 없음을 나타내지 않았다. 증가된 수명이 없고 10%의 장기간 생존자를 갖는 muNKp46-IC 아이소타입 대조군으로 처리한 그룹에 대해 NK 고갈의 영향이 없다는 것이 관찰된다. 28%의 ILS 및 20%의 장기간 생존자를 갖는 IC-huCD123 아이소타입 대조군은 통계적으로 유의미하게 활성이었다. 수명 증가가 없고 장기간 생존자가 없는 IC-huCD123 아이소타입 대조군으로 처리된 그룹에 대해 고갈의 통계적으로 유의미한 영향이 관찰되었다.
84%의 ILS 및 40%의 장기간 생존자를 갖는 muNKp46-huCD123_F25는 통계적으로 유의미하게 활성이었다. 14%의 ILS를 갖고 장기간 생존자가 없는 muNKp46-huCD123_F25로 처리된 그룹에 대해 고갈의 통계적으로 유의미한 영향이 관찰되었다.
결론적으로, NK 고갈은 생체내 효능에서 muNKp46-huCD123_F25 NKCE에서 효과기 세포로서의 NK 관여를 확인하는 muNKp46-huCD123_F25의 항-종양 활성에 영향을 미쳤다.
B.14. NKp46-CD123 NK 세포 관여자는 NHP에서 안전하고 효율적이다
NHP 연구에서 Nkp46-CD123 세포 관여자의 안전성 프로파일을 확인하는 것을 도 9 및 도 13에서 수행하여, 수컷 사이노몰거스 원숭이에서 높은(3 ㎎/㎏) 또는 낮은(3 ㎍/㎏ 및 0.5 ㎍/㎏) 용량(3 ㎎/㎏ 및 3 ㎍/㎏ 용량에 대해 각각 2마리의 동물 및 0.5 ㎍/㎏ 용량에 대해 1마리의 동물)의 단일 i.v. 주사로 투여한 CD123-NKCE의 약물동력학 및 약력학의 정보를 얻었다.
CD123-NKCE에 의한 처리는, 10일 초과 동안 3 ㎎/㎏과 3 ㎍/㎏ 용량 둘 다에서(도 20a 및 도 20b에서 CD123+ 호염기구 및 총 CD123+ 세포에 대해 예시한 바와 같이), 임의의 관련된 임상 징후 없이 매우 소량의(50 pg/㎖ 미만의) 전염증 사이토카인 IL-6 및 IL-10 방출(도 20c)만으로 모든 원숭이의 혈액 중 CD123+ 세포의 지속적이고 완전한 고갈을 촉진시켰다.
가장 낮은 용량(0.5 ㎍/㎏, 데이터 미제시)에서 처리한 원숭이에서 CD123+ 세포의 일시적이고 부분적인 고갈이 관찰되었지만, 3 ㎍/㎏은 이 종에서 가장 낮은 용량인 것으로 간주되었다. 가장 고용량(3 ㎎/㎏)에서 처리한 2마리 원숭이의 PK 프로파일을 처리 후 12 내지 14일에 생긴 항-약물 항체(ADA) 반응(데이터 미제시)에 의해 표시되었고(도 20d), 이후의 시점에 혈액으로부터의 CD123+ 세포의 회수와 관련된다.
CD123-NKCE의 전임상 안전성 프로파일은 4마리의 원숭이(2마리/성별/용량)를 매주 4주 동안 1시간 동안의 정맥내 주입에 의해 투여한 3 ㎎/㎏/투여 또는 0.1 ㎎/㎏/투여의 용량으로 처리한 탐색적 반복-용량 독성 연구를 통해 추가로 정보를 얻었다(도 21). 모든 원숭이에서(원숭이 중 한 마리, 원숭이 M5, 수컷 5번 제외; 도 21), CD123-NKCE에 대한 노출을 적어도 2주 동안 시험 용량 둘 다에서, 세 번째 투여(제15일)로부터 검출된 항-약물 항체(ADA)의 존재(데이터 미제시)에 대해 지속하였다(표 6).
아래의 표 6은 4주(제1일, 제8일, 제15일 및 제22일) 동안 사이노몰거스 원숭이에 대한 0.1 및 3 ㎎/㎏/투여 시 1시간 정맥 내 주입의 매주 반복 후 개개 CD123-NKCE 혈장 농도값을 나타낸다.
각각의 매주 투여 후 용량 둘 다에 대해 IL-6 농도의 일시적인 최소 증가가 관찰되었다(표 7 각각 0.1 및 3 ㎎/㎏/투여 용량에 대해 25 및 160 pg/㎖의 최대 수준). 표 7은 4주(제1일, 제8일, 제15일 및 제22일) 동안 사이노몰거스 원숭이에 대한 0.1 및 3 ㎎/㎏/투여로 CD123-NKCE의 1시간 정맥 내 주입의 매주 반복 후 개개 IL-6 혈장 농도값을 나타낸다.
특히, ADA 반응을 나타내지 않았고 연구 내내 CD123-NKCE에 노출된 고용량(3 ㎎/㎏/투여)으로 처리된 원숭이 M5에서 유의미한 IL-6 방출은 관찰되지 않은 반면(도 21a 및 도 21b), 이 원숭이의 혈액과 골수 둘 다에서 CD123+ 세포 고갈의 강한 PD 효과는 관찰되지 않았다(표 8 및 도 21c).
표 8은 4주 동안 사이노몰거스 원숭이에게 0.1 및 3 ㎎/㎏/투여로 CD123-NKCE의 매주 반복 1시간 정맥내 주입 후 혈액 및 골수에서의 호염기구 및 총 CD123-양성 세포의 개개 절대 계수를 나타낸다.
모든 다른 동물에서, 첫 투여 후 1.5시간 및 세 번째 투여 후 최대 24시간에 혈액 중에서 CD123-발현 세포의 지속적 고갈이 관찰되었고, 제22일 내지 제29일에 회복(기준선 초과)이 관찰되었다(표 8). 또한, 모든 처리한 원숭이는 용량 둘 다에 대해, 마지막 투여 1주 후인 제29일에 CD123-양성 집단의 복구와 함께, 제9일(두 번째 투여 후 24시간)에 골수로부터의 CD123-양성 세포의 완전한 고갈을 제시하였다(표 8; 대부분의 동물에 대해 제9일에 검출한계 미만의 값).
용량이 어떻든 간에, 임상 징후 없음, 체중 또는 체온 변화, 및 CD123-NKCE에 의한 처리로 인한 것일 가능성이 있는 ECG에 대한 효과 없음이 관찰되었다. 혈액학, 응고, 임상 화학 또는 비뇨기 파라미터에 대한 화합물-관련 역효과는 관찰되지 않았다. 샘플링된 조직의 현미경 검사는 기관 표적화의 증거를 나타내지 않았고, 언급된 모든 관찰은 배경 변동 범위 내에 놓여 있고 CD123-NKCE의 투여와 관련없는 것으로 간주하였다.
따라서, 전반적으로, 이들 결과는 독성 징후 없이, 생체내 CD123-NKCE의 효능에 대한 원리 검증을 구성한다.
B. 15. 건강한 공여자 NK 세포에 의한 NKp46-CD123 NK 세포 관여자 종양 세포 사멸
NKp46-CD123_F25 및 이의 아이소타입 대조군 IC-CD123_F6을 2명의 상이한 건강한 공여자(HD)로부터 취한 NK 세포를 이용하는 시험관내 종양 세포 사멸 분석에서 시험하였다.
NK 세포 정제 및 AML 세포주
익명의 건강한 공여자(HD)로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 단리시켰다. NK 세포를 MACSxpress® Whole Blood NK 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)에 의해 이들 PBMC로부터 정제하였다. NK 세포를 10% SVF(BioWest) 및 1% L-글루타민(Gibco)을 보충한 RPMI1640(Gibco)에서 밤새 휴지시켰다.
이 연구를 위해 THP1 세포(CD123+. CD64+)를 CD123의 발현에 기반하여 선택하였다. 실험 전에, THP1 세포를 Incucyte® Nuclight Green Lentivirus(Sartorius)로 감염시켜 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현시켰다.
시간에 따른 NKp46-CD123_F25의 존재 하에서의 NK 작용성 분석
NK 세포 및 THP1 GFP 표적 세포를 37℃에서 0.1, 1, 10 및 100 ng/㎖의 NKp46-CD123_F25 또는 이의 아이소타입 대조군 IC-CD123_F6의 존재 하에 인큐베이션시켰다. 효과기:표적 세포 비는 1:1였다. 사용한 배지는 NK 세포 배양물과 동일하였다. Incucyte 생세포 분석 시스템(EssenBioscience)을 이용하여 74시간에 걸쳐 형광 영상화에 의해 표적 세포를 모니터링하였다. IncucyteS3 소프트웨어(2020B 버전)을 이용하여 생표적 세포의 수를 정량하였다.
결론
도 22에 나타낸 바와 같이, 상이한 농도(1, 10 및 100 ng/㎖)의 NKp46-CD123_F25는 1:1의 효과기:표적 세포 비로 시간에 따라 THP1 GFP AML 세포에 대한 HD NK 세포의 세포 독성 활성을 향상시킨다.
SEQUENCE LISTING
<110> INNATE PHARMA
SANOFI
<120> MULTIFUNCTIONAL NATURAL KILLER (NK) CELL ENGAGERS BINDING TO
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<150> 63/256,950
<151> 2021-10-18
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Arg Val
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20 25 30
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35 40 45
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Gln Arg Ile Ser Ala Gln Gln Gln Thr Leu Pro Lys Pro Phe Ile Trp
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Gln Arg Ile Ser Ala Pro Lys Gln Thr Leu Pro Lys Pro Ile Ile Arg
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225 230 235 240
Leu Gln Lys Asp Leu Ala Leu Trp Asp His Thr Ala Gln Asn Asp Tyr
245 250 255
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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<213> Homo sapiens
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Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr Asp Ile
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Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
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Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
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Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
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Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
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Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
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Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
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Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
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Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
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Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
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Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
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Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
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Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
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Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
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Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
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Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
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His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
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Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
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Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
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Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
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Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
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Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
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<212> DNA
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Phe
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Ser Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr Ser Pro Arg
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Arg Ser Ser Gly Asp Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Val Gly Ser Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
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Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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420 425 430
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450 455 460
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His His His His His His
1 5
Claims (30)
- 제1 및 제2 항원 결합 도메인(antigen binding domain: ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질로서, 상기 ABD 각각은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 3개의 상보성 결정 영역(CDR-1 내지 CDR-3)을 포함하고;
(i) 상기 제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-H1, H2 및 H3을 포함하는 VH1, 및
- 각각 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열에 상응하는 CDR-L1, L2 및 L3을 포함하는 VL1
을 포함하며;
(ii) 상기 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하고,
- 각각 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열;
각각 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열;
각각 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열;
각각 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 16, 25 및 26의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-H1, 2 및 3을 포함하는 VH2;
및
- 각각 서열번호 27 내지 29의 아미노산 서열;
각각 서열번호 30 내지 32의 아미노산 서열;
각각 서열번호 33 내지 35의 아미노산 서열;
각각 서열번호 36 내지 38의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 39, 31 및 40의 아미노산 서열
에 상응하는 CDR-L1, 2 및 3을 포함하는 VL2
를 포함하고,
모든 또는 일부의 상기 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합하는, 결합 단백질. - 제1항에 있어서, 아래에 규정된 바와 같은, 2개의 ABD를 형성하는 3개의 폴리펩타이드 쇄 (I), (II) 및 (III)을 포함하는, 결합 단백질:
(여기서,
V1A 및 V1B는 결합쌍 V1(VH1/VL1)을 형성하고;
V2A 및 V2B는 결합쌍 V2(VH2/VL2)를 형성하며;
C1A 및 C1B는 C1(CH1/CL) 쌍을 형성하고, C2A 및 C2B는 C2(CH1/CL) 쌍을 형성하되, CH1은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1이고, CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
힌지1, 힌지2 및 힌지3은 동일 또는 상이하고, 모든 또는 일부의 면역글로불린 힌지 영역에 상응하고;
(CH2-CH3)A 및 (CH2-CH3)B는 동일 또는 상이하고, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하며;
L1은 아미노산 링커임). - 제2항에 있어서,
C1B가 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1)이며;
C2A가 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1)이고;
CL이 면역글로불린 카파 경쇄 불변 도메인(Cκ)에 상응하며;
(CH2-CH3)A가 서열번호 69의 아미노산 서열에 상응하고;
(CH2-CH3)B가 서열번호 70의 아미노산 서열에 상응하며;
힌지1이 서열번호 74의 아미노산 서열에 상응하고;
힌지2가 서열번호 75의 아미노산 서열에 상응하며;
힌지3이 서열번호 77의 아미노산 서열에 상응하고;
L1이 서열번호 76의 아미노산 서열에 상응하는, 결합 단백질. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, EU 넘버링에 따른 상기 Fc 영역 또는 이의 변이체의 잔기 N297은 N-연결 글리코실화를 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모든 또는 일부의 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 CD16A(FcγRIII) 폴리펩타이드에 결합하는, 결합 단백질.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 디설파이드 브리지에 의해 연결된 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는, 결합 단백질.
- 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 쇄 (I) 및 (II)는 C1A와 힌지2 사이에 적어도 1개의 디설파이드 브리지에 의해 연결되고/되거나 상기 폴리펩타이드 쇄 (II) 및 (III)은 힌지3과 C2B 사이에 적어도 1개의 디설파이드 브리지에 의해 연결된, 결합 단백질.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, V1A가 VL1이고, V1B가 VH1인, 결합 단백질.
- 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, V2A가 VH2이고, V2B가 VL2인, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) VH1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(b) VH1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; VL2가 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(c) VH1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2가 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(d) VH1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(e) VH1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2가 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(f) VH1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2가 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(g) VH1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2가 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(h) VH1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2가 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나;
(i) VH1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하거나; 또는
(j) VH1이 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL1이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2가 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL2가 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 결합 단백질. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) VH1 및 VL1이 각각 서열번호 41 및 43의 아미노산 서열에 상응하거나 또는 각각 서열번호 42 및 44의 아미노산 서열에 상응하고;
그리고/또는
(b) VH2 및 VL2가,
각각 서열번호 45 및 53의 아미노산 서열;
각각 서열번호 46 및 54의 아미노산 서열;
각각 서열번호 47 및 55의 아미노산 서열;
각각 서열번호 48 및 56의 아미노산 서열;
각각 서열번호 49 및 57의 아미노산 서열;
각각 서열번호 50 및 58의 아미노산 서열;
각각 서열번호 51 및 59의 아미노산 서열; 또는
각각 서열번호 52 및 60의 아미노산 서열
에 상응하는, 결합 단백질. - 제11항에 있어서,
(q) VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하며;
(r) VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하며;
(s) VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하며;
(t) VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며;
(u) VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하며;
(v) VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하며;
(w) VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하며;
(x) VH1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하며;
(y) VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하며;
(z) VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하며;
(aa) VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하며;
(bb) VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며;
(cc) VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하며;
(dd) VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함한다.
(ee) VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하며;
(ff) VH1은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하고; VL1은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하며; VH2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질. - 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
- 폴리펩타이드 (I)은 서열번호 64의 아미노산 서열로 이루어지고;
- 폴리펩타이드 (II)는 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어지고;
- 폴리펩타이드 (III)은 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어진, 결합 단백질. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액암의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 이형성 증후군(MDS) 또는 림프구 증식 장애의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, CD64-양성 및 CD64-음성 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
- 제20항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제20항의 핵산 분자를 포함하는 단리된 세포.
- 제21항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포.
- 제23항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포인, 단리된 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 제조 방법으로서,
(a) 복수의 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에 숙주 세포(들)를 배양시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 (i) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (ii) 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 (iii) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 단계;
(b) 선택적으로, 발현된 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계
를 포함하는, 방법. - 혈액암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제19항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 골수 이형성 증후군(MDS) 또는 림프구 증식 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제19항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 급성 골수성 백혈병(AML)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제19항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- CD64-양성 및 CD64-음성 급성 골수성 백혈병(AML)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제19항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- CD64-양성 급성 골수성 백혈병(AML)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제1 및 제2 항원 결합 도메인(ABD) 및 모든 또는 일부의 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 제1 ABD는 인간 CD123에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 ABD는 인간 NKp46에 특이적으로 결합하며, 모든 또는 일부의 상기 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 변이체는 인간 Fc-γ 수용체에 결합하는, 방법.
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