TW202342742A - 用於治療溶酶體儲積症之使用雙啟動子載體的組成物及方法 - Google Patents

Abstract

本文係提供一種組成物，其係包含一用於經修飾之GlcNAc-1-磷酸轉移酶基因及溶酶體酶之共表現的載體。該編碼溶酶體酶之基因係可操作地連接至第一啟動子，且該編碼GlcNAc-1-磷酸轉移酶之基因係可操作地連接至第二啟動子。本文亦提供治療溶酶體儲積症的方法，其係包含對一個體投予本發明之組成物。

Description

用於治療溶酶體儲積症之使用雙啟動子載體的組成物及方法

本發明係關於一種組成物，其係包含一載體，該載體包含編碼一第一啟動子及一第二啟動子的序列，其中，該第一啟動子係可操作地連接至一編碼一溶酶體酶的第一多核苷酸，且該第二啟動子係可操作地連接至一編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶的第二多核苷酸。本發明亦關於使用前述組成物於治療溶酶體儲積症、預防溶酶體酶儲積症發生或發病、以及改善導致溶酶體酶儲積症之溶酶體酶的磷酸化的方法。

溶酶體儲積症（LSD）係指由溶酶體功能缺陷產生之遺傳性代謝病症。目前已鑑定出約50種不同的LSD，但其中只有少數（少於10種）被報導具有治療方法。因此，本領域對用於LSD之安全且有效的治療方法存在未滿足的需求。對此未滿足的需求，本發明係藉由酶替代療法（enzyme replacement therapy，ERT）或基因療法來提供二種解決方案。

本發明係提供一種組成物，其係包含一載體，該載體包含編碼一第一啟動子及一第二啟動子的序列，其中，該第一啟動子係可操作地連接至一編碼一溶酶體酶的第一多核苷酸，且該第二啟動子係可操作地連接至一編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶（PTase）的第二多核苷酸。

於部分實施態樣中，本發明之載體為一病毒載體或非病毒載體。於部分實施態樣中，本發明之載體為一腺病毒載體、或一腺相關病毒（AAV）載體、或一質體（plasmid）。

於部分實施態樣中，本發明載體之第一啟動子為CBH，且該第二啟動子係選自選自EFS或JeT。

於部分實施態樣中，本發明載體之經修飾的GlcNAc-1磷酸轉移酶係包含S1S3磷酸轉移酶（S1S3 PTase）。

於部分實施態樣中，本發明載體之溶酶體酶係選自由以下組成的群組：β-葡腦苷脂酶（GBA）、半乳糖腦苷酯酶（GALC）、α-半乳糖苷酶（GLA）、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶（NAGLU）、酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）、β-己醣胺酶（HexM）、及溶酶體酸性α-甘露糖苷酶（LAMAN）。

於前述實施態樣之任一態樣中，本發明之載體還包含一3’非轉譯區（3’ UTR）。於部分實施態樣中，該3’非轉譯區係選自SV40及bGH多腺苷酸（poly-A）。

於前述實施態樣之任一態樣中，本發明之組成物還包含一醫藥上可接受之載劑。

本發明亦提供一種治療溶酶體儲積症（LSD）的方法，該方法係包含對一個體投予一有效量之前述組成物的任一者，其中該組成物係增加導致LSD之溶酶體酶的磷酸化，從而治療LSD。

於部分實施態樣中，該個體係被診斷患有LSD及／或該個體係出現LSD的跡象或症狀。

本發明亦提供一種預防溶酶體酶儲積症（LSD）發生或發病的方法，該方法係包含對一個體投予一有效量之前述組成物的任一者，其中該組成物係增加導致LSD之溶酶體酶的磷酸化，從而預防該個體發生LSD。

於部分實施態樣中，該個體有LSD發生或發病的風險及／或該個體係出現LSD的跡象或症狀。

本發明亦提供一種改善導致溶酶體酶儲積症（LSD）之溶酶體酶的磷酸化的方法，該方法係包含使一細胞與一有效量之前述組成物的任一者接觸，其中該組成物係增加該溶酶體酶的磷酸化。

於部分實施態樣中，該細胞為體外的（in vitro）或離體的（ex vivo）。

於部分實施態樣中，該細胞係包含於一個體中。於部分實施態樣中，該個體係出現LSD的跡象或症狀、該個體有LSD發生或發病的風險、及／或該個體係被診斷患有LSD。於前述實施態樣之任一態樣中，該個體為人。

於前述實施態樣之任一態樣中，該投予係包含全身途徑的投予或局部途徑的投予。於部分實施態樣中，該全身途徑的投予為腸道內、腸道外、口服、肌肉內（IM）、皮下（SC）、靜脈內（IV）、動脈內（IA）、脊髓鞘內（intrathecal）、脊椎內（intraspinal）、或腔室內（intraventricular）。

本發明係關於包含表現載體及基因療法載體之新穎組成物，以及生成可操作地連接至GlcNAc-1磷酸轉移酶之S1S3變體（S1S3 PTase）的溶酶體酶的方法。本發明係提供一種新穎的雙啟動子載體，其中溶酶體酶係由一個啟動子控制，且S1S3 PTase係由另一個啟動子控制。在共同表現後，該雙啟動子載體係製造具有適當磷酸化之N-連接寡醣的溶酶體酶。

S1S3 PTase及溶酶體酶的表現顯著地增加了所表現之溶酶體酶的M6P含量。具有良好磷酸化的酶可使得該酶能夠被有效攝取及溶酶體傳遞。此可以實現更好的組織分布、細胞攝取、溶酶體標靶及基質減少。該雙啟動子載體使得溶酶體酶與S1S3 PTase表現於基因轉錄及轉譯中能夠分開調節，此可增加細胞中的溶酶體酶表現水平、避免使用較長雙順反子訊息（bicistronic message）所造成之複雜現象、以及能夠只表現編碼序列（避免包括額外的胺基酸序列）。S1S3 PTase的表現顯著地增加溶酶體酶中的M6P含量水平。

定義

除非有額外定義，否則本文使用的所有技術及科學術語皆具有如本發明所屬領域中具通常知識者所通常理解的相同涵義。將使用以下術語來描述及主張本發明。

本文使用之術語「表現載體」係指一包含重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸係包含可操作地連接至一待表現之核苷酸序列的表現控制序列。表現載體係包含用於表現之充足的順向作用（cis-acting）元件；可透過宿主細胞或於一體外表現系統中提供其他用於表現的元件。表現載體包括所有本領域已知者，例如：併入該重組多核苷酸的黏質體（cosmid）、質體（例如裸露於或包含於脂質體中）以及病毒（例如：慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、及腺相關病毒）。於部分實施態樣中，所揭露之載體於本文中係被稱作病毒載體。於部分實施態樣中，所揭露之載體於本文中係被稱作表現載體。

如本文所使用，術語「胜肽」、「多肽」、及「蛋白質」可相互交換使用，且係指一由透過胜肽鍵共價連接之胺基酸殘基所組成的化合物。蛋白質或胜肽必須含有至少二個胺基酸，且對可包含一蛋白質或胜肽之序列的胺基酸最大數量並沒有限制。多肽包括任意的胜肽或蛋白質，其係包含透過胜肽鍵彼此結合的二或多個胺基酸。如本文所使用，該術語係指短鏈（本領域通常亦稱為例如胜肽、寡肽及低聚物）以及長鏈（本領域一般稱為蛋白質，其中有許多類型）二者。舉例言之，「多肽」包括生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、同型二聚體、異二聚體、多肽之變體、經修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然胜肽、重組胜肽、合成胜肽、或前述的組合。

術語「醫藥上可接受之載劑」包括一醫藥上可接受之鹽、醫藥上可接受之材料、組成物或載劑，例如：液態或固態的填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑、或封裝材料（涉及攜帶或運輸本發明之化合物於可能表現其所欲功效的個體內、或攜帶或運輸本發明之化合物至可能表現其所欲功效的個體）。一般而言，係將該等化合物從身體的一個器官或部分攜帶或運輸至身體的另一器官或部分。各鹽或載劑必須在與配方的其他成分相容且不對個體造成傷害的意義下為「可接受的（acceptable）」。可作為醫藥上可接受之載劑的材料的部分實例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，例如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及醋酸纖維素；粉末狀黃耆膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例如可可脂及栓劑蠟（suppository wax）；油，例如花生油、棉仔油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二元醇（glycol），例如丙二醇；多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，例如氫氧化鎂及氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水（pyrogen-free water）；等張鹽水；林格氏液（Ringer’s solution）；乙醇；磷酸鹽緩衝液；稀釋劑；造粒劑；潤滑劑；黏合劑；崩解劑；潤濕劑；乳化劑；著色劑；離型劑；塗佈劑；甜味劑；調味劑；芳香劑（perfuming agent）；防腐劑；抗氧化劑；塑化劑；增黏劑；增稠劑；固化劑；定型劑；懸浮劑；界面活性劑；保濕劑；載劑；穩定劑；以及，其他用於醫藥配方之無毒可相容基質、或前述的任意組合。如本文所使用，「醫藥上可接受之載劑」亦包括與化合物活性相容且為個體生理上可接受之任意的及所有的塗料、抗細菌劑及抗真菌劑、及吸收延遲劑等。補充的活性化合物亦可併入該些組成物中。

如本文使用，術語「有效量」或「治療有效量」係指自本發明載體生成之病毒顆粒或感染單位的量，需要其以預防特定疾病病況、或減少該疾病病況之嚴重度、及／或改善該疾病病況或至少一種其病狀或與其相關之病況。

本發明組成物

本發明係提供一種組成物，其係包含一載體，該載體係包含一編碼透過第一啟動子控制之溶酶體酶的多核苷酸、以及一編碼透過第二啟動子控制之經修飾的GlcNAc-1磷酸轉移酶的多核苷酸。

於部分實施態樣中，該雙啟動子載體係包含一特定的核酸序列。於其他實施態樣中，該雙啟動子載體係包含一與如WO2021003442所揭露之SEQ ID NO: 1具有至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%相似度的核酸序列。

於部分實施態樣中，該編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase的多核苷酸係包含對應至如WO2021003442所揭露之SEQ ID NO: 4的核酸序列，WO2021003442之全部內容係併入本文中。於其他實施態樣中，該GlcNAc-1 PTase係透過一與如WO2021003442所揭露之SEQ ID NO: 4具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%相似度的多核苷酸進行編碼。

於部分實施態樣中，該編碼一溶酶體酶之多核苷酸係編碼一涉及至少一種LSD之溶酶體酶。該些溶酶體酶為本領域已知，且包括作為舉例但不限於WO2021003442之表1A至1C所列者，WO2021003442之全部內容係併入本文中。於部分實施態樣中，作為舉例但非限制地，該溶酶體酶係選自由以下組成的群組：β-葡腦苷脂酶（GCase、GBA）、半乳糖腦苷酯酶（GALC）、α-半乳糖苷酶（GLA）、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶（NAGLU）、酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）、β-己醣胺酶（HexM）、及溶酶體酸性α-甘露糖苷酶（LAMAN）。於部分實施態樣中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含一如WO2021003442所述之SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO: 10的核酸序列，WO2021003442之全部內容係併入本文中。

於部分實施態樣中，該雙啟動子載體係包含一由外而內的構型，其中二個啟動子為一與各基因之3’ UTR區域相鄰的遠端構型。

於部分實施態樣中，該雙啟動子載體係包含一由內而外的構型，其中二個啟動子的5’端係相鄰以向外驅動基因表現。

啟動子

該雙啟動子的啟動子可為構成性（constitutive）的、可誘導的／可抑制的（repressible）、及／或細胞類型特異性的。於某些實施態樣中，該啟動子為構成性的。用於哺乳動物細胞之構成性啟動子的非限制性實例包括巨細胞病毒（CMV）、UBC、EF1α（EFS）、JeT、SV40、PGK、CAG、CBA／CAGGS／ACTB、CBh、MeCP2、U6、及HI（包括前述的野生型及已知修飾者）。用於哺乳動物細胞之可誘導啟動子的非限制性實例包括四環黴素、熱休克、類固醇激素、重金屬、巴豆酯、腺病毒El A元件、干擾素、及血清可誘導啟動子。在不排除本領域已知的其他細胞類型特異性啟動子的情形下，可使用針對以下之細胞類型特異性啟動子的部分非限制實例：用於神經元（例如突觸素（synapsin））、星狀細胞（例如GFAP）、寡樹突細胞（例如髓鞘鹼性蛋白）、小神經膠細胞（例如CX3CR1）、神經內分泌細胞（例如：染色顆粒素A）、肌肉細胞（例如肌間線蛋白（desmin）、Mb）、或心肌細胞（α肌凝蛋白重鏈啟動子）。於一實施態樣中，細胞類型特異性啟動子可為Nrl（桿狀光受體特異性）啟動子、或HBB（血紅蛋白β）啟動子。

該雙啟動子載體之啟動子可以都是構成性的、可誘導的／可抑制的、及／或細胞類型特異性的。或者，該雙啟動子之啟動子可為不同類型的啟動子。作為舉例但非限制地，該第一啟動子可包含一構成性啟動子且該第二啟動子可包含一可誘導／可抑制的啟動子。或者，該第一啟動子可包含一構成性啟動子且該第二啟動子可包含一細胞類型特異性的啟動子。或者，該第一啟動子可包含一可誘導／可抑制的啟動子且該第二啟動子可包含一構成性啟動子。或者，該第一啟動子可包含一可誘導／可抑制的啟動子且該第二啟動子可包含一細胞類型特異性的啟動子。或者，該第一啟動子可包含一細胞類型特異性的啟動子且該第二啟動子可包含一構成性啟動子。或者，該第一啟動子可包含一細胞類型特異性的啟動子且該第二啟動子可包含一可誘導／可抑制的啟動子。

作為舉例但非限制地，S1S3 PTase基因的啟動子可為EFS或JeT，且溶酶體酶基因的啟動子可為CBH。

本發明之載體可進一步包含一或多個特異性的3’非轉譯區（3’ UTR，亦稱為多腺苷酸序列）。於部分實施態樣中，該3’ UTR可為雙向作用的（bidirectional）。3’ UTR之非限制性實例包括CMV、SP1、SV40多腺苷酸、牛生長激素多腺苷酸（bGH polyA）、兔–β球蛋白多腺苷酸、及雙向性UTR（例如來自SV40的序列）。

該雙啟動子載體的二個3’ UTR可以是相同的。或者，該雙啟動子載體的3’ UTR可為不同類型的3’ UTR。作為舉例但非限制地，可透過SV40來增強S1S3 PTase基因，且可透過bGH poly-A來增強溶酶體酶基因。

報告基因（ Reporter gene ）／可選擇標誌基因（ Selectable Marker gene ）

為了確認在雙啟動子載體間的多肽表現，該載體亦可包含一可選擇標誌基因、或一報告基因、或前述二者，以利從經經由病毒載體轉染或感染之細胞族群中識別及篩選出表現細胞。於部分實施態樣中，該可選擇標誌基因可被攜帶於一DNA分開片段上，並用於一共轉染程序（co- transfection procedure）。可選擇標誌基因及報告基因二者的側邊皆可存在適當的調節序列，以使能夠於宿主細胞中表現。有用的可選擇標誌基因包括該些本領域已知者，例如抗生素抗性基因（例如neo）等。

報告基因係用於識別潛在之經轉染細胞及評估調節序列的功能性。一般而言，報告基因為一不存在或不表現於受體生物或組織中的基因，且該基因係編碼一多肽，該多肽的表現係透過一些可容易檢測之特性（例如酶活性）來顯現。該報告基因的表現係在將DNA引入受體細胞後的合適時間進行測定。報告基因之非限制性實例包括編碼冷光素酶（luciferase）、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌之鹼性磷酸酶的基因、或綠螢光蛋白基因（例如：Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479: 79-82）。合適的表現系統為本領域已知，且可使用已知技術進行製備或商業購得。一般而言，具有顯示報告基因之最高表現水平的最小5’側翼區（flanking region）的建構體係被識別為啟動子。該些啟動子區域可連接至一報告基因，並用以評估摻劑調節啟動子驅動轉錄的能力。

將基因引入細胞

將基因引入和表現到細胞中的方法係本領域已知。於表現載體的情況下，可透過本領域已知的任何方法輕鬆地將該載體引入宿主細胞（例如：哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母菌細胞、或昆蟲細胞）。舉例言之，該表現載體可透過物理、化學、或生物學手段轉移至宿主細胞。

將多核苷酸引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質體轉染（lipofection）、粒子轟擊（particle bombardment）、微注射、電穿孔等。用於產生包含載體及／或外源核酸之細胞的方法係本領域已知。參見例如Sambrook等人之文獻（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）。用於將多核苷酸引入宿主細胞的較佳方法為磷酸鈣轉染。

將感興趣之多核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體（尤其是反轉錄病毒載體）已成為將基因插入哺乳動物（例如人）細胞中之最廣為使用的方法。其他病毒載體可衍生自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒及腺相關病毒。參見例如美國第5,350,674及5,585,362號專利。

將多核苷酸引入宿主細胞的化學手段包括膠體分散系統，例如：高分子複合物、奈米膠囊、微球、珠子、及脂質基系統（包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體）。用作為體外及體內傳遞媒劑（vehicle）的例示性膠體系統為脂質體（例如人造膜載體）。

於使用非病毒傳遞系統的部分實施態樣中，例示性的傳遞媒劑為脂質體。預期使用脂質配方於（體外、離體、或體內）將核酸引入宿主細胞。於部分實施態樣中，該核酸可與脂質締合。該與脂質締合的核酸可封裝於脂質體的水性內部、散布在脂質體的脂質雙層內、透過一與脂質體及寡核苷酸二者締合之連接分子附接至脂質體上、包埋（entrapped）於脂質體中、與脂質體複合（complexed）、分散於含有脂質的溶液中、與脂質混合、與脂質組合、以懸浮形式存在於脂質中、存在於膠束中或與膠束複合、或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質／DNA、或脂質／表現載體相關的組成物在溶液中結構並無任何特定的限制。舉例言之，其可呈現雙層結構，作為膠束存在、或呈現「折疊的（collapsed）」結構。其也可以簡單地散布於溶液中，可能形成大小及形狀不均勻的聚集體。脂質為脂肪物質，其可以是天然存在的脂質、或是合成的脂質。舉例言之，脂質包括細胞質中天然存在的脂肪小滴（fatty droplet）、及含有長鏈脂族烴及其衍生物的化合物類別（例如：脂肪酸、醇、胺、胺基醇、及醛）。

適合使用的脂質可從商業來源獲得。舉例言之，二肉豆蔻基卵磷脂（dimyristyl phosphatidylcholine，「DMPC」）可從Sigma（聖路易斯，密蘇里州）獲得；磷酸鯨蠟酯（dicetyl phosphate，「DCP」）可從K & K Laboratories（普萊恩維尤，紐約州）獲得；膽固醇（「Choi」）可從Calbiochem-Behring獲得；二肉豆蔻基磷脂醯甘油（dimyristyl phosphatidylglycerol，「DMPG」）及其他脂質可從Avanti Polar Lipids, Inc.（伯明罕，阿拉巴馬州）獲得。氯仿或氯仿／甲醇中之脂質的儲存溶液可存放於-20℃。氯仿被作為唯一的溶劑，因為其較甲醇更容易揮發。「脂質體」是一個包含各種單層及多層脂質媒劑的通用術語，該些脂質媒劑係透過生成封閉的脂質雙層或聚集體來形成。脂質體可被表徵為具有磷脂質雙層膜及內部水性介質的囊泡結構。多層脂質體係具有多個經由水性介質分隔的脂質層。當磷脂質懸浮於過量的水溶液時，會自發性形成脂質體。脂質成分經歷自我重組，然後形成封閉結構及包埋水及溶解在脂質雙層之間的溶質（Ghosh et al, 1991 Glycobiology 5: 505-10）。然而，亦包含具有於溶液中與正常囊泡結構不同的結構。舉例言之，脂質可能呈現膠束結構或僅是以不均勻的脂質分子聚集體的形式存在。也預期有脂染胺（lipofectamine）–核酸的複合物。

不論使用何種將外源核酸引入宿主細胞的方法，為了確認重組DNA序列存在於宿主細胞中，可進行各種試驗。該些試驗包括但不限於：本領域具有通常知識者所知的「分子生物學」試驗，例如：南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR；「生物化學」試驗，例如透過免疫手段（ELISA及西方墨點法）或透過本文所述之試驗來檢測特定胜肽之存在或不存在，以識別落入本發明範圍內的試劑。

載體

如本文揭露之用於治療或預防個體LSD的載體係適用於在真核細胞中複製及視需要地整合。

典型的載體係含有轉錄及轉譯的終止子、起始序列、及有助於調節所需核酸序列表現的啟動子。

亦可使用標準基因傳遞流程將本發明之載體用於核酸免疫及基因療法。用於基因傳遞之方法為本領域已知。參見例如美國第5,399,346、5,580,859、及5,589,466號專利，其全文透過引用而併入本文中。於另一實施態樣中，本發明係提供一基因療法載體。

可將本發明之經分離核酸選殖（clone）至多種類型的載體。舉例言之，可將該核酸選殖至包括但不限於以下的載體：質體、嗜菌粒（phagemid）、嗜菌體衍生物、動物病毒、及黏質體。感興趣之載體包括表現載體、複製載體、探針生成載體、及定序載體。

此外，可將載體以病毒載體的形式提供至細胞。病毒載體技術為本領域所知，且描述於例如Sambrook等人之文獻（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）、及其他病毒學與分子生物學的手冊中。

可作為載體之病毒包括但不限於：反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、及慢病毒。一般而言，合適的載體係包含一在至少一個生物體中作用的複製起源、一啟動子序列、便利的限制內切酶位點、及一或多個可選擇標誌基因（例如：WO 01/96584、WO 01/29058、及美國第6,326,193號專利）。

已發展出多種以病毒為基礎的系統來將基因轉移至哺乳動物細胞中。舉例言之，反轉錄病毒係提供一個方便的基因傳遞系統平台。可使用本領域已知的技術，將所選基因插入至載體中且封裝於反轉錄病毒顆粒中。接著，將重組病毒分離，並於體內或離體地將其傳遞至個體之細胞中。本領域已知多種反轉錄病毒系統。於部分實施態樣中，係使用腺病毒載體。本領域已知多種腺病毒載體。於一實施態樣中，係使用慢病毒載體。

舉例言之，衍生自反轉錄病毒（例如慢病毒）的載體係達到長期基因轉移的合適工具，因為其使一轉殖基因能夠長期穩定地整合到細胞中並於子代細胞中繁殖。因為慢病毒載體可以轉導非增生細胞（例如肝細胞），故其相較於衍生自致癌反轉錄病毒（onco-retrovirus；例如鼠科白血病病毒）的載體具有額外的優勢。其亦具有低免疫原性（immunogenicity）的額外優勢。於一較佳實施態樣中，該組成物係包括衍生自腺相關病毒（AAV）的載體。腺相關病毒（AAV）載體已成為治療多種病症的強大基因傳遞工具。AAV載體具有許多使其非常適合用於基因療法的特性，包括缺少致病力、最小的免疫原性、以及以穩定且有效方式轉導有絲分裂後（post-mitotic）細胞的能力。可透過選擇AAV血清型、啟動子、及傳遞方法的適當組合，將AAV載體內所含之特定基因的表現特異性地靶向一或多種類型的細胞。

於部分實施態樣中，所揭露之雙啟動子病毒載體包含：腺病毒（例如：Ad-SYE、AdSur-SYE、Ad5/3-MDA7/IL-24、Ad-SB、Ad-CRISPR、溶瘤性（oncolytic）Ad）；腺相關病毒AAV（例如：AAV-MeCP2、AAV1、AAV5、雙AAV9 AAV8、AAV9、AAVrhlO、AAVhu37）；單純皰疹病毒HSV（例如：HSV1、HSV2、HSV-1、HF10溶瘤性HSV-2）；反轉錄病毒（例如：RRV/ Toca 511、GRV）；慢病毒（例如：HIV-1、HIV-2）；α病毒（SFV、Ml）；黃病毒（Kunjin病毒）；桿狀病毒（VSV）；麻疹病毒（例如MV-Edm）；新城疫病毒（例如NDV90、anhinga）；小核醣核酸病毒；Coxsackie病毒（例如：CVB3、CAV21、EV1）；或者，痘病毒（例如：PANVAC、VV、VV-GLV-lhl53、CPXV）。

於部分實施態樣中，所揭露之雙啟動子載體係一包含以下病毒之病毒載體：腺病毒、腺相關病毒（AAV）、α病毒、黃病毒、單純皰疹病毒（HSV）、麻疹病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒、慢病毒、新城疫病毒（NDV）、痘病毒、或小核糖核酸病毒。於部分實施態樣中，該雙啟動子載體係一包含腺病毒、腺相關病毒（AAV）、反轉錄病毒、或慢病毒之病毒載體。

於部分實施態樣中，編碼溶酶體酶的多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase的多核苷酸係包含於一AAV載體內。可取得超過30種天然存在的AAV血清型。存在許多AAV殼體（capsid）的天然變體，使得具有特定適用於骨骼肌之特性的AAV能夠鑑定及使用。可使用傳統分子生物學技術對AAV病毒進行工程改造，使得該些顆粒能夠最適化，以例如用於核酸序列之細胞特異性傳遞、用於最小化免疫原性、用於調整穩定性及顆粒壽命、用於有效降解、用於精準地傳遞至細胞核。

因為AAV相對無毒、提供有效的基因轉移、且可以輕易地針對特定用途進行最適化，使用AAV是一種常見的外源DNA傳遞模式。在從人或非人靈長類（NHP）分離且充分描述其特徵的AAV血清型中，人類血清型2為最早被發展為基因轉移載體的AAV；其已被廣泛地用於不同目標組織及動物模型中之有效基因轉移實驗。對於一些人類疾病模型，基於AAV2載體之實驗應用的臨床試驗正在進行，且包括諸如囊腫纖維化及血友病B之疾病的治療。其他可用的AAV血清型包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、及AAV9。

用於組裝至載體中所需之AAV片段係包括cap蛋白（包括vpl、vp2、vp3、及高度可變區）、rep蛋白（包括rep 78、rep 68、rep 52、及rep 40）、以及編碼該些蛋白的序列。該些片段可容易地在各種載體系統及宿主細胞中使用。該等片段可單獨使用、與其他AAV血清型之序列或片段併用、或者與來自其他AAV或非AAV病毒序列的元件併用。如本文使用，人工AAV血清型係包括但不限於具有非天然存在之殼體蛋白的AAV。該等人工殼體可透過任何合適技術使用所選AAV序列（例如vpl殼體蛋白的片段）與異源序列的組合來生成，其中該異源序列可獲得自不同的所選AAV血清型、相同AAV血清型之非連續部分、非AAV病毒來源、或非病毒。人工AAV可為嵌合AAV殼體、重組AAV殼體、或「人源化」AAV殼體，但不限於此。因此，適合用於感興趣之溶酶體酶及經修飾之GlcNAc-1 PTase表現的例示性AAV、或人工AAV包括AAV2/8（參見美國第7,282,199號專利）、AAV2/5（可從美國國家衛生研究院獲得）、AAV2/9（第WO2005/033321號國際專利公開本）、AAV2/6（美國第6,156,303號專利）、及AAVrh8（第WO2003/042397號國際專利公開本）等等。

於部分實施態樣中，本文所述之雙啟動子載體係含有編碼所選AAV血清型殼體（例如AAV8殼體）或其片段的序列。於另一實施態樣中，本文所述之雙啟動子載體係含有編碼所選AAV血清型rep蛋白（例如AAV8之rep蛋白）或其片段的序列。視需要地，該等載體可含有AAV之cap與rep蛋白二者。於提供AAV之cap與rep蛋白二者的載體中，該AAV之rep序列及AAV之cap序列二者可以是一種血清型起源，例如皆為AAV8起源。或者，本文所述之雙啟動子載體可含有來自與提供cap序列不同之AAV血清型的rep序列。於一實施態樣中，該rep及cap序列係由個別的來源（例如：個別的載體、或宿主細胞與載體）表現。於另一實施態樣中，該些rep序列係融合至不同AAV血清型之cap序列的兩側，以形成一嵌合AAV載體，例如美國第7,282,199號專利所述之AAV2/8。

合適的重組腺相關病毒（AAV）係透過培養宿主細胞來生成，該宿主細胞係含有一如本文所定義之編碼腺相關病毒（AAV）血清型殼體蛋白或其片段的核酸序列；一功能性rep基因；一由（最低量的）AAV末端反向重複序列（ITRs）及編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼GlcNAc-1 PTase之多核苷酸所組成的袖珍基因（minigene）；且該宿主細胞係含有准許將袖珍基因包裝至AAV殼體蛋白中的充足輔助工具。可反過來對該宿主細胞提供需要培養於宿主細胞中以將AAV袖珍基因封裝於AAV殼體中的該些組分。或者，可透過一合適的宿主細胞來提供所需組分（例如：袖珍基因、rep序列、cap序列、及／或輔助工具）的任意一或多者，其中已使用本領域具有通常知識者所知方法對該宿主細胞進行工程改造以含有所需組分的一或多者。

最合適地，此一穩定的宿主細胞將含有在一構成性啟動子之控制下的所需組分。但所需組分可在一可誘導啟動子的控制下。合適的可誘導及構成性啟動子的實例係於本文中的其他地方提供。於另一選擇中，所選之穩定宿主細胞可含有在構成性啟動子之控制下的所選組分、以及在一或多種可誘導啟動子之控制下的其他所選組分。舉例言之，可從293細胞（含有在構成性啟動子之控制下的E1輔助工具）生成穩定的宿主細胞，但其含有在可誘導啟動子之控制下的rep蛋白及／或cap蛋白。還有其他穩定的宿主細胞可由本領域具有通常知識者生成。

可以轉移宿主細胞上攜帶之序列的任何遺傳元件的形式，將製造本發明之rAAV所需的袖珍基因、rep序列、cap序列、及輔助工具傳遞至封裝的宿主細胞。所選遺傳元件可使用任何合適方法傳遞，包括本文述者及任何本領域可使用者。用於建構本發明之任意實施態樣的方法為熟悉操作核酸者已知，且包括基因工程、重組工程、及合成技術（參見例如：Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y）。相似地，係熟知生成rAAV病毒體的方法且合適方法的選擇並不限於本發明（其中參見例如：K. Fisher et al, 1993 J. Virol., 70:520-532、以及美國第5,478,745號專利）。

除非另有指定，否則本文所述之AAV的ITRs及其他所選AAV組分可容易地選自任何AAV血清型，該AAV血清型包括但不限於：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、或其他已知或未知的AAV血清型。可使用本領域具有通常知識者可得之技術容易地自AAV血清型中將該些ITRs或其他AAV組分分離。此一AAV可從學術、商業或公共資源（例如：American Type Culture Collection，馬納薩斯，維吉尼亞州）獲得。或者，可透過參考諸如可於文獻或資料庫（例如：GenBank、PubMed、或類似者）獲得之公開序列，經由合成或其他合適手段獲得AAV序列。

經修飾之細胞

於部分實施態樣中，本發明係提供一種包含本發明之載體的細胞。

該細胞可為原核細胞或真核細胞。合適的細胞包括但不限於：哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、及昆蟲細胞。

於部分實施態樣中，本發明係提供包含本發明之雙啟動子載體的哺乳動物細胞。於部分實施態樣中，該細胞為一能夠表現人類序列及／或製造人類蛋白質的哺乳動物細胞。於部分實施態樣中，該哺乳動物細胞係分離或衍生自小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、貓、狗、或非人靈長類動物。於部分實施態樣中，該細胞為一能夠表現人類序列及／或人類蛋白質的人細胞。於部分實施態樣中，該細胞為經培養的細胞。於部分實施態樣中，該細胞為永生化或穩定化的細胞系（cell line）。可用於蛋白質表現之哺乳動物細胞的非限制性實例包括中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、HeLa細胞、人胚胎腎細胞293（HEK293）細胞、幼倉鼠腎（BHK）細胞、猴腎細胞（COS）、人肝細胞癌細胞（例如Hep G2）、人胚胎腎細胞、源自原牛（Bos primigenius）的細胞、及源自小家鼠（Mus musculus）的細胞。於一特定實施態樣中，該細胞為CHO細胞。此外，該哺乳動物細胞可以是已建立且可商業購得的細胞系（例如：American Type Culture Collection（ATCC），馬納薩斯，維吉尼亞州）。該細胞可為永生化細胞。或者，該細胞可為初代細胞。

於部分實施態樣中，該細胞為細菌細胞。合適之細菌細胞的非限制性實例包括大腸桿菌（E. coli）以及其他腸桿菌（Enterobacteriaceae）、艾氏菌屬（Escherichia sp.）、彎曲桿菌屬（Campylobacter sp.）、沃林氏菌屬（Wolinella sp.）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio sp.）、弧菌屬（Vibrio sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、李斯特菌屬（Listeria sp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）、鏈球菌屬（Streptococcus sp.）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus sp.）、巨球型菌屬（Megasphaera sp.）、梳狀菌屬（Pectinatus sp.）、月單胞菌屬（Selenomonas sp.）、嗜發酵菌屬（Zymophilus sp.）、放線菌屬（Actinomyces sp.）、節桿菌屬（Arthrobacter sp.）、弗蘭克氏菌屬（Frankia sp.）、微單胞菌屬（Micromonospora sp.）、土壤絲菌屬（Nocardia sp.）、丙酸桿菌屬（Propionibacterium sp.）、鏈黴菌屬（Streptomyces sp.）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus sp.）、乳酸球菌屬（Lactococcus sp.）、明串珠菌屬（Leuconostoc sp.）、小球菌屬（Pediococcus sp.）、醋酸桿菌屬（Acetobacterium sp.）、真菌屬（Eubacterium sp.）、螺旋桿菌屬（Heliobacterium sp.）、螺旋陽光菌屬（Heliospirillum sp.）、鼠孢菌屬（Sporomusa sp.）、螺原體屬（Spiroplasma sp.）、脲原體屬（Ureaplasma sp.）、丹毒菌屬（Erysipelothrix sp.）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium sp.）、腸球菌屬（Enterococcus sp.）、梭菌屬（Clostridium sp.）、黴漿菌屬（Mycoplasma sp.）、分支桿菌屬（Mycobacterium sp.）、放線菌門（Actinobacteria sp.）、沙門氏桿菌屬（Salmonella sp.）、志賀氏菌屬（Shigella sp.）、莫拉氏菌屬（Moraxella sp.）、螺桿菌屬（Helicobacter sp.）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）、微球菌屬（Micrococcus sp.）、奈瑟菌屬（Neisseria sp.）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio sp.）、嗜血桿菌屬（Hemophilus sp.）、克雷白氏菌屬（Klebsiella sp.）、雷特格氏變形桿菌（Proteus mirabilis）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、鋸桿菌屬（Serratia sp.）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter sp.）、變形桿菌屬（Proteus sp.）、耶氏桿菌屬（Yersinia sp.）、不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）、放線桿菌屬（Actinobacillus sp.）、博多氏桿菌屬（Bordetella sp.）、布氏桿菌屬（Brucella sp.）、嗜二氧化碳嗜纖細菌屬（Capnocytophaga sp.）、心桿菌屬（Cardiobacterium sp.）、艾肯菌屬（Eikenella sp.）、法蘭西斯氏菌屬（Francisella sp.）、嗜血桿菌屬（Haemophilus sp.）、金氏菌屬（Kingella sp.）、巴斯德桿菌屬（Pasteurella sp.）、黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）、黃單胞菌屬（Xanthomonas sp.）、伯克氏菌屬（Burkholderia sp.）、產氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas sp.）、退伍軍人桿菌屬（Legionella sp.）、及諸如沃爾巴克氏體屬（Wolbachia sp.）的α–變形菌門（alpha- proteobacteria）、藍綠菌（cyanobacteria）、螺旋體門（spirochaetes）、綠硫細菌及綠非硫細菌、格蘭氏陰性球菌、苛求性（fastidious）格蘭氏陰性桿菌、發酵葡萄糖之腸桿菌科（Enterobacteriaceae）格蘭氏陰性桿菌、非葡萄糖發酵之格蘭氏陰性桿菌、葡萄糖發酵且氧化酶陽性之格蘭氏陰性桿菌。用於蛋白質表現之特別有用的細菌細胞包括：格蘭氏陰性細菌，例如：大腸桿菌、螢光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、鹽浮游假單胞菌（Pseudomonas haloplanktis）、惡臭假單胞菌AC 10（Pseudomonas putida AC 10）、類黃假單胞菌（Pseudomonas pseudoflava）、韓瑟勒巴通氏菌（Bartonella henselae）、丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）、新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）、運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）、苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）、黃色黏球菌（Myxococcus xanthus）；以及格蘭氏陽性細菌，例如：枯草桿菌（Bacillus subtilis）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、乾酪鏈球菌（Streptococcus cremoris）、變鉛青鏈球菌（Streptococcus lividans）、及變鉛青鏈黴菌（Streptomyces lividans）。大腸桿菌為最廣泛使用的表現細胞之一。因此，於大腸桿菌中過度表現的技術已經很好地發展且對本領域具有通常知識者而言是容易取得的。此外，螢光假單胞菌通常用於高水平生產重組蛋白（即，用於發展生物療法與疫苗）。

於部分實施態樣中，該細胞為酵母菌或真菌細胞。用於蛋白質表現之特別有用的真菌細胞包括米麴菌（Aspergillus oryzae）、黑麴菌（Aspergillus niger）、里氏木黴菌（Trichoderma reesei）、小巢狀麴菌（Aspergillus nidulans）、禾穀鐮孢菌（Fusarium graminearum）。用於蛋白質表現之特別有用的酵母菌細胞包括白色念珠菌（Candida albicans）、麥芽糖念珠菌（Candida maltose）、多型漢遜酵母（Hansenula polymorpha）、脆壁克魯維酵母（Kluyveromyces fragilis）、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）、季氏畢赤酵母（Pichia guillerimondii）、巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）、啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、及解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。

於部分實施態樣中，該細胞為昆蟲細胞。非限制性實例包括草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細胞系（例如：Sf9或Sf21）、果蠅細胞系、或蚊子細胞系（例如衍生自白線斑蚊（Aedes albopictus）之細胞系）。

於部分實施態樣中，該細胞為初代細胞，其係經修飾以表現本發明之載體，並在離體培養。於部分實施態樣中，對經培養的細胞進行永生化或其他修飾，以利細胞於體外無限繁殖，從而生成一經培養的細胞系。

包含所揭露之雙啟動子載體的細胞可用於蛋白質表現，並可視需要進行純化。從細胞表現並視需要地純化一表現蛋白的方法係本領域的標準技術。

於部分實施態樣中，包含本發明之雙啟動子載體的細胞可用於製造一編碼本發明之酶建構體的多肽。一般而言，本發明多肽的製造係包含使用一包含酶建構體之載體來轉染細胞、並培養該細胞，以使該些細胞轉錄及轉譯所欲之多肽。接著，可將該經分離的細胞裂解，萃取所表現的多肽以進行後續的純化。

醫藥組成物及配方

本文亦提供一種醫藥組成物，其係包含透過本發明之雙啟動子載體所表現的溶酶體酶。

此醫藥組成物係以適於投予至個體的形式呈現，或者該醫藥組成物還可包含一或多個醫藥上可接受之載劑、一或多個其他成分、或前述的部分組合。該醫藥組成物的各種組分可以生理上可接受之鹽的形式存在，例如：與本領域所知的生理上可接受的陽離子或陰離子組合。

依據所治療之個體的身分、大小、及病況，及進一步依據投予該組成物的途徑，本發明醫藥組成物中的活性成分、醫藥上可接受之載劑、及任何其他成分的相對量將有所不同。

有助於本發明方法之醫藥組成物可適當地發展成用於吸入、經口、經直腸、陰道、腸道外、局部、經皮、經肺、鼻內、經頰、經眼、脊髓鞘內、靜脈內、或其他途徑的投予。其他預期的配方包括經計畫之奈米顆粒、脂質體製劑、含有活性成分之重新密封的紅血球、及基於免疫學之配方。該（等）投予途徑對於此項技術之技藝人士而言是很明顯的，且取決於任意數目的因素，包括：所治療之疾病的類型及嚴重程度、所治療之動物或人類病患的類型及年齡等。

本文所述之醫藥組成物的配方可透過任何藥物學領域已知的方法或日後發展的方法來製備。一般而言，該等製備方法包括以下步驟：將活性成分與一載劑或一或多個其他附加成分締合，接著，若必要或所需，將產物塑形或包裝成所需的單劑量單位或多劑量單位。於部分實施態樣中，本發明之組成物可調配於天然殼體中、調配於經修飾殼體中、作為裸露的RNA、或者封裝於保護層中。

活性成分的量通常等同於將投予至個體之活性成分的劑量、或此劑量之便利分數（fraction），例如：此劑量的一半或三分之一。單位劑型可用於每日單次給藥、或每日多次給藥之一者（例如：每日約1至4次或更多次）。當使用每日多次給藥時，每次給藥的單位劑型可相同或不同。

雖然本文所提供之醫藥組成物的描述原則上是針對適用於人類倫理投予的醫藥組成物，但此項技術之技藝人士理解，此等組成物通常適用於所有類別之動物的投予。為了使適用於人類投予之醫藥組成物也適用於各種動物的投予，需要對適用於人類投予之醫藥組成物進行修飾，且具通常知識的獸醫藥理學家可僅使用一般實驗（若有）來設計及進行此修飾。預期本發明之醫藥組成物所投予的個體包括但不限於：人及其他靈長類、包括商業相關哺乳動物（例如：家牛、豬、馬、綿羊、貓、及狗）的哺乳動物。於一實施態樣中，該個體為人或非人哺乳動物，作為舉例但不限於馬科、綿羊科、牛科、豬科、犬科、貓科及鼠科。於一實施態樣中，該個體為人。

於一實施態樣中，係使用一或多種醫藥上可接受之賦形劑或載劑來調配該組成物。於部分實施態樣中，本發明係提供一種治療罹患LSD之個體的醫藥組成物。於部分實施態樣中，本發明係提供一種醫藥組成物，其中係包含透過本發明之雙啟動子載體及醫藥上可接受之載劑所表現之溶酶體酶。

有用的醫藥上可接受載劑包括但不限於：丙三醇、水、鹽水、乙醇、及其他醫藥上可接受之鹽溶液（例如：磷酸鹽及有機酸之鹽）。該載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇（例如：丙三醇、丙二醇、液態的聚乙二醇等）、前述之適當的混合物、及植物油的溶劑或分散介質。舉例言之，可透過使用塗層（例如卵磷脂）、透過在分散之情況下維持所需顆粒大小、以及透過使用界面活性劑來維持適當的流動性。微生物作用的預防可透過各種抗菌劑及抗真菌劑來達成，例如：對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞（thimerosal）等。於部分實施態樣中，較佳係於該組成物中包括等張劑，例如：糖、氯化鈉、或多元醇（例如甘露醇及山梨醇）。可透過於可注射組成物中加入吸收延遲劑（例如單硬酯酸鋁或明膠）來實現該可注射組成物的延長吸收（prolonged absorption）。

可將配方與習知的賦形劑（即，適用於經口、腸道外、經鼻、靜脈內、皮下、經腸、或本領域已知的其他任何合適投予模式的醫藥上可接受之有機或無機載劑基質）混合使用。該醫藥製劑可經滅菌，且若需要，可與輔助劑混合，例如：潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及／或芳香物質等。當需要時，其亦可與其他活性劑（例如其他止痛劑）合併。

本發明之組成物可包含防腐劑，其佔該組成物總重量的約0.005%至2.0%。該防腐劑係用於防止暴露於環境中的汙染物而產生的腐敗。根據本發明之有用的防腐劑的實例包括但不限於選自由以下組成之群組：苯甲醇（benzyl alcohol）、山梨酸、對羥基苯甲酸酯、咪尿素（imidurea）、及前述的組合。於部分實施態樣中，該防腐劑係約0.5%至2.0%之苯甲醇與0.05%至0.5%之山梨酸的組合。

該組成物可包括抑制化合物降解的抗氧化劑及螯合劑。部分化合物的較佳抗氧化劑係BHT、BHA、α–生育酚、及抗壞血酸，其較佳範圍為組成物總重量的約0.01重量%至0.3重量%，且更佳的抗氧化劑係組成物總重量之0.03重量%至0.1重量%的BHT。較佳地，螯合劑的含量係佔組成物總重量的約0.01重量%至0.5重量%。尤其較佳地，螯合劑係包括依地酸鹽（例如依地酸二鈉）及檸檬酸，其重量範圍為組成物總重量的約0.01重量%至0.20重量%，且更佳為組成物總重量的0.02重量%至0.10重量%。螯合劑可用來螯合組成物中可能不利於配方之貨架期的金屬離子。於部分實施態樣中，BHT及依地酸二鈉分別是部分化合物之抗氧化劑及螯合劑，然而，如本領域具有通常知識者所知般地，可以其他合適且等效的抗氧化劑及螯合劑取代之。

本發明係提供一種醫藥組成物，其係包含透過本發明之載體及醫藥上可接受之載劑所表達的溶酶體酶。

本發明之組成物可用於酶代替療法（ERT）。替代地或額外地，本發明之組成物可用於基因療法。

本發明之方法

本發明係提供治療被診斷出患有LSD之個體、或有患LSD風險之個體的溶酶體酶不足的方法。該方法係改善溶酶體酶的磷酸化作用，從而治療該個體、或預防該個體發生LSD。此外，該方法係改善病患的生命品質。

本發明係提供一種治療LSD的方法，該方法係包含對一個體投予本發明之組成物，從而治療LSD。

本發明係提供一種治療LSD的方法，該方法係包含對一個體投予一治療有效量之本發明的組成物，其中該組成物係增加溶酶體酶的磷酸化，從而治療LSD。

本發明係提供一種治療罹患LSD之個體的方法，該方法係包含對該個體投予本發明之醫藥組成物，從而增加溶酶體酶的磷酸化並治療該個體。

本發明係提供一種預防一有需要之個體發生LSD的方法，該方法係包含對該個體投予本發明之醫藥組成物，從而增加溶酶體酶的磷酸化並預防該個體發生LSD。

本發明係提供一種對一有需要之個體改善導致LSD之溶酶體酶的磷酸化的方法，該方法係包含對該個體投予本發明之組成物，其中該組成物係增加溶酶體酶的磷酸化。

投予／給藥

投予方案可能會影響治療有效量。舉例言之，可在病患個體接受與LSD相關的手術干預之前或之後、或者在病患被診斷患有LSD後不久即對該病患投予治療配方。此外，可每日或依序投予數個分次的劑量、及交替的劑量，或可為連續輸注方式或全劑量注射（bolus injection）方式給藥。此外，可隨治療或預防情況的緊急需要，而按比例增加或下降治療配方的劑量。

本發明之組成物對病患個體（較佳為哺乳動物，更佳為人）的投予可使用已知程序，以有效治療該個體之LSD的劑量及時間周期來進行。達到治療效果所需之治療化合物的有效量可能因為例如以下因素而有所不同：所使用之特定化合物的活性；投予的時間；該化合物的排泄率；治療持續時間；與該化合物併用的其他藥物、化合物或物質；疾病或病症的階段、年齡、性別、體重、身體狀況、將接受治療之病患的整體健康及先前病史、以及醫療領域中已知的類似因素。可調整劑量方案以提供最佳的治療反應。舉例言之，可每日投予數個分次劑量、或給藥可隨治療情況的緊急需要而按比例減少。用於本發明之治療化合物的有效劑量範圍的非限制性實例為每日每公斤體重約0.01至50毫克。

該化合物可以每日數次的頻率投予至個體，或者可以較低的頻率投予，例如：一天一次、一週一次、每二週一次、一個月一次、或甚至更低的頻率（例如：每數個月一次、或甚至一年一次、或更低）。可以理解，於每日給藥劑量的非限制性實例中，可每日、每隔一日、每2日、每3日、每4日、或每5日進行投予。舉例言之，在每隔一日投予的情況下，可於星期一以每天5毫克的劑量開始給藥，第一個後續的每天5毫克劑量在星期三投予、第一個後續的每天5毫克劑量在星期五投予，以此類推。給藥的頻率對於熟悉此項技術者為容易明瞭的，且取決於許多因素，舉例但不限於：所治療疾病的類型與嚴重程度、及動物的類型與年齡。可以改變本發明醫藥組成物中之活性成分的實際劑量水平，以便在不對病患產生毒性作用的情況下，對特定病患、組成物及投予模式達到所欲之治療反應的活性成分的量。本領域具有通常知識的醫療人員（例如：醫生或獸醫）可容易地確定及開藥方指定所需之醫藥組成物的有效量。舉例言之，該醫生或獸醫可以從低於達成所欲治療效果需要的水平開始給予醫藥組成物中之本發明化合物，並緩慢地增加劑量直到達到所欲效果。

於部分實施態樣中，將化合物調配為劑量單位形式（dosage unit form）以便於投予與劑量的均勻性是特別有利的。本文使用之劑量單位形式係指適合於作為待治療病患之單一劑量的生理離散單位；每個單位都含有經計算以產生所遇治療效果之治療化合物的預定量，與所需的醫藥媒劑相結合。本發明之劑量單位形式係取決於以下兩點，且與之直接相關：(a) 治療化合物的獨特特徵及所要達成之特定治療效果；以及，(b) 於合成／調配用於LSD治療之治療化合物的領域中的固有限制。

投予途徑

本領域中具有通常知識者將理解，可使用超過一種的途徑來投予，但特定的途徑可提供相較於其他途徑更直接且更有效的反應。

本發明組成物的投予途徑包括吸入、經口、經鼻、經直腸、腸道外、舌下、經皮、經黏膜（例如：舌下、經舌、（經）頰、（經）尿道、陰道（例如經陰道及陰道周圍）、鼻（內）、及（經）直腸）、膀胱內、肺內、十二指腸內、胃內、脊髓鞘內、小腦延髓池內（ICM）、脊柱內、心室內、腦室內、皮下、肌肉內、皮內、動脈內、靜脈內、支氣管內、及局部投予。合適的組成物及劑量形式包括例如：錠劑、膠囊、囊片、丸劑、凝膠帽（gel cap）、口含錠（troche）、分散液、懸浮液、溶液、糖漿、顆粒、珠粒、經皮貼片、凝膠、粉末、微粒（pellet）、乳漿劑（magmas）、喉片（lozenges）、乳霜、藥膏（paste）、藥膠布（plaster）、洗液、紙錠（discs）、栓劑、用於經鼻或經口投予的液體噴霧、用於吸入的乾粉或氣溶膠配方、用於經膀胱投予之組成物及配方等。應理解，本發明中有用之配方及組成物係不限於本文所述之特定配方及組成物。於一實施態樣中，LSD的治療係包含選自由以下投予途徑所組成之群組：吸入、經口、經直腸、經陰道、腸道外、局部、經皮、經肺、鼻內、經頰、經眼、肝動脈內、胸膜內、脊髓鞘內、腫瘤內、靜脈內、及前述的任意組合。

本領域中具有通常知識者係理解，可使用不同的傳遞方法將載體投予至細胞。實例包括：(1) 使用物理手段的方法，例如電穿孔（電力）、基因槍（物理力量）、或施用大量體積的液體（壓力）；以及，(2) 將載體與另一實體（例如脂質體、聚集蛋白、或轉運分子）複合的方法。

此外，實際給藥及用藥排程可能會因為組成物是否與其他醫藥組成物合併投予、或是因為個體間的藥物動力學、藥物動向（drug disposition）、代謝的差異而有所不同。相似地，於體外應用中的量可能因為所使用之特定細胞系（例如：基於呈現在細胞表面上之載體受體的數目、或用於基因轉染之特定載體在該細胞系中的複製能力）而不同。再者，將添加到各細胞之載體的量將隨著插入載體中之治療基因的長度及穩定度、還有序列的本質而可能不同，且該量尤其是需要憑經驗確定的參數，且可能會因為本發明方法的非固有因素（例如：與合成相關的成本）而改變。本領域中具有通常知識者可輕易地根據特定情況的緊急需要而進行任何必要的調整。

含有治療劑的細胞亦可含有一自殺基因，即，編碼一可用於摧毀該細胞之產物的基因。於許多基因療法的情況中，期望能夠於宿主細胞中表現用於治療目的之基因，但也期望能夠具有隨意地摧毀該宿主細胞的能力。可將治療劑連接至一自殺基因，且該自殺基因的表現不會在缺乏活化劑化合物的情況下被活化。當希望使已引入治療劑與自殺基因二者的細胞死亡時，會對該細胞投予活化劑化合物，從而活化該自殺基因的表現且滅殺該細胞。可使用之自殺基因／前藥組合的實例為單純皰疹病毒–胸苷激酶（HSV-tk）與更昔洛韋（ganciclovir）、阿昔洛韋（acyclovir）；氧化還原酶與環己醯亞胺（cycloheximide）；胞嘧啶脫胺酶與5–氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶（Tdk::Tmk）與AZT；以及，去氧胞苷激酶與阿糖胞苷（cytosine arabinoside）。 實施例

係參考以下實施例來描述本發明。提供該些實施例僅用於說明之目的，以及本發明不應以任何方式被解釋為限於該些實施例，而應被解釋為包含因為本文提供之揭露內容而變得顯而易見的任何及所有變體。

在沒有進一步描述的情況下，咸信本領域中具有通常知識者可使用前面的描述內容與以下的說明性實施例，製造並使用本發明之化合物、並實施所主張的方法。以下的操作實施例不應被解釋為以任何方式限制本發明的範圍。

實施例 1 ： S1S3 – GLA 雙啟動子載體的建構

為了生成含有雙啟動子的載體，將DNA片段集合以生成基因表現卡匣，其中S1S3 PTase及溶酶體酶GLA可從分開的啟動子及分開的3’ UTR進行表現。將片段集合於不同的組成物中，以透過強啟動子（即，Cbh啟動子）與標準3’ UTR（即，牛生長激素多腺苷酸）來驅動溶酶體酶，以及透過分開的啟動子（即，EF-1-α核心–Efs或經修飾之JeT啟動子）與分開的3’ UTR（即，sv40多腺苷酸）來驅動S1S3 PTase。接著，將此二基因表現卡匣集合在用於生成AAV的質體中，以使得：(1) 二個啟動子的5’端相鄰–由內而外；(2) 3’ UTR區域相鄰–由外而內；或者，(3) 二個卡匣依序排列（卡匣1之3’ UTR與第二個啟動子的5’區域相鄰）–依序（參見圖1）。

含有啟動子（例如EFs或JeT）與UTR（例如：sv40、bGH polyA）的DNA片段係從IDT（https://www.idtdna.com/pages/products/genes-and-gene-fragments/double-stranded-dna-fragments/gblocks-gene-fragments）或Twist Biosciences（https://www.twistbioscience.com/）訂購。本案發明人引領了DNA合成的創新。使用限制酶與標準分子生物學劑術將該些片段集合，以便創造含有溶酶體酶或S1S3 PTase的卡匣。放置限制位點（即，SacII、BamHI、NheI）以便取代溶酶體酶、或修飾S1S3 PTase序列（XbaI/PmeI）。使用標準分子生物學技術（限制消化、接合、細菌轉形）將DNA片段集合以創造含有來自AAV之ITR序列的最終質體。

基因表現卡匣係以三種方位進行排列（圖1）。第一種稱為由內而外（Inside-Out），其中啟動子係相鄰以向外朝位於相對兩端之3’-UTR序列方向來驅動基因表現。所使用之啟動子可為二個不同的啟動子（例如：Cbh、EFs、JeT）或是一雙向啟動子。第二個排列方式是由外而內（Outside-In），其特點在於啟動子為遠端構型且卡匣的3’-UTR區域相鄰。此使得基因可由不同的啟動子（例如：Cbh、EFs、JeT）驅動，且3’-UTR可為牛生長激素多腺苷酸、sv40多腺苷酸、兔–β球蛋白多腺苷酸、或雙向性UTR（例如來自SV40的序列）。第三個排列方式是依序方位，其中基因表現卡匣係連續放置於相同股上。依序方位係具有5’啟動子與第一基因、還有3’ UTR，接著連續是第二啟動子、基因、及第二UTR。該等不同的方位使得能夠從個別的啟動子表現mRNA，進而生成S1S3 PTase及溶酶體酶之蛋白質。此構型使得特定的啟動子與UTR組能夠透過使用不同的基因卡匣，個別地控制各基因的基因表現。圖1係顯示如何能夠使用雙啟動子表現GLA及S1S3 PTase。圖1係顯示於AAV表現卡匣中之構形。該些用於S1S3 PTase共表現之雙啟動子排列可用於酶替代療法、基於AAV之基因療法、基於奈米顆粒之劑術中的蛋白質表現。

實施例 2 ：將由內而外設計之雙啟動子載體轉染至 HEK239T 細胞中

使用HEK293T細胞的暫態轉染（transient transfection）來進行S1S3 PTase與溶酶體酶之共表現的雙啟動子由內而外設計（如實施例1所述）的初始測試。首先，將由內而外的質體（G0543：Efs-S1S3-sv40/Cbh-GLA-bGH poly A；G0547：JeT-S1S3-sv40/Cbh-GLA-bGH poly A）或對照組（G0500：Cbh-GLA-sv40）轉染至細胞（圖2A）。對細胞裂解物進行GLA活性試驗。可檢測到，相較於轉染的空白組（mock），對照組（G0500）及用於GLA／S1S3 PTase表現之由內而外的雙啟動子系統（G0543或G0547）的質體轉染係增加了GLA活性（圖2B）。透過西方墨點法確認GLA蛋白及S1S3 PTase蛋白的表現（圖2C）。該些圖式係顯示由內而外之雙啟動子構型的功能。

接下來，使用HEK293T細胞的暫態轉染來進行用於S1S3 PTase與溶酶體酶之共表現的雙啟動子由外而內設計。首先，將由外而內的質體G0544（Efs-S1S3-sv40/Cbh-GLA-bGH poly A）、G0595（JeT-S1S3-sv40/Cbh-GLA-bGH poly A）、由內而外的建構體G0543（Efs-S1S3-sv40/Cbh-GLA-bGH poly A）、或對照組（G0500：Cbh-GLA-sv40）轉染至細胞中（圖3A）。以細胞裂解物進行GLA活性試驗。再次地，可檢測到，相較於轉染的空白組，對照組（G0500）、由內而外的雙啟動子系統（G0543）、以及用於GLA／S1S3表現之由外而內的雙啟動子系統（G0544或G0595）的質體係轉染增加了GLA活性（圖3B）。透過西方墨點法確認GLA蛋白及S1S3 PTase蛋白的表現（圖3C）。該些圖式係顯示由內而外與由外而內之雙啟動子構型的功能。

方法

使用lipofectamine 3000及用於AAV卡匣之質體對HEK-293T細胞進行轉染，其中該AAV卡匣係含有雙啟動子，其中一者（例如Cbh）係驅動GLA表現，而另一者（例如EFs）係驅動S1S3 PTase表現。在進行轉染48小時之後收集細胞，將條件培養基及細胞裂解物保存，以用於酶活性試驗、CIMPR結合、及西方墨點法的分析。

遵循一已建立之流程來量測α-GAL活性，參見：Mayes, Scheerer et al. 1981、Yasuda, Huston et al. 2020。

簡言之，以0.1莫耳濃度至0.2莫耳濃度之檸檬酸–磷酸緩衝液（pH4.5）及0.25% TX-100來進行試驗。α-GAL基質為溶解於DMSO中的4-甲基傘形酮α-D-吡喃半乳糖苷（4-methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside；貨號：M7633，Millipore-Sigma），於試驗緩衝液中稀釋為1至5毫莫耳濃度。試驗緩衝液係包括一Gal-B抑制劑，90毫莫耳濃度的N–乙醯半乳糖胺（N-acetyl-Galactosamine，GalNAc；貨號：A2795，Millipore-Sigma）。將45微升之基質溶液等份分裝至一96孔板中，並以二重複（每個樣品2孔）的方式添加5微升之樣品（細胞裂解液、條件培養基、純化的蛋白質等）。為了比較活性，在試驗期間於相同的平板中進行4-甲基傘形酮（4-Methylumbelliferone，4-MU）鈉鹽（Sigma，M1381）的序列稀釋。接著，將該平板密封，並在搖晃／攪動下於37℃溫育1小時。透過添加150微升之終止緩衝液（0.4莫耳之甘胺酸–NaOH，pH 10.8）來停止反應。然後，使用Molecular Devices Spectramax Id3平板讀取儀及Softmax Pro 7.1軟體，在激發光360及散射光460下使用基質螢光來量測α-GAL活性。基於基質單獨或空白轉染條件來扣除螢光背景值。使用Excel來進行分析，並使用GraphPad Prism軟體來製作圖表。樣品的蛋白質濃度係使用BCA蛋白試驗盒（ThermoFisher 23227）遵循使用者流程進行量測的。再來，使用Molecular Devices Spectramax Id3平板讀取儀及Softmax Pro 7.1軟體量測在260下的吸光值。將濃度與BSA標準品進行比較。

實施例 3 ：體內之雙啟動子載體表現

為了確定使用GLA及S1S3 PTase雙啟動子轉殖基因的AAV9基因療法的表現，對8週齡之野生型C57BL/6J小鼠投予中度劑量之僅表現GLA的AAV9、或以雙啟動子由內而外構型表現GLA及S1S3 PTase的AAV9。AAV9注射2週後，收穫組織並將其均質化。透過微滴式數字PCR量測基因拷貝數及其mRNA水平。相較於A0500（僅含GLA的AAV9），二個雙啟動子的AAV9載體係於肝臟及腎臟顯示較高的GLA及S1S3 PTase基因拷貝數水平（圖4A及圖4B）、以及mRNA水平（圖4C及圖4D）。

實施例 4 ：用於 PPT1 及 S1S3 PTase 共表現之依序排列的啟動子設計

將用於PPT1及S1S3磷酸轉移酶共表現之依序排列的啟動子設計轉染至Expi293懸浮細胞中。圖5A係顯示依序排列的質體設計，其中CMV啟動子係用於PPT1表現，且第二啟動子（PGK、JeT、EF1-α）係用於S1S3表現，G0802為僅表現PPT1的質體。將Expi293細胞以所指定的質體進行轉染，於轉染48小時後收集條件培養基，並透過SDS-PAGE及考馬斯亮藍（Coomassie）染色檢驗PPT1的表現（圖5B）。所有含有PPT1的質體皆顯示出相當的PPT1酶／蛋白質表現。透過對細胞裂解物中融合至S1S3基因c-端之V5標籤進行西方墨點法，來檢驗S1S3的表現效果。如圖5C所示，所有S1S3的啟動子皆產生良好的S1S3表現，且EF1-α啟動子給出了最佳的表現。亦使用經轉染之細胞的條件培養基來進行陽離子非依賴性甘露糖6-磷酸受體（CI-MPR）結合試驗。使用PPT1活性試驗來確定結合。相較於僅表現PPT1的質體（G0802），含有依序排列啟動子之表現S1S3的質體係顯示出PPT1對CI-MPR的結合增強（G0813、G0816、G0817）（圖5D）。

實施例 5 ：經由 AAV 載體表現 GBA1 的雙啟動子設計

體外

使用AAV載體來確定雙啟動子設計的效果。設計含有AAV之ITR序列及使用Cbh啟動子表現GBA1之卡匣的質體。此外，係使用由外而內的設計以使用短的EF1-α啟動子（EFs）來共表現S1S3（G0158及G0194）。將共表現的質體與僅表現GBA1的質體（G0101）進行比較（圖6A）。

將由外而內之AAV質體轉染至Expi293懸浮細胞。使用僅表現GBA1的質體（G0101）、或GBA1／S1S3共表現質體（G0158及G0194）對細胞進行轉染，並於轉染48小時後收集條件培養基。使用一體外活性試驗來檢測條件培養基的GCase的酶活性。經媒劑（vehicle）轉染的細胞可檢測到最小活性，經G0101、G0158或G0194轉染之細胞則存在相當的GCase活性（圖6B）。使用抗GCase抗體（上方）或抗GAPDH內參對照抗體（loading control；下方）透過SDS-PAGE及西方墨點法對條件培養基（來自圖6B）進行檢驗（圖6C）。G0101、G0158、或G0194組呈現相似的GCase量，而來自媒劑對照組之培養基係呈現最少的GCase（註：G0158／G0194因為K360N突變而有尺寸位移）。檢測條件培養基（來自圖6B）對於CI-MPR的結合。將CI-MPR預結合至一96孔板並以來自表現G0101或G0194之細胞的條件培養基進行溫育。使用GCase活性試驗來測試結合（圖6D）。相較於G0101（灰色），G0194（橘色）係顯示出對CI-MPR的結合增強。

體內動物研究

使用圖5A所述之質體來生成僅表現GBA1之AAV9病毒載體（G0101）或GBA1與S1S3共表現之AAV9病毒載體（G0158及G0194）。經由尾靜脈將每公斤2×10 ¹³vg（2e13 vg/kg）之AAV9或作為靜脈內（IV）對照組之配方緩衝液注射至野生型小鼠。注射21天後，收集動物組織並將其均質化，並量測裂解物中的GCase活性。檢測於肝臟、心臟及腦中的GCase活性（圖7）。

亦將組織進行肝臟、心臟、腦、骨髓、及脾臟之GBA1與S1S3基因體DNA及mRNA的分析。使用檢測GBA1與S1S3之特異性引子及探針，透過微滴式數字PCR（ddPCR）來分析DNA及mRNA。如圖8A至8B所示，在以AAV（G0101、G0158、G0194；藍色）處理之動物的所有組織中，皆檢測到增加之GBA1的DNA（圖8A）及mRNA（圖8B）拷貝數。在以AAV（G0158、 G0194；橘色）處理之動物的所有組織中，皆檢測到增加之S1S3的DNA（圖8A）及mRNA（圖8B）拷貝數。此顯示出由外而內的AAV9可以共表現GBA1與S1S3二者（G0158及G0194）。

為了更好地理解經由全身注射（IV）之小鼠腦部的AAV轉導，係透過Basescope對小鼠腦部進行原位檢驗，以確認GBA1的轉錄。透過顯微鏡檢驗紋狀體，以觀察GBA1之mRNA表現及其在小鼠腦部紋狀體中的分布。圖式係顯示對於所有經含有GBA1基因之AAV9處理之小鼠的腦部皆有相似的GBA1之mRNA表現（圖9）。經媒劑處理之對照組中則沒有檢測出GBA1。

亦使用人GCase特異性抗體對小鼠腦部進行免疫組織化學染色檢驗，以檢測於小鼠腦部體感覺皮質中的GCase酶／蛋白質。圖式顯示經GBA1-S1S3共表現之AAV9（G0158及G0194）處理的小鼠，其腦部的GCase染色結果係增強（圖10）。此表示，當使用本發明之雙啟動子AAV設計來共表現S1S3時，GCase的組織分布會提升。

實施例 6 ：經由 AAV 載體表現 HexM 的雙啟動子設計

使用Cbh啟動子來設計一質體，其含有AAV之ITR序列、以及用於表現具有C-尾FLAG標籤之HexM的卡匣（關於HexM的描述，參見：Tropak, MB, Yonekawa, S, Karumuthil-Melethil, S, Thompson, P, Wakarchuk, W, Gray, SJ, et al., Construction of a hybrid β-hexosaminidase subunit capable of forming stable homodimers that hydrolyze GM2 ganglioside in vivo. Mol. Ther. - Methods Clin. Dev. 3: 15057 (2016)）（圖11A）。此外，係使用由外而內的設計以使用短的EF1-α啟動子（EFs）來共表現S1S3。將共表現的質體與僅表現帶有FLAG標籤之HexM的質體（G0718）進行比較。

將由外而內的AAV質體轉染至Expi293懸浮細胞。使用僅表現HexM的質體（G0718）、或HexM／S1S3共表現質體（G720）對細胞進行轉染，並於轉染48小時後，收集條件培養基與細胞裂解物。使用4-甲基傘形酮-7-(6-硫代-2-乙醯胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-methylumbelliferyl-7-(6-sulfo-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside)）鈉鹽（MUGS，sigma，M0662）對條件培養基進行HexM酶活性試驗。經媒劑轉染之細胞可檢測出最小活性，經G0718或G0720轉染之細胞則呈現相當的HexM活性（圖11B）。對經轉染之Expi293細胞的細胞裂解物，透過4-MU基質MUGS進行HexM活性試驗（圖11C），並進行磷酸轉移酶（PTase）活性試驗（Lin Liu etc, Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Mar 29;5:59-65）（圖11D）。於經HexM質體（G0718或G0720）轉染之細胞的細胞裂解物中係檢測出相似的HexM活性。只有經S1S3表現質體（G0720）轉染之細胞顯示出較媒劑組的細胞或僅表現HexM的細胞增強的PTase活性（圖11D）。檢測條件培養基（來自圖11B）對於CI-MPR的結合。將CI-MPR預結合至一96孔板，並以來自表現G0718或G0720之細胞的條件培養基進行溫育。使用HexM活性試驗來測試結合（圖11E）。相較於G0718（灰色），G0720（橘色）係顯示出HexM對CI-MPR的結合增強。

方法：從Jackson實驗室購得野生型小鼠，並轉移至史丹佛研究中心進行動物研究。該小鼠係在12小時亮／12小時暗之週期下飼養。於8週齡時，係經由尾靜脈對動物進行靜脈內投予，每組5隻動物。注射3週後，將動物犧牲，並在收集組織前以10毫升之冰冷的PBS緩衝液進行灌流。收集各組織的相同區域以進行急凍處理（snap-frozen）或4%甲醛固定。於史丹佛研究中心，係進行疼痛、發病率、及致死率的生存能力觀察（viability observation），並且每天測量體重。於此研究期間，沒有動物被註記有任何顯著的變化。 相關申請的交叉參考

此申請係主張於2022年2月4日申請之第63/306,615號美國專利的優先權，其全部內容係透過引用併入本文。

為了說明本發明之目的，將本發明之某些實施態樣以圖式進行描述。然而，本發明並不受限於該些以圖式描述之實施態樣的精確佈置及手段。

圖1為用於S1S3磷酸轉移酶及GLA表現之雙啟動子基因表現卡匣（two-promoter gene expression cassette）的圖形描述，包括由內而外（inside-out）、由外而內（outside-in）及依序排列的構型。

圖2A為轉染至HEK 293T細胞中之用於S1S3 PTase及GLA表現的雙啟動子基因表現卡匣的圖形描述（以由內而外的構型）。

圖2B係描述HEK 293T細胞之裂解物（lysate）的GLA活性，其中該HEK 293T細胞係轉染有由內而外之構形的基因表現卡匣。

圖2C係描述HEK 293T細胞裂解物中之GLA、S1S3 PTase、及GAPDH蛋白的西方墨點法實驗結果，其中該HEK 293T細胞係轉染有由內而外之構形的基因表現卡匣。

圖3A為轉染至HEK 293T細胞中之用於S1S3 PTase及GLA表現的雙啟動子基因表現卡匣的圖形描述（以由外而內的構型）。

圖3B係描述HEK 293T細胞之裂解物的GLA活性，其中該HEK 293T細胞係轉染有由外而內之構形的基因表現卡匣。

圖3C係描述HEK 293T細胞裂解物中之GLA、S1S3 PTase、及GAPDH蛋白的西方墨點法實驗結果，其中該HEK 293T細胞係轉染有由外而內之構形的基因表現卡匣。

圖4A係描述肝臟中之GLA及S1S3 PTase的基因拷貝數水平。

圖4B係描述腎臟中之GLA及S1S3 PTase的基因拷貝數水平。

圖4C係描述肝臟中之GLA及S1S3 PTase的mRNA水平。

圖4D係描述腎臟中之GLA及S1S3 PTase的mRNA水平。

圖5A為用於S1S3 PTase及PPT1表現之雙啟動子質體設計的圖形描述。

圖5B係描述Expi293細胞裂解物的SDS-PAGE及考馬斯亮藍（Coomassie）染色的實驗結果，其中該Expi293細胞係轉染有圖5A所述之質體設計。

圖5C係描述Expi293細胞中之S1S3 PTase表現的西方墨點法實驗結果，其中該Expi293細胞係轉染有圖5A所述之質體設計。

圖5D係描述Expi293細胞之條件培養基中棕櫚醯基蛋白質硫酯酶1（palmitoyl-protein thioesterase 1，PPT1）對陽離子非依賴性M6P受體（Cation-independent mannose 6-phosphate receptor，CI-MPR）的結合，其中該Expi293細胞係轉染有圖5A所述之質體設計。

圖6A為用於S1S3 PTase及β-葡腦苷脂酶1（GBA1）表現之雙啟動子AAV載體設計的圖形描述。

圖6B係描述Expi293細胞的GCase活性，其中該Expi293細胞係轉染有圖6A所述之質體設計。

圖6C係描述Expi293細胞中之GCase及GAPDH表現的SDS-PAGE及西方墨點法實驗結果，其中該Expi293細胞係轉染有圖6A所述之質體設計。

圖6D係描述Expi293細胞之條件培養基中GCase對CI-MPR的結合，其中該Expi293細胞係轉染有圖6A所述之質體設計。

圖7係描述接受AAV9病毒載體注射之小鼠的肝臟、心臟、及大腦中的GCase活性，其中該AAV9病毒載體係生成自圖6A所述之質體設計。

圖8A係描述接受AAV9病毒載體注射之小鼠的肝臟、心臟、大腦、骨髓、及脾臟中GBA1及S1S3 PTase的基因拷貝數，其中該AAV9病毒載體係生成自圖6A所述之質體設計。

圖8B係描述接受AAV9病毒載體注射之小鼠的肝臟、心臟、大腦、骨髓、及脾臟中GBA1及S1S3 PTase的mRNA拷貝數，其中該AAV9病毒載體係生成自圖6A所述之質體設計。

圖9係描述接受AAV9病毒載體注射之小鼠的紋狀體（striatum）中GBA1的mRNA表現，其中該AAV9病毒載體係生成自圖6A所述之質體設計。

圖10係描述接受AAV9病毒載體注射之小鼠的體感覺皮質（somatosensory cortex）中的GCase蛋白質表現，其中該AAV9病毒載體係生成自圖6A所述之質體設計。

圖11A為用於S1S3 PTase及HexM表現之雙啟動子AAV載體設計的圖形描述。

圖11B係描述Expi293細胞之條件培養基中的HexM活性，其中該Expi293細胞係轉染有圖11A所述之質體設計。

圖11C係描述Expi293細胞之細胞裂解物中的HexM活性，其中該Expi293細胞係轉染有圖11A所述之質體設計。

圖11D係描述Expi293細胞之細胞裂解物中的PTase活性，其中該Expi293細胞係轉染有圖11A所述之質體設計。

圖11E係描述Expi293細胞之條件培養基中HexM對CI-MPR的結合，其中該Expi293細胞係轉染有圖11A所述之質體設計。

Claims (28)

1. 一種組成物，其係包含一載體，該載體包含編碼一第一啟動子及一第二啟動子的序列，其中，該第一啟動子係可操作地連接至一編碼一溶酶體酶的第一多核苷酸，且該第二啟動子係可操作地連接至一編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶的第二多核苷酸。
2. 如請求項1所述之組成物，其中該載體為一病毒載體。
3. 如請求項1所述之組成物，其中該載體為一非病毒載體。
4. 如請求項1所述之組成物，其中該載體為一腺病毒載體或一腺相關病毒（AAV）載體。
5. 如請求項1所述之組成物，其中該載體為一質體。
6. 如請求項1至5中任一項所述之組成物，其中該第一啟動子為CBH，且該第二啟動子係選自EFS或JeT。
7. 如請求項1至5中任一項所述之組成物，其中該第一啟動子為CMV，且該第二啟動子係選自PGK、JeT、或EF1-ɑ。
8. 如請求項1至5中任一項所述之組成物，其中該經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶係包含S1S3磷酸轉移酶（S1S3 PTase）。
9. 如請求項1至5中任一項所述之組成物，其中該溶酶體酶係選自由以下組成的群組：β-葡腦苷脂酶（GBA）、半乳糖腦苷酯酶（GALC）、α-半乳糖苷酶（GLA）、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶（NAGLU）、酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）、溶酶體酸性α-甘露糖苷酶（LAMAN）、及β-己醣胺酶（HexM）。
10. 如請求項1至5中任一項所述之組成物，其中該載體還包含一3’非轉譯區（3’ UTR）。
11. 如請求項10所述之組成物，其中該3’非轉譯區係選自SV40及bGH多腺苷酸（poly-A）。
12. 如請求項1至5中任一項所述之組成物，其中該組成物還包含一醫藥上可接受之載劑。
13. 一種使用如請求項1至12中任一項所述之組成物於製備一治療個體中溶酶體儲積症（LSD）的藥劑的用途，其中該藥劑係增加導致LSD之溶酶體酶的磷酸化，從而治療LSD。
14. 如請求項13所述之用途，其中該個體係被診斷患有LSD。
15. 如請求項13所述之用途，其中該個體係出現LSD的跡象或症狀。
16. 一種使用如請求項1至12中任一項所述之組成物於製備一預防個體中溶酶體酶儲積症（LSD）發生或發病的藥劑的用途，其中該藥劑係增加導致LSD之溶酶體酶的磷酸化，從而預防該個體發生LSD。
17. 如請求項16所述之用途，其中該個體有LSD發生或發病的風險。
18. 如請求項16所述之用途，其中該個體係出現LSD的跡象或症狀。
19. 一種使用如請求項1至12中任一項所述之組成物於製備一改善細胞中導致溶酶體酶儲積症（LSD）之溶酶體酶的磷酸化的藥劑的用途，其中該藥劑係增加該溶酶體酶的磷酸化。
20. 如請求項19所述之用途，其中該細胞為體外的（in vitro）或離體的（ex vivo）。
21. 如請求項19所述之用途，其中該細胞係包含於一個體中。
22. 如請求項21所述之用途，其中該個體係出現LSD的跡象或症狀。
23. 如請求項21所述之用途，其中該個體有LSD發生或發病的風險。
24. 如請求項21所述之用途，其中該個體係被診斷患有LSD。
25. 如請求項13至24中任一項所述之用途，其中該藥劑係透過全身途徑投予。
26. 如請求項25所述之用途，其中該全身途徑的投予為腸道內、腸道外、口服、肌肉內（IM）、皮下（SC）、靜脈內（IV）、動脈內（IA）、脊髓鞘內（intrathecal）、脊椎內（intraspinal）、或腔室內（intraventricular）。
27. 如請求項13至24中任一項所述之用途，其中該藥劑係透過局部途徑投予。
28. 如請求項13至24中任一項所述之用途，其中該個體為人。