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TWI626061B - 治療癌症之奈米粒子及其用途 - Google Patents

治療癌症之奈米粒子及其用途 Download PDF

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TWI626061B
TWI626061B TW105104413A TW105104413A TWI626061B TW I626061 B TWI626061 B TW I626061B TW 105104413 A TW105104413 A TW 105104413A TW 105104413 A TW105104413 A TW 105104413A TW I626061 B TWI626061 B TW I626061B
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莊其穆
張啟泰
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友杏生技醫藥股份有限公司
建州生技醫藥有限公司
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Abstract

本發明提供一用於腹腔注射之抗癌奈米粒子之醫藥組合物及其用途，具有緩慢且持續釋放抗癌藥物之特性，可有效率地殺死腫瘤細胞。該奈米粒子之醫藥組合物，依據體外透析結果，可於8小時內釋放30%或30%以下的抗癌藥物。

Description

治療癌症之奈米粒子及其用途
本發明係提供治療癌症之方法，包括注射奈米藥物於患者腹腔，以達成較持續之藥物釋放和較佳之治療功效。
卵巢癌係卵巢細胞癌化生長所形成。超過90%以上的卵巢癌被歸類為上皮細胞癌，並且是由卵巢表面之上皮細胞所形成；但仍有其他報導指出，輸卵管亦可能為卵巢癌的來源。由於卵巢以及輸卵管之間的關係非常密切，因此輸卵管所形成之癌症與卵巢癌亦十分相似。除此之外，亦有可能來自卵細胞(生殖細胞瘤(germ cell tumor))或支持細胞(supporting cells)。故卵巢癌被歸類為婦科癌症的範疇。
治療卵巢癌通常採用化學藥物治療(chemotherapy)或手術，有時亦使用放射線治療。若是卵巢惡性腫瘤已高度分化並且癌細胞局限於卵巢上，可以手術移除；若腫瘤已具有高度侵略性，則可能額外施予化療藥物。如該病患具有更進一步之病症，將一併給予化療療程以及手術移除。
針對罹患第IIIC期卵巢上皮腺癌並且以手術移除大部分腫瘤細胞的患者，近期的臨床試驗結果顯示可有效地以腹腔內(intraperitoneal，IP)化療藥物注射延長患者平均存活時間。但是該項試驗中，患者之化療順從度(compliance)不高，並且僅不到半數的患者完成總共6次的 腹腔注射化療療程。儘管有一定比例的病患無法完成完整療程，該項試驗整體來說，接受腹腔內注射之病患其平均存活率高於接受靜脈注射之化療(intravenous chemotherapy)病患。即使腹腔注射化療普遍被建議為卵巢癌的第一線治療方法，但該方法之功效優劣仍不無爭議，並且仍未發展為第3或4期的卵巢癌標準療法。
大腸癌係另一常見癌症，而腹腔內的擴散是大腸癌末期之特徵。於腹腔內擴散的癌細胞造成惡性的腹部水腫；腫瘤細胞所產生的液體滲出至腹腔之中，並且是大腸癌致死的主要原因。
結合奈米科技以及普通化學治療可成為治療癌症的新療法，並可望獲得更佳的療效。近期臨床試驗已採用多種奈米粒子(nanoparticles，NPs)如微脂體(liposome)、白蛋白(albumin)等，企圖改良藥物的溶解度、功效以及降低其副作用。奈米粒子之通透性增強及停滯效應(enhanced permeability and retention effect,EPR效應)之優劣，成為奈米藥物發展的重要標準。
本發明係提供一種奈米粒子包覆抗癌藥物用於製備治療癌症之醫藥組合物之用途，該奈米粒子係具有適時地緩慢釋放抗癌藥物之特性，並且可有效地殺死腫瘤細胞。
本發明另提供一種包覆抗癌藥物之奈米粒子用於製備藉由局部注射治療癌症之醫藥組合物之用途，該奈米粒子可持續釋放藥物；該奈米粒子於胸膜內給藥
圖1 具持續釋放功能之微脂體紫杉醇，其例示之特性與協同作用；(1A)以穿透式電子顯微鏡(TEM)掃描微脂體之單層(unilamellar)形態，估計微脂體平均大小為100奈米；(1B)紫杉醇於體外(in vitro)自微脂體中釋放，以數學計算結果，係依循樋口釋放動力學(時間的平方根，R2=0.9864)，顯示其釋放機制受擴散作用控制；(1C)腫瘤內藥物濃度，分別比較Nano-Taxol和Taxol®、系統性給藥和局部給藥之組合；Nano-Taxol之局部給藥之結果具有最大曲線下面積(AUC0-∞)；(1D)以流式細胞儀分析比較腫瘤細胞以局部給藥Nano-Taxol和系統性給藥Taxol之細胞凋亡，後者給藥方法為現今卵巢癌的標準療法；前者產生之細胞凋亡(75.2%，上圖)顯著地高於後者(23.3%，下圖)；(1E)周-塔拉雷圖(Chou-Talalay plot)，係功效高低(Fa，x軸)與組合指數(y軸)之分析圖；6次試驗所得之藥物組合指數皆低於1，顯示奈米藥物和局部給藥具有協同作用；(1F)標準化等效抑制曲線(normalized isobolograms)，閾值線以下的值代表協同組合，各實驗進行3重複；圖2A-D 例示之Nano-taxol局部給藥治療效果；(2A)療程設計：各試驗中紫杉醇和Nano-taxol皆以每實驗小鼠10mg/kg之劑量給藥，D：實驗日程；(2B)治療功效評估：各小鼠於第1日移植2x105個ES-2細胞，並且於第5、8、11日進行前述劑量之治療；於第4日拍攝生物光學影像作為基準，第14日拍攝結果；紫杉醇局部給藥，於隨機化的第III期試驗(參考文獻25)，顯示些許治療效果；相對地，Nano-taxol局部給藥顯示最佳的 腫瘤胞殺效果；蓖麻油聚氧乙烯醚(商品名Cremophor EL)為紫杉醇載劑；EP：空的微脂體奈米粒子(empty particle)；(2C)各實驗組總體存活率之風險比(hazard ratio)：Nano-taxol局部給藥之風險比僅0.4為其中最佳(*,P值(顯著機率值)<0.05)；(2D)各實驗組白血球計數：Nano-taxol局部給藥實驗組小鼠白血球計數平均值，與紫杉醇系統性給藥並無統計上差異；各實驗皆進行3重複；圖3A-D 例示之Nano-platin局部給藥治療效果；(3A)療程設計：各試驗中順鉑和Nano-taxol皆以每實驗小鼠5mg/kg之劑量給藥；(3B)治療功效評估：各小鼠於第1日移植2x105個ES-2細胞，並且於第5、10日進行前述劑量之治療；於第4日拍攝生物光學影像作為基準，第14日拍攝結果；順鉑局部給藥，顯示些許治療效果，；然而，Nano-platin局部給藥幾乎沒有治療效果；(3C)各實驗組總體存活率之風險比；(3D)各實驗組白血球計數；各實驗皆進行3重複；圖4A-D 例示之Nano-topotecan局部給藥治療效果；(4A)療程設計：各試驗中托普樂肯和Nano-topotecan皆以每實驗小鼠10mg/kg之劑量給藥；(4B)治療功效評估：各小鼠於第1日移植2x105個ES-2細胞，並且於第5、10日進行前述劑量之治療；於第4日拍攝生物光學影像作為基準，第14日拍攝結果；托普樂肯局部給藥，顯示些許治療效果，；然而，Nano-topotecan局部給藥顯示最佳治療效果(*,P<0.05)；(4C)各實驗組總體存活率之風險比；(4D)各實驗組白血球計數；各實驗皆進行3重複；圖5A-D 例示之Nano-doxorubicin局部給藥治療效果；(5A)療程設計：各試驗中阿黴素和Nano-doxorubicin皆以每實驗小鼠5mg/kg之劑量給 藥；(5B)治療功效評估：各小鼠於第1日移植2x105個ES-2細胞，並且於第5、10日進行前述劑量之治療；於第4日拍攝生物光學影像作為基準，第14日拍攝結果；doxorubicin局部給藥，顯示些許治療效果，；(5C)各實驗組總體存活率之風險比；(5D)各實驗組白血球計數；各實驗皆進行3重複；圖6A-D 例示之亞伯杉劑(Abraxane®)局部給藥治療效果；(6A)療程設計：各試驗中紫杉醇和亞伯杉劑皆以每實驗小鼠10mg/kg之劑量給藥；(6B)治療功效評估：各小鼠於第1日移植2x105個ES-2細胞，並且於第5、8、11日進行前述劑量之治療；於第4日拍攝生物光學影像作為基準，第14日拍攝結果；紫杉醇局部給藥，顯示些許治療效果，；然而，亞伯杉劑局部給藥幾乎沒有殺死腫瘤的效果；EP：空的白蛋白奈米粒子(albumin empty particle)；(6C)各實驗組總體存活率之風險比；(6D)各實驗組白血球計數；各實驗皆進行3重複；圖7A-D Nano-taxol局部給藥抑制重要器官之癌症轉移；(7A)控制肝轉移：第1日於脾臟注射腫瘤細胞以誘發肝轉移，並於第8、11、14日依組別分別給予治療並且於第18日取出肝臟；結果顯示，Nano-taxol局部給藥(腹腔內)顯示其控制癌細胞轉移肝臟的功效最佳，圖示揭示代表圖，箭號表示腫瘤；(7B)控制肺轉移：第1日於尾靜脈注射腫瘤細胞以誘發肺轉移，接受局部(胸膜內)給藥治療的小鼠顯示Nano-taxol控制癌細胞轉移肺臟的功效最佳；(7C)腹膜後淋巴結轉移施予Nano-taxol腹腔內局部給藥以及控制組；(7D)施予Nano-taxol腹腔內局部給藥以及控制組，其不同器官轉移之總體存活率的風險比； 圖8A-H Nano-taxol局部給藥可發揮更佳的癌幹細胞胞殺效果；(8A)給予治療之球形腫瘤之形成能力：每實驗小鼠於第1日移植2x106個ES-2細胞，並於第5、8、11日依據前述劑量給予治療；於第14日取出各組別小鼠之腫瘤，分離為單細胞懸浮液後置於超低吸附培養皿中培養10日；施予紫杉醇局部治療之腫瘤顯示幾乎無微球形腫瘤形成，而其他3組治療(Taxol® i.v.,Taxol® i.p.,Nano-Taxol i.v.)後腫瘤有增大，圖示揭示代表圖；(8B)球形腫瘤形成之統計(平均值±標準差)；(8C)以流式細胞儀分析赫斯特33342染色的細胞，並辨別其中側群細胞，以側群細胞百分比表示；(D-G)以反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)分析幹細胞標誌表現量(8D)、EMT驅動訊息基因及其上皮或間質表現型(8E)、腫瘤血管新生基因(8F)、和多重抗藥性基因(8G)；(8H)保存幹細胞CXCR4/CXCL12表現量：紫杉醇局部給藥之治療組，其CXCR4/CXCL12表現量比控制組少；而經其他3組藥物治療的腫瘤(Taxol® i.v.,Taxol® i.p.,Nano-Taxol i.v.)其CXCR4/CXCL12表現量則高於控制組；各實驗進行3重複；圖9A-D Nano-taxol局部給藥可取代腹腔高溫化療；(9A)取出復發腫瘤並以流式細胞儀分析經赫斯特33342染色的側群細胞；復發腫瘤之側群細胞(3.6%，右圖)顯著地高於原發腫瘤(0.4%，左圖)，顯示復發腫瘤具有較多的癌幹細胞；SP：side population；(9B)腹腔高溫化療示意圖：說明流入和流出的孔洞，以及灌流時監測小鼠體內溫度的探針；小鼠以每分鐘3ml紫杉醇(10mg/kg)之流速灌流；(9C)針對復發腫瘤，紫杉醇之腹腔高溫化療以及Nano-taxol腹腔給藥皆可達成良好的控制腫瘤功效；(9D)腹腔高溫化療於該實驗組別產生的併發症，包括腸阻塞或腸 穿孔；Nano-taxol腹腔給藥之組別無併發症產生；各實驗進行3重複；圖10 依據本發明所實施而製備奈米粒子之方針；在二極端(結合過於緊密或鬆散)皆無法令奈米粒子產生最佳胞殺效果，太鬆散的螯合另一藥物作用模式近似於游離態藥物，僅產生中等療效；而太緊密螯合會使藥物無療效；只有藉由可持續釋放奈米藥物之局部給藥可適時地產生最佳的腫瘤胞殺效果；圖11 腫瘤細胞生長與生物發光影像之相關性；圖中標示之ES2-luc細胞數培養於24孔培養皿、37℃ 24小時，24小時後拍攝生物發光影像(IVIS-50 system)。
圖12A-B SCID小鼠體內腫瘤細胞生長與生物發光影像之相關性；各小鼠於第1日移植5×105個ES2-luc細胞，生物發光影像則於指定日期拍攝，其中1隻小鼠於17日死亡。
圖13 Nano-Taxol和Micelle-Taxol抑制腫瘤生長之結果；第1日，各小鼠接種5×105個ES2-luc細胞，並於第5、8、11日以圖中指定之藥物劑量進行治療；第4日拍攝生物發光影像之基準影像，第14日再次拍攝結果；Micelle-Taxol腹腔內給藥及系統性給藥皆有1隻小鼠於拍攝前死亡；圖14 圖13之生物發光影像之量化結果，其結果使用活體影像系統(Xenogen IVIS-50)和活體影像軟體(Caliper Life Sciences)分析之，數據以平均值±標準差表示；Nano-Taxol組別N=11，Micelle-Taxol組別N=10；圖15 10mg/kg Nano-Taxol劑量和10mg/kg Micelle-Taxol劑量對於腫瘤生長抑制治療效果；各實驗小鼠於第1日移植5x105個ES2-luc細胞，並 於第5、8、11日以10mg/kg劑量之Nano-Taxol或Micelle-Taxol進行治療；生物發光影像於第4日(基準影像)和第14日拍攝；圖16 帶有腫瘤的小鼠其腹腔解剖圖；小鼠各形成不同程度的腹水，解剖圖A(控制組)和B(Micelle-Taxoli.v.)顯示具有最嚴重的腹水和出血，施予Nano-TaxolMicelle-Taxol腹腔內給藥的小鼠(C-G)其腹水形成較A、B少；所有實驗小鼠皆在死亡後進行解剖(A、B：第19日；C、F、G：第21日；D、E：第26日)；圖17 使用活體影像系統拍攝腫瘤腹水；控制組小鼠的腹水揭示於圖16A，並收集培養；培養後的細胞以活體影像系統分析，該細胞產生生物發光影像訊號，顯示該腹水含有人類卵巢癌細胞株ES2-luc；圖18 圖17之動物實驗中，小鼠體重變化圖；圖19 ES2-luc細胞株注射至實驗小鼠腹腔內，再以Nano-Taxol和Micelle-Taxol治療之結果；第1日，5×105個ES2-luc細胞接種至小鼠腹腔，以鹽水為控制組載劑(●)，實驗組包括Micelle-Taxol系統性給藥(10mg/kg：○)、Micelle-Taxol腹腔給藥(10mg/kg：▼)、Nano-Taxol腹腔給藥(2mg/kg：△)、Nano-Taxol腹腔給藥(5mg/kg：■)、Nano-Taxol腹腔給藥(10mg/kg：□)和Nano-Taxol腹腔給藥(20mg/kg：◆)，分別於第5、8、11日給藥，並分析小鼠存活期(給予Nano-Taxol組別：n=11；給予Micelle-Taxol組別：n=10)；存活率計算係依據圖13之實驗小鼠；圖20 ES2-luc細胞株注射至實驗小鼠腹腔內，再以10mg/kg Nano-Taxol和Micelle-Taxol治療之結果；第1日，5×105個ES2-luc細胞接種至小鼠腹腔，以鹽水為控制組載劑(●)，實驗組包括Micelle-Taxol系統性給藥 (10mg/kg：○)、Micelle-Taxol腹腔給藥(10mg/kg：▼)，分別於第5、8、11日給藥，並分析小鼠存活期(給予Nano-Taxol組別：n=3；給予Micelle-Taxol組別：n=7)；存活率計算係依據圖15之實驗小鼠；圖21 生物發光影像與體外細胞生長之相關性；CT-26-luc以指示之細胞數培養於24孔培養基、37℃、24小時，生物發光影像於培養24小時候拍攝(IVIS-50 system)；圖22A-B生物發光影像與SCID小鼠體內細胞生長之相關性；第一日於小鼠體內植入1×105個CT-26-luc細胞，生物發光影像於指示日期拍攝；圖23A-B (23A)Nano-taxol和紫杉醇抑制腫瘤生長的結果；第一日於小鼠體內植入1×105個CT-26-luc細胞，並於第4、6、8日依指示劑量給予Nano-taxol或紫杉醇治療；生物發光影像於第4(基準值)、14日拍攝；(23B)圖23A之生物發光影像之量化圖，其結果使用活體影像系統(Xenogen IVIS-50)和活體影像軟體(Caliper Life Sciences)分析之，數據以平均值±標準差表示；Nano-Taxol組別N=8，控制組和紫杉醇組別N=7；圖24 圖23A-B動物實驗結果之小鼠體重；圖25 ES2-luc細胞株注射至實驗小鼠腹腔內，再以Nano-Taxol和紫杉醇治療之結果；第1日，5×105個ES2-luc細胞接種至小鼠腹腔，以鹽水為控制組載劑(●)，實驗組包括紫杉醇系統性給藥(10mg/kg：○)、紫杉醇腹腔給藥(10mg/kg：▼)、Nano-Taxol系統性給藥(10mg/kg：△)、Nano-Taxol腹腔給藥(10mg/kg：■)，分別於第4、6、8日給藥，並分析小鼠存活期(給予Nano-Taxol組別：n=8；給予Micelle-Taxol組別和控制組：n=7)；存 活率計算係依據圖23之實驗小鼠。
本發明之新穎技術特徵，包含特定特徵，係揭示於申請專利範圍，針對本發明之技術特徵，較佳之理解茲配合說明書、依據本發明原理之實施例、和圖式將本創作較佳之實施例詳細說明如下
奈米粒子(NP)相關之醫藥組合物皆以EPR效應為試驗原則。理論上，NP藥物應因具有藥物動力學上的優勢，可於系統性循環中延長藥物半衰期。儘管具有上述優勢以及多項專利及研究發表，奈米藥物的發展仍於多方面受限。此外，腫瘤標靶藥物於施藥上最大的障礙在於往往高估了EPR效應。
舉例來說，雖然聚乙二醇(PEG)化微脂體阿黴素(PEGylated liposomal doxorubicin)(DOXIL,Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development,L.L.C.,Raritan,NJ；CAELYX,Schering-Plough Corporation,Kenilworth,NJ)，第一個被美國食品藥物局核准的奈米藥物，已被證實於腫瘤中有顯著地累積，有2項第III期的臨床試驗，比較Doxil®與阿黴素治療轉移性乳癌之效果，前者儘管有良好的EPR效果，但並無較顯著的腫瘤治療效果以及存活率。另一核准之奈米藥物亞伯杉劑(Abraxane®)，一種具有良好EPR之白蛋白結合紫杉醇(albumin-binding paclitaxel)，必須施予高於紫杉醇劑量之50%之劑量，以達到相同的腫瘤治療效果以及存活率；以可轉移性乳癌患者而言，並無較佳的存活率(65.0 weeks vs.55.7 weeks,P=0.374)。此外，一項用於Abraxane®藥物登記許可的第III期可轉移性非微小細胞肺癌 (NSCLC)之關鍵臨床試驗，其治療存活率中位數為12.1月，僅比目前常用的紫杉醇治療存活率：11.2月，延長0.9月的存活時間(P=0.271)。有鑑於總體存活率仍然是評估藥物治療最重要的準則，奈米藥物的EPR效應仍難以轉變為抗癌功效。
紫杉醇(Paclitaxel)是一種用於治療卵巢癌、肺癌、乳癌、胰臟癌、以及其他癌症的藥物，該藥物為美國國家癌症研究所於太平洋紫杉(Taxus brevifolia)的樹皮所篩選以及命名(taxol)。紫杉醇由Bristol-Myers Squibb公司所開發，並且學名藥命名為paclitaxel，商品名為Taxol。另有商品名Abraxane®。醫師常以PTX為簡寫指稱紫杉醇，儘管因容易混淆而不鼓勵如此使用。因此，若無特別說明，紫杉醇即指涉taxol、Taxol、Abraxane®、PTX等與紫杉醇具有相同化學結構之藥物。
局部化療例如腹腔內化療，對於腹腔的腫瘤治療有其藥物動力學上的優勢，由於藥物在腹腔的濃度比在全身循環的血中高因而增加腹腔與血漿之曲線下面積比。臨床上使用局部化療之相關案例，包括使用腹腔注射之順鉑(cisplatin)治療卵巢癌患者，該藥物的腹腔曲線下面積是全身循環血中(systemic compartment)的20倍；以及由肝動脈灌注脫氧氟尿苷(floxuridine)，其腫瘤中藥物濃度是以肝門靜脈灌注的15倍。但縱然上述藥物具有藥物動力學之優勢，腹腔內注射療法仍有若干缺點，包括小分子藥物清除過快、專一性低、以及藥物穿透組織能力較低。
若結合奈米技術以及局部化療，即奈米藥物局部治療(regional delivery of nanomedicine)，則可能透過互補來克服各自的短處。首先，奈米藥物局部治療如同前文所述，可能因奈米粒子以及局部化療，而 具有藥物動力學之優勢。二來，疏水性或溶解度低的局部化療藥物，可能因低吸收率以及低生物可利用率(bioavailability)而具有若干缺點，奈米技術可改善藥物之低溶解度並且協助開發更多可能之化療藥物。第三，有些常用的抗癌藥物係抑制細胞分裂週期而需較長之作用時間，包括5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、紫杉醇、和喜樹鹼(camptothecin)等，故奈米藥物之持續釋放藥物的特性可克服作用時間的限制。再者，普通的化療常因藥物快速分解而限制其治療效果，所以必須反覆地注射藥物；並且普通化療藥物於腹腔內注射所造成之高濃度累積往往造成該處之毒性，奈米技術則可協助藥物持續釋放而降低高藥物濃度所造成的毒性。
結合奈米科技以及普通的化學治療可成為治療癌症的新療法，並可望獲得更佳的療效。近期臨床試驗已採用多種奈米粒子(nanoparticles，NPs)如微脂體、白蛋白等，企圖改良藥物的溶解度、功效以及降低其副作用。奈米粒子之滲透性增強及留滯效應(enhanced permeability and retention effect,EPR效應)之優劣，成為奈米藥物發展的重要準則。
為了加速藥物開發以及研究EPR效應是否確實影響奈米藥物的療效，本發明測試多種已核准或開發中之奈米藥物，包括微脂體紫杉醇(liposomal paclitaxel，命名為Nano-taxol，取自台灣工業技術研究院)、含順鉑之聚微胞(cisplatin-incorporating polymeric micelles，命名為Nano-platin，取自NanoCarrier Co.,Ltd.,Kashiwa,Japan)、含托普樂肯之聚微胞(polymeric micelle topotecan，命名為Nano-topotecan取自台灣微脂體公司)、PEG化微脂體阿黴素(命名為Nano-doxorubicin、Doxil、或Caelyx，取自Merck & Co.,Whitehouse Station,New Jersey,USA)、和白蛋白結合紫杉醇 (命名為Abraxane®取自Celgene,NJ,USA)；並設計2因子試驗，其中包含第1因子係比較系統性以及局部性給藥(systematic delivery versus regional delivery)以及第2因子係比較游離態藥物以及奈米藥物(free drug versus nanomedicine)。於各項因子試驗中，活性藥物以相同劑量給予。
本發明挑選之奈米藥物針對卵巢癌、大腸癌、以及其他癌症進行腹腔內之活體內(in vivo)試驗。
依據本發明之實施，抗癌藥物之腹腔注射化療之f缺點可以用奈米藥物載體來克服，達成持續釋放藥物的目的。前述示例之奈米藥物如Nano-taxol和Micelle-taxol，可經腹腔注射抑制卵巢癌腫瘤(實施例7)。Nano-taxol依其劑量具有抗癌活性並且可於20毫克/公斤(mg/kg)之劑量下根除11隻實驗小鼠其中8隻小鼠之腹腔中之卵巢癌。於10mg/kg之劑量，11隻實驗小鼠其中3隻小鼠的腫瘤可被根除，且降低其中8隻小鼠之腫瘤負擔。其反應率為100%。
針對人類移植腫瘤模式小鼠(human xenograft tumor mice model)，腹腔注射之Nano-taxol具有治療卵巢癌之功效(實施例7)。為研究腹腔注射Nano-taxol對於其他腹腔癌症之療效，本案使用同基因型大腸癌之小鼠模式(syngeneic mice model)，研究Nano-taxol經腹腔(i.p.)注射或靜脈(i.v.)注射治療之功效(實施例8)，發現Nano-taxol經腹腔注射可抑制大腸癌細胞株CT-26-luc於活體內生長。
於本發明一實施例，揭示一種腹腔內治療癌症之方法，包含施予患者包覆於奈米粒子中之抗癌藥物，其中該奈米粒子具有適時地緩慢釋放藥物以殺死癌細胞之特性。於一特定實施例中，該奈米粒子依體外透 析結果具有每8小時30%以下之釋放率之特性。於另一特定實施例，該癌症係卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌、或大腸癌。於另一特定實施例，該癌症係卵巢癌。於另一特定實施例，該癌症係大腸癌。
於另一特定實施例，該抗癌藥物係選自吉西他濱(gemcitabine)、伊達比星(idarubicin)/阿糖胞苷(cytarabine)(/：合併使用)、依託泊苷磷酸鹽(etoposide phosphate)、伊馬替尼(imatinib/gleevec)、替莫唑胺(temozolomide)、硼替佐米(bortezomib)、來曲唑(letrozole)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、紫杉醇、Nab-紫杉醇(nab-paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、厄洛替尼(erlotinib)、培美曲塞(pemetrexed)、培美曲塞/卡鉑(carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel)/卡鉑、來曲唑/環磷醯胺(Cyclophosphamide)、替羅莫司(temsirolimus)、貝伐珠單抗/替羅莫司、伊匹木單抗(ipilimumab)、依維莫司(everolimus或RAD001)、帕唑帕尼(pazopanib)、FOLFIRI(5-氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸(leucovorin)/愛萊諾迪肯(Irinotecan)合併療法)、I類磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)抑制劑Buparlisib(BKM120)、曲美替尼(Trametinib或GSK1120212)、PI3K/mTOR抑制劑PF-05212384(PKI-587)/愛萊諾迪肯、腫瘤血管生成抑制劑Cediranib(AZD-2171)、PI3K/mTOR抑制劑PF-04691502、環磷醯胺、順鉑、阿糖胞苷/唐黴素注射劑(Daunorubicin)、temsirolimus、厄洛替尼/替羅莫司、卡培他濱(capecitabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、、曲妥珠單抗(trastuzumab)、多西他賽/卡培他濱、曲妥珠單抗/法尼基轉移酶(Farnesyltransferase)抑制劑Tipifarnib、tipifarnib/吉西他濱、和托普樂肯(Topotecan)、和上述藥物或療法之組合所構成之群組。於另一特定實施例 中，該抗癌藥物係紫杉醇。
於本發明一實施例，前述奈米粒子(包覆抗癌藥物)包含一第一磷脂質、第二磷脂質、以及微脂體構成材料；該第一磷脂質係選自氫化自然磷脂質(hydrogenated naturally-occurring phospholipid)和具長碳鍊之飽和磷脂質(-(CH2)n-，n大於14)所構成之群組，且該第一磷脂質向變(phase transition)溫度Tg1介於40~74℃；該第二磷脂質係選自非飽和磷脂質和具短鍊飽和磷脂質(-(CH2)n-，n不大於14)所構成之群組，且該第二磷脂質向變(phase transition)溫度Tg2介於-30~10℃；該微脂體構成材料可構成微脂體，該微脂體於其中包覆互不相溶之第一磷脂質與第二磷脂質並為不連續區域，且於其中第一磷脂質與第二磷脂質之莫爾比例至少為3：16；該為微脂體所包覆之抗癌藥物之莫爾百分率至少為20%。於另一特定實施例，該奈米粒子之包覆藥物之能力係於製造奈米藥物6個月之後仍可包覆約70%或以上之藥物。於另一特定實施例，該第一磷脂質係選自磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine，PC)、磷脂丙三醇(phosphatidylglycerol，PG)、磷脂絲胺酸(phosphatidylserine，PS)、磷脂酸(phosphatidyl acid，PA)、以及磷脂乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)所構成之群組。於另一特定實施例，該第一磷脂質係選自氫化卵磷脂(hydrogenated egg phosphatidylcholine，HEPC)、氫化大豆磷脂質(hydrogenated soy phosphatidylcholine，HSPC)、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(distearoyl phosphatidylcholine，DSPC)、二花生油酸磷脂醯膽鹼(diarachidoyl phosphatidylcholine)、二肉豆蔻醯基磷脂乙醇胺(dimyristoyl phosphatidylethanolamine，DMPE)、二軟脂醯基磷脂乙醇胺(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine，DPPE)、二硬脂醯磷脂乙醇胺(distearoyl phosphatidylethanolamine，DSPE)、二軟脂醯基磷脂丙三醇(dipalmitoyl phosphatidylglycerol，DPPG)、二硬脂醯磷脂丙三醇(distearoyl phosphatidylglycerol)、二肉豆蔻醯基磷脂酸(dimyristoyl phosphatidyl acid，DMPA)、二軟脂醯基磷脂酸(dipalmitoyl phosphatidyl acid，DPPA)、二軟脂醯基磷脂絲胺酸(dipalmitoyl phosphatidylserine，DPPS)、以及二硬脂醯磷脂絲胺酸(distearoyl phosphatidylserine，DSPS)所構成之群組；前述奈米粒子可為、但不限於Nano-taxol。
於本發明一特定實施例，該奈米粒子係用於治療腹腔內癌症，且包含至少一嵌段共聚物，該嵌段共聚物包含一疏水性嵌段、一與疏水性嵌段鍵結之親水性嵌段、以及至少一兩性離子。於另一特定實施例，該兩性離子具有一正電荷以及一負電荷且與疏水性嵌段鍵結。於另一特定實施例，該疏水性嵌段係選自聚己內酯(polycaprolactone，PCL)、聚戊內酯(polyvalerolactone，PVL)、聚乳酸甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide acid)，PLGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、和聚丁內酯(polybutyrolactone，PBL)、聚甘醇酸(polyglycolide，PGA)、聚丙內酯(polypropiolactone，PPL)所構成之群組；該親水性嵌段係選自聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、玻尿酸(hyaluronic acid，HA)、和聚γ-麩胺酸(poly-γ-glutamic acid，PGA)所構成之群組。
於本發明一實施例，該奈米粒子係用於治療腹腔內癌症，且包含一聚微胞(如Micelle-taxol)，該聚微胞包含一嵌段共聚物具有以下化學 結構：，其中R係氫基、 C1-6烷基、苯甲基(benzyl group)、或醯基；其中m、n係分別為介於10-100之整數。於另一特定實施例中，該聚微胞之直徑係介於20至1,000奈米(nm)。於另一特定實施例中，該聚微胞內側為疏水性、表面為親水性。
於本發明一實施例，揭示一種局部給藥治療癌症之方法，包含施予患者之抗癌藥物包覆於可緩慢釋放藥物之奈米粒子中，其中該抗癌藥物和奈米粒子係於胸膜內給藥。於一特定實施例中，該癌症係卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌、或大腸癌。於另一特定實施例中，該癌症具有轉移性。於一實施例中，該患者腹腔中具有嚴重沾黏(severe adhesion)。於一特定實施例中，該抗癌藥物係紫杉醇。
特定藥學及醫學用語
本發明說明書及申請專利範圍中所述之所有技術性及科學用語，除非另有所定義，皆依據以下敘述定義之。其中單數用語「一」、「一個」、「該」，除非另有說明，皆可指涉多於一個對象。除非另有說明，本發明採用之通常技術包括核磁共振(NMR)、高效液向層析法(HPLC)、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術、藥理學技術。本說明書使用之「或」、「以及」、「和」，除非另有說明，皆指涉「或/和」。此外，用語「包含」、「包括」皆非有所限制之開放式連接詞。前述段落僅為系統性之指涉而不應解釋為對發明主體之限制。除非另有說明，本發明所用之材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。
本說明書中關於化學式、醫藥組合物、或成分之用語「可接 受」係指涉對於服藥者之通常健康，不具有持續有害之影響。
本說明書用語「載劑(carrier)」，係指涉不具毒性之化合物或藥劑，其具有協助細胞或組織吸收藥物之功能。
本說明書用語「合併使用」或近似用語，係指涉給予、施予一患者至少一種選擇之藥物，且包含一療程，該療程係同時或分別以相同或多種途徑給藥。
本說明書用語「稀釋劑」，係指涉給藥前用以稀釋藥物之化合物。稀釋劑可用於穩定化合物或藥物，因其可提供較穩定之外在環境。本發明用於溶解鹽類之緩衝溶液，包括但不限於磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBS)。
本說明書用語「有效量(effective amount)」或「治療(therapeutically)有效量」，係指涉化合物或藥物之一足夠量，可於患者服藥後減輕一或多項疾病症狀或生理狀況；其結果為降低和/或緩和徵象(sign)、症狀(symptom)、或病因，或為其他生理系統之有意圖之改變。舉例而言，治療之「有效量」係包含一本發明提供化合物之可於臨床上顯著降低疾病症狀之劑量。一適當之有效量，其有效值取決於通常藥學技術，如藥物增量方法(dose escalation methods)。
本說明書用語「提高」、「提升」或近似用語，係指涉增加或延長藥物之意圖之效力或持續期間。因此，提升治療藥物之療效，其中「提升」係指涉其餘治療系統中增加或延長之能力，該能力係藥效或持續期間。本說明書用語「提高有效量」係指涉一用以增加另一於治療系統中之治療藥物效果之適當量。
本說明書用語「藥學組合」，係指涉一產物，該產物係來自混和或組合多於一種活性成分，並且該產物之活性成分係組合藥或非組合藥之組合物。用語「組合藥」說明其活性成分，如包覆於奈米粒子中之抗癌藥物，及其助劑(co-agent)係同時以一藥劑給予患者；用語「非組合藥」說明其活性成分，如包覆於奈米粒子中之抗癌藥物，及其助劑(co-agent)係以分離之藥劑同時、分別、或依序地施予患者且無限制其用藥間隔，前述施予提供患者於體內具有有效量之多種化合物；其中該非組合藥可應用於雞尾酒療法，即施予三種或多種活性成分。
本說明書用語「醫藥組合物」指涉包覆於奈米粒子中之抗癌藥物及其他化學成分之混和，該化學成分包含載劑、安定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增厚劑、或賦形劑、或上述之組合；該醫藥組合物協助將藥物或化合物給予一生物體；本發明可應用多項給藥技術，包括但不限於靜脈注射、口服、氣霧、非消化道給藥(parenteral)、眼部給藥、肺部給藥、或局部給藥、或上述給藥途徑之組合。
用語「患者」、「治療主體」或近似用語，係哺乳動物，該哺乳動物包含但不限於屬於哺乳綱之動物，如人類、非人靈長類如黑猩猩、猿、猴，或畜牧動物如牛、馬、綿羊、山羊、豬，或家庭動物如兔、狗、貓，或實驗動物如囓齒動物、大鼠、小鼠、天竺鼠、或近似動物。於一特定實施例，該哺乳動物為人類。
本說明書用語「治療」、「治療中」、「療法」，係包含以治療或預防之方式緩和、減輕、或改善至少一項疾病症狀或生理狀況、預防新增之症狀、抑制疾病或生理狀況、阻止或減緩疾病發展、造成疾病或生理 狀況之復原、減緩因疾病造成的生理狀況、停止疾病症狀或生理狀況。
醫藥配方
於本發明另一實施例，本發明提供之包覆抗癌藥物之奈米粒子係包含一第一磷脂質、第二磷脂質、以及微脂體構成材料；該第一磷脂質係選自氫化自然磷脂質和具長碳鍊之飽和磷脂質(-(CH2)n-，n大於14)所構成之群組，且該第一磷脂質向變溫度Tg1介於40~74℃；該第二磷脂質係選自非飽和磷脂質和具短鍊飽和磷脂質(-(CH2)n-，n不大於14)所構成之群組，且該第二磷脂質向變溫度Tg2介於-30~10℃；該微脂體構成材料可構成微脂體，該微脂體於其中包覆互不相溶之第一磷脂質與第二磷脂質並為不連續區域，且於其中第一磷脂質與第二磷脂質之莫爾比至少為3：16；該為微脂體所包覆之抗癌藥物之莫爾百分率20%。於另一特定實施例，該奈米粒子之包覆藥物之能力係於製造奈米藥物6個月之後仍可包覆約70%或以上之藥物。於另一特定實施例，該第一磷脂質係選自磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂丙三醇(PG)、磷脂絲胺酸(PS)、磷脂酸(PA)、以及磷脂乙醇胺(PE)所構成之群組。於另一特定實施例，該第一磷脂質係選自氫化卵磷脂(HEPC)、氫化大豆磷脂質(HSPC)、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二花生油酸磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯基磷脂乙醇胺(DMPE)、二軟脂醯基磷脂乙醇胺(DPPE)、二硬脂醯磷脂乙醇胺(DSPE)、二軟脂醯基磷脂丙三醇(DPPG)、二硬脂醯磷脂丙三醇、二肉豆蔻醯基磷脂酸(DMPA)、二軟脂醯基磷脂酸(DPPA)、二軟脂醯基磷脂絲胺酸(DPPS)、以及二硬脂醯磷脂絲胺酸(DSPS)所構成之群組；前述奈米粒子可為、但不限於Nano-taxol。
於本發明一特定實施例，該奈米粒子係用於治療腹腔內癌 症，且包含至少一嵌段共聚物，該嵌段共聚物包含一疏水性嵌段、一與疏水性嵌段鍵結之親水性嵌段、以及至少一兩性離子。於另一特定實施例，該兩性離子具有一正電荷以及一負電荷且與疏水性嵌段鍵結。於另一特定實施例，該疏水性嵌段係選自聚己內酯(PCL)、聚戊內酯(PVL)、聚乳酸甘醇酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、和聚丁內酯(PBL)、聚甘醇酸(PGA)、聚丙內酯(PPL)所構成之群組；該親水性嵌段係選自聚乙二醇(PEG)、玻尿酸(HA)、和聚γ-麩胺酸(PGA)所構成之群組。
於本發明一實施例，該奈米粒子係用於治療腹腔內癌症，且包含一聚微胞(如Micelle-taxol)，該聚微胞包含一嵌段共聚物具有以下化學 結構：，其中R係氫基、 C1-6烷基、苯甲基、或醯基；其中m、n係分別為介於10-100之整數。
本發明使用之抗癌藥物係選自吉西他濱、伊達比星/阿糖胞苷、依託泊苷磷酸鹽、伊馬替尼、替莫唑胺、硼替佐米、來曲唑、西妥昔單抗、貝伐珠單抗、紫杉醇、Nab-紫杉醇、多西他賽、厄洛替尼、培美曲塞、培美曲塞/卡鉑、紫杉醇/卡鉑、來曲唑/環磷醯胺、替羅莫司、貝伐珠單抗/替羅莫司、伊匹木單抗、依維莫司、帕唑帕尼、FOLFIRI(5-氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸/愛萊諾迪肯合併療法)、I類磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)抑制劑BKM120、曲美替尼、PI3K/mTOR抑制劑PF-05212384(PKI-587)/愛萊諾迪肯、腫瘤血管生成抑制劑Cediranib(AZD-2171)、PI3K/mTOR抑制劑PF-04691502、環磷醯胺、順鉑、阿糖胞苷/唐黴素注射劑、temsirolimus、厄洛替尼/替羅莫司、卡培他濱、他莫昔芬、、曲妥珠單抗、多西他賽/卡培 他濱、曲妥珠單抗/法尼基轉移酶抑制劑Tipifarnib、tipifarnib/吉西他濱、和托普樂肯、和上述藥物或療法之組合所構成之群組。於另一特定實施例中，該抗癌藥物係紫杉醇。
於本發明一實施例，本發明之奈米粒子係包覆抗癌藥物之奈米粒子(如Nano-taxel)或聚微胞(如Micelle-taxol)，該抗癌藥物可被適時而持續地釋放，且有效地殺死腫瘤細胞(圖10)。
於本發明一實施例，本發明之奈米粒子係包覆紫杉醇之奈米粒子(如Nano-taxel)或聚微胞(如Micelle-taxol)，該紫杉醇可被適時而持續地釋放，且有效地殺死腫瘤細胞(圖10)。
本發明實施例提供醫藥組合物，該醫藥組合物係本發明之奈米粒子及其他化學成分之混和，該化學成分包含載劑、安定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增厚劑、或賦形劑、或上述之組合；該醫藥組合物協助將藥物或化合物給予一生物體。本發明說明書實施例提供之治療方法以及治療有效量之奈米粒子係以醫藥組合物之形式給予罹患疾病或生理狀況之哺乳動物。於一特定實施例，該哺乳動物為人類。於另一特定實施例，治療有效量依據疾病嚴重程度、患者年齡、患者健康狀態、癌症潛在風險、或其他因素而改變。前述奈米粒子可單獨或組合、混和一或多種治療用之成分而使用。
製備本發明之奈米粒子之醫藥組合物的方法，包含以一或多種不與藥物反應之載劑或佐劑配製該奈米粒子，以形成固態、半固態、或液態之醫藥組合物之形式。前述醫藥組合物之形式包含液態溶液、懸浮液、適合於給藥前調配為液態溶液或懸浮液之固態藥物、或乳化液；前述醫藥 組合物可選擇性地包含少量之無毒性輔助物質，包含潤濕劑、乳化劑、酸鹼值緩衝劑或其他。
前述醫藥組合物亦可選擇性地包含溶解劑，以提高本發明之奈米粒子之溶解度。本發明用語「溶解劑」係可形成溶液或微胞溶液之成分之通稱；特定之溶解劑，包含但不限於可接受之非離子性界面活性劑或眼科學上可接受之乙二醇、聚乙二醇、或乙二醇酯，該界面活性劑可為聚山梨醇酯80(polysorbate 80)，該聚乙二醇可為聚乙二醇400。
再者，於前述實施例中之醫藥組合物可選擇性地包含一或多種酸鹼值調整劑或緩衝劑，該調整劑或緩衝劑包含酸性溶液以及鹼性溶液，該酸性溶液係乙酸、硼酸、乳酸、磷酸、或鹽酸、或前述之組合，該鹼性溶液係氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、或三羥甲基氨基甲烷(Tris)、或前述之組合，該緩衝劑可為檸檬酸/葡萄糖溶液、碳酸氫鈉、或氯化銨、或前述之組合。前述之酸性溶液、鹼性溶液、緩衝劑以特並比例混和後，可維持組合物酸鹼值於一可接受之範圍。
此外，前述實施例中之醫藥組合物可選擇性地包含一定量之一或多種鹽類，該鹽類之量以令該組合物之滲透壓維持一可接受之範圍為準；該鹽類包含但不限於陽離子如鈉、鎂、銨，和陰離子如氯、檸檬酸鹽、抗壞血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氫根、硫、硫代硫酸根、硫酸氫根；適當之鹽類包含但不限於氯化鈉、氯化鉀、硫代硫酸鈉、硫酸氫鈉、和硫酸銨。
其他醫藥組合物可選擇性地包含一或多種防腐劑，用於抑制微生物之活性。適當之防腐劑包括但不限於含汞物質如硼酸苯汞 (Phenylmercurium borate，又名merfen)或硫柳汞(thiomersal)、穩定化之二氧化氯(stabilized chlorine dioxide)、四級銨化合物如氯化卞二甲烴銨(benzalkonium chloride)、溴化十六烷基三甲基銨(cetyltrimethylammonium bromide)、氯化十六烷基三甲基銨(cetylpyridinium chloride)。
其他醫藥組合物可選擇性地包含一或多種界面活性劑，以提高物理穩定性或其他用途。適當之非離子性界面活性劑包含但不限於聚氧乙烯、脂肪酸甘油脂、植物油，如聚氧乙烯60、氫化蓖麻油(hydrogenated castor oil)，以及聚氧乙烯烷基醚、烷基苯醚如辛基酚聚醚-10、辛基酚聚醚-40。
其他醫藥組合物可選擇性地包含一或多種抗氧化劑，以提高化學穩定性。適當之抗氧化劑包括但不限於抗壞血酸或偏焦亞硫酸鈉(sodium metabisulfite)。
於另一特定實施例，醫藥組合物之液態懸浮液係包裹於單劑(single-dose)之非複接型(non-reclosable)容器。相對地，多劑(multi-dose)可複接型容器可用於包含防腐劑之組合物。
於另一特定實施例，本說明書之醫藥配方包含一或多種抗氧化劑、金屬螯合劑、含硫醇化合物、或其他通常之穩定劑、或前述成分之組合。穩定劑包括但不限於約0.5-2%(w/v)甘油、約0.1-1%甲硫胺酸、約0.1-2% 1-硫甘油(monothioglycerol)、約1-10毫莫耳每單位升(mM)伸乙二胺四乙酸(EDTA)、約0.01-2%抗壞血酸、約0.003-0.02%聚山梨醇酯80、約0.001-0.05聚山梨醇酯20、精胺酸(arginine)、肝素(heparin)、硫化葡聚糖(dextran sulfate)、環糊精(cyclodextrins)、聚戊醣多硫(pentosan polysulfate)、 類肝素、二價陽離子如鎂、鋅、或前述穩定劑之組合。
組合治療(combination treatment)之通常考量
通常而言，關於實施例中說明及採用之組合治療，本說明書所述之組合物以及其他藥劑成分不必以同一醫藥組合物給藥；於實施例中，因不同的物理和化學特性，可以不同途徑給藥。於本案實施例中，初期給藥係依據已建立之給藥流程，再由臨床醫師依據藥物功效、劑量、給藥模式、給藥次數等而更動。
於本發明實施例中，治療有效劑量依據組合治療而變動。組合治療可進一步包括週期性治療，該週期性治療係指涉多次起始以及停止之治療以助於病患之臨床管理。關於本說明書所述之組合治療，共同給藥之化合物之劑量，依據共同給藥之藥物、主要治療之藥物、疾病、生理異常、生理狀況等因子而變動。
於本發明實施例中，為達成治療、預防、或改善生理狀況以及緩和症狀，給藥療程係依據多項因子而變動或修正；前述因子包含病患之生理異常、年齡、體重、性別、飲食、用藥情況等。因此，於本案另一實施例，劑量療程可廣泛地變動以及偏離起初之給藥療程。
實施例1 用於生長腫瘤細胞之模式動物和細胞株
將人類卵巢癌細胞株ES-2(2×105細胞/小鼠，ATCC no.CRL-1978)，於實驗第0日(d0)注射至五週大之嚴重合併性免疫不全病(SCID)小鼠(CB.17 scid/scid)腹腔，使腫瘤生長；並於第3週以小鼠是否腹部膨大以及具有惡性水腫，判斷腫瘤是否確實生長。本實施例所使用之模式動物購買於國家實驗動物中心，並且保存於台北榮民總醫院(台北)動物腫瘤學實驗 室。動物實驗皆依據動物健康照護規範，且皆由實驗動物照護及使用委員會所核准進行。帶有腫瘤之小鼠於顯示出疾病徵兆時施以安樂死，該徵兆包括毛皮皺裂、呼吸速度加快、弓背、活動力下降、以及持續水腫。將小鼠區分為數個組別進行給藥治療。本實施例以2因子試驗進行，其中第1因子係比較系統性以及局部性給藥以及第2因子係比較游離態藥物以及奈米藥物，各試驗給藥劑量皆相等。數種以許可或開發中奈米藥物，包含作為例示之微脂體紫杉醇(liposomal paclitaxel，命名為Nano-taxol，取自台灣工業技術研究院)、含順鉑之聚微胞(cisplatin-incorporating polymeric micelles，命名為Nano-platin，取自NanoCarrier Co.,Ltd.,Kashiwa,Japan)、、含托普樂肯之聚微胞(polymeric micelle topotecan，命名為Nano-topotecan取自台灣微脂體公司)、PEG化微脂體阿黴素(命名為Nano-doxorubicin、Doxil、或Caelyx，取自Merck & Co.,Whitehouse Station,New Jersey,USA)、和白蛋白結合紫杉醇(命名為Abraxane®取自Celgene,NJ,USA)。針對各藥物(游離態藥物和奈米藥物)給藥計畫以先前研究中的最大容許劑量為準。肺癌細胞轉移以尾靜脈注射誘發之；肝癌細胞轉移以脾臟注射；腹膜後淋巴癌細胞轉移(retroperitoneal lymphatic metastases)則以子宮內(intra-uterine)注射。各奈米藥物之醫藥組合物於藥物購買資料所說明或調配，例如Nano-taxol包含HSPC、膽固醇、d-α-生育酸聚乙烯乙二醇琥珀酸(d-alpha-tocopheryl polyethylene glycol succinate)。
實施例2 腫瘤細胞之紫杉醇試驗
以HPLC測定紫杉醇奈米粒子於體內釋放之藥物動力學
本實施例使用例示藥物紫杉醇奈米粒子(如微脂體紫杉醇) 以及室溫透析方法分析藥物之釋放，並且與游離態之紫杉醇(未包覆於奈米粒子)相比較。首先，於PBS(pH 7.4)回溶冷凍乾燥之微脂體並且配製1.5毫克/毫升(mg/ml)之紫杉醇，取0.1ml微脂體懸浮液置於透析管(MWCO 6000-8000,Gene Bio-Application Ltd.,Israel)之中，並且密封之。再將透析管浸泡於200ml之釋放基質，即含有0.1%(體積比例，v/v)聚山梨醇酯80(Tween 80)之PBS(pH 7.4)，且保持浸入；並使用磁性攪拌子以每分鐘300轉(rpm)速度攪拌該釋放基質，之後24小時內於預先設定之時間間隔取出0.5ml釋放基質樣本；取出同時，另加入相同量之新鮮釋放基質。樣本以乙腈(acetonitrile)適當稀釋後，並不需其他處理，再以HPLC測定紫杉醇濃度。
分析紫杉醇濃度之試驗以安捷倫1100系列層析系統(Agilent 1100 series chromatographic system,Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)進行；層析之分離以C18 Altima TM管柱(4.6mm ID,150mm；5μm)(Grace,MA)進行以及同軸玻璃濾器(Phenomenex® SecurityGuardTM in-line filter frit,Torrance,CA,USA)保護之。層析法之液相由水、甲醇、以及乙腈(25：35：40,v/v)所組成，該液相以0.45微米(μm)濾紙(Millipore,Bedford,MA,USA)過濾，並於分析前脫氣(degassed)。HPLC於室溫中沖提8分鐘，其流速為每分鐘1.0ml，並以量化分析其230nm光波照射結果之波峰；以標準濃度50-50,000奈克(ng)/ml之紫杉醇為校正基準，量化結果之校正曲線呈現線性，且其相關係數為R 2=0.999；量化偵測極限為50ng/ml。
本試驗中，Nano-taxol為主要之測試藥物，用以測試其持續釋放之功能。穿透式電子顯微鏡拍攝之Nano-taxol揭示於圖1A。運用動力學計算模式，藥物釋放過程之數據以數學方式計算，其包含零階、一階、以 及樋口方程式(Higuchi equation)計算(T.Higuchi,Rate of release of medicaments from ointment bases containing drugs in suspension,Journal of pharmaceutical sciences,50(1961)874-875)。樋口方程式中相關係數越高，分析圖越呈現線性，表示游離態藥物持續地釋放，並且其釋放機制主要受擴散作用所控制，本試驗結果之相關係數(R2)為0.9864(圖1B)，且與其他已知之微脂體產品相近。將藥物Nano-taxol，以局部注射施予帶有腫瘤之小鼠後，腫瘤內藥物濃度(圖1C)以及腫瘤細胞凋亡(圖1D)，其圖表中曲線下面積(AUC)皆有顯著增加。
實施例3 以周-塔拉雷方法(Chou-Talalay method)測定奈米藥物之局部給藥具有協同作用
分別以6個不同劑量評估藥物之協同作用。為達成計算組合藥物之功效，採用周-塔拉雷所發表之組合指數(combination index，CI)-等效抑制曲線(isobologram)。使用例示藥物即紫杉醇奈米粒子(如Nano-taxol)之局部給藥，測定組合效果；另比較Nano-taxol之系統性給藥、游離態紫杉醇(Taxol®)之局部給藥二者之單一效果。周-塔拉雷方法包括繪製個別藥物或組合藥物於多重稀釋劑量之下，其劑量-功效之曲線圖，依據中效定理計算實驗結果和期望加乘效果之差距。CI=1、<1、和>1分別表示加乘效果、協同效果、和拮抗效果。組合指數取決於不同效果或是不同劑量，等效抑制曲線圖可藉由Compusyn軟體繪製。
功效-組合指數分析圖揭示藥物組合指數皆小於1，顯示Nano-taxol局部給藥可產生腫瘤胞殺之協同效果，且其效果優於單一藥物(Nano-taxol系統性給藥或游離態紫杉醇局部給藥)(圖1E)。此外，對於多種 組合比例之組合藥物，其標準化等效抑制曲線(normalized isobologram)，亦揭示其腫瘤胞殺協同效果(圖1F)。
針對腫瘤胞殺協同效果是否確實具有治療腫瘤之功效，於本實施例所設計之治療療程中(圖2A)，使用可持續釋放之Nano-taxol局部給藥，顯示其腫瘤胞殺效果優於其他治療方法(圖2B)。Nano-topotecan局部給藥之試驗顯示相同治療效果(圖4)；然而Nano-platin(圖3)、Nano-doxorubicin(圖5)、以及Abraxane®等藥物之局部給藥(圖6)並未得到相同治療效果。值得注意的是，Taxol®(圖2B)、順鉑(圖3)、托普樂肯(圖4)、和阿黴素(圖5)等藥物之腹腔給藥(IP)具有些許療效，其結果與各藥物人體試驗結果相似(D.S.Alberts,P.Y.Liu,E.V.Hannigan,R.O'Toole,S.D.Williams,J.A.Young,E.W.Franklin,D.L.Clarke-Pearson,V.K.Malviya,B.DuBeshter,Intraperitoneal cisplatin plus intravenous cyclophosphamide versus intravenous cisplatin plus intravenous cyclophosphamide for stage III ovarian cancer,The New England journal of medicine,335(1996)1950-1955.-28；D.K.Armstrong,B.Bundy,L.Wenzel,H.Q.Huang,R.Baergen,S.Lele,L.J.Copeland,J.L.Walker,R.A.Burger,G.Gynecologic Oncology,Intraperitoneal cisplatin and paclitaxel in ovarian cancer,The New England journal of medicine,354(2006)34-43；H.G.Muntz,T.W.Malpass,K.F.McGonigle,M.D.Robertson,P.L.Weiden,Phase 2 study of intraperitoneal topotecan as consolidation chemotherapy in ovarian and primary peritoneal carcinoma,Cancer,113(2008)490-496；G.Delgado,R.K.Potkul,J.A.Treat,G.S.Lewandowski,J.F.Barter,D.Forst,A.Rahman,A phase I/II study of intraperitoneally administered doxorubicin entrapped in cardiolipin liposomes in patients with ovarian cancer, American journal of obstetrics and gynecology,160(1989)812-817；discussion 817-819)
進一步研究之，本發明揭示奈米藥物之系統性給藥(依據EPR效應)，相較於游離態藥物，並未顯示良好療效，意味著依據EPR效應的治療並未反映在其治療效果；此外，游離態藥物之局部給藥顯示些許療效，而並非所有奈米藥物之局部治療具有療效(Nano-taxol、Nano-topotecan有而Nano-doxorubicin、Abraxane®不具療效)，上述結果揭示Nano-doxorubicin、Abraxane®所含游離態藥物與奈米粒子形成之共軛(conjugates)過於穩定，以至於游離態藥物無法適時地釋放以及控制腫瘤生長。由此可知，並非所有奈米藥物皆適合局部給藥。
總體存活率之風險比(hazard ratio)顯示Nano-taxol局部給藥之組別具有最高存活率(圖2C)，並且各治療組別之間白血球計量並未有顯著下降和差異(圖2D)。
於另實施例中，提供之治療方法包括持續釋放之奈米藥物之局部給藥，該治療方法可抑制重要器官之癌症轉移。
即使癌細胞經常於腹腔中直接擴散，卵巢癌亦可經淋巴管或血管轉移。針對重要器官癌細胞轉移的預後評估往往效果極差，但現今常用的治療仍為紫杉醇的系統性給藥。與紫杉醇系統性給藥相比，Nano-taxol腹腔給藥可顯著地抑制腫瘤轉移至肝臟(圖7A)。
由於先前研究揭示Nano-taxol局部給藥可顯著地抑制卵巢癌腫瘤，且與本發明所實施內容一致，本發明提供之奈米粒子局部給藥可應用於其他癌症，如肺癌轉移。舉例而言，肺癌轉移的小鼠動物實驗揭示， Nano-taxol胸膜內(intrapleural)給藥，對於肺癌轉移可產生最佳抑制效果(圖7B)。相對地，通用的標準治療：紫杉醇系統性給藥仍缺乏良好的腫瘤療效。儘管紫杉醇胸膜內給藥顯示些許療效，一項第II期臨床試驗之報導指出，Nano-taxol局部給藥仍優於紫杉醇局部給藥，與本發明揭示結果一致。近來研究顯示，儘管給予標準系統性治療，卵巢癌轉移至肺部之預後評估仍然不佳。Nano-taxol胸膜內給藥針對肺轉移則顯示較佳的抑制效果，同時也可抑制腹腔內轉移。
本發明所揭示內容並未被其他理論所局限，奈米藥物之局部給藥可視為是將奈米藥物注射至一特定腔室。舉例而言，若腹腔(人體最大腔室)中癌症因器官嚴重沾黏而導致無法進行治療，依據本發明實施內容，可以胸腔取代腹腔進行奈米藥物注射。腔室中持續釋放之游離態藥物可有效地控制局部腫瘤(如肺轉移)或遠端轉移(如腹腔中轉移)。
目前已知具有淋巴結癌轉移以及後期卵巢癌的病患，其預後評估極差。除了紫杉醇系統性給藥，近來並無其他針對淋巴結癌轉移的治療，而且減積(cytoreduction)手術移除腹膜後淋巴結的效果仍不明確(E.Halkia,J.Spiliotis,P.Sugarbaker,Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer,Gastroenterology research and practice,2012(2012)541842)。依據本發明揭示內容，針對淋巴結癌轉移，Nano-taxol腹膜給藥仍優於紫杉醇系統性給藥(圖7C)。整體存活率之風險比則證明Nano-taxol局部給藥可有效地控制重要器官之癌症轉移(圖7D)。
依據本發明實施結果，例示之紫杉醇奈米粒子針對腹膜後淋巴結和肝臟轉移皆展現其良好控制功效。舉例而言，第1日於子宮注射腫瘤 細胞以誘發肝轉移的模式小鼠，於第8、11、14日給予治療並且於第18日犧牲，Nano-taxol局部給藥(腹腔內)顯示其控制癌細胞轉移至腹膜後淋巴結的功效最佳(圖7D)。
本發明實施例提供一種治療癌症的方法，係藉由局部給藥的方式給予患者一抗癌藥物(如Nano-taxol,Micelle-taxol)，該抗癌藥物包覆於可持續釋放藥物之奈米粒子並且於胸膜內給藥。於特定實施例中，前述癌症係轉移性癌症。
於本發明實施例，紫杉醇奈米粒子之局部給藥，例如Nano-taxol，可發揮更佳的癌幹細胞胞殺效果。
癌幹細胞(cancer stem cells，CSCs)被視為關鍵的腫瘤起始細胞(tumor-initiating cells)，於癌症復發的過程發揮不可或缺的角色。癌幹細胞獨特的分子機制令其對於大多化療藥物皆具有抗藥性，消耗癌幹細胞或抑制其分子標誌可降低癌症復發並且改善臨床治療結果(Nguyen et al.Cancer stem cells：an evolving concept.Nature reviews cancer,12(2012)133-143)。癌細胞亦可依循治療而產生適應性變化，加重抗藥性。對於上皮細胞癌症，適應性變化至少有部分包括了上皮-間質細胞轉換(epithelial to mesenchymal transitions，EMT)，EMT可誘發癌細胞反轉為類似癌幹細胞的表現型，揭示EMT、癌幹細胞、與其抗藥性的連結。
可持續釋放之Nano-taxol之局部給藥發揮最佳的球形腫瘤(圖8A-B)及其側群細胞(side population)(圖8C)之抑制效果；此外，紫杉醇之局部或系統性給藥皆可增加腫瘤形成和側群細胞數量，表示施予常用的化療後在腫瘤微環境中的癌幹細胞會增加，與先前報導一致。值得注意的是， 本發明揭示之Nano-taxol局部給藥於腫瘤微環境中，有效地抑制幹細胞標誌(圖8D)、EMT驅動訊息與其表現型(圖8E)、血管新生訊息(圖8F)、以及多重抗藥性訊息(圖8G)。
本發明實施例提供一種可持續釋放之奈米藥物之局部給藥方法，該奈米藥物於腹腔高溫化療(hyperthermia intraperitoneal chemotherapy，HIPEC)有相同功效。
腹腔高溫化療為卵巢癌主要治療方法之一，對於胃癌患者，腹腔癌症具有最高復發率(15-40%)，而對於大腸癌患者則是第2高復發率。在一些案例中，在不備任何特定理論限制之下，於腹腔中結合高溫及化學治療最重要的藥學邏輯在於達到更深層的藥物滲透。多篇報導指出，腹腔高溫化療被證實可增加總體存活率以及癌細胞發展(T.D.Yan,D.Black,R.Savady,P.H.Sugarbaker,A systematic review on the efficacy of cytoreductive surgery and perioperative intraperitoneal chemotherapy for pseudomyxoma peritonei,Annals of surgical oncology,14(2007)484-492；T.D.Yan,D.Black,R.Savady,P.H.Sugarbaker,Systematic review on the efficacy of cytoreductive surgery combined with perioperative intraperitoneal chemotherapy for peritoneal carcinomatosis from colorectal carcinoma,Journal of clinical oncology：official journal of the American Society of Clinical Oncology,24(2006)4011-4019)。然而，腹腔高溫化療非常耗時並且需要更多醫藥照護，還有發生致命的併發症的風險；最常見的併發症為消化道瘺管，包括吻合外漏(anastomotic leak)或遠離吻合線的腸道穿孔。
比較Nano-taxol局部給藥(較不耗時且較少操作)和腹腔高溫 化療，於實驗中設計卵巢癌復發模型模擬腹腔癌症。經以流式細胞儀分析赫斯特(Hoechst)33342染色的細胞，復發腫瘤較原發腫瘤具有較高比例的側群細胞(圖9A)，表示復發腫瘤具有較強的抗藥性。腹腔高溫化療(HIPEC)的流程揭示於圖9B。Nano-taxol局部給藥與腹腔高溫化療具有相當的治療功效(圖9C)，但前者顯示毒性較低。故可持續釋放的功能具有與高溫處理相當的療效。
依據本發明實施例，奈米藥物系統性給藥利用EPR效應產生的療效不佳，儘管EPR效應在腫瘤微環境中已是完善建立之現象，但利用該效應並不能顯著地使奈米藥物獲得比其相同劑量之游離態藥物更好的療效。相對地，繞過EPR效應而進行奈米藥物局部治療(本發明之奈米粒子)以及利用其可持續釋放的功能，可表現出遠比系統性給藥更好的腫瘤控制效果。
但並非每種奈米藥物都適合用於局部給藥。
依據本發明實施，某些奈米藥物之局部給藥並不能表現出更佳的腫瘤胞殺效果(近期研究如Nano-platin、Nano-doxorubicin、和Abraxane®)，其原因係游離態藥物與奈米粒子之間共價鍵或非共價鍵之螯合過於穩定，因而造成藥物無法適時地釋放。舉例而言，某些特定的奈米藥物局部治療，在一極端狀況，會令奈米藥物近似於游離態藥物之作用(奈米粒子缺少功效)；在另一極端，奈米藥物釋放游離態藥物過於緩慢，對於腫瘤幾乎不造成抑制效果；而於二極端之間，僅有某些特定奈米藥物具有可持續且適時地釋放藥物的功能，有效地殺死腫瘤細胞(圖10)。
實施例4 治療卵巢癌之劑量反應研究
本實施例依據大學動物實驗倫理規範，和美國國家衛生研究院之實驗動物照護和使用規範(NIH publication no.85-23,revised 1996)而執行。動物設施控制於恆溫(22±1℃)和恆濕(60±5%)，以及維持於12小時/12小時之光暗循環，並供給可隨意獲得的食物和飲水。本研究使用5周大的SCID母鼠，移植細胞株ES2/luc，並施予Nano-taxol或Micelle-taxol。
小鼠依表1分組，各組有15隻小鼠，並至少收集10個實驗數據點。
以已知技術於小鼠體內誘發卵巢癌，包括第0日於6周大的小鼠腹腔內注射ES2/luc細胞(100μl含漢克平衡鹽緩沖液(HBSS)，含5 x 105細胞)；第4日以活體影像系統(IVIS® spectrum，in vivo imaging system)拍攝各實驗小鼠並評估腫瘤生長。第8、11日，依據表1，給予不同劑量之Nano-taxol或Micelle-taxol進行治療。
實驗第14日，使用活體影像系統再次拍攝各小鼠腫瘤細胞生長，評估治療效果，並且持續監測各組別存活率。
實施例5 大腸癌與胃癌實驗
本實施例依據大學動物實驗倫理規範，和美國國家衛生研究院之實驗動物照護和使用規範(NIH publication no.85-23,revised 1996)而執 行。動物設施控制於恆溫(22±1℃)和恆濕(60±5%)，以及維持於12小時/12小時之光暗循環，並供給可隨意獲得的食物和飲水。本研究使用5周大的SCID母鼠，移植細胞株HT-29-luc(大腸癌細胞株)或NCI-N87-luc 2-GFP(胃癌細胞株)，並施予Nano-taxol或Micelle-taxol。
小鼠依表2分組，各組有15隻小鼠，並至少收集10個實驗數據點。
以已知技術於小鼠體內誘發大腸癌和胃癌，包括第0日於6周大的小鼠腹腔內注射HT-29-luc或NCl-N87-luc 2-GFP細胞(100μlHBSS，含106細胞)；於適當時間，如第4日以活體影像系統拍攝各實驗小鼠並評估腫瘤生長。於第二次適當時間，第8、11日，依據表2，給予不同劑量之Nano-taxol或Micelle-taxol進行治療。
實驗第14日或其他適當時間，使用活體影像系統再次拍攝各小鼠大腸癌或胃癌生長，評估治療效果，並且持續監測各組別存活率。
實施例6 比較Nano-taxol和游離態紫杉醇治療大腸癌的效果
本實施例依據大學動物實驗倫理規範，和美國國家衛生研究院之實驗動物照護和使用規範(NIH publication no.85-23,revised 1996)而執行。動物設施控制於恆溫(22±1℃)和恆濕(60±5%)，以及維持於12小時/12小時之光暗循環，並供給可隨意獲得的食物和飲水。本研究使用5周大的SCID母鼠，移植細胞株HT-29-luc(大腸癌細胞株)，並施予Nano-taxol或游離態紫 杉醇。
小鼠依表3分組(共5組)，各組有15隻小鼠，並至少收集10個實驗數據點。
以已知技術於小鼠體內誘發大腸癌腫瘤，包括第0日於6周大的小鼠腹腔內注射HT-29-luc細胞(100μlHBSS，含106細胞)；於適當時間，如第11日以活體影像系統拍攝各實驗小鼠並評估腫瘤生長。第12、15、18日時進行治療，以劑量10mg/kg分別以不同途徑給藥(i.p.或i.v.)，其治療效果以活體影像系統拍攝評估；依據表2，給予不同劑量之Nano-taxol或Micelle-taxol進行治療，並且持續監測各組別存活率。
實施例7 針對移植卵巢癌之小鼠給予Nano-Taxol and Micelle-taxol抗腫瘤效果評估
卵巢上皮細胞癌是第2常見的婦科惡性腫瘤，並且是美國婦科癌症死亡數最多的癌症。在2014年估計有21,980新病例，以及14,270名患者因卵巢癌死亡(2014美國癌症學會)。大多卵巢癌病患，在第1次就醫時就已經是第III期或第IV期癌症，而在台灣，依據國衛院2011年報導，估計每年有1,000卵巢癌的新病例。
局部化療例如腹腔內化療，對於腹腔的腫瘤治療有其藥物 動力學上的優勢，由於藥物在腹腔的濃度比在全身循環的血中高，因而增加腹腔與血漿之曲線下面積比(Lancet Oncol.2003；Nat Rev Clin Oncol.2010)。縱然上述藥物具有藥物動力學之優勢，腹腔內注射療法仍有若干缺點，包括小分子藥物清除過快、專一性低、以及藥物穿透組織能力較低(Nat Rev Cancer.2006)。理論上，腹腔注射抗癌藥物化療的缺點可可以用奈米藥物載體來克服，將藥物包覆於特殊設計之給藥基質，達成持續釋放藥物之目的。藥物於腹腔中持續釋放可增加抗癌藥物與細胞的接觸時間，以及可導致更有效的胞殺效果。Tamura及其團隊觀察到，腹腔中具有腫瘤的小鼠，若於腹腔中注射含有抗癌藥物的D,L-聚乳酸(poly D,L-lactic acid)微球體，可持續地抑制腫瘤生長，並延長存活時間(Eur J Pharm Biopharm.2002)。
本發明之目的係探討Nano-Taxol和Micelle-Taxol於不同劑量之下以腹腔內(i.p.)或系統性(i.v.)給藥，治療移植卵巢癌的實驗小鼠之效果。
實驗設計
為評估奈米藥物針對在腹腔內擴散之卵巢癌之療效，將ES2-luc細胞株以腹腔注射接種於SCID小鼠的腹腔內，並以活體影像系統拍攝生物發光影像(bioluminescence images，BLI)。
當腫瘤擴散後並達到基準值(以發光值判斷)時開始進行治療。小鼠以2、5、10以及20mg/kg等劑量之Nano-Taxol自腹腔給藥，或是以10mg/kg劑量之Micelle-Taxol系統性或腹腔給藥，並每3日給予3劑。至第14日以生物發光影像偵測Nano-Taxol或Micelle-Taxol之抗癌活性，以及紀錄實驗動物存活率。
實驗流程
依前述ES2-luc細胞數培養於14孔培養皿、37℃ 24小時。24小時後以活體影像系統(IVIS-50 system)拍攝生物發光影像，發光活性和細胞生長之相關性揭示於圖11。
5週大的SCID母鼠(CB.17 SCID/SCID)購買自台北國家實驗動物中心，並保存於台北榮民總醫院(台北)動物腫瘤學實驗室。動物實驗皆依據動物健康照護規範進行。
實驗第0日於六週大SCID小鼠腹腔內注射含5×105個ES2-luc細胞100μl opti-MEM培養液，第4日以活體影像系統拍攝生物發光影像，設定腫瘤生長之基準影像，而控制組則注射100μl的0.9%氯化鈉。各組別之生物發光影像於治療前進行標準化，再於第5、8、11、14給予治療，前述治療分別為Nano-taxol腹腔注射劑量2、5、10、或20mg/kg，以及Micelle-Taxol腹腔注射或系統性給藥劑量10mg/kg。第14日拍攝生物發光影像，觀察Nano-Taxol和Micelle-Taxol對於減小腫瘤之抗癌效果，各實驗動物個別偵測至死亡和評估存活率。
測量生物發光影像(BLI)
小鼠以活體影像系統(IVIS-50 system，Xenogen,Alameda,CA)拍攝實驗結果。各小鼠於第1日移植5×105個ES2-luc細胞，生物發光影像則於指定日程拍攝。其中1隻小鼠於第17日死亡。生物發光影像與腫瘤細胞生長之相關性，揭示於圖12A-B。
統計分析
前述實驗結果以平均值±標準差揭示至少3重複之統計結果，總體存活率自移植腫瘤之日至死亡日而計，並以卡本-麥爾存活曲線 呈現。
腫瘤生長評估
在腹腔注射之後，Nano-Taxol抑制卵巢癌腫瘤生長之效果係依據劑量高低(dose-dependent manner)(圖13、14)，總共11隻實驗小鼠中，20mg/kg Nano-Taxol劑量幾乎完全根除其中8隻小鼠腹腔內的卵巢癌(圖13)，降低其中2隻小鼠之50%以上的腫瘤負擔；另，11隻小鼠中，10mg/kg Nano-Taxol劑量可根除其中3隻小鼠腹腔內腫瘤(圖13)，降低其中8隻小鼠之50%以上的腫瘤負擔；2mg/kg和5mg/kg Nano-Taxol劑量與控制組相比亦具有抗腫瘤活性(圖13)。20mg/kgNano-Taxol劑量可達成100%之腫瘤生長抑制(Tumor growth inhibition，TGI)，高於2mg/kg的劑量所達成之95%。Micelle-Taxol同樣可藉由腹腔給藥抑制卵巢癌細胞株ES2，但系統性給藥則否；腹腔給藥可於治療後達成98%抑制效果(圖13、14)。
為確認Nano-Taxol和Micelle-Taxol腹腔給藥，其抑制癌症之效果，而進行第2次實驗(圖15A-B)，其實驗方法、流程與前述相同。經腹腔注射後，Nano-Taxol和Micelle-Taxol皆可抑制卵巢癌生長；於7隻小鼠中，10mg/kg Nano-Taxol可根除其中2隻小鼠的腹腔腫瘤，並降低其中5隻的腫瘤負擔，Micelle-Taxol之治療亦有近似功效；10mg/kg Nano-Taxol和10mg/kg Micelle-Taxol於腹腔注射後，可達近100%腫瘤抑制效果(圖15A-B)。
小鼠於死亡日進行解剖，觀察ES2-luc之發光影像。如圖16所示，其中1隻小鼠為控制組(16A)、另一接受Micelle-Taxol系統性給藥的小鼠(圖16B)具有最嚴重的腹水；控制組小鼠(圖16A)之腹水，收集後進行細胞培養，其培養之細胞使用活體影像系統分析，產生生物發光影像訊號，顯 示該腹水含有人類卵巢癌細胞株ES2-luc(圖17)。其餘小鼠施予Nano-Taxol和Micelle-Taxol腹腔給藥(圖16C-G)之後，隨劑量增加而較少腹水產生。
各項實驗中，小鼠體重並未因治療而顯著變化(圖18)。
存活率評估
(段落【0117】)接種5×105個ES2-luc細胞後，控制組小鼠存活期為21日(圖19)；10mg/kg Micelle-Taxol系統性給藥之組別，存活期為21日；10mg/kg Micelle-Taxol、以及2、5、10、20mg/kg Nano-Taxol腹腔給藥之組別，存活期分別為33、32、33、45以及超過49日(圖19)。Nano-Taxol和Micelle-Taxol腹腔給藥，相較於控制組，皆可延長12日以上之存活期，但與控制組具有顯著差異之組別僅有5、10、20mg/kg Nano-Taxol腹腔給藥之組別(p<0.05)。相較於10mg/kg Micelle-Taxol組別，10、20mg/kg Nano-Taxol腹腔給藥之組別顯著地延長12日之生存期(p<0.05)(圖19)。
10mg/kg Micelle-Taxol系統性給藥之組別，小鼠存活期中位數為19日；10mg/kg Micelle-Taxol、以及2、5、10、20mg/kg Nano-Taxol腹腔給藥之組別，小鼠存活期中位數分別為28、27、29、37以及37日(圖19)。
另，(段落【0118】)接種5×105個ES2-luc細胞後，控制組小鼠存活期為19日；10mg/kg Micelle-Taxol、以及10mg/kg Nano-Taxol腹腔給藥之組別，小鼠存活期分別為30、以及38日(圖20)。相較於控制組，Micelle-Taxol和Nano-Taxol腹腔給藥皆可延長11日之存活期(p<0.05)。與10mg/kg Micelle-Taxol相較，10mg/kg Nano-Taxol腹腔給藥可顯著地延長8日(p<0.05)(FIG.20)。
控制組、10mg/kg Micelle-Taxol、以及10mg/kg Nano-Taxol 腹腔給藥之組別，生存期中位數分別為18、27、31日(圖20)。
結論
Micelle-Taxol和Nano-Taxol腹腔給藥皆具有抗腫瘤之活性，Nano-Taxol腹腔給藥之抗癌活性依據劑量而定，並且以20mg/kg之劑量幾乎可完全根除11隻小鼠其中8隻的腹腔卵巢癌；以10mg/kg之劑量可根除11隻小鼠其中3隻的腹腔卵巢癌。反應率為100%，因此，10mg/kg之劑量可視為最小有效劑量(minimum effective dose)。
綜上所述，Micelle-Taxol和Nano-Taxol皆可顯著地治療腹腔內的卵巢癌。
同系模式動物中Nano-Taxol針對大腸癌之抗腫瘤活性評估
為評估Nano-Taxol治療腹腔內擴散之大腸癌之功效，於BALB/c實驗小鼠腹腔中注射CT-26-luc細胞，並以活體影像系統拍攝生物發光影像，測量腫瘤生長大小。當腫瘤擴散後並達到基準值(以發光值判斷)時開始進行治療。小鼠施予10mg/kg Nano-Taxol之系統性給藥或腹腔給藥、或10mg/kg紫杉醇之系統性給藥或腹腔給藥，並每3日給予3劑。第11日以生物發光影像評估Nano-Taxol和紫杉醇的抗腫瘤活性，並記錄小鼠之存活率。
CT-26-luc細胞依指示之數量培養於24孔培養皿、37℃、24小時，生物發光影像於24小時候以活體影像系統拍攝。發光活性和細胞生長之相關性揭示於圖21。
實驗預備
5週大BALB/c母鼠購買自台北國家實驗動物中心，並保存於台北榮民總醫院(台北)動物腫瘤學實驗室。動物實驗皆依據動物健康照護規 範進行，且皆由實驗動物照護及使用委員會所核准進行。各小鼠皆依指示之劑量注射100μl(系統性)或200μl(腹腔內)之Nano-taxol或紫杉醇，精確之藥劑體積依據體重而計；控制組則注射100μl氯化鈉。
實驗第0日，6週大BALB/c小鼠注射含1×105個CT-26-luc細胞之200μl opti-MEM培養基。第4日，以活體影像系統拍攝生物發光影像，設定腫瘤生長基準值。各組別之生物發光影像於治療前進行標準化，再於第4、6、8給予治療，治療包括控制組載劑、10mg/kg Nano-Taxol腹腔給藥或系統性給藥、和10mg/kg紫杉醇PTX腹腔給藥或系統性給藥。第11日，Nano-Taxol或紫杉醇之抗腫瘤活性以發光活性之減少量評估之；各實驗動物個別偵測至死亡和評估存活率。
小鼠以活體影像系統(IVIS-50 system，Xenogen,Alameda,CA)拍攝實驗結果。生物發光影像與腫瘤細胞生長之相關性，揭示於圖22A-B。
統計分析：前述實驗結果以平均值±標準差揭示至少3重複之統計結果，總體存活率自移植腫瘤之日至死亡日而計，並以卡本-麥爾存活曲線呈現。
結果與結論
腫瘤生長評估
為評估Nano-Taxol針對大腸癌之治療效果，本實施例建立一已擴散之同系(syngeneic)大腸癌模式，BALB/c小鼠之生物發光影像與CT-26-luc細胞生長之相關性，揭示於圖22A-B。給藥治療後，Nano-Taxol可經腹腔給藥而抑制腫瘤生長，但系統性給藥則否(圖23A-B)。10mg/kg Nano-Taxol之劑量可減少8隻小鼠其中6隻的75%腫瘤負擔，但皆未能根除腫瘤(圖23B)。此外，無論是腹腔或系統性給藥，紫杉醇皆無法抑制大腸癌腫瘤生長(圖23A-B)。
圖24揭示於所有治療組別中，小鼠體重並未有顯著變化。
存活率
接種1×105個CT-26-luc細胞後，控制組小鼠存活期為27日(圖24)；10mg/kg紫杉醇系統性給藥、10mg/kg Nano-taxol系統性給藥、以及10mg/kg紫杉醇腹腔給藥等組別，小鼠存活期為27日(圖24)；10mg/kg紫杉醇腹腔給藥，小鼠存活期為40日(圖24)。劑量為10mg/kg Nano-taxol之腹腔給藥治療，相較控制組可顯著地延長存活期約13日(p<0.05)。
控制組存活期中位數為24日；10mg/kg紫杉醇系統性、腹腔給藥，存活期中位數分別為24、26日；10mg/kg Nano-taxol系統性、腹腔給藥，存活期中位數分別為26、35日(圖25)。Nano-taxol僅於腹腔給藥時，抑制小鼠大腸癌細胞株CT-26-luc生長，10mg/kg Nano-taxol可減少8隻小鼠其中6隻的腫瘤負擔，但並無小鼠腫瘤被根除。反應率為75%。
綜上所述，針對大腸癌同基因型模式，10mg/kg Nano-taxol之腹腔給藥僅具有中等的抗腫瘤活性。
於本說明書較佳實施例揭示之內容，本發明所屬領域具有通常知識者可明顯得知前述實施例僅為例示；具本發明所屬技術領域通常知識者可藉由諸多變換、替換而實施，並不與本發明之技術特徵有所差異。依據說明書實施例，本發明可有多種變換仍無礙於實施。本說明書提供之請求項界定本發明之範圍，該範圍涵蓋前述方法與結構及與其相等之發明。

Claims (15)

  1. 奈米粒子包覆抗癌藥物用於製備治療癌症之醫藥組合物之用途，該奈米粒子係具有適時地緩慢釋放抗癌藥物之特性，並且可有效地殺死腫瘤細胞，該釋放藥物之速率為24小時內釋放30%或以下的抗癌藥物；該抗癌藥物係紫杉醇；其特徵在於該奈米粒子係為脂質體，該脂質體包含一磷脂質；該磷脂質係選自氫化自然磷脂質、膽固醇和d-α-生育酸聚乙烯乙二醇琥珀酸(d-alpha-tocopheryl polyethylene glycol succinate)所構成之群組。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該磷脂質係為氫化大豆磷脂質。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該奈米粒子係用於治療腹腔內癌症，且包含至少一嵌段共聚物，該嵌段共聚物包含一疏水性嵌段、一與疏水性嵌段鍵結之親水性嵌段、以及至少一兩性離子。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，該疏水性嵌段係選自聚己內酯、聚戊內酯、聚乳酸甘醇酸、聚乳酸、和聚丁內酯、聚甘醇酸、聚丙內酯所構成之群組；該親水性嵌段係選自聚乙二醇、玻尿酸、和聚γ-麩胺酸所構成之群組。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該奈米粒子包含一聚微胞，該聚微胞包含一嵌段共聚物具有以下化學結構：
    Figure TWI626061B_C0001
    ，其中R係氫基、C1-6烷基、苯甲基、或醯基；其中m、n係分別為介於10-100之整數。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，該聚微胞之直徑係介於20至1,000奈米。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該癌症係卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌、或大腸癌。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，該癌症係卵巢癌或大腸癌。
  9. 一種包覆抗癌藥物之奈米粒子用於製備藉由局部注射治療癌症之醫藥組合物之用途，該奈米粒子可持續釋放藥物；該奈米粒子於胸膜內給藥，該釋放藥物之速率為24小時內釋放30%或以下的抗癌藥物；該抗癌藥物係紫杉醇；其特徵在於該奈米粒子係為脂質體，該脂質體包含一磷脂質；該磷脂質係選自氫化自然磷脂質、膽固醇和d-α-生育酸聚乙烯乙二醇琥珀酸(d-alpha-tocopheryl polyethylene glycol succinate)所構成之群組。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，該磷脂質係為氫化大豆磷脂質。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該奈米粒子係用於治療腹腔內癌症，且包含至少一嵌段共聚物，該嵌段共聚物包含一疏水性嵌段、一與疏水性嵌段鍵結之親水性嵌段、以及至少一兩性離子。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之用途，該奈米粒子包含一聚微胞，該聚微胞包含一嵌段共聚物具有以下化學結構：
    Figure TWI626061B_C0002
    ，其中R係氫基、C1-6烷基、苯甲基、或醯基；其中m、n係分別為介於10-100之整數。
  13. 如申請專利範圍第9項所述之用途，該癌症係卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌、或大腸癌。
  14. 如申請專利範圍第9項所述之用途，該癌症係轉移性癌症。
  15. 如申請專利範圍第9項所述之用途，該治療癌症係指治療腹腔中嚴重嚴重沾黏之患者之癌症。
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