TWI280365B - Molecular constructs and methods of use for detection of biochemical reactions - Google Patents

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1280365 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明主要涉及分子生物學以及生物化學。本發明提 供刀子構築體以及測定單個或多個生化反應的方法。 【先前技術】 、、、田胞中的生化反應決定細胞功能和活動。這些反應包 括在受體配體間的複雜的相互作用和酵素反應，其調節細 胞所發出的訊號及其活動。生理條件會影響參與這些反應 的酵素和蛋白質的活性水平。 例如，胜肽鏈上的胺基酸殘基的修飾在調節細胞中的 蛋白質功能方面扮演著重要的角麟酸基、甲基或碳水 化合物的轉移包含了在蛋白質受質中的構形改變，而這種 改變又反過來導致蛋白質功能發生變化。這些反應通常是 可逆的。$白質修飾過程中包含特殊的酵素活動種類。例 如：甲基化作用通常是由被稱為轉甲基酵素的一類酵素來 進仃催化的。}白質甲基化作用調節細胞質蛋白質對細胞 膜的附著’並且有助於防止胜肽# c端蛋白水解的降解反 應。例如，大多數@ G蛋白質是甲基化的。甲基化的半胱 氨酸殘基位於或接近於G蛋白質的羧基末端，並且有助於 胜肽附著到用於訊號傳導的細胞膜上（Rand〇, B —

Biophys Acta 1300(1) ： 5-12 (1996) ， Hrycyna ， p— Ther. 59(3):28"00(1 993))。在幾種肌動 蛋白的73位置處的組氨酸也被甲基化。已經表明甲基化 對於維持肌動蛋白分子的固有的構形是必須的（Ya〇 了 1280365

Biol .Chem · 274(52):37443-9(1 999))。在肌球蛋白的 S-1區域進行的離胺酸殘基的曱基化會導致在肌纖蛋白收 縮中的 ATP 降低（Bivin，Proc · Nat，l Acad· Sci USA 91(18):8665 - 9(1994))。已經表明膜蛋白的甲基化作用 會導致糖尿病患者中心血管疾病的發生（Schaffer，Mol. Cell Biochem 107(1):卜 20( 1 991 ))。此外，甲基化作用 減少核蛋白中的RNA—蛋白質的相互作用（Kira, Amino

Acids 1 5(4):291-306( 1 998))，並且選擇性地調整別3 功能域一中介蛋白一蛋白之間的相互作用（Bedf〇rd，j.

Biol· Chem, 275(21):16030-6(2000))。 同樣地，碳水化合物可以被轉移到在許多分泌型蛋白 質或細胞表面的蛋白質上的天冬醯胺、絲氨酸或蘇氨酸殘 基的側鏈上。將碳水化合物轉移到人體凝結因子V上的 2181位置的天冬醯胺上會削弱因子v和磷脂膜之間的相互 作用（Nicolaes， Biochemistry 38(41):13584-91(1999) )。大型的碳水化合物如多糖可以通過將許多糖單體鏈結 反應後得到。 【發明内容】 發明概述 本發明涉及-種具有捕獲部位和受質部位的分子構築 體。捕獲部位用於將構築體從測試的樣品中分離出來，受 質部位提供反應的場所用於教感興趣的目標分子的存: =動水平。在—種較佳的具體實例中，分子構築體包括 肽核酸（m)作為捕獲部位和胜肽或蛋白質作為受質 1280365 邛位。另-種可選擇的較佳受質部位包括非胜肽類分子， 如脂肪酸、類固醇、糖、辅助因子和其他的可以與感興趣 的目標分子反應或作為其受質的結構。 —本發明也涉及使用分子構築體的方法。此外還提供測 定一種或多種酵素活動的方法，這種方法是通過測定分子 構築體中被修㈣受質部位，而這反過來又可以指示樣品 中存在的種或夕種酵素的活性。相似地，本發明還提供 在測定細胞、細胞族群或組織樣品中的被分析物的方法。 本發明中具有胜肽核酸（PNA)捕獲部位的分子構築體 相對於現有技術巾的分子構築體來說是特別好的。由於 PJA的主鏈具有無電荷性，所以pNA與互補核酸序列的雜 交具有更高的特異性和更高的親和力。由力pNA具有核酸 如DNA或腿所不具有的各種特性，所以m核酸序列雜 交要相對好得多。PNA在較大PH值的範圍内和低離子強度 環境中是穩定的。這些性質使得PNA特別適用於本發明的 偵測分析中。 為了偵測和分析生化反應所需進行的測定應該是精確 地、省時有效地和能夠高靈敏度地篩選出一個或多個反應 的。因此，為了防止和/或治療疾病，特別是由病毒、細 菌和寄生蟲引起的人類疾病，如存在一種方法能夠偵測一 個或多個生化反應，且該方法容易使用、具有高特異性、 能夠精確地、靈敏地進行篩選，則是非常有用的。 發明詳述 本發明涉及一種具有捕獲部位和受質部位的分子構築 !28〇365 體。捕獲部位能夠將構築體從混合分子中分離出來，並較 佳含有核酸或核酸衍生物。受質部位能夠使構築體發生作 用’並經歷一可被測量或檢測到的改變。該改變可以是物 理的，例如化學修飾或對受質部位的剪切或加成。另外， 改變也可以是將配體或細胞結合到構築體上的受質部位。 本發明的分子構築體可以是含有共價連接成分的pNA 胜肽肷合體，包括PNA寡聚物、一種或多個pna的衍生 物形態（例如，ρΡΝΑ )、連接物和合成胜肽或其他受質部 位。肷合體的ΡΝΑ部位（其可以為線性的或為雙—排列的 (bis-f0rroat))作為將複合體捕獲到互補募核苷酸上的 釦形體（anchor)，其中，募核苷酸固定在固體支持物上 。PNA錨定區域的鹼基序列為嵌合體的受質區域的被分析 物提供-種獨特的標記。固體支援物支持物可以具有經定 義的物理特性。另夕卜，固體支持物可以被光或化學地編碼 喪合體的受質部位作為參加生化敎的；力能性/受質成 ^。分子構築體的受質部位包含分子結構，其在生化反應 ^為配體或酵素受質。例如，*白質或胜肽可以被用作 心_ 體、，σ的％所。胜肽在偵測配體 党體反應中也同樣有用。蛋白質 贫曰負了以用作分離具有特異 田胞表心記的細胞族群的受質。另夕卜，酵素輔助因子也 可以形成嵌合體受質部位的全部或部分，例如，Up、 cAMP、GTP等。類似的，脂肪、類 .^ ^ ^ ^ ^ 員口醇和/或脂肪酸可以形 成肷合體的受質部位，這是由於 八 岸$ 、二刀子也可以在生化反 1280365 呈中被修飾，目此可㈣本發明可以被測定出。碳氫化合 勿也可以形成嵌合體的全部或部分的受質部位。這些分子 包括：如，單糖、澱粉、多糖或蛋白多糖類等。 文貝部位可以被修飾為含有一個或更多的部位，例如 可偵測標記物或酵素剪切識別部位，如磷酸基、糖基、甲 基等。在另一種具體實例中，嵌合體的受質部位包含一個 或多個f光標記。這些標記可以與聚組氨酸、生物素、異 經基洋地黃毒疳元（digoxygenin)標記等的使用相結合 。通過使用單標記的受質部位，酵素消化從消化的受質中 消除標記物。通過使用雙標記的受質部位，酵素消化從受 質中消除猝滅染料，導致從次要染料發射出的螢光保留在 ^切產物上。通過使用具有一個可偵測的標記物外加内聚 組氨酸標記物的受質部位，酵素消化將消除螢光。並且， 來自為未剪切的受質的可偵測訊號可以被歸一化以檢測由 内聚組氨酸標記物發出的訊號。這些具體實例在實施例i 〇 、14、16和1 7中有詳細描述，其表明了這種分子構築體 可以提供關於感興趣的酵素活性的定量資訊。在另一實施 例中’嵌合體的受質部位含有一個或更多的磷酸基團或其 他感興趣的部分’其可作為部分的填酸酶或其他感興趣的 酵素的酵素剪切位點。 本發明的分子構築體可被用於偵測受質部位中發生的 變化的方法中。這裏公開的方法可被用於確定蛋白質_蛋 白質相互作用、配體一受體結合、蛋白質修飾、蛋白質表 達、在無細胞和以細胞為基形式（format)中的酵素活性 9 1280365 。本發明的方法也可被用作分 ^ 離有特異細胞表面標記物 •…被用作夕種用途。構築體可用在基因 :選刀析中、在疾病的診斷中或在治療和/或防止中、在 樂物開發和在對疾病或條件的毒理學測定中，例如但不限 於癌症、寄生蟲感染、神經I 、、生 , r、、紊亂垃血紊亂、肌肉骨胳紊 亂(muscoskeletal )、心 a 总文、功 ^ ； 〜血官紊亂、淋巴紊亂、呼吸紊 亂、内分泌紊亂和胃腸紊亂。 /通常，用於本發明的分子構築體的使用方法使PNA— 受質嵌合體與蛋白質、配體或酵素在測試樣品中反應。反 應可以在同質的溶劑中}隹并 -V iJii A iaak 進仃，或嵌合體的捕獲部位可以在 反應前被事先固定在固體基體上。如果測試反應在樣品表 面發生，制反應對後合體的受質部位進行修飾。如果生 化反應在溶劑中發生，則谈合體按照序列特異性的方式被 捕獲到寡核普酸-功能化的固體支持物上。在—種具體實 例中，彩色編碼的微粒子被用作固體支持物。微粒子可以 使用現有的方法，如LEAPS或直接沈積法組裝。LEAps是 一種已知的粒子在接近表面的光控動電組装技術，並且是 一種根據需求用於多被分析物分子分析而構築體微粒子陣 列的方法。LEAPS在美國專利6, 251，691和W0 97/40385 中有洋細兄载，在此引入作為參考。在生化反應完成後， 嵌合體被捕獲到位於固體表面的互補DNA寡核苷酸感應物 上。在隨後的檢測和資料分析中，嵌合體的相同性隨後根 據載體表面的編碼（例如珠的彩色編碼）而確定。捕獲後 ’表面上的嵌合體可根據現有的方法直接被檢測到。這種 10 1280365 方法的非限制的例子包括沈澱反應、過氧化酶或螢光染料 、標記的抗體、配體結合檢測或流式細胞計。分子構築體 的修飾的受質部位可以被一種或多種現有的形式而被偵測 到’例如’組裝的粒子的隨機編碼陣列檢測（READ) ( w 0 97/40385 )、粒子懸浮液的流式細胞計、在空間規定的 固體表面上的沈積等。 在固體表面上的DNA寡核苷酸在多元測定中作為對 PNA散合體的錨定區域的序列特異性捕獲的感應物。具有 確定驗基序列的寡核苷酸可以含有其他的修飾，例如間隔 序列、化學基團、配體和/或標記物，這些修飾有助於偶 合、雜交和/或檢測。固體表面也可以含有特定的用於偶 合的化學基團。可以直接或間接地將寡核苷酸偶合到固體 表面上。用於偶合的具體方法在現有技術中是已知的。在 較佳的具體實例中，寡核苷酸偶合可以通過以生物素—中 型抗生物素蛋白為媒介的間接偶合，或以胺一甲苯磺醯基 為媒介的直接偶合。 在本發明的一種具體實例中，分子構築體的捕獲部位 包含胜肽核酸（PNA) 。PNAs與DNA類似，具有類似胜肽 的主架。PNA主架包括通過醯胺基連接的重復的N— (2一 胺乙基）甘氨酸殘基。與DNA或RNA不同，pNA不含任何 戊糖和墙酸基。由於PNA的主鏈具有無電荷性，使得將 PNA與互補的DNA或RNA序列雜交比其他的核酸材料更加 八有特異性和更高的親和力。此外，PNa和雙一 pna可與 DNA雜交’其具有的特異性序列適於形成局部的 1280365 ΜΑ/腿/PNA三重體。⑽的特點以及合成這此分 法已在如BUchardt等的w〇 92/mG2(i 992年 ?)二公開’其在此將其引入作為參考。由於m的雜交 疋非吊特異性的，所以在雜交測定M m探針可 MA探針短。PNA在較大pH值的範圍内是穩定的，可使 低離子強度的環境。此外，PNA丨一種合成的化合物，复 在自然中不存在。因此，蛋白酵素和核酸酵素均不能識^ PNA分子的聚醯胺骨架。這—特性使得pNAs特別適合於使 用細胞溶菌產物或細胞或組織的雜交試驗。 PNA—受質嵌合體的PNAs較佳為具有1〇 —託個鹼基的 長度，更較佳為約15個鹼基的長度。在分子的N末端的 第一或第二個鹼基是與其他分子結合的隔離物。 剩餘的PNA寡聚物係作為一種探針，對嵌合體的序列特異 性雜交到固定在固體支持物上的寡核苷酸上進行調節。嵌 合體的PNA部位可以是單股或雙— PNA。雙_PNa也指“ PNA夾”，其含有通過一柔軟的“髮夾，，連接物連接的兩 個呈延伸狀的PNA募聚物。當雜交時，雙—pna與互補的 DNA形成三股結構。 與DNA — DMA和DMA — RNA雜交相比，pNAs與其互補的 DNA具有更高的序列特異性結合親和力及特異性。當用於 多元測定時，PNA嵌合體的錨定區域和與它們的互補DNA 寡核苷酸感應物雜交，所述DNA寡核苷酸感應物固定在感 興趣的載體的特定表面上（圖2 ) 。DNA寡核苷酸感應物 較佳含有特定的鹼基序列，該鹼基序列與PNA嵌合體庫中 12 1280365 的一個PNA錨形體（anchor)(即捕獲部位）互補。將寡 核苷酸固定在載體表面可用現有方法實現，其可以是通過 化學反應如胺基和甲苯磺醯基之間的反應而直接連接到表 面，也可以是通過連接分子，如在表面上將生物素化募核 苷酸結合到抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白或中性抗生 物素蛋白上而間接偶合到表面。DNA寡核苷酸感應物可以 含有間隔分子、標記物、標記或其他反應基團，以助於固 定、雜交和偵測。載體較佳含有特定的空間的和顏色特性 ，用於對固定的寡核苷酸進行解碼。在較佳的具體實例中 ，載體可以含有微粒子。當具有ns型的DNA寡核苷酸感應 物和η*型的彩色編碼珠時，可以合成得到寡核苷酸官能化 的載體庫（n3xn4)。在多元測定時，每種類型的寡核芽酸 官能化的微粒子較佳僅捕獲一種類型的pNA嵌合體。 在本發明的一種具體實例中，分子構築體包含pNA 一 受質後合體。該具體實例包含通過連接分子連接到多目太上 的PNA。通過現有的方法可合成pNA寡聚物。這樣的方法 包括 B〇C 化學、Fmoc 化學（Nielsen, P.E.，Egh〇lm，M， Peptide Nucleic Acid ： Protocols and Applications ^ PP.21-50,Horizon Scientific Press, 1999) ^ ^ in ^ 此被引入作為參考。 在本發明的另一種具體實例中，嵌合體的受質部位較 佳為胜肽’如酵素的受質一類特別適合於本發明的多元 形式的車又佳的酵素為相關酵素族中的一部分，例如，激酶 ;&c fee特異性半胱胺酸蛋白酶（)、磷酸（酯 13 1280365 )酵素、轉移酵素、核酸酵素等。對於本發明的非多元形 式，任何利用受質的生化反應都可被測定，其中，受質或 活性位點可以結合到嵌合體的捕獲部位。對於多肽受質， 用於受質胜肽的胺基酸序列可通過現有方法得到。 在本發日月巾，一種較佳的結合方法是在胜狀的末端插 入一半胱氨酸，如在合成胜肽時的N—末端。在半胱氨酸 殘基侧鏈上的聽可㈣於在合成後合體時將胜_㈣ 連接分子上。另外，離胺酸可被加入到胜肽的另一末端用 作生物素化，該生物素化用於在某些多元生化測定中進行 檢測。異型雙官能團交聯劑可被用在PNA_胜肽嵌合體的 合成中。琥珀醯亞胺基一 4— (N —馬來醯亞胺甲基）環己 烷1 (羧基—6 一氨基己酸酯），也稱作LC-SMCC ,是 一種雙特異性交聯劑，其與被分析物的巯基和氨基反應。 如現有技術所知，LC —SMCC的NHS酯首先與pNA寡聚物的 N—末端上的氨基反應，在pH為7_ 8時，能夠活化pNA 为子。然後，LC-SMCC的馬來醯亞胺基與胜肽的巯基反應 ，在pH為6.5-7.5時，形成官能化的pNA—胜肽嵌合體 。合成的PNA —胜肽嵌合體用現已知的各種方法進行純化 和濃縮。因此，可合成PNA_受質嵌合體庫，用於多元生 化測定。在PNA—受質嵌合體庫中，每種胜肽都可以結合 到特殊的PNA寡聚物上。但是’給定的一序列pNA寡聚物 可被用於建造多個PNA—受質嵌合體的子庫。 儘&不疋必需的，本發明的一個較佳具體實例在連接 PNA和又質時使用連接物。交聯物可以提供更有彈性 1280365 (flexible)的結構，這是因為它作為PNA和嵌合體的受質 部位的空間樞紐。連接物額外的彈性有助於酵素受質的相 互作用以及PNA寡核苷酸雜交。另外，在合成PNA嵌人體 時，奈米粒子可用作連接物。PNA和胜肽受質可連續戈同 時連接到粒子的表面。當磁性奈米粒子被用作連接物時， 所得的PNA受質嵌合體可根據試驗需要而被純化或富集。 可通過各種方法實現對修飾的PNA受質嵌合體的偵、貝· 。如果只應用一種PNA受質嵌合體，則已知的任何方法= 適用。當使用多元化試驗時，則需使用多個嵌合體群。15 这個測定中，給定嵌合體群的捕獲部位較佳對應於單= 型的受質部位，使得在生化反應完成後，特異修飾的礙入 體可通過其相應的序列如已知的錯形體序列而被分 別。攻些嵌合體群的捕獲是通過將嵌合體雜交到多 §曰、 上而實現的，每個表面上含有與PNA—受質 = 捕獲部位互補的寡核穿酸。多個表面可包含多個 體基質，或可以是單個的固體表面，其中表° 、固 異類型的寡核苦酸。多種^ 口 (^刀含有特 存在，例如磁性粒子、微粒子 千形式 合物、金屬或陶竟膜等。對這些粒子可以在某:或無機聚 修倚，以區別不同的群，例如通過顏色、離面加以 或反射指數，或它們的化學或物理特性等。2何、形狀 以通過物理分離’從而區分不同的群：::粒子還可 =固體基質時’其例子包括陣列或微陣列，：：的是單個 合體群被雜交以使陣列的各部分離散。〃不问的我 15 1280365 在本ι明的一種具體實例中，寡核苷酸被固定在彩色 編碼的微^子上。這些募核芽酸作為探針，從溶液中對把 又夤甘入&體的互補捕獲部位進行雜交，以用於檢測 =據序列特異性亲隹《，微粒子的顏色代碼可被用於對來 自夕元生化測定中的特定的胜狀訊號進行解碼。寡核苦酸 抓針軏仏含有1 5〜5〇個核苷酸。在募核苷酸的末端較佳 引入官能基團如氨基，以用於固冑。另外，探針的末端核 苷酸也可以被適當地生物素化或標記。合成這些修飾的寡 核苷酸的方法在現有技術中是已知的。在某些情況下，寡 核苷酸探針較佳係具有獨特的鹼基序列。 彩色編碼的微粒子的表面可以載有特定的化學基團可 用於夕元生化測定中的生物分子的固定。用於在粒子表面 產生活化化學基團的特定化學方法，在現有技術中是已知 的 如 Polymer Colloids: A copmprehensive

Introduction, edited by Fitch, R·M·， Academic Press( 1 997)。募核苷酸、DMA碎片、RNA分子、合成胜肽 、重組蛋白質、純化的天然蛋白質等可按照已知的方法通 過與表面化學基團的相互作用而固定在粒子上，例如， Bioconjugate Techniques, edited Hermanson, G. T., Academic Press( 1 995)。個別類型的彩色編碼的微粒子可 與特定類型的生物分子結合，使得來自多元生化測定的可 "ί貞測的訊號可以根據結合微粒子的顏色而被解碼。粒子與 生物分子的官能化可以使用自動設備平行進行以使偏差最 小化。另外，寡核苷酸探針可在固體基質的表面定位。例 16 1280365 如，定位的寡核苷酸陣列可用於捕獲PNA嵌合體。並且， 寡核苦酸探針可以在固體基質表面上直接合成，例如用於 捕獲PNA嵌合體的高密度寡核苷酸陣列。 在本發明的另一種具體實例中，公開了捕獲PNA-受 貝肷合，庫的方法。該具體實例在微粒子陣列上捕獲這些 庫。這裏’在進行晶片上的生化測定之前，預先形成的編 碼微粒的平面陣列被用於捕獲相應的pNA — 在另-種較佳的具體實例中，在完成了生化反應後1過 养核苷酸捕獲到PNA—受質嵌合體上的編碼粒子被組裝。 在種八體只例中，如圖3所示，已知被捕獲到載體 固體表面上的修飾的嵌合體可被抗體偵測到。修飾的嵌合 體可通過使用修飾的被標記的受f —特異性抗體而㈣到 °抗體可以源自在培養介質、人體或動物體中產生的不同 種類的免疫球蛋白分子。來自酵素標記抗體，例如，過氧 化酶標記的抗體的訊號可通過酪醯胺（tyramide)增加的 方法被偵測到。也可以使用其他類似的標記和酵素。這種 分子對於本領域技術人員是熟悉的。螢光染料標記的抗體 可用於偵測修飾受質。除了在圖3A㈠中分別顯示的單 抗體和雙抗體偵測體系外，捕獲在固體表面上的修飾的嵌 合體可以通過使用三抗體偵測系統而偵測到（圖％ )。簡 而言之，結合到修飾受質上的主要抗體可以結合到對主要 抗體是特異性的二級抗體上。修飾受質、主要抗體和第二 抗體的複合體可通過使用標記的第三抗體而偵測到。另外 ，修飾的受質可通過使用特異性的螯合分子偵測到，如胺 17 1280365 二醋酸鎵（鎵ΝΤΑ)，其對磷酸基團具有高度的親合性。 因此，鎵ΝΤΑ可被用於偵測ρΝΑ嵌合體的磷酸化的胜肽。 在固體基質上將ΡΝΑ—受質嵌合體雜交到DNA募核苷 酸上的條件是已知的，如Peptide Nucleic Acids:

Protocols and Application, edited by nielsen , P. & Egholm, M. , pg. 87-1 62, Horizon Scientific PreSS( 1 999)。已知的方法提供了範圍較寬的適當的雜交 條件和用於將嵌合體捕獲到感應物寡核苷酸上的方法。在 車乂佳的具體實例中’將DNA _受質巍合體捕獲到寡核苦酸 官能化的微粒上是依照上述條件進行的。預_雜交可以在 雜交緩衝液（例如，1QmM的磷酸納，15mM#氣化鋼’ lmg/ml的BSA， 〇. lmg/ml的熱變性的青魚精子⑽八， 〇.1%SDS’ 1〇%甲酿胺，PH7.2)中，在机以恒定速 率培養寡核㈣官能化的微粒約m BSA在預雜μ 程中封閉微粒表面未占據的位點。其他的大的非特 白質（如脫脂乾奶）適合作為BSA的替代物。 雜交步驟較佳利用具有與叙合體的捕獲部位完全互 ^列的寡料酸探針。PNA—受質嵌合體被加人到寡核 苷心功能化的粒子的懸浮液中使最終濃度A H)〜100nM 雜交可在適當條件下進行，較佳在約饥下以恒㈣ 仃"時雜父後雜交的微粒子較佳用洗滌緩 15mM的氯化鈉 轉速進行30分 洗’更佳的是’在非常嚴格的緩衝液（如i 仃： 15mM ^ >ίκ ^ , π 1 〇/ΟΤΛΟ 文納， 1%SDS，PH7.2)中在約45。口以惶定 。然後微粒子用第一洗滌緩衝液（如 18 1280365 ΙΟηΜ磷酸鈉，15mM的氣化鈉，ΡΗ7· 2)沖洗，接著用第二 洗滌缓衝液（如ΙΟΟηΜ磷酸鈉，150mM的氯化鈉，ρΗ7· 2) 沖洗，在室溫下沖洗約10分鐘。雜交條件和沖洗頻率可 根據嵌合體捕獲部位的鹼基序列而調整。用於ΡΝΑ雜交的 通用協定被 Nielsen 和 Egholm 公開（peptide Nucleci Acids: Protocols and Application, edited by Peter· E. Nielsen and Michael Egholra, Horizon Scientific Press(1999) o 本發明的多元測定特別適用於確定相關實體的存在和 活性水平，活性實體如酵素族、相關DNA結合分子、相關 配體一受體對等。一種較佳的酵素族，其可在本發明的多 元測定中被確認，是催化蛋白質的磷酸化或脫磷酸的酵素 。絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的殘基的磷酸化通常被認為是 細胞間最重要的調節機制之一。對細胞膜上的受體的刺激 活化激酿的級聯（cascade) ’導致各種細胞内蛋白質的磷 酸化。這些反應是可逆的，允許細胞以動態方式回應各種 刺激訊號。通過使用傳統方法很難同時確定多個用於在相 互連接的訊號傳導路徑中的激酶的活性。使用本發明的分 子構築體，對多個受質中的每一個來說的獨特的標記可以 被製得，以用於多元測定。在璘酸化時，磷酸化的PNA礙 合體可以被序列特異性地捕獲到寡核每酸功能化的彩色編 碼的微粒子上，通過使用對磷酸化的受質具有特異反應性 的可偵測的配體來用於偵測，磷酸化的受質如麟酸—受質 結合蛋白，填酸一受質一特異性抗體或碟酸一受質結合螯 19 1280365 合物。因此，多種激酶的活性可在組織，細胞和其他試樣 中被同時確定。 測量激酶蛋白質家族的例子如圖4所示，這裏Raf蛋 白質（Raf — 1，A-Raf以及B-Raf )是絲氨酸_蘇氨酸激 酶，其同源於PKC族，含有氨基端的調控區域和羧基端的 催化£域。Raf家族的成員結合到Ras蛋白質上導致它們 遷移到質膜上，然後活化。通過對非活化的MEK1激酶的 填酸化、Rf激酶活化MEK1激酶，反過來活化MAP激酶 2/Erk2。Rf激酶調節從Ras到MAP激酶的訊號傳遞。最近 Kolch綜述了關於這些發出訊號的複合體的調節（j.

Biochem(2000)，35:289-305)。 MAP激酶2/Erk2的活性可用PNA—MAP激酶受質胜肽 肷合體確認。碟酸化的PNA —胜肽散合體可以被序列特異 性地捕獲到寡核苷酸功能化的彩色標記的微粒子上，然後 是被磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸部分進行偵測。通過加入激 酶抑制劑，例如2, 一氨基一3，一甲氧黃酮（Ci6Hi3N〇3)， 特異性激酿可以在訊號傳導途中被抑制（見圖4)。因此 ，級聯激酶試驗可與本發明的分子構築體一同使用來债測 細胞試樣中的激酶活性。這種測定在偵測與疾病狀態和疾 病過程有關的異常激酶活性方面是很有價值的。已發現有 很夕重要的使用Ras/Raf訊5虎傳導途徑來刺激細胞增殖的 生長因子以及發出訊號的複合體在某些癌症中具有異常的 活性。這些試驗在與藥物研究和訊號傳導途徑有關的方法 中也是有用的。 1280365 第二個用於確定多重激酶活性的非限制性例子與非受 體絲氨酸激酶的JAK ( Janus族絲氨酸激酶）族有關。 JAKs與細胞内的細胞因子受體有關，並被細胞外的細胞因 子啟動。JAK激酶（JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2 )具有激酶 區域和不具有酵素活性的假激酶區域。細胞素的結合引發 細胞素受體的二聚作用，啟動相關的jAKs，其對受體自身 進行磷酸化。然後，磷酸化的受體作為含SH2的STATs ( 訊號傳導物和轉錄活化劑）的停靠區。JAK1對於從il-2 、IL-6 ( gpl30 )和干擾素（IFN )發出訊號來說是非常重 要的。JAK3對於通過共用相同g鏈的細胞素受體發出訊號 來說是必須的。另外，JAKs也活化Ras-MAP激酶途徑，並 在細胞中通過Tec、PI_3激酶途徑。JAKs的主要效應物 STATs是潛在的細胞質轉錄因子。一旦被jAK激酶磷酸化 ’ STATs通過它們的SH區域以頭一尾形式二聚。STAT1是 IFN發出訊號的關鍵媒介，STAT4對IL-2是特異性的， STAT6主要被IL -4和IL-3啟動，而il-5A和IL-5B被認 為是在調節生長荷爾蒙和促乳激素中是最重要的。這些 STAT —誘發的磷酸化過程也有利於特異性的轉錄反應。 Heinrich等對gpi3〇/JAK/STAT發信途徑的調節進行過綜 述（Biotech.J.334:297-314(1 998)) · 對本發明的PNA 一受質嵌合體的收集可應用到對多重 JAK或STAT蛋白質的活性水平的同時監控或偵測。通過使 用PNA — STAT嵌合體，對多重STATs的磷酸化可在以細胞 為基的測定中同時被確認。一種用於測量多重STAT蛋白 21 1280365 質活性水平的方法是通過將各種PNA — STAT嵌合體（包括 可侵入細胞的PNA嵌合體）加到細胞培養物中開始的。對 來自細胞素或其他化合物的刺激進行回應，JAK —STAT單 傳導途徑被活化，使得包括PNA-STAT嵌合體在内的STAT 蛋白質的磷酸化作用。當細胞以標準方法溶解時，PNA _ STAT嵌合體就被釋放到溶液中。然後，pna—STAT後合體 被序列特異性地捕獲到寡核苦酸功能化的微粒子上從而被 偵測。將PNA嵌合體雜交到微粒子上的募核苷酸可以在試 管内（試管内雜交）進行，或在具有微粒子陣列的石夕晶片 上（晶片上雜交）進行。本發明的這種具體實例如圖5所 除了 PNA _ STAT t欠合體外，其他種類的pna _蛋白質 肷合體’如PNA-JAK後合體和含有抗原決定部位的pna一胜 狀肷合體可用在為彳貞測其他訊號傳導途徑的其他效應物的 以細胞為基的功能性試驗中。這樣的試驗在封閉激酶一啟 動的轉錄活性以為了調節疾病情況中是非常有用的。人體 中的JAK — STAT訊號途徑與某些白血病的發展有關。另外 ，這些試驗在藥物發現測定和功能蛋白質組學測定中也是 有用的。 另一個偵測多重激酶活性的例子與Akt，也稱為PKB 和RAC有關，其是一種在細胞凋亡的調節和發生中具有活 躍角色的蛋白質。Akt/PKB蛋白激酶被胰島素和各種生長 因子活化。它在Wooiannin-敏感（sensitive)途徑中起作 用，包括PI-3激酶。Akt/PKB包含氨基端基普列克受質同 22 1280365 源（pl eckstr in homology，PH)區域，其回應 PI-3 激酶 的活化而結合細胞膜的填酸化的脂類。Akt/PKB通過磷酸 醋結合和在活化圈中的蘇氨酸308和在C —端基區域的絲 氨酸473處的PKD1磷酸化而活化。Akt/PKB通過其自身對 多個目標，如Bad，Forkhead轉錄因子（FKHR) ，GSK-3 和天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶-9等的磷酸化和去活的 能力而抑制細胞凋亡，從而能夠起到促進細胞生存的作用 。使用PNA-PKDtide嵌合體和PNA—Akt-SGK胜肽嵌合體 作為受質，可同時在組織和細胞中確定PKD1和Akt/PKB 的活性。這種方法包括將PNA胜肽嵌合體加入到樣品中使 之發生磷酸化作用。在磷酸化後，磷酸化的PNA胜肽嵌合 體可被序列特異性地捕獲到寡核苷酸功能化的彩色編碼的 微粒子上，包括彩色編碼的磁性微粒子。然後，被捕獲的 磷酸化的胜肽可以使用對磷酸化的胜肽特異性的配體或對 石粦酸化的胜肽特異性的抗體進行偵測。該方法的過程如圖 6A所示。 另外，如圖6B所示，Akt/PKB發出的訊號也可以在PNA 嵌合體以細胞為基試驗中被系統地研究。這種方法包括在 感興趣的細胞樣品中加入一個或多個具有受質部位的pNA 蛋白質嵌合體，這些受質部位是pKD1/2和/或Akt/PKB， 如PKD、Akt/PKB、天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶9、 FKHR、Bad和GSK-3的受質。在這裏，通過收穫pNA嵌合 體來確疋這些蛋白質的活性狀態和/或水平從而可直接測 量内激酶活性。另外，也可用活性抑揚調節劑（ 23 1280365 modulator)，如，胰良本々丄ρ σ。將^此:k m ，、或生長荷爾蒙，來處理細胞樣 口口將境些抑揚調節劑結合到細胞表 认^ A ★ 瓜衣面文體上可以活化位 於細胞膜内側上的ρΜ

Akt/pKR $t DK1/2。活化的 PDK1/2 磷酸化 AKt/PKB，反過來，碰酿乂 m p * 天；胺酸特異性半胱胺酸蛋白 鉍 9、FKHR、Bad 和 Gsk_3 外品銳# ηλτ A 蛋白質。然後，細胞被溶解， 從而釋放PNA —蛋白皙推人脚 ηλ 、人曰體。ΡΝΑ嵌合體被雜交到序列 特異性的寡核苦酸功能化的 ^ 化的被粒子或其他固體基質上。然 後，嵌合體的修飾的某皙部 、 ’' ]丞質。卩位通過標準方法而偵測到。在 圖6B中描繪出了贫、、目丨丨中 、> 4疋°這一測定在偵測與疾病情況和 病程有關的異常激酶活性上是 丨上疋很有用的。早先的研究表明 ’突變體早衰一 1基因引發细腧 土口 w知細胞凋亡，並且下調（d〇wn regulate)患有老年痴呆病患者體中的Akt/pKB(wehi，μ al.J· Neur〇Science 1 9:536〇_5369 (l 999 ))。該試驗 對於#斷這種疾病情況也是有用的。 另了用本發明的方法分析的蛋白質家族是天冬胺酸 特異性半胱胺酸蛋白酶。該酵素族與調節細胞凋亡，即程 式死亡有關。凋亡别訊號如線粒體細胞色素c的釋放促使 起始子天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶，如天冬胺酸特異 性半胱胺酸蛋白酶8，9和1 0的自催化活化。一旦被活化 ，這些天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶將剪切並活化下游 效應物如天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶3, 6和7，其反 過來又剪切〉周亡細胞的細胞骨架和核蛋白質。另一〉周亡前 刺激包括將Fas配體和TNF — α結合到受體的細胞表面， 細胞内的DNA破壞和壓迫内質網（ER) 。Fas和TNF受體 24 1280365

活化天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶8和ι〇，破壞的dna 導致天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶9的活化，而ER壓 迫導致天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶12的以鈣為媒介 的活化。這一複雜的過程如圖7所示。本發明的使用pNA 喪合體的多元測定提#了-有力的工具來同時監控發出訊 號的效率或細胞功能。 在本發明的一種具體實例中，製備pNA 一天冬胺酸特 異性半胱胺酸蛋白酶嵌合體，使得每個嵌合體含有確定前 天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶的剪切位點。PM _天 冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶嵌合體還含有至少一個標識 的標記，較佳為兩個標記，例如，一個螢光標記和一個聚 組氨酸標§己，以用於偵測。這些雙標記位於胜肽受質的剪 切位點的任何一側。細胞一可滲透的PNA —天冬胺酸特異 性半胱胺酸蛋白酶嵌合體的混合物被加入到目標細胞樣品 中〉周亡如刺激，如TNF — α或Fas配體可被加入到選擇 的樣品中引發細胞程式死亡訊號。細胞凋亡途徑的活化導 致各種天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶受質，包括pNA_ 天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶嵌合體的剪切。含在雙標 記的PNA嵌合體中的一種螢光染料被天冬胺酸特異性半胱 胺酸蛋白酶一催化的剪切而消除。當細胞被溶解時，pNA 嵌合體被釋放。然後，釋放的PNA嵌合體被捕獲到募核苦 酸功能化的微粒子上。來自單標記一剪切產物或雙標記一 剪切產物的螢光被確認和分析。 在本發明的另一具體實例中，該方法在識別新藥中是 25 1280365 有用的。在該具體實例中’小分子藥物候選物被結合到 PNAs上測試其效果。這種PNA —小分子嵌合體可被用於藥 物研究的配體的高通量的篩選。這種方法的一個例子顯示 在圖8中。這裏，製備一 PNA—小分子嵌合體庫用於進行 篩選。每種嵌合體含有特定的小分子作為受質區域，以及 PNA寡聚物與已知的鹼基序列作為錨定區域。pNA_小分子 嵌合體的混合物被加入到目標細胞培養液中，並被結合嵌 合到目4示物件上’並且引發目標細胞的活化。圖8顯示了 G —蛋白質偶合的受體（GPCR )，其引發訊號傳導。活化 後，有效的PNA—小分子嵌合體被捕獲到位於彩色編碼的 微粒子上的與之互補的募核脊酸上。可通過偵測小分子上 的標記或結合可偵測的小分子特異性配體的方式來進行偵 測。也可以通過在溫度高於以捕獲或錨定域形成的雙鏈體 的融化溫度的溶液中對粒子進行培養而除去捕獲的小分子 PNAs。 除了通過螢光光譜谓測外，也可以通過流式細胞計來 偵測雜交到在以彩色編碼的微粒子上的互縣好酸上的 PNA嵌合體的平面陣列，以及單個微粒子-顯示的m_# 合體。這種具體實例如圖9所示。因此ip.嵌合體特 :I也雜乂到固疋在彩色編媽的微粒上的寡核苦酸上的過 私可以在懸浮液中推、 力的配體進行培養，出炎成撕 β门、口 口親和 成為感興趣的嵌合體的修飾的受 位。另外，配體可 ^又貝# 3有特異性的螢光物用於偵 ’第二可偵測的γ、 为外 '可以修飾結合到嵌合體上的主要配體 26 1280365 ’保證偵測螢光物的發射波長與彩色編碼的粒子的螢光不 同。為了偵測PNA雜交，粒子用流式細胞計數分析。不同 類型的粒子根據它們自身的特異性螢光而被識別。具有捕 獲PNA嵌合體的粒子可根據來自偵測螢光物的特異性螢光 而被識別。 在本發明的另一具體實例中，PNA嵌合體被用作偵測 和分離特定的細胞，即在它們的細胞表面上表達特殊蛋白 質或其他識別體的細胞。例如，PNA —抗體篏合體被產生 ’其中’抗體對於感興趣的細胞表面受體來說是特異性的 。抗體可以用螢光染料標記以監控捕獲過程。該方法的一 個例子如圖1 〇所示。CD4 +細胞和CD8 +細胞被偵測和捕獲 。Cy3和Cy5是水溶性的花青染料，其是蛋白質、修飾的 券核早酸和含一級胺的化合物的榮光標記物。 在本發明的另一具體實例中，PNA嵌合體的受質部位 包含核酸結合區域。在該具體實例中，PNA嵌合體暴露在 可偵測的核酸前，該核酸被認為能夠與嵌合體的功能域相 互作為。然後，結合核酸被捕獲到固定基質上的寡核芽酸 上並被偵測到。該具體實例也可能是多元的。 以下的實施例描述了如何製備和使用本發明。並對之 些例子加以圖解說明。但並非用於對本發明作任何限制。 在此描述的所有的文獻特別被引入作為參考。 【實施方式】 實施例1

27 1280365 附著到固體表

上。簡而言之，對於固定數量的彩色編碼的中性抗生物素 蛋白功能化的珠來說，被培養的Cy_5標記的生物素化寡 有兩種不通的方法可以將寡核苷酸探針 面上，該固體表明如彩色編碼的微粒。在第 7· 813、15· 63、 核苷酸（0· 488、0.977、1·953、3.906、 31.25、62.5、125和250 nM)的量增加。在室溫條件下 ，偶合反應在PBS上進行30分鐘。偶合之後，未束缚的 寡核苷酸通過用PBST洗滌珠而除去。微粒的表面上未被 占據的位點利用BSA(l〇mg/ml，在i〇〇mM磷酸鹽緩衝液 中，pH為7.4)封閉。經1〇〇 raM，pH值為74的磷酸鹽 緩衝液的洗滌之後，微粒可以被存儲在rc的貯存緩衝液 中。然後’不同類型的珠一起被放進一個試驗試管中用於 組裝形成微粒陣列。在螢光顯微鏡下檢測陣列。圖11A中 顯示了中性抗生物素蛋白的滴定序列的結果。31 nM的生 物素化寡核苷酸的偶合能夠使中性抗生物素蛋白功能化的 珠（直徑為3.2//m)上的所有區域飽和，這顯示了當寡核 苦酸濃度增加時，以1 00 0ms積分記錄的Cy5訊號強度大 28 1280365 致從100增加到6000。在圖 平均標準偏差。 11A中顯示的誤差條線顯示了 募核苷酸也可以通過形成共價連接而直接結合到固體 載體的表面上。根據現有方法，氨基可以結合到寡核苷酸 的5’終端。將寡核芽酸結合到甲苯續醯基活化的微粒上可 以在個單步反應中達到。目i 1β中顯示了以胺一甲苯石黃 醯基為媒介的直接偶合的例子。簡言《，對於固定數量的 彩色編碼的甲苯績醯基—活化珠來說，被培養的^5標記 的氨基修飾募核苷酸（0.977、1953、3.9〇6、7 813、 15.63、31.25、62.5、125、250 和 500 nM)的量增加。 一般來說，偶合反應在1〇〇 mM且ρΗ為7·4的磷酸鈉溶液 中在37 C下過夜。偶合之後，未束缚的募核苷酸通過用 PBST洗滌珠除去，並且微粒用牛血清白蛋白（BSA )( lOmg/ml，在100 mM磷酸鹽緩衝液中，pH為7· 4)將微粒 表面未占據的位點封閉。封閉是在37°C下在恒定轉速的狀 態下進行1小時。然後，不同類型的珠一起被放進一個試 驗式管中用於組裝形成微粒陣列。在螢光顯微鏡下檢測陣 列。在圖11B中顯示的滴定序列的結果表明當寡核苦酸濃 度增加時，以1 000ms積分記錄的Cy5訊號強度大致從1 〇〇 增加到5 0 0 0。在圖11B中顯示的誤差條線顯示了該方法的 標準偏差。利用250 nM氨標記的寡核芽酸的偶合能夠使 甲苯績醯基-活化包覆的珠（直徑3 · 2μπι )上的所有位點飽 和。在用100 mM且pH為7· 4的磷酸鹽緩衝液洗濰之後， 寡核苷酸功能化的微粒可以以恒定轉速存儲在4 °C的貯存 29 1280365 緩衝液（100 mM璘酸鹽，1 mM EDTA，含有〇·〇5%疊氮化 納）中。 U勿素化ΡΝΑ寡聚物的純化 合成的ΡΝΑ嵌合體可以用液相層析純化。圖2顯示了 兩種生物素化ΡΝΑ寡聚物的用高壓液相層析（Hplc )純化 的例子。生物素化的雙-ΡΝΑ ( “ ΡΝΑ夾，，）和線性ΡΝΑ分 別具有4· 3kD和7. 5kD的分子量。ΡΝΑ寡聚物在凝膠過濾 管柱上，在10mM的Tris—緩衝液、pH值為7.5、和125 mM NaCl中的分離，並以260 nm的波長監測圖譜的圖像。 流速為〇· 5 ml/分鐘的0· 5ml洗脫液中的48種餾分被收集 。兩個特別的單峰，一短一高分別對應於4· 3kDdePNA夾 (第25餾分）和7.5kD的線性PNA (第28餾分）。純化 的PNA寡聚物的分子量通過質譜分析確定。 life 例 3 毯-ik的PNA-胜肽後合體的分光光度性能 為了驗證PNA嵌合體的螢光標記，通過掃描分光光度 計記錄純化的PNA嵌合體的分光光度性能。在圖丨3a和 13B示出的純化的四甲基若丹明（tmr)標記的pNA胜狀礙 合體以及Cy5標記的PNA的分光光度性能分別顯示了 PNa 和螢光染料不同的吸收特徵。250-300nm波長範圍的峰對 應於含有或不含有胜肽的PNA，其中，TMR標記（圖} 3A ) 係由50 0-550nm範圍的峰值識別，而Cy5標記（圖13B) 係由6 2 5- 6 75 nm波長範圍的峰識別。 1280365 實施例4· 摹聚物良行晶片上雜交到微粒陝列上的 核择酸卜. 進行晶片上雜交試驗是為了確定固定在微粒陣列上的 DNA募核芽酸對雙—pNA寡聚物的序列特異性捕獲。簡言 之，雙一PNA募聚物是一個在每個臂上具有12_13個胸腺 嘧啶鹼基的PNA夾。在雜交之前，四種類型的生物素化寡 核苷酸被偶合到中性抗生物素蛋白功能化的微粒上，每個 寡核苷酸分別含有18-mer的低聚腺嘌呤（A_18) 、18個 核苷酸（N-18)的非相關序列、1〇_mer聚合腺嘌呤（Α_ι〇 )以及10個核苷酸（N_1〇)的非相關序列。偶合之後， 所有的募核苷酸功能化的微粒於不含有寡核苷酸捕獲探針 的陰性對照組粒子被放入到一個試管中用於在矽片上組裝 成微粒陣列。晶片首先在含有90inM NaC1、83mM硫氰酸胍 、8mM MgCl2、17nM EDTA、〇. 1%生物素、〇. 1Tween_2〇、 70mM Tris-HCl ’ pH為7.5的緩衝液中，在4〇t下預雜交

20分鐘。然後’生物素化的雙—m被加入到預雜交緩衝 液中形成200nM的最終濃度。雜交在4〇1的增濕房内進行 1小時。陰性對照組晶片在雜交緩衝液中不接受m。雜 交完成後，在室溫下，晶片用100mM NaC1、i〇mM HC1 ’ pH 為 7.5、0.1% TWeen-20 沖洗 1〇 分鐘。為 了對生 物素化PNA雜交到有粒子陳列的寡核苷酸控針上進行偵測 ，晶片在lOOmM NaCl、l00mM碑酸納，邱為7 5的溶液中 用Cy5結合的鏈黴抗生物素蛋白在室溫下培養3〇分鐘。 31 1280365 在用 15mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH 為 7.5 的溶液沖洗 後，利用螢光顯微鏡觀察陣列。利用通過特定波長的不同 時檢程式可從同一晶片中得到不同的圖像。根據微粒各自 的顏色代碼可以確定微粒的特徵。來自晶片的Cy 5晶片圖 像的珠的試驗訊號和解碼的粒子合並。來自配對的A—工〇 和A-18粒子的試驗訊號以及來自未配對的n-1〇和a-18 粒子的試驗訊號被萃取用來分析。具有Cy5訊號的粒子通 過標準圖像分析識別。如圖14所示，雙—pna夾特異性地 雜父到聚腺嗓吟的l〇-mers和18-mers功能化的粒子上， 然而，雙-PNA夾不能雜交到非相關的核苷酸序列（νη 〇 或N-18 )上。相反的，陰性對照組陣列未捕獲pNA。利用 電腦私式來自動排列來自晶片的圖像。從圖像中提出不同 波長下的螢光強度，並分配給晶片上的對應的粒子。然後 ’染色的珠的内部染料的螢光強度被聚集在一起。 實施例5 1雙一PNA寡聚物雜交到彩色編碼的檄鈕^的MA复枋并 藥上的試營内雜交 進行试管内雜父试驗是為了確定在彩色編碼的微粒上 的DNA寡核苷酸對雙一 pna寡聚物的序列特異性捕獲。簡 言之，雙一PNA募聚物是一種在每個臂上有12_13個胸腺 鳴咬驗基的生物素化PNA夾。在雜交之前，四種類型的生 物素化寡核脊酸被偶合到中性抗生物素蛋白功能化的微粒 上’寡核苦酸分別含有18-mer低聚腺嘌呤（A-18) 、18 個核苷（N-18)的非相關序列、l〇ie;r聚腺嗓吟（A—1〇) 32 1280365 以及ίο個核苷酸（N〜10)的非相關序列。在表面上，調 控微粒不含寡核苷酸。偶合之後，將所有寡核苷酸功能化 的微粒放入一個試管。寡核苷酸功能化的微粒首先在含有 90mM NaCl、83mM 硫氰酸胍、8mM MgCl2、17fflM edta、 0-1%生物素、O.lTween-20、70mM Tris-ΗΠ，PH 為 7.5 的 緩衝液中，在4(TC下預雜交2〇分鐘。接著，生物素化的 雙一PNA被加入預雜交緩衝液中形成2〇〇nM的最終濃度。 雜交在40°C的增濕房内進行】小時。陰性對照組在雜交緩 衝液中沒有PNA時被檢驗。雜交完成後，在室溫下，粒子 用 100mM NaC卜 l〇mM Tris-HC1 ， pH 為 7.5 、 0·1% Tween- 2 0冲洗1 〇分鐘，然後在矽晶片上組裝微粒陣列。為了偵 測被捕獲生物素化PNA，晶片在i〇〇mM NaCl、l〇〇mM磷酸 鈉且pH為7· 5的溶液中用Cy5· 5結合的鏈黴抗生物素蛋 白（20 mg/ml)在室溫下培養3〇分鐘。在用i5mM NaC1、 10mM Tris-HC1，pH為7· 5的溶液沖洗後，利用螢光顯微 鏡檢查陣列。根據微粒各自的顏色代碼可以確定微粒的特 徵。具有Cy5· 5訊號的粒子通過電腦程式來識別。如圖 15A顯示，雙-PNA夾明顯雜交到a—18功能化的粒子上， 而沒有雜交到C-18和N-18上，更具體地，雙—pna夾被特 異地捕獲到A-18上，並且在Cy5· 5途徑上在1 000ms内積 分產生一個約4750個規定單元的Cy5. 5訊號，同時C-18 和N-18功能化粒子分別產生了約500和1 000的Cy5· 5訊 號。由試管内PNA雜交產生的Cy5. 5訊號強度（圖15A) 可以與實施例4敘述的晶片上雜交（圖1 5B )相穩合。 33 1280365 ~ ^ 合體雜交到排列在微验陣列上的DNA幂 核苷__ 進订晶片上雜交試驗是為了確定固定在微粒陣列上的 DNA募核苷酸對雙— pNA寡聚物的序列特異性捕獲。簡言 之，雙〜ΡΝΛ蛋白質嵌合體是一個Cy5.5標記的鏈黴抗生 物素蛋白和生物素化P·夾的結合體。每個陣列上PM夾 含有12-13個胸腺嘧啶鹼基。配合使用適當量的Cy5· 5標 圮鏈黴抗生物素蛋白和生物素化的PNa，在室溫下PM中 進行30分鐘。在雜交之前，四種類型的生物素化的募核 苷酸被偶合到中性抗生物素蛋白功能化的微粒上，寡核苷 酸分別含有18-mer低聚腺嘌呤（A—18) 、18個核苷酸（ N-18 )的非相關序列、1〇 —mer聚合腺嘌呤（A —1〇 )以及 10個核苷酸（N-10)的非相關序列。偶合之後，所有的寡 核苷酸功能化的微粒和不含有寡核苷酸捕獲探針的陰性對 照組粒子被放到一個試管内，以在矽晶片上組裝微粒陣列 。晶片首先在含有90mM NaCl、83mM硫氰酸胍、8mM MgCl2 、17nM EDTA、0· 1%生物素、〇· 1Tween —2〇、7〇mM Tris — 此1’011為7.5的緩衝液中，在4〇。(；：下預雜交2()分鐘。 然後，雙一PNA被加入雜交緩衝液中形成2〇〇nM的最終濃 度。雜父在40 C的增濕房内進行j小時。陰性對照組晶片 在雜交緩衝液中沒有接受到PNA。雜交完成後，在室溫下 ，晶片用 lOOmM NaCl、i〇mM Tris-HC1，pH 為 7. 5、0· 1%

Tween-20沖洗10分鐘。利用螢光顯微鏡檢查陣列。使用 34 l28〇365 :夠透過特定波長的不同濾鏡’從相同晶片中取得—些圖 。艮據微粒各自的顏色代碼可以識別微粒。且- =號=子通過在實㈣4中描述的標準圖像;析得以確 :二圖：所示’是雙-PNA蛋白質嵌合體特異性地雜交 Γ的聚腺嗓吟偶合的粒子上，其與請的對形 成比較。在兩種情況下，C—18，Ν_18和對照（無；在表 面上沒有寡㈣酸）僅導致了約45個單元的Cy5.5訊號 強度（以l〇〇〇ms積分）。 在磁性彩色編礁 上土募核哲酸的晶片上雜吞 將目標分子晶片上雜交到募核苷酸探針，使其被固定 在彩色編碼的磁性粒子上。具體地，具有已知核苷酸序列 (〇· 4μΜ )的生物素化寡核苷酸被偶合到給定類型的彩色 編碼磁性粒子（約6· 7χ1〇5個粒子）上，該磁性粒子表面 披覆了中性抗生物素蛋白。偶合反應在〇 ·丨m 1的緩衝液 (150 mM NaCl、0.05 mM 乙二胺四乙酸（EDTA) 、〇· 5% 牛 也清白蛋白、0.5 mM Tris-HC1和100·石粦酸鈉，pH 7.2 )中在室溫下震盪進行3〇分鐘。偶合之後，粒子利用一 種磁性體收集。未反應的中性抗生物素蛋白位點在震盪下 在 150 mM NaCl 和 1〇〇 遞填酸納含有 0.05% Tween-20 且pH值為7· 2的溶液中在室溫下利用〇· 1 %的生物素阻斷 。阻斷之後’粒子用〇 2mi的g NaCl和1〇〇 πιΜ鱗 35 1280365 酸納0.2ml含有{K〇5〇/GTween-20且pH為7·2的溶液沖洗 。這種方法也可以應用到將其他生物素化寡核苷酸偶合到 其他類型的中性抗生物素蛋白彼覆的粒子中。 幾種類型的彩色編碼的寡核苷酸功能化的微粒，包括 磁性粒子和非磁性對照組，被一同放到一個試管中，根據 現有方法組裝成微粒子陣列。在這個例子中，陣列形成在 2. 5x2· 5mm的矽質晶片上，其含有4〇〇〇個區域的陣列模板 。生物素化胜目太核酸（P N A )寡聚物在顯示互補寡核苦酸 捕獲探針的微粒子陣列上的晶片上雜交是在3()微升的雜

父緩衝液（90mM NaCl、83mM 硫氰酸脈、8mM MgCl2、17nM EDTA、0· 02%生物素、〇· iTween —2〇、7〇mM Tris-HC1，pH 為7.5)中進行的，其中雜交緩衝液含有2〇〇nM濃度的生 物素化PNA寡聚物。在40 °C下，雜交在一個旋轉振盪器上 進行60分鐘。等到雜交完成，在室溫下，將陣列用5〇微 升的 250mM NaCl、lOmM Tris-HC1 且 pH 為 7· 5、0· 1%

Tween-20沖洗i〇分鐘。通過在15〇mM NaC1、1〇〇mM磷酸 鈉且pH為7.2下，用Cy 5.5—結合鏈黴抗生物素蛋白（18 A g/m 1 )在室溫下對微粒陣列進行培養3〇分鐘後，可觀 察到捕獲的生物素化的PNA募聚物。在用15mM NaCl、 l〇mM Tris-HCl且ΡΗ為7· 5的溶液沖洗後，在螢光顯微鏡 下檢查陣列。從彩色編碼的微粒和Cy5· 5標記的ΡΝΑ寡聚 物發出的榮光可以利用具有特定波長的光學濾鏡而確定。 對磁性或非磁性粒子係根據其顏色代碼解碼。具有Cy 5訊 就的粒子通過如圖4顯示的標準圖像分析來識別。如圖i 7 36 1280365 顯示的試驗結果表明，PNAs特異性雜交到陳列在彩色編碼 磁性和非磁性粒子上的互補寡核苷酸上。更具體地， Cy5· 5訊號強度係自晶片上雜交試驗中的兩個微粒陣列（ 晶片A和B’分別為圖A和B) @四種類型的彩色編碼微 粒m)來確定。類型^粒子是彩色編碼 的磁性粒+，而類型n、是三種不同類型的非磁性 的彩色編碼的粒子。類型1和Π的粒子用肖PNA寡聚物互 補的生物素化寡㈣酸固I類型π粒子利用具有非相關 鹼基序列的寡核苷酸偶合到ΡΝΑ上。類型贝粒子在表面上 沒有募核苦酸。晶片B作為晶片a的陰性對照組，其利用 沒有PNA的雜交混和物培養。“n”表示晶片上的粒子數 置。類型I和類型Π的粒子分別產生約225〇和15〇〇的訊 號強度’而類型HI和類型IV不產生明顯螢光，Μ 4〇〇和 250 Cy5. 5訊號強度。條狀表示了平均的標準偏差。 實施例8 在微粒陣列上 這在圖13和實施例3中已有所述。在雜交之前，如實施 例1所述，四種類型的生物素化的寡核苷酸被偶合到中性 抗生物素蛋白功能化的微粒上。寡核苷酸分別含有如下序 進行試管内雜交分析，以確定位於彩色編碼的微粒丨 列上的MA寡核苦酸對雙_PNA_小分子嵌合體的序列; 特異性捕獲。簡言之’雙-PNA—小分子喪合體是一種: 每個臂上含有1 〇個鹼基和Cy5染料的雙一 pNA的共軛物 37 1280365 列：l〇ier聚腺嘌呤（A-10)和1〇 mer、每一個互補到 雙—PNA寡聚物（P-10)的一個臂上。還包括有未顯示募 2苷酸捕獲探針的對照微粒。偶合之後，所有寡核苷酸功 能化的微粒和不含寡核苷酸捕獲探針的陰性對照組粒子放 到個忒官中以在矽晶片上組裝微粒陣列。晶片首先在含 有 9 0mM NaCl、83mM 硫氰酸胍、8mM MgCl2、17nM EDTA、 l/。生物素、〇· 1Tween—20、70mM Tris—Hci 且邱為 7· 5 的緩衝液中，在4〇°c下預雜交2〇分鐘。雙_ ㈣共 軛體被加入到預雜交的緩衝液中形成約2〇〇nM的最終濃度 雜交在40 C的增濕房内進行1小時。陰性對照組晶片被 放到不含有PNA嵌合體的雜交緩衝液中。雜交完成後，晶 片用 15mM NaH、l〇mM Tris-HC1 且 pH 為 7· 5 溶液沖洗， 然後在榮光顯微鏡下檢查。根據微粒各自的顏色代碼可以 確定微粒。具有Cy5· 5訊號的粒子通過如實施例4所述的 標準圖像分析可從珠中識別出。圖顯示的晶片分析結 果顯不了雙一 PNA —小分子嵌合體特異性雜交到用互補p一 1 〇捕獲探針功能化的粒子上，但沒有雜交到A—丨〇粒子和 對照粒子上’該雙—PNA _小分子嵌合體產生雜交訊號（ 以50Oms整段時間記），而在晶片上的粒子沒有產生明顯 的訊號。誤差條線表示平均的標準偏差。 f施例9 金^粒陣列上生三種磷醢化胜肚的標準曲緩 三種不同的生物素化磷酸化胜肽（胜肽-P-1、胜肽-P一 2和胜肽-P-3 )。胜肽-P-1 :生物素- 38 1280365 CKVEKIGEGT[pY]GVVYK (序列ID號：1)，衍生於人類酪 氨酸激酶受質p34cdc2，其中，在胺基酸11上的酪氨酸被 填酸化（Cheng，et al. J. Biol. Chem· 267: 9248-9256， 1 992 ) 。胜肽-P-2 :生物素- CEGPWLEEEEEA[pY]GWMDFK-生物素（序列 ID 號：2)，是 人類胃泌激素-17，在酪氨酸的13位上被磷酸化（

Baldwin et al，Nature，301，435-437，1 983 )。胜肽-P-3:生物素-CRRLIEDAE[pY]AARGK (序列 ID 號：3)，衍 生於來自勞氏肉瘤病毒轉移蛋白在p6〇src上酪氨酸磷酸化 位點，在胺基酸1〇上的酪氨酸上被磷酸化（Casnelli et al，PNAS 79: 282-286，1982)。在規定濃度 〇、look 、〇·0024 、 0·0048 、 〇·0064 、 〇·〇〇8 和 〇·〇12pg/ml 下，胜 肽P 1、胜肽-P-2以及胜肽-P — 3被偶合到彩色編碼的微 粒上，這種微粒已如前述的實施例丨用中性抗生物蛋白 功能化了。然*，所有胜肽功能化的微粒按照現有的方法 (諸如實施例1所述）組合以組裝入微粒陣列。組裝的微粒 陣列用對所有胜肽上璘酸化修㈣具有特異性的單株抗體 :仃培養。為了達到將訊號放大的㈣，用螢光染色標記 =級抗體對W進行培養，其中，二級抗體對結合在陣 列上的主要單株抗體具有 ^ ，、有特異性。用PBST洗滌後，陣列 檢查T中的方法(如隱分析法)利用螢光顯微鏡 種微位方法，三種磷酸化胜肽的標準曲線可用-種镟粒陣列而產生（圖 ㈣為整段時間的對鄉-辰度的增加’在以 w ; 一種磷S文化胜肽的Cy5螢光訊 39 1280365 號強度也增加了，以500ms為整段時間中Cy5訊號強度的 範圍為從約400到約1 400單位。圖19顯示的誤差條線表 示平均的標準偏差。 f施例1 Π 翁列上磷酸化胜p標準曲線的產峰 每種如實施例9所述的具有規定濃度〇、〇. 002、 〇·〇〇4、〇.〇〇8、0.01和〇·12 # g/ml的生物素化磷酸化的 胜肽（胜肽-P-1和胜肽—p_2)被偶合到特定類型的彩色編 碼珠上，這種珠已經根據現有技術（如實施例1的方法）在 其表面上彼覆了中性抗生物素蛋白。粒子的表面上未反應 的區域係根據現有技術的方法阻斷。然後，根據現有方法 ’將具有相同類型的麟酸化胜肽的功能化珠一起放到試驗 減管中’根據現有方法組裝成粒子陣列。現有的方法如 LEAPS和在臨時專利申請號60/343, 621 ( 2001年12月28 曰申請）以及美國申請號1 0/1 92, 352 ( 2002年7月9日 申請）中描述的直接配置組裝法。組裝的微粒陣列用對所 有胜肽上磷酸化修飾具有特異性的單株抗體進行培養。為 了達到將訊號放大的目的，主要單株抗體利用特異性的二 級抗體和螢光（Cy5)標記的第三種抗體而被進一步結合。 用PBST洗滌後，陣列根據現有技術中的方法（如READ分 析法）利用螢光顯微鏡檢查。通過這種方法，利用一種微 粒陣列產生磷酸化胜肽標準曲線（圖20)。對於胜狀—pH ’以500ms積分的Cy5訊號強度從約500増加到約5〇〇〇 個單位’峰值出現在〇· 008 /z g/ml濃度上。類似地，對於 胜肽-P-2，以500ms積分的Cy5訊號強度從約5〇〇增加到 約4500個單位，峰值出現在〇· 〇〇8/z g/ml濃度上。圖2〇 顯示的誤差條線表示平均的標準偏差。 1280365 實施例η 利用在微粒陣列上的過氣化酵素結合的抗體對旙醢化胜肽 的免疫偵測 每種生物素化磷酸化胜肽或生物素化非磷酸化胜肽被 偶合到特定類型的彩色編碼珠上，這種珠已經根據現有技 術（如實施例1的方法）在其表面上彼覆了中性抗生物素蛋 白。載體表面上的胜肽密度如實施例1所述達到最大化。 偶合之後’將粒子用加入了 0 05% Tween-2〇(PBST)的磷酸 緩衝的鹽水（PBS ; 0· 1M磷酸鈉，〇. 15氯化鈉，PH值為 7· 2 )洗條。然後，根據現有方法，所有胜肽功能化的珠 被一起放到測試試管中以組裝成微粒子陣列。現有的方法 諸如靠近表面光控電動微粒組裝（LEAPS )和臨時專利申 請號60/343621 ( 2001年12月28日申請）以及美國申請 號1 0/1 92352 ( 2002年7月9日申請）所述的直接配置組 裝法。組裝的微粒子陣列在PBST中利用1%的牛血清白蛋 白（BSA )阻斷。對於在陣列上磷酸化胜肽的免疫偵測， 晶片利用對磷酸化修飾具有特異性的過氧化酵素配合的單 株抗體進行培養。為了將抗體結合到磷酸化的胜肽上，培 養在增濕房内進行。抗體結合的微粒子陣列利用pBsT ^ 洗滌，然後根據現有技術利用過氧化酵素受質偵測，現有 技術如分子探針的酪醯胺試劑（如分類號t —L 20916 等）。 ’

兩種嶙醱化胜肽（Ty-p-l 酉曼化胜肽（Ty-p-1或胜肽p —2)之 或一種非磷 在圖 1280365 酸化胜肽，或無胜肽的對照組（PBS )進行偶合，其中， 在酪氨酸的14位置上被磷酸化，其中，以-丨是生物素 KVEKIGEGTYGVVYK (序们IM虎：4)，Ty—p一uTy —Γ，但 在胺基I 10的上有一個磷酸化的酪氨酸（生物素一 KVEKIGEGT[pY]GVVYK )，並且胜肽-ρ —2 :生物素— CEGPWLEEEEEEA[pY]GWMDFK(序列 ID 號：2)。胜肽功能化 的微粒被組裝到粒子陣列，制對修飾具有特異性的驗性 %酉夂酶配合的單株抗體進行免疫㈣。通過利㈣酿胺試 劑對結合抗體進行㈣。來自珠的螢光訊號根據現有方法 利用螢光顯微鏡偵測，現有的方法如隨機編碼陣列偵測（ READ)分析。簡言之，從彩色編碼微粒及被分析物發出的 螢光係利用特^的光學遽鏡確^。粒子的等同性係根據其 獨特的顏色代碼進行解碼。具有陽性測定訊號的粒子用: 實施例4所述的標準圖像分析識別。由鹼性磷酸酶催化化 子反應產生的螢光產物 螢光素isothiocynate(FITC) 沈積在結合抗體的珠上。圖21顯示在磷酸化胜肽中較高 的FITC訊號強度，對於以―ρ— 1在l〇〇〇ms内的積分為 11000單位，對於Ty —P —2在1 000ms内的積分為1 5000單 位，/又有磷酸化的Ty—丨或對照組中顯示了明顯低的訊號 ，大約在lOOOins内的積分為700單位。圖21顯示的誤差 條線表示平均的標準偏差。 實施例12 m粒陣營光染制二盤記的抗體偵測磷酸化胜壯 每種生物素化磷酸化胜肽或生物素化非磷酸化胜肽被 42 l28〇365 偶合到特定類型的彩色編碼珠上，這種珠已經根據現有技 術如實施例1的方法在其表面上彼覆了中性抗生物素蛋白 。載體表面上的胜肽密度如實施例丨所述達到最大化。偶 合之後，將粒子用PBST洗滌。然後，根據現有方法，所 有胜肽功能化珠被一起放到測試試管中以組裝微粒子陣列 。現有的方法如（leaps)和臨時專利申請號60/343621 ( 2〇〇1年12月28日申請）以及美國申請號1〇/1 92352 ( 2002年7月9日申請）所述的直接配置組裝法。組裝的微 粒陣列在PBST中用1 %的bsA阻斷。對於在陣列上磷酸化 胜肽的免疫偵測，晶片利用對磷酸化修飾具有特異性的單 株抗體進行培養。為了將抗體結合到磷酸化的胜肽上，培 養在增濕房内進行。未結合的抗體利用PBST來洗滌。為 了達到訊號放大的目的，用對結合在陣列上的主要單株抗 體具有特異性的二級抗體培養晶片。通過用對二級抗體具 有特異性的螢光標記的抗體對晶片進一步培養，訊號可以 被進一步放大。用PBST沖洗之後，然後根據現有方法如 READ測定，利用螢光顯微鏡驗查陣列。 在微粒陣列上利用螢光標記的抗體對磷酸化胜肽的免 疫偵測的結果顯示在圖22中。簡言之，四種類型彩色編 碼微粒的每一種和兩種磷酸化胜肽（Ty-p-1或胜肽—p —2) 之一、一種實施例u中所述的非磷酸化多胜肽（Ty—ι)或 …、胜肽的對肤組偶合。胜肽功能化微粒被組裝到粒子陣列 利用對磷酸化胜狀特異的單株鼠1 gG抗體對晶片進行培 養，然後利用對鼠lgG 一特異性的二級抗體進行培養，然 43 1280365 後用Cy 5標記的第三抗體利用螢光顯微鏡進行偵測。通過 Cy5訊號偵測螢光。圖22顯示在磷酸化胜肽中較高的Cy5 訊號強度，對於Ty-P-丨在1 000ms内的積分為15〇〇〇單位 ，對於胜肽-P-2在i〇〇〇ms内的積分為155〇〇單位，沒有 磷酸化的Ty-Ι或對照組中顯示了明顯低的訊號，大約在 1000 ms内的積分為1400單位。圖22顯示的誤差條線表示 平均的標準偏差。 實施例13 支徵粒陣列上利^ 光染料標記的抗^體對多磷酴化賊听的 偵測 每種生物素化磷酸化胜肽或生物素化非磷酸化胜肽被 偶合到特定類型的彩色編碼珠上，這種珠已經根據現有技 術如實施例1的方法在其表面上彼覆了中性抗生物素蛋白 載體表面上的胜目太密度如實施例1所述達到最大化。偶 合之後，將粒子用PBST洗滌。然後，根據現有方法，所 有胜肽功能化珠被一起放到測試試管中組裝微粒子陣列。 現有的方法（如LEAPS )和臨時專利申請號60/343621 ( 200 1年12月28日申請）以及美國申請號1〇/1 92352 ( 20 02年7月9日申請）所述的直接配置組裝法。組裝的微 粒陣列在PBST中用1%的BSA阻斷。對於在陣列上磷酸化 胜肽的免疫偵測，晶片係利用對磷酸化修飾具有特異性的 單株抗體進行培養。為了將抗體結合到磷酸化的胜肽上， 培養在增濕房内進行。未結合的抗體用PBST洗滌。為了 達到訊號放大的目的，用對結合在陣列上的主要單株抗體 1280365 /、有特異性的一級抗體培養晶片。用對二級抗體具有特異 性的螢光標記抗體對晶片進一步培養，訊號可以被進一步 放大。用PBST沖洗之後，然後根據現有方法如READ測定 ’利用螢光顯微鏡驗查陣列。 在微粒陣列上通過利用螢光標記的抗體對磷酸化胜目太 的免疫偵測的結果顯示在圖22中。簡言之，如實施例9 和11所述’六種類型彩色編碼微粒的每一種和四種碟酸 化胜肽（胜肽-P-1、胜肽-P — 2、胜肽_p_3或Ty —P—n之 一、一種非麟酸化胜肽（Ty- 1 )或無胜肽的對照組偶合。 胜肽功能化微粒被組裝到粒子陣列中。利用對磷酸化胜肽 特/、的單株鼠1 gG抗體對晶片進行培養，然後利用對鼠 1 gG —特異性的二級抗體進行培養，然後用Cy5標記的第 二抗體利用螢光顯微鏡進行偵測。通過Cy5訊號偵測螢光 。圖23顯示在磷酸化胜肽中較高的Cy5訊號強度，對於 胜肽-P-1、胜肽-P-2、胜肽—p — 3和Ty-P-l在l〇〇〇ms内的 積分為約14000單位，沒有磷酸化的丁广！或對照組中顯 示了明顯低的訊號，在1 〇〇 〇ms内的積分約為5〇〇單位。 圖2 3顯示的誤差條線表示平均的標準偏差。 實施例14

一種被分析物可用兩種螢光染料標記。根據現有技術 的方法，一種螢光染料標記被分析物的内部或外部，而另 一種染料在感興趣的生化反應中參與到被分析物中。來自 被分析物的螢光（被分析物訊號）和來自測定的螢光可以 45 1280365 根據現有技術如READ測定利用螢光顯微鏡確定。和反應 效率相關的陣列訊號通過比率量化來估計，即，測定中的 /貝J疋Λ號與被分析物訊號的比率。對於雙重標記被分析物 的比率量化的常規設計如圖24α。 一種雙重標記ΡΝΑ胜肽嵌合體的特異設計如圖24Β中 顯不。ΡΝΑ —胜肽嵌合體含有合成胜肽的ρΝΑ錨定區域和 功能區域。含有天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白SI 3剪切位 點的。成胜狀被c~端的螢光染料（Cy3)和ν一端的聚組 氨I ( His6)相鄰。PNA—天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶 3雙重標記胜肽嵌合體如下·遺―連接物(用於結合 )His His His His His His Asp Glu Val Asp Ala Lys-(C18-間隔物）-Cy3(序列id號：5)。 嵌合體的天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶3消化（藉读 在冬氨酸殘基# 3,位點剪切)導致Cy3螢光染料的剪切。 肖化後甘入口體通過序列特異性的雜交而被捕擔 到特定彩色編碼微粒的表面。具有捕獲的PM-胜肽p ㈣微粒被組裝為微粒陣列。欲合體上的_標記通^ 晶片上Hls6-特異性單株抗體制。主要單株抗體通過使 用特異性二級抗體和螢光Uy5)標記第三抗“ __ 步結合。來自微粒_ Cy3螢光強度和未剪切嵌合㈣ 部位相關’而Cy5標記的強度對應於在微粒陣列上捕 肷合體總里。這樣’相對天冬胺酸特異性半胱胺酸： 3活性通過確定測定中Cy3與Cy5的比率來定量 = 24C )。由比率量化確定 （圈 妁、、、口果顯不田天冬胺酸特異性4 46 1280365 脱胺酸蛋白酶3濃度（〇、〇·〇625、0.125、0.5、1、2和 4 ng/ // 1 )增加時，螢光Cy3/Cy5訊號比率從約i降到 0· 6。圖24C顯示的誤差條線表示平均的標準偏差。 實施例15 藉雜交到1色編碼微敘上寬枋并舱的 PNA嵌合艚 囷2 5 A顯示了藉由流式細胞計偵測雜交到彩色編碼微 粒上寡核穿酸@ PNA欲合體。簡言之，兩種類型的標記綠 色編碼的珠（綠A和綠B)分別舆兩種具有特定鹼基序列 (綠A生物素—間隔物_ — AAAAAAAAAA，序列a號·· 6 ; 綠B ·生物素一間隔物-AAGGAGAGAA，序列Ιβ號·· I )的 寡核芽酸偶合。寡核苷酸在珠上的固定如實施例1所述或 根據現有技術進行。綠A和β珠在綠色頻道具有獨特的發 射波長，雖然珠在橙色波長之發射波長基本上重疊（圖 25Α )。养核苷酸功能化的微粒被用於如實施例5中描述 的4 &内ΡΝΑ雜交中。生物素化的ρΝΑ —胜肽嵌合體的 ΡΝΑ錨定區域結合到固定在綠Β珠的互補的寡核苹酸感應 物上，而不會結合到綠Α珠上的不配對的寡核苷酸上。雜 又之後粒子用藻紅蛋白配合的鏈黴抗生物素（i : i 〇 〇 )1 xPBS培養。r—藻紅蛋配合的鏈黴抗生物素結合到雜交 到珠上的生物素化胜肽嵌合體。雜交pNA嵌合體㈣測係 以流式細胞計進行。（如圖25C的示意圖）。如圖25A， 測定後，_ B珠獲得了明顯量的燈色螢光，其對應於r一藻 紅蛋白的發射波長，這表明在測定中m胜肽嵌合體雜交 47 1280365 到綠B上（圖25A )。流式細胞計的债測被用在試管内 ρΡΝΑ雜交到固定在微粒上的互補寡核苷酸上。兩種類型的 中性抗生物素蛋白彼覆的微粒之一係利用生物素間隔固定 。A ( 1 0 )(另一種微粒）則沒有用任何寡核苷酸固定。這 兩種類型的珠用生物素化雙一PPNA嵌合體培養。雙一 的錨定部位在用於雜交的每個臂上含有12 — 13胸腺嘧啶鹼 基。在試管内條件下的洗滌和雜交如上所述。雜交之後， 珠用螢光素（DTAF)結合的鏈黴抗生物素（1: 3〇〇)在ΐχ PBS中培養。螢光素（DTAF )結合的鏈黴抗生物素被結合 到雜交到珠上的生物素化pPNA嵌合體上。雜交的祕嵌 合體的偵測係使用流式細胞計進行。 人 實施例16 -質胜肽的當梘鉛」 m-胜肽嵌合體受質可以用於確定蛋白酵素活性的 在。合成的胜肽通常被詩蛋白酵素活性的確定。這 pna-胜肽後合體受質是以三種形式中的至少—種來設 :2:)。嵌合體的功能區域用一種螢謝“"， )杂枓（n )和一種螢光染料加内部His6標記( ::不=剪切蛋白質之酵素的蛋白酵素消化作㈣ 酵素的例子包括胰島素、二„。這種蛋 素、鏈黴蛋白酵素以及HIV_:熱函蛋白 驗胜肽喪合體受質⑴時酵素。當使用單標 的螢光染料除去。當使用雙=酵素消化把消化的受 “吏用雙仏己ΡΝΑ-胜肽喪合體受質 48 1280365 π)時，蛋白酵素消化除去了受質的猝滅染料（“Η )， 導致分離產物發出Dye_2的螢光。當使用具有—種榮光標 記的和一種内部對照標記（瓜）的PNA—胜肽嵌合體時， 蛋白酵素的4化除去了螢光染料。來自未剪切受質的榮光 訊號被歸-化到内部His6標記產生的偵測訊號水平，如 實施例1 6所示。 實施例17

蛋白酵素活性，如天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶活 性，係使用末端標記的固定在固體表面的生物素化天冬胺 酸特異性半胱胺酸蛋白酶3胜肽受質而測得。等量的生物 素化天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶3胜肽受質與末端標 記的螢光染料Cy 5係在溶液中用逐漸降低含量之純化的重 組天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶3 ( 8、4. 8、2. 88、 1.728、1.037、0.62、0.373、0.224、0.134、〇· 〇48 和 〇 # g/m 1 )/肖化。消化後，消化產物被偶合到特定彩色編碼 的微粒子的表面上，微粒子上按照現有技術，在其表面披 覆了中性抗生物素蛋白。然後，胜肽一功能化的微粒子按 照已知方法被組裝成微粒子陣列中，所述方法如LEAps， 和在臨時專利申請號60/343, 621 ( 2001年12月28日申 請）以及美國申請號1〇/；1 92, 352 ( 2002年7月9日申請 )中描述的的直接配置組裝方法。來自未剪切胜肽受質的 螢光係根據現有方法，如隨機編碼陣列檢測（read )，使 用螢光顯微鏡確定。蛋白酵素消化將螢光染料從消化產物 49 1280365 中除去。如圖27所示，在測定中產生了用於天冬胺酸特 異性半胱胺酸蛋白酶3消化的滴定。隨著天冬胺酸特異性 半胱胺酸蛋白酶3濃度由8降到〇从g/ml，以i〇〇〇ms積 分得到的Cy5訊號強度由約2600上升至5200單元。圖27 中的誤差條線表示平均的標準偏差。 實施例1 8 微粒陣列上2x2PNA嵌合體競爭測定 微粒陣列上2x2PNA嵌合體競爭測定係被用來測試在其 他PNA嵌合體存在下被捕獲到微粒陣列上之DNA寡核苦酸 上的PNA嵌合體。簡言之，在測定中，用到了兩種具有不 同鹼基序列的雙一 PNA類型。一種是生物素化PNA夾（生 物素-PNA-夾），而另一種是配合了四甲基若丹明的雙_ PNA-胜肽（雙一PNA-胜肽-TMR)。雜交之前，兩種類型 的生物素化的寡核苷酸被偶合到限定類型的彩色編碼的微 粒上，這種微粒係根據已知的方法（如實施例1所述）在其 表面上彼覆中性抗生物素蛋白。這些募核苦酸序列分別是 10-mer的聚腺嘌呤（A-10)和10-nier限定的核苦酸序列 (P-10 )。對照微粒（無）在其表面上不含有寡核苦酸。 A -1〇养核芽酸與生物素pna夾的PNA互補，而p-io寡核 芽與雙一 pna —胜肽一TMR喪合體的PNA互補。偶合之後 ’所有的寡核苦酸功能化的微粒被放入到一個試管中以在 石夕片上組裝成微粒陣列。晶片首先在含有NaCl、 83mM 硫氰酸胍、8mM MgCl2、i7nM edta、〇· 1%生物素、 ◦•ITween-20、70mM Tris-HCl，pH 為 7·5 的雜交缓衝液中 50 1280365 ’在40°C下預雜交20分鐘。然後，類似量的生物素一 PNA —夾和雙—pNA —胜肽—TMR被加入到同一個用於放置 晶片的雜交緩衝液中。陰性對照組晶片在雜交緩衝液中沒 有得到PNA。雜交在40°C的增濕房内進行1小時。雜交完 成後，在室溫下，晶片用l〇〇mM NaCl、10mM Tris-HC1， PH為7· 5、0. 196% Tween-20沖洗10分鐘。為了對雜交到 粒子的生物素化PNA的偵測，晶片用i〇0mju NaCl、 1 OOmMTr i s-HC1，ρΗ7·5，0.196 Tween — 20，在室溫下沖 洗l 〇分鐘。為了偵測雜交到粒子上的生物素化的PNAs， 晶片在100mMNaCl，lOOmM磷酸鈉，PH為7· 5的溶液中， 用Cy5配合的鏈黴抗生物素蛋白（2〇pg/ml)在室溫下培 養 30 分鐘。在用 i5mM NaCl、10mM Tris-HC1，pH 為 7.5 的溶液沖洗後，利用螢光顯微鏡觀察晶片。粒子的標識係 根據其彩色代碼而解碼。具有若丹明的Cy5訊號或Cy3訊 號的粒子係用如實施例4所述的電腦程式來識別。如圖28 所不，如Cy5螢光所偵測的，生物素—pNA-夾被特異性地 捕獲到偶合了 l〇—mer聚腺嘌呤的粒子上（以5〇〇ms積分 大約為2250單位# Cy5訊號強度），如Cy3螢光所债測 的，雙-PNA-胜肽-TMR嵌合體結合到晶片上具有p—1〇募核 苷酸的粒子上（以500ms積分大約為45〇〇單位的訊 號強度）。

實施例1 Q 經用LEAPS組霞及肽功能化微敕陣 兩種類型的彩色編碼的微粒、撥色珠和綠色珠係分別 51 1280365 用-種合成的胜肽及其對應嶙酸化胜狀偶合。除了在填酸 化胜狀的路4酸殘基上存在璘酸鹽基團外，胜肽的胺基酸 序列是相同的。在-個試驗試管中，將兩種類型的胜狀功 能化微粒混和。微粒在矽質晶片±由如美國專利 6’251，691公開的_的方法被组裝成微粒陣列。缺後 ’微粒陣列制_的《氨酸為特異性的鼠單株抗體培 養。在如實施例12所述’在晶片上用Cy5標記的山羊‘ ^ ¥偵測單株抗體的結合。然後’晶片利用螢光顯微鏡 檢查。橙色和綠色圖像用於將微粒解碼，而Cy5染色標記 用填酸化胜肽岐的綠色珠。更具體地，纟色珠的圖像表 示非磷酸化的胜肽，而綠色珠表示磷酸化的胜肽。最終的 分析圖像如圖29顯示含磷酪氨酸的特異性抗體的c 光染色。 實施例20 MA — __脖Μ喪合體與偶合到微粒陣列上的彩氙維 的雜交 與上述PNA—胜肽嵌合體相似，DNA寡核苷酸係用雙功 能交聯劑及結合到合成的胜肽上。最終得到的結合被稱為 DNA—胜肽嵌合體。DNA-胜肽嵌合體可以用在微粒陣列上 固定在彩色編碼珠的互補PNA寡聚物的雜交。胜肽部分可 以含有至少一種標記，如生物素或螢光染料，用於偵測珠 上雜交的DNA —胜肽嵌合體。此外，胜肽具有高親和性的 配體或修飾的胜肽也可以用於偵測。將DNA 一胜肽嵌合體 雜交到PNA—功能化微粒的原理在圖3〇A中說明。在本實 52 1280365 施例中，DNA—胜肽嵌合體是脫氧腺嘌呤寡聚物（dA寡聚 物）和生物素化合成胜目太的結合體’其具有雙功能交聯劑 ’ SMCC (琉ίό酿亞胺基4- (N -馬來酿亞胺甲基，環己胺一 卜竣酸酯））。DNA —胜肽結合體利用液相層析純化。純 化的DNA —胜肽嵌合體用於與微粒陣列上固定在彩色編碼 珠上的ΡΝΑ胸腺嘧啶寡聚物雜交。雜交的dna—胜肽嵌合 體係用Cy 3配合的鏈黴抗生物素偵測。微粒陣列利用螢光 顯微鏡檢查。珠顏色和Cy3雜交訊號的螢光強度從陣列中 確定。根據微粒顏色的代碼可以對微粒的身份識別。具有 Cy3螢光染料的珠被偵測和識別。如圖3〇β，dna —胜肽篏 a體特異性地結合到ρνα上，從以1 〇〇〇ms積分的Cy3訊 號強度為約1 〇 〇 〇個單位可以看出具有完全配對鹼基序列 ，而未完全配對鹼基序列的結果是以l〇〇〇ms積分的Cy3 訊號強度約為3 0 0單位。 實施例21 酸特異性車映脸s#蛋白_洁化 天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶對多胜肽受質的反應 性可以利用ΡΝΑ—胜肽嵌合體來同步確定。在本實施例中 ，合成三種類型的ΡΝΑ一胜肽嵌合體，工、。每一 個肷合體含有具有限定的鹼基序列的獨一的PNA錨定部分 ，其與特異性天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶受質胜肽配 合作為功能部分。PNA嵌合體j、n和皿的功能部分分別 含有胺基酸Asp-Glu-Va卜Asp (序列ID號：8 ) ，vah

Glu-lle-Asp (序列⑺號：9)和 Ue —Thr一Asp (序列 53 1280365 ID號：1 〇 )。這些合成的胜肽為已知的天冬胺酸特異性半 胱胺酸蛋白酶3，6，8。胜肽的C端標記有特定的螢光染 料。嵌合體受質的天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶消化導 致了螢光染料從PNA的錨定部分除去。 多受質天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶消化建立如下 疋里的甘欠合體I、π和Π被混合放到一個試驗試管中 。散合體的等分試樣被加入分別含有天冬胺酸特異性半胱 胺酸蛋白酶3，6，8反應溶液中。嵌合體受質的天冬胺酸 特異性半胱胺酸蛋白酶的消化係藉由在水浴中培養反應混 合物一定的時間來進行。陰性對照組是沒有任合天冬胺酸 特異性半胱胺酸蛋白酶的反應混合物。消化之後，在反應 混合物中加入含有胍HC1和去污劑的等量雜交緩衝液形成 雜交混和物。然後，雜交混合物用預組裝的微粒陣列培養 〇 根據現有方法，微粒陣列含有組裝在石夕質晶片上的四 種，型的彩色編碼珠。三種類型的珠被具有#驗基序列 2寡核苷酸功能化，這三種類型分別以序列特異性的形式 。合到PNA -胜肽欲合體工、π和瓜上。除了編碼彩色外 ’四種類型的珠還含有與在標記在嵌合體上螢光染料配對 的翱色。 雜交之後，非特異性結合物從陣列洗去，並利用螢 二微鏡檢查。雜交ΡΝΑ喪合體的測定訊號顏色強度 j確定。珠根據其預先確^的彩色代碼解碼。強度比， ^弋訊號的比率和來自對照珠的訊號被確定了。陰性 、、、且反應給出測定中強度比的最高欢進 κ …、 幻取回水準。對特殊受質的天冬 54 1280365 胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶活性被表達為殘餘測定強度相 對於每個晶片上陰性對照組的比的百分比。研究中測定強 度比的相對百分數概括如下表： 酵素 PNA—胜肽嵌合體 I II III 天冬胺酸特異性 半胱胺酸蛋白酶 3 53. 48% 82. 35% 112.03% 天冬胺酸特異性 半胱胺酸蛋白酶 6 91.80% 41.18% 79. 08% 天冬胺酸特異性 半胱胺酸蛋白酶 8 73· 77% 69. 41°/〇 59.89% 粗體表示測定中比預期更強的消化。 實施例22 利用 PNA進行酵素測定的流程圖 此處揭示的利用PNA嵌合體受質的多元測定具有相對 於現有技術的一些優勢。在PNA嵌合體構築體中，PNA錨 定部位在多元測定中具有兩個重要角色。首先，PNA的鹼 基序列係作為結合受質的代碼。其次，PNA寡聚物係作為 嵌合體的特異性錨定，這種嵌合體可以被捕獲到在標記的 固體表面的互補寡核苷酸上。沒有已知的蛋白酵素和核酸 酵素係用於PNA降解。所以，PNA寡聚物在組織溶解產物 中非常穩定。與DNA-DNA雜交相比，PNA在非常溫和的條 55 1280365 件下雜交到互補的職募核苷酸上。pna_dna複合體在低 鹽溶液中（即’不適合DNA—DNA雜交的條件）是穩定的。因 此，多PNA嵌合體受質可以被加到一般單一或多個類型酵 素反應的反應混和物中。如31所示，此處揭示的多元 測定可以以單-形式進行，其包括合《_嵌合體受質的 :驟，進行多元測定的步驟，雜交到在彩色編碼微粒上的

寡核苦酸上的步驟’偵測修飾的受質的步驟，圖像獲取和 資料分析的步驟。 X 實施例23 多元測定 作為較佳具體實例之—，對於多受f酵素反應，PM — 胜肽嵌合體是理想的受質，該酵素反應諸如激酶測定（圖 32A)、磷酸酶敎（圖32B)、天冬胺酸特異性半耽胺酸 蛋白酶測定（圖32C)、配體結合測定（圖32d)。簡言 之’ PNA-胜肽喪合體庫可用感興趣的激酶培養。在㈣ 中磷酸化反應後’碌酸化的胜肽可以在捕獲的pNA後合體 上確定（® 32A)。這樣，用於激酶的受質胜肽可以從庫 中識別。這種測定的設計可以應用到在藥物發現，以用於 標的識別和在疾病中對改變的激酶活性的識別。通過使用 PNA—磷酸化胜肽嵌合體作為受質，類 到多受質碟酸酶分析中（圖32B)，其可以 中’用於在不同的疾病階段識別特異性的磷酸酶抑制劑。 此：’如實施例17所示，PNA—胜肽嵌合體可以被用於在 试官中確定天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶的活性。如圖 56 1280365 32C所示，PNA —胜肽嵌合體庫可以用感興趣的天冬胺酸特 異性半胱胺酸蛋白酶培養。在消化後，受質胜肽可以從庫 中識別。這種測定的設計可以用於在凋亡細胞中天冬胺酸 特異性半胱胺酸蛋白酶抑制劑的識別。此外，pNA —胜狀 嵌合體也可以用於蛋白質—蛋白質或蛋白質—核酸的相互反 應的結合測定。如圖C (圖32D )，在配體結合測定中， PNA〜胜肽嵌合體庫可以用感興趣的靶來培養。與特異性 標的結合的PNA—胜肽嵌合體可以從庫中識別（圖32D) 〇 上述不同較佳實施例的描述係用於說明和描述本發明 的目的。但並不窮舉可限定本發明的公開的特定形式。根 據上述教導的啟示，可以作出明顯的改進與修飾。所選擇 和說明的實施例是用來為本領域技術人員實現各種實施例 以及對實施例作出適於應用的不同修飾而提供的說明和實 際應用例子。所有這些修飾與改進都應當包括在所附申請 專利範圍之根據其要求的寬度解釋的範圍内，這些申請專 利範圍是平等，合法，公正賦予資格的。 【圖式簡單說明】 圖1顯示了使用LEAPS或直接沉澱的方法來偵測微粒 ，並且隨後在陣列上使用READ、流式細胞計和沈澱法來進 行偵測的實施例。 圖2示意性地描述了用於固定到載體表面的多元測定 中的PNA —被分析物嵌合體。 圖3顯示了通過抗體來伯測經修飾的被分㈣/受質。 57 1280365 被捕獲到固體表面的修飾的被分析物可以通過用榮光（f) 或過氧化酶（E)標記的抗體在一種抗體一（a);二種抗體 一（B )或三種抗體一（C )的形式中檢測得到。 圖4示意性地描述了 MAP激酶訊號傳導途徑用於識別 在MAP激酶途徑中的特異性激酶的活性的報導嵌合體。 圖5示意性地描述了使用PNA-STAT嵌合體進行以細胞 為基測定’以確定在以JAK激酶為媒介之訊號傳導途徑中 的激酿活性。 圖6示意性地描述了偵測對PKD1和Aktl/PKB激酶（A )的特異性激酶活性，並且其可以用在以細胞為基的測定 (B)中來分析Akt/PKB訊號途徑。 圖7示意性地描述了使用PNA_天冬胺酸特異性半脱 胺酸蛋白酶嵌合體來偵測多個天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋 白酶活動。 圖8示意性地描述了在以細胞為基偵測中使用pna 一 小分子嵌合體來識別新藥尋靶GPCR。 圖9示意性地描述了根據流式細胞計偵測到的將pna 礙合體雜交到在彩色編碼微粒上的互補寡核苷酸上。 圖10顯示了一種使用PNA—抗體嵌合體來偵測和分離 細胞的方法，這些細胞在其表面顯示有特異性蛋白質。 圖11顯示了兩種不同的將寡核苷酸探針固定到固體表 面上的方法，包括使用生物素一中性抗生物素蛋白結合進 行的間接偶合（A )，以及使用胺一甲苯磺醯基反應進行 的直接偶合（B)。在下面的圖中顯示出了以生物素—中 58 1280365 性抗生物素蛋白作為媒介，將寡核苷酸間接偶合到固體表 面上的滴定結果，以及將募核苷酸與胺基—甲苯磺醯基的 偶合直接結合到固體表面上的滴定結果。 圖1 2顯示了兩種類型的生物素化寡聚物的高壓液相層 析純化的過程。

圖13顯示了純化的四曱基若丹明（TMR)標記的PNA 一胜肽嵌合體（A)和Cy5標記的PNA一小分子嵌合體（B )和它們相應的譜圖情況。 圖14顯示了晶片上雜交測定的結果，其測試了將生物 素化雙一 PNA寡聚物進行序列特異性捕獲到固定在微粒陣 列上的各種寡核苷酸上。 圖15顯示了試管内雜交測定（A)與晶片上雜交測定 (B )比較的結果，其用於測試將雙_ p寡聚物進行序列 特異性捕獲到固定在彩色編碼微粒上的麗寡核芽酸上。 圖16顯示了晶片上雜交測定的結果，其測試將雙— PNA —蛋白質喪合體進行序列特異性捕獲到固定在微粒陣 列上的DNA寡核苷酸（丨8個鹼基長）上。 圖17顯tf 了將pnA寡聚物雜交到固定在彩色編碼的磁 性顆粒上的互補募㈣酸上的結果，其中晶片B⑴是晶 片A ( A )的陰性對照組。 圖1 8顯示了晶片上雜六、Βί ^ 雜又測疋的結果，其測試了將雙— PNA —小分子嵌合體進杆戾 序歹】特異性捕獲到固定在微粒陣 列上的DNA寡核苷酸（i 〇個 鹼基長）上，其中，晶片2是 對晶片1的陰性對照組。 59 Ϊ280365 圖1 9顯不了三條生物素化的磷酸化的胜肽標準曲線（ 果肽P - ：1，胜肽—P—2和胜肽—p_3)隨濃度上升的結 其中，胜肽通過使用微粒陣列而偶合到特異性的彩色 編碼珠上，該珠被中性抗生素蛋白包覆。 圖20顯不了兩條生物素化的磷酸化的胜肽標準曲線（ 胜肽一P—1和胜肽_P_2)隨濃度上升的結果，其中，胜 肽用中性抗生素蛋白偶合到特異性的彩色編碼珠上。 圖21顯示了使用酪醯胺（tyramide)試劑在微粒陣列 上進行磷酸化的胜肽（Ty—P一 i和Ty_p—2)免疫檢測 的結果。用於該測定的單株抗體用對磷酸化修飾具有特異 性的過氧化酶進行標記。 圖22顯示了使用在陣列上的磷酸化的胜肽特異性的單 株抗體進行填酸化的胜狀（Ty—P— 1和Ty~p—2)免产 檢測的結果。結合的單株抗體用Cy — 5標記的二級抗體來 "[貞測。 圖23顯示了在微粒陣列上使用螢光標記的抗體同時進 行多個磷酸化的胜肽的免疫檢測的結果。 圖24顯示了雙標記的PNA被分析物嵌合體的常規設計 和雙重一測定訊號檢測（A )的比例量化；用螢光染料標 記的特異性PNA —胜肽嵌合體和為確定天冬胺酸特異性半 胱胺酸蛋白酶3活性（B )的比例量化的内部η i S6標記； 以及通過比例量化（c )確定的天冬胺酸特異性半胱胺酸 蛋白酶3活性的結果。 圖25顯示了通過流式細胞分析偵測雜交到彩色編碼微 60 1280365 粒上的PN A嵌合體的結果。在圖2 5A中，兩個綠色珠（綠

A和綠B )與兩種類型的寡核苷酸（a )和（b )偶合。pNA 嵌合體特異性地結合到綠B珠上的募核苷酸上，這可在橙 色途徑上檢測到。類似的，在圖25B中，結果表示卟财 嵌合體序列特異性地結合到一種可由流式細胞計偵測到的 珠上。 圖26顯示了用於檢測蛋白酵素活性的pNA—胜肽嵌合 體受質的常規設計，其中嵌合體的功能域用一種螢光染料 (I)、兩種螢光染料（π)和一種具有内部His6標記的 螢光染料（111 )標記。 圖27冑示了使用生物素化天冬胺酸特異性半耽胺酸蛋 白酶3胜肽受質和在微粒陣列上末端標記的螢光染料確定 天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶活性的結果。 圖28顯示了進行2χ2ΡΝΑ嵌合體競爭敎來測試被捕 獲到在微粒陣列上@舰寡好酸（1()個驗基長）上的 PNA喪合體的特異性的結果u i顯示了生物素化舰 夹（生物素一 PNA —板）（下

敗J (下圖）和用四甲基若丹明（TMR )配合的雙一PNA—胜肽嵌人，彳擁 趴瓜《體（雙-PNA-胜肽—TMR) (上圖）被捕獲到用具有特 H特^基序列功能化的彩色編碼 珠上的結果。晶片2顧+ γ非上I*： ，頁不了對應於生物素一 pNA 一夾）（ 下圖）和雙一PNA—胜肽嵌合 組。 肢1I上圖）的陰性對照 …二，……衫色編碼的微粒子（橙色珠和 色珠）的橙色和綠色圖像，兮 巴口像該珠分別與合成的非磷酸化 61 Η年 1280365

—^ 一_—J 胜肽和與之相應的磷酸化的胜肽偶合（左圖）。綠色珠上 的填酸化的胜肽通過使用晶片上的Cy〜5標記的抗體而被 偵測（右圖）到。 圖30A示意地顯示了 DNA --胜肽嵌合體，圖顯示 了將DNA —胜肽|合體雜交到在微粒陣列上的彩色編碼珠 上的互補PNA上的結果。 圖31顯示一種多兀測定，其包括以下步驟：合成pNA 嵌合體、進行多元測m交到在彩色編碼微粒上的寡核 苷酸上、偵測修飾的受質、圖像獲取和資料分析。 夕圖32A顯示一種多元—受質激酶測定。圖32B顯示一 種多兀—受質磷酸酶測定。圖32C顯示一種多元_受質天冬 賴特異性半胱胺酸蛋白_定。圖32D顯示—種多元_ 受質結合測定。 62 1280365 序列表 <110> 楊嘉誠（JiachengYang)

<120>分子構築體和用於檢測生化反應的方法 <130〉PNA <140〉10/227012 <141> 2002-08-22 <160〉10 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211>16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類酪氨酸激酶基質P34cdc2衍生的人工序列 <221>磷酸化 <222〉（11)...(11) <400〉1

Cys Lys Val Glu Lys lie Gly Glu Gly Thr Tyr Gly Val Val Tyr Lys 15 10 15

<210〉2 <211〉 19 <212〉PRT <213>人工序列 <220> 1280365 <223>人類酪氨酸激酶基質p34cdc2衍生的人工序列 <221〉磷酸化 <222> (13)...(13) <400〉2

Cys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met 15 10 15

Asp Phe Lys <210〉3 <211>15 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人類酪氨酸激酶基質P34cdc2衍生的人工序列 <221〉磷酸化 <222> (10)...(10) <400> 3

Cys Arg Arg Leu lie Glu Asp Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Gly Lys 15 10 15

<210>4 <211>15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列-對照組胜肽 <400〉4 1280365

Lys Val Glu Lys lie Gly Glu Gly Thr Tyr Gly Val Val Tyr Lys 15 10 15

<210〉5 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工序列-caspase3衍生的 <400〉5

His His His His His His Asp Glu Val Asp Ala Lys 1 5 10

<210>6 <211>10 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列-探針 <400> 6 aaaaaaaaaa

<210 7 <211> 10 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列-探針 <400〉7 aaggagagaa 3/4 10

10 1280365 <210>8 <211>4 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>caspase衍生的胜肽 <400〉8 Asp Glu Val Asp 1 <210〉9 <211>4 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉人工序列-caspase衍生的胜肽 <400〉9 Val Glu lie Asp <210> 10 <211>4 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>caspase衍生的胜肽 <400> 10 lie Glu Thr Asp 4/4

Claims (1)

1280365 拾、申請專利範圍： 1 · 一種用於偵測剪切酵素活性之套組，其包括： (a) 多種PNA-受質嵌合體，其等各具有一 pNA捕獲部 位以及一酵素的受質，其中不同種類的嵌合體具有能夠與 不同酵素反應不同的受質，但每種的嵌合體各具有一特定 的欠質與一選定的PNA序列捕捉部分， (b) 陳列在被不同地編碼的微粒子上之不同種類的募核 苦S文’且其中該不同種類的寡核苷酸能夠煉合至不同的選 定PNA序列捕捉部分。 2 ·如申睛專利範圍第1項的套組，其中該受質部位包 括蛋白質。 3 ·如申請專利範圍第2項的套組，其中該受質蛋白質 包括胜狀。 4 ·如申睛專利範圍第1項的套組，其中該受質部位係 以標記修_。 5·如申請專利範圍第4項的套組，其中該標記係選自 由六組氨酸殘基、螢光部分、磷酸鹽基團、以及糖基所組 成之群組。 6.如申請專利範圍第4項的套組，其中該標記包括可 偵測的部分。 7·如申請專利範圍第1項的套組，其中該受質部位包 括天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶的受質（caspase )或 其活性胜肽。 8·如申請專利範圍第1項的套組，其中該受質部位包 63 1280365 括磷酸酶的受質或其活性胜肽。 9·如申請專利範圍第1項的套組，其中該捕獲部位包 括雙一PNA。 1 〇·如申請專利範圍第丨項的套組，進一步包括連接物 11. 在樣本中偵測複數種酵素活性的方法，其包括 (a )將複數種PNA—受質嵌合體加到樣本中，該等 PNA又質肷合體各具有一 pNA捕獲部位以及一酵素的受質 ，其中不同種|員的嵌合體具有能夠肖不同_素反應不同的 受質’但每種嵌合體各且右 粗合兴有特疋的受質與一選定的PNA 序列捕捉部分； (b )使酵素與該嵌合體族群之受質部分反應； (c)以不同種類的寡核苷酸捕獲經反應的pNA-受質 彼合體’其中該不同猶麵的也人碰 个N禋類的嵌合體各自陳列在經不同編碼 的微粒子上，且其中該捕雜技M丄 t /捕獲係藉由一種寡核苷酸至一選定 ΡΝΑ序列捕捉部分之煉合；以及， (d )"[貞測捕獲的經及雍& 夂應的PNA—受質嵌合體中受質的 改變； 、 (e )解碼經編碼的微輪； 做拉子M鑑認何種受質發生反應， 並因此鑑認在樣本中出現的酵素。 12 ·如申請專利範圍第〗〗 1項的方法，其中該微粒子是 經彩色編碼的。 13·如申請專利範圍第丨〗 币u項的方法，其中該PNA—受 64 1280365 質嵌合體含有兩個標記。 14.如申請專利範圍第13項的方法，其中該標記為螢 光部分。 】5·如申睛專利範圍第11頊的方法，其中該PNA —受 質礙合體的受質部位是天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶的 受質。 16·如申請專利範圍第丨丨項的方法，其中該pNA_受 質嵌合體的受質部位是磷酸酶的受質。 其中該PNA—受 17 ·如申請專利範圍第11項的方法， 質嵌合體的捕獲部位是雙一 PN A。 拾壹、圖式： 如次頁 65 1280365 柒、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 無 捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式