TWI620934B

TWI620934B - 鑑別帕金森氏症與帕金森氏症失智症的方法

Info

Publication number: TWI620934B
Application number: TW105140435A
Authority: TW
Inventors: 楊謝樂
Original assignee: 磁量生技股份有限公司
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2018-04-11
Also published as: TW201821797A

Abstract

本發明提供一種用於在個體中鑑別具正常認知的帕金森氏症或帕金森氏症失智症的方法。

Description

鑑別帕金森氏症與帕金森氏症失智症的方法

本發明係關於一種鑑別帕金森氏症與帕金森氏症失智症的方法。

帕金森氏症(Parkinson disease，PD)是阿茲海默症之外第二常見的神經退化性疾病。65歲以上的人之中有超過1%患有PD。全世界約有1000萬人患有PD。一名PD患者的直接和間接醫療照護費用估計為每年100,000美元。許多國家，特別是美國、加拿大、歐洲和澳大利亞，正在擔心醫療照護成本增加而難以維持。大量的資源和精力已投入發展PD的診斷、治療和疫苗。

PD的臨床診斷標準為運動障礙(例如運動遲緩、齒輪狀強硬、靜止性震顫和姿勢不穩定)的觀察。雖然這些臨床特徵普遍被使用，但診斷PD有幾個致命的問題。例如，其他運動障礙(例如多系統萎縮症(multiple system atrophy)、大腦皮質基底核退化症(corticobasal degeneration)或進行性上眼神經核麻痺症(progressive supranuclear palsy))可能與PD的臨床症狀重疊，並降低診斷PD的準確性。此外，據報導，臨床症狀出現在基底核(特別是黑質)超過50%的多巴胺神經元(dopaminergic neurons)退化之後，使用臨床運動障礙的觀察對於PD的早期診斷是非常困難的。遺傳序列分析看起來是PD早期診斷較佳的方法。然而，只有10%的PD患者是遺傳性的，有百分之九十的PD患者是偶發性。

PD發展為認知障礙和失智是很常見的，稱為帕金森氏症失智症(PDD)。預測PD中失智症的發展具有挑戰性，且在該領域中有重大影響。研究人員目前正在嘗試利用生物分子診斷來達成PD與PDD的鑑別。α-突觸核蛋白是PD或PDD中最常被辨識的生物標記。由於α-突觸核蛋白(α-synuclein)分子被磷酸化，磷-α-突觸核蛋白(phosphor-α-synuclein)分子彼此容易聚集而在多巴胺神經元中形成路易氏體(Lewy body)。具有路易氏體的多巴胺神經元開始退化並失去表現多巴胺的能力。大腦運動皮層的神經細胞因缺乏多巴胺而受損，造成運動障礙。

許多發現顯示，與健康受試者相比，由於PD或PDD患者有路易氏體的形成使腦脊液(CSF)中α-突觸核蛋白的濃度降低。然而，報導結果顯示血液中α-突觸核蛋白的濃度變化並不一致。血漿α-突觸核蛋白檢測結果不一致的主要原因是檢測中較差的低偵測極限。根據這些報導，目前用於測定CSF或血漿中的α-突觸核蛋白為酶聯免疫吸附測定(ELISA)。α-突觸核蛋白被表現並且大量存在於腦和脊髓中，但在週邊血液系統中則非常低。ELISA無法精確地檢測超低濃度的蛋白質，如血漿中的α-突觸核蛋白。因此，PD或PDD的生物分子診斷中利用ELISA進行α-突觸核蛋白的檢測，CSF樣本比血漿更佳。

而CSF通常是通過腰椎穿刺採集，具有高風險且不舒服。藉由測定CSF中的α-突觸核蛋白進行早期診斷未被一般大眾廣泛接受。另一方面，臨床上血液更容易取得。因此，需要高靈敏度的檢測技術以達成血漿中超低量α-突觸核蛋白的檢測。

因此，發明人發展一種免疫檢測技術，稱為免疫磁減量(IMR)，用於定量偵測極低濃度(例如1-10pg/ml或更低)的生物分子。造成IMR超高靈敏度的主要原因是利用抗體功能化的磁性奈米粒子。這些磁性奈米粒子均勻分散在試劑中，且可以在被測樣品中的任何地方捕捉目標生物分子。此外，由於粒子為奈米級尺寸，總結合面積非常大。因此，固定在磁性奈米粒子表面上的抗體能夠非常有效地與目標生物分子結合，使得使用IMR的免疫檢測有超高靈敏度。IMR已被證明可以用於測定人血漿中的極低濃度的β-類澱粉蛋白和tau蛋白。透過檢測血漿β-類澱粉蛋白和tau蛋白，證實了健康個體與阿茲海默症造成的輕度認知障礙患者之間有明顯區別。這些結果促使我們調查檢測人血漿中極低濃度α-突觸核蛋白的可行性，以達成PD或PDD的生物分子診斷，或根據血漿α-突觸核蛋白濃度來區分PD與PDD。在本發明中，製備了利用IMR檢測α-突觸核蛋白的試劑，探討試劑的特性並檢測α-突觸核蛋白。為了比較，檢驗使用ELISA的α-突觸核蛋白的檢測特性。最後，報告了透過檢測血漿α-突觸核蛋白來鑑別PD患者、PDD患者和健康個體的初步結果。雖然在本研究中完成的橫斷性研究不能解決預測PD中PDD的進程，但結果可能指出此測量血漿α-突觸核蛋白在鑑別PD與PDD的潛在用途。

本發明提供一種用於鑑別個體中具有正常認知的帕金森氏症或帕金森氏症失智症的方法，包含：(a)在該個體的一血液樣本中偵測α-突觸核蛋白之體外免疫磁減量(IMR)訊號，其中該α-突觸核蛋白之IMR訊號係由α-突觸核蛋白與含有抗α-突觸核蛋白抗體的磁性奈米粒子結合而產生；(b)將步驟(a)偵測到的該α-突觸核蛋白之IMR訊號與一邏輯函數(I)比對以計算該血液樣本中的α-突觸核蛋白之濃度：其中IMR(%)係該α-突觸核蛋白之IMR訊號，φ_α-syn係該α-突觸核蛋白之濃度，比對的參數A係背景值，B係最大值，φ_o係當IMR訊號等於((A+B)/2)時α-突觸核蛋白之濃度，γ係以φ_α-syn為x軸且IMR(%)為y軸的一曲線在資料點φ_o的斜率；及(c)將步驟(b)得到的該α-突觸核蛋白之濃度與一預定的閾值範圍比較，其中該α-突觸核蛋白之濃度高於該預定的閾值範圍代表帕金森氏症失智症，該α-突觸核蛋白之濃度介於該預定的閾值範圍之間代表具有正常認知的帕金森氏症，該α-突觸核蛋白之濃度低於該預定的閾值範圍代表健康。

在一較佳實施例中，該磁性奈米粒子的材料係選自由Fe₃O₄、Fe₂O₃、MnFe₂O₄、CoFe₂O₄及NiFe₂O₄所組成的群組。

在另一較佳實施例中，該磁性奈米粒子的材料為Fe₃O₄。

在進一步較佳實施例中，該血液樣本為血漿。

圖1繪示利用免疫磁減量對固定在磁性Fe₃O₄奈米粒子的抗體之生物活性測試。

圖2繪示α-突觸核蛋白濃度依賴性IMR訊號(實線)及and在450nm的光吸收密度，O.D.450nm(虛線)。

圖3繪示檢測α-突觸核蛋白的動態範圍分析中經轉換的α-突觸核蛋白濃度φ_α-syn,IMR對PBS溶液中增量的α-突觸核蛋白濃度φ_α-syn的圖。

圖4繪示對於健康個體、PD患者及PDD患者利用IMR偵測到的血漿α-突觸核蛋白濃度。

以下實施例非用於限定而僅是本發明的各個態樣與特徵的代表。

方法

用於檢測α-突觸核蛋白的試劑係由抗α-突觸核蛋白的磁性Fe₃O₄奈米粒子(MF-DEX-0060,MagQu)功能化單株抗體(sc-12767,Santa Crusz Biotech)所組成。將抗體固定於磁性Fe₃O₄奈米粒子的詳細步驟係描述於洪等人(Horng et al.，IEEE Trans Appl Supercond.2005；15：668-671)及楊等人(Yang et al.，J Magn Magn Mater.2008；320：2688-2691)的著作。將抗體功能化磁性Fe₃O₄奈米粒子分散於pH-7.2的磷酸鹽緩衝液(PBS)中，利用動態雷射散射儀(Nanotrac-150,Microtrac)分析粒子的分佈，使用振動樣品磁力計(HysterMag,MagQu)測量試劑的磁性濃度，利用IMR分析儀(XacPro-S,MagQu)檢驗磁性奈米粒子上的抗體的生物活性。IMR分析儀為一種配備有高T_c超導量子干涉裝置(SQUID)磁量計作為磁感測器的交流磁導率計(ac magnetosusceptometer)。交流磁導率計的細節描述於楊等人(Yang et al.，IEEE Trans Appl Supercond.2013；23：1600604-1600607)及謝等人(Chieh et al.，J Appl Phys 2008,103：014703-1-6)的著作。製備在PBS溶液中增量(spike)的α-突觸核蛋白(ab51189,Abcam)以建立IMR訊號與α-突觸核蛋白濃度之間的關聯性，對每個IMR訊號的測量，將80-μl試劑與40-μl之α-突觸核蛋白溶液混合，接著利用IMR分析儀(XacPro-S,MagQu)偵測IMR訊號，對每個濃度的α-突觸核蛋白溶液的IMR訊號進行重複測量。在IMR訊號測量之外，利用市售ELISA套組(KHB0061,Novex)找出α-突觸核蛋白濃度依賴性的光吸收值。

給予參加本發明的志願者主要的系統性疾病、手術和住院治療的醫療清單，由志願者報告不受控制的醫療狀況，包括心臟衰竭、最近的心肌梗塞(過去6個月)、惡性腫瘤(過去2年)或控制不佳的糖尿病(HbA1C>8.5)，志願者也接受身體檢查。本發明經大學醫院倫理委員會審查委員會批准。

要求參加者提供10-ml非空腹靜脈血液樣本(K3 EDTA，紫頭試管)，每個樣品都分配一個依採樣順序的註冊編號，因此，實驗室人員對個體的臨床狀況和人口統計學數據並不了解，將血液樣本在收集1小時內離心(2500g，15分鐘)，將血漿等分至冷凍管，並在-80℃儲存(少於三個月)直到經IMR測量而解凍，將80-μl試劑與40-μl血漿混合以經IMR測量α-突觸核蛋白濃度，對每個血漿樣本進行重複測量。

使用來自38至73歲的健康個體的9個人類血漿樣本、來自PD患者(38-85歲)的9個人類血漿樣本以及來自PDD患者(60-81歲)的14個人類血漿樣本，利用IMR進行α-突觸核蛋白檢測。使用臨床症狀來鑑別PD和PDD患者。需注意的是PD患者皆為認知正常。在接受程序前提供所有登記的受試者知情同意書，本發明由台灣大學醫院研究倫理委員會批准。

抗體功能化磁性Fe₃O₄奈米粒子的流體動力學直徑的平均值為55.5nm，而粒子的流體動力學直徑的標準差為12.7nm。透過掃描電子顯微鏡的使用，得到抗體功能化磁性Fe₃O₄奈米粒子的直徑的平均值為~40nm。試劑為超順磁性，其飽和磁化強度為0.3emu/g。根據先前發表的文章(J Appl Phys 2013,144903-1-5)，在0.3emu/g的1-ml試劑中，抗體功能化奈米粒子的數量約為10¹³。在1-ml試劑中，抗體功能化磁性奈米粒子的總表面積約1000cm²。在實驗中使用80-μl試劑。對於每次檢測，在80-μl試劑中抗體功能化磁性奈米粒子的總表面積約為80cm²。與96孔ELISA板相比，每個孔的抗體和目標生物分子之間的結合面積為0.45cm²。因此，IMR的結合面積幾乎是ELISA的180倍大。

透過測量因α-突觸核蛋白與磁性奈米粒子上的抗體之間結合產生的IMR訊號以研究固定在磁性奈米粒子上的抗體的生物活性。記錄試劑和待測溶液混合後試劑的時間依賴性交流磁化率χ_ac，如圖1所示。製備兩個待測樣品：一個是純PBS溶液，另一個是3.1-fg/ml的α-突觸核蛋白溶液。圖中的虛線1表示試劑和PBS溶液的混合物的時間依賴性交流磁化率χ_ac。顯然，虛線之時間性χ_ac幾乎維持不變。然而，對於對應於試劑和3.1-fg/ml的α-突觸核蛋白溶液的混合物之實線，時間性χ_ac在45分鐘下降，然後達到一較低的值。可觀察到因α-突觸核蛋白與磁性奈米粒子上的抗體之間結合造成試劑的交流磁化率χ_ac顯著降低。

為了定量該試劑的交流磁化率χ_ac的減少，根據圖1所示的時間性χ_ac計算α-突觸核蛋白與磁性奈米粒子上的抗體之間結合之前/之後的起始/最終χ_ac。如先前發表的論文(ACS Chem Neurosci.2011；2：500-505；J Appl Phys 2010,107：074903-1-5)所述，測定試劑的交流磁化率χ_ac的信賴區間介於圖1所示的時間依賴性交流磁化率χ_ac的第一和最後40-50分鐘內。在本發明中，使用第一和最後45分鐘內的試劑的交流磁化率χ_ac的數據來測定χ_ac的減少。

如圖1所示，對於PBS溶液而言，在第一和最後45分鐘的間隔之間的交流磁化率χ_ac的p值為0.046。可觀察到與PBS混合的試劑的交流磁化率χ_ac略有減少。對於3.1-fg/ml的α-突觸核蛋白溶液而言，第一和最後45分鐘間隔之間的交流磁化率χ_ac的p值為0.007。證明在與α-突觸核蛋白溶液混合後的試劑的時間依賴性交流磁化率χ_ac的明顯減少。

起始χ_ac表示為χ_ac,o，其係χ_ac在第一45分鐘內的平均值。最終χ_ac被稱為χ_ac,φ，其係χ_ac在最後45分鐘內的平均值。試劑的交流磁化率χ_ac的減少，例如IMR訊號，係由下式得出IMR(%)=(χ_ac,o-χ_ac,φ)/χ_ac,o×100% (1)

透過式(1)，圖1中虛線及實線的IMR訊號經計算分別為1.56及2.13%，圖1中的結果顯示IMR檢測的背景值。此背景值主要由檢測系統的電子雜訊所造成。根據重複測量，PBS溶液的IMR訊號為1.56及1.65%。因此，IMR訊號的背景值為1.61%，標準差為0.06%。

IMR訊號為α-突觸核蛋白的濃度的函數，即IMR(%)-φ_α-syn曲線，係繪示於圖2。隨著α-突觸核蛋白的濃度φ_α-syn從3×10^-4pg/ml(=0.3fg/ml)增加，IMR訊號亦增加。φ_α-syn依賴性IMR(%)依循以下表示的邏輯函數其中A、B、φ_o和γ為比對參數。藉由比對圖2中的數據點與式(2)，得出比對參數為A=1.94、B=3.95，φ_o=49.7，γ=0.26。比對曲線係繪示於圖2中的實線，對應的決定係數R²為0.998。R²非常接近1意味著φ_α-syn依賴性IMR(%)確實受邏輯函數所控制。

式(2)中的參數A為φ_α-syn趨近於零時IMR(%)的值。通常，值A較背景值稍高。例如，A為1.94%而此處背景值為1.61%。A與背景值之間的差異主要是由於蛋白質分子與抗體功能性磁性奈米粒子之間結合的動態平衡引起的雜訊。然而，A並非作為低偵測極限(low-detection limit)。通常，低偵測極限被定義為IMR訊號相較於A高出低濃度測試時IMR訊號的標準差的三倍，即，3-σ準則。在本實驗中，低濃度攝氏的標準差為0.028%。因此，低偵測極限為具有2.02%IMR訊號的濃度。經由式(2)，檢測α-突觸核蛋白的低偵測極限為0.3fg/ml。

利用ELISA在450nm處的α-突觸核蛋白濃度依賴性光吸收密度，O.D.450nm，係繪示於圖2中的十字符號。實驗數據符合邏輯函數

式(3)中的比對參數A'、B'、φ_o '及γ'分別為0.189、5.070、13566.08及1.44。式(3)之邏輯函數係繪示於圖2中的虛線。十字符號與虛線之間的決定係數R²為0.999。利用3-σ準則，使用ELISA檢測α-突觸核蛋白的低偵測極限為79.04pg/ml。對於檢測α-突觸核蛋白而言，IMR明顯較ELISA靈敏250,000倍，如上所述，考慮反應表面後，IMR的偵測靈敏度高於ELISA的200倍。另外1250倍可能是因為極低雜訊的磁感測器，即高T_c超導量子干涉裝置(SQUID)磁量計。高T_c SQUID磁量計顯示雜訊值為50fT/Hz^1/2，其係低於單一磁性奈米粒子產生的磁訊號三個數量級。這意味著單一磁性奈米粒子因為與目標生物分子結合造成的交流磁訊號減少可以被高T_c SQUID磁量計所偵測。因此，極低雜訊的高T_c SQUID磁量計對於試劑的交流磁訊號的降低非常敏感，且在測定生物分子中顯示出超高的靈敏度。

除了低偵測極限之外，使用IMR測定α-突觸核蛋白的動態範圍也是重要的特徵。為了檢驗該動態範圍，將圖2中的實驗IMR訊號經由式(2)轉換為α-突觸核蛋白的濃度。α-突觸核蛋白的轉換濃度係由φ_α-syn,IMR表示。檢驗φ_α-syn,IMR和φ_α-syn之間的相關性，如圖3所示。在圖3中，可以得到φ_α-syn,IMR和φ_α-syn之間的線性關係。根據美國食品藥物管理局(FDA)頒布的規定，圖3中線性的斜率必須在0.90和1.10之間。在圖3中，若使用對α-突觸核蛋白濃度φ_α-syn為0.31fg/ml至31ng/ml的φ_α-syn,IMR，則φ_α-syn,IMR-φ_α-syn曲線的斜率為0.77，且決定係數R²為0.991，如圖3中的點線(dotted line)所示。圖3中點線的斜率不符美國FDA的要求，用於調查檢測動態範圍的α-突觸核蛋白濃度範圍應縮小。因此，忽略圖3中最高的φ_α-syn,IMR，即φ_α-syn為31ng/ml的值。φ_α-syn,IMR和φ_α-syn之間的線性曲線在0.31~3.1ng/ml的範圍內係以虛線(dashed line)繪製於圖3。虛線的斜率為1.48，且決定係數R²為0.999，虛線的斜率遠高於美國FDA的要求。看起來圖3中第二高的φ_α-syn,IMR也應該被忽略。φ_α-syn,IMR和φ_α-syn之間的線性曲線在0.31fg/ml至310pg/ml的範圍內係以實現繪示於圖3。實線的斜率為0.93，且決定係數R²為0.999。值得注意的是，實線的斜率符合美國FDA的要求。因此，IMR檢測的α-突觸核蛋白濃度的動態範圍為0.3fg/ml至310pg/ml。

圖2中所示的數據證明IMR測定非常靈敏且可能可以偵測人類血漿中的α-突觸核蛋白。先前研究採集來自9個健康個體、9個PD患者和14個PDD患者的血漿樣本，利用IMR區分健康個體、PD患者及PDD患者。所收集的33個受試者的人口統計資訊列於表1中。人類血漿中α-突觸核蛋白的偵測濃度φ_α-syn,IMR顯示於圖4中。PDD患者的血漿φ_α-syn,IMR範圍為0.1至100pg/ml，而健康個體的血漿φ_α-syn,IMR遠低於0.1pg/ml。PD患者的血漿φ_α-syn,IMR則分佈於健康個體及PDD患者的值之間。健康個體及PD患者之間血漿φ_α-syn,IMR的p值為0.005，顯示與健康個體相比，PD患者血漿α-突觸核蛋白濃度較高的事實。在圖4中，可觀查到PD患者和PDD患者之間血漿φ_α-syn,IMR的明顯區別(p<0.001)。根據圖4的結果，血漿α-突觸核蛋白濃度在健康個體罹患PD並進展為PDD時持續上升。值得注意的是，健康個體和PD患者之間(p>0.05)以及PD患者和PDD患者之間(p>0.05)的年齡相符。

PD：帕金森氏症；PDD：帕金森氏症失智症；MMSE：簡易智能狀態測驗(mini-mental state examination)；SD：標準差

先前研究顯示α-突觸核蛋白會透過胞吐作用由神經元釋放至體液中，包括CSF和血漿，這有助於腦中α-突觸核蛋白病理學的細胞間傳遞。許多研究集中在檢查PD患者的血漿樣本中全部或寡聚α-突觸核蛋白的值，並與健康對照組相比較，但結果是相互矛盾的。由於磷酸化和纖維狀的α-突觸核蛋白是蛋白質的主要病理形態，最近的一項研究發現，與對照組相比，早期PD無失智的樣本中磷酸-α-突觸核蛋白在血漿的值較高，這些觀察結果顯示，α-突觸核蛋白在血漿的值(全部或者是寡聚或磷酸化形式)可能部分反映PD患者腦中的α-突觸核蛋白病理學的可行性和潛力。此外，皮質路易氏體/神經炎病理學在PDD中比在沒有失智症的PD中更廣泛，這意味著血漿中α-突觸核蛋白負荷在PDD中比在PD中更嚴重。我們的結果支持此一假設：血漿α-突觸核蛋白的值在PDD中顯著高於具有正常認知的PD，其值略高於健康對照組。而阿茲海默症失智症的病理學特徵：類澱粉蛋白β斑塊和tau神經元纖維纏結亦可被觀察到，並與PDD患者的認知狀態相關聯，未來的研究需要合併評估PDD患者的磷酸-α-突觸核蛋白、類澱粉蛋白β、血漿中全部和磷-tau的值，以對PDD的病理生理學有更佳的理解。

在血漿樣本中，異嗜性抗體是主要造成混淆的因素，並且會干擾三明治ELISA法的檢測結果。根據臨床與實驗室標準協會(CLSI-EP-A2：臨床化學干擾試驗)的準則，異嗜性抗體(HA)係定義為免疫測定的常見的干擾物質之一。IMR方法與先前研究的ELISA相比，具有低干擾和高專一性的效果，其選擇的機制是基於由試劑中振盪的磁性奈米粒子產生的離心力，先前研究已對詳細內容加以討論。事實上，不只HA，血漿中經常使用的藥物之自然存在的生物分子透過該選擇機制也會防止與磁性奈米粒子結合。這使IMR成為用於帕金森氏症血漿生物標記的臨床分析之高度專一性的方法。

臨床上，患者首先被診斷患有PD，而在疾病的後期階段可能發展為失智症因而被診斷為PDD。因此，可預測或診斷PD個體之PDD早期進程的生物標記確實具有臨床意義。根據圖7的結果，PDD患者中血漿α-突觸核蛋白的值明顯高於PD患者(p<0.001)，這意味著血漿α-突觸核蛋白有望用作監測PD患者之PDD進程的臨床參數。

藉由將抗α-突觸核蛋白的抗體固定在磁性奈米粒子上，開發用於測定α-突觸核蛋白的試劑。透過高T_c SQUID磁量計利用免疫磁減量(IMR)，測定α-突觸核蛋白的動態範圍為0.3fg/ml至310pg/ml。將以超靈敏度SQUID為基礎的IMR應用於測定人類血漿α-突觸核蛋白，初步結果顯示，健康個體、PD患者和PDD患者之間的血漿α-突觸核蛋白濃度有明顯差異，此方法看起來有希望藉由測定血漿α-突觸核蛋白將IMR應用於PD和PDD的診斷。

Claims

一種用於鑑別個體中具有正常認知的帕金森氏症或帕金森氏症失智症的方法，包含：(a)在該個體的一血液樣本中體外偵測α-突觸核蛋白之免疫磁減量(IMR)訊號，其中該α-突觸核蛋白之IMR訊號係由α-突觸核蛋白與含有抗α-突觸核蛋白抗體的磁性奈米粒子結合而產生，並藉由下式得出α-突觸核蛋白之IMR訊號：IMR(%)=(χac,o-χac,φ)/χac,o×100%其中，χac表示時間依賴性交流磁化率；χac,o表示為起始χac，其係χac在第一45分鐘內的平均值；χac,φ表示為最終χac，其係χac在最後45分鐘內的平均值；(b)將步驟(a)偵測到的該α-突觸核蛋白之IMR訊號與一邏輯函數(I)比對以計算該血液樣本中的α-突觸核蛋白之濃度：其中IMR(%)係該α-突觸核蛋白之IMR訊號，φ_α-syn係該α-突觸核蛋白之濃度，比對的參數A係背景值，B係最大值，φ_o係當IMR訊號等於((A+B)/2)時α-突觸核蛋白之濃度，γ係以φ_α-syn為x軸且IMR(%)為y軸的一曲線在資料點φ_o的斜率；及(c)將步驟(b)得到的該α-突觸核蛋白之濃度與一預定的閾值範圍比較，其中該α-突觸核蛋白之濃度高於該預定的閾值範圍代表帕金森氏症失智症，該α-突觸核蛋白之濃度介於該預定的閾值範圍之間代表具有正常認知的帕金森氏症，該α-突觸核蛋白之濃度低於該預定的閾值範圍代表健康。
如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該磁性奈米粒子的材料係選自由Fe₃O₄、Fe₂O₃、MnFe₂O₄、CoFe₂O₄及NiFe₂O₄所組成的群組。
如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該磁性奈米粒子的材料為Fe₃O₄。
如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該血液樣本為血漿。