TW202122579A - 用於治療溶酶體儲積症之載體組合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供用於治療或預防個體中溶酶體儲積症(lysosomal storage disorder；LSD)之雙順反子載體組合物及其使用方法。所揭示之組合物包含雙順反子載體，該載體包含啟動子、內部核糖體進入位點(IRES)、編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。本發明方法包括向個體投與包含如本文中所揭示之雙順反子載體之醫藥組合物。

Description

用於治療溶酶體儲積症之載體組合物及其使用方法

本發明係關於用於治療溶酶體儲積症之組合物及方法。更特定言之，本發明係關於使用改善之基因療法及改善之酶替代療法(ERT)治療溶酶體病症之領域。

溶酶體儲積症(LSD)係指由溶酶體功能缺陷產生之遺傳性代謝病症。目前，已識別約50種不同LSD，但是此等中之少數(少於10種)被報導具有治療。因此，此項技術中對用於LSD之安全且有效治療存在未滿足的需求。本發明提供用於此未滿足的需求之兩種解決方案，通過酶替代療法(ERT)或基因療法。

本發明提供包含載體之組合物，該載體包含編碼啟動子之序列、編碼溶酶體酶之第一多核苷酸序列及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之第二多核苷酸序列，其中該啟動子能驅動哺乳動物細胞中之表現且其中該啟動子以可操作方式連接至該第一多核苷酸及該第二多核苷酸。

於本發明之組合物之一些實施例中，該載體進一步包含編碼內部核糖體進入位點(IRES)之序列。於一些實施例中，該編碼IRES之序列位於編碼溶酶體酶之序列與編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之序列之間。於一些實施例中，自5’至3’，該載體包含編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之序列、編碼IRES之序列及編碼溶酶體酶之序列。於一些實施例中，自5’至3’，該載體包含編碼溶酶體酶之序列、編碼IRES之序列及編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該載體進一步包含編碼裂解位點之序列。於一些實施例中，該裂解位點包含編碼2A自裂解肽之序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該載體為表現載體。

於本發明之組合物之一些實施例中，該載體為遞送載體。

於本發明之組合物之一些實施例中，該載體為非病毒載體。

於本發明之組合物之一些實施例中，該載體為病毒載體。於一些實施例中，該載體為慢病毒載體。於一些實施例中，該載體為腺病毒載體或腺相關病毒(AAV)載體。於一些實施例中，該AAV載體包括選自由以下組成之群之血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。於一些實施例中，該AAV載體包含編碼衣殼的序列，該衣殼分離或衍生自選自由以下組成之群之血清型中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。於一些實施例中，該AAV載體包含編碼至少一個末端反向重複序列(ITR)的序列，該ITR分離或衍生自選自由以下組成之群之血清型中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、及AAV9。

於本發明之組合物之一些實施例中，該載體為雙順反子載體。

於本發明之組合物之一些實施例中，該載體為多順反子載體。

於本發明之組合物之一些實施例中，該啟動子包括構成性啟動子。於一些實施例中，該構成性啟動子包括巨細胞病毒(CMV)啟動子。

於本發明之組合物之一些實施例中，該載體包含SEQ ID NO: 1之核酸序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 4之核酸序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶涉及如表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶包括表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體酶。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶係選自由以下組成之群：β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)、半乳糖基神經醯胺酶(GALC)、α-半乳糖苷酶(GLA)、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)及溶酶體酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶包括β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。於一些實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 5之核酸序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶包括半乳糖基神經醯胺酶(GALC)。於一些實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 6之核酸序列。於一些實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 23之核酸序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶包括α-半乳糖苷酶(GLA)。於一些實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 7之核酸序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶包括α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)。於一些實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 8之核酸序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶包括α-葡萄糖苷酶(GAA)。於一些實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 9之核酸序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶包括溶酶體酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。於一些實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 10之核酸序列。

本發明提供一種治療溶酶體儲積症(LSD)之方法，該方法包括向個體投與有效量之本發明之組合物，其中該組合物增加導致LSD之溶酶體酶的磷酸化，從而治療LSD。於一些實施例中，該個體呈現LSD之徵兆或症狀。於一些實施例中，該個體已經診斷患有LSD。

本發明提供一種預防溶酶體儲積症(LSD)之發生或發作之方法，該方法包括向個體投與有效量之本發明之組合物，其中該組合物增加導致LSD之溶酶體酶的磷酸化，從而預防該個體中LSD之發生。於一些實施例中，該個體處在LSD之發生或發作之風險中。於一些實施例中，該個體呈現LSD之徵兆或症狀。

本發明提供一種改善導致溶酶體儲積症(LSD)之溶酶體酶的磷酸化之方法，該方法包括向個體投與有效量之本發明之組合物，其中該組合物增加該溶酶體酶之磷酸化。於一些實施例中，該個體呈現LSD之徵兆或症狀。於一些實施例中，該個體處在LSD之發生或發作之風險中。於一些實施例中，該個體已經診斷患有LSD。

本發明提供一種改善導致溶酶體儲積症(LSD)之溶酶體酶的磷酸化之方法，該方法包括使有效量之本發明之組合物與細胞接觸，其中該組合物增加該溶酶體酶之磷酸化。於一些實施例中，該細胞係於活體外或離體。於一些實施例中，該細胞係於活體內。於一些實施例中，個體包含該細胞。於一些實施例中，該個體呈現LSD之徵兆或症狀。於一些實施例中，該個體處在LSD之發生或發作之風險。於一些實施例中，該個體已經診斷患有LSD。

於本發明之方法之一些實施例中，該溶酶體酶涉及如表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)。

於本發明之方法之一些實施例中，該溶酶體酶為如表1A、表1B或表1C中所列之至少一者。

於本發明之方法之一些實施例中，該溶酶體酶包括下列中之一或多者：β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)、半乳糖基神經醯胺酶(GALC)、α-半乳糖苷酶(GLA)、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)及溶酶體酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。

於本發明之方法之一些實施例中，該投與包括全身性投與途徑。於一些實施例中，該全身性投與途徑為經腸、非經腸、經口、肌肉內(IM)、皮下(SC)、靜脈內(IV)、動脈內(IA)、脊柱內、心室內、鞘內、腦室內。

於本發明之方法之一些實施例中，該投與包括局部性投與途徑。

於本發明之方法之一些實施例中，該個體為人類。於一些實施例中，該個體為男性。於一些實施例中，該個體為女性。

相關申請案

本申請案主張2019年7月2日申請之臨時申請案USSN 62/869,781及2019年7月2日申請之USSN 62/869,808之權益，其全部內容係以引用的方式併入本文中。併入序列表

在2020年7月1日創建及大小為436 KB之命名為「M6PT-002/01WO_SeqList.txt,」之文本檔案之內容的全文係以引用的方式併入本文中。

溶酶體儲積症(LSD)係指自溶酶體功能缺陷產生之遺傳性代謝病症。目前，已識別約50種不同LSD，但是此等中之少數(少於10種)被報導具有治療。患者目前藉由靜脈內輸注酶替代療法(ERT)治療，該等療法補充患者中之失去酶以解決其疾病之症狀。ERT之目標為將足夠量之正常酶引入缺陷細胞之溶酶體中以清除儲積物質及恢復溶酶體功能。為確保ERT至受影響溶酶體之有效攝取，ERT含有高含量之甘露糖6-磷酸(M6P)係必要的。患有LSD之理想患者應藉由投與具有高度飽和含量之M6P以能有效遞送至溶酶體之失去酶來治療。然而，此方法極具挑戰性，因為使M6P能添加至溶酶體之磷酸化過程係固有地低效。最近發現GlcNAc-1-磷酸轉移酶之S1-S3變異體可顯著改善溶酶體酶之磷酸化過程，然而，有效且高度有效磷酸化之ERT之產生仍為主要挑戰。此外，存在對將向患者提供LSD之長期治癒之基因療法之需求。 示例性實施例

本發明提供包含載體之組合物，該載體包含編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。

本發明提供包含雙順反子載體之組合物，該雙順反子載體包含編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。

於本發明之組合物之一些實施例中，該雙順反子載體包含位於編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之前及位於編碼溶酶體酶之多核苷酸之後之內部核糖體進入位點(IRES)。於一些實施例中，該雙順反子載體包含位於編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之後及位於編碼溶酶體酶之多核苷酸之前之IRES。

於本發明之組合物之一些實施例中，該雙順反子載體包含啟動子。於一些實施例中，該雙順反子載體包含構成性啟動子。於一些實施例中，該構成性啟動子包含巨細胞病毒(CMV)啟動子。於一些實施例中，該啟動子以可操作方式連接至編碼溶酶體酶之多核苷酸或編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸。於一些實施例中，該啟動子以可操作方式連接至編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸。

於本發明之組合物之一些實施例中，該雙順反子載體包含SEQ ID NO: 1之核酸序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 4之核酸序列。

於本發明之組合物之一些實施例中，該經編碼之溶酶體酶涉及如表1中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)。於一些實施例中，該經編碼之溶酶體酶或其變異體引起如表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)。於一些實施例中，該經編碼之溶酶體酶或其變異體於如表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)中之活性或功能減少、抑制或解除。

於本發明之組合物之一些實施例中，該溶酶體酶包括表1A、表1B或表1C中所列之溶酶體酶。於一些實施例中，該溶酶體酶包括表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體酶。於一些實施例中，該溶酶體酶包括表1A、表1B或表1C中所列之一或多種溶酶體酶。於一些實施例中，該溶酶體酶係選自由以下組成之群：β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)、半乳糖基神經醯胺酶(GALC)、α-半乳糖苷酶(GLA)、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)及溶酶體酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。於一些實施例中，該溶酶體酶包括β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。於一些實施例中，該溶酶體酶包括半乳糖基神經醯胺酶(GALC)。於一些實施例中，該溶酶體酶包括α-半乳糖苷酶(GLA)。於一些實施例中，該溶酶體酶包括α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)。於一些實施例中，該溶酶體酶包括酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)。於一些實施例中，該溶酶體酶包括溶酶體酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。於一些實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 5-10之核酸序列。

本發明提供組合物，其包含雙順反子載體，該雙順反子載體包含構成性啟動子、內部核糖體進入位點(IRES)及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。

於本發明之組合物之一些實施例中，該組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑。

於本發明之載體之一些實施例中，該載體為病毒載體。於一些實施中，該病毒載體為腺病毒、腺相關病毒(AAV)、逆轉錄病毒或慢病毒。於一些實施例中，該病毒載體包括腺病毒。於一些實施例中，該病毒載體包括AAV載體。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9之一或多種AAV分離或衍生之序列。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型1 (AAV1)之AAV分離或衍生之序列。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型2 (AAV2)之AAV分離或衍生之序列。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型3 (AAV3)之AAV分離或衍生之序列。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型4 (AAV4)之AAV分離或衍生之序列。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型5 (AAV5)之AAV分離或衍生之序列。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型6 (AAV6)之AAV分離或衍生之序列。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型7 (AAV7)之AAV分離或衍生之序列。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型8 (AAV8)之AAV分離或衍生之序列。於一些實施例中，該AAV載體包含自血清型9 (AAV9)之AAV分離或衍生之序列。

於本發明之載體之一些實施例中，該載體為表現載體。於一些實施例中，該表現載體包含SEQ ID NO: 1之多核苷酸序列。

本發明提供一種細胞，其包含本發明之載體。於一些實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。於一些實施例中，該細胞為靈長類動物細胞。於一些實施例中，該細胞為人類細胞。於一些實施例中，該細胞為經培養之細胞。於一些實施例中，該細胞為經永生化或穩定之細胞系。於一些實施例中，該細胞為中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary/CHO)細胞。於一些實施例中，該細胞為人類胚胎腎293 (HEK293)細胞。

本發明提供一種細胞，其包含本發明之雙順反子載體。於一些實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。於一些實施例中，該細胞為靈長類動物細胞。於一些實施例中，該細胞為人類細胞。於一些實施例中，該細胞為經培養之細胞。於一些實施例中，該細胞為經永生化或穩定之細胞系。於一些實施例中，該細胞為中國倉鼠卵巢細胞。於一些實施例中，該細胞為人類胚胎腎293 (HEK293)細胞。

本發明提供一種細胞，其包含本發明之組合物。於一些實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。於一些實施例中，該細胞為靈長類動物細胞。於一些實施例中，該細胞為人類細胞。於一些實施例中，該細胞為經培養之細胞。於一些實施例中，該細胞為經永生化或穩定之細胞系。於一些實施例中，該細胞為中國倉鼠卵巢細胞。於一些實施例中，該細胞為人類胚胎腎293 (HEK293)細胞。

本發明提供醫藥組合物，其包含藉由本發明之載體表現之溶酶體酶及醫藥上可接受之載劑。

本發明提供一種治療溶酶體儲積症(LSD)之方法，該方法包括向個體投與本發明之組合物，從而治療該LSD。

本發明提供一種治療溶酶體儲積症(LSD)之方法，該方法包括向個體投與治療上有效量之本發明之組合物，其中該組合物增加溶酶體酶之磷酸化，從而治療該LSD。

本發明提供一種治療患有溶酶體儲積症(LSD)之個體之方法，該方法包括向該個體投與本發明之醫藥組合物，從而增加溶酶體酶之磷酸化及治療該個體。

本發明提供一種預防有需要個體之溶酶體儲積症(LSD)之發生之方法，該方法包括向該個體投與本發明之醫藥組合物，從而增加溶酶體酶之磷酸化及預防該個體中之LSD之發生。

本發明提供一種改善有需要個體中導致溶酶體儲積症(LSD)的溶酶體酶之磷酸化的方法，該方法包括向該個體投與本發明之組合物，其中該組合物增加該溶酶體酶之磷酸化。

於本發明之方法之一些實施例中，該溶酶體酶涉及如表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)。

於本發明之方法之一些實施例中，該溶酶體酶包括表1A、表1B或表1C中所列之溶酶體儲積症(LSD)。於一些實施例中，該溶酶體酶包括表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)。於一些實施例中，該溶酶體酶包括表1A、表1B或表1C中所列之一或多種溶酶體儲積症(LSD)。 酶替代療法 (ERT)

本文中提供包含雙順反子表現載體之組合物，該載體包含編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。於一些實施例中，所揭示之雙順反子表現載體包含位於編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之前及位於編碼溶酶體酶之多核苷酸之後之內部核糖體進入位點(IRES)。於其他實施例中，所揭示之雙順反子表現載體包含位於編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之後及位於編碼溶酶體酶之多核苷酸之前之IRES。

本文中提供哺乳動物細胞，其包含所揭示之雙順反子表現載體。

本文中提供醫藥組合物，其包含藉由如本文中所揭示之雙順反子載體表現之溶酶體酶及醫藥上可接受之載劑。

本文中提供治療患有溶酶體儲積症(LSD)之個體之方法及預防有需要個體之溶酶體儲積症(LSD)之發生之方法。 基因療法

本文中提供組合物，其包含雙順反子病毒載體，該載體包含編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。於一些實施例中，所揭示之雙順反子病毒載體包含位於編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之前及位於編碼溶酶體酶之多核苷酸之後之內部核糖體進入位點(IRES)。於其他實施例中，所揭示之雙順反子病毒載體包含位於編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之後及位於編碼溶酶體酶之多核苷酸之前之IRES。於一些實施例中，該病毒載體為腺病毒、腺相關病毒(AAV)、逆轉錄病毒或慢病毒。

本文中提供藉由向個體投與所揭示之雙順反子病毒載體來治療患有溶酶體儲積症(LSD)之個體之方法及預防有需要個體之溶酶體儲積症(LSD)之發生之方法。

本文中進一步提供改善有需要個體中導致LSD之溶酶體酶之磷酸化的方法。

本文中提供組合物及使用雙順反子載體治療或預防個體之溶酶體儲積症(LSD)之方法。

本發明提供組合物，其包含雙順反子載體，該雙順反子載體包含啟動子、內部核糖體進入位點(IRES)、編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。本發明之方法包括向個體投與包含如本文中所揭示之雙順反子載體之醫藥組合物。 定義

除非另有指定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬之一般技術者通常所理解相同之含義。雖然與本文中所述彼等相似或等效之任何方法及材料可用於實務中以測試本發明，但是本文中描述較佳材料及方法。於描述及主張本發明中，將使用下列術語。

亦應瞭解，本文中所用之術語係僅出於描述一些實施例之目的，且意欲為限制性。

如本文中所用，使用冠詞「一(a/an)」係指該冠詞之語法物件中之一者或超過一者(即，至少一者)。舉例而言，「一元件」意指一個元件或超過一個元件。

如本文中所用，當提及可量測值，諸如量、持續時間及類似者時，術語「約」意欲包含自指定值±20%或±10%，更佳地±5%，甚至更佳地±1%，及仍更佳地±0.1%之變化，因為此等變化適宜進行所揭示之方法。

術語「2A」或「2A肽」或「類2A肽」為自加工病毒肽。2A肽可分離以單ORF轉錄單位之不同蛋白質編碼序列(Ryan等人，1991, J Gen Virol 72:2727-2732)。雖然稱作「自裂解」肽或蛋白酶位點，2A序列自一個轉錄本產生兩種蛋白質之機理藉由核糖體跳躍發生，其中正常肽鍵在2A處受損，導致來自一個轉譯事件之兩個不連續蛋白質片段。與2A肽序列連接導致衍生自單ORF之多個離散蛋白質(以基本上等莫耳量)之細胞表現(de Felipe等人，2006, Trends Biotechnol 24:68-75)。

術語「生物」或「生物樣品」係指獲自生物體或生物體之組分(例如，細胞)之樣品。該樣品可為任何生物組織或流體。頻繁地該樣品將為「臨床樣品」，其為源自患者之樣品。此等樣品包括(但不限於)骨髓、心臟組織、痰、血液、淋巴液、血液細胞(例如，白細胞)、組織或細針活組織檢查樣品、尿、腹膜液及胸膜液、或其中細胞。生物樣品亦可包括組織切片，諸如出於組織學目的所取之冷凍切片。

如本文中所用，術語「衍生物」指示病毒之衍生物可具有相對於模板病毒核酸或胺基酸序列不同之核酸或胺基酸序列。

「疾病」為動物之一種健康狀態，其中該動物不可維持體內穩態，且其中若不改善該疾病，則該動物之健康繼續惡化。

相比之下，動物之「病症」為一種健康狀態，其中該動物能維持體內穩態，但是其中該動物之健康狀態較其在不存在該病症下較不有利。若未經治療，則病症不一定引起動物之健康狀態之進一步下降。

「表現載體」係指包含重組多核苷酸之載體，該重組多核苷酸包含以可操作方式連接至待表現之核苷酸序列之表現控制序列。表現載體包含用於表現之足夠順式作用元件；用於表現之其他元件可藉由宿主細胞或於活體外表現系統中供給。表現載體包括此項技術中已知之所有彼等，諸如併入重組多核苷酸之黏粒、質體(例如，裸露或含於脂質體中)及病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。於一些實施例中，所揭示之載體於本文中被稱作病毒載體。於一些實施例中，所揭示之載體於本文中被稱作表現載體。

如本文中所用，「更高」係指較對照參考高至少10%或更多，例如，高20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或更多，及/或高1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍或更多，及介於其中之任何及所有完全或部分增量之表現程度。本文中所揭示之較參考值更高之表現程度係指較健康個體中量測或此項技術中定義或使用之表現之正常或對照程度(mRNA或蛋白質)更高之表現程度(mRNA或蛋白質)。

如本文中所用，「更低」係指較對照參考低至少10%或更多，例如，低20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或更多，及/或低1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍或更多，及介於其中之任何及所有完全或部分增量之表現程度。本文中所揭示之較參考值更低之表現程度係指較健康個體中量測或此項技術中定義或使用之表現之正常或對照程度(mRNA或蛋白質)更低之表現程度(mRNA或蛋白質)

如本文中所用，術語「對照」或「參考」可互換使用且係指用作比較標準之值。

如本文中所用，「組合療法」意指結合另一劑投與第一劑。「與…組合」或「與…結合」係指投與除了另一種治療模式之一種治療模式。因而，「與…組合」係指在向個體遞送另一種治療模式之前、期間或之後投與一種治療模式。認為此等組合為單一治療方案或協定之部分。例如，載體或包含本發明之載體之組合物可與第二治療劑組合向個體提供或投與。於一些實施例中，本發明之載體及組合物與第二治療劑同時或依序向個體提供或投與。於一些實施例中，本發明之載體及組合物與第二治療劑同時向個體提供或投與。於一些實施例中，本發明之載體及組合物與第二治療劑依序向個體提供或投與。於一些實施例中，本發明之載體及組合物在投與第二治療劑之前向個體提供或投與。於一些實施例中，本發明之載體及組合物在投與第二治療劑之後向個體提供或投與。於一些實施例中，該第二治療劑包括本發明之組合物之第二載體。於一些實施例中，該第二治療劑包括本發明之溶酶體酶之變異體形式，包括編碼其之載體或本發明之組合物。於一些實施例中，該第二治療劑包括減輕溶酶體儲積症之徵兆或症狀之一或多種藥劑。於一些實施例中，該第二治療劑包括一或多種抗發炎劑或免疫抑制劑。

如本文中所用，術語「以可操作方式連接」意指核酸序列之表現係在啟動子之控制下，其與該啟動子空間上連接。啟動子可定位於在其控制下之核酸序列之5' (上游)。

如本文中所用，「初級細胞」係指自活組織(即，活組織檢查材料)直接採集及用於活體外生長建立之細胞，其已經歷極少群體倍增及因此與連續致瘤或人工永生化細胞系相比更代表主要功能組分及衍生其之組織之特徵。

如本文中所用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用及係指包含藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩種胺基酸，及對可包含蛋白質或肽之序列之胺基酸之最大數目不設限制。多肽包含包含藉由肽鍵連接至彼此之兩種或更多種胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文中所用，該術語係指短鏈(其於此項技術中亦通常被稱作例如肽、寡肽及低聚物)，及較長鏈(其於此項技術中一般被稱作蛋白質，其中存在許多類型)二者。「多肽」包括尤其例如生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、同型二聚體、異二聚體、多肽之變異體、經修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

如本文中所用，術語「啟動子」可意指能賦予、激活或增強核酸之表現之合成或天然衍生之分子。如本文中所用，該啟動子經定義為由細胞之合成機器識別或引入啟動多核苷酸序列之特異性轉錄所需之合成機器之DNA序列。

如本文中所用，術語「啟動子/調節序列」意指用於以可操作方式連接至啟動子/調節序列之基因產物之表現所需之核酸序列。於一些實例中，此序列可為核心啟動子序列及於其他實例中，此序列亦可包含增強子序列及用於基因產物之表現所需之其他調節元件。該啟動子/調節序列可例如為以組織特異性方式表現基因產物者。

「構成性」啟動子為核苷酸序列，當與編碼或指定基因產物之多核苷酸以可操作方式連接時，其引起該基因產物於細胞中在細胞之大多數或所有生理條件下產生。

「可誘導性」啟動子為核苷酸序列，當與編碼或指定基因產物之多核苷酸以可操作方式連接時，其實質上僅當對應於啟動子之誘導子存在於細胞中時引起該基因產物於細胞中產生。

如本文中所用，術語「RNA」經定義為核糖核酸。

如於本發明之上下文中所用之術語「治療」意欲包括疾病或病症之治療性治療以及預防性或抑制性措施。如本文中所用，術語「治療(treatment)」及相關術語，諸如「治療(treat/treating)」意指疾病病狀或其至少一種症狀之進展、嚴重度及/或持續時間之減少。因此術語「治療」係指可對個體有益之任何方案。該治療可係關於現有病狀或可係預防性(預防性治療)。治療可包括治癒、減輕或預防效果。本文中提及「治療性」及「預防性」治療係在其最廣泛背景下考量。術語「治療性」不一定暗示個體經治療直至總體恢復。類似地，「預防性」不一定意指個體最終將不患有疾病病狀。因此，例如，術語治療包括在疾病或病症之發作之前或之後投與藥劑，從而預防或移除該疾病或病症之所有徵兆。作為另一實例，於該疾病之臨床表現後投與藥劑以減輕該疾病之症狀包括該疾病之「治療」。

如本文中所用，術語「核酸」係指多核苷酸，諸如去氧核糖核酸(DNA)，及在適宜的情況下，核糖核酸(RNA)。該術語亦應理解為包含自核苷酸類似物製備之RNA或DNA之等效物、類似物及適用於所述實施例，單股(正義或反義)及雙股多核苷酸。EST、染色體、cDNA、mRNA及rRNA為可稱作核酸之分子之代表性實例。

如本文中所用，術語「醫藥組合物」係指可用於本發明之至少一種化合物與其他化學組分，諸如載劑、穩定劑、稀釋劑、佐劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑之混合物。醫藥組合物促進化合物至生物體之投與。投與化合物之多種技術存在於此項技術中，包括(但不限於)：腫瘤內、靜脈內、胸膜內、經口、氣溶膠、非經腸、經眼、經肺及局部投與。

語言「醫藥上可接受之載劑」包括涉及將本發明之化合物於個體內攜帶或轉運或攜帶或轉運至個體使得其可進行其預期功能之醫藥上可接受之鹽、醫藥上可接受之材料、組合物或載劑，諸如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料。通常，此等化合物自身體之一個器官或部分攜帶或轉運至身體之另一器官或部分。各鹽或載劑必須在與調配物之其他成分相容且對個體無傷害之意義下係「可接受」。可用作醫藥上可接受之載劑之材料之一些實例包括：糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；甘醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇及聚二乙醇；酯，諸如油酸乙酯及月矽酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏(Ringer’s)溶液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；稀釋劑；造粒劑；潤滑劑；黏合劑；崩解劑；潤濕劑；乳化劑；著色劑；脫模劑；塗層劑；甜味劑；調味劑；芳香劑；防腐劑；抗氧化劑；增塑劑；膠凝劑；增稠劑；硬化劑；定型劑；懸浮劑；表面活性劑；潤濕劑；載劑；穩定劑；及於醫藥調配物中採用之其他無毒相容物質，或其任何組合。如本文中所用，「醫藥上可接受之載劑」亦包括與化合物之活性相容且對個體生理上可接受之任何及所有塗料、抗細菌劑及抗真菌劑、及吸收延遲劑及類似者。補充活性化合物亦可併入該等組合物中。

如本文中所用，術語「有效量」或「治療上有效量」意指自本發明之載體產生之病毒粒子或傳染單元之量，需要其以預防特定疾病病狀，或其降低疾病病狀或其至少一種症狀或與其相關病狀之嚴重度及/或改善疾病病狀或其至少一種症狀或與其相關病狀。

如本文中所用，「個體」或「患者」可為人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括例如家畜及寵物，諸如綿羊科、牛科、豬科、犬科、貓科及鼠科動物。較佳地，該個體為人類。

範圍：整篇本發明，可以範圍形式呈現一些實施例。應瞭解，呈範圍形式之描述僅係出於方便且簡潔及不應解釋為本發明之範圍之僵化的限制。因此，應認為範圍之描述具有特定揭示之所有可能子範圍以及該範圍內之個別數值。例如，應認為諸如1至6之範圍之描述具有特定揭示之子範圍，諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該範圍內之個別數字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。不管範圍之寬度，此適用。 組合物

本文中提供藉由向個體投與包含雙順反子表現載體之醫藥治療或預防個體之溶酶體儲積症(LSD)之組合物及方法。

於一些實施例中，本發明提供包含雙順反子載體之組合物，該雙順反子載體包含編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。於一個實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸以可操作方式連接。

於一些實施例中，本發明提供包含雙順反子載體之組合物，該雙順反子載體包含構成性啟動子、內部核糖體進入位點(IRES)及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。

於一些實施例中，該雙順反子載體包含位於編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之前及位於編碼溶酶體酶之多核苷酸之後之IRES。於其他實施例中，該雙順反子載體包含位於編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之後及位於編碼溶酶體酶之多核苷酸之前之IRES。

IRES之序列可為此項技術中已知之序列或其變異體。IRES變異體可經修飾或突變。於一個實施例中，序列IRES包含SEQ ID NO: 3。於其他實施例中，IRES之序列與SEQ ID NO: 3至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%相似。

於一個實施例中，溶酶體酶之多核苷酸以可操作方式連接至編碼2A肽之2A DNA，其繼而以可操作方式連接至經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之多核苷酸。此項技術中已知之各種2A肽可用於所揭示之雙順反子載體中，包括(但不限於) T2A、P2A、E2A及F2A。於一些實施例中，可將增加之GSG殘基添加肽之5’端以提高裂解效率。

於一些實施例中，該雙順反子病毒載體包含以可操作方式連接至編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之啟動子。

於一些實施例中，該雙順反子表現載體包含啟動子。

啟動子可係構成性、可誘導/可抑制或細胞類型特異性。於某些實施例中，該啟動子可係構成性。用於哺乳動物細胞之構成性啟動子之非限制性實例包括CMV、UBC、EF1 a、SV40、PGK、CAG、CBA/CAGGS/ACTB、CBh、MeCP2、U6及H1。於一些實施例中，目前揭示之雙順反子載體包含構成性啟動子。於一些實施例中，該構成性啟動子為巨細胞病毒(CMV)啟動子。於一些實施例中，CMV啟動子之多核苷酸包含SEQ ID NO: 2之核酸序列。

於其他實施例中，該啟動子可為可誘導啟動子。該可誘導啟動子可係選自由以下組成之群：四環素(tetracycline)、熱激、類固醇激素、重金屬、佛波酯、腺病毒E1A元件、干擾素及血清可誘導啟動子。

於不同實施例中，該啟動子可係細胞類型特異性。例如，可使用針對以下之細胞類型特異性啟動子：神經元(例如突觸蛋白(syapsin))、星形細胞(例如GFAP)、少突細胞(例如髓磷脂鹼性蛋白)、小神經膠質細胞(例如CX3CR1)、神經內分泌細胞(例如嗜鉻粒蛋白(chromogranin) A)、肌細胞(例如肌間線蛋白(desmin)，Mb)或心肌細胞(例如α肌球蛋白(myosin)重鏈啟動子)。於示例性實施例中，啟動子可為Nrl (棒狀感光器特異性)啟動子或HBB (血紅蛋白β)啟動子。啟動子可進一步包含一或多個特異性轉錄調節序列以進一步增強表現及/或改變核酸之空間表現及/或時間表現。

在載體上發現之增強子序列亦調節其中含有之基因之表現。通常，增強子與蛋白因子結合以增強基因之轉錄。增強子可位於其調節之基因之上游或下游。增強子亦可係組織特異性以增強特定細胞或組織類型之轉錄。於一個實施例中，本發明雙順反子載體包含一或多個增強子以促進存在於該載體內之基因之轉錄。增強子之非限制性實例包括CMV增強子及SP1增強子。

於一些實施例中，超過一個啟動子以可操作方式連接至編碼多肽之各多核苷酸，該等啟動子可係相同或不同。啟動子與待表現之核酸序列之間之距離可係與該啟動子與其控制之初始核酸序列之間之距離約相同。如此項技術中已知，可在不失去啟動子功能下適應此距離之變化。

為評估雙順反子載體內之多肽之表現，該載體亦可包含可選擇標記基因或報告基因或二者以促進來自尋求通過病毒載體轉染或感染之細胞群體之表現細胞之識別及選擇。於一些實施例中，該可選擇標記基因可在DNA之分開片段上攜帶及用於共轉染程序。可選擇標記基因及報告基因二者可在適宜調節序列側面以使能於宿主細胞中表現。可用可選擇標記基因包括例如抗生素抗性基因，諸如neo及類似者。

報告基因係用於識別潛在經轉染之細胞及評價調節序列之功能性。一般而言，報告基因為不存在於接受者生物體或組織中或藉由接受者生物體或組織表現且編碼多肽之基因，該多肽之表現藉由一些可容易檢測性質，例如，酶促活性顯示。報告基因之表現在將DNA引入接受者細胞後之適宜時間分析。適宜報告基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌之鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適宜表現系統係熟知且可使用已知技術製備或商業獲得。一般而言，顯示報告基因之表現之最高水平之具有最小5'側翼區的構築體被識別為啟動子。此等啟動子區可連接至報告基因及用於評價藥劑調節啟動子驅動之轉錄之能力。

將表現基因引入細胞中之方法係此項技術中已知。於表現載體之背景中，該載體可藉由此項技術中之任何方法容易地引入宿主細胞，例如，哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。例如，表現載體可藉由物理、化學或生物方法轉移至宿主細胞。

用於將多核苷酸引入宿主細胞之物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、粒子轟擊、微注射、電穿孔及類似者。產生細胞(包括載體及/或外源核酸)之方法係此項技術中熟知。參見，例如，Sambrook等人. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。用於將多核苷酸引入宿主細胞之較佳方法為磷酸鈣轉染。

用於將所關注之多核苷酸引入宿主細胞之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體及尤其逆轉錄病毒載體已變成用於將基因插入哺乳動物(例如，人類細胞)之最廣泛使用之方法。其他病毒載體可係衍生自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒及腺相關病毒及類似者。參見，例如，美國專利案第5,350,674號及第5,585,362號。

用於將多核苷酸引入宿主細胞之化學方法包括膠狀分散體系，諸如大分子複合體、奈米膠囊、微球、珠及脂質基體系(包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體)。用作活體外及活體內遞送媒劑之示例性膠狀體系為脂質體(例如，人工膜囊泡)。

於利用非病毒遞送系統之一些實施例中，示例性遞送媒劑為脂質體。期望使用脂質調配物用於將核酸引入宿主細胞(活體外、離體或活體內)。於一些實施例中，核酸可係與脂質相關聯。與脂質相關聯之核酸可被封裝於脂質體之水性內部，散佈於脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸二者均相關聯之連接分子附接至脂質體，陷留於脂質體中，與脂質體複合，分散於含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，呈脂質之懸浮液包含，包含膠束或與膠束複合，或以其他方式與脂質相關聯。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體相關組合物不限於溶液中之任何特定結構。例如，其可以雙層結構，呈膠束或以「折疊」結構呈現。其亦可簡單散佈於溶液中，可能形成大小或形狀不均勻之聚集體。脂質為脂肪物質，其可係天然產生或合成脂質。例如，脂質包括於細胞質中天然產生之脂肪小滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別，諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。

適用於使用之脂質可獲自商業來源。例如，二肉豆蔻基卵磷脂(「DMPC」)可獲自Sigma, St. Louis, MO；磷酸鯨蠟酯(「DCP」)可獲自K & K Laboratories (Plainview, NY)；膽固醇(「Choi」)可獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可獲自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)。含於氯仿或氯仿/甲醇中之脂質之儲備溶液可儲存在約-20℃下。氯仿係用作唯一溶劑，因為其較甲醇更容易蒸發。「脂質體」為一般術語，其包含由封閉之脂質雙層或聚集體之產生形成之各種單層及多層脂質媒劑。脂質體可經表徵為具有囊泡結構，具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有藉由水性介質分開之多個脂質層。當磷脂懸浮於過量水溶液中時，其自發形成。脂質組分經歷自我重排，之後形成封閉結構及陷留水及溶解脂質雙層之間之溶質(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5: 505-10)。然而，亦涵蓋具有溶液中較正常囊泡結構不同結構之組合物。例如，脂質可假設膠束結構或僅呈脂質分子之不均勻聚集體存在。亦設想脂質轉染胺(lipofectamine)-核酸複合體。

不管用於將外源核酸引入宿主細胞之方法，為證實宿主細胞中之重組DNA序列之存在，可進行各種分析。此等分析包括例如熟習此項技術者熟知之「分子生物」分析，諸如南方及北方墨點法(Southern and Northern blotting)、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，諸如檢測特定肽之存在或不存在，例如，藉由免疫學方法(ELISA及西方墨點法(Western blot))或藉由本文中所述之識別落入本發明之範圍內之藥劑之分析。 基因療法之載體

如本文中所揭示之用於治療或預防個體之LSD之載體適用於複製及視情況整合於真核細胞中。典型載體含有轉錄及轉譯終止子、啟動序列及可用於調節所需核酸序列之表現之啟動子。

本發明之載體亦可用於核酸免疫及使用標準基因遞送方案之基因療法。基因遞送之方法係此項技術中已知。參見，例如，美國專利案第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，其全文係以引用的方式併入本文中。於另一實施例中，本發明提供基因療法載體。

可將本發明之經分離之核酸選殖至許多類型之載體。例如，可將核酸選殖至包括(但不限於)質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏粒之載體。所關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及定序載體。

此外，可將載體以病毒載體之形式提供給細胞。病毒載體技術係此項技術中熟知且述於例如Sambrook等人. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)，及其他病毒學及分子生物手冊中。可用作載體之病毒包括(但不限於)逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及慢病毒。一般而言，適宜載體含有於至少一種生物體中起作用之複製起源、啟動子序列、方便限制性內切酶位點及一或多個可選擇標記物(例如，WO 01/96584、WO 01/29058及美國專利案第6,326,193號)。

已開發許多基於病毒之系統用於至哺乳動物細胞之基因轉移。例如，逆轉錄病毒提供用於基因遞送系統之方便平臺。可使用此項技術中已知之技術將選定基因插入載體中及封裝於逆轉錄病毒粒子中。然後可將重組病毒分離及活體內或離體遞送至個體之細胞中。許多逆轉錄病毒系統係此項技術中已知。於一些實施例中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體係此項技術中已知。於一個實施例中，使用慢病毒載體。

例如，源自逆轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為達成長期基因轉移之適宜工具，因為其允許轉殖基因之長期穩定整合及其於子細胞中之繁殖。慢病毒載體具有超過源自腫瘤-逆轉錄病毒(諸如鼠科白血病病毒)之載體之增加之優點，因為其可轉導非增殖細胞，諸如肝細胞。其亦具有低免疫原性之增加之優點。於較佳實施例中，該組合物包含源自腺相關病毒(AAV)之載體。腺相關病毒(AAV)載體已變成用於治療各種病症之強有力基因遞送工具。AAV載體具有致使其理想適用於基因療法之許多特徵，該等特徵包括缺少病原性、最小免疫原性、及以穩定且有效方式轉導有絲分裂期後細胞之能力。AAV載體內含有之特定基因之表現可藉由選擇AAV血清型、啟動子及遞送方法之適宜組合特異性靶向一或多種細胞。

於一些實施例中，所揭示之雙順反子病毒載體包含腺病毒(例如Ad-SYE、AdSur-SYE、Ad5/3-MDA7/IL-24、Ad-SB、Ad-CRISPR、致瘤性Ad)、腺相關病毒AAV (例如AAV-MeCP2、AAV1、AAV5、雙AAV9 AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVhu37)、單純皰疹病毒HSV (例如HSV1、HSV2、HSV-1、HF10溶瘤性HSV-2)、逆轉錄病毒(例如RRV/ Toca 511、GRV)、慢病毒(例如HIV-1、HIV-2)、α病毒(SFV、M1)、黃病毒(flavivirus) (庫京(Kunjin)病毒)、彈狀病毒(rhabdovirus) (VSV)、麻疹病毒(例如MV-Edm)、新城(Newcastle)疫病毒(例如NDV90)、美洲鴕鳥微小核糖核酸病毒(Picornaviruses)柯薩基病毒(Coxsackievirus) (例如CVB3、CAV21、EV1)、或痘病毒(例如PANVAC、VV、VV-GLV-1h153、CPXV)。

於一個實施例中，所揭示之雙順反子病毒載體為腺病毒、腺相關病毒(AAV)、α病毒、黃病毒、單純皰疹病毒(HSV)、麻疹病毒、彈狀病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、新城疫病毒(NDV)、痘病毒或微小核糖核酸病毒。於一個實施例中，所揭示之雙順反子病毒載體為腺病毒、腺相關病毒(AAV)、逆轉錄病毒或慢病毒。

於一個實施例中，編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸包含於AAV載體內。AAV之超過30種天然產生之血清型係可得。AAV衣殼中之許多天然變異體存在，允許識別及使用具有特定適用於骨骼肌之性質之AAV。AAV病毒可使用習知分子生物技術工程改造，使其能最佳化此等粒子舉例而言用於核酸序列之細胞特異性遞送、用於最小化免疫原性、用於調整穩定性及粒子壽命、用於有效降解、用於精確遞送至細胞核。

AAV之使用為外源遞送DNA之常見模式，因為其係相對無毒，提供有效基因轉移，且出於特定目的可容易最佳化。在自人類或非人類靈長類動物(NHP)分離及良好表徵之AAV之血清型中，人類血清型2為開發作為基因轉移載體之第一AAV；其已廣泛用於不同靶組織及動物模型中之有效基因轉移實驗。實驗應用基於AAV2之載體至一些人類疾病模型之臨床試驗取得進展，及包括諸如例如囊性纖維化及血友病B之疾病之療法。其他可用AAV血清型包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。

用於組裝至載體之所需AAV片段包括cap蛋白質(包含vp1、vp2、vp3及高可變區)、rep蛋白質(包含rep 78、rep 68、rep 52及rep 40)及編碼此等蛋白質之序列。可於各種載體系統及宿主細胞中容易利用此等片段。此等片段可單獨、與其他AAV血清型序列或片段組合、或與來自其他AAV或非AAV病毒序列之元件組合使用。如本文中所用，人工AAV血清型包括(不限於)具有非天然產生之衣殼蛋白之AAV。此人工衣殼可藉由任何適宜技術，使用選定AAV序列(例如，vp1衣殼蛋白之片段)與可獲自不同選定之AAV血清型、相同AAV血清型之非連續部分、非AAV病毒來源或非病毒來源之異源序列組合產生。人工AAV血清型可為(不限於)嵌合AAV衣殼、重組AAV衣殼或「人源化」AAV衣殼。因此，適用於所關注之溶酶體酶及經修飾之GlcNAc-1 PTase之表現之示例性AAV或人工AAV包括尤其AAV2/8 (參見美國專利案第7,282,199號)、AAV2/5 (可獲自美國國家衛生研究院(National Institutes of Health))、AAV2/9 (國際專利公開案第WO2005/033321號)、AAV2/6 (美國專利案第6,156,303號)及AAVrh8 (國際專利公開案第WO2003/042397號)。

於一個實施例中，可用於本文中所述之組合物及方法中之載體以最低量包含編碼選定AAV血清型衣殼(例如AAV8衣殼)或其片段之序列。於另一實施例中，可用載體以最低量包含編碼選定AAV血清型rep蛋白(例如AAV8 rep蛋白)或其片段之序列。視情況，此等載體可含有AAV cap及rep蛋白二者。於提供AAV rep及cap二者之載體中，該AAV rep及AAV cap序列可均係一種血清型起源，例如，均為AAV8起源。或者，載體可用於rep序列係來自與提供cap序列不同之AAV血清型之情況下。於一個實施例中，該等rep及cap序列自分開來源(例如，分開載體、或宿主細胞及載體)表現。於另一實施例中，此等rep序列於框架中融合至不同AAV血清型之cap序列以形成嵌合AAV載體，諸如美國專利案第7,282,199號中所述之AAV2/8。

適宜重組腺相關病毒(AAV)係藉由培養宿主細胞產生，該宿主細胞含有編碼腺相關病毒(AAV)血清型衣殼蛋白或其片段之核酸序列，如本文中所定義；功能性rep基因；由最低量之AAV反向末端重複序列(ITR)及編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1 PTase之多核苷酸組成之小基因；及許可將小基因封裝至AAV衣殼蛋白之充分協助工具。可向宿主細胞反式提供需要於宿主細胞中培養以將AAV小基因封裝至AAV衣殼之組分。或者，所需組分(例如，小基因、rep序列、cap序列及/或協助工具)中之任一者或多者可藉由穩定宿主細胞提供，該宿主細胞已使用熟習此項技術者已知之方法工程改造以含有所需組分中之一或多者。

最適宜地，此穩定宿主細胞將含有在構成性啟動子之控制下之所需組分。然而，該(等)所需組分可係在可誘導啟動子之控制下。適宜可誘導及構成性啟動子之實例於本文中其他地方提供，且係此項技術中熟知。於仍另一替代中，選定穩定宿主細胞可含有在構成性啟動子之控制下之選定組分及在一或多種可誘導啟動子之控制下之其他選定組分。例如，可產生穩定宿主細胞，其係源自293細胞(其含有在構成性啟動子之控制下之E1協助工具)，但是含有在可誘導啟動子之控制下之rep及/或cap蛋白質。仍其他穩定宿主細胞可由熟習此項技術者產生。

用於產生本發明之rAAV所需之小基因、rep序列、cap序列及協助工具可以轉移其上攜帶之序列之任何遺傳元件之形式遞送至封裝宿主細胞。選定遺傳元件可使用任何適宜方法，包括本文中所述彼等及此項技術中可得之任何其他者遞送。用於構建本發明之任何實施例之方法係熟習核酸操作者已知且包括遺傳工程改造、重組工程改造、及合成技術(參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y)。類似地，產生rAAV病毒子之方法係熟知及適宜方法之選擇不限於本發明(參見，例如，尤其K. Fisher等人，1993 J. Virol., 70:520-532及美國專利案第5,478,745號)。

除非另有指定，否則本文中所述之AAV ITR及其他選定AAV組分可容易自任何AAV血清型選擇，該血清型包括(不限於) AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其他已知或尚未知之AAV血清型。此等ITR或其他AAV組分可使用熟習此項技術者可得之技術容易自AAV血清型分離。此AAV可自學術、商業或公共資源(例如，American Type Culture Collection, Manassas, Va.)分離或獲得。或者，該等AAV序列可通過合成或其他適宜方法參考諸如文獻或資料庫(諸如例如GenBank、PubMed或類似者)中可得之公開序列獲得。

於一些實施例中，該雙順反子載體包含SEQ ID NO: 1之核酸序列。於其他實施例中，該雙順反子載體包含與SEQ ID NO: 1具有至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%相似性之核酸序列。

於一些實施例中，該經編碼之溶酶體酶涉及如下表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)。於其他實施例中，該溶酶體酶為如下表1A、表1B或表1C中所列之至少一者。

表 1A - ERT 實施例 ( 具有 (Uniprot 寄存編號 ) 之酶 )

涉及溶酶體儲積症之酶	SEQ ID NO:	疾病 (LSD)
1. 多醣降解中之缺陷
1.1. 醣蛋白降解中之缺陷
神經胺糖酸苷酶Q99519	24及25	I及II型涎酸儲積症
細胞自溶酶A P10619	26及27	半乳糖唾液酸儲積症
α-甘露糖苷酶A5PKX5	28及29	I及II型α-甘露糖苷儲積症
β-甘露糖苷酶O00462	30及31	β-甘露糖苷儲積症
葡糖基天冬醯胺酶P20933	32及33	天冬胺醯基葡糖胺尿症
α-L-岩藻糖苷酶P04066	34及35	岩藻糖苷儲積症
α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶P54802		坎崎氏(Kanzaki)病、辛德勒氏(Schindler)病，I及III型
	36及37
1.2. 醣脂降解中之缺陷
1.2a.GM1 神經節苷脂
β-半乳糖苷酶-1 P16278		I、II及III型GM1神經節苷脂儲積症
己糖胺酶α-亞單元P06865		GM2-神經節苷脂儲積症，泰薩克斯氏(Tay-Sachs)病
己糖胺酶β-亞單元P07686		GM2-神經節苷脂儲積症，山德霍夫氏(Sandhoff)病
GM2活化蛋白P17900		GM2神經節苷脂儲積症AB變異體
酸性β-葡萄糖苷酶P04062		高歇氏病
蛋白皂角素(Saposin) C P07602		非典型高歇氏病
1.2b. 硫脂降解中之缺陷
芳基硫酸酯酶A P15289		異染性腦白質失養症
蛋白皂角素B P07602		異染性腦白質失養症
硫酸酯酶-修飾因子-1 Q8NBK3		多種硫酸酯酶缺乏症
半乳糖基神經醯胺酶P54803		克拉培氏病
1.2c.球形三醯神經醯胺降解中之缺陷
α-半乳糖苷酶A P06280		法布立氏病
1.3 黏多醣降解中之缺陷 ( 黏 多醣 儲積症 )
1.3a. 硫酸乙醯肝素之降解
艾杜糖酸2-硫酸酯酶 P22304		MPS II (亨特氏(Hunter))
α-L-艾杜糖苷酸酶P35475		MPS I (胡爾勒氏(Hurler),沙伊氏(Scheie))
N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶P51688		MPS IIIa (A型聖菲利柏氏(Sanfilippo))
乙醯肝素-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶Q68CP4		MPS IIIc (C型聖菲利柏氏)
N-α-乙醯葡萄糖胺苷酶(以上已列出) P54802		MPS IIIb (B型聖菲利柏氏)
β-葡萄糖醛酸苷酶P08236		MPS VII (斯來氏(Sly))
N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶P15586		MPS IIId (D型聖菲利柏氏)
1.3b 其他黏多醣之降解
N-乙醯半乳糖胺4-硫酸酯酶P15848		MPS VI
半乳糖胺-6-硫酸鹽硫酸酯酶-----需要輸入		MPS IVA (A型Morquio氏)
透明質酸酶1 Q12794		MPS IX
1.4. 糖原降解中之缺陷
酸性α-1,4-葡萄糖苷酶P10253		龐貝氏病
2. 脂質降解中之缺陷
2.1 鞘磷脂降解中之缺陷
酸性神經磷脂酶Q92484		A及B型尼曼(Niemann)匹克氏(Pick)
酸性神經醯胺酶Q13510		法伯氏(Farber)脂肪肉芽腫病
2.2 三酸甘油酯及膽固醇酯降解中之缺陷
酸性脂肪酶P38571		沃爾曼(Wolman)及膽固醇酯儲積病
3. 蛋白質降解中之缺陷
細胞自溶酶K P43235		緻密性成骨不全症
三肽基肽酶O14773		蠟樣脂褐質儲積症2
棕櫚醯基-蛋白硫酯酶1 P50897		蠟樣脂褐質儲積症1
4. 溶酶體轉運中之缺陷
胱抑素(Cystinosin) (胱胺酸轉運) O60931		胱胺酸儲積症
溶質載體家族17 (酸性糖轉運子)，成員5 H0UI05		紮拉氏(Salla)病
5. 溶酶體轉運蛋白之缺陷
UDP-N-乙醯葡萄糖胺Q96950
N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶γ-亞單元Q9UJJ9		黏脂儲積症III γ (I-細胞)
N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶α/β-亞單元Q3T906		黏脂儲積症III α/β
黏脂蛋白-1(陽離子通道) Q9GZU1		黏脂儲積症IV
溶酶體相關膜蛋白2 (LAMP-2) P13473		達農氏(Danon)病
尼曼-匹克氏C1 O15118		尼曼匹克氏C1及D型
附睾分泌蛋白HE1 P61916		C2型尼曼-匹克氏病
蠟樣脂褐質儲積症-3 Q13286		蠟樣脂褐質儲積症，神經元，3
蠟樣脂褐質儲積症-6 Q9NWW5		蠟樣脂褐質儲積症6
蠟樣脂褐質儲積症-8 Q9UBY8		蠟樣脂褐質儲積症8
溶酶體轉運調節子Q99698		闕東二氏(Chediak-Higashi)
肌球蛋白5A Q9Y4I1		1型格里瑟里氏(Griscelli)
Ras相關蛋白RAB27A P51159		2型格里瑟里氏
黑素親和素Q9BV36		3型格里瑟里氏
AP3 β-亞單元O00203		2型哈布二氏(Hermansky Pudliak)

表 1B- 基因療法實施例

涉及溶酶體儲積症之酶	疾病 (LSD)
1. 多醣降解中之缺陷
1.1. 醣蛋白降解中之缺陷
神經胺糖酸苷酶	I及II型涎酸儲積症
細胞自溶酶A	半乳糖唾液酸儲積症
α-甘露糖苷酶	I及II型α-甘露糖苷儲積症
β-甘露糖苷酶	β-甘露糖苷儲積症
葡糖基天冬醯胺酶	天冬胺醯基葡糖胺尿症
α-L-岩藻糖苷酶	岩藻糖苷儲積症
α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶	坎崎氏病、辛德勒氏病，I及III型
1.2. 醣脂降解中之缺陷
1.2a. GM1 神經節苷脂
β-半乳糖苷酶-1	I、II及III型GM1神經節苷脂儲積症
己糖胺酶α-亞單元	GM2-神經節苷脂儲積症，泰薩克斯氏病
己糖胺酶β-亞單元	GM2-神經節苷脂儲積症，山德霍夫氏病
GM2活化蛋白	GM2神經節苷脂儲積症AB變異體
酸性β-葡萄糖苷酶	高歇氏病
蛋白皂角素C	非典型高歇氏病
1.2b. 硫脂降解中之缺陷
芳基硫酸酯酶A	異染性腦白質失養症
蛋白皂角素B	異染性腦白質失養症
硫酸酯酶-修飾因子-1	多種硫酸酯酶缺乏症
半乳糖基神經醯胺酶	克拉培氏病
1.2c.球形三醯神經醯胺酶降解中之缺陷
α-半乳糖苷酶A	法布立氏病
1.3. 黏多醣降解中之缺陷 ( 黏脂儲積症 )
1.3a. 硫酸乙醯肝素之降解
艾杜糖酸2-硫酸酯酶	MPS II (亨特氏)
α-L-艾杜糖苷酸酶	MPS I (胡爾勒氏，沙伊氏)
N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶	MPS IIIa (A型聖菲利柏氏)
乙醯肝素-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶	MPS IIIc (C型聖菲利柏氏)
N-α-乙醯葡萄糖胺苷酶	MPS IIIb (B型聖菲利柏氏)
β-葡萄糖醛酸苷酶	MPS VII (斯來氏)
N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶	MPS IIId (D型聖菲利柏氏)
1.3b 其他黏多醣之降解
N-乙醯半乳糖胺4-硫酸酯酶	MPS VI
半乳糖胺-6-硫酸鹽硫酸酯酶	MPS IVA (A型Morquio氏)
透明質酸酶1	MPS IX
1.4. 糖元降解之缺陷
酸性α-1,4-葡萄糖苷酶	龐貝氏病
2. 脂質降解之缺陷
2.1 鞘磷脂降解中之缺陷
酸性神經磷脂酶	A及B型尼曼匹克氏
酸性神經醯胺酶	法伯氏脂肪肉芽腫病
2.2 三酸甘油酯及膽固醇酯降解中之缺陷
酸性脂肪酶	沃爾曼及膽固醇酯儲積病
3. 蛋白質降解中之缺陷
細胞自溶酶K	緻密性成骨不全症
三肽基肽酶	蠟樣脂褐質儲積症2
棕櫚醯基-蛋白硫酯酶1	蠟樣脂褐質儲積症1
4. 溶酶體轉運中之缺陷
胱抑素(胱胺酸轉運)	胱胺酸儲積症
溶質載體家族17 (酸性糖轉運子)，成員5	紮拉氏病
5. 溶酶體轉運蛋白中之缺陷
UDP-N-乙醯葡萄糖胺
N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶γ-亞單元	黏脂儲積症III γ (I-細胞)
N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶α/β-亞單元	黏脂儲積症III α/β
黏脂蛋白-1(陽離子通道)	黏脂儲積症IV
溶酶體相關膜蛋白2 (LAMP-2)	達農氏病
尼曼-匹克氏C1	C1及D型尼曼匹克氏
附睾分泌蛋白HE1	C2型尼曼-匹克氏病
蠟樣脂褐質儲積症-3	蠟樣脂褐質儲積症，神經元，3
蠟樣脂褐質儲積症-6	蠟樣脂褐質儲積症6
蠟樣脂褐質儲積症-8	蠟樣脂褐質儲積症8
溶酶體轉運調節子	闕東二氏
肌球蛋白5A	1型格里瑟里氏
Ras相關蛋白RAB27A	2型格里瑟里氏
黑素親和素	3型格里瑟里氏
AP3 β-亞單元	2型哈布二氏

表 1C- 溶酶體病症

臨床名稱	子類型	蛋白質	SEQ ID NO:	基因	SEQ ID NO:	示例性第二治療劑
活化蛋白缺乏，GM2-神經節苷脂儲積症；GM2-神經節苷脂儲積症AB變異體	AB變異體GM2-神經節苷脂儲積症	GM2-活化蛋白		GM2A
α-甘露糖苷儲積症	1型，輕度形式	⍺-甘露糖苷酶		MAN2B1
	2型，中度形式	⍺-甘露糖苷酶		MAN2B1
	3型，新生兒，嚴重	⍺-甘露糖苷酶		MAN2B1
β-甘露糖苷儲積症	β-甘露糖苷儲積症	溶酶體β-甘露糖苷酶		MANBA
天冬胺醯基葡萄糖胺尿症	天冬胺醯基葡萄糖胺尿症	葡糖基天冬醯胺酶		AGA
溶酶體酸性脂肪酶缺乏	膽固醇酯儲積病(晚期發作)	溶酶體酸性脂肪酶		LIPA		西貝脂肪酶(sebelipase) α (Kanuma™)
溶酶體酸性脂肪酶缺乏	沃爾曼氏病(嬰兒期)	溶酶體酸性脂肪酶		LIPA		西貝脂肪酶(sebelipase)α (Kanuma™)
胱胺酸儲積症	成人非腎病	胱抑素		CTNS		半胱胺(Cystagon, Procysbi)
	晚期發作幼年或青少年腎病類型	胱抑素		CTNS		半胱胺(Cystagon, Procysbi)
	嬰兒腎病	胱抑素		CTNS
查那林-多爾夫曼二氏(Chanarin-Dorfman)症候群	中性脂質儲積病伴魚鱗癬；NLSDI			CGI58
	中性脂質儲積病伴肌病；NLSDM	脂肪三酸甘油酯脂肪酶		PNPLA2
達農氏病	達農氏病	溶酶體相關膜蛋白-2		LAMP2
法布立氏病	法布立氏病I型，經典	⍺-半乳糖苷酶A		GLA		半乳糖苷酶(agalsidase) β (Fabrazyme®)；米加司他(migalastat) (Galafold®)
	法布立氏病II型，晚期發作	⍺-半乳糖苷酶A		GLA		半乳糖苷酶β (Fabrazyme®)；米加司他(Galafold®)
法伯氏病；法伯氏脂肪肉芽腫病	酸性神經醯胺酶缺乏	酸性神經醯胺酶		ASAH1
岩藻糖苷儲積症	岩藻糖苷儲積症	⍺-L-岩藻糖苷酶		FUCA1
半乳糖唾液酸儲積症(合併神經胺糖酸苷酶及β- 半乳糖苷酶缺乏)	細胞自溶酶A缺乏	保護蛋白質/細胞自溶酶A		CTSA
高歇氏病	I型高歇氏病	酸性β-葡萄糖苷酶		GBA		藥理學重組人類葡糖腦苷脂酶醣蛋白
	II型高歇氏病	酸性β-葡萄糖苷酶		GBA		藥理學重組人類葡糖腦苷脂酶醣蛋白
	III型高歇氏病	酸性β-葡萄糖苷酶		GBA		藥理學重組人類葡糖腦苷脂酶醣蛋白
	IIIC型高歇氏病	酸性β-葡萄糖苷酶		GBA		藥理學重組人類葡糖腦苷脂酶醣蛋白
	非典型高歇氏病，由於蛋白皂角素C缺乏	蛋白皂角素C		PSAP
GM1-神經節苷脂儲積症	嬰兒GM1-神經節苷脂儲積症	β-半乳糖苷酶-1		GLB1
	嬰兒晚期/青少年GM1-神經節苷脂儲積症	β-半乳糖苷酶-1		GLB1
	成人/慢性GM1-神經節苷脂儲積症	β-半乳糖苷酶-1		GLB1
球形細胞腦白質失養症，克拉培氏病	嬰兒早期發作	半乳糖基神經醯胺β-半乳糖苷酶		GALC		使用來自健康供體之臍帶血之造血幹細胞植入
	嬰兒晚期發作	半乳糖基神經醯胺β-半乳糖苷酶		GALC
	青少年發作	半乳糖基神經醯胺β-半乳糖苷酶		GALC
	成人發作	半乳糖基神經醯胺β-半乳糖苷酶		GALC
	非典型克拉培氏病，由於蛋白皂角素A缺乏	蛋白皂角素A		PSAP
異染性腦白質失養症	嬰兒晚期	芳基硫酸酯酶A		ARSA
	青少年	芳基硫酸酯酶A		ARSA
	成人	芳基硫酸酯酶A		ARSA
	部分硫酸腦苷脂缺乏	芳基硫酸酯酶A		ARSA
	假芳基硫酸酯酶A缺乏	芳基硫酸酯酶A		ARSA
	異染性腦白質失養症，由於蛋白皂角素B缺乏	蛋白皂角素B		PSAP
黏脂儲積症：
MPS I，胡爾勒氏症候群		⍺-L-艾杜糖苷酸酶		IDUA		來自健康供體之造血幹細胞植入；及拉羅尼酶(laronidase) (Aldurazyme®)
MPS I，胡爾勒氏-沙伊氏症候群		⍺-L-艾杜糖苷酸酶		IDUA		拉羅尼酶(Aldurazyme®)
MPS I，沙伊氏症候群		⍺-L-艾杜糖苷酸酶		IDUA		拉羅尼酶(Aldurazyme®)
MPS II，亨特氏症候群	經典重度/ MPS IIA	艾杜糖酸2-硫酸酯酶		IDS
MPS II，亨特氏症候群	減弱/MPS IIB	艾杜糖酸2-硫酸酯酶		IDS
A型聖菲利柏氏症候群/ MPS IIIA		乙醯肝素N-硫酸酯酶		SGSH		rhHNS
B型聖菲利柏氏症候群/ MPS IIIB		N-α-乙醯葡萄糖胺苷酶		NAGLU
C型聖菲利柏氏症候群/ MPS IIIC		乙醯肝素CoA: α-胺基葡糖苷乙醯轉移酶		HGSNAT
D型聖菲利柏氏症候群/ MPS IIID		N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶		GNS
Morquio氏症候群A型/ MPS IVA		半乳糖胺-6-硫酸鹽硫酸酯酶		GALNS		依洛硫酸酯酶(elosulfase) α (VIMIZIM®)
Morquio氏症候群B型/ MPS IVB		β-半乳糖苷酶		GLB1
MPS IX透明質酸酶缺乏		透明質酸酶		HYAL1
MPS VI馬-拉二氏(Maroteaux-Lamy)症候群		芳基硫酸酯酶 B		ARSB
MPS VII斯來氏症候群		β-葡萄糖醛酸苷酶		GUSB		vestronidase (維卓尼酶)α (Mepsevii®)
黏脂儲積症I，涎酸儲積症	I型	神經胺糖酸苷酶		NEU1
	II型	神經胺糖酸苷酶		NEU1
I-細胞病，Leroy氏病，黏脂儲積症II				GNPTAB
假胡爾勒氏氏多處失養症/黏脂儲積症III型				GNPTAB
黏脂儲積症IIIC / ML III GAMMA		N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶之γ亞單元		GNPTG
黏脂儲積症IV型		黏脂蛋白-1		MCOLN1
多種硫酸酯酶缺乏	青少年硫脂儲積症	硫酸酯酶-修飾因子-1		SUMF1
尼曼-匹克氏病	A型	酸性神經磷脂酶		SMPD1
	B型	酸性神經磷脂酶		SMPD1
	C1型/慢性神經病形式	附睾分泌蛋白HE1		NPC1		2-羥基-丙基-β-環糊精；伏立諾他(Vorinostat)
	C2型			NPC2		阿瑞洛莫(arimoclomol)
	D型/ Nova Scotian型	附睾分泌蛋白HE1		NPC1
神經元蠟樣脂褐質儲積症：
CLN6病-非典型嬰兒晚期，晚期發作變異體，青少年早期				CLN6
Batten-Spielmeyer-Vogt三氏/青少年NCL/CLN3病				CLN3
芬蘭變異體嬰兒晚期CLN5				CLN5
Jansky-Bielschowsky二氏病/嬰兒晚期CLN2/TPP1病				TPP1
Kufs/成人發作NCL/CLN4病	A型			CLN6
	B型			CLN6
北方癲癇/變異體嬰兒晚期CLN8				CLN8
Santavuori-Haltia二氏/嬰兒CLN1/PPT病		棕櫚醯基-蛋白質硫酯酶-1		PPT1
龐貝氏病(糖元儲積病II型)	嬰兒龐貝氏病	酸性麥芽糖酶(酸性α-1,4-葡萄糖苷酶)		GAA		阿糖苷酶(alglucosidase) α (Lumizyme®)
	晚期發作龐貝氏病	酸性麥芽糖酶(酸性α-1,4-葡萄糖苷酶)		GAA		阿糖苷酶(alglucosidase) α (Lumizyme®)
緻密性成骨不全症		細胞自溶酶K		CTSK
山德霍夫氏病/ GM2神經節苷脂儲積症	嬰兒	己糖胺酶A及B
山德霍夫氏病/ GM2神經節苷脂儲積症	青少年	己糖胺酶A及B
山德霍夫氏病/ GM2神經節苷脂儲積症	成人發作	己糖胺酶A及B		HEXB
辛德勒氏病	I型/嬰兒	α-N-乙醯半乳糖胺苷酶		NAGA
	III型/中間，可變	α-N-乙醯半乳糖胺苷酶		NAGA
坎崎氏病	辛德勒氏病II型	α-N-乙醯半乳糖胺苷酶		NAGA
紮拉氏病	唾液酸儲積病之成人形式	唾液酸轉運蛋白(sialin)		SLC17A5
嬰兒游離唾液酸儲積症(ISSD)	唾液酸儲積病之嬰兒形式	唾液酸轉運蛋白		SLC17A5
脊髓性肌萎縮伴進行性肌陣攣性癲癇(SMAPME)	肌陣攣，遺傳性，伴隨進行性遠端肌肉萎縮			ASAH1
泰薩克斯氏病/ GM2神經節苷脂儲積症	嬰兒泰薩克斯氏病	己糖胺酶A		HEXA
	青少年發作泰薩克斯氏病	己糖胺酶A		HEXA
	晚期發作泰薩克斯氏病	己糖胺酶A		HEXA
Christianson氏症候群	MRXSCH	單價鈉-選擇性鈉/氫交換劑(NHE)		SLC9A6
Lowe氏眼腦腎症候群				OCRL
Charcot-Marie-Tooth 氏4J型，CMT4J				FIG4
Yunis-Varon氏症候群				FIG4
雙側顳枕多小腦回(BTOP)				FIG4
X染色體關聯之高鈣腎結石，Dent-1				CLCN5
Dent病2		PIP(2) 5-磷酸酶		OCRL
		ATG5		ATG5
		ATG7		ATG7
		mTORC1		mTORC1
		SLC38A9		SLC38A9

於一些實施例中，該溶酶體酶係選自由以下組成之群：β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)、半乳糖基神經醯胺酶(GALC)、α-半乳糖苷酶(GLA)、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)及溶酶體酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。於又其他實施例中，該編碼溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 5-10之核酸序列。於其他實施例中，該溶酶體酶係藉由與SEQ ID NO: 5-10具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%相似性之多核苷酸編碼。

於一些實施例中，經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶係藉由包含SEQ ID NO: 4之核酸序列之多核苷酸編碼。於其他實施例中，該GlcNAc-1 PTase係藉由與SEQ ID NO: 4具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%相似性之多核苷酸編碼。

本發明亦應構建為包含與本文中所揭示者具有實質同源性之多肽或多核苷酸之任何形式。

較佳地，「實質上同源」之多肽係與本文中所揭示之肽之胺基酸序列具有約50%同源性，更佳地約70%同源性，甚至更佳地約80%同源性，更佳地約90%同源性，甚至更佳地約95%同源性，及甚至更佳地約99%同源性。

多肽可或者藉由重組方法或藉由自較長多肽裂解製備。肽之組成可藉由胺基酸分析或定序證實。根據本發明之多肽之變異體可為(i)其中胺基酸殘基中之一或多者經保守或非保守胺基酸殘基(較佳地保守胺基酸殘基)取代且此經取代之胺基酸殘基可或可非藉由遺傳代碼編碼者，(ii)其中存在一或多個經修飾之胺基酸殘基，例如，藉由附接取代基修飾之殘基者，(iii)其中該多肽為本發明之多肽之替代剪接變異體者，(iv)該多肽之片段及/或(v)其中該多肽與另一多肽，諸如前導序列或分泌序列或純化採用之序列(例如，His標籤)或檢測採用之序列(例如，Sv5抗原決定基標籤)融合者。該等片段包括經由原始序列之蛋白分解裂解(包括多位點蛋白分解)產生之多肽。變異體可經轉譯後或化學修飾。此等變異體被視作於熟習此項技術者自本文中教示之範圍內。

如此項技術者已知，兩種多肽之間之「相似性」係藉由比較一種多肽之胺基酸序列及其保守胺基酸取代與第二多肽之序列來測定。變異體經定義為包含不同於原始序列，較佳地不同於原始序列小於40%之殘基/所關注之片段，更佳地不同於原始序列小於25%之殘基/所關注之片段，更佳地小於10%之殘基/所關注之片段不同，最佳地不同於原始蛋白質序列僅幾個殘基/所關注之片段且同時與原始序列足夠同源以保留原始序列之功能性及/或結合至泛素或泛素化蛋白之能力之多肽序列。本發明包含與原始胺基酸序列至少60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%或95%相似或相同之胺基酸序列。兩種多肽之間之同一性之程度係使用熟習此項技術者廣泛已知之電腦演算法及方法確定。兩種胺基酸序列之間之同一性較佳地藉由使用BLASTP演算法[BLAST手冊，Altschul, S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S.等人，J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]確定。

本文中所揭示之多肽可經轉譯後修飾。例如，落入本發明之範圍內之轉譯後修飾包括信號肽裂解、醣基化、乙醯化、異戊二烯化、蛋白分解、豆蔻醯化、蛋白質折疊及蛋白分解加工等。一些修飾或加工事件需要引入另外生物機器。例如，加工事件(諸如信號肽裂解及核醣基化)藉由添加犬科微粒體膜或非洲蟾蜍屬(Xenopus)卵提取物至標準轉譯反應中來檢查。

本發明之多肽可包含藉由轉譯後修飾或藉由在轉譯期間引入非天然胺基酸形成之非天然胺基酸。用於在蛋白質轉譯期間引入非天然胺基酸之各種方法係可得。

如本文中所用，術語「功能等效物」係指較佳地保留本發明之溶酶體酶之特定胺基酸序列之至少一種生物功能或活性的多肽。

多肽可與其他分子(諸如蛋白質)結合以製備融合蛋白。此可例如藉由合成N端或C端融合蛋白實現，只要所得融合蛋白保留本發明之溶酶體酶之功能性。

多肽可使用習知方法磷酸化。於一個實施例中，目前揭示之溶酶體酶可經磷酸化，由於目前揭示之經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)。

肽或嵌合蛋白之環狀衍生物亦於本文中設想。環化可允許肽或嵌合蛋白呈現更有利構象以與其他分子締合。環化可使用此項技術中已知之技術達成。例如，可在具有游離巰基之兩個適宜間隔組分之間形成二硫鍵，或可在一種組分之胺基與另一組分之羧基之間形成醯胺鍵。

環化亦可使用含偶氮苯之胺基酸達成。形成鍵之組分可為胺基酸、非胺基酸組分或二者之組合之側鏈。於一個實施例中，環狀肽可包含右邊位置之β轉折。可藉由在右邊位置處添加胺基酸Pro-Gly將β轉折引入本發明之肽。可期望產生環狀肽，其較含有如上所述之肽鍵聯接之環狀肽更具撓性。更具撓性肽可藉由在肽之右左位置處引入半胱胺酸及在兩個半胱胺酸之間形成二硫橋來製備。安排兩個半胱胺酸以便使β折疊及轉折不變形。由於二硫鍵聯接之長度及β折疊部分中之氫鍵之更小數目的結果，該肽係更具撓性。環狀肽之相對可撓性可藉由分子動力學模擬來測定。 標籤

於一個實施例中，如本文中所揭示之多肽進一步包含標籤之胺基酸序列。該標籤包括(但不限於)：多組胺酸標籤(His標籤) (例如H6及H10等)或用於IMAC系統(例如，Ni2+親和管柱等)之其他標籤、GST融合、MBP融合、鏈黴抗生物素(streptavidine)標籤、細菌酶BIRA之BSP生物素化靶序列及藉由抗體引導之標籤抗原決定基(例如尤其c-myc標籤、FLAG標籤、HPC4標籤)。如由熟習此項技術者將觀察到，標籤肽可用於本發明之融合蛋白之純化、檢查、選擇及/或視覺化。於一個實施例中，該標籤為檢測標籤及/或純化標籤。應瞭解，該標籤序列將不干涉本發明之蛋白質之功能。 前導序列及分泌序列

因此，本發明之多肽可融合至另一多肽或標籤，諸如前導序列或分泌序列或純化或檢測採用之序列。於一些實施例中，本發明之多肽包含穀胱甘肽-S-轉移酶蛋白標籤，其提供本發明之多肽之快速高親和力純化的基礎。的確，然後此GST-融合蛋白可經由其對穀胱甘肽之高親和力自細胞純化。可將瓊脂糖珠偶合至穀胱甘肽，及此等穀胱甘肽-瓊脂糖珠結合GST蛋白。因此，於特定實施例中，該多肽可結合至固體擔體。於一些實施例中，若該多肽包含GST部分，則將該多肽偶合至經穀胱甘肽修飾之擔體。於一些實施例中，該經穀胱甘肽修飾之擔體為穀胱甘肽-瓊脂糖珠。此外，可在親和力標籤與多肽序列之間包含編碼蛋白酶裂解位點之序列，從而允許於與此特異性酶培育後移除結合標籤及因此促進所關注之對應蛋白質之純化。

本文中所揭示之多肽亦可融合或整合至靶蛋白，及/或能引導嵌合蛋白至所需細胞組分或細胞類型或組織之靶向域。該等嵌合蛋白亦可含有另外胺基酸序列或域。該等嵌合蛋白在各種組分係來自不同來源及因而於天然中未一起發現(即，異源)之意義上係重組。

於本發明之組合物之一些實施例中，多肽包含本發明之溶酶體蛋白之肽擬似物或載體編碼本發明之溶酶體蛋白之肽擬似物。肽擬似物為基於或源自肽及蛋白質之化合物。

包含與其他分子結合之本發明之肽或嵌合蛋白之N端或C端融合蛋白可藉由通過重組技術融合該肽或嵌合蛋白之N端或C端及具有所需生物功能之選定蛋白質或選定標記物之序列來製備。所得融合蛋白含有包含融合至如本文中所述之選定蛋白或標記蛋白之肽或嵌合蛋白之溶酶體酶。可用於製備融合蛋白之蛋白質之實例包括免疫球蛋白、穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、血清凝集素(HA)及經截短之myc。

目前所揭示之多肽及嵌合蛋白可藉由與諸如鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸等之無機酸或諸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、水楊酸、苯磺酸及甲苯磺酸之有機酸反應轉化成醫藥鹽。 經修飾之細胞

於一些實施例中，本發明提供包含本發明之載體之細胞。於一些實施例中，該載體為病毒載體(例如，AAV或慢病毒載體)。於一些實施例中，該載體為非病毒載體(例如，脂質體、奈米粒子、脂質奈米粒子、膠束、聚合物囊泡、外泌體)。於一些實施例中，該載體為表現載體。於一些實施例中，該載體含有允許至少兩種序列之雙順反子、多順反子(polycistronic)或多順反子(multicistronic)表現之至少一種元件。於一些實施例中，該載體包含編碼本發明之溶酶體酶之序列。或者或此外，於一些實施例中，該載體包含編碼本發明之S1S3構築體之序列。於一些實施例中，該溶酶體酶為表1A、表1B或表1C中所列之酶中之一或多者。於一些實施例中，該載體包含編碼溶酶體酶之核酸或胺基酸序列，該溶酶體酶為表1A、表1B或表1C中所列之酶中之一或多者。

於一些實施例中，包含本發明之載體之細胞為本發明之經修飾之細胞。於一些實施例中，包含本發明之載體之細胞係非天然產生。

於一些實施例中，該細胞為能表現人類序列及/或產生人類蛋白質之哺乳動物細胞。於一些實施例中，該哺乳動物細胞係自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、狗或非人類靈長類動物分離或衍生。

於一些實施例中，該細胞為能表現人類序列及/或產生人類蛋白質之人類細胞。

於一些實施例中，該細胞為經修飾以表現本發明之載體及離體培養之初級細胞。於一些實施例中，該經培養之細胞經永生化或以其他方式修飾以促進細胞於活體外無限繁殖，從而產生經培養之細胞系。 宿主細胞

於一些實施例中，本發明提供包含本發明之雙順反子載體之細胞。該細胞可為原核細胞或真核細胞。適宜細胞包括(但不限於)細菌、酵母、真菌、昆蟲及哺乳動物細胞。

於一些實施例中，本發明提供包含本發明之雙順反子載體之哺乳動物細胞。

包含所揭示之雙順反子載體之宿主細胞可用於蛋白質表現及視情況純化。用於表現及視情況純化來自宿主之所表現蛋白質之方法為此項技術中之標準。

於一些實施例中，包含本發明之載體之宿主細胞可用於產生藉由本發明之酶構築體編碼之多肽。一般而言，本發明之多肽之產生涉及將宿主細胞用包含酶構築體之載體轉染及然後培養該等細胞使得其轉錄及轉譯所需多肽。然後可將經分離之宿主細胞溶解以提取經表現之多肽用於隨後純化。

於一些實施例中，該宿主細胞為原核細胞。適宜原核細胞之非限制性實例包括大腸桿菌(E. coli )及其他腸桿菌科(Enterobacteriaceae )、埃希氏菌屬(Escherichia sp. )、彎麴菌屬(Campylobacter sp. )、沃林氏菌屬(Wolinella sp. )、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio sp. )、弧菌屬(Vibrio sp. )、假單胞菌屬(Pseudomonas sp. )、桿菌屬(Bacillus sp. )、李斯特菌屬(Listeria sp. )、葡萄球菌屬(Staphylococcus sp. )、鏈球菌屬(Streptococcus sp. )、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus sp. )、巨球型菌屬(Megasphaera sp. )、梳狀菌屬(Pectinatus sp. )、月形單胞菌屬(Selenomonas sp. )、嗜發酵菌屬(Zymophilus sp. )、放線菌屬(Actinomyces sp. )、節細菌屬(Arthrobacter sp. )、弗蘭克氏菌屬(Frankia sp. )、小單孢子菌屬(Micromonospora sp. )、諾卡氏菌屬(Nocardia sp. )、丙酸桿菌屬(Propionibacterium sp. )、鏈黴菌屬(Streptomyces sp. )、乳酸菌屬(Lactobacillus sp. )、乳球菌屬(Lactococcus sp. )、明串珠菌屬(Leuconostoc sp. )、足球菌屬(Pediococcus sp. )、乙醯桿菌屬(Acetobacterium sp. )、真桿菌屬(Eubacterium sp. )、螺旋桿菌屬(Heliobacterium sp. )、螺旋陽光菌屬(Heliospirillum sp. )、鼠孢菌屬(Sporomusa sp. )、螺原體屬(Spiroplasma sp. )、脲原體屬(Ureaplasma sp. )、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix sp. )、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp. )、腸球菌屬(Enterococcus sp. )、梭菌屬(Clostridium sp. )、支原體屬(Mycoplasma sp. )、分支桿菌屬(Mycobacterium sp. )、放線菌屬(Actinobacteria sp. )、沙門氏菌屬(Salmonella sp. )、志賀氏菌屬(Shigella sp. )、摩拉克氏菌屬(Moraxella sp. )、螺桿菌屬(Helicobacter sp. )、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas sp. )、微球菌屬(Micrococcus sp. )、奈瑟氏菌屬(Neisseria sp. )、蛭弧菌屬(Bdellovibrio sp. )、嗜血桿菌屬(Hemophilus sp. )、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella sp. )、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis )、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae )、沙雷氏菌屬(Serratia sp. )、檸檬酸細菌屬(Citrobacter sp. )、變形桿菌屬(Proteus sp. )、沙雷氏菌屬(Serratia sp. )、耶爾森氏鼠疫桿菌屬(Yersinia sp. )、不動桿菌屬(Acinetobacter sp. )、放線桿菌屬(Actinobacillus sp. )、博多特氏菌屬(Bordetella sp. )、布魯氏菌屬(Brucella sp. )、噬二氧化碳菌屬(Capnocytophaga sp. )、心桿菌屬(Cardiobacterium sp. )、埃肯菌屬(Eikenella sp. )、法蘭西斯氏菌屬(Francisella sp. )、嗜血桿菌屬(Haemophilus sp. )、金氏桿菌屬(Kingella sp. )、巴斯德氏菌屬(Pasteurella sp. )、黃質菌屬(Flavobacterium sp. )、黃單胞桿菌屬(Xanthomonas sp. )、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia sp. )、氣單孢菌屬(Aeromonas sp. )、毗鄰單胞菌屬(Plesiomonas sp. )、軍團桿菌屬(Legionella sp. )及α-變形桿菌門(諸如沃爾巴克氏體屬(Wolbachia sp. )、藍細菌(cyanobacteria) 、螺旋原蟲(spirochaetes )、綠硫及綠非硫細菌)、革蘭氏陰性球菌(Gram-negative cocci )、挑剔之革蘭氏陰性桿菌(Gram negative bacilli )、腸桿菌科-葡萄糖-發酵之革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏陰性桿菌-非葡萄糖發酵槽、革蘭氏陰性桿菌-葡萄糖發酵、氧化酶陽性。用於蛋白質表現之特別有用細菌宿主細胞包括革蘭氏陰性桿菌(諸如大腸桿菌)、螢光假單胞菌、藍斑假單胞菌、惡臭假單胞菌AC 10、熔岩假單胞菌、漢氏巴爾通氏體屬(Bartonella henselae )、丁香假單胞菌、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus )、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis )、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti )、黃黏球菌(Myxococcus xanthus )及革蘭氏陽性細菌，諸如枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis )、棒狀桿菌、乳酪鏈球菌(Streptococcus cremoris )、利維登鏈球菌(Streptococcus lividans )及變鉛青鏈黴菌(Streptomyces lividans )。大腸桿菌為最廣泛使用之表現宿主中之一者。因此，用於於大腸桿菌中過度表現之技術經良好開發及對熟習此項技術者容易可得。

另外，螢光假單胞菌通常用於高水平產生重組蛋白(即，用於開發生物治療劑及疫苗)。

於一些實施例中，宿主細胞為酵母或真菌細胞。用於蛋白質表現之特定可用真菌宿主細胞包括米麯黴(Aspergillis oryzae )、黑麯黴(Aspergillis niger )、裡氏木黴(Trichoderma reesei )、構巢麯黴(Aspergillus nidulans )、禾穀鐮刀菌(Fusarium graminearum )。用於蛋白質表現之特別有用酵母宿主細胞包括白念珠菌(Candida albicans )、麥芽糖念珠菌、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha )、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis )、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis )、季氏畢赤酵母(Pichia guillerimondii )、巴斯德畢赤酵母(P ichia pastoris )、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica )。

於一些實施例中，宿主細胞為昆蟲細胞。非限制性實例包括草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞系(諸如Sf9或Sf21)、果蠅細胞系或蚊子細胞系(諸如源自白紋伊蚊(Aedes albopictus )之細胞系)。

於一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。用於蛋白質表現之可用哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、人類胚胎腎293 (HEK293)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、人類胚胎腎細胞、原牛(Bos primigenius )及小家鼠。於特定實施例中，該等宿主細胞為CHO細胞。此外，該哺乳動物宿主細胞可為建立之可市面上購得之細胞系(例如，美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection/ATCC)，Manassas, VA)。該宿主細胞可為永生化細胞。或者，該宿主細胞可為初級細胞。

於一些實施例中，該宿主細胞已經工程改造以產生高水平之所關注之蛋白質。 本發明之方法

於一些實施例中，本發明提供一種治療患有本文中所揭示之溶酶體儲積症(LSD)之個體之方法。該方法包括向該個體投與包含藉由如本文中其他地方所揭示之雙順反子載體表現之溶酶體酶之醫藥組合物，從而增加溶酶體酶之磷酸化及治療該個體。

於一些實施例中，本發明提供一種預防有需要個體之溶酶體儲積症(LSD)之發生的方法。該方法包括向該個體投與包含藉由如本文中其他地方所揭示之雙順反子載體表現之溶酶體酶之醫藥組合物，從而增加溶酶體酶之磷酸化及預防該個體中之LSD之發生。

於一些實施例中，該溶酶體酶涉及如表1中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)。於其他實施例中，該溶酶體酶為如表1中所列之至少一者。

於其他實施例中，該投與包括選自由經腸、非經腸、經口、肌肉內(IM)、皮下(SC)、靜脈內(IV)及動脈內(IA)組成之群之投與途徑。可用於所揭示方法之另外投與途徑於本文中其他地方詳細描述。 組合療法

當與可用於治療LSD之至少一種另外化合物組合時，用於治療或預防如本文中所述之LSD之組合物及方法可係有用。該另外化合物可包括已知治療、預防或減少LSD之症狀之可市面上購得之化合物。該化合物可為但不限於此項技術中已知之ERT。 醫藥組合物及調配物

本文中亦提供醫藥組合物，其包含藉由本發明之雙順反子載體表現之溶酶體酶。

此醫藥組合物係呈適用於向個體投與之形式，或該醫藥組合物可進一步包含一或多種醫藥上可接受之載劑、一或多種另外成分或此等之一些組合。醫藥組合物之各種組分可以生理上可接受之鹽之形式，諸如與如此項技術中熟知之生理上可接受之陽離子或陰離子組合呈現。

於本發明之一些實施例中，可投與可用於實踐本發明之方法之醫藥組合物以遞送1 ng/kg/天與100 mg/kg/天之間之劑量。於本發明之一些實施例中，可投與可用於實踐本發明之醫藥組合物以遞送1 ng/kg/天與500 mg/kg/天之間之劑量。本發明之醫藥組合物中之活性成分、醫藥上可接受之載劑及任何另外成分之相對量將取決於所治療之個體之身份、大小及病狀及進一步取決於投與該組合物之途徑變化。舉例而言，該組合物可包含0.1%與100% (w/w)之間之活性成分。

於本發明之一些實施例中，可投與可用於實踐本發明之方法之醫藥組合物以遞送1 ng/kg與100 mg/kg之間之劑量。於本發明之一些實施例中，可投與可用於實踐本發明之醫藥組合物以遞送1 ng/kg與500 mg/kg之間之劑量。於本發明之一些實施例中，該醫藥組合物係每日一次、每週一次、每週兩次、每月一次或每年一次提供。本發明之醫藥組合物中之活性成分、醫藥上可接受之載劑及任何另外成分之相對量將取決於所治療之個體之身份、大小及病狀及進一步取決於投與該組合物之途徑變化。舉例而言，該組合物可包含0.1%與100% (w/w)之間之活性成分。

可適宜開發可用於本發明之方法中之醫藥組合物用於吸入、經口、經直腸、陰道、非經腸、局部、經皮、經肺、鼻內、經頰、經眼、鞘內、靜脈內投與或投與之另一途徑。其他期望之調配物包括計畫之奈米粒子、脂質體製劑、含有活性成分之重新密封之紅血球及基於免疫學之調配物。該(等)投與途徑對熟習技工容易顯而易見且取決於任何數目之因素，包括正在治療之疾病之類型及嚴重度、正在治療之獸醫或人類患者之類型及年齡、及類似者。

本文中所述之醫藥組合物之調配物可藉由醫藥技術中已知或後文開發之任何方法製備。一般而言，此等製備方法包括將活性成分帶入與載劑或一或多種其他附加成分締合，及然後，若必要或所需，則將產品定型或包裝至所需單劑量或多劑量單元中之步驟。於一些實施例中，目前揭示之組合物可於天然衣殼、呈裸露RNA之經修飾之衣殼中調配或於保護套中封裝。

活性成分之量一般等於將向個體投與之活性成分之劑量或此劑量之方便分率，諸如例如，此劑量之一般或三分之一。單位劑型可係針對單一每日劑量或多個每日劑量中之一者(例如，每天約1至4次或更多次)。當使用多個每日劑量時，該單位劑型針對各劑量可係相同或不同。

雖然本文中所提供之醫藥組合物之描述主要係針對適用於向人類倫理投與之醫藥組合物，但是熟習技工應瞭解，此等組合物一般適用於向所有類別之動物投與。為致使組合物適用於向各種動物投與，對適用於向人類投與之醫藥組合物之修飾係熟知，及一般熟習獸醫藥理學家可僅利用一般實驗(若有的話)設計及進行此修飾。設想投與本發明之醫藥組合物之個體包括(但不限於)人類及其他靈長類動物、哺乳動物，包括商業相關哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓及狗。於一個實施例中，該個體為人類或非人類哺乳動物，諸如但不限於馬科、綿羊科、牛科、豬科、犬科、貓科及鼠科。於一個實施例中，該個體為人類。

於一個實施例中，該等組合物係使用一或多種醫藥上可接受之賦形劑或載劑調配。於一些實施例中，本發明提供用於治療患有LSD之個體之醫藥組合物。於一些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含藉由本發明之雙順反子載體表現之溶酶體酶及醫藥上可接受之載劑。

可用醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)甘油、水、鹽水、乙醇及其他醫藥上可接受之鹽溶液(諸如磷酸鹽及有機酸之鹽)。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及類似者)、其適宜混合物及植物油之溶劑或分散介質。可例如藉由使用塗層(諸如卵磷脂)，藉由在分散之情況下維持所需粒度及藉由使用表面活性劑維持適當流動性。微生物作用之預防可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及類似者達成。於一些實施例中，較佳地於組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉或多元醇(諸如甘露醇及山梨醇)。可注射組合物之延長吸收可藉由包含延遲吸收之劑(例如，單硬脂酸鋁或明膠)於組合物中實現。

調配物可以與習知賦形劑，即，適用於經口、非經腸、經鼻、靜脈內、皮下、經腸或任何其他適宜投與模式之醫藥上可接受之有機或無機載劑物質之混合物採用。醫藥製劑可經滅菌及若所需，則與輔助劑，例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳香物質及類似者混合。其亦可在需要之情況下與其他活性劑(例如，其他止痛劑)組合。

所揭示組合物可包含該組合物之總重量之約0.005%至2.0%之防腐劑。該防腐劑係用於在暴露於環境中之污染物之情況下防止腐敗。可根據本發明使用之防腐劑之實例包括(但不限於)選自由苄基醇、山梨酸、對羥基苯甲酸酯、咪尿素及其組合組成之群之彼等。於一些實施例中，該防腐劑為約0.5%至2.0%苄基醇及0.05%至0.5%山梨酸之組合。

該組合物可包含抑制化合物之降解之抗氧化劑及螯合劑。一些化合物之較佳抗氧化劑為以組合物之總重量計約0.01%至0.3%之較佳範圍之BHT、BHA、α-生育酚及抗壞血酸及更佳地0.03重量%至0.1重量%之範圍之BHT。較佳地，螯合劑係以組合物之總重量計0.01重量%至0.5重量%之量存在。特別佳螯合劑包含以組合物之總重量計約0.01%至0.20%之重量範圍及更佳地0.02重量%至0.10重量%之範圍之乙二胺四乙酸鹽(例如，乙二酸四乙酸二鈉)及檸檬酸。該螯合劑可用於螯合組合物中之金屬離子，該等離子可對調配物之貨架期不利。於一些實施例中，BHT及乙二胺四乙酸二鈉各自為一些化合物之抗氧化劑及螯合劑，然而，因此可替換其他適宜且等效抗氧化劑及螯合劑，如為熟習此項技術者所瞭解。 投與 / 給藥

投與方案可影響構成有效量之內容。例如，治療性調配物可在與溶酶體儲積症(LSD)相關之手術介入之前或之後，或於患者經診斷患有溶酶體儲積症(LSD)後短期內向患者個體投與。另外，若干分開劑量以及錯開劑量可每日或依序投與，或該劑量可經連續輸注，或可為團式注射。另外，治療性調配物之劑量可按比例增加或減少，如由治療或預防情況之危急性所指示。

本發明之組合物向患者個體，較佳地哺乳動物，更佳地人類之投與可使用已知程序在有效治療個體之溶酶體儲積症(LSD)之劑量及持續時間段下進行。達成治療效果所需之治療性化合物之有效量可根據諸如以下之因素變化：所採用之特定化合物之活性；投與時間；化合物之排泄率；治療之持續時間；與化合物組合使用之其他藥物、化合物或材料；疾病或病症之狀態、正在治療之患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康及先前醫療史及醫療技術中熟知之類似因素。劑量方案可經調整以提供最佳治療反應。例如，若干分開劑量可每日一次投與或該劑量可按比例減少，如由治療情況之危急性所指示。本發明之治療性化合物之有效劑量範圍之非限制性實例為約0.01至50 mg/kg之體重/天。

化合物可向個體每日若干次頻繁地投與或其可較不頻繁，諸如每天一次、每週一次、每兩週一次、每月一次，或甚至較不頻繁，諸如每若干月一次或甚至每年一次或更少投與。應瞭解，每天給藥之化合物之量可(以非限制性實例)每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天或每5天投與。例如，利用每隔一天投與，5 mg/天劑量可在週一開始，第一次投與，隨後5 mg/天劑量在週三第二次投與，隨後5 mg/天劑量在週五投與及等等。劑量之頻率對熟習技工容易顯而易見及取決於任何數目之因素，諸如但不限於正在治療之疾病之類型及嚴重度及動物之類型及年齡。本發明之醫藥組合物中之活性成分之實際劑量水平可變化以便獲得有效達成特定患者、組合物及投與模式之所需治療反應而對患者無毒之活性成分的量。一般熟習此項技術之醫生(例如醫師或獸醫)可容易確定及規定所需醫藥組合物之有效量。例如，醫師或獸醫可開始醫藥組合物中採用之本發明之化合物之劑量在較為達成所需治療效果所需水平更低的水平下及逐漸增加劑量直至達成所需效果。

於一些實施例中，為了方便劑量之投與及均勻性，以單位劑型調配化合物係尤其有利的。如本文中所用，單位劑型係指適用作待治療之患者之單位劑量之物理離散單元；各單元含有經計算以產生所需治療效果之預定量之治療性化合物連同所需醫藥媒劑。本發明之單位劑型藉由以下指示或直接取決於以下：(a)治療性化合物之獨特特徵及待達成之特定治療效果，及(b)配混/調配此治療性化合物用於治療LSD之技術中之內在限制。 投與途徑

熟習此項技術者應知曉，雖然可使用超過一種途徑來投與，但是特定途徑可較另一途徑提供更直接且更有效反應。

所揭示組合物之投與途徑包括吸入、經口、經鼻、經直腸、非經腸、舌下、經皮、經黏膜(例如，舌下、經舌、(經)頰、(經)尿道、陰道(例如，經陰道及陰道周)、鼻(內)及(經)直腸)、膀胱內、肺內、十二指腸內、胃內、鞘內、小腦延髓池內(ICM)、脊柱內、心室內、腦心室內、皮下、肌肉內、皮內、動脈內、靜脈內、支氣管內、吸入及局部投與。適宜組合物及劑型包括例如錠劑(tablet)、膠囊、囊片、丸劑、凝膠帽、喉錠(troche)、分散液、懸浮液、溶液、糖漿、顆粒、珠、透皮貼片、凝膠、粉末、小球、岩漿、口含錠、乳霜、糊劑(paste)、膏藥(plaster)、洗液、盤、栓劑、用於鼻或口投與之液體噴霧、用於吸入之乾粉末或霧化調配物、用於膀胱內投與之組合物及調配物及類似者。應瞭解，可用於本發明之調配物及組合物不限於本文中描述之特定調配物及組合物。於一個實施例中，LSD之治療包括選自由以下組成之群之投與途徑：吸入、經口、經直腸、陰道、非經腸、局部、經皮、經肺、鼻內、經頰、經眼、肝動脈內、胸膜內、鞘內、腫瘤內、靜脈內及其任何組合。 基因療法投與

熟習此項技術者知曉，可利用不同遞送方法將載體投與至細胞。實例包括：(1)利用物理裝置之方法，諸如電穿孔(電力)、基因槍(體力)或施加大體積液體(壓力)；及(2)其中將載體與至另一實體(諸如脂質體、聚集之蛋白質或轉運分子)複合之方法。

此外，實際劑量及時程表可取決於組合物是否與其他醫藥組合物組合投與，或取決於藥物動力學、藥物體內動向及代謝之個體間差異變化。類似地，量可於活體外應用中變化，這取決於利用之特定細胞系(例如，基於存在於細胞表面之載體受體之數目或基因轉移採用之特定載體於該細胞系中複製之能力)。此外，每細胞待添加之載體之量將可隨著載體中插入之治療性基因之長度及穩定性以及亦序列之性質變化，及特定言之為需要經驗測定之參數，且可被更改，由於對本發明之方法非內在之因素(例如，與合成相關之成本)。熟習此項技術者可容易根據特定情況之危急性作出任何必要調整。

含有治療劑之細胞亦可含有自殺基因，即，編碼可用於破壞該細胞之產物之基因。於許多基因療法情況中，期望能表現用於宿主細胞中治療目的之基因，而且具有隨意破壞宿主細胞之能力。治療劑可連接至自殺基因，其表現在不存在活化化合物下未經活化。當已引入該劑及自殺基因二者之細胞之死亡係所需時，將該活化化合物投與至該細胞，從而激活自殺基因之表現及殺死細胞。可使用之自殺基因/前藥組合之實例為單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)及更昔洛韋(ganciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)、氧化還原酶及環己醯亞胺；胞嘧啶脫胺酶及5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸腺嘧啶激酶(Tdk::Tmk)及AZT；及去氧胞苷激酶及胞嘧啶阿拉伯糖苷。 治療

本發明涵蓋一種治療診斷患有LSD之個體或有發展LSD風險之個體之缺乏溶酶體酶之方法。該方法改善溶酶體酶之磷酸化，從而治療該個體或預防該個體中之LSD之發生。此外，該方法提高患者之生活品質。於一個實施例中，本發明之方法包括向個體投與包含編碼溶酶體酶之多核苷酸及編碼GlcNAc-1 PTase之多核苷酸之組合物。 核酸序列：

pLL01雙順反子載體序列(SEQ ID NO:1) (CMV啟動子： 斜體及加底線 。IRES： 粗體及斜體 。S1-S3： 粗體及加底線 。)

CMV序列(SEQ ID NO: 2)

IRES序列(SEQ ID NO: 3)

經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)，S1-S3序列(SEQ ID No: 4)

hGBA野生型序列(SEQ ID NO: 5):

hGBA天然變異體序列(SEQ ID NO: )：hGBA (K360N)序列。在突變位點處之核苷酸加粗及加底線。

hGBA經工程改造之變異體序列(SEQ ID NO: )：hGBA (C165S)序列。在突變位點處之核苷酸加粗及加底線。

mGALC序列(SEQ ID NO: 6)：

hGLA序列(SEQ ID NO: 7)：

hNAGLU序列(SEQ ID NO: 8)：

hGAA序列(SEQ ID NO: 9)：

hGAA (SEQ ID NO: ；UniProt寄存編號P10253-1)

hLAMAN序列(SEQ ID NO: 10)：

hGALC序列(SEQ ID NO: 23；GenBank寄存編號：BC036518.2)：

表 2 ：研究中所使用之引子 。

引子	序列	SEQ ID NO:	限制酶
GBA-F	ctgctagccaccATGGAGTTTTCAAGTCCTTC	11	NheI
GBA-R	atagcggccgcTCACTGGCGACGCCACAGGT	12	NotI
GAA-F	ctgctagccaccATGGGAGTGAGGCACCCGCCCTG	13	NheI
GAA-R	atagcggccgctcaACACCAGCTGACGAGAAACTGCTC	14	NotI
GALC-F	ctgctagccaccATGGCTAACAGCCAACCTAAGGC	15	NheI
GALC-R	atagcggccgctcaGCGAGCAGCTTCCACGCGAAAGTTG	16	NotI
NAGLU-F	ctgctagccaccATGGAAGCCGTGGCTGTCGCAG	17	NheI
NAGLU-R	atagcggccgctcaCCAACTACCAGCCACCCATCTAG	18	NotI
GLA-F	ctggatccaccATGCAGCTGAGGAACCCAGAAC	19	BamHI
GLA-R	atagcggccgctcaAAGTAAGTCTTTTAATGACATCTG	20	NotI
LAMAN-F	ctgctagccaccATGGGCGCCTACGCGCGGGCTTC	21	NheI
LAMAN-R	atagcggccgctcaACCATCCACCTCCTTCCATTGAAC	22	NotI

實例

現參考下列實例描述本發明。此等實例係僅出於說明之目的提供且本發明決不應解釋為受限於此等實例，而應解釋為包含任何及所有變型，該等變型由於本文中所提供之教示而變得明顯。

無需進一步描述，據信一般技術者可使用上述描述及下列說明性實例製備及利用本發明之化合物及實踐所主張之方法。因此，下列工作實例特別指出本發明之較佳實施例，且不被解釋為以任何方式限制本發明之其餘部分。

現描述此等實驗中採用之材料及方法。

細胞系 ：將HEK293T 細胞維持於補充有10% (vol/vol) FBS (Gibco)、100,000 U/L盤尼西林(penicillin)、100 mg/L鏈黴素(streptomycin) (Invitrogen)及2 mM L-麩胺醯胺(Invitrogen)之含0.11 g/L丙酮酸鈉及4.5 g/L葡萄糖之DMEM (Corning)中。Expi293細胞(Invitrogen)於Expi293表現培養基(Invitrogen)中以懸浮液生長。

DNA 構築體 ：CMV-S1S3質體係由聖路易斯(St. Louis)之華盛頓大學之Stuart Kornfeld教授提供。雙順反子載體pLL01係如下以兩步創建：第一步，將486 bp IRES序列自Ptase α/β及γ雙順反子構築體(由Stuart Kornfeld教授提供)擴增及藉由PCR自質體CMV-S1S3獲得S1-S3基因片段。隨後於第二步中，藉由重疊延伸PCR將此等兩個片段連接在一起以形成IRES-S1S3片段。將該IRES-S1S3片段用HpaI及PmeI限制酶(NEB)消化及連接至pcDNA3.1(+)載體。為產生pLL11、pLL21、pLL31、pLL41、pLL51及pLL61雙順反子質體，將hGBA、hGAA、mGALC、hNAGLU、hGLA及hLAMAN基因藉由其特異性引子(表1)擴增及插入雙順反子載體(pLL01)。

磷酸轉移酶分析 ：將HEK293T或Expi293細胞收穫及於裂解緩衝液(25 mM Tris-Cl，pH 7.2，150 mM NaCl，1% Triton X-100及蛋白酶抑制劑混合物)中裂解。將5 μl細胞提取物於磷酸轉移酶分析緩衝液(50 mM Tris-Cl，pH 7.4，10 mM MgCl₂ ，10 mM MnCl₂ ，2 mg/mL BSA，2 mM ATP)中在存在75 mM UDP-GlcNAc、1 mCi UDP-[3H]GlcNAc及100 mM aMM下以50 μL之最終體積在37℃下培育0.5小時。藉由添加1 mL之2 mM EDTA，pH 8.0停止反應，及使樣品經歷QAE-Sephadex層析法。

酶產生 ：將Expi293細胞用空載體、雙順反子質體或其單一表現質體轉染。於2至3天後收穫培養基。為了產生GBA，將含在細胞培養期間為使分泌之酶穩定的30 μM伊索福明(isofagomine)之條件培養基於PBS緩衝液中在4℃下透析過夜以移除伊索福明用於酶活性分析。

酶活性分析 ：針對酶活性分析使用下列受質：4-甲基傘形基[3-D-哌喃葡萄糖苷(GBA酶受質，M3633，Sigma)、4-甲基傘形基α-D-哌喃葡萄糖苷(GAA酶受質，M9766，Sigma)、6-十六醯基胺基-4-甲基傘形基[3-D-哌喃半乳糖苷(GALC酶受質，EH05989，Carbosynth)、4-甲基傘形基-N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷(NAGLU酶受質，474500，Millipore)、4-甲基傘形基α-D-哌喃半乳糖苷(GLA酶受質，M7633，Sigma)及4-甲基傘形基α-D-哌喃甘露糖苷(LAMAN酶受質，M3657，Sigma)。於檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液，pH 5.0，0.25% TX-100，0.25%牛磺膽酸鈉與1 mM GBA受質中分析GBA酶活性。於檸檬酸鹽緩衝液，pH 4.0，0.25% TX-100與1 mM GAA受質中進行GAA酶活性。於檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液，pH 4.0，0.25% TX-100，0.6%牛黃膽酸鈉，0.2%油酸與0.1 mM GALC受質中進行GALC酶活性。於檸檬酸鹽緩衝液，pH 4.0，0.25% TX-100與1 mM NAGLU受質中分析NAGLU酶活性。於檸檬酸鹽緩衝液，pH 4.5，0.25% TX-100與1 mM GLA受質中分析GLA酶活性。於檸檬酸鹽緩衝液，pH 4.0，0.25% TX-100與1 mM LAMAN受質中分析LAMAN酶活性。

CI-MPR結合分析：於高度結合96孔板(Costar 3601)中進行CI-MPR結合。將板用10 μg/ml之50 μl經純化之牛CI-MPR在室溫(RT)下固定1小時及藉由2% BSA在RT下阻斷再1小時。將來自經轉染之Expi293細胞之條件培養基之等分試樣用Hepes緩衝液(40 mM Hepes，pH 6.8，150 mM NaCl，0.05% Tween-20)稀釋及用經固定之CI-MPR在室溫下培育1小時以結合磷酸化之溶酶體酶。於洗滌3次後，藉由4-甲基傘形酮方法分析溶酶體酶活性。 實例 1 ：產生用於溶酶體酶表現之含有磷酸轉移酶 (S1-S3) 之空雙順反子載體

作為藉由兩個基因(GNPTAB及GNPTG)編碼之α2β2γ2六聚體的GlcNAc-1-磷酸轉移酶(GlcNAc-1-PTase，亦稱作Ptase)涉及磷酸化寡醣之產生，該寡醣為經由陽離子獨立性甘露糖6-磷酸受體(CI-MPR)之溶酶體靶向所必需。表現之溶酶體酶之磷酸化藉由與經工程改造之截短之Ptase (S1-S3)共轉染顯著增加。此研究利用產生磷酸化溶酶體酶之S1-S3構築體來治療溶酶體儲積病(LSD，諸如但不限於高歇氏病、龐貝氏病及α-甘露糖苷儲積症)。

為產生用於酶替代療法(ERT)之高度磷酸化之治療性溶酶體酶，將治療性溶酶體酶與S1-S3於相同細胞中同時共同表現。因為S1-S3及溶酶體酶於不同載體中表現，為產生高度磷酸化之治療性溶酶體酶，藉由兩步產生具有溶酶體酶及S1-S3之表現之穩定細胞系：(a)創建表現Ptase S1-S3之穩定細胞系；(b)基於該S1-S3穩定細胞系，產生將治療性溶酶體酶之表現添加至其之第二細胞系。為避免此兩步及耗時程序，本文中揭示的是藉由引入內部核糖體進入位點(IRES)之雙順反子載體，其能在單一啟動子下表現兩個單獨的基因。

雙順反子表現亦可為應用之基因療法用於溶酶體儲積病(LSD)。含486bp IRES序列及S1-S3基因之空雙順反子載體- pLL01在巨細胞病毒(CMV)啟動子下於pcDNA3.1(+)質體載體中(圖1B)。該雙順反子載體pLL01在多選殖位點具有三個獨特限制酶裂解位點，該等多選殖位點位於IRES序列前面及允許插入治療性溶酶體酶基因。為檢查使用雙順反子載體pLL01之S1-S3之表現，將HEK293細胞用pcDNA3.1(+)、CMV-S1S3 (圖1A)或pLL01之等量質體轉染。48小時後，將細胞收穫及於裂解緩衝液(25 mM Tris緩衝液，pH 7.4，150 mM NaCl，1% TX-100與蛋白酶抑制劑混合物)中裂解。進行表現pcDNA3.1(+)、CMV-S1S3或pLL01之全細胞提取物之磷酸轉移酶活性分析以測定S1-S3之表現。如圖1C中所示，與樣品CMV-S1S3相比，pcDNA3.1(+)樣品之磷酸轉移酶活性係可忽略，但是雙順反子載體pLL01維持9.3%活性。 實例2：雙順反子表現增強治療性溶酶體酶之磷酸化

因為雙順反子載體中之S1-S3之表現係低的(9.3%) (參見實例1)，設計此研究以確定該低的S1-S3活性是否足夠將溶酶體酶磷酸化。於目前雙順反子載體中測試六種不同溶酶體酶。該等酶係如下：酸性β-葡萄糖苷酶(GBA)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、半乳糖基神經醯胺酶(GALC)、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)、α-半乳糖苷酶(GLA)及酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。

酸性 β- 葡萄糖苷酶 (GBA) ：GBA為將其受質葡糖腦苷脂於溶酶體中降解之溶酶體酶。溶酶體中之GBA之缺乏引起高歇氏病，其為最常見溶酶體儲積病(LSD)。為測試目前揭示之雙順反子載體中之GBA之磷酸化，GBA雙順反子質體- pLL11藉由將具有終止密碼子之1611 bp人類GBA cDNA序列通過NheI及NotI限制位點插入雙順反子空載體- pLL01中產生(圖2A)。將相同量之具有或不具有CMV-S1S3質體之pLL11及GBA質體轉染至Expi293細胞。48小時後，分開收穫細胞及條件培養基。出人意料地，pLL11條件培養基中之GBA活性為240 nmol/小時/ml，其高於藉由單獨GBA製備之培養基(96 nmol/小時/ml)或GBA與S1-S3共轉染製備之培養基(90 nmol/小時/ml，圖2B)超過2倍。除了GBA表現外，使用細胞提取物藉由磷酸轉移酶分析定量S1-S3表現。與缺少GBA之雙順反子載體pLL01相似，pLL11樣品與GBA及S1-S3之共轉染樣品相比具有7.5%磷酸轉移酶表現(圖2C)。

因為S1-S3表現於雙順反子載體中減少，測定低的磷酸轉移酶表現對GBA之磷酸化之後果。出於此目的，收穫pLL11、單獨GBA及與S1-S3共轉染之GBA之條件培養基及藉由進行陽離子獨立性甘露糖6-磷酸受體(CI-MPR)結合實驗來定量磷酸化之程度。目前揭示之雙順反子載體中產生之GBA於平穩期具有甚至更高之與CI-MPR之結合(圖3A)。然而，當藉由使用線性範圍點計算受體結合之百分比時，於所揭示之雙順反子載體中產生之GBA之44%結合至CI-MPR，其與藉由與S1-S3共轉染產生之GBA相同(43%)及高於藉由內源性磷酸轉移酶產生之GBA (4.5%，圖3B) 10倍。

此項技術中已廣泛使用滴度來測定經識別之分析物之濃度。將結合實驗中之CI-MPR之濃度滴定。將經連續稀釋之CI-MPR固定於96孔板中，及將藉由目前揭示之雙順反子載體或內源性磷酸酶(Ptase)產生之相似量之GBA酶添加至該板中用於受體結合分析。如圖3C中所示，來自pLL11樣品之GBA之結合係依賴於CI-MPR之濃度，及當受體濃度達到15 µg/ml時其飽和，而藉由內源性Ptase產生之GBA之結合停留在低水平。目前數據指示，所揭示之雙順反子載體極大升高GBA酶之磷酸化水平。

酸性 α- 葡萄糖苷酶 (GAA) ： 溶酶體酶GAA係溶酶體中糖元降解為葡萄糖所必需的。GAA基因中之突變係與溶酶體儲積症-龐貝氏病相關聯。為創建GAA雙順反子質體-pLL21，將含有終止密碼子之2859個鹼基對(bp)人類GAA基因片段擴增及於藉由限制酶NheI及NotI消化後插入雙順反子載體pLL01中(圖4A)。將序列證實之pLL21及GAA質體於Expi293細胞中轉染。48小時後，收集條件培養基用於GAA活性及CI-MPR結合實驗。與GBA類似，pLL21條件培養基中之GAA活性高於GAA單一表現(圖4B)。pLL21條件培養基之結合較GAA單一條件培養基更快且更高(圖4C)。在1小時培育時間期間，來自pLL21條件培養基之GAA之72.5%結合至CI-MPR，但是來自GAA單一表現之GAA之CI-MPR結合僅為21.5% (圖4D)。此等數據表明，目前揭示之雙順反子表現平臺可極大增加GAA酶之磷酸化。

半乳糖基神經醯胺酶 (GALC) ：於溶酶體中，GALC酶負責藉由自神經醯胺衍生物移除半乳糖來分解代謝半乳糖基神經醯胺。GALC酶之遺傳缺陷為克拉培氏病之原因。為測試目前揭示之雙順反子表現中之GALC酶，藉由將小鼠GALC基因插入載體pLL01中產生雙順反子質體pLL31 (圖5A)。於經pLL31轉染之Expi293細胞中收穫之pLL31條件培養基中之GALC酶活性類似於僅GALC培養基(0.86 nmol/µl/h相比0.62 nmol/µl/h，圖5B)。CI-MPR受體結合結果顯示，具有S1-S3之GALC之雙順反子表現增加其CI-MPR結合，自28.4%增加至56.8% (圖5C及D)。

α-N- 乙醯葡萄糖胺苷酶 (NAGLU) ：NAGLU基因編碼會降解溶酶體中之硫酸肝素之酶。NAGLU酶之缺乏導致B型聖菲利柏氏症候群，亦稱作黏脂儲積症(MPS) IIIB。當用於ERT之細胞系中產生之NAGLU酶於甘露糖殘基中不具有任何磷酸鹽時。且用於其ERT之臨床試驗在今年早期失敗。為於目前揭示之雙順反子載體中表現NAGLU，使用如上所述之相同程序。將2229 bp人類NAGLU基因插入pLL01雙順反子載體中(圖6A)，及將NAGLU雙順反子質體-pLL41及NAGLU單一表現質體轉染至Expi293細胞。藉由使用條件培養基，顯示樣品pLL41中之NAGLU活性高於NAGLU單一表現樣品(圖6B)。在CI-MPR結合方面，自NAGLU單一表現樣品幾乎檢測不到NAGLU結合，儘管吾人放置高量酶(多至9 nmol/小時，圖6C至6D)。然而，藉由雙順反子載體產生之NAGLU結合至CI-MPR多至25% (圖6C至6D)。

α- 半乳糖苷酶 (GLA) ：溶酶體酶GLA將蜜二糖水解成半乳糖及葡萄糖且能代謝球形三醯神經醯胺(GL-3)。GLA酶活性之缺乏引起X染色體相聯症-法布立氏病。為製備GLA雙順反子質體– pLL51，將人類GLA基因片段及雙順反子載體pLL01用BamHI及NotI消化，及藉由T4連接酶連接(圖7A)。將正確pLL51純系及GLA單一質體於Expi293細胞中轉染及表現。藉由使用其條件培養基進行GLA活性分析及CI-MPR結合實驗。如圖7B中所示，單獨GLA或pLL51條件培養基中之GLA活性相似。使用此等兩種培養基之滴定曲線表明pLL51樣品較GLA樣品更多且更快地結合至CI-MPR (圖7C)。針對pLL51樣品之總體結合百分比為62.1%，其為GLA樣品之幾乎兩倍(33.1%，圖7D)。

酸性 α- 甘露糖苷酶 (LAMAN) ： 遺傳疾病α-甘露糖苷儲積症係由由MAN2B1基因編碼之溶酶體酶LAMAN之缺乏引起。因為人類LAMAN酶幾乎不磷酸化，hLAMAN為用於所揭示之雙順反子表現之良好候選。將3033 bp人類LAMAN基因插入pLL01雙順反子載體中(圖8A)及於Expi293細胞中表現用於後期研究。LAMAN雙順反子質體pLL61條件培養基中之LAMAN活性係稍微低於LAMAN單一表現(圖8B)。當滴定其與CI-MPR之結合時，藉由使用LAMAN單一表現樣品幾乎檢測不到LAMAN酶與CI-MPR之結合，但是發現來自pLL61樣品之大量LAMAN酶與CI-MPR相互作用(圖8C)。利用S1-S3雙順反子表現，LAMAN與CI-MPR之結合自1.6%增加至75.2% (圖8D)。

可將以上六種酶基於其基礎磷酸化水平分類成兩組。組1為低磷酸化溶酶體酶(GBA、NAGLU及LAMAN)，其為在酶產生期間之野生型Ptase之差的受質。第二組為高磷酸化酶(GAA、GALC及GLA)。該等酶被視為野生型Ptase之良好受質及接受相當量之磷酸鹽。顯示目前揭示之S1-S3之雙順反子表現顯著增加六種溶酶體酶之磷酸化，而與其基礎磷酸化水平無關。鑑於彼等發現，本文中所揭示之雙順反子載體pLL01可用於產生高度磷酸化之溶酶體酶以治療所有溶酶體儲積病。明顯地，目前揭示之雙順反子載體極大有益於治療溶酶體儲積症之ERT及基因療法。 實例 3 ：治療高歇氏病 酶替代療法 (ERT)

包含編碼GBA之序列及編碼經S1-S3修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之序列之表現載體可用於治療或預防高歇氏病之徵兆或症狀。下列研究證實，於技術公認之高歇氏病之標準小鼠模型中表現GBA-S1-S3會導致表現GBA-S1-S3、GBA-S1-S3自循環血流轉運至細胞及採用GBA-S1-S3複合體之細胞中增加的GBA活性。因GBA-S1-S3複合體之表現及攝取所致之GBA之少量增加導致小鼠模型中功能之顯著功能恢復。

圖16A至16B為描述於GaucherD409V/裸小鼠之肝、肺及脾中觀察到之升高之葡糖基(b)神經醯胺含量的一對圖。將20週齡小鼠用於葡糖基神經醯胺分析。於組織勻漿中測定GBA之天然受質葡糖腦苷酯之累積。GC於肺中之累積為統計上及治療上有價值的結果，其為目前護理標準之已知未滿足的需求。1).將20 µL樣品、校準標準物、品質控制、稀釋品質控制、單空白及雙空白樣品之等分試樣添加至96孔板；2).將各樣品(除雙空白外)各自用200 µL IS中止(將雙空白樣品用200 µL甲醇/ACN/H₂ O (v:v:v=85:10:5)中止)，及然後將混合物在800 rpm下渦流混合5分鐘及在3220 g (4000 rpm)，4℃下離心15分鐘；3).將50 µL上清液用氮氣乾燥及用甲醇/ACN/H₂ O (v:v:v=85:10:5)再懸浮，及然後完全渦流5分鐘，及直接注射經稀釋之溶液用於LC-MS/MS分析。

圖17A至17C為證實GCase^M6P 於GBAD^409V 小鼠模型中與伊米苷酶相比具有更長半衰期及更大組織攝取之系列圖。使用護理標準伊米苷酶(Cerezyme)及於利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現之經純化之GBA進行D409A高歇氏小鼠模型中之PK/PD研究，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體及在中性及略鹼性條件下報導更大穩定性之GBA之天然變異體。簡言之，使3隻動物接受約1.5 mg/kg之GBA之尾靜脈注射。針對血清或血漿藥物動力學數據，在2、10、20、40及60分鐘時收集血漿樣品。使用合成受質，4-甲基傘形酮-β-D-哌喃葡萄糖苷(4MU-Glc)量測活性。於個別動物中藉由設置2分鐘時間點作為100%活性及隨後時間點為t=2分鐘時間點之%，將活性標準化。在存在S1S3下表現之經穩定之GBA似乎具有更長半衰期。此更長半衰期為酶係穩定及不同清除路徑之組合。為測定多少GBA由組織攝取，於酶注射2小時後，將組織回收，均勻化及使用4MU-Glc受質量測活性。將活性標準化至勻漿中之總蛋白質，如由針對蛋白質測定之BCA方法所測定。於右圖所示之組織攝取數據中觀察到M0111之真正優點。針對所評價之所有組織，於與S1S3共同表現之經穩定之GBA中發現更多活性。此於肺、肌肉及腦中係最顯著的，其中伊米苷酶具有有限活性。當一併考慮組織及血清數據時，具有更大磷酸化之更穩定GBA用於遞送更多酶至患病組織之優點係顯然的。這是第一次顯著量之GBA已在此等劑量下遞送至肺、肌肉及心臟。

圖18A至18C為證實GCase^M6P ERT於GBA^D409V 小鼠模型中較伊米苷酶更好地減少組織巨噬細胞之系列圖。使用護理標準伊米苷酶及於利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現之經純化之GBA進行D409A高歇氏小鼠模型中之功效研究，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體及在中性及略鹼性條件下報導更大穩定性的GBA之天然變異體。將約20週齡高歇氏小鼠用約1.5 mpk (毫克/千克或mg/kg)酶每週一次處理四週。四週後，收穫肝及肺組織及固定於4%多聚甲醛-PBS，pH 7.4中用於利用CD68抗體之免疫組織化學。M0111與目前護理標準相比具有更大功效，如由CD68 Ab可視化之患病組織中巨噬細胞的減少所證實。

圖18D至18E為提供圖18A至18C中所示之肺及肝研究之定量分析的一對圖。

圖19A至19C為證實GCase^M6P ERT於GBA^D409V 小鼠模型中較伊米苷酶更好地減少高歇氏儲積細胞之數目及大小的系列圖。使用護理標準伊米苷酶及於利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現之經純化之GBA進行D409A高歇氏小鼠模型中之功效研究，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體及在中性及略鹼性條件下報導更大穩定性的GBA之天然變異體。將約20週齡高歇氏小鼠用約1.5 mpk酶每週一次處理四週。四週後，收穫肝及肺組織及固定於4%多聚甲醛-PBS，pH 7.4中用於蘇木精及曙紅(H&E)染色。GCase^M6P 與目前護理標準相比具有更大功效，如由CD68 Ab可視化之患病組織中巨噬細胞的減少所證實。

圖20A至20B為證實M0111 ERT於GBA^D409V 小鼠模型中較伊米苷酶更好地減少累積之受質的一對圖。將約20週齡高歇氏小鼠用約1.5 mpk酶每週一次處理四週。收集組織樣品及均勻化用於葡糖基神經醯胺分析。於組織勻漿中測定GBA之天然受質葡糖腦苷脂之累積。具重要性的值為肺中之GC之累積，其為目前護理標準之已知未滿足的需求。1).將20 µL樣品、校準標準物、品質控制、稀釋品質控制、單空白及雙空白樣品之等分試樣添加至96孔板中；2).將各樣品(除雙空白外)各自用200 µL IS中止(將雙空白樣品用200 µL甲醇/ACN/H₂ O (v:v:v=85:10:5)中止)，及然後將混合物在800 rpm下渦流混合5分鐘及在3220 g (4000 rpm)，4℃下離心15分鐘；3).將50 µL上清液用氮氣乾燥及用甲醇/ACN/H₂ O (v:v:v=85:10:5)再懸浮，及然後完全渦流5分鐘，及直接注射經稀釋之溶液用於LC-MS/MS分析。針對量測之兩種神經醯胺，經M0111處理之動物於ERT療法後較伊米苷酶具有更低水平。 基因療法

包含編碼GBA之序列及編碼經S1-S3修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之序列之遞送載體可用於治療或預防高歇氏病之徵兆或症狀。下列研究證實，於技術公認之高歇氏病之標準小鼠模型中表現GBA-S1-S3會導致表現GBA-S1-S3、GBA-S1-S3自循環血流轉運至細胞及採用GBA-S1-S3複合體之細胞中增加的GBA活性。因GBA-S1-S3複合體之表現及攝取所致之GBA之少量增加導致小鼠模型中之功能之顯著功能恢復。

或者或此外，包含編碼經S1-S3修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之序列之遞送載體可用於治療或預防高歇氏病之徵兆或症狀。S1-S3之表現可增加內源性GBA由身體組織之攝取，從而誘導小鼠模型中之功能之顯著功能恢復。

圖21A至21D為顯示AAV介導之基因療法用於治療高歇氏病之活體內研究之結果的系列圖。為測定AAV9基因療法之效應，利用具有兩種不同啟動子之穩定GBA + S1S3 Pt’ase之雙順反子表現轉殖基因。將20週齡GBA^D409V 小鼠用適度劑量之AAV9-穩定GBA+^S1S3 PT’ase，5E11病毒基因組(vg)給藥。為測定多少GBA由組織產生，於AAV9注射後2週後，將組織回收、均勻化及使用4MU-Glc受質量測活性。將活性標準化至勻漿中之總蛋白質，如由針對蛋白質測定之BCA方法所測定。

圖29A至29C為描述於高歇氏小鼠中注射AAV9-hTLV-GBA-S1S3基因療法2週後肺及肝中之酶活性之定量的系列圖。AAV9-hTLV-GBA-S1S3原本被稱作AAV9-hTLV-GBA^M6P ，其中該M6P表示S1S3構築體。 實例 4 ：治療 α - 甘露糖苷儲積症 酶替代療法(ERT)

包含編碼LAMAN之序列及編碼經S1-S3修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之序列之表現載體可用於治療或預防α - 甘露糖苷儲積症之徵兆或症狀。下列研究證實，於小鼠模型中表現LAMAN-S1-S3導致表現LAMAN-S1-S3、LAMAN-S1-S3自循環血流轉運至細胞及採用LAMAN-S1-S3複合體之細胞中增加的LAMAN活性。因LAMAN-S1-S3複合體之表現及攝取所致之LAMAN之少量增加導致小鼠模型中之功能之顯著功能恢復。

圖22A至22C為描述使用α-甘露糖苷儲積症作為ERT之活體外研究之結果的系列圖。

圖23A至23B為描述M0611 LAMAN酶表現、純化及表徵之照片及對應數據表。將LAMAN之兩個製劑於利用或不利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體。二者藉由利用HPC4標籤純化。磷酸化之顯著增加藉由量測以劑量依賴性方式友好結合至經固定之陽離子獨立性甘露糖6-磷酸受體之LAMAN的量來證實。所結合之LAMAN之量係基於使用其合成受質4-甲基傘形酮-α-D-哌喃甘露糖苷(4MU-Man)之其活性。經由磷酸化寡醣結合之特異性藉由添加之甘露糖6-磷酸阻斷結合之能力來證實。值得注意的是甚至在存在M6P下MO611結合受體之能力。選擇來自批次P-0030之M0611及來自批次P-0031之LAMAN用於活體內動物研究。

圖23C為描述M0611 LAMAN酶表現、純化及表徵之圖。將LAMAN之兩個製劑於利用或不利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體。二者藉由利用HPC4標籤純化。磷酸化之顯著增加藉由量測以劑量依賴性方式友好結合至經固定之陽離子獨立性甘露糖6-磷酸受體之LAMAN的量來證實。所結合之LAMAN之量係基於使用其合成受質4-甲基傘形酮-α-D-哌喃甘露糖苷(4MU-Man)之其活性。經由磷酸化寡醣結合之特異性藉由添加之甘露糖6-磷酸阻斷結合之能力來證實。值得注意的是甚至在存在M6P下MO611結合受體之能力。選擇來自批次P-0030之M0611及來自批次P-0031之LAMAN用於活體內動物研究。

圖24A至24B為證實於用於酶替代療法之野生型小鼠中之α-甘露糖苷儲積症之生物分佈的一對圖。為評價LAMAN與與S1S3 PT’ase共同表現之LAMAN之間之組織攝取的差異，將2 mg/kg之各製劑經由尾靜脈注射至野生型小鼠(n=4)。於給藥2及8小時後，將組織回收、均勻化及使用4MU-Man受質量測活性。將活性標準化至勻漿中之總蛋白質，如由針對蛋白質測定之BCA方法所測定。於組織攝取數據中觀察到M0611 (與S1S3 PT’ase共同表現之LAMAN)之優點。針對肝、脾、心、肺及腦，在2小時時於組織中存在更大活性。此趨勢在8小時時亦真，除了肺外。此可為於此組織之分析中觀察到之高變化的結果。此觀察之唯一例外為腎。自所有樣品減去內源性LAMAN活性。於利用吾人LAMAN酶M0611注射之小鼠之大多數組織中檢測到更高LAMAN酶活性。

圖25A至25B為證實於用於酶替代療法之野生型小鼠中之α-甘露糖苷儲積症之生物分佈的一對圖。為評價LAMAN與與S1S3 PT’ase共同表現之LAMAN之間之組織攝取的差異，將10 mg/kg之各製劑經由尾靜脈注射至野生型小鼠(n=4)。於給藥2及8小時後，將組織回收、均勻化及使用4MU-Man受質量測活性。將活性標準化至勻漿中之總蛋白質，如由針對蛋白質測定之BCA方法所測定。於組織攝取數據中觀察到M0611 (與S1S3 PT’ase共同表現之LAMAN)之優點。針對肝、脾、心、肺及腦，在2小時時於組織中存在更大活性。此趨勢在8小時時亦真，除了肺外。此可為於此組織之分析中觀察到之高度變化的結果。此觀察之唯一例外為腎。 基因療法

包含編碼LAMAN之序列及編碼經S1-S3修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之序列之遞送載體可用於治療或預防α- 甘露糖苷儲積症之徵兆或症狀。下列研究證實，於α- 甘露糖苷儲積症之小鼠模型中表現LAMAN-S1-S3導致表現LAMAN-S1-S3、LAMAN-S1-S3自循環血流轉運至細胞及採用LAMAN-S1-S3複合體之細胞中增加的LAMAN活性。因LAMAN-S1-S3複合體之表現及攝取所致之LAMAN之少量增加導致小鼠模型中之功能之顯著功能恢復。

或者或此外，包含編碼經S1-S3修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之序列之遞送載體可用於治療或預防α- 甘露糖苷儲積症之徵兆或症狀。S1-S3之表現可增加內源性LAMAN由身體組織之攝取，從而誘導小鼠模型中之功能之顯著功能恢復。 實例5：治療黏脂儲積症 酶替代療法(ERT)

包含編碼經S1-S3修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之序列之表現載體可用於治療或預防黏脂儲積症之徵兆或症狀。下列研究證實，表現S1-S3導致表現S1-S3、該S1-S3以及一或多種溶酶體酶自循環血流轉運至細胞及採用S1-S3複合體之細胞中增加的一或多種溶酶體酶活性。因S1-S3複合體及一或多種溶酶體酶之表現及攝取所致之S1-S3複合體之少量增加導致功能之顯著功能恢復。 基因療法

包含編碼經S1-S3修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之序列之遞送載體可用於治療或預防黏脂儲積症之徵兆或症狀。下列研究證實表現S1-S3導致表現S1-S3、該S1-S3以及一或多種溶酶體酶自循環血流轉運至細胞及採用S1-S3複合體之細胞中增加的一或多種溶酶體酶活性。因S1-S3複合體之表現及攝取所致之一或多種溶酶體酶之活性的少量增加導致功能之顯著功能恢復。

或者或此外，包含編碼經S1-S3修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之序列之遞送載體可用於治療或預防黏脂儲積症之徵兆或症狀。S1-S3之表現可增加一或多種內源性溶酶體酶由身體組織之攝取，從而誘導小鼠模型中之功能之顯著功能恢復。

圖26A至26B為描述用於黏脂儲積症基因療法(GTx)之AAV9設計及活體外測試的示意圖及圖表。將293T細胞用各種M0021病毒轉導及培養2天，之後進行PTase活性分析。

圖27A至27B為證實M0021治療減少ML II小鼠中之血清溶酶體酶含量的一對圖。描述一隻34週齡雌性ML II小鼠，其接受4E11 vg/小鼠之AAV9用於4週表現。檢查血清酶活性。為測定S1S3 Ptase基因療法之效應，將34週齡雌性小鼠用適度劑量之AAV9-^S1S3 PT’ase，4e12 vg (2e13 vg/kg)給藥。ML2之表現型中之一者為溶酶體酶之升高之血清含量，由於其不能經靶向至細胞內中溶酶體。當於接受該療法正好4週後存在血清中之LAMAN及ManB活性之減少時，觀察到鼓舞人心的結果。此結果係重要的，因為其證實實現MLII小鼠模型之所述表現型之能力。

圖28A至28C為證實M0021治療增加ML II中之溶酶體酶之磷酸化的系列圖。為進一步瞭解對S1S3Ptase基因療法在減少LAMAN及ManB之血清活性方面之影響，使用較早所述之固定化受體結合分析評價血清中發現之酶之CIMPR結合。簡言之，以漸增之量添加已知活性至固定化CIMPR。洗掉未結合之酶及使用適宜合成受質ManB (4-甲基傘形基-α-D-哌喃甘露糖苷(4MU-Man))，LAMAN (4MU-Man)量測剩餘結合之物質酶。ML II小鼠中之AAV9-S1S3基因療法增加溶酶體酶之磷酸化。血清中之總磷酸化之溶酶體酶經恢復至正常水平或更多。

本文中引用之每篇專利、專利申請案及公開案各者之揭示內容之全文係以引用的方式併入本文中。雖然已參考特定實施例揭示本發明，但是顯然本發明之其他實施例及變型可在不背離本發明之真正精神及範圍下由熟習此項技術者設計。隨附申請專利範圍意欲被解釋為包含所有此等實施例及等效變型。

出於說明本發明之目的，於圖示中描述本發明之某些實施例。然而，本發明不限於圖示中所述之實施例之精確配置及手段。

本專利或申請案檔案含有以顏色執行之至少一個圖示。具有彩色圖示之本專利或專利申請公開案之副本將在請求及支付必要費用後由官方提供。

圖1A至1C為描述S1-S3雙順反子載體之系列圖及圖表。圖1A：CMV-S1S3載體。圖1B：pLL01: pCMV-MCS-IRES-S1S3載體。圖1C：說明CMV-S1S3及pLL01之表現程度之圖(CPM：計數/分鐘)。

圖2A至2C為描述GBA雙順反子表現質體於S1-S3雙順反子載體中之產生之系列圖及柱狀圖。圖2A：pLL01: pCMV-hGBA-IRES-S1S3載體。圖2B：條件培養基中之GBA活性。圖2C：說明磷酸轉移酶活性%之柱狀圖。

圖3A至3C為顯示雙順反子表現增加GBA酶之磷酸化之系列圖及柱狀圖。

圖4A至4D為顯示雙順反子表現增加GAA酶之磷酸化之系列圖、圖表及柱狀圖。

圖5A至5D為顯示雙順反子表現增加GALC酶之磷酸化之系列圖、圖表及柱狀圖。

圖6A至6D為顯示雙順反子表現增加NAGLU酶之磷酸化之系列圖、圖表及柱狀圖。

圖7A至7D為顯示雙順反子表現增加GLA酶之磷酸化之系列圖、圖表及柱狀圖。

圖8A至8D為顯示雙順反子表現增加LAMAN酶之磷酸化之系列圖、圖表及柱狀圖。

圖9A至9E為證實本發明之S1-S3 Ptase雙順反子載體顯著增加GBA酶之CI-MPR結合及其於治療高歇氏病(Gaucher disease)中之細胞攝取之系列圖(A至C)。小圖D及E證實GBA酶中之單點突變增加其穩定性但是不影響其對CI-MPR之結合。

圖10A至10C為證實本發明之S1-S3 Ptase雙順反子載體顯著增加GAA酶之CI-MPR結合及其於治療龐貝氏病(Pompe Disease)中之細胞攝取的系列圖。

圖11A至11C為證實本發明之S1-S3 Ptase雙順反子載體顯著增加GALC酶之CI-MPR結合及其於治療克拉培氏病(Krabbe Disease)中之細胞攝取的系列圖。

圖12A至12C為證實本發明之S1-S3 Ptase雙順反子載體顯著增加NAGLU酶之CI-MPR結合及其於治療MPS IIIB病中之細胞攝取的系列圖。

圖13A至13C為證實本發明之S1-S3 Ptase雙順反子載體顯著增加GLA酶之CI-MPR結合及其於治療法布立氏病(Fabry Disease)中之細胞攝取的系列圖。

圖14A至14C為證實本發明之S1-S3 Ptase雙順反子載體顯著增加LAMAN酶之CI-MPR結合及其於治療α-甘露糖苷儲積症(Mannosidosis)中之細胞攝取的系列圖。

圖15A至15B為證實藉由AAV9載體遞送之本發明之S1-S3 Ptase雙順反子載體可用作治療黏脂儲積病(Mucolipidosis Disease)之基因療法的示意圖及圖表。

圖16A至16B為描述於GaucherD409V/裸小鼠之肝、肺及脾中觀察到之升高之葡糖基(b)神經醯胺含量的一對圖。將20週齡小鼠用於葡糖基神經醯胺分析。於組織勻漿中測定GBA之天然受質葡糖腦苷酯之累積。GC於肺中之累積為統計上及治療上有價值的結果，其為目前護理標準之已知未滿足的要求。1).將20 µL樣品、校準標準、品質控制、稀釋品質控制、單空白及雙空白樣品之等分試樣添加至96孔板；2).將各樣品(除了雙空白外)各自用200 µL IS中止(將雙空白樣品用200 µL甲醇/ACN/H₂ O (v:v:v=85:10:5)中止)，及然後將混合物在800 rpm下渦流混合5分鐘及在3220 g (4000 rpm)，4℃下離心15分鐘；3).將50 µL上清液用氮氣乾燥及用甲醇/ACN/H₂ O (v:v:v=85:10:5)再懸浮，及然後全部渦流5分鐘，及直接注射經稀釋之溶液用於LC-MS/MS分析。

圖17A至17C為證實GCaseM6P於GBAD409V小鼠模型中與伊米苷酶(imiglucerase)相比具有更長半衰期及更大組織攝取之系列圖。使用護理標準伊米苷酶(Cerezyme)及於利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現之經純化之GBA進行D409A高歇氏小鼠模型中之PK/PD研究，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體及在中性及略鹼性條件下報導更大穩定性的GBA之天然變異體。簡言之，使3隻動物接受約1.5 mg/kg之GBA之尾靜脈注射。針對血清或血漿藥物動力學數據，在2、10、20、40及60分鐘時收集血漿樣品。使用合成受質，4-甲基傘形基(methylumbelliferyl)-β-D-哌喃葡萄糖苷(4MU-Glc)量測活性。於個別動物中藉由設置2分鐘時間點作為100%活性及隨後時間點為t=2分鐘時間點之%將活性標準化。在存在S1S3下表現之經穩定之GBA似乎具有更長半衰期。此更長半衰期為穩定酶及不同清除路徑之組合。為測定多少GBA由組織攝取，於酶注射2小時後，將組織回收，均勻化及使用4MU-Glc受質量測活性。將活性標準化至勻漿中之總蛋白質，如由針對蛋白質測定之BCA方法所測定。於右圖所示之組織攝取數據中觀察到M0111之真正優點。針對所評價之所有組織，於與S1S3共同表現之經穩定之GBA中發現更多活性。此於肺、肌肉及腦中係最大的，其中伊米苷酶具有有限活性。當一併考慮組織及血清數據時，具有更大磷酸化之更穩定GBA用於遞送更多酶至患病組織之優點係顯然的。此為第一次顯著量之GBA已在此等劑量下遞送至肺、肌肉及心臟。

圖18A至18C為證實GCaseM6P ERT於GBAD409V小鼠模型中較伊米苷酶更好減少組織巨噬細胞之系列圖。使用護理標準伊米苷酶及於利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現之經純化之GBA進行D409A高歇氏小鼠模型中之功效研究，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體及在中性及略鹼性條件下報導更大穩定性的GBA之天然變異體。將約20週齡高歇氏小鼠用約1.5 mpk (毫克/千克或mg/kg)酶每週一次處理四週。四週後，收穫肝及肺組織及固定於4%多聚甲醛-PBS，pH 7.4中用於與CD68抗體之免疫組織化學。M0111與目前護理標準相比具有更大功效，如由CD68 Ab設想之患病組織中之巨噬細胞的減少所證實。

圖19A至19C為證實GCaseM6P ERT於GBAD409V小鼠模型中較伊米苷酶更好減少高歇氏儲積細胞之數目及大小的系列圖。使用護理標準伊米苷酶及於利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現之經純化之GBA進行D409A高歇氏小鼠模型中之功效研究，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體及在中性及略鹼性條件下報導更大穩定性的GBA之天然變異體。將約20週齡高歇氏小鼠用約1.5 mpk酶每週一次處理四週。四週後，收穫肝及肺組織及固定於4%多聚甲醛-PBS，pH 7.4中用於蘇木精及曙紅(H&E)染色。GCaseM6P與目前護理標準相比具有更大功效，如由CD68 Ab設想之患病組織中之巨噬細胞的減少所證實。

圖20A至20B為證實M0111 ERT於GBAD409V小鼠模型中較伊米苷酶更好減少累積之受質的一對圖。將約20週齡高歇氏小鼠用約1.5 mpk酶每週一次處理四週。收集組織樣品及均勻化用於葡糖基神經醯胺分析。於組織勻漿中測定GBA之天然受質葡糖腦苷脂之累積。顯著值為肺中之GC之累積，其為目前護理標準之已知未滿足的需求。1).將20 µL樣品、校準標準、品質控制、稀釋品質控制、單空白及雙空白樣品之等分試樣添加至96孔板中；2).將各樣品(除了雙空白外)各自用200 µL IS中止(將雙空白樣品用200 µL甲醇/ACN/H₂ O (v:v:v=85:10:5)中止)，及然後將混合物在800 rpm下渦流混合5分鐘及在3220 g (4000 rpm)，4℃下離心15分鐘；3).將50 µL上清液用氮氣乾燥及用甲醇/ACN/H₂ O (v:v:v=85:10:5)再懸浮，及然後全部渦流5分鐘，及直接注射經稀釋之溶液用於LC-MS/MS分析。針對量測之兩種神經醯胺，經M0111處理之動物於ERT療法後較伊米苷酶具有更低含量。

圖21A至21D為顯示AAV介導之基因療法用於治療高歇氏病之活體內研究之結果的系列圖。為測定AAV9基因療法之效應，利用具有兩種不同啟動子之穩定GBA + S1S3 Pt’ase之雙順反子表現轉殖基因。將20週齡GBAD409V小鼠用適度劑量之AAV9-穩定GBA+S1S3PT’ase，5E11 vg給藥。為測定多少GBA由組織產生，於AAV9注射2週後，將組織回收、均勻化及使用4MU-Glc受質測活性。將活性標準化至勻漿中之總蛋白質，如由針對蛋白質測定之BCA方法所測定。

圖22A至22C為描述使用α-甘露糖苷儲積症作為ERT之活體外研究之結果的系列圖。

圖23A至23B為描述M0611 LAMAN酶表現、純化及表徵之照片及對應數據表。將LAMAN之兩個製劑於利用或不利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體。二者藉由利用HPC4標籤純化。磷酸化之顯著增加藉由量測以劑量依賴性方式友好結合至經固定之陽離子獨立性甘露糖6-磷酸受體之LAMAN的量來證實。所結合之LAMAN之量係基於使用其合成受質4-甲基傘形基-α-D-哌喃甘露糖苷(4MU-Man)之其活性。經由磷酸化寡醣結合之特異性藉由添加之甘露糖6-磷酸阻斷結合之能力來證實。值得注意的是甚至在存在M6P下MO611結合受體之能力。選擇來自批次P-0030之M0611及來自批次P-0031之LAMAN用於活體內動物研究。

圖23C為描述M0611 LAMAN酶表現、純化及表徵之圖。將LAMAN之兩個製劑於利用或不利用雙順反子載體之Expi293細胞中短暫共同表現，該雙順反子載體編碼N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶(Pt’ase)之S1S3變異體。二者藉由利用HPC4標籤純化。磷酸化之顯著增加藉由量測以劑量依賴性方式友好結合至經固定之陽離子獨立性甘露糖6-磷酸受體之LAMAN的量來證實。所結合之LAMAN之量係基於使用其合成受質4-甲基傘形基-α-D-哌喃甘露糖苷(4MU-Man)之其活性。經由磷酸化寡醣結合之特異性藉由添加之甘露糖6-磷酸阻斷結合之能力來證實。值得注意的是甚至在存在M6P下MO611結合受體之能力。選擇來自批次P-0030之M0611及來自批次P-0031之LAMAN用於活體內動物研究。

圖24A至24B為證實於用於酶替代療法之野生型小鼠中之α-甘露糖苷儲積症之生物分佈的一對圖。為評價LAMAN與與S1S3 PT’ase共同表現之LAMAN之間之組織攝取的差異，將2 mg/kg之各製劑經由尾靜脈注射至野生型小鼠(n=4)。於給藥2及8小時後，將組織回收、均勻化及使用4MU-Man受質量測活性。將活性標準化至勻漿中之總蛋白質，如由針對蛋白質測定之BCA方法所測定。於組織攝取數據中觀察到M0611 (與S1S3 PT’ase共同表現之LAMAN)之優點。針對肝、脾、心、肺及腦，在2小時時於組織中存在更大活性。此趨勢在8小時時亦真，除了肺外。此可為於此組織之分析中觀察到之高變化的結果。此觀察之唯一例外為腎。自所有樣品減去內源性LAMAN活性。於利用吾人LAMAN酶M0611注射之小鼠之大多數組織中檢測到更高LAMAN酶活性。

圖25A至25B為證實於用於酶替代療法之野生型小鼠中之α-甘露糖苷儲積症之生物分佈的一對圖。為評價LAMAN與與S1S3 PT’ase共同表現之LAMAN之間之組織攝取的差異，將10 mg/kg之各製劑經由尾靜脈注射至野生型小鼠(n=4)。於給藥2及8小時後，將組織回收、均勻化及使用4MU-Man受質量測活性。將活性標準化至勻漿中之總蛋白質，如由針對蛋白質測定之BCA方法所測定。於組織攝取數據中觀察到M0611 (與S1S3 PT’ase共同表現之LAMAN)之優點。針對肝、脾、心、肺及腦，在2小時時於組織中存在更大活性。此趨勢在8小時時亦真，除了肺外。此可為於此組織之分析中觀察到之高度變化的結果。此觀察之唯一例外為腎。

圖26A至26B為描述用於黏脂儲積症基因療法(GTx)之AAV9設計及活體外測試的示意圖及圖表。將293T細胞用各種M0021病毒轉導及培養2天，之後進行PTase活性分析。

圖27A至27B為證實M0021治療減少ML II小鼠中之血清溶酶體酶含量的一對圖。描述一隻34週齡雌性ML II小鼠，其接受4E11 vg/小鼠之AAV9用於4週表現。檢查血清酶活性。為測定S1S3 Ptase基因療法之效應，將34週齡雌性小鼠用適度劑量之AAV9-S1S3 PT’ase，4e12 vg (2e13 vg/kg)給藥。ML2之表現型中之一者為溶酶體酶之升高之血清含量，由於其不能經靶向至細胞內中溶酶體。當於接受該療法正好4週後存在血清中之LAMAN及ManB活性之減少時，觀察到鼓舞人心的結果。此結果係重要的，因為其證實實現MLII小鼠模型之所述表現型之能力。

圖28A至28C為證實M0021治療增加ML II中之溶酶體酶之磷酸化的系列圖。為進一步瞭解對S1S3Ptase基因療法在減少LAMAN及ManB之血清活性方面之影響，使用較早所述之固定化受體結合分析評價血清中發現之酶之CIMPR結合。簡言之，以漸增之量添加已知活性至固定化CIMPR。洗掉未結合之酶及使用適宜合成受質ManB (4-甲基傘形基-α-D-哌喃甘露糖苷(4MU-Man))，LAMAN (4MU-Man)量測剩餘結合之物質酶。ML II小鼠中之AAV9-S1S3基因療法增加溶酶體酶之磷酸化。血清中之總磷酸化之溶酶體酶經恢復至正常水平或更多。

圖29A至29C為描述於高歇氏小鼠中注射AAV9-hTLV-GBA-S1S3基因療法2週後肺及肝中之酶活性之定量的系列圖。AAV9-hTLV-GBA-S1S3原本被稱作AAV9-hTLV-GBA^M6P ，其中該M6P表示S1S3構築體。

Claims (64)

1. 一種包含載體之組合物，該載體包含編碼啟動子之序列、編碼溶酶體酶之第一多核苷酸及編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶(GlcNAc-1 PTase)之第二多核苷酸，其中該啟動子能驅動哺乳動物細胞中之表現且其中該啟動子以可操作方式連接至該第一多核苷酸及該第二多核苷酸。
2. 如請求項1之組合物，其中該載體進一步包含編碼內部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site；IRES)之序列。
3. 如請求項2之組合物，其中編碼該IRES之序列定位於編碼該溶酶體酶之序列與編碼該經修飾之GlcNAc-1 PTase之序列之間。
4. 如請求項2或3之組合物，其中自5’至3’，該載體包含編碼該經修飾之GlcNAc-1 PTase之序列、編碼該IRES之序列及編碼該溶酶體酶之序列。
5. 如請求項2或3之組合物，其中自5’至3’，該載體包含編碼該溶酶體酶之序列、編碼該IRES之序列及編碼該經修飾之GlcNAc-1 PTase之序列。
6. 如請求項1之組合物，其中該載體進一步包含編碼裂解位點之序列。
7. 如請求項6之組合物，其中該裂解位點包含編碼2A自裂解肽之序列。
8. 如請求項1至7中任一項之組合物，其中該載體為表現載體。
9. 如請求項1至7中任一項之組合物，其中該載體為遞送載體。
10. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中該載體為非病毒載體。
11. 如請求項1至10中任一項之組合物，其中該載體為病毒載體。
12. 如請求項11之組合物，其中該載體為慢病毒載體。
13. 如請求項11之組合物，其中該載體為腺病毒載體或腺相關病毒(adeno-associated viral；AAV)載體。
14. 如請求項13之組合物，其中該AAV載體包含選自由以下組成之群之血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。
15. 如請求項13或14之組合物，其中該AAV載體包含編碼衣殼的序列，該衣殼分離或衍生自選自由以下組成之群之血清型中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。
16. 如請求項13至15中任一項之組合物，其中該AAV載體包含編碼至少一個末端反向重複序列(inverted terminal repeat；ITR)的序列，該ITR分離或衍生自選自由以下組成之群之血清型中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。
17. 如請求項1至16中任一項之組合物，其中該載體為雙順反子載體。
18. 如請求項1至16中任一項之組合物，其中該載體為多順反子載體。
19. 如請求項1至19中任一項之組合物，其中該啟動子包括構成性啟動子。
20. 如請求項20之組合物，其中該構成性啟動子包括巨細胞病毒(Cytomegalovirus；CMV)啟動子。
21. 如請求項1至2中任一項之組合物，其中該載體包含SEQ ID NO: 1之核酸序列。
22. 如請求項1至21中任一項之組合物，其中該編碼經修飾之GlcNAc-1磷酸轉移酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 4之核酸序列。
23. 如請求項1至21中任一項之組合物，其中該溶酶體酶涉及如表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體儲積症(lysosomal storage disorder；LSD)。
24. 如請求項24之組合物，其中該溶酶體酶包括表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體酶。
25. 如請求項1至21或23中任一項之組合物，其中該溶酶體酶係選自由以下組成之群：β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)、半乳糖基神經醯胺酶(GALC)、α-半乳糖苷酶(GLA)、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)及溶酶體酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。
26. 如請求項1至21或23中任一項之組合物，其中該溶酶體酶包括β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。
27. 如請求項27之組合物，其中編碼該溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 5之核酸序列。
28. 如請求項1至21或23中任一項之組合物，其中該溶酶體酶包括半乳糖基神經醯胺酶(GALC)。
29. 如請求項29之組合物，其中編碼該溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 6之核酸序列。
30. 如請求項29之組合物，其中編碼該溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 23之核酸序列。
31. 如請求項1至21或23中任一項之組合物，其中該溶酶體酶包括α-半乳糖苷酶(GLA)。
32. 如請求項32之組合物，其中編碼該溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 7之核酸序列。
33. 如請求項1至21或23中任一項之組合物，其中該溶酶體酶包括α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)。
34. 如請求項34之組合物，其中編碼該溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 8之核酸序列。
35. 如請求項1至21或23中任一項之組合物，其中該溶酶體酶包括酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)。
36. 如請求項36之組合物，其中編碼該溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 9之核酸序列。
37. 如請求項1至21或23中任一項之組合物，其中該溶酶體酶包括溶酶體酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)。
38. 如請求項38之組合物，其中編碼該溶酶體酶之多核苷酸包含SEQ ID NO: 10之核酸序列。
39. 一種治療溶酶體儲積症(LSD)之方法，該方法包括向個體投與有效量之如請求項1至39中任一項之組合物，其中該組合物增加導致LSD之溶酶體酶的磷酸化，從而治療該LSD。
40. 如請求項40之方法，其中該個體呈現該LSD之徵兆或症狀。
41. 如請求項40或41之方法，其中該個體已經診斷患有該LSD。
42. 一種預防溶酶體儲積症(LSD)之發生或發作之方法，該方法包括向個體投與有效量之如請求項1至39中任一項之組合物，其中該組合物增加導致LSD之溶酶體酶的磷酸化，從而預防該個體中該LSD之發生。
43. 如請求項43之方法，其中該個體處於該LSD之發生或發作之風險中。
44. 如請求項43或44之方法，其中該個體呈現該LSD之徵兆或症狀。
45. 一種改善導致溶酶體儲積症(LSD)之溶酶體酶的磷酸化之方法，該方法包括向個體投與有效量之如請求項1至39中任一項之組合物，其中該組合物增加該溶酶體酶之磷酸化。
46. 如請求項46之方法，其中該個體呈現該LSD之徵兆或症狀。
47. 如請求項46或47之方法，其中該個體處於該LSD之發生或發作之風險中。
48. 如請求項46或47之方法，其中該個體已經診斷患有該LSD。
49. 一種改善導致溶酶體儲積症(LSD)之溶酶體酶的磷酸化之方法，該方法包括使有效量之如請求項1至39中任一項之組合物與細胞接觸，其中該組合物增加該溶酶體酶之磷酸化。
50. 如請求項43之方法，其中該細胞係於活體外或離體。
51. 如請求項43之方法，其中該細胞係於活體內。
52. 如請求項43至45中任一項之方法，其中個體包含該細胞。
53. 如請求項53之方法，其中該個體呈現該LSD之徵兆或症狀。
54. 如請求項53或54之方法，其中該個體處於該LSD之發生或發作之風險中。
55. 如請求項53或54之方法，其中該個體已經診斷患有該LSD。
56. 如請求項40至56中任一項之方法，其中該溶酶體酶涉及如表1A、表1B或表1C中所列之至少一種溶酶體儲積症(LSD)。
57. 如請求項40至56中任一項之方法，其中該溶酶體酶為如表1A、表1B或表1C中所列之至少一者。
58. 如請求項40至56中任一項之方法，其中該溶酶體酶包括β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)、半乳糖基神經醯胺酶(GALC)、α-半乳糖苷酶(GLA)、α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(NAGLU)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)及溶酶體酸性α-甘露糖苷酶(LAMAN)中之一或多者。
59. 如請求項40至49中任一項之方法，其中該投與包括全身性投與途徑。
60. 如請求項60之方法，其中該全身性投與途徑為經腸、非經腸、經口、肌肉內(IM)、皮下(SC)、靜脈內(IV)、動脈內(IA)、鞘內、脊柱內或心室內。
61. 如請求項40至49中任一項之方法，其中該投與包括局部性投與途徑。
62. 如請求項40至61中任一項之方法，其中該個體為人類。
63. 如請求項40至62中任一項之方法，其中該個體為男性。
64. 如請求項40至62中任一項之方法，其中該個體為女性。

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