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TWI379693B - Calicheamicin derivative-carrier conjugates - Google Patents

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TWI379693B
TWI379693B TW092112147A TW92112147A TWI379693B TW I379693 B TWI379693 B TW I379693B TW 092112147 A TW092112147 A TW 092112147A TW 92112147 A TW92112147 A TW 92112147A TW I379693 B TWI379693 B TW I379693B
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antibody
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cdr
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Keith Moran Justin
Thomas Rubino Joseph
Jain Neera
Joseph Vidunas Eugene
Mclean Simpson John
David Robbins Paul
Merchant Nishith
Francis Dijoseph John
Edward Ruppen Mark
Krishnaji Damle Nitin
George Popplewell Andrew
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Wyeth Corp
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Publication date
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Publication of TW200404005A publication Critical patent/TW200404005A/zh
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Description

1379693 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於產製具有向藥物裝載和實質上降低之低共 軛部分（LCF)之單體胞毒藥物/載體共軛物（“共軛物，，）的方 法。特定而τ，本發明係關於抗_CD22抗體_單體卡奇黴素 共聚物。本發明亦關於本發明之共輛物，純化該共軛物的 方去，包括孩共軛物的醫藥組合物以及該共軛物之用途。 【先前技術】 為了系統性藥理治療而發展的藥物共軛物，是標靶-專一 的胞母製劑。該概念涉及將治療劑與對已限定之標靶細胞 族群具有專一性的载體分子偶聯。對抗原具有高親和力的 抗體，是作為標乾部分的天然選擇。利用高親和力單株抗 體的利用性，抗體-瞄準療法的展望，已經成為有希望的。 已經與單株抗體聽的毒性物質，包括毒素、低_分子量的 胞毒藥物、生物學反應修都因子以及放射性核素。通常將 抗體-毒素共扼物稱為免疫毒素，但是，將由抗體和低-分子 K樂物，像是胺甲碟4和亞德里亞黴素所組成的免疫共 軛物，稱為化學免疫共軛物。免疫調節劑則含有已知其具 有調節功能的生物反應修飾因子，像是淋巴細胞活素、生 長因子以及補體-激活之眼鏡蛇毒液因子（CVF)〇放射性免 =輛物由放射性同位素所組成，其可用來作為治療劑， 藉著它們的輻射殺死細胞’或用來顯影。預期抗體，節之 將胞毒藥物專-地遞送至腫瘤細胞，㈣增加其抗_腫瘤的 效力’亦防止被正常組織未經瞒準的攝入，因此增加了其 85073.doc 1379693 治療指標 本發明係關於免疫共輛物，包括與胞毒藥物共軛的抗體 ，该柷體係作為瞄準媒介，並對在亞性腫瘤細胞之表面上 的抗原性決定位具有專一性。本發明係關於胞毒藥物-抗體 共軛物，其中該抗體對在B-亞性腫瘤、淋巴增殖性病症和 一 杈性炎症性疾病上之抗原性決定位，具有專一性。本發明 亦關於產製免疫共輛物的方法以及其治療用途（們）。 . 為了治療各種疾病，包括癌症和風濕性關節炎，已經批 春 准I中多以抗體為基礎的治療劑，可供臨床使用或對各種亞 性腫瘤，包括B-細胞亞性腫瘤，像是非-霍奇金氏淋巴瘤， 進行臨床試驗《—種以抗體為基礎的這類治療劑，是利妥 昔單抗（rituximab)(美羅華（Rituxan)TM)，一種未經標示之嵌 合型人類γΐ (+πιγΐν-區域）抗體，其對•細胞上表現之細 胞表面抗原CD20是專一的❶這些0抗體為基礎之治療劑依 賴補體-調節的胞毒性（CDCC)，或抗體-依賴性的細胞胞毒 性（ADCC) ’來對抗Β細胞’或依賴放射性核素的使用，像 儀 是13 4或9QY，對於臨床醫師和患者而言，其與製備和使用的 問題有關。結果，對於免疫共軛物的產製有需求，其可克 服目前以抗體為基礎之治療劑的缺點，治療各種亞性腫瘤 ，包括造血的亞性腫瘤，像是非-霍奇金氏淋巴瘤（NHL)， 可容易且有效地產製，並可重複地使用它，而不引起免疫 反應。 為了應用在骨髓瘤的治療上，發展出包括有潛力之抗細 菌和抗腫瘤劑家族之成員的免疫共輊物，集體地稱為卡奇 85073.doc 1379693 徽素或LL-E3通複合物（參見美國專利第4,97〇,i98號 (1990))。將最有潛力的卡奇黴素命名為&amp;，在本文中將其 簡稱為γ。這些化合物含有甲基三硫化物，其可與適當的硫 醇反應’形成二硫化物，在相同的時間，導入諸如㈣之 類的官能基或其他官能基，其可用來使卡奇徽素附接載劑 。（參見美國專利第5,053,394號卜在為了各式各樣癌症而正 在發展的療法巾，使用㈣卡奇黴素衍生物/㈣共輛物， 已經受到專一性瞄準劑（載體）和共軛作用方法學兩者的限 制，結果在增加與載劑共軛之卡奇黴素衍生物的用量（即藥 物裝載）時，形成蛋白質聚集體。因為較高的藥物裝載，增 加了共軛物固有的效力，所以想要在載體上，裝載與保留 載體蛋白質之親和力一致那樣多的藥物。f集之蛋白質： 存在，其可能是具有非專—之毒性的且為免疫原性的，並 因此必須為了治療應用而將其移除，使得遞増進行這些共 軛物的產製變得更為困冑，並降低產物的產量。在載體蛋 白質上裝載的卡奇黴素量（藥物裝載）’在共輛反應中形成之 聚，體的量，以及可獲得的最終經過純化之單體共輛物的 產I，均是相關的。因此，必需藉著調節加至共軛反應中 &lt;反應性卡奇黴素衍生物的量，在較高的藥物裝載和最終 單體的產量之間達成妥協。 胞毒藥物共軛物，尤其是卡奇黴素共軛物至聚集體的趨 勢，當與在美國專利第5,877,296號和美國專利第5,773,〇〇1 號中描述之交聯劑進行共軛反應時，是特別有問題的|將 其全部以引用的方式併入本文中。在該情況下，所產生的 85073.doc -9- 大部分共軛物為聚集的形式，且為了治療用途藉著這些原 始的方法（CMA法）進行共軛物的純化，是相當困難的。對 某些載體蛋白質而言，除非是以小規模，否則即使是製造 適度裝載的共軛物，也幾乎是不可能的。結果，迫切地需 要共軛胞毒藥物，像是卡奇黴素與載體的改良方法，其將 聚集的量減至最少，並藉此容許儘可能高的藥物裝載，以 及產物的合理產量。 先前，揭示了製備具有較高藥物裝載/產量和降低聚集作 用之單體卡奇黴素衍生物/載體的共軛方法（參見美國專利 第5’712,374號和美國專利第5,714,586號，纟部以引用的方 式併入本文中）。雖然這些方法導致具有實質上降低聚集體 内含K共軛物製品的結果，但其稍後揭示其產生的共軛 物’含有不想要的高量（45_65% Ηριχ面積％)低共輕部分 (LCF)，王要由未共軛之抗體組成的部分。在產物中出現 ’是抗體的無效率使用，因為其並未含有胞毒藥物。它亦 可能與卡奇黴素_載體共軛物競爭標靶，並可能降低後者的 可瞄準性，結果降低了胞毒藥物的效力。因此，想要經過 改良的共軛方法，其結果將明顯地降低之含量，並具有 可接受含量的聚集作用’而不會明顯地改變共輛物的物理 特性。 【發明内容】 本發明係關於產製單體胞毒藥物衍生物/載體共輛物（“共 軛物並具有較高裝載和實質上降低之低共軛部分(LCF) 的方法。特定而言，本發明係關於單體卡奇黴素衍生物-载 85073.doc 體共輛物的產製、該共輛物、組合物、純化該共輛物的方 法以及該共軛物的用途。更特定而言，本發明係關於產製 單體卡奇黴素衍生物-抗-CD22抗體共軛物（CMC-544)的方 法0 在一個具體實施例中，本發明揭示產製結果.為明顯較低
_ III 含量之LCF (低於10%)，並匕羡^性沒有任何 經良之共軛方法。對共 軛方法的進二^吉果不僅明顯地降低了 LCF之含量 ，亦比先前揭示的方法，明顯降低了聚集作會 質 土加本具有下式: Pr(-X-W)m 其中：
Pr為蛋白質之載體， X為交聯劑，其包括任何可與蛋白質載體反應之反應基團 的產物， W為胞毒藥物； m為經過純化之共軛產物的平均裝載，使得胞毒藥物按重 量計構成共輛物的7-9% ;且 (-X-W)m為胞毒藥物衍生物。 在一個具體實施例中，藉著包括下列步驟之本發明方法 ，來產製本發明之共輛物：（1)將胞毒藥物衍生物加至蛋白 質載體中，其中該胞毒藥物衍生物按蛋白質載體之重量計 ，為4.5-11% ; (2)在非-親核的 '蛋白質-可相容的、具有範 圍從大約7至9之pH值的緩衝溶液中，培養該胞毒藥物衍生 85073.doc -11 - 1379693 物和蛋白質載體’產生單體胞毒藥物/載體共輛物，其中該 溶液進-步包括⑷有機的共溶劑和⑻添加劑，包括至少一 個Q-cls羧酸或其鹽，且其中係在從約3〇它到大约35它的溫 度範園下’進行該培養，持續大約15分鐘到24小時的期間 並（3)使在步驟⑺中產生的共轭物接受層析分離方法，分離 ，體胞毒藥物衍生物/蛋白質載體共㈣，按胞毒藥物之重 量計，裝紐園為4·1〇%，並具有低於1()%的低共輛部分， 係來自未共轭蛋白質載體、胞毒藥物衍生物和聚集的共柄 物。 在本發明的一項觀點中，共軛物之蛋白質載體係選自由 荷爾蒙、生長因子、抗體、抗體片段、抗體模仿物及其以 遺傳方式或以酵素方式設計的配對物所組成之群。 在一個具體實施例中，該蛋白質載體為抗體。在較佳的 具體實施例中，該抗體係選自由單株抗體、嵌合型抗體、 人類抗體、人類化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2片段 所組成之群。 在另一個具體實施例中，該人類化抗體係針對細胞表面 抗原CD22。 在一個較佳的具體實施例中，該人類化抗_CD22抗體是 CDR-移植的抗體，並包括輕鏈可變區5/44_gU(序列識別㈣ 號）和重鏈可變區5/44-gH7(序列識別27號）。 在另一個較佳的具體實施例中，該人類化抗_CD22抗體是 CDR-移植的抗體，包括具有在序列識別28號中陳述之序列 的輕鏈。 85073.doc •12- 1379693 在另一個較佳的具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是 CDR-移植的抗體，包括具有在序列識別30號中陳述之序列 的重鏈。 在另一個較佳的具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是 CDR-移植的抗體，包括具有在序列識別28號中陳述之序列 的輕鏈和在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。 在另一個具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體，其為藉著親和力成熟草案獲得的變種抗體， 並對人類CD22具有增加的專一性。 在另一項觀點中，用來產製本發明之單體胞毒藥物/載體 共輛物的胞毒藥物，是微管蛋白聚合作用之抑制劑、與DNA 結合並使其中斷的烷基化製劑、蛋白質合成之抑制劑或酪 胺酸激酶之抑制劑。 在一個具體實施例中，該胞毒藥物係選自卡奇黴素、噻 替喊（thiotepa)、紫杉燒（taxanes)、長春新驗、道諾紅菌素、 阿黴素（doxorubicin)、表柔比星（epirubicin)、艾思普黴素 (esperamicins)、放線菌素、奥索拉黴素（authramycin)、重氮 絲胺酸（azaserines)、博菜黴素、他莫昔芬（tamoxifen)、伊達 比星（idarubicin)、多拉斯塔，;丁（dolastatins)/奥雷斯塔汀 (auristatins)、半阿斯特林（hemiasterlins)和類美登素 (maytansinoids) ° 在較佳的具體實施例中，該胞毒藥物是卡奇黴素。在特 佳的具體實施例中，該卡奇黴素是γ卡奇黴素或N-乙醯基γ 卡奇黴素衍生物。 85073.doc -13- 1379693 在另一項觀點中，該胞毒藥物具有3-巯基-3-甲基丁醯肼 之官能基，並經由能夠在與標細胞結合並進入其中之後 ，從該共軛物中釋放出胞毒藥物的可水解之交聯劑與蛋白 質載體共軛。 在該項觀點之較佳的具體實施例中，可水解之交聯劑為 4-(4-乙醯基苯氧基）丁酸（AcBut)。 在本發明的另一項觀點中，在共軛方法的期間，使用辛 酸或其鹽，或癸酸或其鹽，作為添加劑，以便降低聚集作 用並增加藥物裝載。 在本發明的另一項觀點中，藉著層析分離方法純化本發 明之共輛物。 在一個具體實施例中，用來分離單體藥物衍生物-載體共 軛物之層析分離方法是尺寸排阻層析法（SEC)。 在另一個具體實施例中，用來分離單體藥物衍生物-載體 共軛物之層析分離方法是HPLC、FPLC或Sephacryl S-200層 析法。 在較佳的具體實施例中，用來分離單體藥物衍生物-載體 共軛物之層析分離方法是厭水性交互作用層析法（HIC)。在 特佳的具體實施例中，使用苯基瓊脂糖6速流層析介質、丁 基瓊脂糖4速流層析介質、辛基瓊脂糖4速流層析介質、 Toyopearl醒-650M層析介質、Macro-Prep甲基HIC介質或 Macro-Prep第三-丁基HIC介質，來進行HIC。在更特佳的具 體實施例中，使用丁基瓊脂糖4速流層析介質來進行HIC。 在另一項觀點中，本發明針對藉著本發明之方法產製的 85073.doc -14- 1379693 單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物。在該項觀點的較佳具體 實施例中，所使用的胞毒藥物為卡奇黴素，且所使用之載 體為抗體。 在另一個較佳的具體實施例中，該抗體係選自由單株抗 體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化抗體、單鏈抗體、Fab 片段和F(ab)2片段所組成之群。在更特佳的觀點中，使用針 對細胞表面抗原CD22的人類化抗體。 在一個具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是CDR-移 植的抗體，並包括輕鏈可變區5/44-gLl (序列識別19號：)和重 鏈可變區5/44-gH7 (序列識別27號）。 在另一個具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體，包括具有在序列識別28號中陳述之序列的輕 鍵。 在較佳的具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體，包括具有在序列識別30號中陳述之序列的重 鍵。 在另一個較佳的具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是 CDR-移植的抗體，包括具有在序列識另ij 28號中陳述之序列 的輕鏈和在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。 在另一個具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗體，其為藉著親和力成熟草案獲得的變種抗體， 並對人類CD22具有增加的專一性。 在較佳的具體實施例中，該卡奇黴素是γ卡奇黴素或N-乙醯基γ卡奇黴素衍生物。 85073.doc -15- 甲Γ個具體㈣財，該卡奇«衍生物具有域基-3· 甲基丁醯胼之官能基。 —個具體實施例中，用來共輛藥物與載體之交聯劑 :此夠在與標靶細胞結合並進入其中之後，從該共軛物中 筆放出胞毒藥物的可水解之交聯劑。在較佳的具體實施例 可X解之人聯劑為4_(4_乙醯基苯氧基）丁酸（AcBut)。 本發月之纟他觀點係針對具有式的單體卡 :黴素衍生物/抗_CD22抗體共輛物，其中· Pr為抗_CD22抗 租，X為可水解之交聯劑，其包括任何可與該抗體反應之反 應基團的產物’ w為卡奇黴素基團；m為經過純化之共輛產 物的平均裝載’使得卡奇黴素按重量計構成共軛物的 ，且（-X-S-S_W)m為藉著本發明之方法產製的卡奇黴素衍生 物0 在垓項觀點的一個具體實施例中，該抗體係選自由單株 抗體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化抗體、單鏈抗體、 Fab片段和F(ab)2片段所組成之群。 在較佳的具體實施例中，該抗體為抗_CD22抗體，其對人 類CD22具有專一性，並包括重鏈，其中可變功能部位包括 CDR ’具有至少一個在圖1中以hi (序列識別1號）為CDR-H1 提供的序列’在圖1中以H2 (序列識別2號）或H2’（序列識別 13號）或H2”（序列識別15號）或H2，’，（序列識別16號）為 CDR-H2提供的序列或在圖1中以H3 (序列識別3號）為 CDR-H3提供的序列，並包括輕鏈，其中可變功能部位包括 CDR，具有至少一個在圖1中以L1 (序列識別4號）為CDR-L1 85073.doc -16- 1379693 提供的序列，在圖1中以L2 (序列識別5號）為CDR-L2提供的 序列，或在圖1中以L3 (序列識別6號）為CDR-L3提供的序列。 在另一個較佳的具體實施例中，該抗-CD22抗體包括重鏈 ，其中可變功能部位包括CDR，具有至少一個以序列識別1 號為CDR-H1提供之序列、以序列識別2號或序列識別13號 或序列識別15號或序列識別16號為CDR-H2提供之序列或 以序列識別3號為CDR-H3提供之序列，以及輕鏈’其中可 變功能部位包括CDR，具有至少一個以序列識別4號為 CDR-L1提供之序列、以序列識別5號為CDR-L2提供之序列 或以序列識別6號為CDR-L3提供之序列。 在另一個較佳的具體實施例中，該抗-CD22抗體包括序列 識別1號之CDR-H1、序列識別2號或序列識別13號或序列識 別15號或序列識別16號之CDR-H2、序列識別3號之CDR-H3 、序列識別4號之CDR-L1、序列識別5號之CDR-L2和序列識 別6號之CDR-L3。 在另一個具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的抗-CD22抗體，並包括可變功能部位，包括人類接受 者架構區和非-人類捐贈者CDRs。 在另一個具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體具有人類 接受者架構’其中該抗體之重鏈可變功能部位的區域是以 人類亞-組I 一致序列為基礎，並在位置1、28、48、71和93 處，包括非-人類的捐贈者殘基。在另一個具體實施例中， 該人類化抗體進一步在位置67和69處，包括非-人類的捐贈 者殘基。 85073.doc -17· 1379693 在一個較佳的具體實施例中，該CDR-移植的人類化抗體 ，包括輕鏈的可變功能部位，其包括以人類亞-组I一致序列 為基礎的人類接受者架構區，並在位置2、4、37、38、45 和60處，進一步包括非-人類的捐贈者殘基。在另一個具體 實施例中，該CDR-移植的抗體在位置3處，進一步包括非-人類的捐贈者殘基。 在另一個具體實施例中，該CDR-移植的抗體包括輕鏈可 變區5/44-gLl (序列識別19號）和重鏈可變區5/44-gH7 (序列 識別27號）。 在另一個具體實施例中，該CDR-移植的抗體包括具有在 序列識別28號中陳述之序列的輕鏈，以及具有在序列識別 3 0號中陳述之序列的重鏈。 在另一個具體實施例中，該CDR-移植的抗體包括具有在 序列識別28號中陳述之序列的輕鏈，以及具有在序列識別 30號中陳述之序列的重鏈。 在一個具體實施例中，該抗-CD22 CDR-移植的抗體是藉 著親和力成熟草案獲得的變種抗體，並對人類CD22具有增 加的專一性。 在另一個具體實施例中，該抗-CD22抗體是嵌合型抗體， 其包括分別在序列識別7號和序列識別8號中陳述之單株抗 體的輕和重鏈可變功能部位之序列。 在另一個具體實施例中，該抗-CD22抗體包括雜種的CDR ，具有截短的捐贈者CDR序列，其中藉著不同的序列置換 捐贈者CDR的漏失部分，並形成有功能的CDR。 85073.doc -18- 1379693 在特佳的具體實施例中’該胞毒藥物衍生物是γ卡奇黴素 或Ν -乙Si基γ卡奇黴素衍生物。 在另一項觀點中，本發明係針對製備單體胞毒藥物衍生 物/載體共軏物的穩定之冷康乾燥組合物的方法。在較佳的 具體實施例中’藉著（a)使單體胞毒藥物衍生物/載體共輛物 溶解於下列溶液中：包括按重量計濃度為丨5%·5%之低溫保 護劑、按重量計濃度為0.5-1.5%之聚合填充劑、濃度為〇 〇1 μ 至0.1 Μ之電解質、按重量計濃度為〇.〇〇5_〇.〇5%之溶解促進 劑 '使得該溶液之終pH值為7.8-8.2、濃度為5_5〇 mM之緩衝 劑和水，至0.5至2毫克/毫升之終濃度；（b)在 的溫度下，將上述的溶液分配至小瓶内；（c)在_35它至_5〇亡 的冷凍溫度下，將該溶液冷凍；使已經冷凍的溶液，在 -l〇°C至-40°C的存放溫度下，在20至80微米的最初乾燥壓力 下，接受最初的冷凍乾燥步驟24至78小時；並（e)使步驟（d) 乏已經冷凍乾燥的產物，在+10°c至+351的存放溫度下， 在20至80微米的乾燥壓力下接受二級乾燥步驟^至川小時 ，來製備單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物的穩定之冷凍乾 燥組合物。 在一個具體實施例中，在胞毒藥物/載體共輛物之冷凍乾 自醛醇、甘露糖醇、 糖路：酸、越酸（aldaric 醛醇類、肌醇類、甘 核糖、木糖、半乳糖 塔羅糖、庚糖、葡萄 燥作用中所使用的低溫保護劑，係選 山梨糖醇、肌醇、聚乙二醇、醛糖酸、 acid)、醛糖類、酮糖類、胺基糖類、 油醛類 '阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、 、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、 85073.doc -19· 1379693 糖、果糖、葡萄糖酸、山梨糖醇、乳糖、甘露糖醇、甲基α_ p比喃葡糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、内酯、山 梨糖、葡糖二酸、赤癬糖、蘇糖、阿拉伯糖、異構糖、阿 卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、赤癬酮糖、核酮糖、木 酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖 二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺、 蔗糖、海藻糖、神經胺糖酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻 聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木 聚糖、果聚糖、岩藻依聚糖、角叉菜膠、半乳卡洛羅糖 (galact〇car〇l〇se)、果膠、果膠酸、直鏈澱粉、支鏈澱粉、 糖原、澱粉果膠、纖維素、葡聚糖、石臍素、幾丁質、瓊 脂糖、角質素、軟骨素、皮膚素、透明質酸、藻酸、黃酸 樹膠、澱粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、聚 乙一醇、I丙一醇、甘油和季戊四醇。 在較佳的具體實施例中，該低溫保護劑是蔗糖，其以按 重量計1.5%的濃度存在。 在一個具體實施例中，在冷滚乾燥之期間中所使用的 合填充劑’係選自葡聚糖4〇或羥乙基澱粉4〇，且濃度為 重量計0.9%。 ^ ”在另-個具體實抱例中，在冷來乾燥溶液中 解質疋氯化麵，其以〇.〇5 Μ之濃度存在。 在較佳的具體實施例中， 他東乾期間中所使用的 命解-促進劑。該溶解促 蝴眘界面活性劑。在特佳的具 月且實犯例中，該界面活 r生洌疋多乙虱基醚80，其以按重量 85073.doc -20· 1379693 計0.01%的濃度存在》 在一個具體#施例中，所使用之緩衝劑為三甲醇氨其甲 垸，其以0.02 Μ之濃度存在。該溶液之阳值，在冷滚乾燦 過程開始時，最好是8.〇。在該過程開始之前，先在+5它之溫 度下，將含有胞毒藥物/載體共軛物之溶液分配到小瓶中二 在較佳的具體實施例中，在-45t的溫度下冷康在小瓶中 的溶液；使已經冷康的溶液，在6〇微米的最初乾燥壓力和 -30 C的存放溫度τ，接受最初的冷;東乾燥步驟6〇小時，·並 使已經冷凍-乾燥的產物，在6〇微米的乾燥壓力和+251的 存放溫度下，接受二級乾燥步驟24小時。 本發明的其他觀點，係針對包括在治療上有效之劑量、 藉著本發明之方法製備的單體胞毒藥物衍生物/載體共軛 物之組合物。 在一個具體實施例中，在單體胞毒藥物衍生物/載體共軛 物中的載體是蛋白質载體，冑自荷爾蒙、生長因子、抗體 和抗體類似物。 在較佳的具體實施例中，該蛋白質載體是人類單株抗體 、嵌合型抗體、人類抗體或人類化抗體。 在較佳的具體實施例中，該人類化抗體係針對細胞表面 抗原CD22。 在本發明該項觀點的特佳具體實施例中，該抗抗體 、子人類CD22具有專一性，並包括重鏈’其中可變功能部位 CDR具有至少一個在圖1中以h 1 (序列識別i號）為 CDR-H1提供的序列，在圖i中以H2 (序列識別：號）或似，（序 85073.doc •21 · 1379693 列識別13號）或H2”（序列識別15號）或H2，，，（序列識別16號） 為CDR-H2提供的序列或在圖1中以H3 (序列識別3號）為 CDR-H3提供的序列，並包括輕鏈，其中可變功能部位包括 CDR ’具有至少一個在圖1中以L1 (序列識別4號）為CDR-L1 提供的序列’在圖1中以L2(序列識別5號）為CDR-L2提供的 序列或在圖1中以L3 (序列識別6號）為CDR-L3提供的序列。 在另一個較佳的具體實施例中，該抗-CD22抗體具有重鏈 ，其中可變功能部位包括CDR，具有至少一個以序列識別1 號為CDR-H1提供之序列、以序列識別2號或序列識別13號 或序列識別15號或序列識別16號為CDR-H2提供之序列或 以序列識別3號為CDR-H3提供之序列，以及輕鏈，其中可 變功能部位包括CDR，具有至少一個以序列識別4號為 CDR-L· 1提供之序列、以序列識另ij 5號為CDR-L2提供之序列 或以序列識別6號為CDR-L3提供之序列。 在另一個較佳的具體實施例中，該抗_CD22抗體包括序列 識別1號之CDR-Η卜序列識別2號或序列識別13號或序列識 別15號或序列識別16號之CDR-H2、序列識別3號之CDR-H3 、序列識別4號之CDR-L1、序列識別5號之CDR-L2和序列識 別6號之CDR-L3。 在特佳的具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是CDR-移植的人類化抗-CD22抗體，並包括輕鏈可變區5/44-gLl (序 列識別19號）和重鏈可變區5/44-gH7 (序列識別27號）。 在另一個特佳的具體實施例中，該人類化抗-CD22抗體是 CDR-移植的抗體，對人類CD22具有專一性，並包括具有在 85073.doc •Ύ1· 1379693 序列識別28號中陳述之序列的輕鏈，以及具有在序列識別 30號中陳述之序列的重鏈。 在一個具體實施例中’該CDR-移植的抗體是變種抗體， 其對人類CD22具有增加的專一性，並藉著親和力成熟草案 獲得該抗體。 在一個具體實施例中，該單體胞毒藥物是卡奇黴素，且 最好是選自γ卡奇黴素或N-乙醯基卡奇黴素。 在一個具體實施例中，該組合物可視需要含有額外的生 物活性劑。這類生物活性劑可以是胞毒藥物、生長因子或 荷爾蒙。 本發明的另一項觀點，係針對藉著對個體投予在治療上 有效之劑量的本發明组合物，治療患有增殖性病症之個體 的方法。可以皮下、腹腔内、靜脈内、動脈内、髓内、鞘 内、經皮、經皮下、鼻内、局部、經腸、陰道内、舌下或 經直腸之方式，投予該組合物。在較佳的具體實施例中， 以靜脈内之方式投予本發明之組合物。 在-個具體實施例中，將组合物投予罹患增殖性病症， 像是癌症的人類個體。力曰祕&amp; ， B-細胞亞性腫瘤。Β·細 原CD22的白企病或淋巴瘤。 在另一個具體實施例中， 本發明的另一項觀點，係 。在較佳的具體實施例中，該癌症為 細胞亞性腫瘤可以是表現細胞表面抗 該癌症為癌或肉瘤。 之患者，投予包括本發明之 係針對藉著對患有這類亞性腫瘤 的具有治療效力之組合物， 之胞毒藥物，-抗-CD22-抗體共軛物 ’治療B-細胞亞性腫瘤的方法。 85073.doc -23· 1379693 在較佳的具體實施例中， 別是非f -細胞亞性腫瘤是琳巴瘤，特 別疋非-霍奇金氏淋巴瘤。 在一個具體實施例中，用类 藥物1€自用來I備本發明之共軛物的胞毒 =自由卡奇《、料★、紫_、長春新驗道 祐紅囷素、阿黴素、 ± 表柔比星、放線菌素、奥索拉黴素、 重虱4胺鉍、博菜黴素、 + 肥旲H分、伊達比星、多拉斯塔 /丁 /奥雷斯塔汀、半阿斯 龆μ八主 成之群。 斯特林、類吴登素和艾思普黴素所組 在較佳的具體實施例中 灼肀琢胞母樂物是γ卡奇黴素或Ν- 乙酿基卡奇徵素。 在另―個具體實施例中，該處理包括連同—或多個選自 抗體、生長因子、并痴、# ^ Β爾豕、，.田胞激動素、抗-荷爾蒙、黃嘌 7素、介白素、干擾素和胞毒藥物的生物活性劑，一起投 予本發明之胞毒藥物共軛物。 在較佳的具體實施例中，該生物活性劑為抗體，並對抗 f Β-細胞亞性腫瘤上表現的細胞表面抗原。在較佳的具體 實施例中’對抗在B'細胞亞性腫瘤上表現之細胞表面抗原的 抗體二係選自由抗_CD19、抗_CD2〇和抗.CD”抗體所组成之 群。廷類抗體包括抗_CD2〇抗體，利妥昔單抗（美羅華，。 在另-個㈣實施例中，該生物活性#沒細胞激動素或 生長因子’並包括但不限齡白素2 (IL_2)、舊、⑽、 GM-CSF和 G-CSF。 在另—個具體實施例中，該生物活性劑是荷爾蒙，並包 括雌激素、雄激素、孕留酮和皮質類固醇。 85073.doc -24- 1379693 在另一個具體實施例中，該生物活性劑為胞毒藥物，選 自阿黴素、道諾紅菌素、伊達比星、阿克拉黴素（aclarubicin) 、佐柔比星（zorubicin)、米托蒽酿（mitoxantrone)、表柔比星 、洋紅徽素I (carubicin)、諾加拉黴素（nogalamycin)、美諾 立爾（menogaril)、匹塔路比星（pitarubicin)、瓦路比星 (valrubicin)、阿糖胞嘗（cytarabine)、吉西他濱（gemcitabine) 、曲氟尿苷（trifluridine)、環胞甞（ancitabine)、依諾他濱 (enocitabine)、阿扎胞苷（azacitidine)、去氧氟尿苷 (doxifluridine)、噴司他丁（pentostatin)、脫氧溴尿苷 (broxuridine)、截瘤達（capecitabine)、克拉君賓（cladribine) 、地西他濱（decitabine)、氟尿嘗（floxuridine)、氟達拉濱 (fludarabine)、谷氏菌素（gougerotin)、嗓羅黴素（puromycin) 、替加氟（tegafur)、p塞嗤吱林（tiazofurin)、亞德里亞徽素、 順氯氨鉑（cisplatin)、卡鉑（carboplatin)、環磷酿胺、甲嗪咪 峻胺（dacarbazine)、長春花鹼、長春新鹼、米托蒽g昆、博菜 黴素、氮芥（mechlorethamine)、強的松（prednisone)、丙卡巴 肼（procarbazine)、胺甲碟呤、氟尿嘧啶（flurouracils)、依托泊 苷（etoposide)、紫杉醇（taxol)、紫杉醇類似物和絲裂黴素》 在較佳的具體實施例中，將具有治療效力之胞毒藥物-抗 -CD22-抗體共軛物的組合物，連同作為治療攝生法之一部 分的胞毒製劑之一或多種組合一起投予，其中該胞毒製劑 的組合係選自：CHOPP (環磷醯胺、阿J數素、長春新鹼、強的 松和丙卡巴肼）；CHOP (環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強 的松）；COP (環磷醯胺、長春新鹼和強的松）；CAP-BOP (環 85073.doc •25-
、長春新驗、地塞米松和甲醯四氫葉酸）；proMACE_MOPP 環磷醯胺、依托泊：y：、甲醯 、強的松和丙卡巴肼）； (強的松、胺甲碟吟、阿黴素、環 四氫葉酸、氮芥、長春新鹼、 pr〇MACE-cytaBOM (強的松、胺曱碟呤、阿黴素、環磷醯 胺、依托泊钻、甲醯四氫葉酸、阿糖胞苷、博菜黴素和長 春新鹼）；MACOP-B (胺曱碟呤、阿黴素、環磷醯胺、長春 新驗、強的松、博菜黴素和甲醯四氫葉酸）；MOM (氮芥、 長春新鹼、強的松和丙卡巴胼）；A B V D (亞德里亞黴素/阿黴 素、博菜黴素、長春花驗和甲嗔咪峻胺）；以ABV (亞德里亞 黴素/阿黴素、博菜黴素和長春花驗）加以改變的M〇pp (氮芥 、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼）；以ABVD (亞德里亞黴素 /阿黴素、博菜黴素、長春花驗和甲嗪咪吐胺）加以改變的 MOPP (氮介、長春新驗、強的松和丙卡巴耕）；chivpp (苯 丁酸氮芥、長春花鹼、丙卡巴肼和強的松）；IMVP-16 (異環 磷醯胺（ifosfamide)、胺甲碟呤和依托泊：y：); MIME(丙酮雙 咪腺（Methyl-gag)、異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷）； DHAP (地塞米松、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨鉑）；esjjap (依托泊苷、曱基脫氫皮留醇、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨 舶）；CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊钻、丙卡巴胼、強的松和博菜 黴素）’ CAMP (洛莫司；丁（i〇niustine)、米托S昆慈、阿糖胞嘗 和強的松）；以及CVP-1 (環磷醯胺、長春新鹼和強的松）。 在較佳的具體實施例中，在投予胞毒藥物的一或多種上 85073.doc -26· 1379693 述組合之前，投予具有治療效力之胞毒藥物_抗_CD22-抗體 共軛物的組合物》在另一個較佳的具體實施例中，在投予 作為治療攝生法之一部分的胞毒藥物之一或多種上述組合 之後’投予具有治療效力之胞毒藥物·抗_CD22-抗體共軛物 的組合物。 本發明的另一項觀點’係針對治療侵略性淋巴瘤的方法 包括對4要该治療之患者’與一或多個生物活性劑一起 ’投予在治療上有效之單體卡奇黴素衍生物_抗_CD22_抗體 共桃物的組合物。 本發明的另一項觀點，係針對本發明之組合物在治療患 有增殖性病症，像是癌症之個體上的用途。特定而言，該 癌症為在細胞表面上表現CD22抗原的B_細胞亞性腫瘤。特 足而言，該B-細胞亞性腫瘤為白血病或淋巴瘤。在一個具 體實施例中，該癌症為癌或白血病。 在-個具體實施例中，以皮下、腹腔内、靜脈内、動脈 内、髓内、鞘内、經皮、經皮下、鼻内、局部、經腸、陰 道内、舌下或經直腸之方式，投予在治療上有效劑量的組 合物。 在較佳的具體實施例中，以靜脈内之方式投予在治療上 有效之劑量的本發明之醫藥組合物。 本發明的另—項觀點，係針對本發明之單體卡奇黴素衍 生物/抗-CD22·抗體共輛物，在治療羅患Μ胞亞性腫瘤， 像是非-霍奇金氏淋巴瘤之個體上的用途。在—個具體實施 U中將本發明之單體卡奇子數素衍生物/抗_CD22-抗體共輛 85073.doc -21 ^ 1379693 物與一或多個生物活性劑一起投予β 在一個具體實施例中，該生物活性劑係選自由抗體、生 長因子、荷爾蒙、細胞激動素、抗_荷爾蒙、黃嘌呤素、介 白素、干.擾素和胞毒藥物所組成之群。 在較佳的具體實施例中，該生物活性劑為對抗在Β_細胞 亞性腫瘤上表現之細胞表面抗原的抗體，像是抗19、抗 -CD20和抗_CD33抗體。在較佳的具體實施例中，該抗_cd2〇 抗體是利妥昔單抗（美羅華TM)。 在另一個具體實施例中，該生物活性劑包括細胞激動素 或生長因子，像是介白素2 (IL_2)、TNF、CSF、gmcsf和 g-csf或荷爾蒙，其包括雌激素、雄激素、孕甾酮和皮質類 固醇。 在另一個具體實施例中，該生物活性劑為胞毒藥物，選 自阿黴素、道諾紅菌素、伊達比星、阿克拉黴素、佐柔比 星、米托E醌、表柔比星、洋紅黴素〗、諾加拉黴素、美諾 立爾、匹塔路比星、瓦路比星、阿糖料、吉西他濱、曲 敦尿誓、環m語他濱、阿扎胞#、去氧氟尿菩、喷 司他丁、脫氧溪尿I、截瘤達、克拉君賓、地西他濱、氣 尿嘗、氟達拉濱、谷氏菌素、嗓羅黴素、替加氟”塞吐味 啦、亞德里亞黴素、順氯氨始、卡銘、環鱗醯胺、甲嗪咪 唾月文、長春花㉟、長春新驗、米托㈣、博菜黴素、氮芬 、強的松、丙卡巴月井、胺曱碟呤、氟尿μ、依托泊/、 紫杉醇、紫杉醇類似物和絲裂黴素。 在車乂佳的具植實施例中’將在治療上有效劑量的單體卡 85073.doc • 28- 1379693 奇黴素衍生物/抗_CD22_抗體共軛物，與作為治療攝生法的 部分之胞毒製劑的一或多種组合一起投予，其中該胞毒 製劑的组合係選自：CH0PP (環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼 、強的松和丙卡巴胼）’· CHOP (環磷醯胺、阿黴素、長春新 鹼和強的松C0P (環磷醯胺、長春新鹼和強的松）； CAP-B〇p (環磷醯胺、阿黴素、丙卡巴胼、博菜黴素、長春 新鹼和強的松）；m_BAC0D (胺甲碟呤、博菜黴素、阿黴素 、環磷醯胺、長春新鹼、地塞米松和甲醯四氫葉酸）； Pr〇MACE-MOPP(強的松、胺甲碟呤、阿黴素 '環磷醯胺、 依托泊苷、甲醯四氫葉酸、氮芥、長春新鹼、強的松和丙 卡巴胼）；Pr〇MACE-CytaB〇M(強的松、胺甲碟呤、阿黴素 、裱磷醯胺、依托泊苷、甲醯四氫葉酸、阿糖胞苷、博菜 黴素和長春新鹼）；MACOP-B (胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯 胺、長春新鹼、強的松、博菜黴素和曱醯四氫葉酸）；M〇pp (氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼）；ABVD (亞德里亞 黴素/阿黴素 '博菜黴素、長春花驗和曱嗪咪峡胺）；以Abv (亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素和長春花鹼）加以改變的 MOPP (氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴胼）；以abvd (亞 德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花鹼和甲嗪咪唑胺） 加以改變的MOPP (氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼） ;ChiVPP (苯丁酸氮芥、長春花鹼、丙卡巴肼和強的松）； IMVP-16 (異環磷醯胺、胺曱碟呤和依托泊苷）；MIME (丙 酮雙咪腙、異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷）；DHAp (地塞米松、高劑量的阿糖胞：y：和順氯氨鉑）；EShap (依托 85073.doc •29· 1379693 泊菩、甲基脫氫皮绍醇、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨鉑）； CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊站、丙卡巴胼、強的松和博菜 黴素）；CAMP (洛莫司汀、米托醌蒽、阿糖胞甞和強的松） ’ CVP-1 (環麟臨胺、長春新驗和強的松）；ESHOP (依托泊 苷、甲基脫氫皮留醇、高劑量的阿糖胞:y：、長春新鹼和順 氯氨銘）；EPOCH (依托泊：y：、長春新鹼和阿黴素96小時， 加環磷醯胺之團塊劑量，並口服強的松）；ICE(異環磷醯胺 、環磷醯胺和依托泊苷）；CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊苷、 丙卡巴肼、強的松和博菜黴素）；CH0P_B (環磷醯胺、阿黴 素、長春新鹼、強的松和博菜黴素）；CEPP_B (環磷醯胺、 依托泊苷、丙卡巴肼和博菜黴素）以及P/D0CE(表柔比星或 阿黴素、長春新鹼、環磷醯胺和強的松）。 在一個較佳的具體實施例中，在投予作為治療攝生法之 一部分的胞毒製劑之一或多種組合之前，先投予單體卡奇 黴素衍生物/抗-CD22抗體共軛物。 、在另-個較佳的具體實施例中，在Μ作為、冶療攝生法 之一部分的胞毒製劑之—或多種組合之後，投予在治療上 有效之劑量的單體+奇黴素衍生物/抗-CD22抗體共輛物。 在另一個較佳的具體實施例中，4同對&amp;在&amp;細胞亞性 腫瘤^之細抱表面抗原的抗體一起投予在治療上有效之劑 勺單阮卡奇黴素衍生物/抗_CD22抗體共輕物，並可视需要 匕括作為/ u療攝生法之—部分的胞毒製劑之—或多種组合。 在另一項觀點中，本發明係針對本發明之單體卡奇黴素 何生物/抗-CD22抗體共輞物，在製造可用來治療增殖性病 85073.doc •30· 1379693 症之醫藥品上的用途。可單獨使用這類醫藥品或與其他生 物活性劑併用，來治療B-細胞增殖性病症。 【實施方式】 本發明之共輛物包括利用交聯劑衍生的胞毒藥物，其包 含任何與蛋白質載體反應的反應性基團，形成胞毒藥物衍 生物-蛋白質載體共軛物。更明確地說，本發明之共軛物包 括利用叉聯劑衍生之胞毒藥物，其包含任何與用來作為蛋 白質載體之抗體反應的反應性基團，形成胞毒藥物衍生物_ 抗體共軛物。更明確地說，該抗體係針對在B_細胞亞性腫 瘤上的細胞表面抗原反應。下文描述製造和純化這類共軛 物的一種經過改良的方法。使用特殊的共溶劑、添加劑和 特定的反應條件，連同分離方法一起，結果將形成單體胞 毒藥物衍生物/抗體共軛物，並明顯地降低了 LCJ^單體的 形式與聚集的形式相反，具有重大的治療價值，並使lcf 減至最少，且實質上降低了聚集作用，結果藉著阻礙LCf 與較高的共軛部分（HCF)競爭，以在治療上有意義之方式， 利用抗體起始物質。 I.載體 本發明之载體/瞄準劑最好是蛋白質的載體/瞄準劑。載體 /瞒準劑包括荷爾蒙、生長因子、抗體、抗體片段、抗體模 仿物及其以遺傳方式或以酵素方式設計的配對物，在後文 中Θ單數或以“載體”群稱呼之。載體之必要特性，是其認 出並結合與不想要細胞有關連之抗原或受體，接著被内化 的此力。在美國專利第5,〇53,394號中揭示了可應用於本發 85073.doc •31 · 1379693 明中之載體的實例’將其全文以引用的方式併入本文中。 可在本發明中使用的較佳載體，是抗體和抗體模仿物。 已經使用許多非-免疫球蛋白之蛋白質鷹架，來產製抗體 模仿物，其與抗原之抗原決定位結合，具有抗體之專一性 (PCT公開案第WO 00/34784號)。例如，“微型抗體（minibody)” 鷹架，其與免疫球蛋白折疊有關’已經藉著從單株抗體之 重鏈可變功能部位中删除三個β股來設計之（Tramontane)等 人，J. Mol. Recognit. 7:9, 1994) »該蛋白質包含61個殘基， 並可用來提供兩個高變環。已經將這兩個環隨機化，並針 I 對抗原結合來選擇產物，但因此遠離該架構，而多少限制 了利用性，歸因於溶解性的問題。其他用來展示環的架構 是坦德米塔（tendamistat)，一種專一地抑制哺乳動物α-澱粉 酶的蛋白質，並為74個殘基，藉著兩個二硫鍵使其結合在 一起的六股 β-片三明治（McConnell和 Hoess，J. Mol. Biol. 250:460，1995)。該鷹架包括三個環，但迄今為止，僅已經 針對其中的兩個進行無規則分布之可能的檢查。 | 已經測試其他作為架構的蛋白質，並已經用來展示在α 螺旋表面上的隨機化殘基（Nord等人，Nat. Biotechnol. · 15:772, 1997; Nord等人，Protein Eng. 8:601，1995)，在 α螺旋 束中在 α螺旋之間的環（Κλι和 Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552, 1995)，以及由二硫橋約束的環，像是那些小 的蛋白酶抑制劑（Markland 等人，Biochemistry 35:8045，. 1996; Markland等人，Biochemistry 35:8058，1996; Rottgen和 Collins, Gene 164:243，1995; Wang 等人，J. Biol. Chem. 85073.doc -32- 1379693 270:12250, 1995)。 可在本發明中使用之抗體載體的實例，包括單株抗體、 嵌合型抗體、人類化抗體、人類抗體及其具有生物活性的 片段。這類抗體最好是在諸如癌症之類的增殖性病症中， 對抗在標靶細胞及/或組織上表現的細胞表面抗原。對抗在 標靶細胞上之細胞表面抗原的特異抗體之實例，包括但不 限於對抗CD22抗原之抗體，其在大多數B-細胞淋巴瘤上過 度表現；G5/44，一種老鼠抗-CD22單株抗體的人類化形式 ;對抗細胞表面抗原CD33的抗體，其普遍出現在某些人類 髓樣腫瘤上，尤其是急性髓樣白血病；hP67.6, 一種抗-CD33 老鼠抗體的人類化形式（參見美國專利第5,773,001號）；對抗 在許多表皮起源之腫瘤上發現，命名為mP67.6之PEM抗原 的抗體（參見 I. D. Bernstein等人，J. Clin. Invest. 79:1153 (1987)和 I.D_ Bernstein 等人，J. Immunol. 128:867- 881 (1992));以及對抗在許多固體腫瘤上過度表現，命名為 hu3S 193之路易斯Y碳水化合物抗原的人類化抗體（參見美 國專利第6,310,185B1號）。此外，有數個市售的抗體，像是 利妥昔單抗（美羅華TM)和搓杜滋美（trastuzumab)(賀癌平 (Herceptin)TM)，其亦可用來作為載體/瞄準劑。利妥昔單抗 (美羅華™)是嵌合型抗-CD20抗體，用來治療各種B-細胞淋 巴瘤，而搓杜滋美（賀癌平1^)是人類化的抗-Her2抗體，用 來治療乳癌。 在本文中，以針對細胞表面抗體CD22之CDR-移植的人類 化抗體分子，命名為G5/44，作為在本發明中用來作為載體 85073.doc -33- 1379693 的例證。該抗體是老鼠抗-CD22單株抗體的人類化形式，其 係針對在某些人類淋巴瘤上普遍出現的細胞表面抗原 CD22。當在本文中使用“CDR-移植之抗體分子”一詞時，意 指其中包括含有一或多個互補性決定區（CDRs)之重及/或 輕鏈的抗體分子，若需要可將來自捐贈者抗體（例如老鼠單 株抗體）之經過修改的CDR (在後文中為CDR)，移植到接受 者抗體（例如人類抗體）的重及/或輕鏈可變區架構内《這類 CDR-移植的抗體，最好具有包括人類接受者架構區的可變 功能部位，以及一或多個上文提及之捐贈者CDRs。 在移植CDRs時，可使用與從其中衍生該CDRs之捐贈者抗 體的種類/類型有關之任何適當的接受者可變區架構序列 ，包括老鼠、靈長類和人類架構區。可在本發明中使用之 人類架構的實例，為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI 、LAY和 POM (Kabat 等人，Seq. of Proteins of Immunol. Interest，1:310-334 (1994))。例如，KOL 和 NEWM 可供重鏈 使用，REI可供輕鏈使用，而EU、LAY和POM可供重鏈和輕 鏈兩者使用。 在本發明之CDR-移植的抗體中，最好是使用具有與捐贈 者抗體之鏈同種的鏈者，作為接受者抗體。接受者重和輕 鏈不一定要是衍生自相同抗體的，且若需要可包括具有衍 生自不同鏈之架構區的综合鏈。 再者，在本發明之CDR-移植的抗體中，架構區不必具有 與接受者抗體的那些精確相同的序列。例如，可將不常見 的殘基改為在接受者鏈的種類或類型中，較常出現的殘基 85073.doc -34- 1379693 。或者，可改變在接受者架構區中選出的殘基，使得其與 在捐贈者抗體中之相同位置處發現的殘基一致。應將這類 改變維持在最低需要，以便恢復捐贈者抗體的親和力。可 能必需改變在PCT公開案第W0 91/09967號中陳述之在接受 者架構區中選擇殘基的草案，將其全文以引用的方式併入 本文中。 捐贈者殘基是得自捐贈者抗體的殘基，即最初從其中衍 生CDRs的抗體。 本發明之抗體可包括重鏈，其中可變功能部位包括稱為 H2,的CDR-H2 (按照Kabat等人（在前）之定義），其中已經移 除可能的糖基化作用位置序列，以便增加該抗體對抗原的 親和力。 或者或另外，本發明之抗體可包括重鏈，其中可變功能 部位包括稱為H2”的CDR-H2 (按照Kabat等人（在前）之定義） ，其中離胺酸殘基是在位置60處。以另一個可選的胺基酸 置換位在CDR-H2中之暴露位置處的離胺酸殘基，並認為該 離胺酸殘基具有與共軛劑反應的潛力，結果降低了抗原結 合親和力。 另外，本發明之抗體可包括重鏈，其中可變功能部位包 括稱為H2”’的CDR-H2 (按照Kabat等人（在前）之定義），其中 利用另一個可選的胺基酸置換可能的糖基化作用位置序列 和在位置60處的離胺酸殘基。 本發明之抗體可包括：具有全長重和輕鏈的完整抗體； 其具有生物活性之片段，像是Fab、經過修改的Fab、Fab’ 85073.doc -35- 1379693 、F(ab’；h或Fv片段；輕鏈或重鏈單體或二聚體；或單鏈抗 體’例如單鏈Fv，其中藉著肽交聯劑連接重和輕鏈可變功 能部位》同樣地，可適當地將重和輕鏈可變區與其他抗體 功能部位混合。 本發明之抗體亦可包含經過修改的Fab片段，其中該修改 是添加一或多個胺基酸，而容許將效應物或受體分子附接 在其重鏈的C-終端。該額外的胺基酸，最好是形成含有一 或兩個半胱胺酸殘基的經過修改之絞鏈區，可將效應物或 受體分子附接在其上。 本發明之抗體的恆定區功能部位，若出現，則可就所提 出之抗體功能而加以選擇，且特別是可能需要或可能不需 要的效應物功能。例如，恆定區功能部位可能是人類IgA、 IgD、IgE、IgG或IgM功能部位。特定而言，當打算將抗體 用於治療用途上’並需要抗體效應物功能時，可使用人類 IgG恆定區功能部位，尤其是igG 1和igG3同型物。或者，當 打算將抗體用於治療目的，但不需要或希望效應物功能時 ，可使用IgG2和IgG4同型物，或可使][g(}1 Fc區突變，廢除 效應物功能。 本發明之抗體具有至少5χΐ〇_8 μ，最好是至少ΐχΐ〇-9 μ， 更佳的是至少0.75x10 10 Μ，而最佳的是至少〇 5χ1〇-ι〇厘的 結合親和力。 在一個具體實施例中，本發明係關於免疫毒素共軛物， 以及使用抗體變種或抗體模仿物製造這些共軛物的方法。 在較佳的具體貫施例中，本發明之抗體的變種，係針對 85073.doc •36· 1379693 -N(CH2CH2)2N-或-X-Ar，-Y-(CH2)n-Z，其中χ' Y和 z 分別為 一鍵結、-NR·-、_S-或-0_，其限制條件為當n=〇時，γ和Z 中至少有一個必需是一鍵結’且Ar1為1，2-、1,3-或1，4-伸落 基，可視需要以1、2或3個（C!-C5)烷基、烷氧基、 (C1-C4)硫坑氧基、鹵素、硝基、.-C〇〇R_,、、 (CH2)nC00R, 、 -S(CH2)nCOOR' 、 _0(CH2)nC0NHR'或 -S(CH2)nCONHR.之基團取代’其限制條件為當Aik1為一鍵 結時，Sp1為一键結； η為從0至5之整數； • R'為分支或未分支之（C1-C5)鏈，可視需要以1或2個-0Η、 (CVC^)^氧基、（Ci-C4)硫烷氧基、鹵素、硝基、（(^-0：3)二 燒胺基或（Ci-C3)三健基铵-A之基團取代，其中a-為在藥學 上可接受之陰離子，而完成鹽；
Ar為1，2-、1，3-或1，4_伸苯基，可視需要以卜2或3個（C丨-C6) 烷基、（CVQ)烷氧基、（CVQ)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR1 、-CONHR’、-0(CH2)nC00R'、-S(CH2)nCOOR'、-〇(CH2)nCONHR' 或-S(CH2)nCONHR'之基團取代，其中n和R’如同前文之定義 ，或 1，2_、1，3_、1，4-、1，5_、1，6_、1，7-、1，8_、2,3-、2,6_ 或2,7-伸莕基，或
每個伸黎基或啡噻畊，可視需要以1、2、 基、（CVC5)烷氧基、（CVC4)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR1 85073.doc •39· 、-CONHR，、-0(CH2)nC00R，、-S(CH2)nCOOR'或-S(CH2)nCONHR' 之基團取代，其中n和R’如同上文之定義，其限制條件為Ar 為啡嶁畊時，Sp1為一鍵結，僅與氮連接；
Sp2為一鍵結、-S-或-0-，其限制條件為當Aik2為一鍵結 時，Sp2為一鍵結； Z1為H、（C!-C5)烷基或苯基，可視需要以1、2或3個（Ci-Cs) 坑基、（C1-C5)燒氧基、（Ci-C4)硫炫氧基、鹵素、硝基、-C00R· 、-ONHR’、-0(CH2)nC00R，、-S(CH2)nC00R，、-0(CH2)nC0NHR· 或-S(CH2)nC0NHR·之基團取代，其中η和R，如同上文之定義； Sp為直線或支鏈的二價或三價（Ci-Cu)基團、二價或三價 芳基或雜芳基基團、二價或三價（C3-C18)環烷基或雜環烷基 基團、二價或三價芳基-或雜芳基-芳基（(^-(：18)基團、二價 或三價環烷基-或雜環烷基-烷基（Cl_Cl8)基團或二價或三價 (C2_C18)不飽和的烷基基團，其中該雜芳基最好是呋喃基、 嘧吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、，号唑基 、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、N-甲基肼甲醯基、胺基薰 草基或啡畊基’且其中若Sp為三價之基團，則Sp可額外地 被低碳數（Ci-Cs)二烷胺基、低碳數（Ci-Cs)烷氧基、羥基或 低碳數（C丨-C5)烷硫基基團取代；且 Q為=NHNC0-、=NHNCS-、=NHNC0NH-、=NHNCSNH-或=NH0-。 較佳的是’ Aik1是分支或未分支之（Cl_ClG)伸烷基鏈；Sp， 是一鍵結、-S-、-0-、-C0NH-、-NHC0-或-NR，，其中 R，如 同前文之定義’其限制條件為當Alki為一鍵結時，Sp1為一 85073.doc •40- 1379693 键結，
Ar為1，2-、1，3-或1,4-伸苯基，可視需要以1、2或3個（&lt;：丨-(：6) 烷基、（CVCs)烷氧基、（CrC4)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR' 、-CONHR'、-0(CH2)nC00R，、-S(CH2)nCOOR'，-0(CH2)nC0NHR， 或-S(CH2)nCONHR’之基團取代，其中n和R’如同前文之定義 ’或 Ar為 1，2-、1，3·、1，4-、1，5-、1，6-、1，7-、1，8-、2,3-、 2,6-或2,7-伸莕基，可分別視需要以1、2、3或4個（C丨-C6)烷 基、（C^-Cs)烷氧基、（C^CJ硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR· 、-CONHR'、-0(CH2)nC00R，、-S(CH2)nCOOR，、-0(CH2)nCONHR， 或-S(CH2)nCONHR’之基團取代。 Z1為（CVCO烷基或苯基，可視需要以1、2或3個（C丨-C5) 烷基、（CVC4)烷氧基、（CVCU)硫烷氧基、鹵素、硝基、-COOR· 、-CONHR，、-0(CH2)nC00R'、-S(CH2)nCOOR，、-0(CH2)nC0NHR' 或-S(CH2)nCONHR'之基團取代；Aik2和Sp2—起為一鍵結且 Sp和Q如同僅接上文之定義。 美國專利第5,773,001號，將其全文以引用的方式併入本 文中，揭示可與親核衍生物一起使用的交聯劑，特別是從 卡奇黴素中製備之醯胼和相關的親核物質。這些交聯劑在 其中獲得較佳之活性的那些案例中，是特別有用的，此時 在藥物與交聯劑之間形成的鍵結為可水解的。這些交聯劑 含有兩個官能基團。一個基團通常是羧酸，用來與載體反 應。酸性的官能基團，當適度地激活時，可與載體之自由 胺基形成醯胺鍵結，像是，例如在抗體或其他蛋白質載體 的離胺酸之側鏈中的胺。其他的官能基通常是羰基基團， 85073.doc -41 · 1379693 即越或_ ’其將與經適當修改之治療劑反應。羰基基團可 與在藥物上的醯胼基團反應，形成腙鍵結。該鍵結是可水 解的谷5午在與標乾細胞結合之後，從共輛物中釋放出治 療劑。 可供本發明使用之最佳雙重功能的交聯劑是4-(4-乙醯基 表氧基）丁敗（AcBut) ’結果產生較佳的產物，其中藉著與3_ 鲦基-3-甲基丁醯肼、八⑶扒交聯劑和人類或人類化Ig(}抗體 瞄準載體反應，將由β·卡奇黴素、γ_卡奇黴素或N_乙醯基γ_ 卡奇黴素組成的共輛物官能化。 IV.單體共軛物 許多胞毒藥物’包括卡奇黴素的天然厭水性質，使得在 製備具有對於治療應用而言必要之良好藥物裝載和合理產 量的單m藥物共輛物時出現困難。在美國專利第5,773,〇〇ι 號中，揭示了藉著諸如AcBut之類的交聯劑，更增加了鍵結 的厭水性，且隔開治療劑與載體（抗體）之共價距離的增加， 亦加劇了該問題。 發生具有較兩藥物裝載之胞毒藥物衍生物/載體共軛物 的聚集，係歸因於藥物的厭水性質。經常必須限制藥物的 裝載，以便獲得合理產量的單體產物，。在某些情況下，像 是在美國專利第5,877,296號中的共軛物，通常不易使用在 美國專利第5,053,394號中揭示的反應條件’以有用的產量 ，製造可供治療應用之有效裝載的共軛物，係歸因於過度 的聚集。這些反應條件，在共軛反應中利用DMF作為共-溶 劑。因此需要容許較高的藥物裝載/產量，但無聚集和喪失 85073.doc -42- 材料本質的方法β 在美國專利第5,712,374號和5,714,586號中描述了降低聚 集的改良，將其全文以引用的方式併入本文中。在那些專 利中’揭示了蛋白質載體’包括但不限於用來瞄準胞毒治 療劑的蛋白質，像是人類或人類化的抗體，像是例如hp67 6 以及其他在本文中揭示的人類化抗體。在那些專利中，發 現含有⑴作為共溶劑之丙二醇和（ii)包括至少一個c6_Ci8叛 酸之添加劑的非-親核性、蛋白質_可相容之緩衝溶液的使用 通$產生具有較向藥物裝載/產量並降低聚集的單體胞毒 藥物衍生物/載體共軛物，具有優異的活性。在本文中描述 的較佳酸類，是（：7至(：：12的酸類，而最佳的酸是辛酸（像是辛 酸）或其鹽類。對於用N-羥基琥珀醯亞胺（〇Su)酯或其他可 相比擬之活性酯製成的共軛物而言，較佳的緩衝溶液是磷 酸-緩衝之生理鹽水（PBS)或N_2_羥乙基六氫吡畊_N，_2•乙烷 磺酸（HEPES緩衝溶液在那些共軛反應中使用的緩衝溶液 不可含有自由胺或親核物質。至於其他類型的共軛物， 可迅速地判定可接受的緩衝溶液。或者，亦發現含有正-丁 醇但無額外添加劑的非·親核性、蛋白f 可相容之緩衝溶液 的使用’產生具有較西藥物裝載/產量並降低聚集的單體卡 奇黴素衍生物/載體共軛物。 形成單體共軛物所需之共溶劑的用量，多少隨著蛋白吳 而有所改變，並可由熟#此藝者判定，不需過度的實驗。 有效形成單體共_物所需之添加劑的用量，亦將隨著抗谱 而有所不同。亦可由熟諳此藝者判定該用量，不需過度¥ 85073.doc 1379693 實驗。在美國專利第5,712,374號和5,714,586號中，丙二醇 的添加量，按總溶液之體積計，範圍是從10%至60%，較佳 的是10%至40%，而最佳的是大約30%，並將範圍從20 mM 至100 mM，較佳的是從40 mM至90 mM，而最佳的是大約 60 mM至90 mM之包括至少一個C6-C18羧酸或其鹽，最好是 辛酸或其鹽的添加劑，加至共輛反應中，產生具有較高藥 物裝載/產量並降低聚集的單體胞毒藥物衍生物/載體共軛 物。亦可使用丙二醇以外的其他蛋白質-可相容之有機共溶 劑，像是乙二醇、乙醇、DMF、DMSO等等。使用一些或全 部的有機共溶劑，將藥物運送至共軛混合物内。 或者，在那些具體實施例中，可將(：6-(：18羧酸或其鹽的濃 度增加至150-300 mM，並將共溶劑降低至1-10%。在一個具 體實施例中，該羧酸是辛酸或其鹽。在較佳的具體實施例 中，該羧酸是癸酸或其鹽。在另一個較佳的具體實施例中 ，該羧酸是辛酸或其鹽，其以200 mM辛酸之濃度，連同5% 丙二醇或乙醇一起存在。 在那些專利中之其他交替的具體實施例中，可將按總溶 液之體積計，濃度範圍從10%至25%，較佳的是15%之第三-丁醇，加至共軛反應中，產生具有較高藥物裝載/產量並降 低聚集的單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物。 將這些已確立之共軛條件應用在CMA-676 (Gemtuzumab Ozogamicin)的形成上，其目前以市販售。自 從為了急性髓樣白血病（AML)而導入該治療，已經經由離 子-交換層析法的應用，學習到卡奇黴素並非以均一之方式 85073.doc -44- 1379693 分布在抗體上。大多數的卡奇黴素是在大約一半的抗體上 ，而另一半以LCF之形式存在，僅含有少量的卡奇黴素。結 果，對於改良使胞毒藥物，像是卡奇黴素與載體的方法， 有重大的需求，其將聚集的量減至最少，並容許較高的均 等藥物裝載，以及明顯改善之共軛產物的產量。 特定的實例為G5/44-NAc-y-卡奇黴素DMH AcBut共軛物 ，將其稱為CMC-544，並在圖17中以一般的方式展示。為 了 CMC-544的發展，希望將LCF的量降低至總抗體的&lt;10% ，並考量各種降低LCF含量的意見。免疫共軛物的其他屬 性，像是抗原結合和胞毒性，必須不受最終溶液的影響。 考量的意見包括抗體的遺傳或物理修改、層析分離技術或 反應條件的修改。 使用舊反應條件（CMA-676處理條件）之G5/44抗體與 NAc-γ-卡奇黴素DMH AcBut OSu的反應，結果產生與 CMA-676類似的物理特性（藥物裝載、LCF和聚集）。然而， 認為在共軛作用之後出現的高程度LCF (50-60%)是不想要 的。經由統計實驗設計方法學，其中評估關鍵性的反應可 變數，像是溫度、pH值、卡奇黴素衍生物輸入和添加劑濃 度，來判定最佳的反應條件。這些實驗的分析，證實卡奇 黴素輸入和添加劑濃度，對低共軛分數LCF和凝集形成的程 度，具有最顯著的影響，而溫度和pH值則發揮較少的影響 。在額外的實驗中，亦顯示蛋白質載體（抗體）之濃度和共溶 劑（乙醇），在控制LCF和聚集程度上，同樣是較不重要的（與 卡奇黴素輸入和添加劑濃度相比較）。為了將LCF降低至 85073.doc -45- 1379693 &lt; 1 〇%，將卡奇黴素衍生物的輸入，相對於在反應中的抗體 含量’從3%增加至8.5%(重量/重量）。將添加劑從2〇〇 濃度的辛酸或其鹽（CMA-676處理），變更為37.5 mM之濃度 的癸酸或其鹽。在稍微升高的溫度（30-35。(：）和pH值 (8.2-8.7)下，進行共輛反應。併入這些改變的反應條件，降 低LCF至10%以下，同時增加了卡奇黴素裝载，並在後文中 稱為CMC-544處理條件或“新”處理條件。在表1中出示以 CMA-676和CMC-544處理條件所獲得之結果的比較。 表1 : CMA-676和CMC-544處理條件的比較 條件/結果 CMA-676處理條件 CMC-544處理條侔 卡奇黴素輸入 添加劑身份和 濃度溫度 3.0%(重量/重量，按 散劑重量計） 辛酸/辛酸鈉；200 mM 26〇C 8.5%(重量/重量） 癸酸/癸酸鈉；37.5 mM 31-35〇C pH值 7.8 8.2-8.7 卡奇黴素裝載 2.4-3.5 7.0-9.0 (重量％ ;藉1^測定） 低共輛部分(LCF) 45-65 HPLC面積。/〇 &lt;10% (在純化之前） 聚集(在純化之前） 〜5 % &lt;5% 聚集(在純化之後） &lt;2% &lt;2% 在卡奇黴素輸入上的增加，使藥物裝載從2.5-3.0重量％ 增加至7.0-9.0(最典型的是7.5-8.5)重量％，且在反應中沒有 蛋白質聚集的增加。因為降低聚集體和LCF，CMC-544處理 85073.doc •46- 1379693 條件結果產生較均質的產物。已經藉著該新共軛程序，以 多-克抗體規模，可再現地製備CMC-544 » 在前述的反應中，抗體濃度的範園可從1至15毫克/毫升 ’而卡奇黴素衍生物，例如N-乙醯基γ-卡奇黴素DMH AcBut OSu酯（用來製造在圖17中出示之共軛物）的濃度，按抗體之 重里計’範園是在大約4.5 -11 %。共溶劑為乙醇，已經在範 圍從6至11.4%的濃度（按體積計）下，證實了該良好結果。在 PBS、HEPES、N-(2_經乙基）六氫吡畊_N，_(4_ 丁烷磺酸） (HEPES)或其他可相容之緩衝溶液中，以8至9之阳值，在範 圍從30 C至大約3 5 C的溫度下，進行反應15分鐘至24小時 。热碏此藝者可輕易地判定其他類型共軛物之可接受的ρΗ 值範圍。對各種抗體而言，已經發現在前文提及之添加劑 的組合中，使用微少的改變，改善了藥物裝載和單體共軛 物產量，並了解任何特定的蛋白質載體，可能在精確的條 件中需要一些較少的改變，或需要選擇添加劑，以便達到 最佳的結果。 V.共軛物純化和分離 在共軛作用之後’可藉著傳統的方法，例如尺寸排阻層 析法（SEC)、厭水性交互作用層析法（hic)、離子交換層析 法（IEC)或層析聚焦（CF)，從未共輕的反應劑（像是蛋白質載 體和自由的胞毒藥物/卡奇㈣）中分離單體共㈣及/或丑 軛物的聚集形式。經過純化的共辆物是單體的，且通常本 有：4至1〇重量%的胞毒藥物/卡奇黴素。在較佳的具體實施 例，使用厭水性交互作用層析法（hic)純化共輛物。在先 85073.doc -47. 1379693 前用來以生產-規模製造胞毒藥物/卡奇黴素-抗體共軛物的 方法（CMA-676法）中，唯一使用的共軛後分離步驟，是尺寸 排阻層析法（SEC)。雖然該步驟在為了調配而移除聚集之共 輛物和完成緩衝劑交換兩者中是相當有效的，但它在降低 LCF内含量上是無效的。結果以SEC-為基礎之方法，完全依 賴共軛反應之化學來控制終產物的LCF内含量。SEC的其他 缺點是限制施用於管柱中之共軛物反應混合物的體積（通 常不超過處理管柱之床體積的5%)。這嚴格地限制了可在特 定產製空間中容納的每批尺寸（並因此限制了產製容量）。最 後，SEC純化法結果亦導致共軛物溶液的明顯稀釋，其使在 調配時以可信賴之方式達到的蛋白質濃度受到束縛。 當胞毒藥物具有高厭水性質，像是卡奇黴素衍生物，並 在共軛物中使用時，厭水性交互作用層析法（HIC)是提供已 共軛和未共軛抗體之有效分離的較佳候選者。HIC提供三個 勝過SEC的關鍵性優點：（1)其具有有效降低LCF内含量的和 聚集體能力，（2) HIC之管柱裝載容量高很多且（3) HIC避免 了產物的過度稀釋。 許多高容量的HIC介質適合產製規模應用，像是丁基、苯 基和辛基瓊脂糖 4速流（Amersham Biosciences，Piscataway, NJ)，可在共軛過程之後，有效地從單體共軛組份中分離共 輛物的未共耗組份和聚集體。 VI.組合物和調配物 本發明亦提供製備治療或診斷用之組合物/調配物的方 法，包括將本發明之單體胞毒藥物衍生物/載體共軛物與在 85073.doc -48- 1379693 藥，上可接受之_劑、稀釋劑和載劑混合在一起。 早體胞毒藥物衍生物，載體共軛物可以 =；：合調配物中的唯—活性成分，或可伴隨有ί他: 二乃匕括其他的抗體成分，例如抗-CD19、抗_CD2〇、 t : m田胞、抗掘以抗·LPS抗體，或非·抗體成 ^是細胞激動素、生長因子、荷爾蒙、抗·荷爾蒙、胞 毒藥物和黃嗓呤素。 可用來治療增殖性病症’像是癌症，並可與本發明之胞 毒藥物衍生物/載體共軛物一起使用的細胞激動素和生長 因子，包括干擾素、介白素，像是介白素2 (IL.2)、TOF、 CSF、GM-CSF和 G-CSF。 經常用來治療增殖性病症，像是癌症，並可與本發明之 胞毒藥物衍生物/載體共軛物一起使用的荷爾蒙，包括雌激 素，像是己晞雌酚和雌二醇，雄激素，像是睪酮和_睪素 (Halotestin)，孕错酮，像是美可治（Megace)和普羅弗 (Provera)，以及皮質類固醇，像是強的松、地塞米松和氫 基可體松。 抗荷爾蒙’像是抗雌激素，即他莫昔芬，抗雄激素，即 氟他胺（flutamide)和抗腎上腺製劑，經常用來治療増殖性病 症，像是癌症，並可與本發明之胞毒藥物衍生物/載體共柄 物一起使用。 經常用來治療增殖性病症，像是癌症，並可與本發明之 胞毒藥物衍生物/載體共軛物一起使用的化學治療/抗贊生 物製劑’包括但不限於亞德里亞黴素、順氯氨鉑、卡舶、 85073.doc -49· 長春花鹼、長春新驗、博菜黴素、胺甲碟呤、阿黴素、氟 尿密疋|托泊甘、紫杉醇及其各種類似物和絲裂徽素。 組合物最好應包括在治療上有效之含量的本發明之共輛 物。在本文中使用“在治療上有效之含量，，一詞，意指治療 、改善或預防目標疾病或狀況’或顯露出可檢測$治療或 預防效果所需之治療劑的量。對任何共輛物而言，一開始 可先在細胞培養载中或在動物模式中，Μ是在嚷齒類 、兔子、狗、緒或靈長類中，估計在治療上有效的劑量。亦 可使用動物模式來判定適當的濃度範圍和投藥途徑。然後 可使用這類資訊’判定在人類中的有用劑量和投藥途徑。 人類個體的實際有效量將視疾病狀態的嚴重性、個體的 一般健康狀況、個體的年齡、體重和性別、飲食、投藥的 時間和頻率、藥物.组合(們)、對治療的反應敏感性和耐受性 /反應性而定。可由例行的實驗判定該用量，並在臨床醫師 的判斷範圍内。通常，有效劑量將從〇1毫克/平方公尺至5〇 冗克/平方公尺，較佳的是〇·4毫克/平方公尺至3〇毫克/平方 公尺，更佳的是2毫克/平方公尺至9毫克/平方公尺，以蛋白 質載體為基礎來計算劑量。 可將組合物分別投予患者，或可與其他製劑、藥物或荷 爾蒙混合投予。所投予之本發明單體胞毒藥物衍生物/抗體 共軛物的劑量，將視待治療之病況的性質、惡性淋巴瘤或 白血病的等級，以及該共軛物是否用於預防上，或用來治 療現存的病況而定。 投藥的頻率將視共軛物之半衰期，及其作用的期間而定 85073.doc •50- 1379693 。若共輛物具有短的半衰期（例如2至财時），可能需.要每 天給予i或多個劑量。或者’若該共輛物分子具有長的半衰 期（例如2至15天），則可能僅需每天給藥1次、每週給藥！次 或甚至每1或2個月給藥1次。 為了投予抗體共輛物，紅合物亦可含有在藥學上可接受 的載劑。載劑本身不應誘導對接受該组合物之個體有害: 抗體的產生’且不應是有毒性的。適當的載劑可以是大的 、緩慢代謝的巨分子，像是蛋白質、多月太、微脂粒、多醋 類、聚乳酸、聚甘醇酸、每入0, 氷合版基酸、胺基酸共聚物和失 活的病毒顆粒。 可使用在藥子上可接文的鹽類，例如無機酸鹽類，像是 鹽版鹽、氫漠酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽，或有機酸的鹽類， 像疋醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽。 在這些組合物中之在藥學上可接受的載劑，可額外地含 有液體’像是水、生理鹽水、甘油和乙醇。此外，在這類 組合物中亦可存有輔助物質，像是濕潤劑或乳化劑或pH值 、爰衝物質。類載劑使該組合物得以調配成錠劑、藥丸、 糖衣錠、膠囊、濠體、凝膠、糖聚、於聚或懸浮液，以供 患者攝食。 可供投藥的較佳形式’包括適合非經腸投藥的形式，例 如藉著注射錢液，例如藉著團塊注射或連續輸液。在用 來注射或輸液的產物之處，可採用在油性或含水媒劑中之 懸浮液、溶液或乳劑的形式，且其可含有調配劑，像是懸 浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。 85073.doc •51 - 1379693 雖二過衝之共輛物溶液的穩定性，足夠短期的.* 性，但長期穩定性 二’、月的穩定 增加並儲存，：佳的。欲促進共輛物的穩定性，並 ，、儲存可命，可將抗體-藥物共軛 水的形式，在使用之前以適當的無菌液體重:以 Γ之冷來乾燥有關的問題，已完全記載於文獻二2 =乾=處理期間’可能發生二級、三級和四級結構: 晶形穩定劑，並在冷J = ，作為共轭物的非 7東乾級的處理期間’維持蛋白質 構…在-個具體實施例中，可用在 護劑是糖醇，傻县欧f T 低/皿保 像疋_、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、聚 乙二醇及其組合。在另—且蝴 夕 θ 個，、實施例中，該低溫保護劑 是糖酸’包括趁糖酸、糖越酸、越酸及其組合。 本發明之低溫保護劑亦可以是碳水化合物。適當的碳水 化“勿疋含有一或多個羥基基團的醛或酮化合物。該碳水 化合物可以是環狀或直線的’並包括例如越糖類、酮糖類 、、胺基糖類：醛醇類 '肌醇類、醛糖酸、糖醛酸或醛酸， 或其組合。該碳水化合物亦可以是單_、二-或多-碳水化合 物，像是例如雙醣或多醣。適當的碳水化合物包括，例如 甘油越：阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖 、葡萄糖、己糖、、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄 糖、果糖、葡萄糖酸、山梨糖醇、乳糖、甘露糖醇、甲基α-峨喃葡糖嘗、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、内酉旨、山 梨糖、葡糖二酸、赤癬糖、蘇糖、阿拉伯糖、異構糖、阿 卓糖纟洛糖艾杜糖、塔羅糖、赤癖酮糖、核酮糖、木 85073.doc -52- 1379693 酮糖、阿洛酮糖'塔格糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖 二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺、 庶糖、海藻糖或神經胺糖酸，或其衍生物。適當的多碳水 化合物包括，例如阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳 聚糖、聚半乳糖㈣、葡聚糖'甘露聚糖、木聚糖（像是例 如菊糖）、果聚糖、岩藻依聚糖、角叉菜膠、半乳卡洛羅糖 '果膠、果膠酸、i鏈澱粉、支鏈澱粉、糖原、澱粉果膠 、纖維素'葡聚糖'石臍素、幾丁質、瓊脂糖、角質素、 軟骨素、皮膚素、透明質酸、藻酸、黃酸樹膠或澱粉。其 中特别有用的碳水化合物是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖 及其組合。蔗糖是特別有用的低溫保護劑。 、f發明之低溫保護劑最好是碳水化合物或“糖，，醇，其可 八疋多元醇。多羥基化合物是含有一個以上羥基基團的化 °物。多滅化合物最好是直線的^適#之多㈣化合物 ’包括例如二元醇，像是乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇、 甘油或季戊四醇或其組合。 -在些較佳的具體實施例+，該低溫保護劑是篇糖、海 藻糖\甘露糖醇或山梨糖醇。 —凋配，便可將本發明之組合物直接投予個體。待治 療 &lt; 個可以疋動物。然而，最好為了投藥給人類個體而 修改該组合物。 °藉著幾個路徑投予本發明之組合物，包括但不限於口 #脈内、肌肉内、動脈内、髓内、勒-内、心室内、經 皮、經皮下（參見PCT公開案第W0 98/20734)、皮下、腹腔 85073.doc •53· 1379693 内、鼻内、經腸、局部、舌下、陰道内或經直腸之路徑。 亦可使用低壓噴霧（hyposprays)來投予本發明之組合物。通 常，可將組合物製備成注射用的液態溶液或懸浮液。亦可 製備適用於溶液或懸浮液的固體形式，在注射之前才放在 液態媒劑中。 通常將藉著皮下、腹腔内、靜脈内或肌肉内注射，完成 組合物的直接遞送，或遞送至組織的間質隙。.亦可將組合 物投予至病變内。給藥處理可以是單次給藥的時間表或多 次給藥的時間表。 將知曉在組合物中的活性成份，將是胞毒藥物/蛋白質載 體共軛物。它本身在胃腸道中，將是易被降解的。因此， 若欲藉著使用胃腸道之路徑投予該組合物，該組合物將需 要含有保護共軛物免於降解的製劑，但當它一旦被胃腸道 吸收，便釋放出該共輛物。 可在 Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N. J. 1991)中，獲得在藥學上可接受之載劑的徹 底討論。 本發明特別提供用來治療增殖性病症之單體卡奇黴素衍 生物/人類化抗-CD22抗體（G5/44)，CMC-544，該增殖性病 症之特徵為細胞在其表面表現CD22抗原。 本發明更進一步提供CMC-544在製造用來治療增殖性病 症之組合物或醫藥品上的用途，該增殖性病症之特徵為細 胞表現CD22。 CMC-544亦可用在各種治療中，其中希望降低出現在欲 以在本文中揭示之組合物或醫藥品治療的個體中之表現 85073.doc -54- 1379693 CD22之細胞的含量。明確地說，使用該組合物或醫藥品來 治療患有增殖性病症，即淋巴瘤和白血病的人類或動物， 其在細胞表面表現CD22抗原。這些表現CD22的細胞可能在 體内循環，或以不想要的大量侷限在體内的特定地方。 最好亦使用CMC-544來治療淋巴細胞家系的亞性腫瘤 ，包括淋巴瘤和白血病，最好是非_霍奇金氏淋巴瘤（NHL) '急性淋巴細胞性白血病（ALL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴 細胞性白血病（ALL)和慢性淋巴細胞性白血病（cll)。可單 獨使用CMC-544，或與其他生物活性劑併用，治療罹患B_ 細胞亞性腫瘤的個體。 苇用的生物活性劑包括生長因子、細胞激動素和胞毒藥 物。經常用來治療増殖性病症，像是癌症，並可與cMc_544 一起使用的胞毒藥物，包括氨茴環黴素，像是阿黴素、道 諾紅菌素、伊達比星、阿克拉黴素、佐柔比星、米托慈醌 表柔比星洋紅黴素j、雜加拉徽素、美諾立爾、匹塔 路比星和瓦路比星’高達3天；以及响啶或嗓呤核芬，像： 阿糖胞芬、吉西他濱、曲氟尿菩、環胞芬、依語他濱、阿 扎胞芬、去氡氟尿嘗、，貪司他丁、脫氧溪尿誓、截瘤達、 君賓、地西他濱、氟尿苷、氟達拉濱、谷氏菌素、嗜 羅黴素 '替加氟L夫琳。其他可與cmc_544一起投予 的化學治療/抗贅生物製劑’包括亞德里亞徽素、順氯氣舶 、卡銘、環鱗醯胺、甲嗪咪讀、長春花驗、長春新驗、 未托蒽酿、博菜黴素、氮芥、強的松、丙卡巴肿、胺甲碟 吟、氣尿❹、依托泊誓、紫杉醇及其各種類似物以及絲 85073.doc -55· 1379693 裂黴素。CMC-544可與這些治療劑中的一或多個同時投予 。或者，可在投予這些治療劑中的一或多個之後，連續投 予 CMC-544。 亦可單獨、與其他作為治療攝生法之一部分的生物活性 劑之組合，像是生長因子、細胞激動素、類固醇、諸如抗 -CD20抗體、利妥昔單抗（美羅華7^)之類的抗體，以及化學 治療劑，同時或之後投予CMC-544。針對惡性淋巴增殖性 病症之治療所確立的治療攝生法，包括CHOPP (環磷醯胺、 阿黴素、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼）；CHOP (環磷醯胺 、阿黴素、長春新鹼和強的松）；COP (環磷醯胺、長春新 鹼和強的松）；CAP-BOP (環磷醯胺、阿黴素、丙卡巴肼、 博菜黴素、長春新鹼和強的松）；m-BACOD (胺甲碟呤、博 菜黴素、阿黴素、環磷酿胺、長春新驗、地塞米松和甲醯 四氫葉酸）；ProMACE-MOPP (強的松、胺甲碟呤、阿黴素 、環磷酿胺、依托泊芬、甲酸四氫葉酸、氮芬、長春新驗 、強的松和丙卡巴胼）；ProMACE-CytaBOM (強的松、胺甲 碟呤、阿黴素、環磷醯胺、依托泊苷、甲醯四氫葉酸、阿 糖胞瞀、博菜黴素和長春新鹼）；MACOP-B (胺甲碟呤、阿 黴素、環磷酿胺、長春新驗、固定劑量的強的松、博菜黴 素和甲醯四氫葉酸）；MOPP (氮芥、長春新驗、強的松和丙 卡巴肼）；ABVD (亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春 花鹼和曱嗪咪唑胺）；以ABV (亞德里亞黴素/阿黴素、博菜 黴素和長春花鹼）加以改變的MOPP ;以ABVD (亞德里亞黴 素/阿徽素、博菜黴素、長春花驗和甲11 秦咪吐·胺）加以改變的 85073.doc -56- MOPP (氮介、長春新驗、強的松和丙卡巴耕）以及⑶vpp (苯 丁酸氮芥、長春花鹼、丙卡巴胼和強的松）。治療可包括誘 導’口療期、鞏ϋ治療期和維持治療期。亦可單獨、與任何 上文確認之治療攝生法’作為誘導、冶療期、鞏固治療期和 維持治療期的一部分，同時或之後投予cmc_544。 本發明之共軛物亦可與其他生物活性劑和化學治療劑— 起投予，作為治療復發性侵襲性淋巴瘤之組合化療攝生法 的一部分。這類治療攝生法包括1河¥1&gt;_16(異環磷醯胺、胺 甲碟呤和依托泊苷）；MIME (丙酮雙咪腙、異環磷醯胺、胺 甲碟呤和依托泊：y：); DHAP (地塞米松 '高劑量的阿糖胞苷 和順氣氨鉑）；ESHAP (依托泊：y：、甲基脫氫皮甾醇、高劑 量的阿糖胞苷和順氯氨鉑）；EP0CH (依托泊甞、長春新鹼 和阿黴素96小時，加環磷醯胺之團塊劑量，並口服強的松） ;CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊甞、丙卡巴肼、強的松和博 菜黴素）；CAMP (洛莫司汀、米托醌蒽、阿糖胞站和強的松） ’ CVP-1 (環磷醯胺、長春新驗和強的松）；ch〇p_b (環鱗醯 胺、阿黴素、長春新驗、強的松和博菜黴素）；CEPP-B (環 磷醯胺、依托泊：y：、丙卡巴駢和博菜黴素·)以及P/Doce (表 柔比星或阿黴素、長春新鹼、環磷醯胺和強的松）^侵襲性 淋巴瘤的額外.治療攝生法可包括在第一階段中，利用Chop (環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松）_利妥昔單抗（美羅 華tm)-CMC-544的第一線治療，接著在第二和第三階段，利 用CHOP-利妥昔單抗（美羅華，、CHOP_CMc_544或cH0P_ 利妥昔單抗（美羅華tm)_cmc_544。或者，第一階段可具有 85073.doc -57- 1379693 利用COP (環磷醯胺、長春新鹼和強的松）-利妥昔單抗（美羅 • tm)-CMC-544的第一線治療，接著在第二和第三階段，利 用COP-利妥昔單抗（美羅華1^)、COP-CMC-544或COP-利妥 昔單抗（美羅華tm)-CMC-544。在更進一步的具體實施例中 ，侵襲性淋巴瘤的治療可包括在第一階段中，利用抗體藥 物共軛物CMC-544的第一線或第二線治療，接著在第二和 第三階段中，利用CMC-544和CHOP (環磷醯胺、阿黴素、 長春新鹼和強的松）、CMC-544和COP (環磷醯胺、長春新鹼 和強的松）、CMC-544與利妥昔單抗（美羅華™)或僅有利妥 .昔單抗（美羅華TM)。在另一個具體實施例中，侵襲性淋巴瘤 的治療可包括利用抗體藥物共軛物CMC-544的第一線治療 ，接著在第二和第三階段中，僅利用CMC-544，或與其他 治療攝生法組合，包括但不限於ESHOP (依托泊苷、甲基脫 氫皮甾醇、高劑量的阿糖胞甞、長春新鹼和順氯氨鉑）； EPOCH (依托泊:y：、長春新鹼和阿黴素96小時，加環磷醯胺 之團塊劑量’並口服強的松）；IMVP-16 (異環磷醯胺、胺甲 碟呤和依托泊苷）；ASHAP (亞德里亞黴素、甲潑尼龍琥珀酸 鈉（solumedrol)、Ara-C和順氣氨鉑）；MIME (丙酮雙咪腙、 異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊苷）以及ICE (異環磷醯胺、 環磷醯胺和依托泊：y： ρ在本申請案中提供之可用在惡性化 療中之胞毒藥物的細節，包括組合化療攝生法、劑量等等 ’均可在 Cancer Principles and Practice of Oncology,編輯 Vincent T. DeVita, Samuelo Heilman, Steven A. Rosenberg, 弟 6版’出版商：Lippincott, Williams and Wilkins (2001)和 85073.doc -58- 1379693
Physician's Cancer Chemotherapy Drug Manual,編輯 Edward Chu和 Vincent T. DeVita,出版商：Jones and Bartlett, (2002) 中找到。 本發明亦提供治療罹患或有增殖性病症危險之人類或動 物個體的方法，該增殖性病症之特徵為細'胞表現CD22，該 方法包括對該個體投予有效含量的本發明之CMd&lt;44。4 . 在下文特定的工作實例中進一歩描述本發明，真僅企圖 進一步描述本發明，並非限制其範圍。 實例1 候選抗體的產製 使用下列的選擇基準，從融合瘤中選出對抗CD22之抗體 的名單：與Daudi細胞結合，在Daudi細胞上内化，與周園 血液單核細胞（PBMC)結合，在PBMC上内化，親和力（大於 1(Γ9Μ) ’老鼠γΐ和產生速率。選出5/44為較佳的抗體。 I.嵌合型5/44抗體分子的基因選殖和表現
a) 製備5/44融合瘤細胞，並從其土製備rn、A 藉著傳統的融合瘤技術產製融合瘤5/44，接著以人類 CD22蛋白質免疫老鼠》使用RNEasy套組（Qiagen, Crawley, UK;目錄第74106號），從5/44融合瘤細胞中製備RNA。按 照下述，將所獲得的RNA逆轉錄成cDNA β b) 將CD22分布在NHL腫瘤上 進行免疫組織化學研究，使用5/44抗-CD22單株抗體，檢 查發生率和染色的分布。在研究中併入對照的抗_CD22和抗 -C D 7 9 a抗體，澄實腫瘤的B細胞面積。 85073.doc •59- 總共研究50個腫瘤，如下藉著Working Formulation和 REAL分類系統將這些腫瘤分類： • 7個B淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤（高/1) • 4個B-CLL/小淋巴細胞性淋巴瘤（低/A) • 3個類淋巴漿細胞（lymphoplasmacytoid)/免疫細胞瘤（低 /A) • 1個外層細胞（中等/F) • 14個濾泡中心淋巴瘤（低至中等/D) • 13個瀰漫性大細胞淋巴瘤（中等至高/G，H) • 6個無法分類的（K) • 2個T細胞淋巴瘤 利用0.1微克/毫升之5/44抗體，40個B細胞淋巴瘤對CD22 抗原是陽性的，而另有6個在濃度增加至0.5微克/毫升時變 成陽性的。有2個B細胞腫瘤在0.1微克/毫升時仍維持陰性， 但剩下的組織不夠在高濃度下進行測試。然而，利用命名 為6/13的其他抗-CD22抗體（Celltech，Slough, UK)進行平行 測試，其給予比5/44更強的染色，結果所有48個B細胞淋巴 瘤對CD22均為染色陽性的。 因此，可推論CD22抗原在B細胞淋巴瘤上廣泛地表現， 並因此在NHL中提供適合免疫療法的標靶。 c)5/44 VH和 的 PCR選殖 使用逆轉綠酶合成編碼5/44重和輕鏈之可變功能部位的 cDNA序列，產生出現在總RNA中之mRNA的單股cDNA副本 。然後藉著聚合酶連鎖反應（PCR)，使用專一的寡核#酸引 85073.doc -60· 1379693 子，用這個作為模板，擴大老鼠的v-區序列。 i) cDNA合成 在20微升含有下列製劑的反應體積中，合成cDNA : 50 mM Tris-HCl pH 8.3，75 mM KC1，10 mM二硫蘇糖醇，3 mM MgCl2，dATP、dTTP、dCTP和 dGTP各 0.5 mM，20單位 RNA素（RNAsin)，75毫微克隨機的六核甞酸引子，2微克5/44 RNA和200單位莫洛尼老鼠白血病病毒逆轉錄酶。在42°(：下 培養60分鐘之後，藉著加熱至95°C5分鐘，中止該反應。
ii) PCR 使等份的cDNA接受PCR，使用對重和輕鏈專一的引 子組合。設計降解引子集合，與信號肽之保留序列黏接， 用來作為前進引子。這些序列均按順序含有限制位置（VL Sful ; VH Hindlll)，從其5'端的7個核甞酸開始，序列 GCCGCCACC (序歹|J識另U50號），容許所得的mRNAs、開始 密碼子以及以已知老鼠抗體之前導肽序列為基礎的20-30 個核贫酸（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，1991，U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health) ，進行最佳的轉譯。 設計跨越抗體之架構4 J-C接合點，並含有有助於選殖VL PCR片段之酵素BsiWI限制位置的3’引子。重鏈3’引子是設 計成跨越抗體之J-C接合點的混合物。3 ’引子包括有助於選 殖的Apal限制位置。引子的3’區含有以在已知老鼠抗體中發 現的那些（Kabat等人，1991，在前）為基礎的混合序列。 85073.doc • 61 - 1379693 上述的引子組合，使得VH和VL的PCR產物，能夠直接被 選殖到適當的表現載體（參見下文）内，產生嵌合型（老鼠-人類）重和輕鏈，並使那些在哺乳動物細胞中表現的基因， 產生想要同型物的嵌合型抗體。 如下建立PCR的培養（100微升）。每個反應含有10 mM Tris-HCl pH 8.3，1.5 mM MgCb，50 mM KC1，0.01%重量/ 體積的明膠，dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP 各 0.25 mM，10 微 微莫耳的5’引子混合物，10微微莫耳3’引子，1微升cDNA 和1單位Taq聚合酶。在95°C下培養該反應5分鐘，然後經過 94°C 1分鐘，55°C 1分鐘和72°C 1分鐘的循環。在30次循環之 後，在瓊脂糖凝膠上，藉著電泳分析每個反應的等份。 至於重鏈V-區，僅在以在架構1的起點内黏接之引子集合 置換信號肽引子集合時，才獲得已擴大之DNA產物。將該 片段選殖到DNA定序載體内。定出DNA序列並轉譯，得到 推衍的胺基酸序列。藉著參考以實驗判定的N-終端蛋白質 序列，證實該推衍的序列。圖1顯示老鼠單株抗體5M4之 CDRS的胺基酸序列。圖2和3分別顯示老鼠單株抗體5M4之 成熟輕和重鏈V-區的DNA/蛋白質序列。 iii) PCR片段的分子選殖 然後將老鼠的V-區序列選殖到表現載體pMRRl 0.1和 pMRR 14内（圖7和8)。這些是表現含有編碼人類/c輕鏈和人 類γ_4重鏈之DNA的輕和重鏈的載體。藉著限制消化，將VL 區繼代選殖到表現載體内，並連接定序載體，使用Sful和 83丨\¥1限制位置，創造出質體卩]^111110 (544(；1〇(圖8)。藉著 85073.doc -62- 1379693 PCR擴大重鏈DNA，使用5'引子引入信號肽，因為未在選殖 策略中獲得這個-使用得自不同的機構内融合瘤（稱為162) 之老鼠重鏈抗體前導。5«引子具有下列的序列： 5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCT CTCGTGTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTG AGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3’(序列識別 51號）。 逆向引子與在原始之VH基因選殖中使用的相同。將以酵 素Hindlll和Apal消化而獲得之PCR產物繼代，並證實其DNA 序列，創造出質體pMRR14 (544cH)(圖7)。將兩個表現載體 暫時地共同轉移感染到CHO細胞内，產生嵌合型c5/44抗體 。使用脂染胺（Lipofectamine)試劑，根據製造者的草案 (InVitrogen: Life Technology, Groningen, The Netherlands. 目錄第11668-027號）完成之。 II.移除糖基化作用位置和反應性離胺酸 在CDR-H2中觀察到可能的N-連接糖基化作用位置序列 ，具有胺基酸序列N-Y-T (圖3)。5/44及其片段（包括Fab)的 SDS-PAGL·、西方墨點和凝膠之碳水化合物染色，指出該位 置確實是糖基化了的（未顯示）。此外，在CDR-H2内的暴露 位置，觀察到離胺酸殘基，其藉著對抗體可與其共軛之製 劑提供額外的共軛位置，而具有降低抗體之結合親和力的 潛力。 使用PCR策略，在CDR-H2序列内導入胺基酸取代，企圖 移除糖基化作用位置及/或反應性離胺酸，如同在圖4中所 示。使用編碼突變N55Q、T57A或T57V的前進引子，移除糖 85073.doc -63- 1379693 基化作用位置（圖4)，並產製含有取代K60R的第四個前進引 子，移除反應性離胺酸殘基（圖4)。在這些PCR擴大作用的 每一個中，使用架構4逆向引子。以酵素Xbal和Apal消化PCR 產物，並插入pMRR14 (544cH)(亦利用Xbal和Apal切開）内， 產生編碼這些突變種的表現質體。N55Q、T57A和T57V突變 ，藉著使胺基酸序列改變，遠離一致序列N-X-T/S，剝奪了 糖基化作用位置，而K60R突變亦利用類似的帶正電殘基精 胺酸，置換了可能具有反應性的離胺酸。以cL質體共同-轉 移感染所得的cH變種質體，產生經過表現的嵌合型抗體變 種。 III.評估嵌合型基因的活性 在暫時地轉移感染至CHO細胞内之後，評估嵌合型基因 的活性，並藉著BiaCore分析，判定親和力常數》 使用BIA技術，針對與CD22-mFc構築體的結合，調查已 經移除其糖基化作用位置或其反應性離胺酸之嵌合型5/44 或其變種的親合力。在圖9中出示該結果。所有的結合測定 均以 BIAcoreTM 2000儀器（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala， Sweden)進行。藉著經由已經固定之抗-老鼠Fc捕捉CD22mFc ，來進行測定。抗體是在可溶相中。將試樣、標準物和對 照組（50微升）注射在已經固定的抗·老鼠Fc上，接著是在可 溶相中的抗體。在每次循環之後，以30微升/分鐘，使用50 微升40 mM HC1 ’使表面再生。使用BIA評估3.1軟體 (Pharmacia)，進行動力學分析。 在構築體T57A中移除糖基化作用位置，與嵌合型5/44相 S5073.doc -64- 1379693 比較，結果產生稍快的開-速率和明顯較慢的關-速率，得到 大約5-倍的親和力改良。N55Q突變種對親和力並無影響。 該結果是沒有預料到的，因為它暗示碳水化合物本身的移 除，對結合作用似乎沒有影響（如同N55Q的改變）。僅對 T57A的改變，觀察到改良的親和力。一種可能的解釋為與 碳水化合物的存在無關，移除在位置57處對結合作用發揮 負面影響的蘇胺酸，將蘇胺酸轉變為丙胺酸。丙胺酸之小 尺寸是重要的，且蘇胺酸的負面影響與其尺寸有關之假說 ，得到使用T57V突變作用所獲得之結果的支持：在位置57 處以，纈胺酸置換，不是有利的（結果未顯示）。 藉著K60R突變移除離胺酸殘基，對親和力有中立的影響 ，即導入精胺酸殘基，移除可能的反應性位置，並沒有損 害親和力。 因此，移除糖基化作用位置和移除反應性離胺酸的突變 ，兩者均被包含在人類化作用的設計中。 實例2 5/44的CDR-移植 在上文中已經針對5/44抗體之重和輕鏈的可變區，描述 了基因的分子選殖，及其產製嵌合型（老鼠/人類）5/44抗體 的用途。在圖2和3中，分別出示老鼠之5/44 Vl和VH功能部 位的核苷酸和胺基酸序列（序列識別7和8號）。本實例描述 5/44抗體在人類架構上的CDR-移植，在人類中降低可能的 免疫原性，根據Adair等人的方法（PCT申請案第W0 91/09967 號）。 85073.doc -65- 1379693 I_ 5/44輕鏈的CDR移植 與得自人類亞-組I &amp;輕鏈V區之一致序列的蛋白質序列 排列’指出64%的序列同一性。所以，為了建構CDR-移植 之輕鏈’選出與人類¥〖亞_组I生殖種系〇12，DpK9序列一 致的接受者架構區。架構4接受者序列係衍生自人類j_區生 殖種系序列JK1。 在圖5中提供老鼠5/44之架構區與接受者序列的胺基酸 序列比較’並顯示在捐贈者和接受者鏈之間有27個差異。 在每個位置’進行老鼠殘基促成抗原結合之可能性的分析 ’直接或間接地經由對包裝或在Vh/Vl界面之影響》若認為 某個老鼠殘基是重要的，並從尺寸、極性或電荷的觀點來 看，與人類殘基有充分的差異，此時便保留該老鼠殘基。 以該分析為基礎’建構兩個版本的CDR-移植輕鏈，具有在 序列識別19號和序列識別20號（圖5)中提供之序列。 II. 5/44重鏈的CDR-移植 使用與針對輕鏈描述的相同的策略，完成5/44重鏈的 CDR-移植。發現5/44重鏈之V-功能部位，是與屬於亞 '组工 之人類重鏈同種的（70%序列同一性），並因此使用人類亞_ 组I生殖種系架構VH1 -3，DP7作為接受者架構。架構4接受 者序列係衍生自人類J-區生殖種系序列JH4。 在圖6肀出示5/44重鏈與架構區的比較，其中可看出在22 位置處’ 5/44重鏈與接受者序列有所不同。對於任何可促 成抗原結合的分析’導致建構5個版本的cdR-移植重鏈，具 有在序列識別23號、序列識別24號、序列識別25號、序列 85073.doc -66- 1379693 D60是靠近CDR-L2的表面殘基，並可直接促成抗原的結合 。在這些殘基中，發現在人類/C基因之生殖種系序列中的 V2、L37、Q45和D60，來自其他的亞-組。重鏈移植物gH7 具有4個捐贈者架構殘基（在CDR-移植使用的結構定義之下 ，認為殘基R28是CDR-H1的一部分（參見Adair等人（1991), PCT申請案第W0 91/09967號））。殘基E1和A71是靠近CDRs 的表面殘基。殘基148是可能的包裝殘基。殘基T93出現在 Vh/Vl界面處。在這些殘基中，發現E1和A71是在人類亞-組I的其他生殖種系基因中。發現殘基148是在人類生殖種 系亞-組4中，並發現T73是在人類生殖種系亞-組3中。 在圖16中顯示輕鏈和重鏈兩者的完整DN A和蛋白質序列 ，包括由載體提供之在恆定區基因内的插入序列之約略位 置，並分別在序列識別29號和序列識別28號中提供輕鏈的 ，並分別在序列識別3 1號和序列識別30號中提供重鏈的。 從這些載體中切下編碼這些輕和重鏈基因的DNA。在5 ’ Hindlll位置處消化重鏈DNA，然後以大腸桿菌DNA聚合酶 I的克勒諾片段處理，創造出5'弄鈍的末端。在3’ EcoRI位 置處切開，結果產生重鏈片段，從瓊脂糖凝膠中將其純化 。以相同之方式，產生輕鏈片段，在5’ Sful位置處弄鈍， 並帶有3 ’ EcoRI位置。將兩個片段選殖到以DHFR為基礎的 表現載體内，並用來在CHO細胞内產製穩定的細胞株。 實例3 NAc-γ卡奇黴素DMH AcBut對人類化 抗-CD22抗體（G5/44)的共軛作用 85073.doc -69- 1379693 在代表性的共軛反應中，將人類化抗-CD22抗體（G5/44) 與NAc-γ卡奇黴素DMH AcBut OSu (卡奇黴素衍生物）共軛（ 參見圖17)，其中標靶蛋白質濃度為7.5毫克/毫升，且標靶 卡奇黴素衍生物的裝載，按蛋白質之重量計，為8.5%。標 靶反應pH值為8.5±0.2，而其他反應成分的標靶濃度如下： 50 mM N-(2-羥乙基）六氫吡畊-Ν·-(4-丁烷磺酸）（HEPBS)， 37.5 mM癸酸鈉以及9%體積/體積的總乙醇。在33土2°C下進 行反應1小時。在純化之前，該代表性反應的分析結果如下 :蛋白質：7.34毫克/毫升；卡奇黴素裝載：82.7微克/毫克 ;聚集體：93.25%以及未共軛的蛋白質（1^戶）：1.07%(按1^1^ 計之1^面積％)。 測試各種界面活性劑添加劑及其濃度對產物產量和純度 的影響，以便判定其對共軛單體之產製的影響（參見表2)。 在每件事均維持不變，除了添加劑及其濃度之外，執行該反 應。就蛋白質濃度；卡奇黴素裝載、聚集體内含量和LCF， 分析得自這些反應的共軛產物。雖然所有範圍在C6 (己酸） 至C12 (十二烷酸）内的正-羧酸均提供可接受的結果，但在濃 度範圍30 mM至50 mM之癸酸中，觀察到最佳的整體結果（低 LCF、低聚集體和單體共軛物的高回收）。 85073.doc 70- 表2 :添加# 身份和濃度對共軛結果的影響 添加劑/濃度 蛋白質回收 聚集體百分比 LCF百分比 (回收％) 己酸-500 mM 51.3 3.36 38.3 庚酸-400 mM 49.9 4.7 20.6 辛酸-200 mM 57.3 3.27 10.6 壬酸-100 mM 54.7 1.41 0.3 癸酸-50 mM 56.7 1.35 0.2 十一烷•酸-20 mM 46.9 2.95 0.6 十二燒酸-5 mM 65.6 0.78 7.0 1379693 實例4 層析純化法 I.層析分離法 雖然確認丁基瓊脂糖4速流為最佳的HIC介質，但可獲得 之可接受的結果，與使用其他樹脂，像是辛基瓊脂糖速流 、PPG-600C (Tosoh Biosep)、Fractogel EMD 丙基（EM Processing) 和 Source 15IS0 (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)的層析 法條件，稍有出入。 純化的起始物質是含有7.2毫克/毫升蛋白質，以83微克/ 毫克之卡奇黴素衍生物裝載，具有10.1%聚集體内含量（按 HPLC計之面積％)和5.6% LCF内含量（以HPLC計之面積％) 的共輛反應混合物。 在完成共軛反應之後，藉著加入磷酸钾溶液至終磷酸濃 度為0.7 M (pH 8.2)，將反應混合物稀釋四倍。在混合之後 85073.doc -71 - 1379693 ，通過0.45-微米的濾紙過濾該溶液。將經過稀釋之溶液裝 入丁基瓊脂糖4速流管柱中。裝入管柱中的蛋白質總量為每 毫升床體積29毫克。在以0.7 Μ磷酸鉀沖洗之後，使用從0.7 Μ 至4 mM磷酸鉀，pH 8.2的梯度洗脫管柱。收集在梯度中洗 脫出的溶離份，進行進一步的處理，該集合由單體共辆物 組成，帶有分別低於1面積％的聚集體和LCF。將該集合裝 入交聯葡聚糖G-25 (Amersham Biosciences)脫鹽管柱中，交 換成適合調配的緩衝溶液，其由20mMTris-Cl和100mM氯 化鈉，pH 8.0組成。經過純化、交換緩衝溶液的CMC-544 製品，具有下列特性：卡奇黴素裝載：81微克/毫克；聚集 體：0.4% (按HPLC計之面積％) ; LCF : 0.8% (按HPLC計之 面積％)。 實例5 NAc-γ卡奇黴素DMH AcBut-G5/44免疫共軛物 (CMC-544)的結合分析 在結合測定中，分析藉著上文之共軛方法產製的帶有卡 奇黴素之人類化抗-CD22抗體（G5/44)的免疫共軛物 (CMC-544)，判定使用改良方法產製的共軛物，是否對抗原 結合作用具有任何不利的影響。表3顯示該共軛製程，對抗 體之抗原結合親和力，沒有任何影響。藉著舊或新共軛製 程製造的CMC-544免疫共軛物，以相同之親和力與標靶抗 原結合，其與未共軛抗體G5/44的親和力沒有差異。 85073.doc -72- 1379693 表3 :藉著使用CMA-676和CMC-544共軛製程，製造之 CMC-544的結合親和力 抗-CD22抗體 Kd(M) Κα(1/Μ) kd(l/s) ka(l/Ms) LCF% 人類化G5/44 1.30 xlO·10 7.90 χ 109 2.80 χ ΙΟ'5 2.20 xlO5 100 CMC-544 (21微 毫克) 1.20 xlO·10 8.10 xlO9 6.10 χ 1〇·5 4.90 χ ΙΟ5 25 (CMA-676製程） CMC-544 (87微克/毫克） 1.50 χ ΙΟ'10 6.60 xlO9 6.90 χ 1〇'5 4.60 χ ΙΟ5 3.3 (CMC-544製程）
使用 BIAcore 2000 (BIAcore AB，Uppsala，Sweden)進行生 物感應器分析。將CD22mFc共價固定在N-羥基琥珀醯亞胺_ 激活之羧甲基葡聚糖塗覆的生物感應晶片（CM5)上，使用標 準胺-偶聯化學，以大約2000共振單位的蛋白質密度。以HBS 緩衝溶液（10 mM HEPES ’ pH 7.4，含有 150 mM NaCl，3 mM EDTA和0.005%多乙氧基醚20 (體積/體積））稀釋cmC-544或 G5/44的試樣，並以1至ΙΟΟηΜ之濃度範圍，以3〇微升/分鐘 之流速，注射在CD22mFc-塗覆之生物感應晶片的表面上3 分鐘’容許結合。在結合期之後，藉著在15分鐘的期間内 ，以HBS緩衝溶液沖洗晶片，監視已結合抗體的解離。藉 著以15微升再生緩衝溶液（10 mM NaOH和2〇〇 mM NaCl)沖 洗生物感應晶片3 0秒，使抗原性表面再生，接著在下一次 循環之前，有2分鐘的穩定時間。藉著非線性最小二乘方回 歸分析，使用1:1蘭格謬爾（Langmuir)結合曲線吻合模式和 BIA評估程式（3.0版，BIAcore) ’計算動力學常數。藉著表 面等離子體激光共振分析，使用共價固定在生物感應晶片 85073.doc -73 - 1379693 上的CD22mFc，評估CMC-544的抗原結合作用。CMC-544 和G5/44與CD22mFc結合之動力學分析的結果，在補償質量 傳遞，使資料全面地吻合1:1蘭格謬爾結合模式之後，顯示 CMC-544和未共軛之G5/44兩者與CD22結合，具有類似的親 和力（CMC-544:CD22 KD=200 pM ; G5/44:CD22 KD=235 pM) 。與卡奇黴素的共軛作用，不影響G5/44有效結合CD22mFc 的能力。 亦藉著流動細胞計數法，檢查CMC-544和G5/44與在B淋 巴瘤細胞表面上表現之CD22的結合作用。在本評估中，使 用抗-CD33 mAb吉姆單抗（gemtuzumab)(hP67.6)及其卡奇黴 素共辆物 CMA-676 (滅髄瘤（gemtuzumab ozogamicin))，作為 可匹敵之同型物的對照組。使用利妥昔單抗（美羅華TM)，一 種嵌合型人類IgGl抗-人類CD20 mAb，作為陽性對照组。 亦使用經過純化的人類多株IgGl和IgG4作為陰性對照组。 CMC-544和G5/44與在Ramos或RL BCL上之CD22的結合作 用是類似的，並可與人類多株IgG4區別。RL BCL展現出比 Ramos BCL更低的CD22之表面表現。相反的，CMA-676或 gLlgH7對BCL的結合作用，類似與人類多株IgG4的結合， 符合其缺乏CD33的表現（資料未顯示）。相同的細胞證實了 抗-CD20利妥昔單抗（美羅華™)的強結合。不像hP67.6和 CMA-676，證實 CMC-544和 G5/44沒有任一個與 CD22· CD33 + HL-60白血病細胞結合（資料未顯示）。這些結果暗示G5/44 與卡奇黴素的共軛作用，不影響其抗原專一性。CMC-544 專一地認出在人類B細胞上的CD22，但不認得在老鼠、大 85073.doc -74- 1379693 鼠、狗、豬或靈長類（獼猴和恆河猴）B細胞上的（資料未顯 示）。 實例6 CMC-544之在活體外和在活體内影響的分析 I.在活體外的胞毒性 在活體外生長的CD22+B-細胞淋巴瘤細胞株，RL、Daudi 、Raji和Ramos上，比較藉著使用CMA-676和CMC-544法製 造之CMC-544的影響。使用瞄準人類CD33的可匹敵之同型 物的卡奇黴素共軛物（CMA-676)，反映共軛物的抗原-非-專 一性影響。在本評估中，使用未共軛之N-Acy卡奇黴素DMH (在酸性水解作用時，從共輛物中釋放出藥物），指出在所使 用的這些細胞株中，每一個都是對卡奇黴素之致命影響敏 感的。表4顯示這些評估的結果，是以卡奇黴素之當量為基 礎，而表5則以共軛抗體蛋白質的濃度來表現這些結果。 CD22-調節將卡奇黴素遞送至CD22+細胞，在殺死標靶細胞 方面，比未共軛藥物本身至少更有效10倍》可匹敵之同型 物的對照組共軛物（CMA-676)所顯示出的胞毒性，比未共軛 之卡奇黴素衍生物更低或與其類似。從表4中，似乎藉著 CMC-544共軛法製造的共軛物，可在比藉著CMA-676共軛法 製造之共軛物更低的抗體濃度下，產製相等的胞毒影響。 85073.doc -75- 1379693 :藉著共赛气兔立，素的生長抑y (卡奇黴^ B-細胞 淋巴瘤株 CMC-544 法 CMC-544裝載: 65微克 CMA-676法 CMC-544裝載： 35微克/毫克
RL 1號 2號 6 12 30 40
Daudi 1 號 21 80
Raji 1號 2號 500 560
Ramos 1 號 2號 200 260
ND* 520 130 ND
陰性對照組 CMA-676裝載 35微克/考1 600 400 ‘ND，未判定 表5 :藉共輛之@體 B-細胞 淋巴瘤株 一 CMC-544法 CMC-544裝载： 65微克/毫妾 CMA-676法 CMC-544裝載： 35微克/毫克' L/毫升） 陰性對照組 CMA-676装載： 35微克/臺古 抗體對照 組 G5/44 RL 1號 0.09 0.86 - 17.14 &gt;100 2號 0.18 1.14 11 41 Daudi 1 號 - &gt;100 0.32 2.29 53 RQ Raji 1 號 --- &gt;100 7.69 ND* 80.00 &gt;100 2號 8.62 14.86 117.U Ramos 1 號 3.08 3.71 ND &gt;100 &gt;100 2號 * -，一 t. 山 4.00 ND nd &gt;100 85073.doc -76- 1379693 在活體内的胞毒性。在B-細胞淋巴瘤異種移植中，進一 步評估藉著CMC-544法製造的CMC-544。在這些研究中，使 用兩個B-細胞淋巴瘤腫瘤，RAMOS和RL。RL淋巴瘤是非-伯吉特氏NHL-衍生物的細胞株，而RAMOS則是一開始衍生 自伯吉特氏淋巴瘤的。在圖18中出示的代表性實驗中，顯 示CMC-544及其老鼠抗體配對物，以劑量-依賴性之方式， 有效地抑制了 RAMOS B-細胞淋巴瘤的生長》 顯示人類化抗體的共輛物，比其老鼠配對物更有效。在 本研究中，能夠引起淋巴瘤之明顯生長抑制的最低劑量之 卡奇黴素共輛物，為10微克/公斤之共輛的NAc-γ卡奇黴素 DMH。相反的，未共軛的抗體G5/44，以類似共軛物之時間 表，腹腔内投予10毫克/公斤，對腫瘤生長沒有影響。 使用RL淋巴瘤模式，進行類似的研究。表6顯示三個獨立 實驗的組合分析，其中在在裸鼠上，分期至尺寸300-400毫 克之RL NHL腫瘤中，評估CMC-544之抗-腫瘤效果。在3-週的時間體制内，CMC-544以劑量依賴之方式引起腫瘤退 化。從這些研究的統計分析中，建立CMC-544在RL淋巴瘤 模式中的最低有效劑量，以卡奇黴素内含量為基礎，為20 微克/公斤。在這三個研究的任一個中，都沒有死亡。較高 劑量（60-320微克/公斤）的CMC-544，幾乎導致RL淋巴瘤的 完全退化。總而言之，藉兩個B-細胞淋巴瘤模式所獲得的 結果，清楚地證實了 CMC-544引起腫瘤退化的能力。 85073.doc -77· 表6: CMC-544在裸鼠中對抗RLNHL異種移 植的抗-腫瘤效力___ - 卡奇黴素劑量 微克/公斤 平均相對的 腫瘤生長1 % T/C2 Ρ-值對媒劑 媒劑 6.74 - - 20 2.87 43 o.oii 40 1.34 20 &lt;0.001 60 0.58 9 &lt;0.001 80 0.54 8 &lt;0.001 160 0.21 3 &lt;0.001 320 0.10 1 &lt;0.001 按照（在第3週的腫瘤質量/在第1天的腫瘤質量）計算每隻 動物的相對腫瘤生長（RTG) 2 100 (CMC-544給藥的平均RTG/媒劑組的乎均RTG) 3得自CMC-544對媒劑之單側t_檢定比較的ρ·值，使用範圍_ 轉換的RTG作為反應變數。所有t_檢定的誤差項均以集合的 里盖.為基礎’ s2，跨越所有處理組（s2=154 54)__ 亦使用RAMOS和RL淋巴瘤模式兩者，調查藉著新製程製 造之CMC-544抑制廣泛建立之心細胞淋巴瘤異種移植之生 長的能力。容許腫瘤生長，並在腹腔内投予cmc_544或可 匹敵之同型物的陰性對照組共輛物（CMA_676)之後，分期至 L5或2克的腫瘤團塊，在第卜5和9天時，以16〇微克/公斤 之共軛的卡奇黴素，維持給藥的原始時間表。㈣的給藥 時間表，顯示較早引起小的分期腫瘤之長期持續的退化(參 85073.doc •78- 1379693 見表6)。如同在圖19中所示’對攜帶大的RAMOS淋巴瘤之 老鼠投予CMC-544，導致預先存在之淋巴瘤團塊的逐漸退 化，並在20天之後，4隻攜帶腫瘤的老鼠中，有3隻沒有腫 瘤了。監視這些沒有腫瘤的老鼠最多50天，未顯示任何已 退化之RAMOS淋巴瘤的再度生長。相反的’可匹敵之同型 物的對照組，CMA-676，對腫瘤的生長沒有影響。5隻 CMA-676處理之攜帶大腫瘤的老鼠中’4隻在第15天之前就 被犧牲了，因為牠們的腫瘤負荷達到接近其體重的15%。 在RL淋巴瘤模式中，進行使用CMC-544的類似實驗。按 照前述，在類似的時間表上，以160微克/公斤之劑量，腹 腔内注射CMC-544，在30天内引起&gt;90%之RL淋巴瘤的現存 團塊退化。然而，在45天之後，在這組中具有已萎縮之淋 巴瘤的2隻老鼠顯示出腫瘤的再度-生長。這些結果表示 CMC-544能夠導致小的和大的已確立之淋巴瘤的退化。在 本文中未顯示的少數研究中，再度以CMC-544再處理在最 初CMC-544-引起的退化之後，散發性地再度-生長之RL淋 巴瘤。這些研究顯示RL腫瘤仍對利用CMC-544處理的第二 次過程產生反應，並再度退化。因此，利用CMC-544的處 理，可有效對抗小和大質量的B·細胞淋巴瘤，並具有重複 治療的效力。 II.在活體内比較以CMA-676和CMC-544共軛法製造的共軛物 圖2〇顯示其中使用標準給藥時間表，使攜帶分期之RL淋 巴瘤的老鼠接受兩種不同劑量（8〇和32〇微克/公斤共軛的卡 奇黴素）、使用CMA-676共軛法和cMC_544共軛法製造的 85073.doc -79. 1379693 CMC-544之代表性實驗的結果。如同預期的，觀察到抗-腫 瘤效力是劑量·依賴性的，且在兩種CMC_544製品的效力上 並沒有差異。相反的，以⑽微克/公斤，腹腔内投予未共 輛之N-乙酿基卡奇黴素DMH，是無活性的。然而，應該 強調的是，對每個劑量的共軛卡奇黴素而纟，以共軛物形 式投予之抗體蛋白質的含量，藉著CMA-676法製造的 CMC-544比藉著CMC-544法製造的更高4倍。因為瞒準共輛 物的卡奇黴素内含# ’主要負責引起抗_腫瘤的效果，可能 經由使用新製程製造之共輛物，來遞送卡奇黴素時所需要 的用量，比瞄準抗體的量少很多。在效力上，增加藉著 CMC-544法製造之共軛物的裝載，係歸因於缺乏大量的低 共軛部分（LCF)。 III•利妥昔單抗（美羅華TM)_抵抗力腫瘤的治療 下一個欲探究的問題，是在停止市售之抗&lt;〇2〇利妥昔單 抗（美羅華TM)治療之後生長的B-細胞淋巴瘤，是否仍將對 CMC.544治療有反應。為了這個目的，以利妥昔單抗（美羅 華™)處理正在發育中（未分期）的尺[淋巴 瘤3週。只要繼續利 安昔單柷（美羅華1^)治療，便抑制^^^淋巴瘤的生長。當停 止利妥昔單抗（美羅華tm)治療時，RL淋巴瘤迅速地生長至 大約1克團塊的尺寸，此時以16〇微克/公斤之腹腔内劑量的 CMC-544處理它們。如同在圖21和22中所示，這些RL淋巴瘤 仍對CMC-544起反應，有8〇%的老鼠在6〇天後變成沒有腫瘤 的。因此，CMC-544能夠以3個劑量引起b-細胞淋巴瘤的退 化，這僅能藉著連續的利妥昔單抗（美羅華TM)給藥抑制之。 85073.doc -80 - 1379693 實例8 CMC-544在活體外和在活體内的影響 I.結合和毒性研究 評估CMC-544與CD22的結合作用，並評估其在在活體外 和在活體内之模式中的活性。亦比較CMC-544和CMA-676 ’ hP67.6 (IgG4)與AcBut連接之卡奇徽素的可匹敵之同型物 的對照組共軛物，和利妥昔單抗（美羅華TM)，一種嵌合型 IgGl 抗-CD20 mAb (IDEC Pharmceuticals，San Diego，CA)， 其為市售的，並購自 Medworld Pharmacy (Chestnut Ridge, NY)。在G5/44結合功能部位研究中，使用下列的抗體：BU12 (Celltech, Slough, UK); BLCAM, HD239 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA); RFB-4 (Ancell Corp, Bayport, MN); SHCL-1, Leu 14 (Becton Dickinson, Franklin Lakes，NJ); 4KB128和 To 15 (Dako Corp, Carpinteria, CA); M6/13和 M5/44(Celltech， Slough, UK)。在阻斷研究中使用的額外抗體是SJ10 (Immunotech，Fullerton, CA)和 M17.1.1，M19.1.1，M38.1.1 (Celltech Slough，UK)。可供研究的細胞株包括伯吉特氏淋巴 瘤細胞株Ramos (CRL-1923)和非-霍奇金氏淋巴瘤（NHL)細 胞株RL (CRL-2261)，均獲自美國典型培養物收集中心 (American Type Culture Collection)。藉著聚合酶連鎖反應黴 漿菌檢測測定（ATCC，Manassas, VA)，判定細胞株是無黴漿 菌的。在加入10% FBS，10 mM HEPES ’ 1 mM丙酮酸鈉，0.2% 葡萄糖，青黴素G鈉100單位/毫升和硫酸鏈黴素1〇〇微克/毫 升的RPMI培養基中，以懸浮培養物之形式維持細胞株。 85073.doc -81- 1379693 藉著BIAcore分析，使用固定Fc-CD22之BIAcore CM5晶片 ，評估G5/44是否可抑制對CD22具有已知專一性之老鼠 mAbs的結合作用。比較先前有或無已固定之&quot;FC-CD22與 G5/44的飽和作用，所獲得的表面等離子體激光共振單位 (RU)。使用BIACORE 2000進行生物分子交互作用分析。使 抗體越過空白的對照組表面（流動池1，作為對照組，沒有 蛋白質被偶聯），和FC-CD22之測試表面（流動池2)，經由胺偶 聯化學，以9,042 RU之含量，固定在CM5感應晶片上。所得的 感應器圖（sensorgram)，是在流動池2上的反應（RU)減在流 動池1上的反應（RU)。藉著首先以G5/44 (100微克/毫升）使 流通池飽和，在導入先前已經定出其結合特徵之對抗CD22 的老鼠mAbs，獲得第二個感應器圖。在測量G5/44反應時， 立刻分別灌注老鼠抗-CD22 mAbs，不移除G5/44。亦記錄產 生第二個混合反應，歸因於老鼠抗-CD22 mAb對G5/44-塗覆 之CD22的結合作用。若老鼠抗體是在與被G5/44佔據的那些 無關之位置與CD22結合，此時混合的反應將是加成的。若 G5/44對CD22之結合作用，干擾或妨礙了二級抗體的結合作 用’此時混合的反應將不是加成的。針對G5/44:CD22交互 作用的“關閉速率”，修正每個二級混合測量。 G5/44僅阻斷與CD22之抗原決定位A/類Ig功能部位1 (SHCL1 Leu 14和HD239)結合的那些抗體的結合，表示 G5/44亦在CD22的該功能部位中結合。與CD22之抗原決定 位B/類Ig功能部位3 (RFB-4)、CD22之抗原決定位C/類Ig功 能部位4 (To 15)和CD22之類Ig功能部位2 (4KB128)結合的 85073.doc -82- 1379693 抗體，不會被G5/44阻斷。這些結果表示在CD22上的G5M4-結合位置，係位在第一個類Ig功能部位’因為它阻礙了那 些認得CD22的第一個類Ig功能部位（抗原決定位A)之抗 -CD22 mAbs的結合作用。其他的抗-CD22抗體，M6/13
(Celltech，Slough, UK)，具有未知的感受性’亦被G5/44阻 斷（Celltech，Slough，UK)，因此對CD22之抗原決定位A/類Ig 功能部位1，進行M6/13的結合位置作圖。抗體M5/44，G5/44 的老鼠親代，具有與G5/44相同的專一性’抑制G5/44的結 合，並作為陽性對照組。抗-CD19抗體BU12則在這些評估 中，作為陰性對照組。在表7中概述結果。 表7:具有已定義之專一性的老鼠抗-CD22 mAb ’ 與G5/44-預先處理之Fc-CD22的結合作用。
以表面等離子體激光共振單位（RU)表現結合反應 抗體 CD22之抗 原決定位Ig 功能部位 #3544 之&gt;^^1 在二級抗-CD22mAb 之 後之域2 磁3( ΜΛ 2-1) 就G544^“ 關閉速率” 調整的反 應3 沒有就背景 調整G544 之二級mAb 的結合作用 被G5徘p 制(％) 抗 CD22 SHCL-1 Leul4 A 1,2 654.3 579.8 -74.5 9 29.3 69 抗 CD22 HD239 A 1 710.5 628.7 -81.8 1.7 19.3 91 抗 CD22 M6/13 ? 9 710.0 652.7 -57.3 26.2 152.4 83 抗 CD22 RFB-4 B 3 703.5 1108.5 405 488.5 534 9 抗 CD22 4KB128 ? 2 691.0 1343.5 652.5 736.0 738.8 0 抗 CD22 To 15 c 4 676.9 1163.6 486.7 570.2 614.6 7 抗 CD22 Μ 5/44 陽性 對照組 725.1 679.3 -45.8 37.7 613.9 94 抗 CD 19 BU12 陰性 對照組 686.2 602.7 -83.5 0 0 0 85073.doc -83- 1379693 使用對CD22之個別功能部位具有已知結合專一性的老 鼠mAbs，調查G5/44阻斷這些抗體與B細胞結合的能力。此 外，亦調查mAbs阻斷G5/44與B細胞結合的能力。在這些研 究中，在使細胞暴露在G5/44 (10微克/毫升）下之前，先在4°C 下，使lxlO5個Ramos細胞暴露在老鼠抗-CD22抗體（10微克/ 毫升之人類化G5/44或老鼠單株抗-CD22)下1小時。在4°C下 培養細胞額外1小時。在抗體處理之後，吸移B細胞，並以 PBS-l°/〇 BSA沖洗，並在4°C下，加入100微升，以PBS-1% BSA 1:100稀釋之適當的二級抗體（FITC-山羊抗-人類（重和輕鏈） 或FITC-山羊抗-老鼠（重和輕鏈））30分鐘。再度吸移細胞， 沖洗，並再懸浮於PBS-1% BSA中，然後加至含有250微升 PBS-1%甲醛的試管中。藉著流動細胞計數，使用BD FACSort流動細胞計數器，測量與細胞結合的螢光強度。 結果顯示之前使CD22+ B細胞暴露在G5/44下，結果導致 後續抗-CD22 mAbs M5/44和M6/13之結合作用的明顯抑制 。相反的，抗-CD22 mAbs RFB4，To 15，HD239和 4KB對 B 細胞的結合作用，並未被G5/44抑制。藉著流動細胞計數， 檢測到缺乏G5/44對HD239與B細胞結合的明顯抑制是意料 之外的，尤其是因為BIAcore分析指出，G5/44可阻斷HD239 對CD22的結合作用。可以在其對CD22之相對親和力上的差 異為基礎，來解釋缺乏G5/44對HD239結合的強抑制作用。 當針對其抑制G5/44對CD22+ B細胞之結合作用的能力，檢 查上文的老鼠抗-CD22 mAbs時，SCHL1和M6-13，但不是其 他抗-CD22 mAbs，抑制了 G5/4.4的結合作用。已經對CD22 85073.doc -84- 1379693 的第一個類Ig功能部位，進行HD239和SHCL1之結合抗原決 定位的作圖。然而，並未對由M6/13或M5/44認出的抗原決 定位作圖。上文詳述的阻斷研究，指出上文的抗體認得位 在CD22之第一個類Ig功能部位上的抗原決定位，集體地稱 為抗原決定位A。 將2萬個Ramos細胞與各種劑量的CMC-544，有或無利妥 昔單抗（美羅華TM)，一起培養96小時。在96小時之後，藉著 流動細胞計數’分析藉著破化丙鍵（Propidium iodide)排阻測 量的細胞存活力。計算3至6孔的平均存活力，並對各種處 理計算細胞存活力的劑量反應抑制。從濃度〇之CMC-544， 計算細胞存活力的背景反應抑制。使用對數回歸，測試 CMC-544是否在0.01至3毫微克之卡奇黴素DMH/毫升的劑 量範圍内，引起在統計上顯著之Ramos細胞生長的劑量依賴 性抑制作用。亦使用對數回歸，判定CMC-544與利妥昔單 抗（美羅華tm)之交互作用，是否在統計學上是顯著的。亦計 算中間抑制濃度（IC5〇)，並記錄每種處理相對於僅以 CMC-544處理的效力。使用在SAS 8.2版中的PROBIT程序， 進行統計學分析。 研究的結果顯示，CMC-544在0.01至3毫微克卡奇黴素 DMH/毫升的劑量範圍内，引起Ramos細胞生長的劑量-依賴 性抑制作用。單獨CMC-544的中間抑制濃度（IC5〇)為0.029毫 微克/毫升。將濃度2、20和200微克/毫升的利妥昔單抗（美 羅華TM)加至CMC-544處理過的細胞中，判定利妥昔單抗（美 羅華TM)與CMC-544之胞毒性活性的交互作用，是否在統計 85073.doc •85- 1379693 學上是顯著的。以20和200微克/毫升加入利妥昔單抗（美羅 *TM)，沒有CMC-544，對細胞生長本身並沒有顯著的影響（分 別為111.7%和94.0%的媒劑生長）。當與〇]^(：-544混合時，所 有三種濃度的（美羅華TM)均在統計學上產生顯著地（p&lt;0.05) 轉移，至CMC-544劑量-反應曲線之斜度和截取點的左邊。2 和200微克/毫升利妥昔單抗的組合，在劑量-反應曲線中產 生最大的轉移。這2個曲線彼此在統計學上並無差異，但在 統計學上，與20微克/毫升之劑量組合是顯著不同的（p&lt;0.05) 。第二個研究（未報告結果）證實了在第一個研究中觀察到的 結果。2、20和200微克/毫升之利妥昔單抗（美羅.TM)加 CMC-544之組合的中間抑制濃度，分別是0.0072、0.0081和 0.0072毫微克/毫升。CMC-544加利妥昔單抗（美羅華™)之中 間抑制濃度，比單獨CMC-544的IC5〇更有效大約4倍。 II.在SCID老鼠中，皮下異種移植和全身散播性B-細胞淋巴 瘤的在活體内之抗-腫瘤活性
給予18-22克雌性無胸腺裸鼠，全身照射（400雷德）。照射 進一步壓抑老鼠的免疫系統，以便提高腫瘤的接納。在照 射之後3天，以在Matrigel中的107 RL細胞（Collaborative Biomedical Products, Belford, ΜΑ,以 RPMI培養基稀釋 1:1) ，在背右側腹處，以皮下注射老鼠。當腫瘤達到適當的尺 寸時（0.3克，通常在21天之後），以0.2毫升/老鼠，腹腔内投 予在生理鹽水中的CMC-544、利妥昔單抗（美羅華ΤΜ)或 CHOP療法（參見下文）。將開始投藥的那夭視為第1天。在第 5和9天，給予2次額外的劑量（治療=每4天一次x3次）。CHOP 85073.doc -86- 1379693 療法由環鱗 Si 胺（C)，（CytoxanTM，Bristol-Meyers Squibb Co.， Princeton，NJ) 40毫克/公斤腹腔内；阿黴素HC1(H) (81呂11^-八1(11^11，&lt;3〇.，811^〇1^，]^0)3.3毫克/公斤腹腔内；長 春新驗（0)(GensiaSicor Pharmaceuticals，Irvine，CA)0.5毫克 / 公斤腹腔内以及強的松（P)(Roxane Labs.，Columbia，OH) 0.2 毫克/公斤口服所組成。CHO根據與CMC-544和利妥昔單抗（ 美羅華TM)(每4天一次x3次）兩者相同的給藥時間表投藥，而 每隔一天口服投予強的松，總共5個劑量（每2天一次x5次） 。每週至少測量腫瘤一次，並按照腫瘤質量（克）=〇.5(腫瘤 寬/2)(腫瘤長）來計算之。計算SEM，並使用多T-檢定，與媒 劑-處理組比較統計顯著性。記錄組平均值最多50天，或直 到老鼠死亡（其中斷組平均值），或腫瘤生長太大（&gt;3.5克）並 將老鼠安樂死為止。之後，僅記錄在所有處理組中，每隻 老鼠個別的腫瘤團塊。亦記錄每個處理組中，在每個實驗 結束時無腫瘤老鼠的數目。 欲判定CMC-544單獨或與其他生物活性劑混合對散播性 淋巴瘤的影響’使用SCID老鼠模式。經由尾靜脈，以1〇6 Ramos細胞（0.2毫升）注射20-25克的雄性SCID老鼠（CB17 SCID)。在細胞注射之後3或9天，腹腔内投予老鼠媒劑、共 軛物（CMC-544或CMA-676)或利妥昔單抗（美羅華TM)，總共3 個劑量。關於3天的處理時間表，在第3、7和11天時投藥給 老鼠。關於9天的處理時間表’在第9、13和17天時投藥給 老鼠。在第9天的處理時間表’亦按照下述給予cmC-544和 利妥昔單抗（美羅華TM)的組合。每天監視老鼠後肢麻痒的出 85073.doc -87- 1379693 現’此時將老鼠殺死。每個處理組使用7至1〇隻老鼠。均計 算每组的平均存活時間（+SD)、中間值、最低和最高存活時 間。藉著使用非參數Log-排列檢定，以在〇 〇5水準報告的顯 著性’判定在各組之間存活分佈上的差異。使用Kaplan_ Meier法，建構存活曲線。 最初的研究檢查兩種不同的給藥時間表，對患有散播性 淋巴瘤之SCID老鼠之存活時間的影響。注意第一個研究是 在靜脈内注射腫瘤細胞之後3天開始藥物的給予（發育模式） ’而第二個研究延遲了藥物的給予，直到腫瘤細胞注射之 後9天才開始（確立模式）。在每個研究中，每隔4天腹腔内投 予CMC-544 (160微克/公斤）、CMA-676 (160微克/公斤）或利 妥昔單抗（美羅華™)(20毫克/公斤）（每4天一次χ3次卜在發 育模式中，以媒劑處理的老鼠具有27天之平均存活時間（圖 23，表8)。CMA-676，CMC-544的可匹敵之同型物對照组， 未明顯地增加存活時間（ρ&gt;0.〇5)。CMC_544明顯地増加存活 時間至41天，而利妥昔單抗則有深遠的影響，增加存活時 間至&gt;125天（明顯比CMC-544更高，p&lt;〇.〇5)。延遲投藥直到腫 瘤細胞有機會散播（成家）並存放在標靶组織内（確立模式） ，改變了 CMC-544和利妥昔單抗（美羅華τΜ)的結果。 CMA-676再度對存活時間沒有顯著影響（圖24，表8”利妥 昔單抗（美羅華TM)增加平均存活時間至62·6天，而cmc_544 改善了平均存活時間至83 5天。在確立模式中，在cmc_544 和利妥昔單抗（美羅華tm)的影響之間，沒有顯著差異。 85073.doc -88- 表8 :存活時間的描述測量 研究 化合物 平均存 活時間 中間存 活時間 標準差 最低存 活時間 最高存 活時間 動物的 數目 發育 模式 CMA-676 32.9 34.0 3.9 28.0 36.0 7 CMC-544 41.0 38.0 10.1 32.0 60.0 7 利妥昔單抗 128.4 &gt;130.0 4.7 119.0 &gt;130.0 7 媒劑 27.2 28.0 1.4 25.0 28.0 8 確立 模式 CMA-676 33.7 31.0 4.6 30.0 42.0 7 CMC-544 83.5 76.5 41.6 34.0 &gt;130.0 8 利妥昔單抗 62.6 37.0 46.2 31.0 &gt;130.0 7 媒劑 30.5 29.0 3.6 27.0 36.0 8 1379693 進行預備研究，判定利妥昔單抗（美羅華TM)對CMC-544 的存活反應，是否具有任何陽性或陰性的影響。在有或沒 有利妥昔單抗（美羅·ΤΜ)(20毫克/公斤，標示為高劑量藥物 組合（HD))之下，投予CMC-544 (160微克/公斤）。此外，將 較低劑量的CMC-544 (80微克/公斤）與低劑量的利妥昔單抗 (美羅華^八⑺毫克/公斤）共同投予。沒有分別給予個別的80 微克/公斤或10毫克/公斤劑量之化合物，因為在研究中有限 的老鼠數目。將該組合，CMC-544 (80微克/公斤）與利妥昔 單抗（美羅華^)(10毫克/公斤）標示為中間劑量組合（MD)， 並進行之，以便判定較低劑量組合之藥物，對SCID老鼠存 活的可行性。按照在上文已確立之模式中報告的，進行 CMC-544 (160微克/公斤）和利妥昔單抗（美羅華TM)(20毫克/ 公斤）的單獨投藥。每組延長平均存活時間，分別至5 8.5和 85073.doc 89· 1379693 50.5天（圖25，表9)。在組合中，高劑量組合的平均存活時間 稍微（雖然在統計學上不是顯著的，p&gt;0.05)改善至64.4天。 80微克/公斤CMC-544和10毫克/公斤利妥昔單抗（美羅華™) 之中間劑量組合顯著地（p&lt;0.05對媒劑處理的）改善存活時 間，至平均92.4天。這些結果暗示較低劑量組合的CMC-544 和利妥昔單抗（美羅華™)被證明是合理的。 表9 :最初組合研究之存活時間的描述測量 化合物 平均存 活時間 中間存 活時間 標準差 最低存 活時間 最高存 活時間 動物的 數目 CMC MD + 利妥昔單抗md 92.4 &gt;100.0 16.0 62.0 &gt;100.0 10 CMC HD + 利妥昔單抗HD 64.4 58.5 26.7 29.0 &gt;100.0 10 CMC-544 58.5 34.5 35.8 27.0 &gt;100.0 10 利妥昔單抗 50.5 41.0 26.4 30.0 &gt;100.0 10 媒劑 31.0 27.0 9.7 27.0 56.0 9 CMCMD=CMC-544中間劑量，80微克/公斤 CMCHD=CMC-544高劑量，160微克/公斤 利妥昔單抗MD=利妥昔單抗中間劑量，10毫克/公斤 利妥昔單抗HD=利妥昔單抗高劑量，20毫克/公斤 進行利用CMC-544和利妥昔單抗（美羅華TM)的進一步組 合研究。進行下列的治療組：40、80和160微克/公斤之 CMC-544 ; 5、10和20毫克/公斤的利妥昔單抗（美羅華™); 以及40微克/公斤CMC-544加5毫克/公斤利妥昔單抗（美羅 .TM)，80微克/公斤CMC-544加10毫克/公斤利妥昔單抗（美 85073.doc • 90- 1379693 羅華TM)和160微克/公斤CMC-544加20毫克/公斤利妥昔單 抗（美羅華TM)。所有劑量的利妥昔單抗（美羅華tm)均稍微改 善平均存活時間至33-40天的範圍’（所有劑量與媒劑_處理 之25.8天的平均存活時間相比較，p&lt;〇.〇5，圖26，表1〇)。 高劑量的CMC-544, 160微克/公斤，改善平均存活時間至85 天，與在較早兩個研究中報告的結果一致《混合cmc_544 與利妥昔卓抗（美羅華τ )’在存活時間上沒有造成明顯的改 善（圖27，表10) β兩個較低劑量的CMC-544 (8〇和40微克/ 公斤）’分別明顯地改善了（ρ&lt;0.05)平均存活時間，超過高 劑量的CMC-544。至於40和80微克/公斤劑量之CMC-544， 分別有90%和80%老鼠仍存活至125天。兩種藥物混合組均 有100%老鼠存活直到125天。較低劑量的CMC-544比160微 克/公斤之高劑量更有效。 與CMC-544混合的利妥昔單抗（美羅華ΤΜ)，在SCID老鼠之 散播性Β-細胞模式中，以受試之劑量（參見上文），對 CMC-544之活性並無明顯的影響。亦在Balb/c裸鼠中，使用 皮下RL B淋巴瘤異種移植模式，評估CMC-544與利妥昔單 抗（美羅華以)共同投予’是否產生增強或抑制抗-腫瘤活性 的結果。在皮下B淋巴瘤模式中，使腫瘤分期至300毫克之 平均腫瘤質量，隨後以IP投予在研究中的兩個治療劑。使 用20或80微克/公斤每4天一次x3次的CMC-544，有或無利妥 昔單抗（美羅華TM)(2〇毫克/公斤每4天一次x3次）利妥昔單抗 (美羅，TM)之共同-投藥，不明顯地提高也不抑制（p&gt;〇.05) CMC-544的治療效果（圖28)。單獨投予利妥昔單抗（美羅華tm) 85073.doc •91- 1379693 ，在本研究中抑制了 RX B淋巴瘤生長（在第2〇天抑制57%的 腫瘤生長，p&lt;0.05對媒劑_處理組），類似在低劑量CMC_544 處觀察到的。 組合化療攝生法CHOP (環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和 強的松）是非-霍奇金氏淋巴瘤患者最常用的治療用藥方式 在已確上之RL B淋巴瘤異種移植中，比較chop和 CMC-544的抗-腫瘤效果。使用它們在裸鼠中評估之各自最 大耐受劑量（未報告資料），使用CH〇p攝生法的個別組份， 且劑量如下：環磷醯胺（(：）4〇毫克/公斤腹腔内，阿黴素 3.3毫克/公斤腹腔内，長春新鹼（〇) 〇 5毫克/公斤腹腔内和 強的松（P) 0.2毫克/公斤口服。CHO是每4天一次X3次投予， 而Ρ是口服投予，每2天一次χ5次。CMC_544是以16〇微克/ 公斤之卡奇黴素當量，每4天一次χ3次腹腔内投予。CH〇p 療法取初導致RL B淋巴瘤生長的明顯抑制（圖29)。然而，3 週之後’腫瘤以像媒劑-處理組一樣的生長速率再度生長。 相反的，CMC-544之抗腫瘤效果，在整個實驗期間是完整 且持續的》這些結果暗示CMC-544 ,以比在裸鼠中最大非 致命劑量明顯更低之劑量，比CHOP組合治療更有效。 這些研究顯示將利妥昔單抗（美羅華與CmC_544加在 一起，對RamosB淋巴瘤細胞中觀察到，引起CMC_544之胞 毒活性的明顯增加。最近在Rarn〇S細胞中，亦報告了利妥昔 單抗（美羅華TM)和糖皮質激素的協同交互作用。此外，當利 妥昔單抗（美羅·ΤΜ)與10 μΜ地塞米松混合給予時，在8個 額外細胞株的4個中，觀察到協同的生長抑制。 85073.doc -92- 1379693 報告了利妥昔單抗（美羅華1^)本身，0.4至10微克/毫升， 對Ramos細胞生長引起明顯但小的（最多18%)抑制作用。此 外’當以10微克/毫升培養（48小時培養）時，在8個匕細胞非 -霍奇金氏淋巴瘤細胞株的6個中，是有活性的。Ghetie等人 ’顯示10微克/毫升的利妥昔單抗（美羅華tm)，在與Ram〇s 細胞一起培養24小時之後，在細胞程式死亡方面引起6 2% 的增加（對在媒劑-處理細胞中的3.5%)〇在最近的研究中，單 獨投予20和200微克/毫升之劑量的利妥昔單抗（美羅華TM)時 ’對Ramos細胞生長沒有影響《在老鼠中，在散播性模式或 皮下異種移植的模式中，沒有在CMC-544和利妥昔單抗（美 羅華tm)之間有任何交互作用的證據。受試的藥物組合，未 干擾彼此的效力，也沒有提高它們。必須判定在散播性模 式中’減少每個藥物之劑量是否將改變該觀察。 已Ik由Flavell等人描述了利用Ram〇s細胞的散播性&amp;細 胞淋巴瘤模式。報告了媒劑·處理老鼠的中間存活時間是 34-36天。老鼠發展出後肢麻痒，並進行成為垂死的，之後 馬上死亡。器官的組織學分析顯示最常涉及的器官是腎上 腺、脾臟和蜘蛛膜下腔.蜘蛛膜下腔的浸潤經常延伸至腦 。當在散播性SCID老鼠之疾病過程早期投予時，利妥昔單 抗（美羅華TM)相當盡責（圖23)，但當在模式之確立期中，在 第9天投予時，則較不令人印象深刻（圖24)。利妥昔單抗（美 維華），屬SlgGl同型物，最可能經由老鼠宿主之效應物 機制來運作。這些機制包括補體_調節的胞毒性及/或抗體依 賴性細胞的胞毒性，經由出現在scid老鼠中之自然殺手細 85073.doc -93- 1379693 胞的新兵招募。注射之Ramos腫瘤細胞或許是較易受影響的 ，在宿主免疫機制開始被利妥昔單抗（美羅·ΤΜ)激活時，在 細胞有機會浸潤至受影響的器官内之前《在SCID老鼠之散 播性腫瘤模式中，尚未測試未共輛的G5/44抗體（在CMC-544 中的瞄準分子），但在將其投予皮下異腫移植物時，並沒有 影響。預期G5/44 (為IgG4的同型物）將不會活化宿主之效應 物機制，也因此將不會產生抗-腫瘤活彳生。 卡奇黴素共軛之G5/44 (CMC-544)，以與利妥昔單抗（美羅 華&quot;™)相反的方式運轉，當在疾病之確立期投予時，產生較 佳的結果。CMC-544在確立期更為盡貴的理由並不清楚， 但確立期更密切地代表臨床狀態。CMA-676，可匹敵之同 型物，未接合之對照共軛物，對平均存活時間沒有明顯的 影響。在散播性SCID模式中的結果’清楚地暗示需要降低 CMC-544之劑量，以便判定最大的有效劑量（MED)。160微 克/公斤之劑量，比80和40微克/公斤的較低劑量更不具活性 。不清楚為甚麼這樣，但160微克/公斤之劑量可能超過MED 很多。策畫進一步的研究，來解決邊·¥論點。
Mohammad等人在利用瀰漫性大細胞淋巴瘤細胞株DLCL 皮下異種移植的模式中，使用CHOP療法（環磷醯胺（C)40毫 克/公斤靜脈内；阿黴素（H) 3.3毫克/公斤靜脈内；長春新鹼 (0) 0.5毫克/公斤靜脈内以及強的松（Ρ) 〇·2毫克/公斤口服） 。判定用在CHOP療法中之劑量為其最大耐受劑量。認為一 次靜脈内給予CHO，且每天給予P持續5天的療法是•主動的· ，產生25.8%的T/C。記錄無腫瘤痊癒。在Mohammad等人描 85073.doc -94- 1379693 述之模式中的結果，似乎類似在本文描述之RL模式中，利 用CHOP療法（腹腔内投予，每4天一次x3次）所觀察到的。在 任一個研究中，CHOP均未產生長期的治癒，不像CMC-544。 表10 :組合研究之存活時間的描述測量 處理 平均存 活時間 中間存 活時間 標準差 最低存 活時間 最高存 活時間 動物的 數目 CMC-544 40 微克/公斤 118.90 125.00 19.29 64.00 125.00 10 CMC LD + 利妥昔單抗LD 125.00 125.00 0.00 125.00 125.00 10 CMC-544 80 微克/公斤 118.22 125.00 17.86 71.00 125.00 9 CMC MD + 利妥昔單抗MD 125.00 125.00 0.00 125.00 125.00 10 CMC-544 160 微克/公斤 85.22 82.00 40.37 35.00 125.00 9 CMC HD + 利妥昔單抗HD 91.30 100.00 36.31 44.00 125.00 10 利妥昔單抗5 毫克/公斤 40.70 36.50 9.57 34.00 64.00 10 利妥昔單抗10 毫克/公斤 33.80 34.00 3.26 29.00 41.00 10 利女昔早抗20 毫克/公斤 40.50 34.00 15.45 31.00 82.00 10 媒劑 25.80 25.00 3.12 22.00 34.00 10 CMCLD=CMC-544低劑量，40微克/公斤 CMCMD=CMC-544中間劑量，80微克/公斤 CMCHD=CMC-544高劑量，160微克/公斤 利妥昔單抗LD =利妥昔單抗低劑量，5毫克/公斤 利妥昔單抗MD=利妥昔單抗中間劑量，10毫克/公斤 利妥昔單抗HD =利妥昔單抗高劑量，20毫克/公斤 85073.doc •95- 1379693 實例9 CMC-544的穩定調配物 藉著加入稀釋劑、賦形劑、載劑和穩定劑，製備適合在 活體内投藥之CMC-544的穩定調配物。在111(：層析法之後， 藉著 SEC-HPLC和多浊县 TIV公;i/f，λ
溶液。因為CMC-544可能經由許多降解路徑而經歷降解作 用’故在調配物的發展φ必猪去虛仏im _
’可能發生之卡 可能發生之卡奇黴素_抗體共軛物的沉澱作用減至最低。 在發展單卡奇黴素衍生物_抗體共輛物的調配物中，調
減至最少，並維持適當的共軛物溶解度。使用sds_page* 抗原結合ELISA獲得的額外資料，指出在8〇之1)11值時，仍 維持明顯的結構完整和抗體之專一性。因此，選擇三甲醇 氨基甲烷作為緩衝劑，以便維持8〇之？11值。另一種緩衝劑 可包括二價磷酸鈉或鉀。緩衝劑之濃度範圍可以是$至 m M。暗示7.5至8.5之較佳的P Η值範圍最適合穩定性/溶解度 。目前特別適合終產物之ρΗ值為7 〇_9(^ 又 85073.doc -96- 1379693 雖然經過緩衝之共輛物溶液的穩定性對於短期而言是足 夠的，但長_定性仍不佳M吏料♦乾燥來改善=物 的儲存壽命。已為了與蛋白質溶液之冷來乾燥有關的問題 提供无分的文件，且在冷凍和乾造燥過程中可能發生二級 、三級和四級結構的喪失。將篇糖納入調配物中7作為丑 辆物的非晶形穩定劑，並在冷;東和乾燥期間，維持抗體^ 結構完整。已經使用濃度⑴⑽重量/體積的贿。此外 ，亦可以按重量計0.5.L5%之濃度，併人聚合填充劑，像是 葡聚糖4G或經乙基殿粉，以便提高冷;東乾燥餅之外觀和物 理剛度。這些形成冷;東乾燥餅的材料是以相對上較低的濃 度，並可用來使冷凍乾燥配方之整體固體内含量減至最少 ，因此容許更快速地冷凍乾燥。調配物研究已經使用按重 量計濃度為0.9%的葡聚糖40。 將多乙氧基醚80併入調配物中，提高共輛物的溶解度。 使用0.01%的較佳濃度，而有效範圍是〇〇〇5%_〇〇5%。亦以 按體積計0.91-0.05%之濃度，將吐溫加至調配物中。 在配方中亦可出現電解質，並可用來改善終純化方法。 通常使用0.01 Μ至0.1 Μ之濃度的氯化鈉。亦可使用額外的 電解質，像是硫酸鈉，來置換氣化鈉，因為其可能較易被冷 凍乾鉍。最佳的疋’最後的CMC-544溶液包括1.5。/。蔗糖（按重 量計），0.9%葡聚糖40 (按重量計），〇〇1%吐溫8〇，5〇爪撾 氣化納，0.01 %多乙氧基鍵80 (按重量計）和2〇爪厘三甲醇氨 基甲燒。 在下文中提供在冷來乾燥之前的溶液之代表性配方： 85073.doc -97- 1379693 CMC-544 0.5毫克/毫升’蔗糖1.5%按重量計，葡聚糖4〇 〇 9〇/ 按重量計，氯化鈉0.05 Μ，吐溫0.01-0.05%按體積計，容 夕乙 氧基酸80 0.01 %按重量計，三甲醇氨基曱淀〇 〇2 Μ，pH 8 〇 和水。在+5°C至10°C(最好是在+5。〇的溫度下，將溶液分 送至琥拍色小瓶中；在-35T：至-50°C(最好是_45。〇的冷;東溫 度下冷凍該溶液；使已冷凍的溶液在2〇至80微米（最好是6〇 . 微米）的最初乾燥壓力下，接受最初的冷凍乾燥步驟；將已 冷凍乾燥的產物維持在_1〇。(：至_4〇°C (最好是_3〇。(：）之存放 ' 溫度下24至72小時（最好是60小時）；且最後使已冷凍乾燥的 _ 產物在20-80微米（最好是6〇微米）的乾燥壓力下，在+ 1〇&lt;5(：至 +35 C (最好是+25 C )的存放溫度下，接受二級乾燥步驟叉$ 至30小時（最好是24小時）。使用壓力升高試驗，判定最初乾 燥的終點。在冷凍乾燥循環終了時，以氮氣回填小瓶，並 塞住。 表11陳述CMC-544使用之調配物與CMA_676使用之調配 物上的差異。在CMA-676調配物和CMC-544所使用之調配 物之間的明顯差異，包括在新的調配物中，降低蛋白質濃鲁 度（0.5 φ克/¾升），使用三甲醇氨基甲烷作為緩衝劑以及· 0.01%吐溫80的出現。在新調配物中，重建CMC_544的結果 ' 疋澄清的，與在重建CMA_676調配物時所見的混濁相反（參 見表12和13)。 85073.doc -98- 表11 :針對CMC-544，比較CMA-676調配物 和 CMC-544i芦 配物 CMA-676調配物 CMC-544調配物 蛋白質濃度 1.0毫克/毫升 0.5毫克/毫升 調配物 1.5%蔗糖，0.9%葡聚 糖40，100 mM氯化鈉 ，5 mM磷酸緩衝液 1.5%蔗糖，0.9%葡聚糖40 ，0.01%吐溫 80，.01% 多乙 氧链80，50 mM氯化鈉， 20 mM三甲醇氨基甲烷 1379693 表 12 :在 5°C 下針對 CMC-544，CMA-676和 CMC-544調配物 之穩定性和物理-化學觀察 CMA-676調配物 CMC-544調配物 時間 最初 2週 最初 2週 物理觀察 稍微混濁 稍微混濁 澄清 澄清 pH值 7.5 7.5 7.8 7.8 總蛋白質 1.07 1.07 0.52 0.52 (毫克/毫升） 總卡奇黴素 67 67 57 57 (微克/毫克蛋白質） 未共輛之卡奇黴素 1.21 2.82 0.97 1.13 (微克/毫克蛋白質） 聚集體％ 3.03 2.81 1.59 1.70 85073.doc •99- 表13:冷凍乾燥和 配 w 储存在 25 C 下之 CMA-676 和 cMC_544 調 觀察 時間 重建共基察
稍微混濁稍微混濁 7.5 1.03 總卡奇黴素 (微克/ ¾克蛋白質y 未共軛之卡奇黴素 (微克/ ¾克蛋白質、 聚集體％ 67 1.13 2.63 CMA-676^j&amp; 物 7.5 1.03 67 1.03 2.96 CMC-544調配物 最初 4週 澄清 澄清 7.8 7.8 0.51 0.51 57 57 1.03 0.94 1.49 2.09 ^ J ----- 1「了 n , Μ 7丨川的万式制 本文中在上文-確認的專利說明書中，包括許多本發胡 的^改和變化’並預期對熟諳此藝者而言是明顯的。咸^ 信這類針對共_方法、藉著該方法製造之共輛物以及包相 該共軛物之組合物/調配物的修改和改變，均包括在中請肩 利範圍的範園内。 【圖式簡單說明】 圖.1顯示老鼠單株抗體5/44之CDRs的胺基酸序列（序列袁 別1至6號）。 圖2顯示老鼠單株抗體5/44之輕鏈可變（VL)功能部位的 DNA和蛋白質序列。 圖3顯示老鼠單株抗體5/44之重鏈可變功能部位（Vh)的完 85073.doc -100- 1379693 整序列。 圖4顯示移除在CDR-H2中之糖基化作用位置和反應性離 胺酸的策略。 圖5顯示5/44輕鏈序列的移植設計。DPK-9是人類生殖種 系接受者架構序列。垂直線代表在老鼠和人類殘基之間的 差異。加下標線之序列代表已經被保留在移植物中的捐贈 者殘基。以粗斜體字母表示CDRs(對於DPK-9則未顯示）。移 植物gLl有6個捐贈者架構殘基，gL2有7個。 圖6顯示5/44重鏈序列的移植設計；DP7是人類生殖種系 接受者架構序列。垂直線代表在老鼠和人類殘基之間的差 異。加下標線之序列代表已經被保留在移植物中的捐贈者 殘基。以斜粗體字母表示CDRs(對於DP7則未顯示）。移植物 gH4和gH6有6個捐贈者架構殘基。移植物gH5和gH7有4個捐 贈者架構殘基。 圖7顯示載體pMRR14的舆圖。 圖8顯示載體pMRRIO.l的舆圖。 圖9顯示戚合型5/44突變種的Biacore測定結果。 圖10顯示5/44 gHl和gLl基因組合的寡核苷酸。 圖11顯示中間物載體pCR2.1 (544gHl)的質體舆圖。 圖12顯示中間物載體pCR2.1 (544gLl)的質體舆圖。 圖13顯示用來製造更多移植物的寡核苷酸卡匣。 圖14為顯示在螢光標示之老鼠5/44抗體和經移植變種之 間競爭測定的圖。 圖15為顯示在螢光標示之老鼠5/44抗體和經移植變種之 85073.doc -101 - 1379693 間競爭測定的圖。 圖16顯示經移植之重和輕鏈的完整DNA和蛋白質序列。 圖17為抗體-NAc-γ卡奇黴素DMH共軛物的圖解表現。 圖18為顯示CMC-544對RAMOS B-細胞淋巴瘤之生長的 影響的圖。 圖19為顯示在活體内異種移植之模式中，在裸鼠中， CMC-544對大B-細胞淋巴瘤之影響的圖。 圖20是比較使用CMC-544對CMA-676共軛過程所造成之 影響和CMC-544共軛過程對RL淋巴瘤生長之影響的圖。 圖21是顯示經利妥昔單抗（美羅華tm)_治療之大^^^淋巴瘤 ，易感受CMC-544治療的圖。 圖22為顯示利妥昔單抗（美羅華tm)對cmC_544之胞毒效 應的圖。 圖23為顯示CMC-544、利妥昔單抗（美羅華tm)和cma-676 ’對患有散播性早期RAMOS B淋巴瘤之SCID老鼠存活的影 響的圖。 圖24為顯示CMC-544、利妥昔單抗（美羅華tm)和cmA-676 ’對患有散播性晚期RAMOS B淋巴瘤之sciD老鼠存活的影 響的圖。 圖25為顯示CMC-544、利妥昔單抗（美羅華tm)和CMA_676. ’對患有散播性晚期RAMOS B淋巴瘤之SCID老鼠存活的影 響的圖。 圖26為顯示CMC-544、利妥昔單抗（美羅華tm)和cma-676 ’對患有散播性晚期RAMOS B淋巴瘤之sciD老鼠存活的影 85073.doc 102· 1379693 響的圖。 圖27為顯示CMC-544、利妥昔單抗（美羅華TM)和CMA-676 ，對患有散播性晚期RAMOS B淋巴瘤之SCID老鼠存活的影 響的圖。 圖28為顯示與或不與利妥昔單抗（美羅華TM) —起， CMC-544對RL非霍奇金氏淋巴瘤之抗-腫瘤活性的圖。 圖29為顯示CMC-544和CHOP對RL非-霍奇金氏淋巴瘤之 抗-腫瘤活性的圖。 85073.doc 103- 1379693 參考書目 1. 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Asn Tyr Trp lie His 1 5 質 白鼠 217:蛋老 &lt;210〉 &lt;211&gt; &lt;212&gt; &lt;213&gt; &lt;220&gt; &lt;223〉老鼠單株5/44 CDR-H2gLl T3 &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400&gt; 2
Gly He Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys 1 5 10 15
Gly &lt;210 3 &lt;211&gt; 12 &lt;212&gt;蛋白質 85073.doc 1379693 &lt;21&gt;老鼠 &lt;220〉 &lt;223&gt; 老鼠單株5/44 CDR-H3 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 3
Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 &lt;210〉 4 &lt;211&gt; 16 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;老鼠 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 老鼠單株5/44CDR-L1 &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400&gt; 4
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser 15 10 15 &lt;210&gt; 5 &lt;211〉 7 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;老鼠 &lt;220〉 &lt;223&gt; 老鼠單株 5/44 CDR-L2 &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400&gt; 5
Gly lie Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 &lt;210&gt; 6 &lt;211&gt; 9 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;老鼠 85073.doc 1379693 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 老鼠單株5/44 CDR-L3 &lt;220 &lt;221&gt; &lt;400〉 6
Leu Gin Gly Thr His Gin Pro Tyr Thr &lt;210&gt; 7 &lt;211&gt; 113 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;老鼠 &lt;220&gt; &lt;223&gt;老鼠單株5/44gVL功能部位 &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400〉7
Asp Val Val Yal Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly 15 10 15
Asp Gin Val Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser 20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gly lie Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Thr lie Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly 85 90 95
Thr His Gin Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg &lt;210〉 8 &lt;211〉121 85073.doc 1379693 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;老鼠單株5/44 VH功能部位 &lt;220&gt; &lt;223&gt;老鼠單株5/44VH功能部位 &lt;220&gt; &lt;221&gt; ’ &lt;400〉 8
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Trp lie His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Gly lie Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 &lt;210&gt; 9 &lt;211&gt; 13 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt;
&lt;223&gt; cH &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 9
Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly 1 5 10 -4- 85073.doc 1379693 &lt;210&gt; 10 &lt;211&gt; 13 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt;
&lt;223&gt; N55Q &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400〉10
Gly Asn Gin Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly 1 5 10 &lt;210&gt; 11 &lt;211&gt; 13 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220〉
&lt;223&gt; T57A &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400〉11
Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly 1 5 10 &lt;210&gt; 12 &lt;211&gt; 13 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213〉人造的序列 &lt;220&gt;
&lt;223&gt; T57V &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400&gt; 12
Gly Asn Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly 1 5 10 &lt;210&gt; 13 &lt;211&gt; 17 85073.doc 1379693 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; CDR-H2 (T57)A H' &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400 13
Gly lie Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys 15 10 15
Gly &lt;210&gt; 14 &lt;211&gt; 13 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt;
&lt;223&gt; K60R &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400&gt; 14
Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Gly 1 5 10 &lt;210&gt; 15 &lt;211&gt; 17 &lt;212〉蛋白質 &lt;213&gt;人造的序列 ' &lt;220&gt;
&lt;223&gt; CDR-H2(K60R)RHM &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 15
Gly lie Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys 15 10 15
Gly 85073.doc 1379693 &lt;210&gt; 16 &lt;211〉17 &lt;212&gt;蛋白質 人造的序列 &lt;220〉 &lt;223&gt; CDR-H2 (T57A K60R) Η'&quot; &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 16
Gly lie Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys 1 5 10 15
Gly 質 白類 1770蛋人 &lt;210&gt; &lt;211〉 &lt;212&gt; &lt;213〉 &lt;220〉 &lt;223&gt; DPK9 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400〉 17
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 20 25 30
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp 50 55 60
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 &lt;210&gt; 18 &lt;211&gt; 11 &lt;212&gt;蛋白質 85073.doc 1379693 &lt;213&gt;人類 &lt;220&gt; &lt;223&gt; JK1 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 18
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Asp Val Gin Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser 20 25 30
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Arg 85073.doc 1379693 &lt;210&gt; 20 &lt;211&gt; 113 · &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; gL2 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 20
Asp Val Val Val Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ala Asn Ser 20 25 30
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Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gly He Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
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Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly 85 90 95
Thr His Gin Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg &lt;210&gt; 21 &lt;211&gt; 80 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;人類 &lt;220&gt; &lt;223&gt; DP7 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 21 85073.doc 1379693
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Trp Val 20 25 30
Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Lys Phe Gin Gly 35 40 45
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 50 55 60
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Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 &lt;210〉 23 &lt;211&gt; 121 &lt;212&gt;蛋白質 人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; gHl &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 23
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 • 10- 85073.doc 1379693
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Gly Gly lie Asn Pro Gly Asn Gin Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu 50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Mp Thr Λία Val Tyr Tyr Gys 85 90 95
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Gin Giy Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 &lt;210&gt; 24 &lt;211&gt; 121 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; gH4 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 24
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Trp He His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 . 40 45
Gly Gly He Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu 50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 -11 - 85073.doc 1379693
Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 &lt;210&gt; 25 &lt;211&gt; 121 &lt;212&gt;蛋白質 人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; gH5 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400〉 25
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Trp lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Gly lie Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu 50 55 60
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Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Trp lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Gly lie Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe 50 55 60
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Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
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Gly Gly lie Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe 50 55 60
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45
Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys 50 55 60
Pro Gly Lys Ala Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gly lie Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 -14- 85073.doc 1379693
Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110
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Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 &lt;210〉 29 &lt;211&gt; 781 &lt;212&gt; DNA CIS〉人造4岸&quot;列 &lt;220〉 &lt;223&gt;移植輕鏈的完整序列 &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400&gt; 29 ttcgaagccg ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttgg tgcttctgtt gttctggatt 60 cctgcttccc ggggtgacgt tcaagtgacc cagagcccat ccagcctgag cgcatctgta 120 ggagaccggg tcaccatcac ttgtagatcc agtcagagtc ttgcaaacag ttatgggaac 180 acctttttgt cttggtatct gcacaaacca ggtaaagccc cacaattgct catctacgga 240 atctctaaca gatttagtgg tgtaccagac aggttcagcg gttccggaag iggtactgat 300 ttcaccctca cgatctcgtc tctccagcca gaagatttcg ccacttatta ctgtttacaa 360 ggtacacatc agccgtacac attcggtcag ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta 420 gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480 85073.doc -15-
1379693 tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 540 gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 600 agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 660 gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 720 aggggagagt gttagaggga gaagtgcccc cacctgctcc tcagttccag cctgggaatt 780 c 781 &lt;210&gt; 30 &lt;211&gt; 467 &lt;212&gt;蛋白質 &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220 &lt;223&gt;移植重鏈的完整序列 &lt;220〉 &lt;221〉 &lt;400&gt; 30
Met Asp Phe Gly Phe Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu lie Leu Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe 35 40 45
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Glu Trp lie Gly Gly lie Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg 65 70 75 80
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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 -16-
85073.doc 1379693
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460
Leu Gly Lys 465 &lt;210&gt; 31 &lt;211&gt; 2160 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的岸列 &lt;220&gt; &lt;223&gt;移植重鏈的完聱DNA序列 &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400&gt; 31 aagcttgccg ccaccatgga cttcggattc tctctcgtgt tcctggcact cattctcaag 60 ggagtgcagt gtgaggtgca attggtccag tcaggagcag aggttaagaa gcctggtgct 120 tccgtcaaag tttcgtgtaa ggctagcggc tacaggttca caaattattg gattcattgg 180 gtcaggcagg ctccgggaca aggcctggaa tggatcggtg gcattaatcc cgggaataac 240 tacgctacat ataggagaaa attccagggc agagttacga tgaccgcgga cacctccaca 300 agcactgtct acatggagct gtcatctctg agatccgagg acaccgcagt gtactattgt 360 actagagaag gctacggtaa ttacggagcc tggttcgcct actggggcca gggtacccta 420 gtcacagtct cctcagcttc tacaaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc 480 aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660 ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720 aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag 780 ccctcctgcc tggacgcacc ccggctgtgc agccccagcc cagggcagca aggcatgccc 840 catctgtctc ctcacccgga ggcctctgac caccccactc atgcccaggg agagggtctt 900 ctggattttt ccaccaggct ccgggcagcc acaggctgga tgcccctacc ccaggccctg 960 cgcatacagg ggcaggtgct gcgctcagac ctgccaagag ccatatccgg gaggaccctg 1020 cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc agacaccttc 1080 tctcctccca gatctgagta actcccaatc ttctctctgc agagtccaaa tatggtcccc 1140 catgcccacc atgcccaggt aagccaaccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca 1200 ggtgccctag agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cgcatccacc 1260 tccatctctt cctcagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 1320 aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 1380 -18-
85073.doc gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 1440 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1500 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1560 aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccacggg 1620 gtgcgagggc cacatggaca gaggtcagct cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc 1680 tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc 1740 atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1800 ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 1860 cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga 1920 caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 1980 caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaatgagtgc cagggccggc 2040 aagcccccgc tccccgggct ctcggggtcg cgcgaggatg cttggcacgt accccgtcta 2100 catacttccc aggcacccag catggaaata aagcacccac cactgccctg gctcgaattc 2160 &lt;210&gt; 32 &lt;211&gt; 94 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gHlTl &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 32 agtgtgaggt gcaattggtc cagtcaggag cagaggttaa gaagcctggt gcttccgtca 60 aagtttcgtg taaggctagc ggctacaggt tcac 94 &lt;210&gt; 33 &lt;211&gt; 96 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gHlT2 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400〉 33 gtggcattaa tcccgggaat cagtacacta catataaaag aaatctaaag ggcagagcaa 60 cgctgaccgc ggacacctcc acaagcactg tctaca 96 &lt;210&gt; 34 &lt;211&gt; 95 &lt;212&gt; DNA &lt;213〉人造的序列 19- 85073.doc 1379693 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gHlT3 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 34 agagaaggct acggtaatta cggagcctgg ttcgcctact ggggccaggg taccctagtc 60 acagtctcct cagcttctac aaagggccca agaaa 95 &lt;210〉 35 &lt;211&gt; 94 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gHlBl &lt;220〉 &lt;221〉 &lt;400&gt; 35 ggaccaattg cacctcacac tgcactccct tgagaatgag tgccaggaac acgagagaga 60 atccgaagtc catggtggcg gcaagctttt attc 94 &lt;210&gt; 36 &lt;211&gt; 97 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gHlB2 &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400〉 36 gattcccggg attaatgcca ccgatccatt ccaggccttg tcccggagcc tgcctgaccc 60 aatgaatcca ataatttgtg aacctgtagc cgctagc 97 &lt;210&gt; 37 &lt;211&gt; 93 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的居列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gHlB3 20- 85073.doc 1379693 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400〉 37 cgtaattacc gtagccttct ctagtacaat agtacactgc ggtgtcctcg gatctcagag atgacagctc catgtagaca gtgcttgtgg agg 93 &lt;210&gt; 38 &lt;211&gt; 21 &lt;212〉DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gHlFl &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 38 gaataaaagc ttgccgccac c 21 &lt;210〉 39 &lt;211&gt; 22 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gHl R1 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400〉 39 tttcttgggc cctttgtaga ag 22 &lt;210&gt; 40 &lt;211&gt; 87 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220〉 &lt;223&gt; 544gLl T1 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 40 85073.doc -21- 1379693 gcttcccggg gtgacgttca agtgacccag agcccatcca gcctgagcgc atctgtagga 60 gaccgggtca ccatcacttg tagatcc 87 &lt;210&gt; 41 &lt;211&gt; 90 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220〉 &lt;223&gt; 544gLlT2 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 41 tatctgcaca aaccaggtaa agccccacaa ttgctcatct acggaatctc taacagattt 60 agtggtgtac cagacaggtt cagcggttcc 90 &lt;210&gt; 42 &lt;211&gt; 91 &lt;212&gt; DNA &lt;213〉人造的序列 &lt;220〉 &lt;223&gt; 544gLl T3 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 42 agatttcgcc acttattact gtttacaagg tacacatcag ccgtacacat tcggtcaggg 60 tactaaagta gaaatcaaac gtacggcgtg c 91 &lt;210〉 43 &lt;211&gt; 88 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gLlBl &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400〉 43 gaacgtcacc ccgggaagca ggaatccaga acaacagaag caccaacagc ctaacaggca 60 acttcatggt ggcggcttcg aatcatcc 88 -22- 85073.doc 1379693 &lt;210 44 &lt;211&gt; 88 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gLl B2 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400 44 ctttacctgg tttgtgcaga taccaagaca aaaaggtgtt cccataactg tttgcaagac 60 tctgactgga tctacaagtg atggtgac 88 &lt;210&gt; 45 &lt;211&gt; 90 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 544gLlB3 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 45 aacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggagagacga gatcgtgagg gtgaaatcag taccacttcc ggaaccgctg aacctgtctg 90 &lt;210&gt; 46 &lt;211&gt; 20 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt;
&lt;223&gt; 544gLl FI &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 46 ggatgattcg aagccgccac 20 &lt;210&gt; 47 &lt;211&gt; 21 &lt;212&gt; DNA &lt;213〉人造的序列 85073.doc -23 - 1379693 &lt;220〉 &lt;223&gt; 544gLlRl &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 47 gcacgccgta cgtttgattt c 21 &lt;210 48 &lt;211&gt; 339 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;老鼠 &lt;220 ' &lt;223&gt;老鼠單株5/44VL的DNA序列 &lt;220〉 &lt;221&gt; &lt;400&gt; 48 gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca gctttggaga tcaagtttct 60 atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacacctt tttgtcttgg 120 tacctgcaca agcctggcca gtctccacag ctcctcatct atgggatttc caacagattt 180 tctggggtgc cagacaggtt cactggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcacaataa agcctgagga cttgggaatg tattactgct tacaaggtac acatcagccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgt 339 &lt;210〉 49 &lt;211&gt; 363 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;老鼠 &lt;220&gt; &lt;223&gt;老鼠單株5/44VH的DNA序列 &lt;220&gt; &lt;221&gt; &lt;400&gt; 49 gaggtccaac tgcagcagtc tgggactgta ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta caggtttacc aactactgga ttcactgggt aaaacagagg 120 cctgggcagg gtctagaatg gattggtggt attaatcctg gaaataatta tactacgtat 180 aagaggaact tgaagggcaa ggccacactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240 atggacctca gcagcctgac aagtgaggac tctgcggtct attactgtac aagagagggc 300 tatggtaact acggggcctg gtttgcttac tggggccagg ggactctggt caccgtctcc 360 tea 363 -24- 85073.doc 1379693 &lt;210&gt; 50 &lt;211&gt; 9 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220 &lt;223&gt;寡核:y：酸引子内的序列 &lt;400&gt; 50 gccgccacc 9 &lt;210〉51 &lt;211&gt; 101 &lt;212&gt; DNA &lt;213&gt;人造的序列 &lt;220&gt; &lt;223&gt; 5'寡核苷酸引子 &lt;400〉51 gcgcgcaagc ttgccgccac catggacttc ggattctctc tcgtgttcct ggcactcatt 60 ctcaagggag tgcagtgtga ggtgcagctc gtcgagtctg g 101 25- 85073.doc

Claims (1)

  1. 拾
    物的方法’該單體卡奇黴素衍生物/抗體共軛物具有低於 1〇〇/°之降低的低共軛部分（LCF)，且具有下式： -〇 第092112147號專利申請案 -- + 乂私♦老f〗範圍替換本(101年1月) 、申請專利範圍： 丨年'月7Ί完 一種製備包含單體卡奇黴素衍生物/抗體共軛物之組合 Pr(X-S-S-W)m 其中： pr為抗體， X為可水解之交聯劑，其能夠在與標靶細胞結合並進 入其中之後，從該共軛物中釋放出卡奇黴素， W為卡奇黴素； m為經過純化之聽產物的平均裝载，使得卡奇徽素 按重量計構成共輛物的4-1〇%;且 (-X-S-S-W)m為卡奇黴素衍生物， 該方法包括下列步驟： ⑴將卡奇黴素衍生物加至抗體中，其中該卡奇徽 素衍生物按抗體之重量計，為45_11%; ⑺在非-親核的、蛋白質_可相容的、具有範圍從大 約7至9之pH值的緩衝溶液中，培養該卡奇黴素 衍生物和抗體，以產生包含單體卡奇黴素/抗體 共耗物之組合物，其中該溶液進一步包括⑷有 機的共;谷劑和（b)添加劑，包括至少一個c6_Ci8 羧駄或其鹽，且其中係在從約3〇°C到大約35°C 的溫度範圍T ’進行該培養，持續大約15分鐘 到24小時的期間；以及
    85073-1010102.doc 1379693 (3)使步驟（2)產生的組合物接受層析分離過程，以 使單體卡奇黴素衍生物/抗體共軛物，按卡奇黴 素之重量計’裝載範圍為4-10%，並具有低於10% 的低共輛部分（LCF)，與未共軛抗體、卡奇黴素 衍生物和聚集的共輕物分離。 2. 根據申請專利範圍第〗項之方法，其中該抗體係選自由單 株抗體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化抗體、單鏈抗 體及具有生物活性的抗體片段所組成之群，其中該具有 生物活性的片段為Fab、經修飾iFab、Fabi、（Fabi)eFv， 或重鏈單體或二聚體。 3. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中該人類化抗體係針 對細胞表面抗原CD22。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體包括含有序 列識別19號之輕鏈可變區和含有序列識別27號之重鏈 可變區。 5. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該抗體是人類化抗 體，包括含有序列識別28號之輕鏈。 6. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該抗體是人類化抗 體’包括含有序列識別30號之重鏈。 7. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其甲該抗體包括含有序 列識別28號之輕鏈和含有序列識別3〇號之重鏈。 8. 根據申請專利範圍第！項之方法，其争該抗體包括序列識 別1號之C D R - Η1'序列識別2號或序列識別丄3號或序列識 別15號或序列識別16號或序列識別27號之殘基“至66 85073-1010102.doc 1379693 或序列識別23號之殘基5 0至66之CDR-H2、序列識別3號 之CDR-H3、序列識別4號之CDR-L1、序列識別5號之 CDR-L2及序列識別6號之CDR-L3 » 9·根據申請專利範圍第8項之方法，其中該抗體包括序列識 . 別27號之殘基50-66之CDR-H2。 10. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中該人類化抗_CD22 抗體是CDR-移植之抗體，其為藉著親和力成熟草案獲得 的變種抗體’並對人類CD22具有增加的親和力。 11. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該卡奇黴素是γ卡 籲 奇黴素或Ν-乙醯基γ卡奇黴素。 12. 根據申請專利範圍第1或丨丨項之方法，其中該卡奇黴素係 以3 -疏基-3-甲基丁酿耕而官能化。 13. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該可水解之交聯劑 為4-(4_乙醯基苯氧基）丁酸（AcBut)。 14. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（2)(b)之添加 劑是辛酸或其鹽。 15. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中步驟（2)(b)之添加 β 劑是癸酸或其鹽。 16. 根據申請寻利範圍第1項之方法，其中步驟之添加 劑係以小於200 mM之濃度提供。 17. 根據申請專利範圍第16項之方法，其中該添加劑係以小 於100 mM之濃度提供。 1 8.根據申請專利範圍第17項之方法，其中該添加劑係以小 於50 mM之濃度提供。 85073-1010102.doc 1379693 19_根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（3)之層析分 離方法是尺寸排阻層析法（SEC)。 • 20.根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（3)之層析分 離方法是HPLC、FPLC或Sephacryl S-200層析法° 21. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（3)之層析分 離方法是厭水性交互作用層析法（HIC)。 22. 根據申請專利範圍第21項之方法，其中係使用苯基瓊脂 糖6速流層析介質、丁基瓊脂糖4速流層析介質、辛基瓊 _ 脂糖4速流層析介質、Toyopearl謎-650M層析介質、 Macro-Prep 甲基 HIC 介質或 Macro-Prep 第三-丁基 HIC 介 質，來進行該厭水性交互作用層析法（HIC)。 23. 根據申請專利範圍第21項之方法，其中係使用丁基瓊脂糖 4速流層析介質來進行該厭水性交互作用層析法（HIC)。 24. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體包括 CDR-H2之序歹ij，此序列在Kabat位置55處含有除了天門 冬醯胺酸之胺基酸殘基。 B 25.根據申請專利範圍第24項之方法，其中該Kabat位置55 處之胺基酸為麩醯胺酸。 26. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置57處含有除了蘇胺 酸之胺基酸殘基。 27. 根據申請專利範圍第26項之方法，其中該Kabat位置57 處之胺基酸為丙胺酸或纈胺酸。 28. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體包括 85073-1010102.doc 1379693 CDR H2之序列，此序列在Kabat位置6〇處含有除了離胺 酸之胺基酸殘基。 29. 根據申明專利範圍第28項之方法，其中該胺基酸殘基為 精胺酸。 30. —種組合物，其包含單體卡奇黴素衍生物/抗_cd22抗體 共軛物，其中該單體卡奇黴素衍生物/抗_CD22抗體共軛 物具有低於10%之低共軛部分（LCF)，且具有下式： Pr(-X-S-S-W)m 其中： Pr為抗-CD22抗體； X為可水解之交聯劑，其能夠在與標靶細胞結合並進入 其中之後，從該共軛物中釋放出卡奇黴素； W為卡奇黴素； m為經過純化之共軛產物的平均裝載，使得卡奇黴素按 重量計構成共軛物的4-10% ;且 (-X-S-S-W)m為卡奇黴素衍生物。 31. 根據申請專利範圍第30項之組合物，其中該抗抗 體係選自由單株抗體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化 抗體、單鏈抗體及具有生物活性的抗體片段所組成之 群，其中該具有生物活性的片段為Fab、經修飾之Fab、 Fab’、（Fab’)2或Fv，或重鏈單體或二聚體。 32. 根據申請專利範圍第30項之組合物，其中該抗_cd2^^ 體包括含有序列識別19號之輕鏈可變區和含有序列識 別27號之重鏈可變區。 85073-1010102.doc 1379693 33. 根據申請專利範圍第3〇項之組合物，其中該抗_Cd22抗 體為人類化抗體，其包括具有在序列識別28號中陳述之 序列的輕鏈。 34. 根據申請專利範圍第3〇項之組合物，其中該抗_Cd22抗 體為人類化抗體，其包括具有具有在序列識別30號中陳 述之序列的重鏈。 35. 根據申請專利範圍第3〇項之組合物，其中該抗_Cd22抗 體包括含有序列識別28號之輕鏈及含有序列識別30號之 Φ 重鏈。 36. 根據申請專利範圍第3〇項之組合物，其中該抗_Cd22抗 體對人類CD22具有專一性，並包括重鏈，其中可變功能 部位包括CDR，具有至少一個以下序列：序列識別1號之 CDR-H1 ,序列識別2號或序列識別13號或序列識別15號 或序列識別16號之CDR-H2，及序列識別3號之CDR-H3， 並包括輕鏈，其中可變功能部位包括CDR，具有至少一 B 個以下序列：序列識別4號之CDR-L1，序列識別5號之 CDR-L2及序列識別6號之CDR-L3。 37. 根據申請專利範圍第30項之組合物，其中該抗體包括重 鏈’其中可變功能部位包括CDR，具有至少一個以下序 列：序列識別1號之CDR-m、序列識別2號或序列識別13 號或序列識別15號或序列識別16號或序列識別27號之殘 基50至66或序列識別23號之殘基50至66之CDR-H2及序 列識別3號之CDR-H3 ’以及包括輕鏈，其中可變功能部 位包括CDR，具有至少一個以下序列：序列識別4號之 85073-1010102.doc 1379693 CDR-Ll、序列識別5號之CDR-L2及序列識別6號之 CDR-L3。 38. 根據申請專利範圍第30項之組合物，其中該抗-CD22抗 體包括序列識別1號之CDR-H卜序列識別2號或序列識別 13號或序列識別15號或序列識別16號或序列識別27號之 殘基50至66或序列識別23號之殘基50至66之CDR-H2、序 列識別3號之CDR-H3、序列識別4號之CDR-L1、序列識 別5號之CDR-L2和序列識別6號之CDR-L3。 39. 根據申請專利範圍第38項之組合物，其中該抗-CD22抗 體包括序列識別27號之殘基50至66之CDR-H2。 40. 根據申請專利範圍第3 1項之組合物，其中該人類化抗 -CD22抗體是CDR-移植之抗-CD22抗體。 41. 根據申請專利範圍第40項之組合物，其中該人類化抗 -CD22抗體為CDR-移植之抗體，其係藉著親和力成熟草 案獲得的變種抗體，並對人類CD22具有增加的親和力。 42. 根據申請專利範圍第30項之組合物，其中該抗-CD22抗 體包括可變功能部位，其包括人類接受者架構區和非-人類捐贈者CDRs。 43. 根據申請專利範圍第42項之組合物，其中該抗體之重鏈 的可變功能部位之人類接受者架構區，是以序列識别21 及22號為基礎，並在序列識别8號之位置1、28、48、72 和97處，包括捐贈者殘基。 44. 根據申請專利範圍第43項之組合物，其中該抗-CD22抗 體進一步在序列識别8號之位置68和70處包括捐贈者殘 85073-1010102.doc 1379693 基。 45. 根據申請專利範圍第42項之組合物，其中該抗_CD22抗 體’包括輕鏈的可變功能部位，其包括以序列識别丨7及 18號為基礎的人類接受者架構區，並在序列識别7號之 位置2、4、42、43、50和65處進一步包括捐贈者殘基》 46. 根據申請專利範圍第45項之組合物，其中該抗_匸〇22抗 體，進一步在序列識别7號之位置3處包括捐贈者殘基。 47. 根據申请專利範圍第3〇項之組合物’其中該抗_匸〇22抗 體’包括含有序列識別7號之輕鏈可變動功能區和序列識 別8號之重鏈可變功能區。 48. 根據申請專利範圍第31項之組合物，其中該抗_(：〇22抗 體包括雜種的CDR ’其包括截短的捐贈者cdr序列，其 中藉著不同的序列置換捐贈者CDR的漏失部分，並形成 有功能的CDR。 49. 根據申請專利範圍第3〇項之組合物，其中該卡奇黴素是了 卡奇黴素或Ν-乙醯基γ卡奇黴素衍生物。 50. 根據申請專利範圍第30或49項之組合物，其中以3_琉基 -3-甲基丁醯胼將該卡奇黴素官能化。 5 1 ·根據申請專利範圍第30項之組合物，其中該可水解之交 聯劑為4-(4-乙醯基苯氧基）丁酸（AcBut)。 52. 根據申請專利範圍第3 0項之組合物，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置55處含有除了天門 冬醯胺酸之胺基酸殘基。 53. 根據申請專利範圍第52項之組合物，其中該Kabat位置55 85073-1010102.doc 1379693 處之胺基酸為麵醯胺酸。 54. 根據申請專利範圍第3〇項之組合物，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Rabat位置57處含有除了蘇胺 酸之胺基酸殘基。 55. 根據申請專利範圍第54項之組合物，其中該Rabat位置57 處之胺基酸為丙胺酸或纈胺酸。 56_根據申請專利範圍第3 〇項之組合物，其中該抗體包括 CDR-H2之序列’此序列在Kabat位置60處含有除了離胺 酸之胺基酸殘基。 57. 根據申請專利範圍第56項之組合物，其中該胺基酸殘基 為精胺酸。 58. —種製備根據申請專利範圍第3〇項之組合物之安定冷 凍乾燥組合物的方法，該方法包括： (a) 使包含單體卡奇黴素衍生物/抗cd-22抗體共軛物之 組合物溶解於下列溶液中：包括按重量計濃度為 1.5%_5%之低溫保護劑、按重量計濃度為〇 5_15%之 聚合填充劑、濃度為0.01 Μ至0.1 Μ之電解質、按重 量計濃度為0.005-0.05°/。之溶解促進劑、使得該溶液 之終pH值為7.8-8.2、濃度為5-50 mM之緩衝劑和水， 至0.5至2毫克/毫升之終濃度； (b) 在+5C至+ 10C的溫度下’將上述的溶液分配至小瓶 内； (c) 在-35°C至-50°C的冷凍溫度下，將該溶液冷凍； (d) 使已經冷凍的溶液’在·至_40。(：的存放溫度下， 85073-1010102.doc 1379693 在20至80微米的最初乾燥壓力下，接受最初的冷凍 乾燥步驟24至78小時；以及 (e)使步驟（d)之已經冷凍乾燥的產物，在+1〇。〇至+35。〇 的存放溫度下，在20至80微米的乾燥壓力下接受二 級乾燥步驟15至30小時。 59. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該卡奇黴素衍生 物之卡奇黴素是γ卡奇黴素或N-乙酿基卡奇黴素。 60. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體係選自由 單株抗體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化抗體 '單鏈 抗體及具有生物活性的抗體片段所組成之群，其中該具 有生物活性的片段為Fab、經修飾之Fab、Fab，、（Fab')2 或Fv ’或重鏈單體或二聚體。 61·根據申請專利範圍第6〇項之方法，其中該抗體是人類單 株抗體。 62. 根據申請專利範圍第60項之方法，其中該抗體是嵌合型 抗體&quot; 63. 根據申請專利範圍第60項之方法，其中該抗體是人類抗 體。 64. 根據申請專利範圍第60項之方法，其中該抗體是人類化 抗體。 65. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體包括含有 序列識別19號之輕鏈可變區和含有序列識別27號之重 鏈可變區》 66. 根據申δ月專利範圍第58項之方法，其中該人類化抗體是 85073-1010102.doc •10· 1379693 CDR-移植之抗體，對人類CD22具有專一性，並包括具 有在序列識別28號中陳述之序列的輕鏈。 67. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該人類化抗體是 CDR-移植之抗體，對人類CD22具有專一性，並包括具 有在序列識別30號中陳述之序列的重鏈。 68. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體包括含有 序列識別28號之輕鍵，以及包括含有序列識別3〇號之重 鍵。 69. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體對人類 CD22具有專一性，並包括重鏈’其中可變功能部位包括 CDR ’其具有至少一個以下序列：序列識別1號之 CDR-H1，序列識別2號或序列識別13號或序列識別15號 或序列識別16號之CDR-H2及序列識別3號之CDR-H3，並 包括輕鍵，其中可變功能部位包括CDR，具有至少一個 以下序列.序列識別4號之CDR-L1，序列識別5號之 CDR-L2及序列識別6號之CDR-L3。 70. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體包括重 鏈，其中可變功能部位包括CDR，其具有至少一個以丁 序列：序列識別1號之CDR-m、序列識別2號或序列識別 13號或序列識別15號或序列識別16號或序列識別27號之 殘基50至66或序列識別^3號之殘基50至66之CDR-H2及 序列識別3號之CDR-H3 ’以及輕鏈，其中可變功能部位 包括CDR，具有至少一個以下序列：序列識別4號之 CDR-L1 、序列識別5號之CDR-L2及序列識別6號之 85073，l〇l〇i〇2.doc 1379693 CDR-L3。 71. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體包括序列 識別1號之CDR-H卜序列識別2號或序列識別13號或序列 識別15號或序列識別16號或序列識別27號之殘基50至66 或序列識別23號之殘基50至66之CDR-H2、序列識別3號 之CDR-H3、序列識別4號之CDR-L1、序列識別5號之 CDR-L2和序列識別6號之CDR-L3。 72. 根據申請專利範圍第71項之方法，其中該抗體包括序列 識別27號之殘基50至66之CDR-H2。 73. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該人類化抗體是 CDR-移植之抗體’其為變種抗體，對人類cd22具有增 加的親和力，其中係藉著親和力成熟草案而獲得該變種 抗體。 74. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體包括可變 功能部位，其包括人類接受者架構區和非-人類捐贈者 CDRs。 75. 根據申請專利範圍第74項之方法，其中該抗體_CD22之 重鏈的可變功能部位之人類接受者架構區，是以序列識 别21及22號為基礎’並在序列識别8號之位置卜28、48、 72和97處’包括捐贈者殘基。 76. 根據申請專利範圍第75項之方法，其中該抗體進一步在 序列識别8號之位置6 8和7 〇處包括捐贈者殘基。 77·根據申請專利範圍第74項之方法，其中該抗體包括輕鏈 的可變功能部位，其包括以序列識别17及18號為基礎的 85073-1010lQ2.doc 78. 人類接受者架構區，並在序列識别7號之位置2、4、42、 43、50和65處進一步包括捐贈者殘基。 根據申請專利範圍第77項之方法，其中該抗體進一步在 序列識别7號之位置3處包括捐贈者殘基。 79. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體包括含有 序列識別7號之輕鍵可變動功能區和序列識別8號之重鏈 進一步可視需要包括 其中該生物活性劑是 其中該生物活性劑是 其中該生物活性劑是 其中該生物活性劑是 80·根據申請專利範圍第58項之方法， 在治療上有效濃度的生物活性劑。 81 ·根據申請專利範圍第8〇項之方法， 胞毒藥物。 82. 根據申請專利範圍第8〇項之方法， 生長因子。 83. 根據申請專利範圍第8〇項之方法， 荷爾蒙。 84.根據申請專利範圍第8〇項之方法 抗體。 85.根據申請專利範圍第58 座ώc 心万法，其中該低溫保護劑係 選自醛酵、甘露糖醇、山 4糖醇、肌醇、聚乙二醇、醛 糖酸、糖醛酸、醛酸、醛 ^_ 糖類、酮糖類、胺基糖類、醛 龄類、肌醇類、甘油醛類、 丄 阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、 核糖、木耱、半乳糖、葡 ^ 萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、 塔羅糖、庚糖'葡萄糖、 ,,^ 果糖、葡萄糖酸、山梨糖醇、 礼糖、甘硌糖醇、甲基α 叱南葡糖苷、麥芽糖、異抗壞 S5073-1010i02.doc Π79693 血酸、抗壞血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤癬糖、 蘇糖、阿拉伯糖、異構糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、 塔羅糖、赤癖酮糖、核酮糖、木銅糖、阿洛嗣糖、塔格 糖、葡萄糖酸·酸、葡萄糖酸、葡糖二酸、半乳糖酸酸、 甘露糖醛酸、葡萄糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖、神 經胺糖酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、 聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、 岩藻依聚糖、角叉菜膠、半乳卡洛羅糖、果膠、果膠酸、 直鏈澱粉、支鏈澱粉、糖原、殿粉果膠、纖維素、葡聚 糖、石臍素、幾丁質、瓊脂糖、角質素、軟骨素、皮膚 素、透明質酸、藻酸、黃酸樹膠、澱粉、蔗糖、葡萄糖、 乳糖、海藻糖、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油和 季戊四醇。 86. 根據申請專利範圍第85項之方法，其中該低溫保護劑是 蔗糖。 87. 根據申請專利範圍第％項之方法’其中該蔗糖以按重量 §十1.5%的濃度存在。 88. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該聚合填充劑為 葡聚糖40，且按重量計濃度為〇9〇/〇β 89. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該聚合填充劑為 經乙基殿粉40’且按重量計濃度為〇 9〇/〇。 90. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中諒電解質為氣化 鈉，並以0.05 Μ之濃度存在。 91. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該溶解促進劑為 85073-1010102.doc •14· 1379693 界面活性劑。 92. 根據申請專利範圍第91項之方法，其中該界面活性劑是 多乙氧基醚80，並以按重量計〇.〇1%的濃度存在。 93. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該緩衝劑為三甲 醇氨基甲烷’並以〇.〇2 Μ之濃度存在。 94. 根據申請專利範圍第Μ項之方法，其中該步驟（a)之溶液 的pH值是8.0。 95. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中在+5。〇之溫度 下，將在步驟（b)中之溶液分配到小瓶中。 96. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中在步驟（c)中在 -45 C的冷凍溫度下，進行將在小瓶中之溶液冷凍。 97. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中在步驟（d)中，使 已經冷凍的溶液，在6〇微米的最初乾燥壓力和_3〇(}〇的存 放溫度下，接受最初的冷凍乾燥步驟6〇小時。 9S.根據申請專利範圍第58項之方法，其中在步驟（e)中使 步驟（d)之已經冷凍-乾燥的產物，在6〇微米的乾燥壓力 和+25°C的存放溫度下，接受二級乾燥步驟24小時。 99. 根據申請專利範圍第58項之方法，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置55處含有除了天門 冬醯胺酸之胺基酸殘基。 100. 根據申請專利範圍第99項之方法，其中該尺让以位置55 處之胺基酸為楚酿胺酸。 101. 根據申请專利範圍第58項之方法，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置57處含有除了蘇胺 85073-1010102.doc -15· 1379693 酸之胺基酸殘基。. ⑽.根據申請專利範圍第101項之方法，其中狐如位置57 處之胺基酸為丙胺酸或纈胺酸。 103·根據申請專利範圍第以項之方法，纟中該抗體包括 CDR-H2之序列’此序列在Kabat位置6。處含有除了離胺 酸之胺基酸殘基。 104. 根據巾請專利範圍第1G3項之方法，其中該胺基酸殘基 為精胺酸。 105. —種組合物，其包括治療有效劑量之根據申請專利範圍 第30項之組合物，其係以下列步驟製備： (a) 使包含單體卡奇黴素衍生物/抗^以抗體共輛物之 組合物溶解於下列溶液中：包括按重量計濃度為 1.5%-5%之低溫保護劑、按重量計濃度為〇 5_丨5%之 聚合填充劑、濃度為〇·〇1 Μ至0.1 μ之電解質、按重 1计漢度為0.005-0.05%之溶解促進劑、使得該溶液 之終pH值為7.8-8.2、濃度為5-50 mM之緩衝劑和水， 至〇.5至2毫克/毫升之終濃度； (b) 在+5°C至+1〇。(：的溫度下，將上述的溶液分配至小瓶 内； (c) 在_35 C至-50°C的冷康溫度下’將該溶液冷床； (d) 使已經冷凍的溶液，在_10。(：至_4〇。(：的存放溫度下， 在20至80微米的最初乾燥壓力下，接受最初的冷束 乾燥步驟24至78小時；以及 (e) 使步驟（d)之已經冷束乾燥的產物，在+1〇。〇至+35°C 85073-1010102.doc •16· 1379693 的存故溫度下，在20至80微米的乾燥壓力下接受二 級乾燥步驟15至30小時。 106. 根據申請專利範圍第105項之組合物，其中該抗_CD22抗 體係選自由單株抗體、嵌合型抗體、人類抗體、人類化 抗體、單鏈抗體及具有生物活性的抗體片段所組成之 群’其中該具有生物活性的片段為Fab、經修飾之Fab、 Fab’、（Fab')2*Fv，或重鏈單體或二聚體。 107. 根據申請專利範圍第1 〇6項之組合物，其中該抗體是人類 單株抗體。 108. 根據申請專利範圍第106項之組合物，其中該抗體是嵌合 型抗體。 109. 根據申請專利範圍第1〇6項之組合物，其中該抗體是人類 抗體。 110. 根據申請專利範圍第106項之組合物，其中該抗體是人類 化抗體。 111. 根據申請專利範圍第1〇5項之組合物，其中該抗—CD22抗 體包括含有序列識別19號之輕鏈可變區和含有序列識 別27號之重鏈可變區。 112. 根據申請專利範圍第1 〇5項之組合物，其中該抗-CD22抗 體是CDR-移植之抗體，對人類CD22具有專一性，並包 括具有在序列識別28號中陳述之序列的輕鏈。 113. 根據申請專利範圍第1〇5項之組合物，其中該抗-CD22抗 體是CDR-移植之抗體，對人類CD22具有專一性，並包 括具有在序列識別3 0號中陳述之序列的重鏈。 85073-1010102.doc •17- 1379693 114. 根據申請專利範圍第i〇5項之組合物，其中該抗-CD22抗 體包括含有序列識別28號之輕鏈，以及含有在序列識別 30號之重键》 115. 根據申請專利範圍第105項之組合物，其中該抗-CD22抗 體對人類CD22具有專一性，並包括重鏈，其中可變功能 部位包括CDR，其具有至少一個以下序列：序列識別1 號之CDR-H1 ,序列識別2號或序列識另|J 13號或序列識另 15號或序列識別16號之CDR-H2及序列識別3號之 CDR-H3，並包括輕鏈，其中可變功能部位包括CDR，具 有至少一個以下序列：序列識別4號之CDR-L1，序列識 別5號之CDR-L2及序列識別6號之CDR-L3。 116. 根據申請專利範圍第105項之組合物，其中該抗體包括重 鏈，其中可變功能部位包括CDR，其具有至少一個以下 序列：序列識別1號之CDR-Η卜序列識別2號或序列識別 13號或序列識別15號或序列識別16號或序列識別27號之 殘基50至66或序列識別23號之殘基50至66之CDR-H2及 序列識別3號之CDR_H3，以及輕鏈，其中可變功能部位 包括CDR，具有至少一個以下序列：序列識別4號之 CDR-L1、序列識別5號之CDR-L2及序列識別6號之 CDR-L3。 117. 根據申請專利範圍第項之組合物，其中該抗-CD22抗 體包括序列識別1號之CDR-H1、序列識別2號或序列識別 13號或序列識別15號或序列識別16號或序列識別27號之 殘基50至66或序列識別23號之殘基50至66之CDR-H2、序 85073-1010102.doc -18 * 1379693 列識別3號之CDR-H3、序列識別4號之CDR-Ll、序列識 別5號之CDR-L2和序列識別6號之CDR-L3。 118. 根據申請專利範圍第117項之組合物，其中該抗體包括序 列識別27號之殘基50至66之CDR-H2。 119. 根據申請專利範圍第106項之組合物，其中該人類化抗 CD22抗體是CDR-移植之抗體，其為變種抗體，對人類 CD22具有增加的親和力，其中係藉著親和力成熟草案而 獲得該變種抗體。 120. 根據申請專利範圍第105項之組合物，其中該抗-CD22抗 體包括可變功能部位，其包括人類接受者架構區和非-人類捐贈者CDRs。 121. 根據申請專利範圍第120項之組合物，其中該抗-CD22抗 體之重鏈的可變功能部位之人類接受者架構區，是以序 列識别21及22號為基礎，並在序列識别8號之位置卜28、 48、72和97處，包括捐贈者殘基。 122. 根據申請專利範圍第121項之組合物，其中該抗-CD22抗 體進一步在序列識别8號之位置68和70處包括捐贈者殘 基。 123. 根據申請專利範圍第120項之組合物，其中該抗-CD22抗 體包括輕鏈的可變功能部位，其包括以序列識别17及18 號為基礎的人類接受者架構區，並在序列識别7號之位 置2、4 ' 42、43、50和65處進一步包括捐贈者殘基。 124. 根據申請專利範圍第123項之組合物，其中該抗-CD22抗 體進一步在序列識别7號之位置3處包括捐贈者殘基。 85073-1010102.doc -19- 1379693 125.根據申明專利範圍第1〇5項之組合物其中該抗抗 體包括含有序列識別7號之輕鏈可變動功能區和序列識 別8號之重鏈可變功能區。 126·根據申請專利範圍第105項之組合物，其中該卡奇黴素衍 生物之卡奇黴素是γ卡奇黴素或N_乙醯基卡奇黴素。 127.根據申請專利範圍第1〇5項之組合物，進一步可視需要包 括生物活性劑。
    128·根據申請專利範圍第127項之組合物，其中該生物活性劑 是胞毒藥物。 129. 根據申請專利範圍第127項之組合物，其中該生物活性劑 是生長因子。 130. 根據申請專利範圍第127項之組合物，其中該生物活性劑 是荷爾蒙。 131·根據申請專利範圍第127項之組合物，其中該生物活性劑 是抗體。 132. 根據申請專利範圍第1 〇5項之組合物，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置55處含有除了天門 冬醯胺酸之胺基酸殘基。 133. 根據申清專利範圍第132項之組合物，其中該Kabat位置 55處之胺基酸為麩醯胺酸。 134. 根據申請專利範圍第1〇5項之組合物，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置57處含有除了蘇胺 酸之胺基酸殘基。 135·根據申請專利範圍第134項之組合物，其中該Kabat位置 85073-1010102.doc •20· 1379693 57處之胺基酸為丙胺酸或纈胺酸。 136. 根據申請專利範圍第1〇5項之組合物，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置60處含有除了離胺 酸之胺基酸殘基。 137. 根據申請專利範圍第丨36項之組合物，其中該胺基酸殘 基為精胺酸》 138. —種在個體中治療表現CD22之增殖性病症的組合物，該 組合物包括在治療上有效劑量之根據申請專利範圍第3〇 項之組合物。 139. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其中以皮下、腹腔 内、靜脈内、動脈内、髓内、靭内、經皮、經皮下、鼻 内、局部、經腸、陰道内、舌下或經直腸之方式，投予 該組合物。 140·根據申請專利範圍第138項之組合物，其中以靜脈内之方 式投予該組合物。 141. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該個體是人類 個體’而該增殖性病症是癌症。 142. 根據申請專利範圍第141項之組合物，其中該癌症是8_ 細胞惡性腫瘤》 143. 根據申請專利範圍第142項之組合物，其中該B_細胞惡性 腫瘤是白血·病。 144. 根據申請專利範圍第143項之組合物，其中該白血病表現 細胞表面抗原CD22。 145. 根據申請專利範圍第142項之組合物，其中該b-細胞惡性 85073-1010102.doc •21 - 1379693 腫瘤是淋巴瘤。 H6.根據申請專利範圍第145項之組合物，其中該淋巴瘤表現 細胞表面抗原CD22。 147·根據中請專利範圍第141項之組合物，其中該癌症是惡性 瘤。 148. 根據申請專利範圍第141項之組合物其中該癌症是肉 瘤。 149. 根據申請專利範圍第141項之組合物，其中該癌症是非 霍奇金氏淋巴瘤。 150·根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該卡奇黴素衍 生物中之卡奇黴素是γ卡奇黴素或N-乙醯基卡奇黴素。 151. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其係與一或多個生 物活性劑一起投予。 152. 根據申請專利範圍第151項之組合物，其中該一或多個生 物活丨生劑係選自由抗體、生長因子、荷爾蒙、細胞激動 φ 素、抗-荷爾蒙、黃嘌呤素、介白素、干擾素和胞毒藥物 所組成之群。 153. 根據申請專利範圍第152項之組合物，其中該生物活性劑 是抗體。 154. 根據申請專利範圍第153項之組合物，其中該抗體係針對 在Β-細胞惡性腫瘤上表現的細胞表面抗原。 155. 根據申請專利範圍第154項之組合物，其中該針對在&amp; 細胞惡性腫瘤上表現之細胞表面抗原的抗體，係選自由 抗-CD19、抗_CD20和抗_Cd33抗體所組成之群。 85073-1010102.doc -22- 93 93 第155項之組合物，其中該抗-CD20抗 156·根據申請專利範圍 體是利妥昔單抗》 157. 根據申請專利範圍第152項之組合物，其中該細胞激動素 或生長因子係選自由介白素2 (il-2)、TNF、CSF、GM-CSF 和G-CSF所組成之群。 158. 根據申請專利範圍第ι52項之組合物，其中該荷爾蒙是類 固醇荷爾蒙，並選自雌激素、雄激素、孕留酮和皮質類 固醇。 159.根據申請專利範圍第152項之組合物，其中該胞毒藥物係 選自由阿黴素、道諾紅菌素、伊達比星、阿克拉黴素、 佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、洋紅黴素〗、諾加拉黴 素、美諾立爾、匹塔路比星、瓦路比星、阿糖胞甞、吉 西他續、曲氟尿答、環胞甞、依諾他濱、阿扎胞芬、去 氧氟尿站、喷司他丁、脫氧溴尿甞、截瘤達、克拉君賓、 地西他濱、氟尿苷、氟達拉濱、谷氏菌素、嘌羅黴素、 替加氟、嘍唑呋啉、亞德里亞黴素、順氯氨鉑、卡鉑、 長春新驗、米托 丙卡巴肼、胺甲 紫杉醇類似物和 環填醯胺、f嗪咪唑胺、長春花驗 蒽醌、博菜黴素、氮芥 '脫氫可的松 碟吟、氟尿碟咬、依托泊答、紫杉醇 絲裂黴素所組成之群。 160.根據申請專利範圍第152項之組合物，進一步更包 多個胞毒製劑的組合，作為治療攝生法的一部分 該胞毒製劑的組合係選自： A. CHOPP (環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼、強的松和丙 85073-1010102.doc •23- 1379693 卡巴肼）； B. CHOP (環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松）； C. COP (環磷醯胺、長春新鹼和強的松）； D. CAP-BOP (環磷醯胺、阿黴素、丙卡巴肼、博菜黴素、 長春新驗和強的松）； E. m-BACOD (胺甲碟呤、博菜黴素、阿黴素、環磷醯胺、 長春新鹼、地塞米松和曱醯四氳葉酸）； F. ProMACE-MOPP (強的松、胺曱碟呤、阿黴素、環磷 醯胺、依托泊苷、曱醯四氫葉酸、氮芥、長春新鹼、 強的松和丙卡巴肼）； G. ProMACE-CytaBOM (強的松、胺曱碟呤、阿黴素、 環磷醯胺、依托泊甞、曱醯四氫葉酸、阿糖胞甞、 博菜黴素和長春新驗）； H. MACOP-B (胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、長春新鹼、 強的松、博菜黴素和甲醯四氫葉酸）； I. MOPP (氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡巴肼）； J. ABVD(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花鹼 和甲嗪咪唑胺）； K. 以ABV (亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素和長春花鹼) 加以改變的MOPP (氮芥、長春新鹼、強的松和丙卡 巴胼）； L. 以ABVD (亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花 鹼和甲嗪咪唑胺）加以改變的MOPP(氮芥、長春新 驗、強的松和丙卡巴肼）； 85073-1010102.doc -24- 1379693 M. ChlVPP (苯丁酸氮芥、長春花鹼、丙卡巴肼和脫氫可 的松）； N. IMVP-16 (異環磷醯胺' 胺甲碟呤和依托泊誓）； O. MIME (丙酮雙咪腙、異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托 泊苷）； P. DHAP (地塞米松、高劑量的阿糖胞苷和順氯氨始）； Q· ESHAP (依托泊苷、甲基脫氫皮甾醇、高劑量的阿糖 胞苷和順氯氨鉑）； R. CEPP(B)(環峨醯胺、依托泊苷、丙卡巴肼、強的松 和博菜黴素）； S · CAMP (洛莫司汀、米托g昆蒽、阿糖胞:y：和強的松）； T. CVP-1 (環填醯胺、長春新驗和強的松）； U. ESH0P (依托泊：y：、甲基脫氫皮甾醇、高劑量的阿糖 胞站、長春新鹼和順氯氨鉑）； V. EPOCH (依托泊：y：、長春新鹼和阿黴素96小時，加環 磷醯胺之團塊劑量，並口服強的松）； W. ICE (異環磷醯胺、環磷醯胺和依托泊铝）； X. CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊甞、丙卡巴胼、強的松 和博菜黴素）； Y. CH0P-B (環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼、強的松和 博菜黴素）；以及 Z. P/D0CE (表柔比星或何黴素、長春新鹼、環磷醯胺 和強的松p 161.根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該單體卡奇黴 85073-1010102.doc • 25- 1379693 素衍生物/抗-CD22抗體共軛物之抗-CD22抗體包括含有 序列識別19號之輕鏈可變區和含有序列識別27號之重 鍵可變區。 162. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該抗-CD22抗 體為人類化抗體，其包括具有在序列識別28號中陳述之 序列的輕鏈。 163. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該抗-CD22抗 體為人類化抗體，其包括具有具有在序列識別30號中陳 述之序列的重鏈。 164. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該單體卡奇黴 素衍生物/抗-CD22抗體共軛物之抗-CD22抗體包括含有 序列識別28號之輕鏈和含有序列識別30號之重鏈。 165. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該抗-CD22抗 體對人類CD22具有專一性，並包括重鏈，其中可變功能 部位包括CDR，具有至少一個以下序列：序列識別1號之 CDR-H1，序列識別2號或序列識別13號或序列識別15號 或序列識別16號之CDR-H2，及序列識別3號之CDR-H3， 並包括輕鏈，其中可變功能部位包括CDR，具有至少一 個以下序列：序列識別4號之CDR-L1，序列識別5號之 CDR-L2及序列識別6號之CDR-L3。 166. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該抗-CD22抗 體包括重鏈，其中可變功能部位包括CDR，具有至少一 個以下序列：序列識別1號之CDR-Hh序列識別2號或序 列識別13號或序列識別15號或序列識別16號或序列識別 85073-1010102.doc -26- 1379693 27號之殘基50至66或序列識別23號之殘基50至66之殘 基50至66之CDR-H2及序列識別3號之CDR-H3，以及包括 輕鏈，其中可變功能部位包括CDR，具有至少一個以下 序列：序列識別4號之CDR-L1、序列識別5號之CDR-L2 及序列識別6號之CDR-L3。 167. 根據申請專利範圍第138項之組合物，包括序列識別1號 之CDR-H1、序列識別2號或序列識別13號或序列識別15 號或序列識別16號或序列識別27號之殘基50至66或序列 識別23號之殘基50至66之CDR-H2、序列識別3號之 CDR-H3、序列識另ij 4號之CDR-L1 、序列識別5號之 CDR-L2和序列識別6號之CDR-L3。 168. 根據申請專利範圍第167項之組合物，其中該單體卡奇黴 素衍生物/抗-CD22抗體共軛物之抗-CD22抗體包括序列 識別27號殘基50至66之CDR-H2。 169. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置55處含有除了天門 冬醯胺酸之胺基酸殘基。 170. 根據申請專利範圍第169項之組合物，其中該Kabat位置 55處之胺基酸為麩醯胺酸。 171. 根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置57處含有除了蘇胺 酸之胺基酸殘基。 172. 根據申請專利範圍第171項之組合物，其中該Kabat位置 57處之胺基酸為丙胺酸或纈胺酸。 85073-1010102.doc -27· 1379693 m.根據申請專利範圍第138項之組合物，其中該抗體包括 CDR-H2之序列，此序列在Kabat位置6〇處含有除了離胺 酸之胺基酸殘基。 174_根據申睛專利範圍第173項之組合物，其中該胺基酸殘 基為精胺酸。 175. —種在個體中治療B細胞惡性腫瘤的組合物該組合物 包括在治療上有效劑量之根據申請專利範圍第3〇項之組 合物。 176_根據申請專利範圍第175項之組合物，其中申請專利範 圍第24項之組合物令之卡奇黴素是γ卡奇黴素或N_乙醯 基卡奇黴素。 177.根據申請專利範圍第175項之組合物，其中該組合物係以 皮下、腹腔内、靜脈内、動脈内、髓内、鞘内、經皮、 經皮下、鼻内、局部、經腸、陰道内、舌下或經直腸之 方式投予。 Π8.根據申請專利範圍第175項之組合物，其中該B細胞惡性 腫瘤是白血病。 Π9.根據申請專利範圍第ι78項之組合物，其中該白血病表現 細胞表面抗原CD22。 180. 根據申請專利範圍苐175項之組合物，其中該8_細胞惡性 腫瘤是淋巴瘤。 181. 根據申請專利範圍第ι8〇項之組合物，其中該淋巴瘤表現 細胞表面抗原CD22。 182. 根據申請專利範圍第181項之組合物，其中該B-細胞惡性 85073-1010102.doc • 28 * 1379693 ®瘤是非-霍奇金氏淋巴瘤。 183. 根據申請專利範圍第175項之組合物，其進一步包含一或 多種生物活性劑。 184, 根據申請專利範圍第183項之組合物，其中該一或多個生 物/舌丨生劑係選自由抗體、生長因子、荷爾蒙、細胞激動 素、抗荷爾蒙、黃嘌呤素、介白素、干擾素和胞毒藥物 所組成之群。 185·根據申請專利範圍第183項之組合物，其中該生物活性劑 是抗體。 186. 根據申請專利範圍第185項之組合物，其中該抗體係針對 在B-細胞惡性腫瘤上表現的細胞表面抗原。 187. 根據申請專利範圍第186項之組合物其中該針對在&amp; 細胞惡性腫瘤上表現之細胞表面抗原的抗體，係選自由 抗-CD19、抗-CD20和抗-CD33抗體所組成之群。 188·根據申請專利範圍第187項之組合物，其中該抗_cd2〇抗 體是利妥昔單抗。 189.根據申請專利範圍第184項之組合物，其中該細胞激動素 或生長因子係選自由介白素2 (IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF 和G-CSF所組成之群。 190·根據申請專利範圍第184項之組合物，其中該荷爾蒙是類 固醇荷爾蒙，並選自雌激素、雄激素、孕留嗣和皮質類 固醇。 191.根據申請專利範圍第184項之組合物，其中該胞毒藥物係 選自由阿激素、道諾紅菌纟、伊達比星、阿克拉黴素、 85073-1010102.doc 佐柔比星、米托蒽g昆、表柔比星、洋红黴素I、諾加拉徽 素、美諾立爾、匹塔路比星、瓦路比星、阿糖胞誓、士 西他濱、曲氟尿:y：、環胞芬、依諾他濱、阿扎胞芬、去 氧氟尿苷、喷司他丁、脫氧溴尿苷、截瘤達、克拉君賓、 地西他濱、氟尿嘗、氟達拉濱、谷氏菌素'嗓羅黴素、 替加氟、喳唑唤啉、亞德里亞黴素、順氯氨鉑、卡鉑、 環磷酿胺、甲嗪咪唑胺、長春花鹼、長春新鹼、米托 蒽醌、博菜黴素、氮芥、脫氫可的松、丙卡巴肼、胺甲 碟呤'氟尿嘧啶、依托泊苷、紫杉醇、紫杉醇類似物和 絲裂黴素所組成之群。 192.根據申請專利範圍第184項之組合物，進一步更包括一或 多個胞毒製劑的組合’作為治療攝生法的一部分，其中 該胞毒製劑的組合孫選自： A. CHOPP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼、強的松和丙 卡巴肼）； B. CHOP (環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松）； C. COP (環鱗酿胺、長春新驗和強的松）； D. CAP-BOP (環麟醯胺、阿黴素、丙卡巴肼、博菜黴素、 長春新驗和強的松）； E. m-BACOD(胺甲碟呤、博菜黴素、阿黴素、環磷醯胺、 長春新驗、地塞米松和甲酿四氣苹酸）； F_ Pr〇MACE-M〇PP(強的松、胺甲碟呤、阿黴素環磷 醯胺、依托泊甞、节醯四氫葉醆、氮芥、長春新鹼、 強的松和丙卡巴胼）； 85073-1010102.doc 30· 1379693 G· ProMACE-CytaBOM (強的松、胺曱碟呤、阿黴素、 環磷醯胺、依托泊苷、甲醯四氫葉酸、阿糖胞苷、 博菜黴素和長春新驗）； H. MACOP-B(胺甲碟呤、阿黴素、環磷醯胺、長春新鹼' 強的松、博菜黴素和甲酿四氫葉酸 I. MOPP (氮界、長春新驗、強的松和丙卡巴肼）； J. ABVD(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花鹼 和甲嗪咪唑胺）； K. 以ABV(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素和長春花驗）鲁 加以改變的MOPP (氮芥、長春新鹼' 強的松和丙卡 巴胼）； L. 以ABVD(亞德里亞黴素/阿黴素、博菜黴素、長春花 鹼和甲嗪咪唑胺）加以改變的MOPP(氮芥、長春新· 鹼、強的松和丙卡巴胼）； M. ChiVPP (本丁酸氮介、長春花驗、丙卡巴耕和脫氫可 的松）； N. IMVP-16 (異環磷醯胺、胺甲碟呤和依托泊芬）； ® O. MIME (丙酮雙°米膝、異環礙醯胺、胺甲碟吟和依托 泊苷）； P. DHAP (地塞米松、高劑量的阿糖胞替和順氣氨翻）； Q. ESHAP (依托泊苷、甲基脫氫皮甾醇、高劑量的阿糖 胞苷和順氣氨鉑）； R. CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊：y：、丙卡巴肼、強的松 和博菜黴素）； 85073-1010102.doc -31- 1379693 s· camp (洛莫司汀、米托醌蔥、阿糖胞：y：和強的松）； T. CVP-1 (環磷醯胺、長春新鹼和強的松）； - U· ESHOP (依托泊：y：、甲基脫氫皮甾醇、高劑量的阿糖 胞苷、長春新鹼和順氣氨鉑）； V. EPOCH (依托泊荅、長春新鹼和阿黴素96小時，加環 填醯胺之團塊劑量，並口服強的松）； W. ICE (異環磷醯胺、環磷醯胺和依托泊甞）； X. CEPP(B)(環磷醯胺、依托泊：y：、丙卡巴胼、強的松 • 和博菜黴素）； Y· CHOP-B (環鱗醯胺、阿黴素、長春新驗 '強的松和 博菜黴素）；以及 Z. P/DOCE (表柔比星或阿黴素、長春新鹼、環磷醯胺 和強的松）。 193· —種治療侵略性淋巴瘤之組合物’包含根據申請專利範 圍第105項之組合物及一或多種生物活性劑。 194.根據申δ青專利範圍第193項之組合物，其中申請專利範 • 圍第87項之組合物中之單體卡奇黴素衍生物/抗CD22抗 體共軛物為CMC-544。 85073-1010102.doc 32. 1379693 第092112147號專利申請案 中文圖式替換頁(98年10月）
    5/44重鏈序列移植設計 DP7 10 20 30 40 50 EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYRFT NYWIH WVKQRPGQGLEWIG GINPI I Mill I III QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT WVRQAPGQGLEWMG gHl EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFT NYWIH WVRQAPGQGLEWIG GINP gH4,5,6,7 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFT NYWIH WVRQAPGQGLEWIG GINP ,71 4 5 6 7 VHDP89^^^¾ 60 70 80 90 100 GNNYTTYKRNLKG KATLTAVTSASTAYMDLSSLTSEDSAVYYCTR EGYGNYG II Ml I I I I I I KFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARIII I RATLTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTR EGYGNYG RATLTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTR EGYGNYG RVTMT^DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYC全 R ΕσϊΌΝΓσ GNNYATYRRKFQG RATLTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTR EGYGNYG GNNYATYRRKFQG RVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVyYCTR EGYGNYG GNQYTTYKRNLKG GNNYATYRRNLKG GNNYATYRRNLKG VH 110 WGQGTLVTVSS AWFA y WGQGTLVTVSS gHl AWFAY WGQGTLVTVSS gHAMJ AWFAY WGQGTLVTVSS 圖6 85073-fig-981028.doc -6-
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