JP4543170B2 - 標識製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、標識製造方法に関するものである。

従来、モータプロテインの動作を観察するための最も一般的なツールは標識付けされたビーズである。モータプロテインは、生物学者及びエンジニアの興味を引き付けているタンパク質の一種である。これら生体分子は、化学エネルギーを運動に転換することができ、生物界において一般的に見受けられる。運動においては２種類の形態が識別可能である：すなわち、回転と平行移動である。回転は、例えば、生物を推進させるために回転するバクテリアの鞭（べん）毛に見ることができる。直線運動は、例えば、細胞分裂の期間に観察されることができ、細胞の構成要素が自身を整列する運動である。生物的運動の最小単位はモータプロテインである。これらの微小なモータの大きさの範囲は、およそ２〜３ナノメートルであり、光学顕微鏡の解像度よりも遙（はる）かに下の値である。それらの小さなサイズにも関わらず、プロテインの特性を明らかにする技術は多数存在するが、動作中のプロテインを観察するためのもので光学顕微鏡の代わりとなるものは、非常に少ない。モータプロテインの場合、動作が特に興味深いので、これらの微小構造体の動作を可視化するツールを使用することは必須である。

モータプロテインの動作を観察するために、最も一般的なツールは標識付けされたビーズである。このツールは変位の観察を容易にするものではあるが、角運動を検出することはより一層困難である：球形状のビーズは軸方向に関して対称であり、ビーズの回転を識別することが非常に困難である。このような目的のためには、細長い構造体が好適である。このような構造体は、光学顕微鏡で視認するのに十分な長さを有し、構造体を動かすプロテインにかかる抵抗を減少させるために、できる限り小さくなくてはならない。理想的には、このような構造体の寸法は、直径が１００ナノメートル、長さが１〜２マイクロメートル程度であるべきである。このような可視化の問題を解決する１つの方法は、それにも関わらず、ビーズを使用し、相互に結合して細長い構造体を形成するビーズの発現に依存することである（例えば、非特許文献１参照。）。これは簡単ではあるが、収量は程々である。もう１つの解決方法は、アクチン（ａｃｔｉｎ）のフィラメントのような生体フィラメントを使用することである（例えば、非特許文献２参照。）。しかし、付着点を予測することが困難であり、回転するフィラメントの長さを良好に確定することもできない。第３のアプローチは、回転するプロテインの運動を可視化するための細長い構造体を製造することである。各種の用途に使用するための細長い構造体の製造について各種の報告がなされている。一般的なアプローチの１つは、気相−液相−固相界面成長を含むものである。この場合、種（シード）粒子が面上に分配されると、種の触媒作用によって、所定の気体環境下において柱状体が垂直方向に成長する（例えば、非特許文献３〜６参照。）。気相−液相−固相（ＶＬＳ）成長は、多数の針状体を同時に製造することができるという利点があるが、針状体の均一性に問題がある。

さらに、必要な装置はかなり複雑なものである。加えて、機能性材料基板の組み合わせが限定される。他のアプローチは、歪（ひず）み誘導管回転を含むもの（例えば、非特許文献７参照。）であり、特定の付着点を含むことを困難にする。以前報告された従来からのフォトリソグラフィー及び電子ビームリソグラフィーによる針状体は、要求される寸法になっていない（例えば、非特許文献８〜１０参照。）。そして、角運動、製造ツール等のような関連する他の技術も報告されている（例えば、非特許文献１１〜２０及び特許文献２１〜２６参照。）。
T.Nishizaka, K.Oiwa, H.Noji, S.Kimura, E.Munejuki, M.Yoshida, K.Kinosita Jr., "Chemomechanical coupling in F1-ATPase revealed by simultaneous observation of nucleotide kinetics and rotation", Nature Struct. Mol. Biol., vol.11, no.2, pp.142-148, 2004 H.Noji, R.Yasuda, M.Yoshida, K.Kinosita Jr.,"Direct observation of the rotation of F1-ATPase ", Nature, vol.386, pp.299-302, 1997 Y.Wu, H.Yan, M.Huang, B.Messser, J.H.Song, P.Yang,"Inorganic Semiconductor Nanowires: Rational Growth, Assembly, and Novel Properties", Chem.Eur.J., vol.8, no.6, pp.1261-1268, 2002 A.M.Morales, C.M.Lieber,"A Laser Ablation Method for the Synthesis of Crystalline Semiconductor Nanowires", Science, vol.279 pp.208-211, 1998 T.Martensson, P.Carlberg, M.Borgstrom, L.Monelius, W.Seifert, L.Samuelson,"Nanowire Arrays Defined by Nanoimprint Lithography", Nano Lett., vol.4, no.4, pp.699-702, 2004 W.I.Park, G.-C.Yi, M.Kim, S.J.Pennycook,"ZnO Nanoneedles grown vertically on Si Substrates by Non-Catalytic Vapor-Phase Epitaxy", Adv. Mater., vol.14, no.24, pp.1841-1843, 2002 A.V.Prinz, V.Ya.Prinz, V.A.Seleznev,"Semiconductor micro- and nanoneedles for microinjections and ink-jet printing ", Microelectronic Engineering., vol.67-68, pp.782-788, 2003 Y.Hanein, C.G.J.Schabmueller, G.Holman, P.Luecke, D.D.Denton, K.F.Boehringer, "High-aspect ration submicrometer needles for intracellular applications ", J.Micromech. Microeng., vol.13, pp.S91-S95, 2003 V.Ovchinnikov, A.Malinin, S.Norikov, C.Tuovinen,"Silicon Nanopillars Formed by Reactive Ion Etching Using a Self-Organized Gold Mask ", Physica Scripta, vol.T79, pp.263-265, 1999 R.K.Soong, G.D.Bachand, H.P.Neves, A.G.Olkhovets, H.G.Craighead, C.D.Montemagno,"Powering an Inorganic Nanodevice with a Biomolecular Motor", Science, vol.290, pp.1555-1558, 2000 T.Nishizaka, K.Oiwa, H.Noji, S.Kimura, E.Munejuki, M.Yoshida, K.Kinosita Jr., "Chemomechanical coupling in F1-ATPase revealed by simultaneous observation of nucleotide kinetics and rotation", Nature Struct. Mol. Biol., vol.11, no.2, pp.142-148, 2004 H.Noji, R.Yasuda, M.Yoshida, K.Kinosita Jr.,"Direct observation of the rotation of F1-ATPase ", Nature, vol.386, pp.299-302, 1997 Y.Wu, H.Yan, M.Huang, B.Messser, J.H.Song, P.Yang,"Inorganic Semiconductor Nanowires: Rational Growth, Assembly, and Novel Properties", Chem. Eur.J., vol.8, no.6, pp.1261-1268, 2002 A.M.Morales, C.M.Lieber,"A Laser Ablation Method for the Synthesis of Crystalline Semiconductor Nanowires", Science, vol,279 pp.208-211, 1998 T.Martensson, P.Carlberg, M.Borgstrom, L.Monelius, W.Seifert, L.Samuelson,"Nanowire Arrays Defined by Nanoimprint Lithography", Nano Lett., vol.4, no.4, pp.699-702, 2004 W.I.Park, G.-C.Yi, M.Kim, S.J.Pennycook,"ZnO Nanoneedles grown vertically on Si Substrates by Non-Catalytic Vapor-Phase Epitaxy", Adv. Mater., vol.14, no.24, pp.1841-1843, 2002 R.K.Soong, G.D.Bachand, H.P.Neves, A.G.Olkhovets, H.G.Craighead, C.D.Montemagno,"Powering an Inorganic Nanodevice with a Biomolecular Motor", Science, vol.290, pp.1555-1558, 2000 Y.Hanein, C.G.J.Schabmueller, G.Holman, P.Luecke, D.D.Denton, K.F.Boehringer, "High-aspect ration submicrometer needles for intracellular applications ", J.Micromech. Microeng., vol.13, pp.S91-S95, 2003 V.Ovchinnikov, A.Malinin, S.Norikov, C.Tuovinen,"Silicon Nanopillars Formed by Reactive Ion Etching Using a Self-Organized Gold Mask ", Physica Scripta, vol.T79, pp.263-265, 1999 A.V. Prinz, V.Ya.Prinz, V.A.Seleznev, "Semiconductor micro- and nanoneedles for microinjections and ink-jet printing ", Microelectronic Engineering., vol.67-68, pp.782-788, 2003 特開平５−２２６６３７号公報 特開２００４−２７１５３３号公報 特開２００４−１２９６５１号公報 米国特許第６０４８６７１号明細書（ＵＳ−Ａ１−６０４８６７１） 米国特許第４８７９２２０号明細書（ＵＳ−Ａ１−４８７９２２０） 米国特許第６６４９４１４号明細書（ＵＳ−Ｂ１−６６４９４１４）

しかしながら、前述した方法は、３つの問題のために、プロテインの可視化用の微小針状体（ｎａｎｏ−ｎｅｅｄｌｅ）に容易に適用することができない：（１）もし針状体が標識として使用されるのであれば、百万単位の多数の針状体が迅速に、かつ、容易に製造されなければならない。（２）針状体の直径（５０〜４００〔ｎｍ〕の範囲）及び長さ（０．４〜４〔μｍ〕）が良好に制御可能であり、かつ、一様でなければならない。（３）ランダムな付着を避けるために、プロテインに付着するための特定部位の面を局限することが必要である。

本発明の目的は、従来の微小針状体の製造方法における前述の問題点を解決して、機能性表面用材料の薄膜を構造部用材料の基板上に付加するステップと、電子ビームリソグラフィー、又は、機能性表面用材料の薄膜上に付着した複数の樹脂粒子から成るマスクを使用するエッチングによって、前記機能性表面用材料の薄膜及び構造部用材料の基板をパターニングするステップとを含む新規な標識製造方法を提供し、それにより、百万単位の多数の標識を迅速に、かつ、容易に製造し、標識の直径及び長さを一様に制御し、プロテインに付着するための特定部位の面を高度に局限することができるようにすることである。

前記目的を達成するために、本発明によれば、標識製造方法は、生体分子に付着する機能を備える機能性表面を少なくとも一端に備える構造部を含む標識の製造方法であって、機能性表面用材料の薄膜を構造部用材料の基板上に付加するステップと、電子ビームリソグラフィーによって前記機能性表面用材料の薄膜及び構造部用材料の基板をパターニングするステップと、エッチングによって前記構造部用材料の基板をパターニングするステップと、パターニングされた機能性表面用材料上のマスクを取り除くステップと、パターニングされた構造部を構造部用材料の基板の残り部分から分離するステップとを有する。

さらに、本発明によれば、他の標識製造方法は、生体分子に付着する機能を備える機能性表面を少なくとも一端に備える構造部を含む標識の製造方法であって、機能性表面用材料の薄膜を構造部用材料の基板上に付加するステップと、複数の粒子を前記機能性表面用材料の薄膜上に付加するステップと、前記粒子をマスクとするエッチングによって前記機能性表面用材料の薄膜及び構造部用材料の基板をパターニングするステップと、前記マスクを取り除くステップと、パターニングされた構造部を構造部用材料の基板の残り部分から分離するステップとを有する。

更に他の標識製造方法においては、前記機能性表面は機能化要素とともに生体分子に付着する。

更に他の標識製造方法においては、前記構造部の大きさは、直径が５０〜４００〔ｎｍ〕であり、長さが０．４〜４〔μｍ〕である。

更に他の標識製造方法においては、前記生体分子はモータ分子である。

更に他の標識製造方法においては、前記エッチングは異方性エッチングであり、マスク材料の薄膜が前記機能性表面用材料の薄膜上に付加される。

更に他の標識製造方法においては、前記エッチングは異方性エッチングであり、前記粒子はポリスチレンから成る。

更に他の標識製造方法においては、前記パターニングされた構造部は、超音波処理によって、前記構造部用材料の基板の残り部分から分離される。

更に他の標識製造方法においては、前記機能性表面用材料は、Ａｕ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｗ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｏ、Ｎ、Ｎｉ−Ｆｅ合金、Ｚｒ、Ｔａ、Ｉｒ、Ｃ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｚｎ、Ｎｂ、ＳｉＯ₂ 及びＳｉ₃ Ｎ₄ から成る組の中から選択される。

更に他の標識製造方法においては、前記構造部用材料は、Ｓｉ、ＳｉＯ₂ 、ポリイミド及びエポキシから成る組の中から選択される。

本発明の標識製造方法においては、機能性表面用材料の薄膜を構造部用材料の基板上に付加するステップと、電子ビームリソグラフィー、又は、機能性表面用材料の薄膜上に付着した複数の樹脂粒子から成るマスクを使用するエッチングによって、前記機能性表面用材料の薄膜及び構造部用材料の基板をパターニングするステップとが含まれている。そのため、百万単位の多数の標識を迅速に、かつ、容易に製造し、標識の直径及び長さを一様に制御し、プロテインに付着するための特定部位の面を高度に局限することができるようにすることである。

本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は本発明の第１の実施の形態における電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフを使用する作成方法の流れを示す図である。

図１は、ＤＮＡ、（モータ分子を含む）タンパク質等の生物分子に付着させる標識としての微小針状体を製造するための電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフの技術を示している。微小針状体は、細長い構造を有し、直径が４００〔ｎｍ〕以下、長さが４マイクロメートル〔μｍ〕以下である。そして、微小針状体は、その上端に局限された機能性表面を有する。

構造を画定する電子ビームリソグラフィーのステップの後に、クロム−金−アルミニウム層のリフト−オフが行われる。最上位のアルミニウム層は、ディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ：Ｄｅｅｐ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｅｔｃｈｉｎｇ）によって、構造部としての独立したシリコン柱状体を垂直にエッチングするためのマスクとして使用される。最後に、柱状体は、該柱状体を破壊するのに十分な強さを備えた振動を柱状体の基部に付与する超音波処理によって、基板から切り離される。

本発明の第１の実施の形態においては、１枚のシリコン単結晶基板（１１）が構造部用材料の基板として用意された（図１（ａ））。構造部用材料の基板としては、例えば、Ｓｉ、ＳｉＯ₂ 、ポリイミド、エポキシ等の、ある種の無機材料及び高分子材料を選択することもできる。また、基板（１１）の代わりに薄膜を使用することもできる。「基板」という言葉は、いかなる厚さの固体をも包含するものであり、例えば、板（ｂｏａｒｄ）、厚板（ｐｌａｎｋ）、ウェハー（ｗａｆｅｒ）、平板（ｓｌａｂ）、薄板（ｓｈｅｅｔ）及び膜（ｆｉｌｍ）を包含する。

続いて、レジスト（１２）の層が、シリコン単結晶基板（１１）の表面上に形成された（図１（ｂ））。発明者が遭遇した困難の１つは、リフト−オフのためには、形成された金属層の少なくとも３〜４倍の厚さを備えるレジスト（１２）を形成することが望ましいということであった。このため、二層レジスト（１２）が選択された。これにより、構造画定用レジストのより薄い層によって覆われる担持用（ｃａｒｒｉｅｒ）レジストのより厚い層を形成することができた。さらに、レジストの現像作用の差異によって、リフト−オフのために望ましい側壁形状を備えた凹部（１４）を得ることができた。底部層（１２ａ）を形成するためにＺＥＰ−５２０Ａ（ＺＥＯＮ Ｃｏｒｐ．）が使用され、４０００〔回転／分〕でのスピンコートが９０秒間行われ、摂氏１８０度の加熱が加熱板（ｈｏｔ ｐｌａｔｅ）上で４分間行われた。最上層（１２ｂ）は、１対２の割合でアセトンによって希釈されたＰＭＭＡ（ＯＥＢＲ１０００、Ｔｏｋｙｏ Ｏｈｋａ Ｃｏｒｐ．）が使用され、２０００〔回転／分〕でのスピンコートが６０秒間行われ、続いて、摂氏１７０度の加熱が炉内で２０分間行われた。

続いて、レジスト層（１２）がパターニングされ、電子ビームリソグラフィーによって複数の凹部（１４）が形成される（図１（ｃ））。電子ビーム照射線量を、ビーム電流が５０ピコアンペアとなるように、１００〜１２０〔マイクロクーロン／ｃｍ² 〕の間で変化させた。使用された電子ビーム照射は、修正された電子顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）であった。メチル−イソブチル−ケトン（ＭＩＢＫ）とイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）とを１対２の割合で２分間調合したものが上側のＰＭＭＡ層（１２ｂ）の現像に使用され、続いて、ＩＰＡ及び消イオン（ＤＩ）水の中で短時間のリンスが行われた。次に、底部のＺＥＰ−５２０Ａ層（１２ａ）は、ＺＥＤ Ｎ５０で６５秒間現像され、ＩＰＡ及び消イオン（ＤＩ）水の中でリンスされた。

次に、リフト−オフ用の金属を、熱蒸着によって付着させた（図１（ｄ））。現像されたレジスト上に、まず、接着層として、５〔ｎｍ〕のクロム（１５）を付着させた。次に、機能性表面用材料として、３０〔ｎｍ〕の金（１６）を付着させた。最後に、１５〔ｎｍ〕のアルミニウム（１７）を付着させた。最後のアルミニウム層（１７）は、続いて行われるディープ反応性イオンエッチング用のマスクとして機能する。

クロム（１５）、金（１６）及びアルミニウム（１７）の層を付着させるために、熱蒸着の他にも、いかなる薄膜付着技術を使用してもよい。例えば、化学蒸着、電子ビーム蒸着、電気めっき等を使用することができる。そして、クロム（１５）、金（１６）及びアルミニウム（１７）以外のものであっても、薄膜付着技術によって付着させることができ、エッチングすることができるものであれば、多数の金属及び非金属、例えば、Ｔｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｓｉ₃ Ｎ₄ 、ＳｉＯ₂ 等を、後述されるように、使用することができる。

続いて、リフト−オフのプロセスによって、金属膜（１５〜１７）の下の露出していないレジスト（１２）が、電子ビーム用レジストＺＥＰ−５２０Ａ用の市販除去剤であるＺＤＭＡＣ（ＺＥＯＮ Ｃｏｒｐ．）を使用して、除去された（図１（ｅ））。残留したのは、シリコン（１１）表面上の金属多層構造（１５〜１７）であった。

次に、アルミニウム層（１７）がマスクとして機能している間に、ＳＴＳマルチプレックス式ＡＳＥによるボッシュプロセスを使用して、ディープ反応性イオンエッチングが行われた（図１（ｆ））。ディープ反応性イオンエッチングによって、シリコン単結晶基板（１１）が、アルミニウムマスク（１７）に倣って、パターニングされ、複数の柱状体（１８）が形成された。

続いて、最上位に位置するアルミニウムマスク（１７）がウェットケミカルエッチングによって除去された（図１（ｇ））。アルミニウムマスク（１７）をエッチングするためには、ウェットケミカルエッチング以外のエッチング技術、例えば、物理エッチング（収束イオンビーム又はスパッタ）、ドライケミカルエッチング等を使用することもできる。

最後に、パターニングされた構造部としての柱状体（１８）が、シリコン単結晶基板（１１）の残り部分から取り除かれた（図１（ｈ））。柱状体（１８）の開放は、１００〔Ｗ〕、３５〔ｋＨｚ〕での１５分間における超音波処理によって行われた。これにより、標識としての長く延びた針状体（２１）が得られた。柱状体（１８）を切り離すために、超音波処理以外の、例えば、ＳＯＩ（Ｓｉｌｉｃｏｎ−ｏｎ−Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）ウェハー、ＨＦ開放等を使用することができる。各針状体（２２）は、シリコン（１８）の柱状構造部、及び、構造部（１８）の少なくとも一端に付着された金（１６）の機能性表面を有する。

本発明の第１の実施の形態を実行するために代替え可能な方法について説明する。

図２は本発明の第１の実施の形態における代替えの製造方法の流れを示す図である。

ここでは、新たなシリコンウェハー、すなわち、基板（１１）が、構造部用材料の基板として用意される（図２（ａ））。続いて、基板（１１）は、例えば、熱蒸着又は他の膜付着技術により付着されるクロム（１５）及び金（１６）から成る機能性表面用の金属薄膜によって被覆される（図２（ｂ））。金属層の上に、レジスト層（１２）が、好ましくはスピンコートによって、付着される（図２（ｃ））。レジストは、好ましくは、電子ビームリソグラフィーの照射によってパターニングすることが可能な、ＺＥＰ−５２０等の電子感応性レジストである。

続いて、電子ビームリソグラフィーによって、金の表面（１６）上にレジスト（１２）の複数の小さな点が残留するように、パターンが画定される（図２（ｄ））。次に、レジストの点（１２）のパターンが金属層（１５、１６）に移行する。レジストの点（１２）をマスクとして使用し、金属（１５、１６）がエッチングされるが、この場合、レジスト（１２）の下にある金属（１５、１６）は保護されて残留する（図２（ｅ））。

この後、シリコン構造部本体（１１）はディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）によって画定されるが、ディープ反応性イオンエッチングでは、レジスト（１２）がマスクとして作用し、その下の金属層（１５、１６）及びシリコン（１８）を保護する（図２（ｆ））。レジスト（１２）と金（１６）との間に付加されたアルミニウム層を使用すると、ディープ反応性イオンエッチングのステップに対する抵抗性を高めることができる。

最後に、レジストの点（１２）は、例えば、溶剤又は酸素プラズマエッチングによって、取り除かれる（図２（ｇ））。このようにして形成された独立した柱状体（１８）は、シリコン基板（１１）の残り部分から取り除かれる（図２（ｈ））。柱状体（１８）は、更に、他の方法で作成された柱状体（１８）と同様の方法で処理される。

次に、針状体（２１）の形状について説明する。

図３は本発明の第１の実施の形態における電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフによって製造された針状体の配列を示す図である。

電子ビームによる製造方法の利点の１つはデザインの自由度である。針状体の形状は大きく影響され得る。図３に示されるような円形、三角形又は正方形等の基本的形状を備えた試作品が作成された。図３（ａ）において、上半分は電子ビームリソグラフィー後のパターンを示し、下半分はリフト−オフ後のパターンを示している。図３（ｂ）は、ディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）後においても、未だ基板に付着している円形デザインの針状体を示している。図３（ｃ）は、ディープ反応性イオンエッチング後においても、未だ基板に付着している正方形デザインの針状体を示している。図３（ｄ）は、ディープ反応性イオンエッチング後においても、未だ基板に付着している三角形デザインの針状体を示している。

構造体の輪郭は、特に、５００〔ｎｍ〕以下では、デザインに関してわずかに変形してしまい、鋭い角が丸みを帯びた角に変形してしまった。さらに、パターンの大きさを容易に変更することができた。しかし、最終的な構造体の大きさは、照射及び現像パラメータに非常に敏感に依存した。

本実施の形態においては、金（１６）を機能化表面用材料として使用した場合についてのみ説明されている。しかし、薄膜技術の分野において知られている多種類の材料は、金と同様に、機能化表面用材料として使用することができる。例えば、Ｓｉ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｗ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｏ、Ｎ、Ｎｉ−Ｆｅ合金、Ｚｒ、Ｔａ、Ｉｒ、Ｃ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｚｎ及びＮｂである。これらの材料は、単体でも、並びに、例えば、ＳｉＯ₂ 及びＳｉ₃ Ｎ₄ のような複合体でも、機能化表面用材料として機能し得る。

機能化表面と生体分子との間の付着における介在物として、機能化要素を使用することが好ましい。後述される実験結果において示されるように、機能化要素としては、硫黄、すなわち、Ｓが好適な例である。しかし、同じく後述されるように、機能化要素を使用しなくても、機能化表面を生体分子に付着させることができる。

機能化表面の厚さは、好ましくは、１０〜１００〔ｎｍ〕である。この範囲の下限を下回ると、所望の厚さの機能化表面を製造することができず、また、前記範囲の上限を上回ると、表面に付着する機能化要素が多くなり過ぎるので、機能化表面の有効性が前記範囲内のものよりも低下してしまう。好適な一例として、厚さが３０〔ｎｍ〕の機能化表面を備える１２００〔ｎｍ〕の長さの構造部から成る針状体（２１）が作成された。機能化表面の厚さの合計長さに対する比は、２．５〔％〕であった。

次に、針状体（２１）の直径対長さ比について説明する。

図４は実際に製造された各種の直径対長さ比を有する針状体の有効性を示すテーブル、図５は実際に製造された各種の直径対長さ比を有する針状体を示す写真である。

直径の上限は有効性によって決定された。技術的には、直径をマイクロメートル単位の値にすることは容易である。図４に示されるように、直径の下限は５０〔ｎｍ〕未満であった。図４において、良好な結果はＯとして示され、良好でない結果はＸで示されている。長さの下限も有効性によって決定された。技術的には５０〔ｎｍ〕の長さまで短くすることができる。長さの上限は、ディープ反応性イオンエッチング用のマスクの直径に影響された。これは、使用されたエッチングプロセスの限界に起因するものであった。側面は、完全には垂直でなく、わずかに傾斜する。これを定量化するためには、直径対長さ比を考慮することが有効である。これは、長さを直径で除することによって得られる無単位の数値であり、次のように定義される。
直径対長さ比＝長さ／直径
直径対長さ比の値としては、２３までの高い値を得ることができた。これは、直径が５０〔ｎｍ〕の場合、長さが１．５〔μｍ〕未満であることを示すものであった。図５（ａ）に示されるように、直径が６０〔ｎｍ〕の場合、長さが１．４〔μｍ〕の針状体（２１）を得ることができた。図５（ｂ）に示されるように、直径が７０〔ｎｍ〕の場合、長さが１〔μｍ〕の針状体（２１）を得ることができた。図５（ｃ）に示されるように、直径が１００〔ｎｍ〕の場合、長さが１．８５〔μｍ〕の針状体（２１）を得ることができた。図５（ｄ）に示されるように、直径が２５０〔ｎｍ〕の場合、長さが１．２〔μｍ〕の針状体（２１）を得ることができた。図５（ｅ）に示されるように、直径が１５０〔ｎｍ〕の場合、長さが１．４〔μｍ〕の針状体（２１）を得ることができた。なお、図５（ａ）、（ｃ）及び（ｅ）は、後述される第２の実施の形態によるプロセスによって製造されたものを示している。

次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。なお、第１の実施の形態と同じ構成を有するものについては、同じ符号を付与することにより、その説明を省略する。また、前記第１の実施の形態と同じ動作及び効果についても、その説明を省略する。

図６は本発明の第２の実施の形態におけるラテックスビーズを使用する製造方法の流れを示す図、図７は本発明の第２の実施の形態における製造方法のステップでの針状体をスキャニングした側面を示す写真である。

前記第１の実施の形態では形状を良好に制御して微小針状体を製造することができるが、生物検定のためのサンプルを用意する場合に難点がある。標識に対する要求の１つは、標識の付着対象（生体分子）よりも相当に多数の標識を用意しておくことである。これは、典型的な生物検定のためには、数百万単位の針状体が必要であることを意味する。電子ビームリソグラフィーは一連のプロセスであり、サンプルがスキャンされ、デザインの各画素が次々と照射されることを意味する。明らかに、照射される構造体の数の増加に伴って照射時間が増加する。前述された設定を使用すると、約１５分の照射時間において、最大限３００００本程度の針状体を得ることができる。これは、百万本の針状体を得るためには、照射時間が約８〜９時間になるであろうことを意味する。

電子ビームリソグラフィーの難点を避けるために、より並行性を備える、すなわち、すべての構造体が同時に処理されるプロセスが開発された。本発明の第２の実施の形態においては、電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフを行うことに代えて、図６に示されるように、エッチングを行うために重合体マスクが使用される。適切な表面上に、ポリスチレン（ラテックス）のビーズが分配され、溶融によって固着される。その後、ビーズはエッチングマスクとして機能し、最初は金属層の最上層のエッチングマスクとして、続いて、シリコンのディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）用のマスクとして機能する。最後に、ビーズは、灰化（ａｓｈｉｎｇ）によって除去され、針状体が超音波処理によって開放される。

本発明の第２の実施の形態において、個々の製造方法のステップの多くは、前記第１の実施の形態で説明した電子ビームリソグラフィーの製造方法のステップと同様である。まず、１枚のシリコン単結晶基板、すなわち、ウェハー（１１）が構造部用材料の基板として用意された（図６（ａ））。

続いて、清浄なシリコンウェハー（１１）上に、クロム（１５）及び金（１６）を付着させた（図６（ｂ））。最初の金属層（１５、１６）は熱蒸着によって付着させ、接着層としての５〔ｎｍ〕のクロム（１５）と、３０〔ｎｍ〕の金（１６）とを付着させた。ラテックス粒子（２２）の接着性を高めるために、金（１６）の表面は、Ｏ₂ プラズマ（１〜３分間、電力５０〔Ｗ〕、Ｏ₂ 流量１００〔ｓｃｃｍ〕、容器内圧力０．０８〔ｔｏｒｒ〕、Ｓａｍｃｏ ＲＩＥ−１０Ｎ）内における短時間の被膜除去処理が行われた。

前記第１の実施の形態において説明したように、クロム（１５）及び金（１６）を付着させるために、熱蒸着以外の膜付着技術を使用することができる。そして、クロム（１５）及び金（１６）以外にも、薄膜技術によって付着させることができエッチングすることができるものであれば、多くの金属及び非金属を使用することができる。

このステップの直後に、エッチング用マスクとしての樹脂粒子（２２）が金層（１６）の上に分配された（図６（ｃ））。粒子（２２）、すなわち、ビーズの材料としては、ポリスチレン以外のポリマー、金のような金属、及び、シリカのような非金属も使用することができる。しかし、本発明の第２の実施の形態においては、ポリスチレン、すなわち、ラテックスが好適に選択された。ポリスチレン（ラテックス）ビーズは、各種の生物検定のために一般的に使用される標識であり、高品質のものを多量に商業的に入手することができる。入手可能な多くの相違するビーズの中から、ＣＯＯＨ機能性表面を備えるグループであって、公称直径が２３０〔ｎｍ〕のもの（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）が選択された。

水性懸濁液内にあるラテックスビーズ（２２）が、スピンコート（３０００〔回転／分〕、２０秒間）によって金表面上に分配された。密度は、１ミリリットルの消イオン水中に７．５Ｅ１０個のビーズが含まれる（１０重量〔％〕ストックの１対２００希釈）ように調整された。ビーズ（２２）の凝集を防止するために、懸濁液は、スピンコートを行う前に超音波処理が施された。ラテックスビーズ（２２）を分配するために、スピンコート以外の他の分配技術、例えば、乾燥、浸漬（しんし）、散布等を使用することもできる。

スピンの後に、ビーズ（２２）は溶融接着又は溶解によって表面（１６）に付着する。上面にビーズが付着したシリコンウェハーは、摂氏９６〜９７度の加熱板（ｈｏｔ ｐｌａｔｅ）上で１５分間加熱された。ポリスチレンのガラス転移温度は摂氏９５度であり、沸点は摂氏１００度である（図６（ｄ）及び図７（ａ））。ラテックスビーズ（２２）を固定するために、加熱以外の他の技術、例えば、表面反応、加圧等を使用することもできる。

続いて、金層（１６）をパターニングするために、ウェットケミカルエッチングが行われた（図６（ｅ））。ビーズ（２２）は、続いて、エッチング用マスクとして使用された。希釈された金用エッチング溶液（ＫＩ及びＩ₂ 溶液、Ｋａｎｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ． Ｉｎｃ．）内における４分間のウェットケミカルエッチングによって、ビーズ周囲の最上位の金層（２２）が除去された（図６（ｆ））。クロム接着層（１５）は、硝酸セリウム２アモニウム（ＩＶ）／過塩素酸（ＨＹ、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）内における４分間のウェットケミカルエッチングによって除去された。ビーズの下では、金属層（１５、１６）は保護されて残留した。金属層（１５、１６）をエッチングするために、ウェットケミカルエッチング以外の他のエッチング技術、例えば、物理エッチング（収束イオンビーム又はスパッタ）、ドライケミカルエッチング等を使用することもできる。

続いて、ディープ反応性イオンエッチングが行われた（図６（ｇ））。照射が行われたシリコン表面（１１）は、ディープ反応性イオンエッチングによって、電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフのプロセスの場合と同様に、異方性のエッチングが行われた。ディープ反応性イオンエッチングによって、シリコン基板（１１）は、ラテックスビーズマスク（２２）に倣ってパターニングされ、複数の柱状体（１８）が形成された（図７（ｂ））。

ディープ反応性イオンエッチングの後に、ラテックスビーズ（２２）は、Ｏ₂ プラズマ（電力８００〔Ｗ〕、プラテン電力２４０〔Ｗ〕、Ｏ₂ 流量４０〔ｓｃｃｍ〕、４０秒間）内において、灰化によって除去された（図６（ｈ））。続いて、アセトン内に収容された。ラテックスビーズ（２２）を除去するために、灰化以外の他の技術、例えば、紫外線／オゾン処理、化学溶液等を使用することもできる。

最後に、パターニングされた構造部としての柱状体（１８）が、シリコン単結晶基板（１１）の残り部分から取り除かれた（図６（ｉ））。柱状体（１８）を基板（１１）から取り外すために、１００〔Ｗ〕、３５〔ｋＨｚ〕での１５分間における超音波処理が行われた（図７（ｃ））。そして、長く延びた針状体（２１）が得られた。柱状体（１８）を切り離すために、超音波処理以外の他の処理、例えば、ＳＯＩ（Ｓｉｌｉｃｏｎ−ｏｎ−Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）ウェハー、ＨＦ開放等を使用することができる。針状体（２１）は、１５０００〔回転／分〕（〜２００００〔ｇ〕）で１０分間の遠心分離処理によって収集された。これにより、針状体（２１）の集中及びメディアを調整することができた。

次に、針状体（２１）の形状について説明する。

図８は本発明の第２の実施の形態におけるポリスチレンビーズを使用した製造方法によって製造された針状体の写真、図９は本発明の第２の実施の形態における切り離して収集した後の針状体の写真である。

電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフの製造方法と異なり、ポリスチレンビーズ（２２）をマスクとして使用する製造方法は、大量の針状体（２１）を同時に製造することができる。３〔インチ〕のウェハー（１１）上に、図８（ａ）及び（ｂ）に示されるように、１億５０００万〜２億のランダムに分配された針状体（２１）を１度に製造することができる。この条件においてのみ、切り離された針状体（２１）（図９（ａ））を収集し、光学顕微鏡で観察することができる（図９（ｂ））ように、集中した状態で再び懸濁させることが可能となる。

ポリスチレンビーズを使用する製造方法は、安定しているので、パラメータの変動が小さくて制御可能であり、再現性のある結果を得ることができる。製造方法は、余裕を持って１日で実行することができ、生物検定に使用するのに十分な量を生産することができる。これらの利点があるので、この製造方法を更なる研究の対象の有力候補とした。

微小針状体の更なる解析
本発明の第１及び第２の実施の形態における標識製造方法を採用することによって、大量の微小針状体を迅速、かつ、容易に製造することができる。本発明の実施の形態における主な特徴は次のようなものである：（ａ）直径が４００〔ｎｍ〕以下で、長さが４マイクロメートル〔μｍ〕以下の細長い構造の微小針状体を製造することができ、（ｂ）１度に１億〜２億の範囲の数を並行して製造することができ、そして、（ｃ）局限化された機能化表面を上端に備える微小針状体を製造することができる。本発明の実施の形態における他の特徴は次のようなものである：（ｄ）例えば、１日以内で、微小針状体を迅速に製造することができ、（ｅ）一般的な原材料を使用し、（ｆ）微小針状体の寸法を調節することができ、そして、（ｇ）微小針状体が機械的に安定している。

本発明の第１及び第２の実施の形態における標識製造方法によって製造された微小針状体の応用分野は、微小針状体を生体分子に付着させることによって、ＤＮＡ、プロテイン等の生体分子に標識付けすることを含んでいる。微小針状体は、好ましくは、プロテインの一種であるモータ分子に付着させて、光学顕微鏡によってモータ分子の回転運動を観察可能するために使用される。微小針状体の細長い構造は、モータ分子の回転運動を拡大するのに適している。生物検定のためには、多数の微小針状体が必要である。微小針状体の局限化された機能化表面は、付着を制御するために適しており、かつ、運動する対象物の長さにも適している。長さが既知であれば、抵抗及び使用されるエネルギーの計算が容易になる。

電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフの微小針状体の製造方法は、一連のプロセスであるから、多数の製造は小数の製造よりも非常に大きな労力が必要である。電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフの製造方法の利点は、形状及び大きさのデザインの自由度である。ラテックスビーズでマスクする製造方法にとっては、多数を製造するための労力は少数を製造するための労力と本質的に同じなので、ラテックスビーズでマスクする製造方法はより魅力的である。加えて、ラテックスビーズの製造方法は、より安定しており、製造パラメータの変動が少ない。このため、ラテックスビーズでマスクする製造方法を更なる研究のより良い候補とし、電子ビームリソグラフィーを省略する。更なる研究及び結果は、すべて、ラテックスビーズでマスクする製造方法に依るものである。

金の機能化
針状体の上端に金が残留していることを確認するために、各種の分析が行われた。

図１０はサンプルを製造する方法の流れを示す図、図１１は図１０に示される方法で製造されたサンプルの上面の画像を示す写真である。

まず、金（１６）及びクロム（１５）のエッチングの後に、ポリスチレンビーズ（２２）がかなりの密度で表面上に残留していたことを確認することができた。針状体（２１）の外形のため、金帽子（１６）を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で直接観察することは困難である。この問題を回避するために、ディープ反応性イオンエッチングを省略してサンプルが製造された（図１０）。この製造方法では、まず、１枚のシリコン単結晶基板、すなわち、ウェハー（１１）が用意され（図１０（ａ））、続いて、清浄なシリコンウェハー（１１）上に、クロム（１５）及び金（１６）を付着させ（図１０（ｂ））、樹脂粒子（２２）が金層（１６）の上に分配され、該金層（１６）の表面に溶融付着され（図１０（ｃ））、金層（１６）及びクロム層（１５）のパターニングのためにウェットエッチングが行われ（図１０（ｄ））、最後に、ラテックスビーズ（２２）が灰化されて除去された（図１０（ｅ））。

これにより、金の小さな島をよりよく観察することができる平らな表面が製造された。非常に激しい金／クロムのエッチング及びプラズマ灰化の後でさえも、図１１において、観察することができるように、典型的にランダムなビーズの分配の中において、金の島（１６）がシリコン表面（１１）上に残留した。図１１はシリコン表面（１１）の上面を示しており、該上面は、２倍の長さで行われた金（１６）及びクロム（１５）のウェットエッチングの後に、ラテックスビーズ（２２）が２倍の長さのＯ₂ 灰化によって除去されたものである。

標識付けの概要
図１２はプロテイン付着の概要を示す図、図１３は標識付けの概要を示す図、図１４はサンプルの上面の画像を示す写真である。

すべての疑念を払拭（しょく）するために、針状体（２１）が製造され、金（１６）が蛍光性的に標識付けされた。製造及び観察を容易にするために、針状体（２１）を基板（１１）から切り離さなかった。標識付けのために、図１１に示されるように、まず、アミンによって終端するアルカンチオール（３１）（エタノール中における０．１〔ｍＭ〕の１１−アミノ−アンデカンチオール）を金（１６）に付着させた。チオール基は、金に選択的に付着し、自己集合の単分子層（ＳＡＭ：ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成する。硫黄、すなわち、Ｓ（３１ａ）は、機能化要素として作用し、生体分子に機能化物質を付着させるために重要な役割を果たす。

自己集合の単分子層は広く研究されており、アルカンチオールＳＡＭは最も人気のある研究対象の１つである。その原理は次のようなものである。本質的にアルカン鎖である分子は、典型的には１０〜２０メチレン単位を備え、使用される基板に対する強い選択的吸着作用を備えた先端基に付与される。チオール（Ｓ−Ｈ）先端基及びＡｕ基板は、極めて良好に作用することが示された。チオール分子は溶液中から直ちに金上に吸着し、表面から外方に延びる末端基を備えた高密度の単分子層を作る。相違する末端基を備えたチオール分子を使用することによって、結果的に生じる化学表面機能が広い範囲内において変化し得る。これに代えて、ＳＡＭを構成した後に反応を行うことによっても、末端基を化学的機能化することができる。ＳＡＭは、例えば、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、ＳｉＯ₂ 及びＧａＡｓのような、多くの金属及び非金属の上に付着させることができる。

図１２は３ステップ付着工程を示している。第１ステップは、アミンで終端したアルカンチオールのＳＡＭ（３１）を付着させることである。第２ステップは、ＮＨＳ−ビオチン（２７−１）を作成し、ＮＨＳ−ビオチン（２７−１）をアミンで終端したアルカンチオールのＳＡＭ（３１）に付着させることである。第３ステップは、アミンで終端したアルカンチオール（３１）に付着したビオチン（２７−１）にストレプトアビディン（２８）を付着させること、及び、ビオチンリンカー（２７−２）を使用してストレプトアビディン（２８）をプロテインに付着させることによって、ビオチン−ストレプトアビディン−ビオチンを作成することである。

金（１６）を蛍光性的に標識付けするために、図１３に示されるように、ビオチン（２７）が、スクシンイミドのエステル基（ＮＨＳ）を介してアミンの自由端に付着させられ、ＳＡＭとビオチン（２７）との間にアミド結合を形成する。可視化するために、ＰＥＧ及びトリトンを使用してＰＢＳ内においてＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５６８（３２）で標識付けされたアビディン（２８）であって、蛍光性的に標識付けされたアビディン（２８）が使用される。アビディン（２８）がＳＡＭのビオチン（２７）の末端に選択的に付着するので、これにより、金（１６）の分配を判断することができる。

図１４（ａ）は、上方から観察した場合における付着された針状体（２１）を描写する明るいフィールド画像であり、図１４（ｂ）は金（１６）を示す蛍光性画像であり、図１４（ｃ）は、針状体（２１）の上面と一致する蛍光性的に標識付けされた金（１６）を示している。図１３に示されるように、アビディンの蛍光は針状体（２１）の上面と一致するので、これにより、針状体（２１）の上面にのみ金（１６）が存在することが観察されると判断することができる。

均一性及び機械的安定性
針状体（２１）の均一性及び機械的安定性を検討するために、針状体（２１）のサイズ分布が研究された。

図１５は針状体の寸法の度数分布図、図１６は針状体を示す写真、図１７は細長い針状体の寸法の度数分布図、図１８は細長い針状体を示す写真である。

針状体（２１）の直径は、かなり狭い範囲で変動し、針状体（２１）の抵抗力にわずかな影響しか及ぼさないが、長さはより重要なパラメータである。特に、２つの点が研究された：超音波による切り離しの点並びに派生的な遠心分離及び超音波処理の点である。

超音波による切り離しの後における寸法分布は、針状体（２１）の均一性に関する情報を提供し、長さの公称値の信頼性を示す。長さを計測するために、５０本のランダムな針状体（２１）が、電界放出走査型電子顕微鏡（解像度：〜３０〔ｎｍ〕、測定誤差：〜１５〔％〕）を使用して、計測された。比較可能な値を得るために、同一の条件下において、すべての測定が１度に行われた。超音波による切り離し後における測定された寸法の分布は、図１５（ａ）に示されている。測定された平均的長さは１３４４〔μｍ〕であり、その標準偏差が０．０７４〔μｍ〕であった。これは、長さの変動が±５．５〔％〕であることに対応する。

派生的な遠心分離及び超音波処理の後における寸法分布は、針状体（２１）の安定性に関する情報を提供する。もし針状体（２１）が、遠心分離及び超音波処理の両者が一般的である生物検定において処理されるべきものであれば、これらの処理によってダメージを受けることはない。このため、均一性のために測定された一群の針状体のうちのいくつかは、１５０００〔回転／分〕（〜２００００〔ｇ〕）で１０分間の遠心分離処理を６回受け、続いて、１００〔Ｗ〕、３５〔ｋＨｚ〕の超音波処理を６０分間受けた。この追加された処理の後の寸法分布は、図１５（ｂ）に示されている。この結果は、遠心分離及び超音波処理の前の測定結果（図１５（ａ））と比較することができる：針状体の平均長さは１３４９〔μｍ〕（遠心分離及び超音波処理の前は１３４４〔μｍ〕）であり、標準偏差は、０．０７３〔μｍ〕（遠心分離及び超音波処理の前は０．７４〔μｍ〕）であり、処理前と実質的に同じであった。図１５（ａ）及び（ｂ）に示される場合、測定は、電界放出走査型電子顕微鏡によって、同一の条件下で、１度行われた。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による針状体（２１）の画像は図１６に示されている。

比較のために、ほぼ２〔μｍ〕×１００〔ｎｍ〕の非常に長くて細い針状体（２１）について、同様の手続きが行われた。この場合の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による画像は図１８に示されている。ここでは、初期の寸法分布はより大きく（図１７（ａ））、超音波処理の後には大きな寸法シフトが観察された（図１７（ｂ））。これにより、細長い針状体（２１）にはあまり適していないが、遠心分離によっても超音波処理によっても損傷を受けることがない針状体（２１）を製造することができると判断することができる。

針状体の寸法の調整
図１９はエッチングステップ前におけるポリスチレンビーズの灰化によって直径を変化させた同一長さの針状体を示す写真である。

針状体（２１）の寸法を変化させることは、利用可能な可視化装置及び針状体（２１）を付着させる特定のプロテインに応じて長さを最適化するために、興味深いことである。長さは、ディープ反応性イオンエッチングの時間を調整することによって容易に変化させることができる。しかし、針状体（２１）の直径対長さ比は所定の範囲内でなければならない。もし針状体（２１）が細長すぎると、前述したように、針状体（２１）は容易に損傷を受けてしまう。一方、もし針状体（２１）が太く短かすぎると、超音波処理によって針状体（２１）を切り離すことができないことが観察された。そのため、長さの調整は直径の調整と同時に行われる必要がある。１つの可能な方法は、単に公称直径の異なるビーズ（２２）を使用することである。他のアプローチは、製造方法の一部として、ビーズ（２２）の直径をわずかに減少させることである。ビーズ（２２）の加熱を変化させても何の効果もなかったが、酸素プラズマ中における灰化処理の時間を短くすることによって成功した。図１９に示されるように、針状体（２１）の直径（及び直径対長さ比）は、灰化処理の時間を増加させることによって、目に見えるように減少する。図１９は、エッチングステップの前において、同一長さであってポリスチレンビーズ（２２）を灰化（電力５０〔Ｗ〕、Ｏ₂ 流量１００〔ｓｃｃｍ〕、容器内圧力０．０８〔ｔｏｒｒ〕）することによって直径を変化させた針状体（２１）を示している。そして、図１９（ａ）は灰化が５秒の場合を示し、図１９（ｂ）は灰化が２０秒の場合を示し、図１９（ｃ）は灰化が３５秒の場合を示している。ビーズ（２２）を酸素プラズマ（電力５０〔Ｗ〕、Ｏ₂ 流量１００〔ｓｃｃｍ〕、容器内圧力０．０８〔ｔｏｒｒ〕）に３０秒間曝（さら）すことによって、針状体（２１）の直径を概略４５〔ｎｍ〕減少させて、１／３（基部において１４０〔ｎｍ〕〜９５〔ｎｍ〕）にすることができた。これにより、針状体（２１）の寸法を極めて繊細に微調整することができる。

生体への適用
図２０は固定されたＦ₁ ＡＴＰａｓｅに付着されたシリコン針状体を示す図、図２１はＦ₁ ＡＴＰａｓｅの回転を可視化する微小針状体を示す光学顕微鏡のビデオを示す連続した静止画像、図２２は図２１に示される微小針状体の回転を示す図である。

単一のプロテインの角運動を可視化するために製造された針状体（２１）の安定性を示すために、回転プロテイン（２６）であるＦ₁ ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ａｓｅ族が使用された。ＡＴＰを消費しながら、このプロテインは回転子タイプのサブユニットを回転させる。プロテイン（２６）に針状体（２１）を付着させるために、針状体（２１）は、特定されない付着手段によって、ストレプトアビディン（２８）で被覆されている（図２０）。図１２に示される３ステップ付着工程とは対照的に、この付着工程は１ステップ付着工程である。１ステップ付着工程、換言すると直接付着工程は、ＳＡＭもＮＨＳ−ビオチンも作ることなく、金−ストレプトアビディン−ビオチン−プロテインを直接に作る方法である。そのため、１ステップ付着工程によって微小針状体が生体分子に付着されるならば、機能化要素としての硫黄は使用されない。

Ｆ₁ ＡＴＰａｓｅ（２６）は、該プロテイン（２６）に取り付けられたＨｉｓ−ｔａｇ（２９）を介して、ニッケル−ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）で被覆されたフローセルのガラス（２５）に付着されている。針状体の溶液にＦ₁ ＡＴＰａｓｅ（２６）が被覆されたガラス（２５）を接触させることによって、針状体（２１）表面のストレプトアビディンがＦ₁ ＡＴＰａｓｅ（２６）の回転子サブユニット（２６ａ）のビオチンに結合する。

回転プロテインへの針状体（２１）の付着は高度に特定されたものではないが、成功した結合が形成され観察することができた。図２１は、Ｆ₁ ＡＴＰａｓｅ（２６）の回転の微小針状体による可視化を示す光学顕微鏡のビデオの２秒間隔の連続した静止画像を示しており、図２２は、Ｆ₁ ＡＴＰａｓｅ（２６）に付着した微小針状体（２１）の回転を示している。これは、微小針状体（２１）が角運動の可視化において良好な性能を発揮することを立証している。

討論
本発明の実施の形態は、単体のプロテインの角運動を可視化するための使用に高度に適した微小針状体（２１）を製造する方法を呈示したものである。前記実施の形態は、概略１００〔ｎｍ〕の直径及び１〜２〔μｍ〕の長さである針状の形状のシリコン構造（１８）であって、１日以内に多数、すなわち、１億〜２億本を製造可能なものの製造を特徴付けるものであった。製造された針状体（２１）は±５〔％〕までの均一なものであり、寸法は長さも直径も制御可能である。針状体（２１）は丈夫なものであり、遠心分離処理によっても超音波処理によっても損傷を受けることがなく、他の標識用粒子と同様に使用することができる。針状体（２１）表面の高度に局限化された範囲において、明確に機能化された領域（１６）を作成することができる。これにより、予測可能性の高い生体分子への付着が可能となる。針状体（２１）の外形は、単一のモータプロテインの小さな回転運動さえも可視化することができるようにするために理想的なものである。針状体（２１）が回転を鋭敏に探知する部材であることを立証することができた。本発明の実施の形態は、単一のモータ分子（２６）の角運動を観察するための強力なツールである微小針状体（２１）を得ることを保証するものである。

本発明は前記実施の形態に限定されるものではない。本発明の趣旨に基づいて本発明を種々変形させることが可能であり、それらを本発明の範囲から排除するものではない。

本発明の第１の実施の形態における電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフを使用する作成方法の流れを示す図である。 本発明の第１の実施の形態における代替えの製造方法の流れを示す図である。 本発明の第１の実施の形態における電子ビームリソグラフィー及びリフト−オフによって製造された針状体の配列を示す図である。 実際に製造された各種の直径対長さ比を有する針状体の有効性を示すテーブルである。 実際に製造された各種の直径対長さ比を有する針状体を示す写真である。 本発明の第２の実施の形態におけるラテックスビーズを使用する製造方法の流れを示す図である。 本発明の第２の実施の形態における製造方法のステップでの針状体をスキャニングした側面を示す写真である。 本発明の第２の実施の形態におけるポリスチレンビーズを使用した製造方法によって製造された針状体の写真である。 本発明の第２の実施の形態における切り離して収集した後の針状体の写真である。 サンプルを製造する方法の流れを示す図である。 図１０に示される方法で製造されたサンプルの上面の画像を示す写真である。 プロテイン付着の概要を示す図である。 標識付けの概要を示す図である。 サンプルの上面の画像を示す写真である。 針状体の寸法の度数分布図である。 針状体を示す写真である。 細長い針状体の寸法の度数分布図である。 細長い針状体を示す写真である。 エッチングステップ前におけるポリスチレンビーズの灰化によって直径を変化させた同一長さの針状体を示す写真である。 固定されたＦ₁ ＡＴＰａｓｅに付着されたシリコン針状体を示す図である。 Ｆ₁ ＡＴＰａｓｅの回転を可視化する微小針状体を示す光学顕微鏡のビデオを示す連続した静止画像である。 図２１に示される微小針状体の回転を示す図である。

符号の説明

１１ 基板
１２ レジスト
１２ａ 底部層
１２ｂ 最上層
１４ 凹部
１５ クロム
１６ 金
１７ アルミニウム
１８ 柱状体
２１ 針状体

Claims (10)

1. 生体分子に付着する機能を備える機能性表面を少なくとも一端に備える構造部を含む標識の製造方法であって、
   機能性表面用材料の薄膜を構造部用材料の基板上に付加するステップと、
   電子ビームリソグラフィーによって前記機能性表面用材料の薄膜及び構造部用材料の基板をパターニングするステップと、
   エッチングによって前記構造部用材料の基板をパターニングするステップと、
   パターニングされた機能性表面用材料上のマスクを取り除くステップと、
   パターニングされた構造部を構造部用材料の基板の残り部分から分離するステップとを有する標識製造方法。
2. 生体分子に付着する機能を備える機能性表面を少なくとも一端に備える構造部を含む標識の製造方法であって、
   機能性表面用材料の薄膜を構造部用材料の基板上に付加するステップと、
   複数の粒子を前記機能性表面用材料の薄膜上に付加するステップと、
   前記粒子をマスクとするエッチングによって前記機能性表面用材料の薄膜及び構造部用材料の基板をパターニングするステップと、
   前記マスクを取り除くステップと、
   パターニングされた構造部を構造部用材料の基板の残り部分から分離するステップとを有する標識製造方法。
3. 前記機能性表面は機能化要素とともに生体分子に付着する請求項１又は２に記載の標識製造方法。
4. 前記構造部の大きさは、直径が５０〜４００〔ｎｍ〕であり、長さが０．４〜４〔μｍ〕である請求項１又は２に記載の標識製造方法。
5. 前記生体分子はモータ分子である請求項１又は２に記載の標識製造方法。
6. 前記エッチングは異方性エッチングであり、マスク材料の薄膜が前記機能性表面用材料の薄膜上に付加される請求項１に記載の標識製造方法。
7. 前記エッチングは異方性エッチングであり、前記粒子はポリスチレンから成る請求項２に記載の標識製造方法。
8. 前記パターニングされた構造部は、超音波処理によって、前記構造部用材料の基板の残り部分から分離される請求項１又は２に記載の標識製造方法。
9. 前記機能性表面用材料は、Ａｕ、Ｓｉ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｗ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｏ、Ｎ、Ｎｉ−Ｆｅ合金、Ｚｒ、Ｔａ、Ｉｒ、Ｃ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｚｎ、Ｎｂ、ＳｉＯ₂ 及びＳｉ₃ Ｎ₄ から成る組の中から選択される請求項１又は２に記載の標識製造方法。
10. 前記構造部用材料は、Ｓｉ、ＳｉＯ₂ 、ポリイミド及びエポキシから成る組の中から選択される請求項１又は２に記載の標識製造方法。
    

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