TWI684452B

TWI684452B - 胺基噻嗪化合物

Info

Publication number: TWI684452B
Application number: TW104106412A
Authority: TW
Inventors: 費歐娜蜜雪兒瑪丁
Original assignee: 美國禮來大藥廠
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2015-02-26
Publication date: 2020-02-11
Also published as: TW201622729A; EP3116881A1; CA2938616A1; ES2681285T3; EP3116881B1; JP6185192B2; US9708345B1; CN106068269A; JP2017506658A; CA2938616C; TR201809609T4; WO2015138208A1; CN106068269B

Abstract

本發明提供式I化合物，或其醫藥上可接受之鹽。

Description

胺基噻嗪化合物

本發明係關於新穎胺基噻嗪化合物、包含該等化合物之醫藥組合物、使用該等化合物治療生理病症之方法及可用於該等化合物之合成之中間體及方法。

本發明係在阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)及其他涉及類澱粉β(Abeta)肽(即類澱粉前體蛋白(APP)之神經毒性及高度血小板凝集肽區段)之疾病及病症的治療領域。阿茲海默氏病係在世界範圍內侵襲數百萬患者之破壞性神經變性病症。鑒於市場上目前批准之藥劑僅為患者提供瞬時症狀益處，阿茲海默氏病之治療存在明顯未滿足之需要。

阿茲海默氏病之特徵在於Abeta在腦中之產生、聚結及沈積。已顯示完全或部分抑制β-分泌酶(β-位點類澱粉前體蛋白-裂解酶；BACE)對小鼠模型中斑相關及斑依賴性病狀具有顯著效應，此表明即使Abeta肽含量減少較小量亦可使得斑負荷及突觸缺陷長期顯著減小，由此尤其在阿茲海默氏病之治療中提供顯著治療性益處。

WO 2014/013076揭示異硫脲衍生物，其係可用於治療由Abeta肽引起之神經變性疾病(例如阿茲海默氏型失智症)之BACE抑制劑。美國專利第8,158,620號揭示稠合胺基二氫噻嗪衍生物，其具有BACE抑制活性，且進一步揭示為用於由Abeta肽引起之神經變性疾病(例如阿茲海默氏型失智症)之有用治療劑。

期望中樞神經系統(CNS)穿透之BACE抑制劑提供用於Abeta肽介導之病症(例如阿茲海默氏病)的治療。本發明提供係BACE之抑制劑之某些新穎化合物。另外，本發明提供穿透CNS、具有改良副作用概況及改良物理化學性質(例如改良溶解性)之某些新穎化合物。

因此，本發明提供式I化合物：

或其醫藥上可接受之鹽。

本發明亦提供治療阿茲海默氏病之方法，其包含向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。

本發明進一步預防患者之輕度認識損害進展至阿茲海默氏病之方法，其包含向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。

本發明亦提供抑制患者之BACE之方法，其包含向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。

本發明亦提供抑制BACE介導之類澱粉前體蛋白裂解之方法，其包含向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。

本發明進一步提供抑制Abeta肽產生之方法，其包含向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。

此外，本發明提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法中。另外，本發明提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療阿茲海默氏病。本發明提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於預防輕度認知損害進展至阿茲海默氏病。甚至此外，本發明提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療阿茲海默氏病之藥劑。本發明亦提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於預防輕度認知損害進展至阿茲海默氏病之藥劑。

本發明進一步提供醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥上可接受之鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在特定實施例中，該組合物進一步包含一或多種其他治療劑。本發明亦涵蓋用於式I化合物之合成之新穎中間體及方法。

術語「預防輕度認知損害進展至阿茲海默氏病」包括減緩、阻止或逆轉患者之輕度認知損害進展至阿茲海默氏病。

本文所用術語「治療」(「treating」或「to treat」)包括遏製、減緩、停止或逆轉現存症狀或病症之進展或嚴重程度。

本文所用術語「患者」係指人類。

術語「抑制Abeta肽產生」用於意指降低患者中之Abeta肽之活體內含量。

本文所用術語「有效量」係指本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽在單一劑量或多個劑量投與患者時在診斷或治療下在患者中提供期望效應的量。

有效量可由熟習此項技術之主治診斷醫師利用習知技術並藉由觀察類似狀況下所獲得之結果容易地測定。在測定患者之有效量中，主治診斷醫師需考慮多個因素，包括(但不限於)患者之物種；其體型大小、年齡及一般健康狀況；所涉及之具體疾病或病症；疾病或病症之涉及程度或嚴重程度；個體患者之反應；所投與之特定化合物；投與方式；所投與製劑之生物利用度特性；所選投藥方案；伴隨藥物之使用；及其他相關狀況。

本發明化合物通常在寬劑量範圍內有效。舉例而言，每天劑量通常在約0.01mg/kg至約20mg/kg體重之範圍內。在一些情形下，低於上述範圍下限之劑量值可能係過量的，而在其他情形下可採用更大劑量且副作用可接受，且因此上述劑量範圍並非意欲以任一方式限制本發明之範疇。

較佳地，將本發明化合物調配為藉由任一使得化合物生物可用之途徑(包括經口及非經腸途徑)投與之醫藥組合物。最佳地，該等組合物係經口投與。該等醫藥組合物及其製備製程在業內已眾所周知。 (例如，參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy(D.B.Troy編輯，第21版，Lippincott,Williams & Wilkins,2006)。

式I化合物尤其可用於本發明之治療方法中，但某些基團、取代基及構形對於式I化合物較佳。以下章節闡述該等較佳基團、取代基及構形。應理解，該等優先適用於本發明之治療方法及新化合物二者。

呈順式構形之下式化合物：

或其醫藥上可接受之鹽較佳。

N-[2-[(4aR,7aR)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺或其醫藥上可接受之鹽進一步較佳。

N-[2-[(4aR,7aR)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并 [3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺尤佳。

熟習此項技術者應瞭解，本發明化合物包括含有兩個對掌性中心之核心，如下文方案A中所示：

方案A

儘管本發明涵蓋所有個別鏡像異構物及非鏡像異構物、以及該等化合物之鏡像異構物之混合物(包括外消旋物)，但在標記為1及2之碳原子處具有如方案A中所闡釋之絕對構形之化合物係本發明之較佳化合物。

熟習此項技術者應瞭解，本發明化合物可以互變異構形式存在，如方案B中所繪示。在本申請案中任一時刻提及本發明化合物之具體互變異構物中之一者時，應理解其涵蓋互變異構物形式及其所有混合物。

方案B

為清楚起見，某些立體化學中心未指定且不欲以任何方式限制製備及實例之教示。此外，熟習此項技術者可在藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析等方法合成式I化合物中在任一便利點分離或拆分個別異構物、鏡像異構物及非鏡像異構物(參見例如J.Jacques等人，「Enantiomers,Racemates,and Resolutions」,John Wiley and Sons,Inc.,1981及E.L.Eliel及S.H.Wilen,「Stereochemistry of Organic Compounds」,Wiley-Interscience,1994)。名稱「異構物1」及「異構物2」係指分別自對掌性層析第一及第二溶析之化合物，且若在合成早期開始對掌性層析，則相同名稱用於隨後中間體及實例。

另外，闡述於以下製備中之某些中間體可含有一或多個氮保護基團。視特定反應條件及欲實施之特定轉換而定，可變保護基團在每次出現時可相同或不同。保護及去保護條件為熟習此項技術者所熟知且闡述於文獻中(參見例如「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis」，第4版，Peter G.M.Wuts及Theodora W.Greene,John Wiley and Sons Inc.2007)。

某些縮寫定義如下：「APP」係指類澱粉前體蛋白；「DMEM」係指杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)；「DMSO」係指二甲基亞碸；「F12」係指漢氏F12培養基(Ham’s F12 medium)；「FBS」係指胎牛血清；「FRET」係指螢光共振能量轉移；「HB-PS」係指HEPES緩衝之生理鹽水；「HEK」係指人類胚腎；「HEPES」係指2-[4-(2-羥基乙基)六氫吡嗪-1-基]乙磺酸；「HPLC」係指高效液相層析；「IC₅₀」係指產生藥劑可能最大抑制反應之50%之該藥劑之濃度；「JohnPhos」係指二第三丁基-(2-苯基苯基)磷烷；「min」係指分鐘；「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「PDAPP」係指血小板衍生之類澱粉前體蛋白；「RFU」係指相對螢光單位；「SFC」係指超臨界流體層析；且「SEM」係指平均值之標準誤差。

本發明化合物或其鹽可藉由業內已知之多種程序製備，其中一些在製備及實例中闡釋。所述各途徑之特定合成步驟可以不同方式組合以製備式I化合物或其鹽。下文製備及實例中各步驟之產物可藉由業內熟知之習用方法回收，該等方法包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。熟習此項技術者可輕易地獲得試劑及起始材料。

在可選步驟中，式I化合物之醫藥上可接受之鹽(例如鹽酸鹽)可藉由式I之適當游離鹼與適當醫藥上可接受之酸在適宜溶劑中在標準條件下反應形成。另外，該等鹽之形成可與氮保護基團之去保護同時發生。該等鹽之形成已為業內眾所周知且瞭解。例如，參見Gould,P.L.,「Salt selection for basic drugs」,International Journal of Pharmaceutics,33：201-217(1986)；Bastin,R.J.等人「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities」,Organic Process Research and Development,4：427-435(2000)；及Berge,S.M.等人，「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Sciences,66：1-19,(1977)。

以下製備及實例進一步闡釋本發明。

製備1 (第三丁氧基羰基胺基)碳酸第三丁基酯

將羥基胺鹽酸鹽(550.0g,7.9mol)、水(5.5L)及庚烷/MTBE溶液(5：1,5.5L)之混合物冷卻至-5℃。經2小時緩慢添加二碳酸二-第三丁基酯(3.55Kg,16.3mol)、三乙胺(1.67Kg,16.5mol)、於庚烷/MTBE(5：1,1.1L)中之溶液形式之預冷卻(-5℃)溶液。將反應於-5℃下攪拌1小時且隨後升溫至室溫並攪拌過夜。分離各層並將有機層用飽和氯化銨水溶液(2L)及飽和氯化鈉水溶液(1L)洗滌兩次，經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮，以產生油狀物，其結晶成白色固體。將固體與庚烷(1L)一起在冰水浴中攪拌並過濾，以產生標題產物(1360.2g,73%)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ 10.83-10.58(m,1H),1.43(d,J=11.3Hz,18H)。

製備2 [第三丁氧基羰基-[(4-甲氧基苯基)甲基]胺基]碳酸第三丁基酯

在氮下向20L反應器中裝入(第三丁氧基羰基胺基)碳酸第三丁基酯(812.9g,3.48mol)、二甲基甲醯胺(4.4L)、碳酸鉀(626.5g,4.52mol)及1-(氯甲基)-4-甲氧基-苯(462mL,2.56mol)。將混合物於40℃下攪拌過夜。¹H NMR分析顯示不完全反應。添加額外碳酸鉀(626.5g,4.52mol)並將混合物於40℃下攪拌。48小時後之¹H NMR分析顯示反應仍不完全。添加額外碳酸鉀(482g,3.49mol)並將混合物於40℃下攪拌。過夜反應後之¹H NMR分析顯示完全反應且未剩餘起始材料。添加水(5L)及MTBE(5L)並分離各層。將有機層用水(3×3L)洗滌，經硫酸鈉乾燥並濃縮，以產生標題化合物(1.21Kg,98%)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ 7.20(d,J=8.3Hz,2H),6.91(d,J=8.3Hz,2H),3.73(s,2H),3.35(s,3H),1.41(s,18H)。

製備3 N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羥基胺鹽酸鹽

將[第三丁氧基羰基-[(4-甲氧基苯基)甲基]胺基]碳酸第三丁基酯(1.125Kg,3.1mol)溶解於1,4-二噁烷(2.8L)中並經1小時30分鐘逐滴添加鹽酸溶液(4M，於二噁烷中，3.15L，12.4mol)。將溶液於室溫下攪拌過夜。藉由過濾收集白色固體狀標題產物(488.0g,81%)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ 11.71(s,2H),10.94(s,1H),7.44(d,J=8.8Hz,2H),6.95(d,J=8.8Hz,2H),4.22(s,2H),3.75(s,3H)。

製備4 2-(烯丙基(第三丁氧基羰基)胺基)乙酸

於0℃下向含有碳酸鉀(100g,724mmol)、碘化鈉(110g,727mmol)、二甲基甲醯胺(300mL)、三乙胺(200mL,1.44mol)及2-丙烯-1-胺(24g,426mmol)之圓底燒瓶中逐滴添加2-溴乙酸乙酯(60.2g,360mmol)於二甲基甲醯胺(40mL)中之溶液。將反應物升溫至環境溫度並攪拌14小時。藉由過濾移除固體並用二乙醚洗滌。向濾液中添加飽和氯化鈉水溶液(1L)並分離各層。用二乙醚萃取水層。將有機相合併，經硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下移除溶劑，以產生殘餘物。於0℃下向粗製殘餘物於乙醇(500ml)及三乙胺(40g,395mmol)中之溶液中一次性添加二碳酸二-第三丁基酯(105g,467mmol)。將反應物升溫至室溫並攪拌14小時。將反應物在減壓下濃縮並用水(200mL)及飽和碳酸氫鈉水溶液(200mL)稀釋並用二乙醚萃取。將有機相合併，經硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以產生殘餘物。將此殘餘物吸收於甲醇(200mL)中並添加2N氫氧化鈉(500mL)。將所得溶液於室溫下攪拌3小時。在減壓下將體積減少約200ml並使用鹽酸(12N)將所得溶液酸化至pH 4。藉由過濾收集所得淺橙色固體，用水洗滌並乾燥，以產生標題化合物(50g,65%)。¹H NMR(CDCl₃)兩種旋轉異構物之混合物(50：50)δ 1.43,1.45(s,9H),3.86-3.99(m,4H),5.10-5.20(m,2H),5.71-5.83(m,1H)。

製備5 N-烯丙基-N-[2-(甲氧基(甲基)胺基)-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯

於0℃下向四氫呋喃(600mL)中添加2-(烯丙基(第三丁氧基羰基)胺基)乙酸(49.6g,156mmol)，之後添加三乙胺(36.3g,359mmol)及特戊醯氯(31g,353mmol)。將反應物於室溫下攪拌3小時且隨後冷卻至0℃。隨後添加N,O-二甲基羥基胺鹽酸鹽(28g,283mmol)、三乙胺(33mL,237mmol)及四氫呋喃(400mL)。移除冰浴並將反應物於室溫下攪拌3小時並在減壓下濃縮。將所得固體溶解於水中並用乙酸乙酯萃取。將有機相合併，經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下移除溶劑，以產生殘餘物。藉由矽膠管柱層析用己烷中之丙酮之0-50%梯度溶析純化殘餘物，以產生標題化合物(32g,54%)。¹H NMR(CDCl₃)兩種旋轉異構物之混合物(60：40)δ 1.42,1.44(s,9H),3.16,3.17(s,3H),3.66,3.69(s,3H),3.88-3.98(m,2H),4.01,4.11(s,2H),5.10-5.18(m,2H),5.73-5.85(m,1H)。

製備6 4-氯-N-甲氧基-N-甲基-吡啶-2-甲醯胺

將4-氯吡啶-2-甲酸(40.9g,259.59mmol)懸浮於無水二氯甲烷(700mL)中，同時攪拌並排除水份(使用矽膠乾燥管)。將所得溶液冷卻至0℃並添加N-甲基嗎啉(129mL,1.17mol)、N,O-二甲基羥基胺鹽酸鹽(35.45g,363.43mmol)，之後逐份添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(69.67g,363.43mmol)。在此添加完成後，將反應物升溫至室溫並於該溫度下攪拌過夜。添加水(600mL)並分離各層。將水層用二氯甲烷(300mL)再萃取兩次。將有機層合併，用鹽水(400mL)洗滌並經無水硫酸鈉乾燥。在減壓下移除溶劑以產生深色油狀物。藉由矽膠管柱層析使用異己烷中之0%至50%乙酸乙酯之梯度對此物質進行純化，以產生標題化合物(23.7g,46%)。ES/MS(m/e)201/203。

製備7 1-(4-氯吡啶-2-基)乙酮

在氮下在攪拌下向無水四氫呋喃(150mL)中添加甲基溴化鎂(3M，於二乙醚中)(59mL；177.20mmol)。將所得溶液冷卻至-15℃並經20分鐘逐滴添加4-氯-N-甲氧基-N-甲基-吡啶-2-甲醯胺(23.7g1.00118.13mmol)於無水四氫呋喃(150mL)中之溶液，同時保持溫度介於0℃與-15℃之間。在此添加完成後，將反應物於0℃下攪拌45分鐘。隨後將反應物冷卻至-15℃並藉由小心逐滴添加水(250mL)緩慢驟冷。添加飽和氯化銨水溶液(250mL)及二乙醚(200mL)。分離各層並將水層用二乙醚(200mL)再萃取兩次。將合併之有機萃取物經無水硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下移除溶劑，以產生黃色油狀標題化合物(18.6g)。ES/MS 156/158(M+1)。

製備8 2-溴-1-(4-氯-2-吡啶基)乙酮

在攪拌下將1-(4-氯-2-吡啶基)乙酮(24.4g,156.83mmol)溶解於冰乙酸(224mL)中。添加溴化氫溶液(32%，於乙酸中)(34mL)，之後緩慢添加溴(8.2mL,159.97mmol)。將所得溶液於75℃下加熱3.5小時且隨後立刻在冰浴中冷卻。在攪拌下向冷卻反應混合物中緩慢添加飽和碳酸氫鈉水溶液(1L)，之後添加固體碳酸氫鈉以將溶液之pH調節至7。隨後添加乙酸乙酯(400mL)並分離各層。用乙酸乙酯(3×400mL)再萃取水層。將有機萃取物合併，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以產生褐色結晶固體。將分離之固體與異己烷一起研磨並在真空下進一步乾燥，以產生標題化合物(21g)。藉由矽膠管柱層析使用異己烷中之0%至40%二氯甲烷梯度回收異己烷中剩餘之產物，以產生額外5.5g標題產物，其產生組合產率(26.5g,72%)。ES/MS(m/e)234/236/238(M+1)。

製備9 1-(4-氯-2-吡啶基)-2-(二烯丙基胺基)乙酮

在氮下在攪拌下將N-烯丙基丙-2-烯-1-胺(15.8g,158.2mmol)溶解於無水四氫呋喃(283mL)中。添加三乙胺(79mL)並將所得溶液冷卻至0℃。逐滴添加2-溴-1-(4-氯-2-吡啶基)乙酮(26.5g,113.0mmol)於無水四氫呋喃(126mL)中之溶液(在此添加期間，反應物之顏色自無色變為黃色、變為橙色且隨後最後變為紅色)。1.5小時後，添加水(500mL)並在減壓下移除溶劑。將所得水溶液用乙酸乙酯(5×250mL)萃取。向合併之有機萃取物中添加無水硫酸鈉。經由矽膠及矽藻土之薄墊過濾所得懸浮液。用乙酸乙酯(1L)洗滌該墊。隨後在減壓下濃縮濾液，以產生標題化合物(23.6g)。ES/MS(m/e)251/253(M+1)。此中間體具有限制穩定性，不能儲存，且未經進一步純化即直接使用。

製備10 5-烯丙基-6a-(4-氯-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑

在攪拌下在氮下將1-(4-氯-2-吡啶基)-2-(二烯丙基胺基)乙酮(23.6g,94.4mmol)溶解於無水甲苯(343mL)中。依序添加N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羥基胺鹽酸鹽(27.9g,146.9mmol)、三乙胺(23.6mL,169.5mmol)及乙醇鈦(IV)(35.4mL,38.7g,169.5mmol)。將所得反應混合物於70℃下在氮下加熱。8小時後，冷卻反應並於室溫下攪拌一個週末。隨後添加二乙醚(1 l)及水(500mL)。經由矽藻土墊過濾沈澱固體。將墊用二乙醚(500mL)徹底洗滌。分離各相並用二乙醚(300mL)再萃取水相。將合併之有機相經無水硫酸鈉乾燥並過濾以產生褐色油狀物。藉由矽膠管柱層析使用氯仿中之四氫呋喃之0%至20%梯度對此物質進行純化，以產生淺褐色油狀標題化合物(17.5g,40%)。ES/MS(m/e)386/388

製備11 6a-(4-氯-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯

在攪拌下在氮下將5-烯丙基-6a-(4-氯-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑(17.5g,45.35mmol)溶解於無水二氯甲烷(230mL)中。在氮流下添加N,N-二甲基巴比妥酸(38.24g,244.89mmol)及四(三苯基膦)鈀(5.24g,4.53mmol)並使氮鼓泡通過溶液若干分鐘。隨後將所得溶液於30℃下在氮下加熱2小時。隨後將反應冷卻至室溫。添加二碳酸二-第三丁基酯(10.10g,46.26mmol)及三乙胺(7mL,52.15mmol)並將所得溶液於室溫下攪拌2小時。在減壓下濃縮反應混合物以產生琥珀色半固體，隨後將其重新溶解於乙酸乙酯(500mL)中。將所得溶液用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×250mL)洗滌。將有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以產生深色油狀物。藉由矽膠管柱層析使用異己烷中之0%至70%乙酸乙酯之梯度純化油狀物，以產生黃色發泡體狀標題化合物(14.8g,73%)。 ES/MS(m/e)446(M+1)。

製備12 N-烯丙基-N-[2-(4-氯-2-吡啶基)-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯

在氮下於-10℃(甲醇-冰浴)向四氫呋喃(60mL)之攪拌溶液中添加異丙基氯化鎂氯化鋰複合物溶液(56.84mL，73.89mmol，1.3M於四氫呋喃中)。逐滴添加2-溴-4-氯-吡啶(9.48g,49.26mmol)於四氫呋喃(60mL)中之溶液，確保在添加期間溫度不升高高於0℃。40分鐘後，溶液為澄清淺橙色且再添加於四氫呋喃(27mL)中之N-烯丙基-N-[2-(甲氧基(甲基)胺基)-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯(19.09g,73.89mmol)，確保溫度升高超過0℃。添加完成後，隨後使所得褐色溶液升溫至室溫。2小時後，反應藉由添加飽和氯化銨水溶液、之後添加小體積之水而淬滅。添加乙酸乙酯並分離各層。用乙酸乙酯(4×) 再萃取水層。將有機層合併，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮，產生褐色油狀物。粗產物藉由矽膠管柱層析使用於異己烷中之0%至30%乙酸乙酯之梯度純化，產生澄清淺黃色油狀標題化合物(10.1g,66%)。ES/MS(m/e)333(M+23)。

製備13 6a-(4-氯-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯

在氮下向N-烯丙基-N-[2-(4-氯-2-吡啶基)-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯(10.10g,32.50mmol)於甲苯(230mL)中之攪拌溶液中添加N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羥基胺鹽酸鹽(6.47g,34.12mmol)、三乙胺(4.76mL,34.12mmol)及乙醇鈦(IV)(14.27mL,68.25mmol)。在氮下將所得溶液升溫至70℃。3.5小時後，將反應冷卻到室溫。添加水及乙酸乙酯並經由矽藻土過濾所得懸浮液。矽藻土墊用乙酸乙酯充分洗。分離各相並將有機相用鹽水洗，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮，產生橙色油狀物。油狀物藉由矽膠管柱層析使用於異己烷中之0%至25%乙酸乙酯之梯度純化，產生澄清黃色油狀標題化合物(11.72g；81%)。ES/MS(m/e)446(M+1)。

製備14 6a-(4-胺基-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯

將6a-(4-氯-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯(9.4g,21.1mmol)、JohnPhos(2.0g,6.3mmol)、叁(二亞苄基丙酮)二鈀(0)(3.0g,3.2mmol)、二苯甲酮亞胺(7.4mL,42.3mmol)及第三丁醇鈉(6.1g,63.4mmol)一起添加於甲苯(121mL)中。藉由在氮氣氣氛下用液氮冷凍且隨後在真空下在水浴中熔融至室溫使所得混合物徹底脫氣。將此程序重複4次。隨後將反應於75℃下在攪拌下在氮下加熱1.5小時。將反應冷卻至室溫並用乙酸乙酯稀釋。經由矽藻土墊過濾所得懸浮液並將墊用乙酸乙酯充分洗滌。蒸發溶劑以產生中間體亞胺。將此物質重新溶解於甲醇(235mL)中並添加乙酸鈉(7.0g,84.6mmol)及羥基胺鹽酸鹽(5.9g,84.6mmol)。隨後將所得混合物於室溫下攪拌1.5小時。用碳酸氫鈉水溶液驟冷反應並在減壓下移除甲醇。隨後將剩餘水層用乙酸乙酯(2×)萃取。將合併之有機層用鹽水洗滌，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以產生橙色油狀物。藉由矽膠管柱層析使用二氯甲烷中之0%至10% 2M氨甲醇溶液之梯度純化粗產物，以產生褐色膠狀標題化合物及含有各部分之混合產物。合併混合部分並使用矽膠管柱層析使用二氯甲烷中之0%至5% 2M氨甲醇溶液之梯度分兩批進一步純化，以產生額外產物，以產生淺褐色固體狀標題化合物之組合產率(6.72g,75%)。ES/MS(m/e)427(M+1)。

製備15 6a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯

將6a-(4-胺基-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯(3.06g,7.17mmol)放置於250mL燒瓶中並在攪拌下在氮下添加乙酸乙酯(16mL)。向所得懸浮液中添加1-丙烷膦酸環酸酐(

50wt%，於乙酸乙酯中)(11mL,17.92mmol)、三乙胺(3.50mL,25.09mmol)及乙酸(616μL,10.75mmol)。於75℃下在氮下加熱所得溶液。1小時後，將反應冷卻到室溫。添加乙酸乙酯及飽和碳酸氫鈉水溶液。分離各層且用乙酸乙酯(2×)再萃取水相。將合併之有機層經無水硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮，以產生琥珀色發泡體狀標題產物(3.11g,92%)。ES/MS(m/e)469(M+1)。

製備16 N-[2-(1,3,3a,4,5,6-六氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-6a-基)-4-吡啶基]乙醯胺

在攪拌下將6a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯(3.11g,6.64mmol)吸收於三氟乙酸(10mL)中並將所得溶液於50℃下加熱。1.5小時後，將反應冷卻並在減壓下濃縮。將所得深色油狀物重新溶解於二氯甲烷/甲醇溶液中並裝載至兩個離子交換管柱(25g)上。將該物質用甲醇、隨後2M氨甲醇溶液溶析。在減壓下濃縮鹼性部分，以產生黏稠褐色油狀物(1.71g,88%)。ES/MS(m/e)248(M+1)。

製備17 6a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯

在攪拌下將N-[2-(1,3,3a,4,5,6-六氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-6a-基)-4-吡啶基]乙醯胺(1.71g,5.85mmol)溶解於二氯甲烷(無水)(13mL)中並添加二碳酸二-第三丁基酯(1.28g,5.86mmol)、之後添加三乙胺(810μL,5.81mmol)。將所得溶液於室溫下攪拌1小時45分鐘。將反應物用二氯甲烷稀釋並用鹽水洗滌。將有機層經無水硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下蒸發，以產生淺黃色發泡體狀標題產物(2.05g，定量)。ES/MS(m/e)349(M+1)。

製備18 6a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-1-(苯甲醯基胺基甲醯硫基)-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯

在攪拌下在氮下將6a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯(2.05g,5.88mmol)吸收於無水四氫呋喃(15.0mL)中。添加異硫氰酸苯甲醯基酯(900μL,6.54mmol)並於室溫下在氮下攪拌反應。2小時後，在減壓下濃縮反應，以產生淺黃色油狀物。藉由矽膠管柱層析使用環己烷中之20%至100%乙酸乙酯之梯度純化油狀物，以產生乳白色發泡體狀標題產物(2.14g,66%)。ES/MS(m/e)512(M+1)。

製備19 3-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-3-(苯甲醯基胺基甲醯硫基胺基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁基酯

將6a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-1-(苯甲醯基胺基甲醯硫基)-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯(2.14g,3.86mmol)溶解於乙醇(40mL)中並放置於大的Parr氫化瓶中。在氮氣氛下添加氫氧化鈀(20wt%，於碳上，877mg)且隨後將其放置於Parr氫化裝置上並於50psi下氫化24小時。將反應懸浮液用乙醇稀釋並經由矽藻土過濾。將墊用乙酸乙酯洗滌。在減壓下濃縮合併之濾液，以產生標題產物(2.03g,96%)，其未經進一步純化即使用。ES/MS(m/e)514(M+1)。

替代製備19

將3-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-3-胺基-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁基酯(1.43g,4.08mmol)溶解於無水四氫呋喃(27mL)中。添加異硫氰酸苯甲醯基酯(578.49μL,4.20mmol)並將所得混合物於室溫下在氮下攪拌2小時。隨後在減壓下移除溶劑，以產生黃色固體發泡體。藉由矽膠管柱層析使用環己烷中之0%至100%乙酸乙酯之梯度純化此物質，以產生白色固體狀標題化合物(2.1g，定量)。ES/MS(m/e)514(M+1)。

製備20 3-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-3-胺基-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁基酯

在超音波處理下將6a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸第三丁基酯(2.026g,5.82mmol)溶解於乙醇(145mL)中。將所得溶液經由氫氧化鈀(20wt%支撐於碳midi柱上)於70℃以3ml/min在85巴壓力及100%氫產生下操作之流動氫化器上循環兩次。在減壓下移除乙醇，以產生白色發泡體狀標題化合物(1.98g)且存在少量雜質，其未經進一步純化即使用。ES/MA(m/e)351(M+1)。

製備21 外消旋(順式)-7a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-2-苯甲醯胺基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁基酯

在氮下向3-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-3-(苯甲醯基胺基甲醯硫基胺基)-4-(羥基甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁基酯(5.16g,8.53mmol)於四氫呋喃(80mL)中之攪拌溶液中添加1,1'-羰基二咪唑(1.84g,11.35mmol)。於室溫下攪拌所得溶液。4小時後，添加額外1,1'-羰基二咪唑(968.52mg,5.97mmol)且於室溫下繼續反應。再3.5小時後，完全形成中間體咪唑加成物，ES/MS 608(M+1)。隨後將反應升溫至75℃，使用矽膠乾燥管排出水份，且將混合物攪拌過夜。將反應冷卻至室溫並用乙酸乙酯稀釋。將所得溶液用水洗滌，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以產生黃色油狀物。藉由矽膠管柱層析使用異己烷中之0%至100%乙酸乙酯之梯度純化殘餘物，以產生淺黃色固體狀標題化合物(3.31g；78%)。ES/MS(m/e)496(M+1)。

製備22 外消旋(順式)-N-[7a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺

在攪拌下將外消旋(順式)-7a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-2-苯甲醯胺基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸第三丁基酯(3.31g,6.67mmol)懸浮於二氯甲烷(19mL)中。添加三氟乙酸(9.5mL)以產生澄清溶液。將溶液於室溫下攪拌2小時且在減壓下移除溶劑。將所得殘餘物重新溶解於甲醇中並將此溶液裝載至離子交換管柱(50g)上。將該管柱用甲醇(3管柱體積)、隨後用2M氨甲醇溶液(3管柱體積)溶析。將鹼性洗滌物合併並在減壓下濃縮，以產生黃色固體狀標題化合物(2.90g，定量)。ES/MS(m/e)396(M+1)。

製備23 外消旋(順式)-N-[7a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺

向外消旋(順式)-N-[7a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-4a,5,6,7-四氫-4H- 吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(2.90g,6.61mmol)於1,4-二噁烷(100mL)中之攪拌溶液中添加5-氟-2-氯嘧啶(3.15mL,33.03mmol)及二異丙基乙胺(5.8mL,33.03mmol)。將所得溶液於100℃下攪拌18小時且排除水份。在減壓下移除溶劑以產生褐色油狀物。藉由矽膠管柱層析使用異己烷中之0%至100%乙酸乙酯之梯度純化殘餘物，以產生黃色固體狀標題化合物(2.60g；80%)。ES/MS(m/e)492(M+1)。

製備24 外消旋(順式)-7a-(4-胺基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

向外消旋(順式)-N-[7a-(4-乙醯胺基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲醯胺(2.6g,5.3mmol)於甲醇(106mL)中之溶液中添加氫氧化鋰(1.3g,52.8mmol)。將反應物於70℃下加熱8小時且隨後於室溫下加熱夜晚之剩餘時間。在此期間沈澱出白色固體且藉由過濾收集。將經過濾之固體用少量甲醇洗滌並乾燥，以產生標題化合物(1.1g；59%)。ES/MS 346(M+1)。使用離子交換層析回收濾液中剩餘之產物。將甲醇濾液直接裝載至離子交換管柱(50g)上並用甲醇(3管柱體積)、之後2M氨甲醇溶液(3管柱體積)溶析。將鹼性溶析物在減壓下濃縮，以產生額外700mg 70%純度之標題化合物。ES/MS 346(M+1)。

製備25 外消旋(順式)-N-[7a-(4-胺基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]胺基甲酸第三丁基酯

向外消旋(順式)-7a-(4-胺基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(1.08g,3.12mmol)於二甲基甲醯胺(17mL)中之攪拌懸浮液中添加二氯甲烷(9mL)中之二碳酸二-第三丁基酯(1.16g,5.30mmol)。將懸浮液於室溫下攪拌週末。將反應混合物分配在二氯甲烷與鹽水溶液之間。分離有機相並再用鹽水溶液洗滌。將有機層經無水硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以產生黃色油狀物。藉由矽膠管柱層析使用二氯甲烷中之2M氨甲醇溶液之0%至5%梯度純化殘餘物，以產生澄清膠狀標題化合物(外消旋物，1.60g，具有20%殘餘二甲基甲醯胺/二氯甲烷)，其未經進一步純化即直接使用。ES/MS(m/e)446(M+1)。

製備26 外消旋(順式)-N-[(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)胺基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]胺基甲酸第三丁基酯

在攪拌下將外消旋(順式)-N-[7a-(4-胺基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]胺基甲酸第三丁基酯(1.01g,2.27mmol)溶解於乙酸乙酯(8mL)中。隨後添加1-丙烷膦酸環酸酐(

50wt%，於乙酸乙酯溶液中)(2.31mL,3.63mmol)、三乙胺 (948μL,6.80mmol)及5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(454mg,2.95mmol)。將所得溶液於80℃下在氮下加熱1小時20分鐘且隨後將其冷卻至室溫。將混合物用乙酸乙酯及飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋並分離各層。將水層用乙酸乙酯再萃取。將有機層合併，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以產生褐色固體。藉由矽膠管柱層析使用異己烷中之乙酸乙酯之0%至75%梯度純化殘餘物，以產生標題化合物(576mg,44%)。ES/MS(m/e)582(M+1)。

製備27 N-[(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)胺基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]胺基甲酸第三丁基酯

藉由對掌性SFC(管柱：OJ-H,25cm×21.2mm，5微米)；移動相：24%甲醇(0.1%氨)76% CO₂；流速：70mL/min，於UV 220nm下；35℃；12mg/注射)將外消旋(順式)-N-[(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)胺基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]胺基甲酸第三丁基酯(576mg,0.99mmol)分成其構成鏡像異構物。第二溶析異構物(異構物2)係標題化合物(207mg,36%)。ES/MS(m/e)582(M+1)。

實例1 外消旋(順式)-N-[2-[(4aR,7aR)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺

向外消旋(順式)-N-[6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)胺基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]胺基甲酸第三丁基酯(487mg,837.30μmol)於二氯甲烷(14mL)中之溶液中添加三氟乙酸(1.7mL)並將混合物於室溫下攪拌1.5小時。將反應物用二氯甲烷稀釋並用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。分離各層並將水層用二氯甲烷再萃取。將有機層合併，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以產生白色固體。藉由矽膠管柱層析使用二氯甲烷中之0%至5% 2M氨甲醇溶液之梯度純化固體，以產生標題化合物(126mg,31%)。ES/MS(m/e)482(M+1)。

實例2 N-[2-[(4aR,7aR)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺

向N-[(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)胺基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]胺基甲酸第三丁基酯(異構物2，207mg，355.90μmol)於二氯甲烷(6mL)中之溶液中添加三氟乙酸(712μL,9.41mmol)。將所得溶液於室溫下攪拌1.5小時。隨後將反應物用二氯甲烷稀釋並用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。分離各層並將水層用二氯甲烷再萃取。將有機層合併，經無水硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以產生白色固體，將其在真空烘箱於35℃下乾燥5小時，以產生標題化合物(186mg，定量)。ES/MS(m/e)482(M+1)

N-[2-[(4aR,7aR)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺之替代製備

藉由對掌性HPLC(管柱：AD-H，25cm×21.2mm，5微米)；移動相：1：4比率之乙腈對甲醇(20mM氨甲醇溶液)；流速：30mL/min，於UV可變波長檢測下；8mg/注射)將外消旋(順式)-N-[2-[(4aR,7aR)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(126mg,0.262mmol)分成其構成鏡像異構物。第二溶析異構物係標題化合物(92mg,73%)。ES/MS(m/e)482(M+1)。

實例3 外消旋(順式)-N-[2-[2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺鹽酸鹽

將外消旋(順式)-N-[2-[2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺(56mg,0.116mmol)溶解於乙腈(0.35mL)中，之後添加0.1M鹽酸水溶液(1.1mL)。將所得溶液放置於冷凍乾燥器上過夜，以產生白色固體狀標題化合物(61mg,51%)。ES/MS(m/e)482(M+1)

活體外分析程序：

對於活體外酶及細胞分析，在DMSO中製備測試化合物以構成10mM儲存溶液。在實施活體外酶及全細胞分析之前，在96孔圓底板中將儲存溶液在DMSO中連續稀釋以獲得10點稀釋曲線，其中最終化合物濃度在10μM至0.05nM範圍內。

活體外蛋白酶抑制分析： huBACE1 Fc之表現及純化

藉由RT-PCR自總腦cDNA選殖人類BACE1(登錄號：AF190725)。將對應於胺基酸序列號1至460之核苷酸序列插入編碼人類IgG₁(Fc)多肽之cDNA中(Vassar等人，Science,286,735-742(1999))。將BACE1(1-460)及人類Fc之此融合蛋白(稱作huBACE1：Fc)構築至pJB02載體中。將人類BACE1(1-460)：Fc(huBACE1：Fc)在HEK293細胞中瞬時表現。將每一構築體之250μg cDNA與Fugene 6混合並添加至1升HEK293細胞中。在轉染後4天，收穫條件培養基用於純化。藉由蛋白質A層析純化huBACE1：Fc。將酶以小的等份儲存於-80℃下。(參見Yang等人，J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004)。

BACE1 FRET分析

如上文所述製備測試化合物之連續稀釋物。將化合物在KH₂PO₄緩衝液中進一步稀釋20倍。向每一孔中在含有反應混合物(25μL 50mM KH₂PO₄(pH 4.6)、1mM TRITON® X-100、1mg/mL牛血清白蛋白及15μM FRET受質)之相應低蛋白結合黑板之A至H列上添加10μL每一稀釋物(參見Yang等人，J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004))。將內容物在板振盪器上充分混合10分鐘。向含有受質及測試化合物之板中添加15μL存於KH₂PO₄緩衝液中之200pM人類BACE1(1-460)：Fc(參見Vasser等人，Science,286,735-741(1999))以起始反應。在板振盪器上簡單混合後，於激發波長355nm及發射波長460nm下記錄0時刻時混合物之RFU。將反應板用鋁箔覆蓋並在加濕暗爐中於室溫下保持16h至24h。利用時刻0時使用之相同激發及發射設定記錄培育結束時之RFU。時刻0及培育結束時RFU之差異代表在化合物處理下BACE1之活性。以RFU差異對抑制劑濃度繪圖且利用4參數對數方程擬合曲線以獲得IC₅₀值。(參見Sinha等人，Nature,402,537-540(2000)及May等人，Journal of Neuroscience,31,16507-16516(2011))。

基本上如上文所述測試實例2之化合物且其展現0.90nM(±0.36,n=10)平均值±SEM之BACE1之IC₅₀。

此數據證實，實例2之化合物在活體外抑制純化重組BACE1酶活性。

用於量測β-分泌酶活性之抑制之全細胞分析 PDAPP原代神經元分析

亦在自PDAPP轉基因胚胎小鼠生成之原代神經元培養物中運行確認全細胞分析(闡述於Games等人，Nature 373,523-527(1995)及May等人，Journal of Neuroscience,31,16507-16516(2011)中)。自胚胎期第16天PDAPP胚胎製備原代皮質神經元並在96孔板中培養(15×10⁴個細胞/孔，存於DMEM/F12(1：1)與10% FBS中)。在活體外2天後，將培養基用含有B27補充劑及2μM(最後)Ara-C(Sigma,C1768)之不含血清之DMEM/F12(1：1)更換。在活體外第5天，在存在/不存在期望濃度之抑制劑(稀釋於DMSO中)下將神經元於37℃下培育24小時。在培育結束時，藉由(例如)Abeta肽之分析分析條件培養基用於證明β-分泌酶活性。藉由夾心式ELISA使用單株266作為捕獲抗體及生物素化3D6作為報告抗體量測總Abeta肽(Abeta 1-x)。或者，使用單株2G3作為Abeta 1-40之捕獲抗體且使用單株21F12作為Abeta 1-42之捕獲抗體量測Abeta 1-40及Abeta 1-42肽。Abeta 1-40及Abeta 1-42ELISA皆使用生物素化3D6作為報告抗體(關於抗體之說明，參見 Johnson-Wood等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,1550-1555(1997))。在化合物處理後條件培養基中所釋放之Abeta之濃度對應於在該等條件下BACE1之活性。繪製10點抑制曲線且利用4參數對數方程擬合以獲得Abeta降低效應之IC₅₀值。基本上如文所述測試實例2之化合物且其展現以下活性。降低Abeta_1-40之IC₅₀=0.65nM(±0.11,n=3)。降低Abeta_1-42之IC₅₀=0.91nM(±0.16,n=3)。

此數據證實，實例2之化合物在全細胞中抑制Abeta_1-40及Abeta_1-42產生。

Claims

一種下式之化合物或其醫藥上可接受之鹽：
如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其係N-[2-[(4aR,7aR)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項1或2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其係N-[2-[(4aR,7aR)-2-胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲醯胺。
如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法中。
如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)。
一種如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用以治療阿茲海默氏病之藥劑。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。