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TW202217002A - 免疫抑制之治療 - Google Patents

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TW202217002A
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吉尼維弗 英賈斯皮
皮瑞尼 馬汀
史蒂芬 梁騰龍
卡瑞琳 里盧仙杜納拉
阿列克謝 埃拉切夫
查爾斯安托萬 寇佩特
奧雷利 雷
克拉麗絲 杜波依斯
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Abstract

本發明係在免疫療法領域中。本發明提供包含編碼至少一具有IL-7活性之多肽之核酸分子的非繁殖病毒載體，其中該非繁殖病毒載體係用於治療敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制。

Description

免疫抑制之治療
發明領域
本發明係在免疫療法領域中。本發明提供包含編碼至少一多肽之核酸分子之病毒載體，該等病毒載體係用於治療免疫抑制。更精確而言，本發明之病毒載體為非繁殖病毒載體，多肽具有IL-7活性，且免疫抑制係由敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發。本發明特別適用於治療敗血症誘發之免疫抑制。
發明背景
免疫抑制(immunodepression) (亦稱為免疫抑制(immunosuppression)或免疫麻痺(immunoparalysis))為免疫反應之暫時性或永久性功能障礙狀態。其係由對免疫系統之損害造成，導致對致病原(disease agent)之易感性增加且將患者置於較高的感染、敗血症及後續死亡風險下。各種功能障礙係與影響宿主防禦之特異性組分及非特異性組分之免疫抑制狀態相關，該等免疫抑制狀態包括免疫效應細胞活性異常、免疫刺激T細胞活化減少、抑制T細胞功能增強及細胞介素含量更改。
多份文件顯示敗血症、創傷、大手術、燒傷、衰老及冠狀病毒誘發之免疫抑制之間的類似性，該免疫抑制包括在患有創傷及敗血症之患者中誘發單核球增多症及單核球表面上HLA-DR少(Heftrig等人, 2017, Mediat Inflamm, 文章ID 2608349)、在衰老期間及手術或創傷後促炎性細胞介素(例如TNFα、IL-6及IL-8)大量產生(Jia等人, 2019, Eur J Trauma Emerg S, https://doi.org/10.1007/s00068-019-01271-6 ；Kovac等人, 2005, Exp Gerontol., 40(7):549-55)、患有敗血症、燒傷或創傷之患者血漿中IL-10含量持續升高(Thomson等人, 2019, Military Medical Research, 6:11)以及對於患有創傷及冠狀病毒之患者，影響所有淋巴球子集之重度淋巴球減少症、mHLA-DR減少及血漿細胞介素含量適當地增加，該細胞介素同時顯示發炎性反應(IL-6)及免疫抑制性反應(IL-10) (Monneret等人, 2020, Intensive Care Med, 46:1764-1765)。
敗血症經定義為由對感染之失調宿主反應造成之危及生命的器官功能障礙，且死亡率保持高。如今，敗血症係加護病房中之主要死亡原因且經宣告為全球健康首要任務：採用改進敗血症之預防、診斷及管理之解決方案(Venet及Monneret, 2017, Nat Rev Nephrol., 14(2):121-137)。
在敗血症中，促炎性介體之釋放誘發血液動力學不穩定性、末梢器官功能障礙及凝聚異常(Meisel等人, 2009, Am J Respir Crit Care Med., 180(7):640-8)。因此，直至數年，臨床試驗集中於阻止敗血症病程初期之發炎以便抑制宿主免疫系統反應。然而，阻止發炎未能改善敗血症結果(Hamers等人, 2015, Minerva Anestesiol., 81(4):426-439)。以下已變得明顯可見：相當大比例之敗血症患者並不死於難以抵擋的免疫反應且抑制免疫系統在經應用於所有敗血症患者時不為有效策略(Peters van Ton等人, 2018, Front Immunol, 9: 1926)。
進行研究以便理解敗血症生理病理學且減少敗血症相關死亡。似乎，敗血症期間及之後的宿主免疫反應極其複雜：其隨時間推移而變化，且伴隨地存在促炎性機制及抗炎性機制，且其無法恢復至體內恆定(Venet及Monneret, 2017, Nat Rev Nephrol., 14(2):121-137)。亦似乎，敗血症相關死亡大部分歸因於稱為敗血症誘發之免疫抑制、敗血症相關免疫抑制或敗血症相關免疫麻痺的免疫系統之極度抑制狀態而非初始高炎狀態(Hamers等人, 2015, Minerva Anestesiol., 81(4):426-439)。
敗血症誘發之免疫抑制之特徵在於先天性及適應性免疫反應受損，該先天性及適應性免疫反應受損包括細胞凋亡以及CD8+及CD4+淋巴球功能障礙增強、吞噬細胞功能受損、單核球性去活化伴II類HLA表面表現減少以及離體細胞介素產生更改(Meisel等人, 2009, Am J Respir Crit Care Med., 180(7):640-8)。
許多患者在敗血症之初始高炎階段存活，但在免疫抑制狀態時死亡。免疫抑制使敗血性患者更易受繼發性機會性感染、潛伏感染再活化(Hamers等人, 2015, Minerva Anestesiol., 81(4):426-439)及共生病症(例如惡性疾病、心血管疾病、糖尿病、腎功能衰竭、呼吸道機能不全等)影響。
似乎，與敗血症相關之累積死亡率在第一週之後為10% (初期死亡率)、在敗血症之後28天在20%與40%之間(延遲死亡率)及在敗血症之後3年在50%與70%之間(長期死亡率) (Venet及Monneret., 2017, Nat Rev Nephrol., 14(2):121-137)。
因此，評估旨在刺激免疫功能之新穎治療策略對患有敗血症誘發之免疫抑制之患者的治療(Venet及Monneret., 2017, Nat Rev Nephrol., 14(2):121-137)，其中對以免疫調節為主之方法研發之關注不斷增長。
就此而言，測試多種免疫刺激分子：將GM-CSF、IFNγ、抗PD-1及抗PD-L1投與至受敗血症免疫抑制之患者，且在動物模型中用如細胞凋亡抑制劑之試劑進行初步研究。然而，儘管在少數經治療患者或動物中觀測到對免疫系統有一些作用(例如單核球性免疫能力恢復、促炎性細胞介素產生增強、T細胞及NK細胞存活延長或對細胞凋亡之強效抑制)，但該等結果在大型臨床試驗時未受證實(Peters van Ton等人, 2018, Front Immunol, 9; 1926)。
介白素-7對適應性免疫系統之發展及體內恆定十分重要(Shindo等人, 2015; 43(4): 334-343)。因此，提議IL-7用於旨在改進淋巴球減少症之後的T細胞復原之療法(Ponchel等人, 2011, Clinica Chimica Acta 412, 7-16)。在超過390位腫瘤及淋巴球減少患者中之臨床試驗顯示，IL-7係安全的且增加CD4+及CD8+淋巴球計數(François等人, 2018, JCI Insight.;3(5):e98960)。
進行臨床前研究及臨床研究以評估IL-7恢復敗血症誘發之免疫抑制狀態時之免疫功能的能力。重組IL-7之潛在治療作用首次在二個相關敗血症動物模型中經研究，該等模型各別地為盲腸結紮及穿孔(CLP)誘發之鼠類腹膜內腹膜炎模型(Unsinger等人, 2010, J Immunol; 184:3768-3779)及CLP、接著為白色念珠菌( Candida albicans)感染之雙擊敗血症模型(Shindo等人, 2015 Shock. ; 43(4): 334-343)。認為此後一模型模擬患有繼發性院內真菌感染(真菌生物體為許多加護病房中之血流感染之第三至第四最常見原因)之患拖延性敗血症患者之受損免疫狀態。二個特徵在於長循環半衰期之rhIL-7用於此等研究中：經抗IL-7抗體穩定之rhIL-7 (R&D System)及完全人類化之醣化低免疫原性rhIL-7 (稱為CYT-107，由Cytheris, Rockville, MD研發)。Unsinger報導，二個rhIL-7均改善咸信對敗血症之致死性有主要責任之許多關鍵病理生理過程，該改善包括敗血症誘發之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞耗乏逆轉、免疫效應細胞(例如淋巴球)向經感染部位之募集增強及IFNγ生產恢復以及在CLP後48小時內經2次或3次rhIL-7投與治療之動物存活改進(Unsinger等人, 2010, J Immunol; 184:3768-3779)。
相比之下，Shindo等人在雙擊敗血症模型(CLP、接著為白色念珠菌)中報導，在白色念珠菌注射之後24小時開始連續5天皮下投與CYT-107之後，對小鼠存活無作用(Shindo等人, 2015 Shock. 43(4): 334-343)。
在自敗血性患者收集且與rhIL-7一起培育之PBMC上進行之離體分析確認IL-7恢復敗血症誘發之淋巴球更改的能力(Venet等人, 2012, J Immunol November 15, 189 (10) 5073-5081)。
最近，在患有敗血性休克及重度淋巴球減少症之患者中臨床上研究rhIL-7治療。二十七位患者經由肌內途徑接受至多8次CYT-107 rhIL-7注射達4週。重組IL-7具有良好耐受性而無誘導細胞介素風暴或使發炎或器官功能障礙惡化之跡象，但具體而言，在注射部位觀測到1-3級疹。rhIL-7引起絕對淋巴球計數增加以及循環CD4+ T細胞及CD8+ T細胞增多，且增加T細胞增殖及活化。然而，與經安慰劑治療之患者相比，rhIL-7治療並不改進死亡率(François等人, JCI Insight. 2018;3(5):e98960)。
與上文所提及之用可溶性重組rhIL-7進行，因此要求強烈穩定化以改進其循環半衰期(例如：醣化位點添加)及多次投與以提供治療作用的研究形成對比，本發明人提議以載體化IL-7為主之免疫抑制之治療。幾項用載體化免疫調節劑進行之研究已在敗血症誘發之免疫抑制領域中進行。特定而言，Chen等人在盲腸結紮及穿孔(CLP)之後的小鼠中局部或全身投與編碼腫瘤壞死因子(TNF)之腺病毒(Ad)，且伴隨地用綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)攻擊小鼠。Ad TNF之局部投與顯著地改進小鼠之存活。然而，若全身投與Ad TNF，則此作用喪失且甚至逆轉：此投與途徑增加小鼠死亡(Chen等人, 2000, J Immunol, 165:6496-6503)。Ad TNF尚未進一步發展。
如上文所提及，數份文件顯示敗血症、創傷、大手術、燒傷、衰老及冠狀病毒誘發之免疫抑制之間的類似性。冠狀病毒為一組具備正義單股RNA基因體及具有螺旋形對稱性之核蛋白殼的包膜病毒。冠狀病毒在哺乳動物及鳥類中造成疾病：在母牛及豬中，其造成腹瀉，而在小鼠中，其造成肝炎及腦脊髓炎；在人類及鳥類中，其造成可在輕度至致死性範圍內之呼吸道感染。人類之輕度疾病包括一些普通感冒病例，而更加致死性變種可能會造成SARS、MERS及COVID-19。COVID-19為由SARS-Cov2造成之接觸性傳染病。COVID-19症狀為可變的，但常常包括發燒、咳嗽、頭痛、疲勞、呼吸困難以及嗅覺及味覺喪失。在先前所描述之COVID-19中之免疫更改之前，患者均勻地呈現重度淋巴球減少症：淋巴球計數已與COVID-19之疾病嚴重程度增加相關，此係因為死於COVID-19之患者經報導與存活者相比已具有明顯地較低之淋巴球計數。
Monneret等人在進入加護病房之COVID-19患者中在前15天內進行免疫監測。此研究顯示，對SARS-CoV-2感染之免疫反應展現與細菌敗血症中之免疫抑制之延遲階段的類似性，該細菌敗血症中之免疫抑制之延遲階段包括影響所有淋巴球子集之重度淋巴球減少症、mHLA-DR減少及血漿細胞介素含量適當地增加，該細胞介素同時顯示發炎性反應(IL-6)及免疫抑制性反應(IL-10)。此等觀測結果強調在進入加護病房之後COVID-19期間之持續免疫抑制的潛在問題(Monneret等人, 2020, Intensive Care Med, 46:1764-1765)。已測試許多針對COVID-19之治療，但其中各者均尚未給予令人滿意的結果。此處，本發明人提議以載體化IL-7為主之免疫抑制之治療。 技術問題
就不存在用於治療敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制之醫療解決方案而言，吾人可預期該等免疫抑制將繼續為嚴重的全球健康威脅。
因此，為了恢復該等免疫抑制患者之免疫功能，存在強烈的醫療需求，從而引起相關死亡減少。更特定而言，需要用於治療該等病況之IL-7多肽之替代物。
在本發明之上下文中，本發明人發現經工程改造以表現IL-7之非繁殖病毒載體為IL-7多肽之替代物，其對免疫系統恢復具備有前景的作用。
出乎意料地，似乎該等非繁殖病毒載體之單次投與誘導受試者內足以恢復與脾細胞數目及活化增加相關之功能性免疫的IL-7濃度以及原始小鼠中脾及胸腺中之免疫細胞之經改進的Bcl2表現。在CLP模型中，該等非繁殖病毒載體之投與誘導正常脾細胞計數之恢復及至少部分地T細胞計數之恢復、血液免疫細胞計數之改進、脾、肺及血液中數個免疫細胞群體之活化、T細胞功能性之加強、能夠在IFNγ、TNFα及IL2等當中尤其產生TNFα、IL2或2或3細胞介素之細胞之頻率加強。此外，在CLP模型中，該等非繁殖病毒載體之投與顯著地延長宿主存活，此指示病毒載體與經表現IL-7對免疫系統之組合作用可誘導免疫恢復。在COVID患者、衰老創傷患者、ICU創傷患者及ICU重大手術患者中，該等非繁殖病毒載體誘導STAT5之磷酸化及/或T細胞功能性之加強，此亦在此等模型中指示病毒載體與經表現IL-7對免疫系統之組合作用可誘導免疫恢復。
此外，由於原位載體介導之IL-7生產，吾人亦可預期該載體將解決IL-7多肽所遇到之問題。吾等之候選物可提高患者順應性，伴隨例如減少治療投與次數。其亦可提高治療安全性，從而降低與重複注射有關之感染風險。
技術問題係藉由提供如申請專利範圍中所定義之實施例來解決。
本發明之其他及另外態樣、特點及優點將自本發明之當前較佳實施例之以下描述顯而易見。
發明概要
本發明之一個態樣係關於包含編碼至少一具有IL-7活性之多肽之核酸分子的非繁殖病毒載體，其中該非繁殖病毒載體係用於治療敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發(亦即本文所引用之免疫抑制之誘發物中之任一者或其任何組合誘發)之免疫抑制。
在一個實施例中，用於本發明中之非繁殖病毒載體為選自由以下組成之群之載體：痘病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、水皰性口炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰白質炎病毒、馬拉巴病毒(Maraba Virus)及病毒樣粒子。
在再另一實施例中，用於本發明中之非繁殖病毒載體編碼至少一選自由以下組成之群之多肽：鼠類IL-7、人類IL-7、與Fc (用於可結晶片段之Fc)域融合之鼠類IL-7及與Fc域融合之人類IL-7。
在另一態樣中，本發明亦提供包含非繁殖病毒載體及可接受之醫藥媒劑的組合物。在一個實施例中，非繁殖病毒載體或其組合物係用於治療敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發(亦即本文所引用之免疫抑制之誘發物中之任一者或其任何組合誘發)之免疫抑制。在另一實施例中，其組合物係經由靜脈內、皮下、經黏膜或肌內途徑投與。
在再另一實施例中，與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，該非繁殖病毒載體或組合物係用於增強投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之功能性先天性及/或適應性免疫。在另一實施例中，與投與該非繁殖病毒載體或組合物之前的該受試者之免疫反應相比，該非繁殖病毒載體或組合物係用於增強投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之功能性先天性及/或適應性免疫。
在一較佳實施例中，與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，該使用增加投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之選自由CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞、NKT細胞、NK細胞、樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞及嗜中性球組成之群之至少一種類型的免疫相關細胞的含量。在另一實施例中，與投與該非繁殖病毒載體或組合物之前的該受試者之免疫相關細胞之含量相比，該使用增加投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之選自由CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞、NKT細胞、NK細胞、樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞及嗜中性球組成之群之至少一種類型的免疫相關細胞的含量。
在另一較佳實施例中，與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，該使用增加投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之選自由經活化CD4 T細胞、經活化CD8 T細胞、經活化B細胞、經活化NK細胞、單核球及巨噬細胞組成之群之至少一種類型的經活化及/或成熟免疫相關細胞的含量或百分比。在另一實施例中，與投與該非繁殖病毒載體或組合物之前的該受試者之經活化免疫相關細胞之含量相比，該使用增加投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之選自由經活化CD4 T細胞、經活化CD8 T細胞、經活化B細胞、經活化NK細胞、單核球及巨噬細胞組成之群之至少一種類型的經活化及/或成熟免疫相關細胞的含量或百分比。
在另一實施例中，向展現與免疫相關細胞含量及/或經活化免疫相關細胞含量減少相關之一或多種生物標記物之受試者投與所使用之非繁殖病毒載體或組合物。
在另一態樣中，本發明亦提供用於治療有需要之受試者之敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發(亦即本文所引用之免疫抑制之誘發物中之任一者或其任何組合誘發)之免疫抑制的方法，該方法包含一或多次投與如本文所描述使用之非繁殖病毒載體或組合物。
較佳實施例之詳細說明
本文提供將輔助對本發明之理解的許多定義。然而，除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術人員通常所理解之含義相同之含義。本文所引用之所有參考文獻均以全文引用之方式併入。 一般定義
如整個申請案通篇所使用，除非上下文另外清楚地指示，否則術語「一(a/an)」以其意謂「至少一個」、「至少第一個」或「多個」所提及組分或步驟之意義使用。舉例而言，術語「非繁殖病毒載體」包括多個非繁殖病毒載體，包括其混合物。
術語「一或多個」係指一個或大於一個之數目(例如2個、3個、4個、5個等)。
本文各處所使用之術語「及/或」包括含義「及」、「或」以及「由該術語連接之要素之全部或任何其他組合」。舉例而言，「先天性及/或適應性免疫系統」意謂先天性免疫系統或適應性免疫系統或先天性免疫系統及適應性免疫系統。
如本文所使用，當用於定義產物、組合物及方法時，術語「包含(comprising)」(及諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」之包含(comprising)之任何形式)、「具有(having)」(及諸如「具有(have)」及「具有(has)」之具有(having)之任何形式)、「包括(including)」(及諸如「包括(includes)」及「包括(include)」之包括(including)之任何形式)或「含有(containing)」(及諸如「含有(contains)」及「含有(contain)之含有(containing)之任何形式」為開放的且不排除額外未列出之要素或方法步驟。「由……組成」意謂排除具有任何必要意義之其他組分或步驟。因此，由所敍述組分組成之組合物將不排除痕量污染物及醫藥學上可接受之載劑。
在本發明之上下文內，術語「核酸」、「核酸分子」、「多核苷酸」及「核苷酸序列」可互換使用且定義多去氧核糖核苷酸(DNA) (例如cDNA、基因體DNA、質體、載體、病毒基因體、經分離DNA、探針、引子及其任何混合物)或多核糖核苷酸(RNA) (例如mRNA、反義RNA、SiRNA)或混合多核糖-多去氧核糖核苷酸的任何長度之聚合物。其涵蓋單股或雙股、線性或環形、天然或合成、經修飾或未經修飾之多核苷酸。
術語「多肽」應理解為經由肽鍵鍵結之至少九個胺基酸殘基之聚合物，此與其尺寸及轉譯後組分(例如醣化)之存在或不存在無關。對多肽中所包含之胺基酸之最大數目不施加限制。作為一般指示，該術語係指短聚合物(通常在此項技術中稱為肽)及較長聚合物(通常在此項技術中稱為多肽或蛋白質)。此術語尤其涵蓋天然多肽、經修飾之多肽(亦稱為衍生物、類似物、變異體或突變體)、多肽片段、多肽多聚體(例如二聚體)、融合多肽。該術語亦指由編碼該多肽之多核苷酸序列表現之重組多肽。通常而言，此涉及藉由遞送有多核苷酸序列之細胞之核糖體機制將編碼核酸轉譯為mRNA序列及其轉譯體。
術語「一致性」係指二個多肽或核酸序列之間的胺基酸與胺基酸或核苷酸與核苷酸對應關係。二個序列之間的一致性百分比隨該等序列共用之一致位置數目而變，此考慮到需要經引入以用於整體最佳比對之空隙數目及各間隙長度。此項技術中可獲得用於測定胺基酸序列之間的一致性百分比之各種電腦程式及數學演算法，諸如在Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed, 1981, 增刊, 3: 482-9)中之NCBI或ALIGN處可獲得之Blast程式。用於測定核苷酸序列之間的一致性之程式亦可在專用資料庫(例如Genbank、Wisconsin序列分析套裝、BESTFIT、FASTA及GAP程式)中獲得。熟習此項技術者可確定適用於量測比對之參數，該等參數包括在要被比較之序列上達成最大比對所需之任何演算法。出於說明之目的，「至少80%一致性」意謂80%一致性或更高一致性(81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)，而「至少90%一致性」意謂90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，且「至少95%一致性」意謂95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
術語「獲自」、「起源(originating/originate)」及其任何等效術語係用於識別組分(例如多肽、核酸分子、病毒、載體等)之原始來源，但不意欲限制藉以製造組分之方法，該方法可例如藉由化學合成或重組手段進行。
如本文所使用之術語「宿主細胞」應在無任何關於組織、器官或經分離細胞中之特定組織化之限制之情況下加以廣泛地理解。該等細胞可屬於諸如經培養細胞株、原代細胞及分裂細胞的獨特類型之細胞或一組不同類型之細胞。此術語亦包括可為或已為用於本發明中之非繁殖病毒載體之受體的細胞以及該等細胞之後代。
術語「受試者」一般指本文所描述之任何非繁殖病毒載體、組合物及方法為其所需或可對其有益之生物體。通常而言，生物體為哺乳動物，尤其為選自由以下組成之群之哺乳動物：家畜、農畜、運動型動物及靈長類動物。較佳地，受試者為已經診斷為患有免疫抑制或處於患有免疫抑制之風險下的人類。術語「受試者」及「患者」在提及人類生物體時可互換使用且涵蓋男性及女性。要被治療之受試者可為新生兒、嬰兒、青壯年、成年人或老年人。
如本文所使用之術語「治療(treatment)」(及諸如「治療(treating)」、「治療(treat)」之治療(treatment)之任何形式)涵蓋防治(例如處於患有要被治療且由敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制之風險下的受試者中的預防性措施)及/或療法(例如在經診斷為患有敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制之受試者中)以及任擇的習知治療性儀器治療。治療結果為減緩、治癒、改善或控制免疫抑制之發展。舉例而言，若在投與如本文所描述之非繁殖病毒載體之後，受試者顯示其先天性及/或適應性免疫或免疫反應之可觀測改進及/或恢復，則受試者之敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制得到成功治療。
如本文所使用之術語「先天性免疫」或「非特異性免疫」係指針對外來病原體之非特異性第一道防線。該先天性免疫係由包含樹突狀細胞(DC)、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球及肥胖細胞之細胞介導。如皮膚、胃酸及血流中之化學物質之防禦機制之其他要素亦為先天性免疫之一部分。
如本文所使用之術語「適應性免疫」或「特異性免疫」係指由B淋巴球、CD4+輔助T淋巴球、表現抗原特異性受體之CD8+細胞毒性T淋巴球及自然殺手(NK)細胞介導之病原體特異性免疫。該適應性免疫產生記憶體且允許靈活且寬廣的反應組庫。
如本文所使用之術語「投與(administering)」(或諸如「投與(administered)」之投與(administration)之任何形式)係指向受試者遞送諸如本文所描述之非繁殖病毒載體之防治劑或治療劑。
如本文所使用之術語「組合」或「聯合」係指各種組分(例如如本文所描述之非繁殖病毒載體及一或多種有效改進先天性及/或適應性免疫或免疫反應之物質)之任何可能性排列。此類排列包括用於伴隨或依序投與之該等組分混合物以及單獨組合。本發明涵蓋包含相等莫耳濃度之各組分之組合以及具有極不同濃度之各組分之組合。應瞭解，該組合之各組分之最佳濃度可由熟習此項技術者確定。
本發明之一個態樣係關於包含編碼至少一具有IL-7活性之多肽之核酸分子的非繁殖病毒載體，其中該非繁殖病毒載體係用於治療敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制。 病毒載體
術語「病毒載體」、「病毒」、「病毒體」、「病毒粒子」及「病毒載體粒子」可互換用於指在根據允許生成病毒粒子之合適條件將基因體核酸轉導至適當細胞或細胞株中時形成之病毒粒子。
術語「非繁殖病毒載體」係指不能在宿主細胞或組織中繁殖之病毒載體。此等病毒載體可為複製缺陷型或複製受損型載體(例如基因上失能之病毒載體)，此意指其無法在正常細胞中，尤其在正常人類細胞中複製達到任何顯著程度，從而阻礙病毒載體繁殖。複製功能之減損或缺陷可藉由習知手段，諸如藉由量測非容許細胞中之DNA合成及/或病毒力價來加以評估。病毒載體可藉由對病毒複製至關重要之區域之部分或總體缺失或失活而呈現為複製缺陷型的。該等複製缺陷型或受損病毒載體通常需要產生或補充缺失/受損功能之容許細胞株進行繁殖。此等病毒載體亦可為能夠在宿主經感染細胞中產生第一代病毒粒子之複製勝任型或複製選擇型載體(例如經工程改造以更好地或選擇性地在特定宿主細胞中進行複製)，但其中該第一代病毒粒子不能感染新的宿主細胞，從而阻礙病毒載體繁殖。此減損可為如DNA生產減少或減損、病毒蛋白生產減少或減損、抑制骨架組裝蛋白、不完全病毒粒子成熟、該等病毒粒子不能離開宿主細胞或進入新宿主細胞等之各種過程之結果。
適用於本發明中之病毒之代表性實例由各種不同的病毒家族(例如腺病毒科、乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、肝DNA病毒科、小核糖核酸病毒科、冠狀病毒科、絲狀病毒科、副黏液病毒科、彈狀病毒科、正黏液病毒科、沙粒病毒科、布尼亞病毒科(bunyaviridae)、反轉錄病毒科、呼腸孤病毒科、微小病毒科、黃病毒科等)生成。
在一個實施例中，用於本發明中之非繁殖病毒載體選自由以下組成之群：痘病毒、腺病毒(Ad)、腺病毒相關病毒(AAV)、水皰性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MV)、脊髓灰白質炎病毒(PV)、馬拉巴病毒(Maraba Virus)及病毒樣粒子。儘管吾人可使用野生型或天然病毒(亦即在自然界中發現)，但在本發明之上下文中，病毒樣粒子及經基因工程改造之病毒(亦即相較於該病毒之野生型病毒株而言例如藉由截短、缺失、取代及/或插入一或多個在病毒基因體內，特別地在一或多個病毒複製所需之基因中連續或不連續之核苷酸來經修飾之病毒)為較佳的。一或多種修飾可在內源性病毒基因(例如編碼序列及/或調節序列)內及/或在基因間區域內進行，從而較佳地產生經修飾之病毒基因產物。一或多種修飾可以熟習此項技術者已知之多種方式使用習知分子生物學技術進行。
較佳地，本發明所涵蓋之修飾相較於不具有該修飾之病毒載體而言影響例如病毒載體之毒力、毒性或病原性，但不完全抑制至少容許細胞中之新病毒粒子之感染及生產。該一或多種修飾較佳地引起缺陷型(或缺乏合成)蛋白之合成，該缺陷或缺乏合成使得不能確保在正常條件下由未經修飾基因產生之蛋白質之活性。其他合適修飾包括插入一或多種外源性基因(亦即，外源性意謂未在天然病毒基因體中發現)，該一或多種外源性基因諸如為如下文所描述之編碼至少一具有IL-7活性之多肽之核酸分子。
特別地適用於本發明中之非繁殖病毒載體獲自痘病毒。如本文所使用之術語「痘病毒」係指屬於痘病毒科、較佳地關於脊椎動物宿主之脊椎動物痘病毒亞科之病毒，該脊椎動物痘病毒亞科包括諸如正痘病毒、羊痘病毒、禽痘病毒、副痘病毒、野兔痘病毒及豬痘病毒之數個屬。在本發明之上下文中，正痘病毒以及包括金絲雀痘病毒(例如ALVAC)及雞痘病毒(例如FP9載體)之禽痘病毒為較佳的。各種痘病毒科之基因體之序列可在此項技術中在諸如Genbank之專用資料庫中獲得。舉例而言，痘瘡病毒株Western Reserve、Copenhagen、牛痘病毒及金絲雀痘病毒基因體可各別地以寄存編號NC_006998、M35027、NC_003663、NC_005309在Genbank中獲得。
在一較佳實施例中，用於本發明中之非繁殖病毒載體屬於正痘病毒屬且甚至更佳地屬於痘瘡病毒(VV)物種。在天然情形下，痘瘡病毒為具有編碼使得病毒能夠獨立地自宿主細胞機制複製之許多病毒酶及因子之長度為約200 kb之線性雙股DNA基因體的大型複雜的包膜病毒。存在二個不同的感染性病毒粒子，亦即由保持在經感染細胞之細胞溶質中直至溶解之單一脂質包膜包圍的胞內IMV (用於胞內成熟病毒體)及自經感染細胞分離出之雙包膜EEV (用於胞外包膜病毒體)。在本發明之上下文中，可使用包括但不限於以下之任何痘瘡病毒株：MVA (改良型痘瘡病毒Ankara)、NYVAC、Copenhagen (Cop)、Western Reserve (WR)、Wyeth、Lister、LIVP Tashkent、Tian Tan、Brighton、Ankara、LC16M8、LC16M0病毒株等及其任何衍生物。本文所使用之基因命名法為Copenhagen痘瘡病毒株之基因命名法。除非另外指示，否則該基因命名法亦在本文中用於其他痘病毒科之同源基因。然而，基因命名法可根據痘病毒株而不同，但Copenhagen與其他痘瘡病毒株之間的對應關係一般可在文獻中獲得。
可使用之具有修飾之經工程改造痘病毒旨在提高所得病毒之安全性(例如經增加之減毒)及/或功效及/或趨性。吾人亦可引用胸苷激酶(J2R；參見Weir及Moss, 1983, Genbank寄存編號AAA48082)、去氧尿苷三磷酸酶(F2L)、病毒血球凝集素(A56R)、核糖核苷酸還原酶之小亞單元(F4L)及/或大亞單元(I4L)、絲胺酸蛋白酶抑制因子(B13R/B14R)、補體4b結合蛋白(C3L)、骨架組裝蛋白(D13L)內及如K1L、C7L、A39R及B7R-B8R之基因內的缺陷性修飾。
特別地適用於本發明之上下文中之非繁殖病毒載體為MVA，此係歸因於MVA之高度減毒表現型(Mayr等人, 1975, Infection 3: 6-14；Sutter及Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-51)。出於說明之目的，MVA已經由雞胚胎纖維母細胞中之連續繼代生成。MVA基因體之序列分析顯示，MVA經由其基因體更改而損失其親本病毒絨毛膜尿囊痘瘡病毒Ankara之病原性。(Antoine等人, 1998, Virol. 244: 365-96及Genbank寄存編號U94848)。MVA已在超過十萬位個體中安全地且有效地用於天花疫苗接種。病毒在人類細胞中之複製潛能具有缺陷性，但在雞胚胎細胞中不具有缺陷性。各種蜂巢式系統可在此項技術中獲得以產生大量病毒，特別地在以蛋為主之製造製程中(例如WO2007/147528)。該MVA亦為特別地適當的，此係歸因於相較於非減毒載體而言更明顯的在感染時生成之1型IFN反應且歸因於MVA基因體之序列在文獻(Antoine等人, 1998, Virol. 244: 365-96)中及在Genbank (以寄存編號U94848)中之可獲得性。
另一特別地適用於本發明之上下文中之非繁殖病毒載體為NYVAC，此亦歸因於NYVAC之高度減毒表現型(Tartaglia等人, 1992, Virol. 188(1):217-32)。出於說明性目的，NYVAC為藉由自病毒基因體精確缺失18個開放閱讀框架(ORF)而衍生自Copenhagen疫苗病毒株之溶菌斑選殖分離株的高度減毒痘瘡病毒株。
又另一適用於本發明之上下文中之非繁殖病毒載體為經工程改造為非繁殖之痘瘡病毒且特定較佳地具有D13L缺失之Copenhagen病毒株之非繁殖痘瘡病毒。
又另一適用於本發明之上下文中之非繁殖病毒載體為較佳地源自人類或動物腺病毒(例如犬類、綿羊類、猴等)之腺病毒(Ad)。可採用任何血清型。合乎需要地，腺病毒載體源自人類腺病毒或黑猩猩腺病毒。黑猩猩Ad之代表性實例包括但不限於ChAd3 (Peruzzi等人, 2009, Vaccine 27: 1293)、ChAd63 (Dudareva等人, 2009, Vaccine 27: 3501)、AdC6、AdC7 (Cervasi等人, 2015, J. of Virology, 87(17):9420-9430；Chen等人, 2015, J. of Virology, 84(20): 10522-10532)、ChAdOx1 (Dicks等人, 2012, PLoS One.; 7(7): e40385)及此項技術中描述之黑猩猩Ad中之任一者(參見例如WO03/000283；WO03/046124；WO2005/071093；WO2009/073103；WO2009/073104；WO2009/105084；WO2009/136977及WO2010/086189)。較佳地，所使用之該非繁殖病毒載體為較佳地選自由物種A、B、C、D、E、F及G、較佳地物種B、C及D組成之群之人類腺病毒。該人類腺病毒較佳地選自由以下組成之群：血清型1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56及57，且更佳地選自由以下組成之群：血清型5、11、26及35。
複製缺陷型腺病毒可如此項技術中所描述，例如藉由缺失病毒複製所需之腺病毒基因體或其部分之至少一區、特定較佳地部分或總體缺失包含E1編碼序列之E1區(E1A及/或E1B)來獲得。本發明亦涵蓋具有腺病毒基因體(例如如作為E3區之非必需區或作為E2及E4之必需區之全部或部分區，如Lusky等人, 1998, J. Virol 72: 2022；WO94/28152；WO03/104467；Capasso等人, 2014, Viruses, 6, 832-855；Yamamoto等人, 2017, Cancer Sci 108 (2017) 831-837中所描述)內之一或多種額外缺失/修飾的病毒。在一較佳實施例中，用於本發明中之非繁殖病毒載體為E1功能缺陷型(例如參考以寄存編號M_73260揭露於GenBank中及揭露於Chroboczek等人(1992, Virol. 186:280)中之人類Ad5之序列，具有自約位置459延伸至位置3510或位置455延伸至位置3512之缺失)且在E3區內進一步缺失(例如參考同一Ad5序列，具有自約位置28591延伸至位置30469之缺失)的人類腺病毒5。 具有介白素 - 7 活性之多肽
在一個實施例中，根據本發明使用之非繁殖病毒載體包含編碼至少一具有IL-7活性之多肽之核酸分子。術語「IL-7」、「IL7」、「介白素-7」或「介白素7」在本文中可互換使用。
IL-7為在適應性免疫系統中具有重要活性之細胞介素(Gao等人, 2015, Int J Mol Sci.; 16(5): 10267-10280)。其刺激多潛能造血幹細胞分化至淋巴祖細胞中，在淋巴球且更具體而言T譜系、B譜系及自然殺手細胞之發育中在特定階段發揮重要作用。IL-7為T細胞發育及擴展所需，且為維持及恢復成熟T細胞之體內恆定所需。IL-7在各個發育階段及經由以下三個免疫調節路徑來調節T細胞體內恆定：胸腺分化、周邊擴展及胸腺外分化。IL-7亦驅動T細胞增殖且促進周邊天然及記憶T細胞之存活。為了使周邊T細胞再生，IL-7導引胸腺中之T細胞分化及成熟。IL-7在初期B細胞分化中亦至關重要，此係因為其促進向B譜系送交共同淋巴祖細胞。其亦協同轉錄因子起作用以調節祖B細胞及初期前驅B細胞階段中之免疫球蛋白基因重排。隨後，經成功地重排之細胞響應於IL-7及其他細胞介素而增殖(Vanloan等人, 2017, J. Immunol. Res., 文章ID 4807853)。
如同細胞介素之γ鏈(γc-CD132)家族之其他成員，IL-7經由與其獨特α-受體、IL-7Rα (CD127)及共同γc受體形成之三元複合物傳導信號。此相互作用刺激Janus激酶(JAK)以及信號轉導子及轉錄活化子(STAT)蛋白以及用於促進目標基因轉錄之磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)/Akt或Src路徑之後續活化。此初期路徑與IL-7之接合最終引起T細胞存活延長及增殖增加。受體於包括未成熟B細胞、初期胸腺祖細胞及大部分成熟T淋巴球之各種免疫細胞上經表現。更特定而言，此受體於大部分靜止人類T細胞上連續地表現且於天然及中樞記憶細胞上高位準表現且於T-reg上較低位準表現。IL-7R信號轉導在導引包括B細胞、T細胞及自然殺手細胞之免疫細胞之分化、增殖及存活中至關重要。
具有IL-7活性之多肽係指提供天然IL-7之免疫效應功能中之至少一者，特別地選自由以下組成之群之免疫功能中之至少一者的多肽：包括B細胞、T細胞及自然殺手細胞之免疫細胞之分化、增殖、活化及存活。具有IL-7活性之多肽之代表性實例包括天然IL-7多肽(例如天然存在之IL-7多肽)、經修飾IL-7多肽(例如經修飾IL-7、包含一或多種胺基酸修飾之天然存在之IL-7之衍生物、類似物、變異體或突變體)、IL-7多肽片段(例如經截短IL-7)、IL-7多肽多聚體(例如二聚體)、IL-7融合多肽及其類似物，其限制條件為該等多肽保持實質IL-7活性(野生型對應體之至少50%)。大量IL-7類似物可在此項技術中獲得且可用於本發明之上下文中。特別地適當之類似物包含IL-7與Fc域之融合體(IL-7-Fc)以提高IL-7之穩定性，如Seo等人, 2014 J. of Virology 88(16): 8998-9009；Choi等人, 2016, Clin Cancer Res; 22(23): 5898-5908；及Nam等人, 2010, Eur. J. Immunol., 40: 351-358中所描述。Fc域或片段可結晶域為具有與稱為Fc受體之細胞表面受體及補體系統之一些蛋白質相互作用之能力之免疫球蛋白的尾區。Fc域可源自A類(IgA)、D類(IgD)、E類(IgE)、G類(IgG)或M類(IgM)之免疫球蛋白。較佳地，選擇用於誘導低抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之Fc異型體(例如鼠類IgG1、人類IgG2)。
在一個實施例中，由用於本文中之非繁殖病毒載體編碼之IL-7具有促進受試者之先天性及/或適應性反應之能力。
IL-7可源自任何生物體，較佳地源自鼠類(NP_032397及NP_000871)、猴(例如G7PC28_MACFA、G7MZL5_MACMU)或人類(IL7RA_HUMAN)生物體。
人類IL-7基因座具有72 kb之長度，駐存於染色體8q12-13上且編碼分子量為20 kDa之177個胺基酸之蛋白質。儘管鼠類IL-7基因具有41 kb之長度，但其編碼分子量為18 kDa之154個胺基酸蛋白質。野生型鼠類IL-7及人類IL-7之初級蛋白質序列各別地以寄存編號NP_032397及NP_000871揭露於GenBank中。在天然情形下，IL-7經大量醣化且具有25 kDa之分子量。
基於本文所提供之資訊及技術人員之常識，藉由選殖、藉由PCR或藉由化學合成可容易地獲得編碼IL-7之核酸分子。用於本文中之編碼IL-7之核酸分子可為天然IL-7編碼序列(例如cDNA)或藉由突變、缺失、取代及/或添加一或多個核苷酸而衍生自後者之其類似物。此外，編碼IL-7之核酸分子可經最佳化以提供蛋白質之高位準表現及/或改進其在如下文所描述之特定宿主細胞或受試者中之存留及/或延長其半衰期。
在一較佳實施例中，用於本發明中之非繁殖病毒載體編碼選自由以下組成之群之多肽：鼠類IL-7 (mIL-7)、人類IL-7 (hIL-7)、與Fc域融合之鼠類IL-7 (mIL-7-Fc)及與Fc域融合之人類IL-7 (hIL-7-Fc)。較佳地，該鼠類IL-7包含與示於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列具有至少70%、較佳地至少80%、更佳地至少90%且甚至更佳地至少95%一致性之胺基酸序列。較佳地，該人類IL-7包含與示於SEQ ID NO: 2中之胺基酸序列具有至少70%、較佳地至少80%、更佳地至少90%且甚至更佳地至少95%一致性之胺基酸序列。較佳地，該鼠類IL-7-Fc包含與示於SEQ ID NO: 3中之胺基酸序列具有至少70%、較佳地至少80%、更佳地至少90%且甚至更佳地至少95%一致性之胺基酸序列。較佳地，該人類IL-7-Fc包含與示於SEQ ID NO: 4中之胺基酸序列具有至少70%、較佳地至少80%、更佳地至少90%且甚至更佳地至少95%一致性之胺基酸序列。密碼子可藉由技術人員熟知之技術加以最佳化以改進鼠類或人類細胞中之mIL-7、mIL-7-Fc、hIL-7或hIL-7-Fc蛋白表現。
編碼IL-7之核酸分子可經插入非繁殖病毒載體基因體中之任何位置處。MVA基因體於任何缺失I至VII中之插入、較佳地於缺失II或缺失III內之插入為特別地適當的，此後者為較佳的。如下文所描述將編碼該鼠類或人類IL-7或IL-7-Fc之核酸分子置於適當調節要素之控制下以允許其在宿主細胞或受試者中表現。於E1區中之插入特別適合於腺病毒，但亦可設想於E2區、E3區、E4區或基因間區域中之插入。如下文所描述將編碼該鼠類或人類IL-7或IL-7-Fc之核酸分子置於適當調節要素之控制下以允許其在宿主細胞或受試者中表現。較佳地，編碼IL-7或IL-7-Fc之核酸分子代替腺病毒E1區在有義方位經插入。
在一更佳實施例中，本發明係關於用於治療敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制的編碼鼠類IL-7 (例如屬於SEQ ID NO: 1)或人類IL-7 (例如屬於SEQ ID NO:2)或鼠類IL-7-Fc (例如屬於SEQ ID NO: 3)或人類IL-7-Fc (例如屬於SEQ ID NO: 4)之MVA (例如具有如先前所描述之缺失II或缺失III，較佳地具有缺失III)。 其他感興趣之分子
在一個實施例中，用於本發明中之非繁殖病毒載體進一步包含一或多個編碼至少一種感興趣之多肽之核酸分子。感興趣之多肽之實例包括細胞介素、群落刺激因子(例如GM-CSF、C-CSF、M-CSF等)、免疫刺激性多肽(例如B7.1、B7.2等)、免疫檢查點抑制劑(例如抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA4等)、能夠抑制細菌、寄生蟲或病毒感染或其發展之多肽(例如抗原多肽、抗原決定基、藉由競爭抑制天然蛋白作用之反式顯性變異體等)或在此項技術中經辨識為適用於治療敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制的任何其他感興趣之多肽。
編碼至少一具有IL-7活性之多肽及一或多種額外感興趣之多肽的核酸分子可置放於非繁殖病毒載體基因體之相同位置或不同位置中，如例如缺失II或缺失III中。該等核酸分子可包含於相同或不同表現卡匣中。在該等核酸分子包含於相同表現卡匣中之情況下，核酸分子可以任何次序置放；其亦可藉由連接子或藉由自裂解肽融合。核酸分子可在相對於所論述之區域之天然轉錄方向之有義或反義方位定位。 編碼IL -7 之 核酸分子之表現
如先前所提及，要被插入如本文所描述使用之非繁殖病毒載體之基因體中的一或多種編碼IL-7之核酸分子可經最佳化以在特定宿主細胞或受試者中提供高位準表現。實際上已觀測到，生物體之密碼子使用模式為高度非隨機的，且密碼子之使用在不同基因、細胞及宿主之間可明顯不同。因此，一或多個核酸可具有用於在高等真核細胞(例如人類)中有效表現之不當密碼子使用模式。通常而言，密碼子最佳化係藉由用一或多個編碼較頻繁使用之相同胺基酸之密碼子置換對應於在感興趣之宿主生物體中不頻繁使用之密碼子的一或多個「天然」密碼子來執行。置換對應於不頻繁使用之密碼子之所有天然密碼子不為必要的，此係因為即使在部分置換之情況下，亦可達成經增加之表現。
進一步關於密碼子使用之最佳化，宿主細胞或受試者中之表現可進一步經由核酸序列之額外修飾來加以改進。舉例而言，以下情況可能為有利的：防止存在於濃縮區域中之稀少、非最佳密碼子之聚集及/或抑制或修飾預期會負面地影響表現位準之「負」序列要素。該等負序列要素包括但不限於具有極高(＞ 80%)或極低(＜ 30%) GC含量之區域；富含AT或富含GC之序列伸長段；不穩定的直接或反向重複序列；及/或內部隱蔽調節要素，諸如內部TATA盒、嵌合位點、核糖體進入位點及/或剪接供體/受體位點。
根據本發明，所使用之非繁殖病毒載體包含具有IL-7活性之多肽在宿主細胞或受試者中之表現所需的調節要素。術語「調節要素」或「調節序列」係指允許、有助於或調節給定宿主細胞或受試者中之表現之任何要素。調節要素經排列以使得其出於其預期目的而協同起作用，例如用於啟動子以在容許宿主細胞中實現核酸分子自轉錄起始轉錄至該核酸分子之終止子中。在一較佳實施例中，用於本發明之非繁殖病毒載體包含一或多個表現卡匣，各表現卡匣包含置放於核酸分子之5'之至少一個啟動子(例如編碼具有IL-7活性之多肽)及位於該核酸分子之3'之一個多腺苷酸化序列。
熟習此項技術者應瞭解，調節序列之選擇可視諸如以下之因素而定：核酸分子本身、其中插入核酸分子之非繁殖病毒載體、要被治療之宿主細胞或受試者、所需表現位準等。啟動子具有特殊重要性。在本發明之上下文中，其可為於許多類型之宿主細胞中或對某些宿主細胞具有特異性(例如肝特異性調節序列)或響應於特定事件或外源因素(例如藉由溫度、營養添加劑、激素等)或根據病毒循環階段(例如晚期或初期)經調節之經編碼產物(例如具有IL-7、mIL-7、hIL-7、mIL-7-Fc、hIL-7-Fc活性之多肽)的構成性導向表現。吾人亦可使用在生產步驟期間響應於特定事件或外源因素而受到抑制之啟動子以便使病毒載體生產最佳化且阻止生產細胞中之一或多種經表現多肽之潛在毒性。
在目前先進技術中已知之各種啟動子可用於本發明之上下文中。痘瘡病毒啟動子特別地適用於非繁殖痘病毒載體(例如MVA)中。代表性實例包括但不限於痘瘡p7.5K、pH5R、p11K7.5 (Erbs等人, 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28)、TK、p28、p11、B2R、pF17R、pA14L、pSE/L、A35R及K1L啟動子、諸如Chakrabarti等人(1997, Biotechniques 23: 1094-7；Hammond等人, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8；以及Kumar及Boyle, 1990, Virology 179: 151-8)中所描述之合成啟動子的合成啟動子以及初期/晚期嵌合啟動子。可使用選自包含以下之清單之其他啟動子：巨細胞病毒(CMV)即刻初期啟動子(US 5,168,062)、雙向CMV啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma Virus，RSV)啟動子、腺病毒主要晚期(MLP)啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子(Adra等人, 1987, Gene 60: 65-74)、EF1α、單純疱疹病毒(HSV)-1之胸苷激酶(TK)啟動子、T7聚合酶啟動子(WO98/10088)及可誘導啟動子(例如轉錄活性係藉由存在或不存在醇、四環素、類固醇、金屬、糖等來加以調節之啟動子)。CMV啟動子特別地適用於非繁殖腺病毒載體(例如Ad5、Ad11、Ad26、Ad35)中。
所使用之非繁殖病毒載體可視要被表現之一或多個核酸分子之數目而含有一或多個啟動子。較佳地，當病毒載體編碼具有IL-7活性之多肽及另一感興趣之分子時，將編碼核酸分子中之各者置於獨立啟動子之控制下。可替代地，吾人可使用雙向啟動子。在一較佳實施例中，將編碼具有IL-7活性之多肽之核酸分子置於pH5R啟動子之控制下。
熟習此項技術者應瞭解，控制核酸表現之調節要素可進一步包含用於適當地起始、調節及/或終止以下之額外要素：轉錄(例如轉錄終止序列)、mRNA轉運(例如核定位信號序列、多腺苷酸化序列)、加工(例如剪接信號、如T2A、P2A、E2A、F2A之自裂解肽、連接子)、穩定性(例如如16S/19S或嵌合人類β球蛋白/IgG之內含子以及非編碼5'及3'序列)、轉譯(例如起始劑Met、三聯前導序列、IRES核糖體結合位點、信號肽等)；靶向序列、連接子(例如由如甘胺酸及絲胺酸之靈活殘基構成之連接子)、轉運序列、分泌信號及參與複製或整合之序列。該等序列已報導於文獻中且可容易地由熟習此項技術者獲得。 非繁殖病毒載體及生產細胞之生產
一旦用於本文中之非繁殖病毒載體生成，則其可使用習知技術產生/擴增。
通常而言，該等病毒載體係藉由包含以下步驟之方法產生：(a)將病毒載體引入合適生產細胞株中；(b)在合適條件下培養該細胞株以便允許產生/擴增該等病毒載體；(c)自該細胞株之培養物回收所產生之病毒載體；及(d)任擇地純化該等所回收之病毒載體。
生產細胞之選擇係視要被擴增之非繁殖病毒載體之類型而定。舉例而言，MVA係嚴格限定宿主的且通常在禽類細胞，亦即原代禽類細胞(諸如由獲自受精蛋之雞胚胎製備之雞胚胎纖維母細胞(CEF))或永生化禽類細胞株上擴增。適用於MVA生產之禽類細胞株之代表性實例包括但不限於經鴨TERT基因永生化之疣鼻棲鴨( Cairina moschata)細胞株(參見例如WO2007/077256、WO2009/004016、WO2010/130756及WO2012/001075)；經病毒及/或細胞基因之組合永生化之禽類細胞株(參見例如WO2005/042728)、自發地永生化細胞(例如揭露於US5,879,924中之雞DF1細胞株)或藉由自生長因子及飼養層進行漸進性斷裂而衍生自胚胎細胞之永生化細胞(例如揭露於WO2005/007840及WO2008/129058中之Ebx雞細胞株，諸如Olivier等人, 2010, mAbs 2(4): 405-15中所描述之Eb66)。
對於其他痘瘡病毒或其他痘病毒株，除了禽類原代細胞(諸如CEF)及禽類細胞株之外，包括以下之許多其他非禽類細胞株可用於生產：人類細胞株，諸如HeLa (ATCC-CRM-CCL-2 TM或ATCC-CCL-2.2 TM)、MRC-5、HEK-293；倉鼠細胞株，諸如BHK-21 (ATCC CCL-10)；及Vero細胞。在一較佳實施例中，非MVA痘瘡病毒在HeLa細胞中擴增(參見例如WO2010/130753)。
對於腺病毒且更特定而言對於E1缺失腺病毒載體，合適細胞株包括293細胞(Graham等人, 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72)以及PER-C6細胞及HER96 (例如Fallaux等人, 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-1917；WO97/00326)或此等細胞株之任何衍生物。但此項技術中所描述之任何其他細胞株亦可用於本發明之上下文中，尤其用以產生用於人類用途之產物之諸如Vero細胞、HeLa細胞及禽類細胞的任何細胞株。該等細胞可適於表現缺乏E1基因之缺陷性病毒。
生產細胞可在習知醱酵生物反應器、燒瓶及培養盤中經培養。培養可在適合於給定宿主細胞之溫度、pH及氧含量下進行。此處將嘗試不詳細地描述已知用於產生用於本發明中之非繁殖病毒載體之各種原核生物及真核宿主細胞以及方法。生產細胞較佳地使用無動物或人類來源產物之化學成分確定的培養基在不含動物或人類來源之產物之培養基中經培養。特定而言，雖然生長因子可能存在，但其較佳地以重組方式產生且不自動物物質純化。適當的無動物培養基可由熟習此項技術者視所選生產細胞而容易地進行選擇。該等培養基為市售的。特定而言，當CEF用作生產細胞時，其可在VP-SFM細胞培養基(Invitrogen)中經培養。在感染之前，生產細胞較佳地在包含於30℃與38℃之間的溫度下(更佳地在約37℃下)經培養1天與8天之間(較佳地，對於CEF，經培養1天至5天，且對於永生化細胞，經培養2天至7天)。若需要，則可進行1天至8天之數個繼代以便增加細胞總數。
由用於本發明之非繁殖病毒載體感染生產細胞株係在適當條件(特定而言，使用適當感染倍率(MOI))下進行以准許生產細胞之生產性感染。
隨後，經感染之生產細胞在熟習此項技術者熟知之適當條件下經培養直至後代病毒載體產生為止。經感染之生產細胞之培養亦較佳地在30℃與37℃之間的溫度下在不含動物或人類來源之產物之培養基(其可與用於生產細胞培養及/或用於感染步驟之培養基相同或不同) (使用無動物或人類來源之產物之化學成分確定的培養基)中執行1天至5天。
用於本發明中之非繁殖病毒載體可自培養物上清液及/或生產細胞株中收集。細胞培養物上清液及生產細胞可經彙集或分開收集。自生產細胞回收(且任擇地亦自培養物上清液回收)可需要允許使生產細胞膜破裂以允許釋放病毒載體之步驟。包括但不限於冷凍/解凍、低滲透壓溶解、音波處理、微流體化或高速均質化之各種技術可供熟習此項技術者使用。根據一較佳實施例，回收所產生之病毒載體之步驟包含溶解步驟，其中生產細胞膜較佳地藉由使用高速均質機來加以破裂。高速均質機可商購自Silverson Machines公司(East Longmeadow, USA)或Ika-Labotechnik (Staufen, Germany)。根據特別地較佳之實施例，該高速均質機為SILVERSON L4R。
隨後，用於本發明中之非繁殖病毒載體可使用此項技術中熟知之純化步驟進一步純化。可設想包括澄清、酶處理(例如核酸內切酶、蛋白酶等)、層析及過濾步驟之各種純化步驟。適當方法描述於此項技術中(例如WO2007/147528；WO2008/138533、WO2009/100521、WO2010/130753、WO2013/022764)。在一較佳實施例中，純化步驟包含可用於將病毒與其他生物分子分離、使病毒懸浮液濃縮及/或去鹽之切向流過濾(TFF)步驟。視要被過濾之體積而定，此項技術中可獲得尤其包括但不限於Spectrumlabs、Pall公司、PendoTech及New Pellicon之各種TFF系統及裝置。
隨後，用於本發明中之非繁殖病毒載體可藉由此項技術中已知之任何方法來加以保護以便延長受試者血液循環中之病毒載體存留。該等方法包含但不限於如聚乙二醇化(Tesfay等人, 2013, J. of Virology, 87(7): 3752-3759；N'Guyen等人, 2016, Molecular Therapy Oncolytics, 3, 15021)、病毒栓塞(WO2017/037523)等之化學屏蔽。 宿主細胞
在另一態樣中，本發明亦關於包含用於本發明中之非繁殖病毒載體之宿主細胞。該等宿主細胞涵蓋上文所描述之生產細胞。 病毒組合物
本發明亦關於用於治療疑似患有或經識別為患有敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發(亦即本文所引用之免疫抑制之誘發物中之任一者或其任何組合誘發)之免疫抑制之受試者的此類免疫抑制的組合物，其中該組合物包含至少一治療有效量之如本文所描述或根據本文所描述之方法製備的非繁殖病毒載體。較佳地，該組合物進一步包含醫藥學上可接受之媒劑。
「治療有效量」對應於足以產生一或多種有益結果之非繁殖病毒載體之量。此類治療有效量可隨各種參數而變化，該等參數例如為投與模式、疾病狀態、受試者之年齡及體重、受試者對治療起反應之能力、並行治療之種類及/或治療頻率。病毒載體之適當劑量可常規地由醫師鑒於相關情形而確定。適當地，視所用病毒載體之類型及定量技術而定，病毒載體之個別劑量可在自約10 3延伸至約10 12vp (病毒粒子)、iu (感染性單位)或pfu (溶菌斑形成單位)之範圍內變化。存在於樣本中之病毒載體之量可藉由常規滴定技術，例如藉由對容許細胞(例如BHK-21、CEF或HEK-293)感染後之溶菌斑數目進行計數(pfu力價)、藉由免疫染色定量免疫螢光法(例如使用抗病毒抗體) (iu力價)、藉由HPLC (vp力價)來測定。出於說明之目的，適用於非繁殖痘病毒載體之劑量包含於約10 6pfu與約10 12pfu之間、更佳地約10 7pfu與約10 11pfu之間；甚至更佳地，約10 8pfu與約10 10pfu之間(例如5 × 10 8至6 × 10 9、6 × 10 8至5 × 10 9、7 × 10 8至4 × 10 9、8 × 10 8至3 × 10 9、9 × 10 8至2 × 10 9pfu)適宜用於人類用途，其中較佳地，個別劑量包含約10 9pfu痘病毒載體。仍出於說明之目的，適用於非繁殖腺病毒載體之劑量包含於約10 6與約10 14vp之間、較佳地約10 7與約10 13vp之間、更佳地約10 8與約10 12vp之間且甚至更佳地約10 9與約10 11vp之間(例如10 9、2 × 10 9、3 × 10 9、4 × 10 9、5 × 10 9、6 × 10 9、7 × 10 9、8 × 10 9、9 × 10 9、10 10、2 × 10 10、3 × 10 10、4 × 10 10、5 × 10 10、6 × 10 10、7 × 10 10、8 × 10 10、9 × 10 10、10 11vp之劑量)。
術語「醫藥學上可接受之媒劑」意欲包括與哺乳動物且特定而言人類受試者中之投與相容之任何及所有載劑、溶劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、吸收劑及其類似物。
用於本文中之非繁殖病毒載體可獨立地置於適合於人類或動物用途之溶劑或稀釋劑中。溶劑或稀釋劑較佳為等張、低滲或微弱地高滲的且具有相對低之離子強度。代表性實例包括無菌水、生理鹽水(例如氯化鈉)、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、漢克氏溶液(Hank's solution)及其他生理學上平衡之鹽水溶液(參見例如最新版Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins)。
在其他實施例中，病毒組合物經適當地緩衝以用於人類用途。合適緩衝液包括但不限於能夠維持生理或略微鹼性之pH (例如約pH 7至約pH 9)之磷酸鹽緩衝液(例如PBS)、碳酸氫鹽緩衝液及/或Tris緩衝液。
該組合物亦可含有用於提供所需醫藥學或藥效動力學特性之其他醫藥學上可接受之賦形劑，該等特性包括例如滲透壓、黏度、透明度、顏色、無菌性、穩定性、調配物溶解速率、調節或維持向人類或動物受試者中之釋放或吸收、促進跨血液障壁之輸送或在特定器官中之滲透。
在另一實施例中，該組合物可與可溶性佐劑組合，該等可溶性佐劑包括但不限於明礬、礦物油乳液及相關化合物，該等相關化合物諸如為WO2007/147529中所描述之化合物；多醣，諸如Adjuvax及鯊烯；水包油乳液，諸如MF59；雙股RNA類似物，諸如聚(I:C)；單股胞嘧啶磷酸鹽鳥苷寡去氧核苷酸(CpG) (Chu等人, 1997, J. Exp. Med., 186: 1623；Tritel等人, 2003, J. Immunol., 171: 2358)；及陽離子型肽，諸如IC-31 (Kritsch等人, 2005, J. Chromatogr. Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 822: 263-70)。
在一個實施例中，該組合物可以提高其穩定性為目標來加以調配，特定而言在冷凍溫度(例如-70℃、-20℃)、冷藏溫度(例如4℃)或環境溫度下製造及長期儲存(亦即至少6個月、且較佳地至少二年)之條件下。呈冷凍、液體形式或凍乾形式之各種病毒調配物可在此項技術中獲得(例如WO98/02522、WO01/66137、WO03/053463、WO2007/056847及WO2008/114021等)。凍乾組合物通常藉由涉及真空乾燥及冷凍乾燥之方法獲得。出於說明之目的，包括NaCl及/或糖之緩衝調配物特別地適於病毒保存(例如S01緩衝液：342, 3 g/L蔗糖、10 mM Tris、1 mM MgCl 2、150 mM NaCl、54 mg/L Tween 80；ARME緩衝液：20 mM TRIS、25 mM NaCl、2.5% (w/v)甘油，pH 8.0)。 投與
根據本發明使用之非繁殖病毒載體或組合物可以單次劑量或多次劑量投與。若考慮多次劑量，則投與可藉由相同或不同途徑來執行且可在相同部位或在替代性部位進行且可包含呈所指示間隔之相同或不同劑量。各投與之間的間隔可為數小時至8週(例如24小時、48小時、72小時、每週、每2或3週、每月等)。間隔亦可為不規律的。亦有可能經由在休息期之後重複之連續投與循環進行(例如3至6個每週或每二週投與之循環、接著為3至6週之休息期)。各投與之劑量可在上文所描述之範圍內變化。
包括非經腸、局部或經黏膜途徑之習知投與途徑中之任一者均可應用於本發明之上下文中。非經腸途徑意欲用於以注射或輸注形式投與且涵蓋全身以及局部途徑。局部投與受限於身體之局部區域(例如腹膜內或胸膜內投與)。常見非經腸注射類型為靜脈內(至靜脈中)、動脈內(至動脈中)、皮內(至真皮中)、皮下(皮膚下)及肌內(至肌肉中)。輸注通常藉由靜脈內途徑給予。局部投與可使用經皮手段(例如貼片及其類似手段)執行。經黏膜投與包括但不限於經口/消化、鼻內、氣管內、肺內、陰道內或直腸內途徑。在一較佳實施例中，所使用之該組合物係經由非經腸途徑、更佳地經由靜脈內、皮下或肌內途徑且甚至更佳地經由靜脈內途徑投與。在另一實施例中，所使用之該組合物係經由經黏膜投與、較佳地經由鼻內或肺內途徑投與。
投與可使用習知注射器及針(例如Quadrafuse注射針)或此項技術中可獲得之能夠促進或改進受試者中病毒載體或組合物之遞送的任何化合物或裝置。
出於說明之目的，合適組合物包含個別病毒劑量之10 8pfu至10 10pfu (例如約10 9pfu)編碼人類IL-7-Fc之MVA，其較佳地藉由靜脈內途徑用於有需要之受試者(例如患有敗血症誘發之免疫抑制之受試者)。 用途及方法
本發明提供用於治療有需要之受試者之敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發(亦即本文所引用之免疫抑制之誘發物中之任一者或其任何組合誘發)之免疫抑制的如本文所描述之非繁殖病毒載體或組合物。其亦提供治療方法，該方法包含投與呈足以治療該免疫抑制之量的如本文所描述之該病毒載體或組合物。
術語「免疫抑制(immune depression/immunodepression/immune suppression/immunosuppression)」、「免疫麻痹(immune paralysis/immunoparalysis)」可互換使用。其係指免疫反應之暫時性或永久性功能障礙之狀態。其亦指身體免疫系統不能有效地工作以對抗感染及其他疾病。免疫系統之失能可為部分或完全的。
敗血症為危及生命之器官功能障礙，此係歸因於針對感染之宿主反應失調。敗血症誘發之免疫抑制可在超免疫反應之時段之後，該等超免疫反應包括細胞介素生產之強力增加。該免疫抑制之狀態危及生命，此係因為免疫防禦很大程度上不操作。
燒傷為由接觸乾熱(例如火)、濕熱(例如蒸汽或液體)、化學物質、電、雷電或輻射造成之對組織之損傷。
創傷為由外在因素造成之對活性組織之損傷。大手術為執行更大面積切除術(例如進入體腔、移除器官、更改正常解剖結構)之任何侵入性可操作程序。一般而言，若打開間葉障壁(胸腔、腹膜、腦膜)，則手術視為重大的。
衰老為年齡漸增過程，該過程發生在所有物種中且以逐漸減緩之代謝及組織分解為代表，常常伴有內分泌變化。
冠狀病毒造成不同冠狀病毒疾病，該等疾病包括重度急性呼吸症候群(SARS)、中東呼吸症候群(MERS)及冠狀病毒疾病2019 (COVID-19)。經識別之冠狀病毒包括SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV2、229E、NL63、OC43及HKU1。
敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制顯示重大類似性，伴隨例如在創傷及敗血症中誘發單核球增多症及單核球表面上HLA-DR少(Heftrig等人, 2017, Mediat Inflamm, 文章ID 2608349, 12頁)、在衰老期間及手術或創傷後促炎性細胞介素(例如TNFα、IL-6及IL-8)大量產生(Jia等人, 2019, Eur J Trauma Emerg S, https://doi.org/10.1007/s00068-019-01271-6；Kovac等人, 2005, Exp Gerontol., 40(7):549-55)或患有敗血症、燒傷或創傷之患者血漿中IL-10含量持續升高(Thomson等人, 2019, Military Medical Research, 6:11)以及對於患有創傷及冠狀病毒之患者，影響所有淋巴球子集之重度淋巴球減少症、mHLA-DR減少及血漿細胞介素含量適當地增加，該細胞介素同時顯示發炎性反應(IL-6)及免疫抑制性反應(IL-10) (Monneret等人, 2020, Intensive Care Med, https://doi.org/10.1007/s00134-020-06123-1)。
更一般而言，敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制之特徵可在於免疫細胞之細胞凋亡及/或高含量抑制淋巴球及巨噬細胞且抑制促炎性細胞介素生產之抗炎性細胞介素及/或高含量調節性T細胞及/或骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)及/或抑制分子(例如PD-1、PD-L1、CTLA4)。
免疫抑制亦可由在敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制期間出現之繼發性感染(例如院內感染)造成。非限制性地，該等感染可由以下造成： -   細菌(例如不動桿菌屬( Acinetobacter spp .)、難養芽胞梭菌( Clostridium difficile)、大腸桿菌、克雷伯氏菌屬(Klebsiella spp)、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、結核分支桿菌、腸球菌屬、退伍軍人桿菌屬) -   病毒(例如B型及C型肝炎、流感、HIV、輪狀病毒、單純疱疹病毒) -   真菌(例如念珠菌屬、麴菌屬、鐮菌屬、毛黴目屬、賽多孢子菌屬( Scedosporiumspp.))。
較佳地，本發明提供用於治療敗血症誘發之免疫抑制的編碼至少一具有IL-7活性之多肽之非繁殖病毒載體或包含該病毒載體之組合物。
在另一實施例中，本發明提供用於治療SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV2、229E、NL63、OC43或HKU1誘發之免疫抑制的編碼至少一具有IL-7活性之多肽之非繁殖病毒載體或包含該病毒載體之組合物。
在另一實施例中，本發明提供用於治療創傷(例如多創傷、髖部骨折)、大手術及衰老誘發之免疫抑制的編碼至少一具有IL-7活性之多肽之非繁殖病毒載體或包含該病毒載體之組合物。
在一個實施例中，非繁殖病毒載體或其組合物係在敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制階段開始之後在4小時至6年範圍內變化之時間段內投與。在一個實施例中，用於治療免疫抑制之組合物係在初期，較佳地在免疫抑制階段開始之後第一個月內，例如在免疫抑制階段開始之後28天、21天、14天、7天、6天、5天、4天、3天、2天內或甚至前24小時(例如4、6、8、12、16、20小時)內投與。在另一實施例中，用於治療免疫抑制之組合物係在免疫抑制階段開始之後在約1個月至約6個月範圍內變化之時間段內(例如180天、150天、120天、100天、90天、80天、70天、60天、50天、40天、35天、30天或29天內)投與。在再另一實施例中，用於治療免疫抑制之組合物係在免疫抑制階段開始之後的後期，較佳地在免疫抑制階段開始之後6個月至6年(例如6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年)內投與。吾人亦可考慮在敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制之不同階段投與其組合物的任何組合。出於說明之目的，合適方案可包含在免疫抑制階段開始之後第一個月內的初期投與一或多次，及在免疫抑制階段開始之後1個月至6個月內或6個月至6年內、或在免疫抑制階段開始之後1個月至6個月內及6個月至6年內兩者的後期投與一或多次。
較佳地，非繁殖病毒載體或其組合物係在敗血症誘發之免疫抑制階段開始之後在4小時至6年範圍內變化之時間段內投與。在一個實施例中，用於治療敗血症誘發之免疫抑制之組合物係在初期，較佳地在免疫抑制階段開始之後第一個月內，例如在免疫抑制階段開始之後28天、21天、14天、7天、6天、5天、4天、3天、2天內或甚至前24小時(例如4、6、8、12、16、20小時)內投與。在另一實施例中，用於治療敗血症誘發之免疫抑制之組合物係在免疫抑制階段開始之後在約1個月至約6個月範圍內變化之時間段內(例如180天、150天、120天、100天、90天、80天、70天、60天、50天、40天、35天、30天或29天內)投與。在再另一實施例中，用於治療敗血症誘發之免疫抑制之組合物係在免疫抑制階段開始之後的後期，較佳地在免疫抑制階段開始之後6個月至6年(例如6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年)內投與。吾人亦可考慮在敗血症誘發之免疫抑制之不同階段投與其組合物的任何組合。出於說明之目的，合適方案可包含在敗血症誘發之免疫抑制階段開始之後第一個月內的初期投與一或多次，及在敗血症誘發之免疫抑制階段開始之後1個月至6個月內或6個月至6年內、或在敗血症誘發之免疫抑制階段開始之後1個月至6個月內或6個月至6年內的後期投與一或多次。
在一較佳實施例中，非繁殖病毒載體或組合物之使用包含在免疫抑制階段開始之後1次與10次之間、較佳地在免疫抑制階段開始之後1次與5次之間、更佳地在免疫抑制階段開始之後1次與3次之間、甚至更佳地在免疫抑制階段開始之後一次投與該病毒載體或組合物。在一更佳實施例中，一或多次投與係藉由一或多次靜脈內、皮下或肌內投與非繁殖病毒載體或其組合物來進行。
由如本文所描述使用之非繁殖病毒載體或組合物或本發明之方法提供之有益作用可藉由在未根據本文所描述之儀器治療加以治療之情況下臨床狀態相對於基線狀態或相對於預期狀態的可觀測改進來證明。臨床狀態之改進可易於由醫師及熟練健康照護工作人員通常使用之任何相關臨床量測且藉由實驗室中常規使用之技術來加以評估。臨床有益作用亦可藉由諸如血液測試、生物流體分析之適當量測，例如使用各種可獲得之抗體來識別參與免疫反應之不同免疫細胞群體來證明。該等量測結果常規地在醫學實驗室及醫院中加以評估，且大量套組為市售的。該等量測可在投與之前(基線)及在治療期間之各種時間點及在治療停止之後執行。在本發明之上下文中，該等臨床有益作用可與以下但不限於以下相關：功能性先天性及/或適應性免疫增強、至少一種類型之免疫相關細胞含量增加、至少一種類型之經活化免疫相關細胞含量增加及免疫體內恆定恢復(Takeyama等人, 2004, Critical Care 20048 (增刊1):P207)。免疫相關細胞包含但不限於CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞、NKT細胞、NK細胞、樹突狀細胞、單核球、嗜中性球、巨噬細胞及嗜酸性球。
在本發明之上下文中，治療效益可為短暫的(在投與停止之後達一二天、一二週或一二個月)或持續的(達數月或數年)。由於在受試者之間可顯著地變化之臨床狀態之自然過程，故不需要在各所治療之受試者中均觀測到治療效益，但要在大量受試者中觀測到治療效益(例如二組之間的統計學上顯著之差異可藉由諸如Tukey參數檢定、Kruskal-Wallis檢定、根據Mann及Whitney之U檢定、Student t檢定、Wilcoxon檢定等之此項技術中已知之任何統計檢定來測定)。
在一個實施例中，本文所描述之非繁殖病毒載體或組合物之特別地適當的用途在於提供與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比濃度增加之經治療受試者中之血液循環中具有IL-7 (例如hIL-7-Fc)活性之多肽。
在一特定實施例中，有益作用可與以下中之一或多者相關： -   與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之功能性先天性及/或適應性免疫增強；及/或 -   與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之選自由以下組成之群之至少一種類型的免疫相關細胞的含量增加：CD4 T細胞(例如天然CD4 T細胞、CD4+效應記憶細胞、CD4+中樞記憶細胞、CD4+急性效應記憶細胞等)、CD8 T細胞(例如天然CD8 T細胞、CD8+效應記憶細胞、CD8+中樞記憶細胞、CD8+急性效應記憶細胞等)、B細胞、NKT細胞、NK細胞、樹突狀細胞、單核球及嗜中性球。較佳地，該使用增加較佳地至少2種類型、更佳地至少3種類型且更佳地至少4種類型之免疫相關細胞的含量；及/或 -   與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之選自由經活化CD4 T細胞、經活化CD8 T細胞、經活化B細胞及經活化NK細胞組成之群之至少一種類型的免疫相關細胞之至少一種類型的經活化狀態增加(從而引起選自由經活化CD4 T細胞、經活化CD8 T細胞、經活化B細胞及經活化NK細胞組成之群之至少一種類型的經活化免疫相關細胞的數目及/或百分比增加)。較佳地，該使用增加較佳地至少二種類型、更佳地至少3種類型且更佳地至少4種類型之免疫相關細胞的經活化狀態；及/或 -   與未投與該非繁殖病毒載體或組合物或投與IL-7蛋白之受試者相比，肺中之細胞且更特定而言選自由CD4 T細胞、CD8 T細胞及NK細胞組成之群之至少一種類型的免疫相關細胞的含量增加；及/或 -   與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者或經IL-7蛋白治療之受試者相比，投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之肺中選自由經活化CD4 T細胞、經活化CD8 T細胞及經活化NK細胞組成之群之至少一種類型的免疫相關細胞之至少一種類型的經活化狀態增加(從而引起選自由經活化CD4 T細胞、經活化CD8 T細胞及經活化NK細胞組成之群之至少一種類型的經活化免疫相關細胞的數目及/或百分比增加)；及/或與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之選自由IFNγ、TNFα、IL-6及IL-1β組成之群之至少一種類型的細胞介素的含量增加；及/或 -   與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之脾及/或血液CD4 T細胞、脾及/或血液CD8 T細胞及/或胸腺細胞上之Bcl2基因表現增加；及/或 -   與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之血液及/或脾及/或胸腺內CD4+及CD8+雙陽性細胞的百分比減少及CD4+及CD8+簡單陽性細胞的百分比增加；及/或 -   與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者或經IL-7蛋白治療之受試者相比，經該非繁殖病毒載體或組合物治療之受試者之存活延長。
在再另一實施例中，如本文所描述之非繁殖病毒載體或組合物係用於治療展現與免疫相關細胞含量及/或經活化免疫相關細胞含量減少相關之一或多種生物標記物之免疫抑制受試者。在一較佳實施例中，該一或多種生物標記物選自由以下組成之群：循環單核球上之HLA-DR表現、循環IL-10、絕對CD3 T細胞計數、包括調節性T細胞之數個免疫抑制性淋巴球亞群量測結果及如PD-1、PD-L1、CTLA-4、Lag-3及BTLA之抑制受體的表現。
在一個實施例中，與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者相比，本文所描述之非繁殖病毒載體或組合物係用於增強投與該非繁殖病毒載體或組合物之受試者之功能性先天性及/或適應性免疫系統。在一較佳實施例中，該非繁殖病毒載體或組合物係用於增加至少一種類型之先天性免疫相關細胞且較佳地選自由NK細胞及單核球組成之群之至少一種類型之先天性免疫相關細胞的含量、及/或至少一種類型之經活化或成熟先天性免疫相關細胞且較佳地選自由NK細胞及單核球組成之群之至少一種類型之經活化或成熟先天性免疫相關細胞的含量。在另一較佳實施例中，該非繁殖病毒載體或組合物係用於增加至少一種類型之適應性免疫相關細胞且較佳地選自由CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞及NK細胞組成之群之至少一種類型之適應性免疫相關細胞的含量、及/或至少一種類型之經活化適應性免疫相關細胞且較佳地選自由CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞及NK細胞組成之群之至少一種類型之經活化適應性免疫相關細胞的含量。對於一般引導，功能性先天性及/或適應性免疫之增強可常規地例如藉由生物流體分析或藉由標記物使用如實例部分中所描述之合適抗體來加以評估。
本發明亦關於用於治療有需要之受試者之敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制的方法，該方法包含一或多次投與本文所描述或根據本文所描述之方法製備之非繁殖病毒載體或組合物。 組合療法
在本發明之實施例中之任一者中，根據本發明使用之非繁殖病毒載體或其組合物可單獨或與可用於治療免疫抑制之任何習知治療性儀器治療聯合投與。舉例而言，該病毒載體或組合物可與免疫治療性產品聯合使用。代表性實例尤其包括免疫檢查點調節劑，亦即影響細胞表面受體之調節之藥劑，諸如阻斷表皮生長因子受體之單株抗體、阻斷血管內皮生長因子之單株抗體及TLR促效劑(例如TLR9促效劑、TLR4促效劑)。適用於本發明中之該等免疫治療性產品之其他代表性實例尤其為表現載體(例如質體DNA載體、痘瘡病毒、腺病毒、慢病毒、疱疹病毒等)重組多肽及非肽佐劑。
專利、公開案及資料庫條目之所有上文所引用之揭露內容均特定地以全文引用之方式併入本文中。本發明之其他特點、對象及優點將自實施方式、圖式及申請專利範圍顯而易見。併入以下實例以展現本發明之較佳實施例。然而，鑒於本揭露內容，熟習此項技術者應瞭解，可在不背離本發明之精神及範疇之情況下對所揭露之具體實施例作出改變。 實例 1 . 材料及方法
下文所描述之建構係根據Maniatis等人(1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY或後續版本)中詳述之一般基因工程改造及分子選殖技術或當使用商用套組時根據製造商建議來進行。PCR擴增技術為熟習此項技術者已知(參見例如PCR protocols - A guide to methods and applications, 1990, 由Innis, Gelfand, Sninsky及White發佈, Academic Press)。 1.1 載體構築 1.1.1 MVATG18897
此後所說明之亦稱為MVA-hIL-7-Fc之MVATG18897經工程改造以表現處於pH5R啟動子控制下之與人類IgG2 (SEQ ID NO: 4)之Fc序列融合之人類介白素-7。
藉由合成方式生成含有pH5R啟動子及由與痘瘡轉移質體同源之約40 bp序列包圍之融合體IL-7-Fc的DNA片段，且將該DNA片段插入質體15ABXMTP_IL-7中。在藉由 PsiI及 ScaI限制此質體之後，藉由In-Fusion選殖(In-Fusion HD選殖套組，Clontech)在經 NotI及 BglII消化之痘瘡轉移質體pTG18626中插入該片段，從而產生pTG18897。
MVA轉移質體pTG18626經設計以准許藉由同源重組在MVA基因體之缺失III中插入要被轉移之核苷酸序列。該質體源自其中在MVA缺失III周圍選殖側接序列(BRG3及BRD3)之質體pUC18 (Sutter及Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847)。
使用含有編碼mCherry螢光蛋白之基因之親本MVA執行向該親本MVA之缺失III (MVA mCherry)中之同源重組。MVA mCherry之優點在於區分感染已成功地整合表現卡匣之重組病毒之細胞與感染初始MVA mCherry病毒(親本病毒)之細胞。實際上，在缺失III內之表現卡匣成功重組之情況下，mCherry基因經移除，且病毒溶菌斑顯現為白色。
藉由同源重組，藉由使用MVA-mCherry作為親本病毒且使用轉移質體pTG18897在雞胚胎纖維母細胞(CEF)上生成MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)。自12日齡含胚胎無特定病原體(SPF)蛋(Charles River)分離CEF。將胚胎機械地撕開，溶解於Tryple Select溶液(Invitrogen)中，且在補充有5% FCS (Gibco)及2 mM L-麩醯胺酸之MBE (以伊格爾(Eagle)為主之培養基；Gibco)中培養離散細胞。
轉移質體pTG18897與親本MVA-mCherry之間的同源重組使得能夠生成已損失其mCherry表現卡匣且獲得IL-7-Fc表現卡匣之重組痘瘡病毒且藉由分離白色非螢光溶菌斑來執行選擇。
在二個F175燒瓶中在CEF上擴增MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之病毒儲備液以生成適當的病毒儲備液。在DF1細胞上滴定病毒儲備液且感染性力價係以pfu/mL為單位表示。藉由PCR分析此儲備液以使用適當引子對來驗證表現卡匣及重組臂之整合性。亦藉由表現卡匣定序來分析儲備液。定序結果之比對顯示與理論預期序列之100%同源性。若需要，則使用習知技術純化病毒製劑。簡言之，在37℃、5% CO 2下執行病毒擴增72小時。隨後，將經感染細胞及培養基集結且冷凍。使用高速均質機(SILVERSON L4R)使粗收取物破裂且將其提交至純化過程(例如如W02007/147528中所描述)。簡言之，可藉由過濾來澄清經溶解之病毒製劑，且藉由切向流過濾(TFF)步驟將其純化。將經純化病毒再懸浮於合適病毒調配物緩衝液(例如5% (w/v)蔗糖、50 mM NaCl、10 mM Tris/HCl、10 mM麩胺酸鈉，pH 8)中。 1.1.2 MVATG19791
MVATG19791經工程改造以表現處於pH5R啟動子控制下之與人類IgG2 (SEQ ID NO: 4)之Fc序列融合之人類介白素-7。編碼hIL-7-Fc之核苷酸序列經密碼子最佳化以改進重組蛋白在人類細胞中之表現。在ATG起始密碼子前添加Kozak序列(ACC)，且在終止密碼子後添加轉錄終止子(TTTTTNT)。此外，排除進入開放閱讀框架中之一些模式：對痘病毒表現不利之TTTTTNT、GGGGG、CCCCC。
藉由合成方式生成含有經最佳化融合體IL-7-Fc之DNA片段。藉由In-Fusion選殖(In-Fusion HD選殖套組，Clontech)在經 PvuII消化之痘瘡轉移質體pTG19349中插入此片段，從而產生pTG19791。
MVA轉移質體pTG19349經設計以准許藉由同源重組在MVA基因體之缺失III中插入要被轉移之核苷酸序列。該質體源自其中在MVA缺失III周圍選殖側接序列(BRG3及BRD3)之質體pUC18。該質體亦含有pH5R啟動子。
如上文所描述，藉由同源重組，藉由使用MVA-mCherry作為親本病毒且使用轉移質體pTG19791在雞胚胎纖維母細胞(CEF)上生成MVATG19791。 1 .2 . 活體外評估MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 及MVATG19791 )
作為第一步驟，評估感染病毒載體之A549細胞中MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)表現hIL-7-Fc基因之能力。收集細胞及上清液且將其提交至西方墨點法，且使用對人類IL-7具有特異性之兔單株抗體評估hIL-7-Fc偵測。將該等細胞及上清液與不編碼任何外來蛋白之經空MVA (MVATGN33.1)轉導之細胞進行比較。
亦評估MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)表現功能性hIL-7之能力。以0.3、1及3之MOI (感染倍率)感染COS7細胞，且在48小時至72小時後收集上清液。藉由ELISA評估所分泌之IL-7之量，且使用PB1細胞(ATCC)評估IL-7功能性，該等PB1細胞之增殖依賴於hIL-7。在PB1細胞上培育上清液72小時，且執行旨在量測細胞代謝(反映細胞增殖)之MTT分析。
作為第二步驟，評估且比較感染病毒載體之CEF及A549細胞中MVATG18897及MVATG19791表現hIL-7-Fc基因之能力。收集細胞及上清液且將其提交至西方墨點法，且使用對人類IL-7具有特異性之兔單株抗體評估hIL-7-Fc偵測。將該等細胞及上清液與不編碼任何外來蛋白之經空MVA (MVATGN33.1)轉導之細胞進行比較。亦使用hIL-7 ELISA定量上清液中之hIL-7-Fc之量。 1 .3 . 健康C57BL6 /J 小鼠模型中之藥物動力學及生物學活性 1.3.1 動物
在於Charles River Laboratories購買之C57BL/6J小鼠中進行投與之後，評估由MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)表現之與人類IgG2之Fc域(hIL-7-Fc)融合之人類介白素-7的藥物動力學。 1 .3 .2 . 投與方案 1 .3 .2 .1 MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 及空MVA (MVATGN33 .1 ) 注射方案
實驗1：在後眼眶竇處向小鼠靜脈內(IV)注射一次1 × 10 7或1 × 10 8pfu MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或1 × 10 8pfu MVATGN33.1 (用作對照之空MVA) (15隻小鼠/組)。
實驗2：在後眼眶竇處向小鼠靜脈內(IV)注射一次1 × 10 8pfu MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或2 × 10 8pfu空MVA (MVATGN33.1) (15隻小鼠/組)。
實驗3：在後眼眶竇處向小鼠靜脈內(IV)注射一次1 × 10 8pfu MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或1 × 10 8pfu空MVA (MVATGN33.1)。執行實驗二次，且將結果彙集。
實驗4：在後眼眶竇處向小鼠靜脈內(IV)注射一次1 × 10 7pfu MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或5 µg由Geneart在CHO細胞上生產之重組IL-7-Fc蛋白。 1 .3 .3 hIL -7 -Fc 及mIFNγ 之 藥物動力學 1 .3 .3 .1 血液取樣
實驗1：為了量測循環hIL-7-Fc及mIFNγ，在以下時間點對經注射小鼠之血液進行取樣：0小時、2小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時、8天、15天及21天(在各時間點，3隻小鼠/組)。
實驗2：為了量測藉由注射MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)產生之循環hIL-7-Fc以及循環mIFNγ之量，在以下時間點對經注射小鼠之血液進行取樣：0小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時、7天及9天(在各時間點，3隻小鼠/組)。 1 .3 .3 .2 血清製備
在取樣之後，將血液樣本保持在4℃下約1小時。隨後，將血液樣本離心(在4℃下10000 rpm達5 min)，且將血清收集在新管中且在ELISA時將其儲存於-20℃下。 1 .3 .3 .3 hIL -7 及mIFN - γ ELISA
對於hIL-7-Fc藥物動力學，根據提供商說明書使用來自R&D systems之人類IL-7 Duoset ELISA運行ELISA。值得注意地，分析自始至終僅使用50 µL體積之樣本及各種試劑。視樣本及IL-7濃度而定，將樣本自1/3稀釋至1/6561。隨後，使用由R&D System建立且提供之標準曲線來計算各樣本之濃度，該濃度涵蓋7,81 pg/mL至500 pg/mL之值。
為了給藥mIFNγ，根據提供商說明書使用來自Biolegend之小鼠IFN-γ ELISA MAX TMDeluxe運行ELISA。值得注意地，除了塗佈步驟以外，分析自始至終僅使用50 µL體積之樣本及各種試劑。視樣本及IFN-γ濃度而定，將樣本自1/3稀釋至1/6561。隨後，使用由Biolegend建立且提供之標準曲線來計算各樣本之濃度，該濃度涵蓋15,62 pg/mL至1000 pg/mL之值。 1 .3 .4 生物學活性評估
在實驗1中，不評估生物學活性。
實驗2：為了量測MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，在第1天、第3天、第9天及第29天將3隻小鼠/組處死，且收集脾及胸腺。
製備脾細胞及胸腺細胞，且溶解紅血球。在洗滌之後，使用以下抗體及試劑對所收集之細胞進行染色：Fc阻斷溶液(抗CD16-32 (2.4G2))、抗CD3 APC、抗CD4 APC-H7、抗CD8 PE-CY7或抗CD8-PRCP、抗CD19-PE、抗B220-APCH7、抗NK1.1 PercpCy-5、抗CD11c-PE、抗CD11b-V500、抗Ly6G-FITC、抗Ly6C-APC、抗Bcl2-FITC、抗CD62L-PECy7、抗CD44-FITC、抗CD127-PE、活力標記物(LiveDead LV450)，所有此等試劑均在Becton Dickinson購買，來自Invitrogen之活力標記物除外。在與抗體一起培育之前，與Fc阻斷溶液一起培育。隨後，將細胞與3種不同的抗體混合物/抗體組一起培育： *T細胞：抗CD3、抗CD8、抗CD4、抗CD44、抗CD62L、LV450 *骨髓細胞：抗B220、抗NK1.1、抗CD11b、抗CD11c、抗Ly6G、抗Ly6C、LV450 *細胞凋亡：對於脾、抗CD4、抗CD8、抗CD3、抗Bcl2、LV450；對於胸腺，相同抗體混合物，抗CD3除外。
在FACSCanto II細胞計數器上運行經洗滌之染色樣本。使用BD diva軟體分析資料。
實驗3 (執行二次且彙集)：為了量測肺上之MVATG18897及MVATGN33.1之生物學活性，在注射後第3天及第9天將5隻小鼠/組處死，且收集肺。
製備肺細胞，且溶解紅血球。在洗滌之後，使用Muse細胞分析儀對所收集之細胞進行計數且使用以下抗體及試劑對其進行染色：Fc阻斷溶液(抗CD16-32 (2.4G2))、抗CD3 APC、抗CD4 APC-H7、抗CD8 PE-CY7、抗NK1.1 PercpCy-5、抗CD69-FITC、活力標記物(LiveDead LV450)，所有此等試劑均在Becton Dickinson購買，來自Invitrogen之活力標記物除外。在與抗體一起培育之前，與Fc阻斷溶液一起培育。藉由流式細胞量測術(FACSCanto II)分析染色。
實驗4 (執行二次，一次係針對脾分析，一次係針對肺分析)：為了量測MVATG18897及hIL-7-Fc蛋白之生物學活性，在各實驗中在注射後第3天及第9天將6隻小鼠/組處死，且收集脾或肺。
製備脾細胞及肺細胞，且溶解紅血球。在洗滌之後，使用Muse細胞分析儀對所收集之細胞進行計數且使用以下抗體及試劑對其進行染色：Fc阻斷溶液(抗CD16-32 (2.4G2))、抗CD3 APC、抗CD4 APC-H7、抗CD8 PE-CY7、抗NK1.1 PercpCy-5、抗CD69-FITC、活力標記物(LiveDead LV450)，所有此等試劑均在Becton Dickinson購買，來自Invitrogen之活力標記物除外。在與抗體一起培育之前，與Fc阻斷溶液一起培育。藉由流式細胞量測術(FACSCanto II)分析染色。
亦使用脾細胞及肺細胞執行胞內細胞介素染色分析。在Golgi Plug (1/1000最終稀釋度)存在之情況下用各1 µg/mL之抗CD3抗體(1/1000最終稀釋度)及抗CD28抗體(1/1000最終稀釋度)刺激細胞4小時30分鐘。在培育之後，使用以下抗體及試劑對細胞進行染色：Fc阻斷溶液(CD16/32)、抗CD4-APC-H7、抗CD8-V500、活力標記物(Live/Dead LV450)。在與抗體一起培育之前，與Fc阻斷溶液一起培育。隨後，將細胞固定且滲透，且用以下抗體執行胞內細胞介素染色：抗CD3-PerCP、抗IFNγ-Alexa488、抗TNFα-APC及抗IL2-PE。在BD Biosciences FACSCanto II細胞計數器上運行樣本。使用BD Biosciences Diva軟體分析資料。 1 .3 .5 統計分析
為了評估生物學活性，使用伴隨重複量測之雙向ANOVA (混合模型)檢定、接著為用於組間比較之Bonferonni後檢定(若顯著(p＜ 0.05))執行統計分析(GraphPad Prism軟體)。由於多重比較，p值經校正。若Bonferonni檢定之後及校正之後的p值低於0.05，則在二組之間觀測到之差異視為顯著的。 1 .4 . 敗血症小鼠模型中之生物學活性 1 .4 .1 . 盲腸結紮及穿孔 (CLP )
為了誘發多微生物腹膜炎，使8至11週齡C57BL/6雄性小鼠經受根據Restagno等人(2016, PLoS One, 11(8):e0162109)所描述之方案加以調適之盲腸結紮及穿孔(CLP)手術。簡言之，用甲苯噻𠯤與氯胺酮之混合物麻醉小鼠。使盲腸暴露，在其外部三分之一處結紮且用21號針穿孔二次以產生二個單孔。擠壓少量糞便以便誘發輕度級別之敗血症。對照為原始小鼠，且在僅暴露盲腸且無CLP之情況下經Sham操作小鼠經歷開腹術。所有經操作小鼠均在手術之前接受鎮痛(丁基原啡因(buprenorphine))。在手術結束時，所有經操作小鼠均接受5%葡萄糖鹽水溶液之皮下注射。在手術之後約六小時且隨後每十二小時持續接下來二天，所有經操作小鼠均接受抗生素(亞胺培南(imipenem)/西司他汀(cilastatin))之腹膜內注射及丁基原啡因之皮下注射以控制疼痛。隨後，一天二次監測小鼠直至研究結束為止。界定臨床分數，若分數高於預定臨限值，則使小鼠安樂死。觀測到逐漸失能、呼吸困難、厭食症或體溫低於30℃，則使動物安樂死。隨後，測定存活率直至手術後第7天為止。 1 .4 .2 . 投與方案
比較Sham小鼠、未經治療CLP小鼠及經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠的實驗：在CLP之後4天，在異氟醚吸入麻醉之後，在後眼眶竇處向一組CLP小鼠靜脈內(IV)注射一次含1 × 10 8pfu MVATG18897 (MVA-hIL-7-Fc)之100 µL S08緩衝液。
比較經空MVA治療之CLP小鼠及經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠的實驗：在CLP之後4天，在異氟醚吸入麻醉之後，在後眼眶竇處向一組CLP小鼠靜脈內(IV)注射一次含1 × 10 8pfu MVATG18897 (MVA-hIL-7-Fc)之100 µL S08緩衝液。恰好以相同方式、但用空MVA對第2組進行治療。
比較MVA-hIL-7-Fc及hIL-7-Fc蛋白之實驗(2個實驗)：在CLP之後4天，在異氟醚吸入麻醉之後，在後眼眶竇處向一組CLP小鼠靜脈內(IV)注射一次含1 × 10 7pfu MVATG18897 (MVA-hIL-7-Fc)之100 µL S08緩衝液。恰好以相同方式、但用5 µg hIL-7-Fc對第2組進行治療。 1 .4 .3 . 生物學活性評估 1.4.3.1. 血液 1 .4 .3 .1 .1 . 血清製備
在研究結束時，將血液收集至收集管(Microvette® CB 200 Z-Gel, Sarstedt)中。在取樣之後，將血液樣本保持在4℃下約1小時。隨後，將血液樣本離心(在4℃下10000 rpm達5 min)，且將血清收集在新管中且將其儲存於-20℃下直至進行ELISA及多重分析為止。 1 .4 .3 .1 .2 . 細胞懸浮液製備
自後眼眶竇獲取血液。將小體積全血用1%乙酸溶液溶解，混合且在固定時間期間在BD FACSCanto II之培養基速度(1微升/秒)下採集。對對應於未溶解核之事件數目進行計數，因此得到每微升全血之有核細胞濃度。為了進行進一步流式細胞量測術分析，將剩餘全血用10 mL紅血溶解緩衝液(BioLegend)溶解約15分鐘。在洗滌之後，使細胞繼續進行染色，如針對脾細胞一樣。 1 .4 .3 .2 . 脾
為了量測MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，在注射MVA-hIL-7-Fc之後三天，亦即在CLP之後七天將小鼠處死，且收集脾。將脾解離且獲得細胞懸浮液。在溶解紅血球之後，收集脾細胞，對其進行讀數且使其繼續進行下文所描述之免疫分析。 1.4.3.3. hIL-7 ELISA
根據提供商說明書使用來自R&D Systems之人類IL-7 DuoSet® ELISA研發系統運行ELISA。值得注意地，所有試劑體積均除以二。以1/3稀釋血清且隨後連續5次進行三倍稀釋。隨後，使用由R&D Systems建立且提供之標準曲線來計算各樣本之濃度，該濃度涵蓋7.81 pg/mL至500 pg/mL之值。 1 .4 .3 .4 . 多重分析
在經刺激脾細胞之血清及上清液上執行分析。以0.5 × 10 6個細胞/經抗CD3抗體(1 µg/mL)預塗佈之孔接種脾細胞。二十四小時後，收集上清液且將其儲存於-20℃下。根據提供商說明書使用來自Meso Scale Discovery (MSD)之U-PLEX多重分析在血清及上清液上運行多重分析以便評估以下細胞介素：IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα及IFNγ。隨後，使用由MSD建立且提供之標準曲線來計算各樣本之濃度。 1.4.3.5. IFNγ ELISpot 分析
以25 × 10 3個細胞/孔塗鋪脾細胞且將其與抗CD3抗體(1 µg/mL)及抗CD28抗體(1 µg/mL)一起培養隔夜(約20小時)。藉由來自CTL之鼠類IFNγ單色酶促酶相關免疫斑點(ELISpot)分析(MIFNGP-1M/5)定量產生IFNγ之T細胞。含有抗CD3/CD28抗體之實驗孔中所偵測到之斑點數目減去陰性對照孔中之斑點數目(對應於產生IFNγ之T細胞)。 1 .4 .3 .6 . 流式細胞量測術分析 1 .4 .3 .6 .1 . 細胞表型分型
使用以下抗體及試劑對脾細胞進行染色：Fc阻斷溶液(抗CD16/32，殖株2.4G2)、抗CD45-PE-Cy7、抗CD3 APC、抗CD4 APC-H7、抗CD8 V500、抗CD19-PE、抗CD69-FITC、抗NK1.1 PercpCy-5、活力標記物(LiveDead LV450)，所有試劑均在Becton Dickinson購買，來自Invitrogen之活力標記物除外。在與抗體一起培育之前，與Fc阻斷溶液一起培育。隨後，在FACSCanto II細胞計數器上運行樣本且使用BD Diva軟體分析資料。 1 .4 .3 .6 .2 . 三重胞內細胞介素染色分析
在Golgi Plug (1/1000)存在之情況下用抗CD3抗體(1 µg/mL)及抗CD28抗體(1 µg/mL)刺激脾細胞4小時。隨後，使用以下抗體及試劑對細胞進行染色：Fc阻斷溶液(抗CD16/32，殖株2.4G2)、抗CD4 V500、抗CD8 APC-H7、活力標記物(LiveDead LV450)。在與抗體一起培育之前，與Fc阻斷溶液一起培育。在洗滌之後，將細胞固定且滲透。用以下抗體執行胞內細胞介素染色：抗CD3 PerCP、抗IFNγ Alexa488、抗TNFα APC及抗IL2 PE。隨後，洗滌且在FACSCanto II細胞計數器上運行樣本。使用BD Diva軟體分析資料。 1 .4 .3 .7 . 統計分析
對於存活研究，使用對數等級檢定、接著為使用Tukey多重性調整檢定進行之各組之間的特定比較來執行統計分析(SAS® 9.4軟體)。
為了評估比較Sham小鼠、未經治療CLP小鼠及經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠的實驗以及比較經空MVA治療之CLP小鼠及經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠的實驗中的生物學活性，使用單向ANOVA Kruskal-Wallis檢定、接著為用於組間比較之配對Mann-Whitney檢定(若顯著(p＜ 0.05))執行統計分析(GraphPad Prism軟體)。若用Mann-Whitney檢定獲得之p值低於0.05，則在二組之間觀測到之差異視為顯著的。
為了評估比較MVA-hIL-7-Fc及hIL-7-Fc蛋白之實驗中之生物學活性，使用單向ANOVA Kruskal-Wallis檢定、接著為用於組間比較之配對Dunns檢定(若顯著(p＜ 0.05))執行統計分析(GraphPad Prism軟體)。若用Dunns檢定獲得之p值低於0.05，則在二組之間觀測到之差異視為顯著的。 1 .5 . ICU Covid -19 免疫抑制患者中之生物學活性
全血係獲自入選觀測性臨床研究REA-IMMUNO-COVID (RICO)之感染SARS-CoV-2之患者，該研究經倫理委員會(法蘭西島人民保護委員會(Comité de Protection des Personnes Ile de France) 1 - N°IRB/IORG編號：IORG0009918 -協定2020-A01079-30)批准且在ClinicalTrials.gov以NCT04392401編號經登記(里昂綜合人民醫院(Hospices civils de Lyon)之加護病房)。在進入ICU之後第3天與第5天之間自六位在入院時展現大於或等於5之SOFA分數的患者獲得樣本。
評估在用含有hIL-7-Fc之上清液刺激之後的STAT5磷酸化。使用來自MVATG18897或MVATGN33.1感染物之經稀釋上清液(1/2.5、1/5及1/10稀釋度)及未經感染細胞上清液(1/2.5稀釋度)刺激全血十分鐘。用抗人類CD3 Pe-Cy7及抗人類CD45 APC-H7對細胞進行染色。使用Perfix暴露套組執行固定、紅血球溶解及滲透步驟。在滲透之後，用抗人類pSTAT5 (pY694)對細胞進行染色。在CantoII流式細胞儀上分析細胞且使用Flow Jo軟體分析資料。
藉由胞內細胞介素染色來測定CD4+ T細胞之功能性。根據製造商說明書使用Duractive 1刺激套組刺激全血，來自MVATG18897或MVATGN33.1感染物之上清液或未經感染細胞上清液除外。以1/2及1/10稀釋上清液以刺激細胞。根據製造商說明書使用Duraclone IF T活化套組來執行CD4+ T細胞之胞內染色。在CantoII流式細胞儀上分析細胞且使用Flow Jo軟體分析資料。 1 .6 . 衰老創傷患者中之生物學活性
包括年齡超過75歲、入住皮提耶-薩爾佩特里爾醫院(Pitié Salpêtrière hospital)急診室之髖部骨折患者之前瞻性觀測性臨床研究HIPAGE經倫理委員會(CPP Pitié-Salpêtrière, Paris, France)批准。另外，亦募集年齡匹配之衰老對照患者。所有包括在內之參與者均被告知且提供其同意書。在5位衰老患者及10位在手術後48小時至72小時獲得之衰老髖部骨折患者之低溫保存PBMC上執行分析。
進行免疫表型分型以評估CD57在CD8 T細胞當中之表現，亦即熟知的免疫衰老標記物(Kared等人, 2016, J Immunol Immunother, 65(4):441-52)。將PBMC解凍且用固定活力染料(eFluor 780)、抗人類CD3-Pe-Cy7、抗人類CD8-BV650及抗人類CD57-FITC對其進行染色。使用BD-LSRFortessa流式細胞儀分析細胞且使用Flow Jo軟體分析資料。
評估經解凍PBMC上之用含有hIL7-Fc之上清液刺激之後的STAT5磷酸化。使用來自感染MVATG19791之細胞之經稀釋上清液(在對應於12.5 ng/mL IL-7-Fc之稀釋度下)或來自感染MVATGN33.1之細胞之經稀釋上清液(具有相同稀釋度)刺激PBMC十分鐘。同時使用具有未經刺激對照之培養基。使用BD-Cytofix緩衝液執行固定，且使用BD-Perm緩衝液III進行滲透。在滲透之後，用抗人類CD3 Pacific Orange、抗人類pSTAT5 (pY694)對細胞進行染色。使用BD-LSRFortessa流式細胞儀分析細胞且使用Flow Jo軟體分析資料。
評估經解凍PBMC上之T細胞增殖。用細胞增殖染料(eFluor 450)對PBMC進行染色且使用來自感染MVATG19791之細胞之經稀釋上清液(在對應於12.5 ng/mL IL7-Fc之稀釋度下)或來自感染MVATGN33.1之細胞之經稀釋上清液(具有相同稀釋度)對其刺激五天。同時使用具有未經刺激對照之培養基。隨後，用可固定活力染料(eFluor 780)及抗人類CD3-Pe-Cy7對PBMC進行染色。在BD-LSRFortessa流式細胞儀上分析細胞且使用Flow Jo軟體分析資料。 1 .7 . ICU 創傷及重大手術患者中之生物學活性
低溫保存PBMC係獲自一組在創傷性休克之後或在重大手術操作之後入住加護病房之危重病患者。在入住ICU之後第3天至第5天時自在入院時具有大於或等於4之SOFA分數之患者獲得血液。緊接著製備PBMC且冷凍直至分析為止。PBMC係由Transhit Biomarker公司提供，該公司具有包括患者及/或周圍家庭同意書之倫理條件保證書。分析三位重大手術操作之後的患者及三位強烈多創傷性休克之後的患者。
藉由3位創傷患者及3位手術患者之PBMC上之胞內細胞介素染色來測定CD4+ T細胞之功能性。在解凍及隔夜靜止之後，在蛋白質轉運抑制劑(布雷非德菌素A (Brefeldin A) (GolgiPlug BD))存在之情況下使用3 ng/mL PMA-0.3 µg/mL離子黴素或抗CD3/抗CD28抗體(各1 µg/mL)刺激PBMC 5小時。同時使用未經刺激對照。對於各刺激條件，添加來自感染MVATG19791之細胞之上清液(在對應於60 ng/mL IL7-Fc之稀釋度下)或來自感染MVATGN33.1之細胞之上清液(具有相同稀釋度)且將其與僅具有對照之培養基進行比較。
隨後，將PBMC固定且滲透(BD cytofix/cytoperm)，且用針對CD3-PECy7、CD4-BV510、CD8-APC-H7、IFNγ-BB700、IL2-PE、TNFα-A488之單株抗體對其進行染色。在CantoII流式細胞儀上分析細胞且使用Flow Jo軟體分析資料。 2. 結果 2 .1 活體外評估在藉由MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 轉導細胞之後的hIL -7 -Fc 表現及功能性
在第一實驗中，藉由空MVA (MVATGN33.1，陰性對照)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)轉導A549細胞。收集細胞及上清液且藉由西方墨點法對其進行分析(圖1A)。在來自空MVA (MVATGN33.1)轉導之細胞及上清液之情況下未偵測到特異性頻帶，而在經MVA-hIL-7-Fc轉導之細胞及對應上清液之情況下清楚地偵測到特異性信號。如所預期，在β-巰基乙醇不存在之情況下，細胞及上清液顯現污跡，且在β-巰基乙醇存在之情況下，細胞及上清液顯現清晰的單頻帶，該單頻帶由於蛋白質醣化而略微地大於43 kDa。
在第2實驗中，使用MVA-hIL-7-Fc以各種MOI轉導COS7細胞且在48小時或72小時收集上清液。隨後，在用MVA-hIL-7-Fc轉導之後，在所收集之上清液上執行偵測人類IL-7之ELISA以偵測所分泌之人類IL-7 (圖1B)。在用MVA-hIL-7-Fc轉導之後清楚地偵測到hIL-7，而在用空MVA轉導之後在COS7細胞之上清液中未偵測到信號。在所收集之上清液內偵測到之IL-7之量清楚地為劑量/MOI依賴性的(對於MOI 0.3，為25 ng/mL；對於MOI 1，為56 ng/mL；且對於MOI 3，為66 ng/mL)。
在PB1細胞上評估上清液中之hIL-7之功能性，該等PB1細胞之生長為hIL-7依賴性的。在將細胞與各種稀釋度之所收集之上清液一起培育之後72小時，在PB1細胞上執行量測細胞代謝之MTT分析。如圖1C中所示，在來自空MVA轉導之上清液之情況下未偵測到活性，而在來自經MVA-hIL-7-Fc轉導之細胞之上清液之情況下偵測到信號。如所預期，所偵測活性係視MOI及上清液稀釋度而定。其展現在細胞感染之後由MVA-hIL-7-Fc產生之人類IL-7之活性/功能性。 2 .2 活體內評估健康C57BL6 /J 小鼠模型中之MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 2 .2 .1 實驗1 ： 以2 種 劑量 (1 × 10 7 及1 × 10 8 pfu ) 靜脈內注射MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之後的hIL -7 的 藥物動力學
在此實驗中，將C57BL6/J小鼠分成3組15隻動物。向3組各別地注射呈1 × 10 8pfu之劑量之空MVA (MVATGN33.1)及呈1 × 10 7pfu或1 × 10 8pfu之劑量之MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)，以上全部藉由靜脈內途徑注射。在0小時、2小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時、8天、15天及21天時對3隻小鼠/組之血液進行取樣(各時間點之經取樣小鼠由於倫理考慮因素而為不同小鼠)。因此，使用血清，使用ELISA測定經注射小鼠之血液中之hIL-7藥物動力學，以及使用另一ELISA測定循環mIFNγ藥物動力學。
圖2顯示不同組之小鼠血液中循環hIL-7及mIFNγ之偵測結果。圖2A顯示在IV注射空MVA之後，由於病毒載體自身誘導先天性免疫，故少量IFNγ被誘導(在注射後6小時，最大值10.7 ng/mL)，而如所預期，未偵測到hIL-7。圖2B顯示在IV注射呈10 7pfu之劑量之MVA-hIL-7-Fc之後，由於病毒主鏈，相同少量IFNγ被誘導(在注射後6小時，最大值5.1 ng/mL)。平行地，在注射後2小時立即偵測到循環hIL-7之峰值，其中在注射後24小時偵測到最大值(2.4 ng/mL)。所偵測到之hIL-7之量隨時間推移而緩慢地減少：在注射後4天仍可偵測到hIL-7 (0.1 ng/mL)，且在注射後第8天不再偵測到hIL-7。圖2C顯示注射10 8pfu MVA-hIL-7-Fc之小鼠之類似模式，不同之處在於最大峰值在注射後24小時較高且略微延遲(在注射後6小時，為24.5 ng/mL，且在注射後24小時，為61.4 ng/mL)。所偵測到之hIL-7之總體量比較低劑量高約1-對數。關於低劑量，在注射後4天仍偵測到hIL-7 (3.1 ng/mL)，且在注射後8天不再偵測到hIL-7。循環mIFNγ之藥物動力學與在相同劑量之空MVA之情況下所觀測到之藥物動力學相同。
此實驗清楚地證實與空MVA相比MVA-IL-7經至少4天表現可偵測含量之循環hIL-7之能力。 2 .2 .2 實驗2 ： 靜脈內注射MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 或空MVA (MVATGN33 .1 ) 之後的hIL -7 的 藥物動力學及相關免疫活性
在此實驗中，將C57BL6/J小鼠分成2組15隻動物。向2組各別地注射呈2 × 10 8pfu之劑量之空MVA (MVATGN33.1)及呈1 × 10 8pfu之劑量之MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)，以上全部藉由靜脈內途徑注射。在0小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時、8天、9天、15天及29天時對3隻小鼠/組之血液進行取樣(各時間點之經取樣小鼠由於倫理考慮因素而為不同小鼠)。因此，使用血清，使用ELISA測定經注射小鼠之血液中之hIL-7藥物動力學，以及藉由另一ELISA測定給藥循環mIFNγ藥物動力學。另外，在第1天、第3天、第9天及第29天時將3隻小鼠/組處死，且對其脾及胸腺進行取樣以便監測免疫細胞、免疫細胞數目、活化狀態及表現型。 2 .2 .2 .1 hIL -7 及mIFNγ 藥物動力學
圖3A顯示在實驗自始至終在IV注射空MVA之小鼠中可能未偵測到循環hIL-7，而在注射後前4天內偵測到微量循環mIFNγ，其中在注射後6小時偵測到8.5 ng/mL峰值，反映MVA載體自身誘導之先天性免疫反應。
圖3B顯示經MVATG18897 (MVA-hIL-7-Fc)治療之小鼠在注射後6小時立即展現循環hIL-7 (在注射後6小時及24小時，23 ng/mL之平均值)，該循環hIL-7隨時間推移而略微地減少(在注射後第2天、第3天及第4天，10 ng/mL、7 ng/mL及5.1 ng/mL之平均值)。在注射後第8天，不再偵測到循環hIL-7。循環mIFNγ之概況與在注射空MVA之小鼠中觀測到之概況完全相當，且因此可歸因於MVA載體自身。 2 .2 .2 .2 MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之 免疫學活性 2 .2 .2 .2 .1 脾細胞總數
圖4顯示隨群組及時間而定之脾細胞總數。與未經治療小鼠相比，空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)均誘導脾細胞總數在第1天略微地減少(因此，作用可能由載體自身介導)。在第3天，未經治療小鼠及經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠展現類似數目之脾細胞，而經空MVA治療之小鼠仍展現較低數目之脾細胞。在第9天，與空MVA (92 × 10 6個細胞/脾之平均值)及未經治療小鼠(59 × 10 6個細胞/脾)相比，MVA-hIL-7-Fc在第9天強烈且顯著地增加脾細胞數目(231 × 10 6個細胞/脾之平均值)。在第29天，3組展現總數相當之脾細胞。
呈現於圖4上之此等結果清楚地顯示能夠增加脾細胞總數之載體MVA的作用及能夠在第9天驚人地增加脾細胞數目之裝有IL-7臂之MVA的作用。MVA-hIL-7-Fc概括載體自身與裝臂(arming)之免疫學作用。預期MVA-hIL-7-Fc增加脾細胞數目之能力在免疫抑制患者中藉由製備患者免疫系統以更好且更迅速地對潛在新感染或侵入起反應而有益。 2 .2 .2 .2 .2 脾中之CD4 T 細胞 及CD4 + T 細胞 亞群之總數
圖5顯示以下視群組及時間點而定之總數：脾內CD4 T細胞(圖5A)以及CD4+ T細胞之各亞群，亦即天然CD4 T細胞(圖5B)、CD4+效應記憶細胞(圖5C)、CD4+中樞記憶細胞(圖5D)及CD4+急性效應記憶細胞(圖5E)。經由以下標記物識別出CD4+ T細胞之此等4個亞群：對於天然細胞，CD3+ CD4+ CD62L+ CD44-；對於效應記憶細胞，CD3+ CD4+ CD62L- CD44+；對於中樞記憶細胞，CD3+ CD4+ CD62L+ CD44+；及對於急性效應細胞，CD3+ CD4+ CD62L- CD44-。
關於脾中之CD4+ T細胞總數，所有3組(未經治療小鼠、經空MVA治療之小鼠及經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠)在第1天、第3天及第29天展現類似數目。相反地，經空MVA (MVATGN33.1)治療之小鼠在第9天展現相較於未經治療小鼠而言略微地增加之CD4+ T細胞總數(20.8 × 10 6相對於13.2 × 10 6)。明顯地，經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠在第9天展現相較於未經治療小鼠而言及相較於經空MVA治療之小鼠而言顯著地增加之脾中之CD4+ T細胞總數(32.1 × 10 6)。MVA-hIL-7-Fc誘導之CD4+ T細胞較高總數係用於治療免疫抑制患者之優點，此係因為此意指更多來自適應性免疫臂之細胞存在於次級淋巴器官中，準備好對新侵入起反應。
與未經治療小鼠相比，脾中之天然CD4+ T細胞(圖5B)似乎在第1天及第3天因空MVA及MVA-hIL-7-Fc而略微地減少(作用與MVA載體相關)。相反地，天然CD4+ T細胞數目在第9天因MVA-hIL-7-Fc治療而相較於未經治療小鼠而言顯著地增加(各別地16.9 × 10 6相對於9.9 × 10 6)。在注射後第29天，所有群組均展現類似數目之天然CD4+ T細胞。
儘管空MVA及MVA-hIL-7-Fc均在注射後第1天減少效應記憶CD4+ T細胞數目(圖5C)，但僅MVA-hIL-7-Fc在第3天相較於經空MVA治療之小鼠(1.6 × 10 6個細胞)及在第9天(10.6 × 10 6個細胞)而言(相較於未經治療小鼠(1.8 × 10 6個細胞)及經空MVA治療之小鼠(5.2 × 10 6個細胞)而言)顯著地增加此亞群(3.8 × 10 6個細胞)。在第29天仍觀測到類似趨勢。值得注意地，經空MVA治療之小鼠在第9天展現中等增加數目之CD4+效應記憶細胞，該數目顯著地高於未經治療小鼠中之數目，但亦顯著地低於經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠中之數目。對於另一效應群體(急性效應，圖5E)，與空MVA (2 × 10 6個細胞)及未經治療小鼠(1.4 × 10 6個細胞)相比，MVA-hIL-7-Fc在注射後第9天顯著地增加此群體(3.8 × 10 6個細胞)。
與在注射後第3天及第9天之空MVA (在第3天及第9天各別地1 × 10 6個細胞及1.4 × 10 6個細胞相對於各別地0.5 × 10 6個細胞及0.8 × 10 6個細胞)相比以及與在注射後第9天及第29天之未經治療小鼠(對於MVA-hIL-7-Fc，在第9天及第29天各別地1.4 × 10 6個細胞及1.2 × 10 6個細胞相對於對於未經治療小鼠，各別地0.4 × 10 6個細胞及0.6 × 10 6個細胞)相比，MVA-hIL-7-Fc亦顯著地增加CD4+中樞記憶細胞之數目(圖5D)。對於此細胞亞群，未觀測到相較於未經治療小鼠而言顯著的空MVA作用。
在注射後一個或若干個時間點，與空MVA相比，MVA-hIL-7-Fc特異性誘導經注射小鼠之脾中之CD4+效應記憶細胞、急性效應細胞及中樞記憶細胞。此證實MVA-hIL-7-Fc中之經編碼IL-7之作用。CD4 T細胞之該等亞群之誘導在免疫抑制之治療中至關重要，一個特定實例為敗血症誘發之免疫抑制之治療，如在特定效應記憶細胞及急性效應細胞中為在第二次感染之後展現最快特異性免疫反應之細胞。 2 .2 .2 .2 .3 脾中之CD8 + T 細胞 及CD8 + T 細胞 亞群之總數
圖6顯示以下視群組及時間點而定之總數：脾內CD8 T細胞(圖6A)以及CD8+ T細胞之各亞群，亦即天然CD8 T細胞(圖6B)、CD8+效應記憶細胞(圖6C)、CD8+中樞記憶細胞(圖6D)及CD8+急性效應記憶細胞(圖6E)。經由以下標記物識別出CD8+ T細胞之此等4個亞群：對於天然細胞，CD3+ CD8+ CD62L+ CD44-；對於效應記憶細胞，CD3+ CD8+ CD62L- CD44+；對於中樞記憶細胞，CD3+ CD8+ CD62L+ CD44+；及對於急性效應細胞，CD3+ CD8+ CD62L- CD44-。
與未經治療小鼠相比，空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)在注射後第1天均減少脾中之CD8+ T細胞總數。經空MVA或MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠展現相當含量，此表明病毒載體自身之作用(圖6A)。在第3天及第9天，與空MVA (在第3天及第9天各別地6.8 × 10 6個細胞及10.2 × 10 6個細胞)及未經治療小鼠(對於第3天及第9天各別地9.2 × 10 6個細胞及7.7 × 10 6個細胞)相比，僅MVA-hIL-7-Fc顯著地增加CD8 T細胞總數(在第3天及第9天各別地13.2 × 10 6個細胞及19.4 × 10 6個細胞)，此表明MVA-hIL-7-Fc中經編碼之IL-7對脾之整體CD8+ T細胞群體的特異性作用。
空MVA及MVA-hIL-7-Fc亦在注射後第1天強烈地減少天然CD8+ T細胞數目(圖6B)及CD8+ T中樞記憶細胞數目(圖6D)。在注射後第3天，與未經治療小鼠相比，此減少仍在二種MVA針對天然CD8+ T細胞時偵測到。相反，在相同時間點(第3天)，與空MVA (各別地10.9 × 10 6個細胞、6.6 × 10 6個細胞及16.5 × 10 6個細胞)及未經治療小鼠(各別地4.6 × 10 6個細胞、9.2 × 10 6個細胞及16 × 10 6個細胞)相比，僅MVA-hIL-7-Fc強烈且顯著地增加CD8+效應記憶細胞數目(36.6 × 10 6個細胞，圖6C)、中樞記憶細胞數目(21.1 × 10 6個細胞，圖6D)及急性效應細胞數目(35.6 × 10 6個細胞，圖6E)。此作用在注射後第9天仍被偵測到且顯著：對於MVA-hIL-7-Fc、空MVA及未經治療小鼠，各別地對於效應記憶CD8+ T細胞係33.9 × 10 6個細胞相對於11.2 × 10 6個細胞相對於2.7 × 10 6個細胞；對於MVA-hIL-7-Fc、空MVA及未經治療小鼠，各別地對於記憶中樞CD8+ T細胞係35 × 10 6個細胞相對於8.4 × 10 6個細胞相對於4.3 × 10 6個細胞；對於MVA-hIL-7-Fc、空MVA及未經治療小鼠，各別地對於急性效應CD8+ T細胞係40.5 × 10 6個細胞相對於19.7 × 10 6個細胞相對於21.1 × 10 6個細胞。在此時間點，與未經治療小鼠(48.5 × 10 6個細胞)相比，MVA-hIL-7-Fc亦顯著地增加天然CD8+ T細胞數目(88.9 × 10 6個細胞)。與空MVA (8.5 × 10 6個細胞)及未經治療小鼠(7.1 × 10 6個細胞)相比，MVA-hIL-7-Fc在注射後第29天對CD8+中樞記憶細胞(16.4 × 10 6個細胞)之作用仍顯著(圖6D)。值得注意地，儘管與未經治療小鼠相比，CD8+效應記憶細胞數目在注射後第3天、第9天及第29天因空MVA而略微地增加，但該數目仍顯著地低於MVA-hIL-7-Fc誘導之該等細胞數目。
MVA-hIL-7-Fc對脾之CD8+ T細胞具有重大作用且其作用主要由裝臂人類IL-7介導。關於CD4+ T細胞，CD8 T細胞之該等亞群之誘導在免疫抑制之治療中至關重要，一個特定實例為敗血症後之免疫抑制之治療，如在特定效應記憶細胞及急性效應細胞中為在第二次感染之後展現最快特異性免疫反應之細胞。另外，對於T細胞增殖及效應T細胞中之轉化，在注射後至多第29天CD8+中樞記憶T細胞之誘導亦為人感興趣，此係因為此等細胞為適應性記憶反應儲集器。 2 .2 .2 .2 .4 脾及胸腺中之T 細胞中之Bcl2 表現
Bcl2為存活基因，對應蛋白質在抗細胞凋亡過程中發揮一定作用。在此實驗之小鼠之脾內之T細胞上以及在胸腺細胞上監測Bcl2表現(圖7)。在注射後第1天及第3天及在來自3組中之各者之小鼠上藉由流式細胞量測術分析平均螢光強度(MFI)。
圖7顯示表示為MFI的脾中之CD4+ T細胞(圖7A)、CD8+ T細胞(圖7B)上及胸腺細胞上之Bcl2表現(圖7C)。MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)在注射後第1天在脾中之CD4+ T細胞上特異性誘導相較於展現類似含量之空MVA (344)及未經治療小鼠(342)而言較高的Bcl2 MFI (442，圖7A)。在第1天，來自脾之CD8+ T細胞中經表現之Bcl2之MFI (圖7B)相較於未經治療小鼠(483)而言亦在經空MVA治療之小鼠中顯著地較高(630)，且相比於經空MVA治療之小鼠及未經治療小鼠而言在經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠中顯著地較高(757)。在第3天，3組看起來相當。在脾中，空MVA及/或MVA-hIL-7-Fc似乎快速地增加CD4 T細胞及CD8+ T細胞上之Bcl2表現。
在胸腺中，空MVA及MVA-hIL-7-Fc在注射後第3天相較於未經治療小鼠(131)而言增加Bcl2表現(各別地227及246)。此所觀測到之空MVA及MVA-hIL-7-Fc之作用為等效的，此表明作用主要由MVA自身介導。
總體而言，空MVA及/或MVA-hIL-7-Fc改進抗細胞凋亡蛋白Bcl2表現，極早地在注射後第1天在脾中之CD4 T細胞及CD8 T細胞上及在第3天在胸腺中。如在敗血症中所描述，免疫細胞經歷大規模細胞凋亡，該細胞凋亡為MVA-hIL-7-Fc改進諸如Bcl2之抗細胞凋亡蛋白之表現的令人感興趣的潛在治療作用。 2 .2 .2 .2 .5 胸腺內之細胞亞群比例
圖8表示屬於3組且視時間點(第1天及第3天)而定之胸腺內之各細胞亞群百分比。將胸腺細胞分成4個亞群：雙陰性細胞(DN，其為CD4-及CD8-)、雙陽性細胞(DP，其為CD4+及CD8+)、單陽性CD4+ (SP CD4+，其為CD8-及CD4+)及單陽性CD8+ (SP CD8+，其為CD8+及CD4-)。胸腺中之分化路徑為分化成DP細胞之第一個DN細胞，該等DP細胞分化成SP CD4+或SP CD8+，且隨後成熟SP CD4+及SP CD8+可遷移出胸腺以在生物體中發揮其作用。在用空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療後，4個細胞亞群之比例與未經治療小鼠相比在注射後第1天不經調節(圖8A)。相反地，在注射後第3天，空MVA及MVA-hIL-7-Fc減少DP細胞百分比達至類似程度(在未經治療小鼠中73%至對於空MVA及MVA-hIL-7-Fc各別地58%及56%)，而二種MVA均增加SP CD4+細胞比例(與對於未經治療小鼠之12%相比，對於二種MVA均為22%)及SP CD8+細胞比例(與對於未經治療小鼠之7%相比，對於空MVA及MVA-hIL-7-Fc各別地為12%及13%) (圖8B)。所有百分比均返回至等效於在第9天及第29天未經治療小鼠之值(未示出)。此等資料表明，MVA (空或編碼IL-7)能夠推動T細胞自胸腺分化，此係因為其似乎增加單陽性細胞(CD4+或CD8+)百分比，此舉將促進胸腺外部存在成熟T細胞。在敗血症後之免疫抑制之情形下，觀測到淋巴球減少症，且此免疫抑制階段中之療法目標中之一者在於恢復正常淋巴球計數。預期MVA-hIL-7-Fc對胸腺及對T細胞分化之作用有益於恢復正常淋巴球計數。 2 .2 .2 .2 .6 嗜中性球及骨髓樹突狀細胞數目
圖9表示視治療及時間點而定之脾中之嗜中性球數目(圖9A)及骨髓樹突狀細胞(mDC)數目(圖9B)。在第1天，與未經治療小鼠相比，空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)均傾向於增加嗜中性球數目。明顯地，MVA-hIL-7-Fc在以下時間誘導嗜中性球數目顯著地增加：注射後第3天(1.9 × 10 6個細胞)及第9天(1.1 × 10 6個細胞)，此係相較於未經治療小鼠(在第3天0.49 × 10 6個細胞及在第9天0.3 × 10 6個細胞)及/或空MVA (在第3天0.42 × 10 6個細胞及在第9天0.6 × 10 6個細胞)而言。所有3組在第29天均展現數目相當之嗜中性球。嗜中性球為在宿主防禦包括感染之各種攻擊中發揮重要作用之重要細胞。嗜中性球可在免疫抑制情形下，如例如在敗血症誘發之免疫抑制中更改。因此，MVA-hIL-7-Fc誘導嗜中性球之能力表示達到嗜中性球之體內恆定恢復的強有利條件。
平行地，與未經治療小鼠(9.3 × 10 5個細胞)相比，脾中之mDC監測顯示空MVA (1.3 × 10 5個細胞)及MVA-hIL-7-Fc (3.2 × 10 5個細胞)在注射後第3天顯著地減少mDC。對於此減少之一個假設為MVA對mDC之可能性感染引起該等細胞凋亡(在感染後48小時由MVA誘導)，同時該等細胞在脾內表現經編碼hIL-7。相反地，在第9天，與空MVA (6.1 × 10 5個細胞)及未經治療小鼠(4.6 × 10 5個細胞)相比，MVA-hIL-7-Fc特異性誘導mDC顯著地增加(14.4 × 10 5個細胞)，而未經治療小鼠及經空MVA治療之小鼠中之mDC數目相當(空MVA誘導之減少恢復)。在各組中，mDC數目在第29天相當，所觀測到之作用為短暫的。在免疫抑制且特定而言敗血症誘發之免疫抑制階段期間，mDC數目減少。在第9天MVA-hIL-7-Fc對此等細胞數目之作用對於恢復該等細胞數目有吸引力。 2 .2 .2 .2 .7 單核球亞群數目
在免疫抑制且特定而言敗血症誘發之免疫抑制期間，單核球明顯受影響。儘管更多描述IL-7對T細胞具有活性之事實，但監測MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)及其對照空MVA (MVATGN33.1)對單核球之作用。特定而言，對小鼠中已描述之3個單核球亞群進行染色：具有促炎性且施加吞噬作用之單核球亞群(展現Ly6C 高) (圖10A)，僅具有促炎性之單核球亞群(Ly6C 中等) (圖10B)及經描述為組織/巨噬細胞中之巡邏者之單核球亞群(展現Ly6C 低) (圖10C)。單核球分化之天然方式係自Ly6C 高階段至Ly6C 低階段。
在此實驗中，關於以上段落中所描述之其他細胞群體，在未經治療小鼠中觀測到之情況相比，空MVA及MVA-hIL-7-Fc在第1天誘導脾中之3個單核球亞群數目略微地減少，作用可能由MVA載體介導。對於Ly6C 高單核球，MVA-hIL-7-Fc在第3天相較於空MVA (63.9 × 10 4個細胞)及未經治療小鼠(36.6 × 10 4個細胞)而言特異性誘導此等單核球強烈且顯著地增加(185.5 × 10 4個細胞)。3組中之此等Ly6C 高單核球數目在第9天及第29天再次變得相當。對於Ly6C 中等單核球，MVA-hIL-7-Fc亦在以下時間誘導強烈且顯著地增加：第3天(106.4 × 10 4個細胞)及第9天(192.5 × 10 4個細胞)，此係相較於空MVA及未經治療小鼠(在第3天各別地42.3 × 10 4個細胞及23.3 × 10 4個細胞以及在第9天各別地53.2 × 10 4個細胞及8.8 × 10 4個細胞)而言。值得注意地，在第9天，相較於未經治療小鼠而言，空MVA亦誘導此等細胞增加。各組中之此等單核球數目在第29天再次變得相當。對於Ly6C 低單核球，MVA-hIL-7-Fc亦在以下時間特異性誘導此等單核球顯著地增加：第3天(61.1 × 10 4個細胞)及第9天(68.54 × 10 4個細胞)，此係相較於空MVA及未經治療小鼠(在第3天各別地28.5 × 10 4個細胞及29.1 × 10 4個細胞以及在第9天各別地17.4 × 10 4個細胞及11.7 × 10 4個細胞)而言。類似於其他單核球亞群，各組中之此等亞群數目在第29天變得相當。
此等資料表明，MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)對單核球具有活性，該活性似乎主要由裝臂IL-7介導(似乎亦因空MVA而增加、但達到比MVA-hIL-7-Fc低之含量的Ly6C 中等單核球除外)。其在注射後第3天第一次誘導Ly6C 高單核球(「不成熟單核球」)，此情況在後續時間點消失。其他單核球Ly6C 中等及Ly6C 低亦在第3天立即增加，但在第9天展現等效或甚至更強烈的增加，而Ly6C 高單核球返回至在未經治療小鼠中觀測到之「正常」值。此觀測結果可表明，MVA-hIL-7-Fc誘導單核球，該等單核球隨後在第3天與第9天之間分化成Ly6C 中等及Ly6C 低單核球。所有群組在第29天再次相當，此指示此誘導為短暫的。關於在敗血症誘發之免疫抑制期間單核球之經更改特點，所觀測到之MVA-hIL-7-Fc對單核球之作用特別為人感興趣。 2 .2 .3 實驗3 ： 健康C57BL6 /J 小鼠之肺細胞上之MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 及空MVA (MVATGN33 .1 ) 活性 2 .2 .3 .1 肺細胞數目
在肺製備之後，使用Muse細胞分析儀對總體回收細胞進行計數(圖27A)。在注射後第3天，與未經治療小鼠相比，MVATGN33.1顯著地增加肺細胞數目。與未經治療小鼠相比，MVA-hIL-7-Fc亦顯著地增加此細胞數目。另外，經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠中之肺細胞數目增加顯著地高於針對經MVATGN33.1治療之小鼠觀測到之肺細胞數目增加，此表明裝臂MVA之活性更強。在注射後第9天，與未經治療小鼠相比，經MVATGN33.1治療之小鼠不展現細胞肺數目之任何增加，而經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠仍展現細胞肺數目之顯著增加，該增加顯著地高於未經治療或經MVATGN33.1治療之小鼠之細胞肺數目增加。 2 .2 .3 .2 肺中之經活化NK 細胞、CD8 + T 細胞 及CD4 + T 細胞 數目
藉由流式細胞量測術評估肺細胞中之經活化NK細胞、CD8+ T細胞及CD4+ T細胞(例如：展現CD69標記物)數目。
當與未經治療小鼠中之經活化NK細胞數目相比時，MVATGN33.1及MVA-hIL-7-Fc均在注射後第3天顯著地增加經活化NK細胞數目(圖27B)。當與MVATGN33.1相比時，MVA-hIL-7-Fc甚至顯著地增加經活化NK之此等數目，此表明裝臂之作用顯著。在注射後第9天，所有3組之CD69+ NK細胞數目均等效。
當與未經治療小鼠相比時，MVATGN33.1及MVA-hIL-7-Fc亦在注射後第3天顯著地增加經活化CD8+ T細胞數目(圖27C)。MVA-hIL-7-Fc誘導之增加顯著地強於MVATGN33.1誘導之增加，此再次表明hIL-7-Fc裝臂對此參數之活性顯著。在注射後第9天，與未經治療小鼠相比，經MVATGN33.1或MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠仍展現顯著較高數目之CD69+ CD8+ T細胞。儘管如此，經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠與經MVATGN33.1治療之小鼠之間不存在統計學上顯著之差異。
對於經活化CD4+ T細胞，與未經治療小鼠及經MVATGN33.1治療之小鼠相比，僅MVA-hIL-7-Fc展現該等細胞數目之顯著增加，此表明此時間點之裝臂作用。在注射後第9天，與未經治療小鼠相比，MVATG18897及MVATGN33.1經顯示為增加CD69+ CD4+ T細胞數目，且MVATGN33.1與MVA-hIL-7-Fc之間的差異亦為顯著的，其中經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠中細胞數目較高。 2 .2 .4 實驗4 ： 健康C57BL6 /J 小鼠之脾及肺細胞上之MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 及hIL -7 -Fc 蛋白活性 2 .2 .4 .1 肺細胞數目
在肺製備之後，使用Muse細胞分析儀對總體回收細胞進行計數(圖28A)。在注射後第3天，hIL-7-Fc及MVATG18897均顯著地增加肺中之總細胞數目。儘管如此，經MVATG18897治療之小鼠中之數目更大程度且顯著地較高。在注射後第9天，未經治療或經治療之3組展現類似數目之肺細胞。 2 .2 .4 .2 肺中之經活化 (CD69 +) NK 細胞、CD8 + T 細胞 及CD4 + T 細胞 數目
與未經治療小鼠相比，經MVATG18897治療之小鼠之肺中經活化(CD69+) NK細胞數目在注射後第3天強烈且顯著地增加(圖28B)。此等數目返回至與在注射後第9天未經治療小鼠之位準相當之位準。平行地，hIL-Fc蛋白對此等經活化細胞不展現任何活性，此係因為該等細胞數目與未經治療小鼠在注射後第3天及第9天的細胞數目類似。
關於CD69+ CD8+ T細胞，hIL-7-Fc蛋白傾向於在第3天增加該等細胞數目(儘管此增加不顯著) (圖28C)。此等數目等效於未經治療小鼠在注射後第9天之數目。平行地，與未經治療小鼠及經hIL-7-Fc治療之小鼠相比，MVATG18897在注射後第3天強烈且顯著地增加該等細胞數目。在注射後第9天，當與未經治療小鼠及經hIL-7-Fc蛋白治療之小鼠相比時，經MVATG18897治療之小鼠仍展現顯著較高數目之CD69+ CD8+ T細胞。
關於CD69+ CD4+ T細胞，當與未經治療小鼠相比時，hIL-7-Fc在注射後3天顯著地增加該等細胞數目(圖28D)。在注射後9天不再觀測到hIL-7-Fc對此等細胞有作用。當與未經治療小鼠相比時以及當與經hIL-7-Fc治療之小鼠相比時，MVATG18897在注射後第3天強烈且顯著地增加該等細胞數目。在注射後第9天，當與未經治療小鼠及經hIL-7-Fc治療之小鼠相比時，MVATG18897仍誘導CD69+ CD4+ T細胞數目顯著地增加。
在肺中之此等3個細胞群體上，MVATG18897活性明顯顯著地高於hIL-7-Fc蛋白中之一者，此表明對使此類病毒載體中之hIL-7-Fc載體化感興趣。此特別為人感興趣，此係因為免疫抑制敗血性患者中之大部分繼發性感染為肺繼發性感染，且此等經誘導之經活化免疫細胞將直接在感染部位上迅速引發免疫反應。 2 .2 .4 .3 脾及肺中CD8 + T 細胞 產生細胞介素之能力 .
在TCR刺激之後，經由ICS監測脾及肺中之CD8+ T細胞之功能性。
在脾中，在第3天，當與未經治療小鼠(0.6%之平均值)相比時，僅產生IFN-γ之CD8+ T細胞百分比(圖29A)因hIL-7-Fc蛋白及MVATG18897而顯著地增加。MVATG18897誘導之增加(6.5%之平均值)顯著且大大地高於hIL-7-Fc誘導之增加(2%之平均值)。在第9天，經hIL-7-Fc蛋白治療之小鼠展現類似於未經治療小鼠之百分比(約0.6%至0.9%之平均值)，而經MVATG18897治療之小鼠仍展現顯著較高百分比之產生IFNγ之CD8+ T細胞(7.5%之平均值)。可針對產生IFNγ及TNFα之CD8+ T細胞進行類似觀測(圖29C)。與未經治療小鼠相比(0.2%之平均值)，hIL-7-Fc在注射後第3天略微但顯著地增加該等細胞百分比(2.3%之平均值)，且在注射後第9天不再存在作用。當與未經治療小鼠及經hIL-7-Fc治療之小鼠相比時，MVATG18897在其一方面在第3天強烈且顯著地增加此等細胞百分比(8.5%之平均值)。儘管不太重要，但此作用在注射後第9天仍明顯顯著。對於產生3種細胞介素(IFNγ及TNFα以及IL2)之CD8+ T細胞(圖29E)，當與未經治療小鼠(0.5%之平均值)相比時，hIL-7-Fc蛋白在注射後第3天顯著地增加該等細胞百分比(1.2%之平均值)，且在注射後第9天不再觀測到此作用。MVATG18897在注射後第3天及第9天各別地以2.6%及1.5%之平均值誘導此等多功能細胞百分比強烈且顯著地增加。在脾中，MVATG18897顯著地優於hIL-7-Fc蛋白以在TCR刺激之後誘導能夠產生細胞介素之CD8+ T細胞。MVAtG18897誘導之此等功能性T細胞將能夠顯著地促進對未來潛在的繼發性感染之控制。
在肺中，儘管在脾中具有活性，但當與未經治療小鼠相比時，hIL-7-Fc在注射後第3天及第9天不能夠增加產生僅IFNγ、或IFNγ及TNFα、或IFNγ、TNFα及IL2之CD8+ T細胞百分比(圖29B、29D及29F)。對於產生IFNγ之CD8+ T細胞，在注射後3天僅可觀測到輕微趨勢(2.8%之平均值，此係相較於未經治療小鼠之1.8%而言)。相反地，當與未經治療小鼠及經hIL-7-Fc治療之小鼠相比時，MVATG18897能夠在注射後第3天及第9天強烈且顯著地增加肺中之產生IFNγ、IFNγ/TNFα及IFNγ/TNFα/IL2之CD8+ T細胞百分比。
在肺中，MVATG18897能夠加強CD8+ T細胞產生細胞介素之能力，而hIL-7-Fc蛋白對此器官中之CD8+ T細胞之功能性僅具有極差活性。在肺繼發性感染之情況下，預見肺中之功能性CD8+ T細胞之存在為明顯優點，此係因為此等功能性細胞將能夠經由至少產生細胞介素而直接在潛在感染部位上迅速控制感染。
總體而言，MVATG18897與hIL-7-Fc之比較顯示，hIL-7-Fc對脾中之一些細胞具有活性，但MVATG18897在此器官中展現明顯較強活性。由於MVATG18897而在脾中存在許多經活化及功能性免疫細胞表明，在繼發性感染之情況下，總體免疫系統將能夠更快速地對抗繼發性感染。另外，僅MVATG18897對肺中之免疫細胞，特定而言T細胞之功能性具有強烈且顯著的活性。準備好直接在潛在繼發性感染部位上引發快速且強烈的免疫反應之該等細胞之存在為MVATG18897的額外有利特點。此等情況表明健康小鼠中MVATG18897對hIL-7-Fc之差異及優越性。 2 .3 活體內評估CLP 小鼠中之MVATG18897 2.3.1 存活
自第0天至第4天，亦即在第4天之MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之前追蹤所有CLP小鼠及對照經Sham操作小鼠中之小鼠存活(圖11A)。與其中未觀測到死亡之對照Sham組(5/5隻小鼠)相比，33隻CLP小鼠中之二十五隻(76%)在第4天仍存活。在第4天，隨後，將存活CLP小鼠分成二組：在第4天投與MVA-hIL-7-Fc之CLP小鼠(n=15)及保持未經治療之對照CLP小鼠(n=10)。在第7天，儘管7/10隻未經治療CLP小鼠(70%)仍存活，但所有經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠均存活(圖11B)。
此結果顯示，MVA-hIL-7-Fc具有活性且顯著地延長CLP誘發之敗血性小鼠之存活，此表明MVA-hIL-7-Fc可改進宿主免疫系統以對抗感染。 2 .3 .2 . 循環hIL -7 -Fc在第7天，亦即在MVA-hIL-7-Fc治療之後3天，藉由hIL-7特異性ELISA測定經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠中產生之循環hIL-7-Fc的含量。在經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之血清中量測到大量人類IL-7 (9600 pg/mL) (圖12)。如所預期，在未經治療CLP小鼠及Sham小鼠之血清中觀測到不可偵測含量之hIL-7。此情況表明，MVA-hIL-7-Fc可轉導免疫抑制CLP小鼠中之細胞且hIL-7-Fc轉殖基因由MVA充分表現且在血液中釋放至可偵測含量。 2 .3 .3 CLP 小鼠中之MVATG18897 之 生物學活性
隨後，評估MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)恢復或加強CLP誘發之免疫抑制敗血性小鼠之免疫系統之能力。在MVA-hIL-7-Fc投與後三天，評估與未經治療CLP小鼠及對照Sham小鼠相比經治療CLP小鼠中之總體發炎性狀態及免疫細胞區室。 2 .3 .3 .1 . 總體發炎性狀態
藉由在經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之敗血性CLP操作小鼠之血清中給藥促炎性細胞介素及抗炎性細胞介素來測定動物之整體發炎性狀態。
在手術後七天及MVA-hIL-7-Fc治療後3天，評估Sham小鼠、未經治療CLP小鼠及經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之血清中之IFNγ含量(圖13)。儘管IFNγ含量在Sham小鼠中低於偵測下限值且在未經治療CLP組中係在低值下(各別地0.6 pg/mL及1.9 pg/mL)，但在經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之血清中量測到顯著較高含量之IFNγ (12.4 pg/mL)。因為已在危重病敗血性患者中報導IFNγ治療之治療作用，故在改善此等患者之免疫系統中特別對MVA-hIL-7-Fc治療誘導循環IFNγ感興趣。
此等結果表明，MVA-hIL-7-Fc在敗血症誘發之後4天投與時不加重顯示其免疫效能之敗血性動物之總體發炎性狀態，且在血清中量測之細胞介素無重大變化，IFNγ除外。引起關注地，MVA-hIL-7-Fc促進血液中IFNγ之生產，此舉可有助於改進受損宿主免疫系統。 2 .3 .3 .2 . 表徵脾中之免疫細胞子集 2 .3 .3 .2 .1 . 細胞表型分型
藉由流式細胞量測術測定MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療對免疫抑制CLP小鼠之脾中受損細胞區室之恢復的作用。圖14顯示脾中之不同細胞子集之組成。如文獻中所觀測，在手術後七天，CLP小鼠呈現脾腫大。CLP小鼠中之總脾細胞實際上比Sham小鼠中之總脾細胞多2.2倍(各別地144 × 10 6個細胞及73 × 10 6個細胞；圖14A)。MVA-hIL-7-Fc治療產生與Sham小鼠中類似數目之總脾細胞(70 × 10 6個細胞)。此結果引起關注，此係因為其表明，MVA-hIL-7-Fc幫助敗血性CLP小鼠之免疫系統恢復正常生理條件。
CLP小鼠中之總T細胞(CD3 +)與Sham小鼠相比大大地減少(各別地7 × 10 6個細胞及25 × 10 6個細胞)，此為敗血性CLP小鼠中誘發之免疫抑制之標誌(圖14B)。在投與MVA-hIL-7-Fc之CLP小鼠中，顯著且部分地回收T細胞區室(12 × 10 6個細胞)，此表明MVA-hIL-7-Fc在CLP小鼠中有效，此係因為IL-7之主要已知作用中之一者即使在免疫抑制受試者中亦誘導T細胞增殖。
與Sham小鼠相比，在未經治療CLP小鼠中，集中於作為C8+ T細胞及CD4+ T細胞之CD3+亞群，二者均強烈地減少(圖14C及圖14D)。MVA-hIL-7-Fc與未經治療CLP小鼠相比顯著地增加CD8+ T細胞數目，從而與Sham小鼠相比部分地恢復該等細胞數目(圖14D)。MVA-hIL-7-Fc對CD4+ T細胞群體之作用不太明顯，不管增加此等細胞群體之趨勢如何(圖14C)。
MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)能夠恢復與此模型以及人類中之敗血症誘發之發病機制有關之CLP小鼠之脾內的正常細胞數目。更具體而言，其亦能夠部分地恢復脾中之T細胞(CD3+ T細胞整體且特定而言此群體內之CD8+ T細胞)數目，該等數目在未經治療CLP小鼠中強烈地減少。總體而言，裝臂MVA經顯示為至少部分地恢復免疫抑制敗血性小鼠內之脾中T細胞的免疫體內恆定。 2 .3 .3 .2 .2 . 細胞活化
經由利用流式細胞量測術定量表現CD69之細胞來研究MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療對免疫細胞活化之作用。圖15顯示脾之不同細胞子集中之CD69 +細胞數目及百分比。
當與Sham小鼠(0.9 × 10 6個細胞)及未經治療CLP小鼠(1.9 × 10 6個細胞)相比時，經MVA-IL-7-Fc治療之CLP小鼠之脾中CD69 +B細胞之絕對計數(圖15A)顯著地增加(4 × 10 6個細胞)。
關於CD69 +CD4 T細胞，儘管其數目在Sham小鼠及未經治療CLP小鼠中類似(各別地1.1 × 10 6個細胞及0.8 × 10 6個細胞)，但與未經治療CLP小鼠相比，經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠中之CD69 +CD4 T細胞計數顯著地增加(1.3 × 10 6個細胞；圖15B)。
儘管Sham小鼠與CLP小鼠之間的CD69 +CD8 T細胞數目類似(各別地0.35 × 10 6個細胞及0.25 × 10 6個細胞；圖15C)，但在經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠中量測到經活化CD69 +CD8 T細胞數目重要地增加(1.04 × 10 6個細胞)。
Sham小鼠及未經治療CLP小鼠中之表現活化標記物CD69之NK細胞數目再次類似(各別地0.2 × 10 6個細胞及0.3 × 10 6個細胞；圖15D)，且在MVA-hIL-7-Fc治療之後顯著地增加(0.8 × 10 6個細胞)。
總而言之，此等資料表明，在誘發敗血症之後4天的MVA-hIL-7-Fc治療誘導敗血性免疫抑制CLP小鼠之脾中CD4 T細胞及CD8 T細胞區室之部分恢復，對於後者而言，該部分恢復為顯著的。此結果至關重要，此係因為危重病敗血性患者中之主要問題中之一者為T細胞區室之恢復。此外，CLP小鼠中之MVA-hIL-7-Fc投與增加包括T細胞、NK細胞及B細胞之各種細胞子集中之經活化細胞數目，此舉可促進對抗腹腔感染。 2 .3 .3 .3 . 表徵血液中之免疫細胞子集 2 .3 .3 .3 .1 . 細胞表型分型
關於脾，亦研究與未經治療CLP小鼠相比經治療CLP小鼠中MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)對恢復血液中之免疫細胞區室之作用。圖16顯示經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠或未經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠中每微升血液之不同細胞子集之絕對計數。
在投與MVA-hIL-7-Fc之CLP小鼠中量測到相較於未經治療CLP小鼠而言顯著較高濃度之總CD3 +細胞(各別地1310個細胞/微升及794個細胞/微升；圖16A)。
在CD3 +細胞中，CD4 T細胞濃度在MVA-hIL-7-Fc治療後相較於未經治療CLP小鼠而言顯著地增加(各別地577個細胞/微升及336個細胞/微升；圖16B)。
儘管不顯著，但經治療CLP小鼠中之血液中之CD8 T細胞濃度相較於未經治療小鼠而言亦增加(各別地595個細胞/微升及396個細胞/微升；圖16C)。
關於NKT細胞，儘管在血液中在低數目下可偵測，但在投與MVA-hIL-7-Fc之CLP小鼠中量測到相比於未經治療CLP小鼠而言顯著較高濃度之此細胞子集群體(各別地29個細胞/微升及18個細胞/微升；圖16D)。
關於血液中之NK細胞，注意到相同觀測結果。在一微升經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之血液中量測到相比於未經治療CLP小鼠而言更多的NK細胞(各別地272個細胞/微升及154個細胞/微升；圖16E)。
在經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之血液中觀測到相較於對照CLP小鼠而言某種程度上增加之B細胞濃度(各別地1951個細胞/微升及1318個細胞/微升；圖16F)。
亦在經治療CLP小鼠中觀測到相較於未經治療CLP小鼠而言某種程度上增加之CD11c +細胞(各別地36個細胞/微升及14個細胞/微升；圖16G)。
最後，在經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠中觀測到當與未經治療CLP小鼠相比時特別地強烈增加之CD11b +細胞計數(各別地2514個細胞/微升及1068個細胞/微升；圖16H)。 2 .3 .3 .3 .2 . 細胞活化
經由利用流式細胞量測術定量表現CD69之細胞來研究MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療對循環免疫細胞子集活化之作用。圖17顯示不同血細胞子集中之CD69 +細胞數目。MVA-hIL-7-Fc投與引起CLP小鼠中之CD69 +CD4 T細胞相較於未經治療CLP小鼠而言增加4倍(各別地18.5個細胞/微升及4.7個細胞/微升；圖17A)。
經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠中之血液中之經活化CD8 T細胞亦顯著地增加。在經治療CLP小鼠中觀測到相較於對照CLP小鼠而言多五倍之CD69 +細胞/微升血液(各別地69個細胞/微升及14個細胞/微升；圖17B)。
關於B細胞，每微升經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠血液之CD69 +B細胞數目相較於未經治療CLP小鼠而言增加3.7倍(各別地77個細胞/微升及21個細胞/微升；圖17C)。
圖17D繪示循環NK細胞之活化狀態。經治療CLP小鼠中之血液中之CD69 +NK細胞濃度增加相較於未經治療CLP小鼠而言多3.8倍(各別地180個細胞/微升及48個細胞/微升)。
總體而言，吾等表明，MVA-hIL-7-Fc顯著地增加敗血性免疫抑制小鼠之血液中之T細胞隔室，特定而言CD4 T細胞計數。此結果為臨床上相關的，此係因為敗血性患者之血液中之T細胞數目高度消減。此外，在MVA-hIL-7-Fc投與後CLP小鼠中包括T細胞、B細胞及NK細胞之數個細胞子集之活化增強。此結果為人感興趣，此係因為MVA-hIL-7-Fc治療可經由活化循環免疫細胞來加強危重病敗血性患者之受損免疫系統以便加速對新感染之控制及/或預防新感染。 2 .3 .3 .4 .MVA -hIL -7 -Fc 治療對T 細胞 功能之作用
免疫細胞之功能在對導致高死亡率之繼發性感染變得高度敏感之敗血性免疫抑制患者中強烈減弱。因此，恢復或加強敗血性患者中之免疫細胞之功能至關重要。隨後，研究CLP誘發之敗血性小鼠中MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療對免疫功能，特定而言適應性免疫之改進。 2.3.3.4.1 IFNγ ELISpot 分析
圖18A顯示響應於抗CD3抗體刺激總脾細胞之IFNγ ELISpot分析之結果。MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療相較於Sham小鼠組及未經治療CLP小鼠組(各別地17個斑點/10 5個細胞及48個斑點/10 5個細胞)而言引起CLP小鼠之脾中產生IFNγ之T細胞頻率極大地增加(1314個斑點/10 5個細胞)。
圖18B繪示三組中之各者中之斑點尺寸(平均值)。儘管Sham組及未經治療CLP組中之平均斑點尺寸類似(各別地5 × 10 -3mm²及7 × 10 -3mm²)，但所獲得之經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之細胞之平均值顯著地增加2.6倍(18 × 10 -3mm²)，此反映來自經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之各產生IFNγ之細胞產生較大量IFNγ的能力(斑點尺寸與各細胞所產生之IFNγ之量成比例)。
此結果至關重要，此係因為敗血性患者中之T細胞IFNγ反應描述為受損的。MVA-hIL-7-Fc治療可實際上加強免疫抑制敗血性受試者之適應性免疫系統以預防或對抗感染，因此提高其存活。 2 .3 .3 .4 .2 三重胞內細胞介素染色分析
亦藉由測定在經抗CD3抗體及抗CD28抗體刺激之後產生IFNγ、IL2及/或TNFα之CD4 T細胞及CD8 T細胞百分比來評估T細胞功能性。
圖19A顯示在總CD4 T細胞中表現細胞介素中之一者、二者或三者之CD4 T細胞的總百分比。引起關注地，MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療能夠加強CD4反應。在經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之脾細胞之情況下量測到相較於未經治療CLP小鼠而言顯著較高百分比之產生細胞介素之CD4 T細胞(各別地27%及20%)。
關於CD8 T細胞反應(圖19B)，投與MVA-hIL-7-Fc之CLP小鼠中產生細胞介素之CD8 T細胞百分比當相較於未經治療CLP小鼠而言時令人印象深刻地加倍(各別地63%及32%)。
圖20繪示在所執行之ICS分析中藉由MVA-hIL-7-Fc治療顯著地改進之總CD4 T細胞群體中雙或三細胞介素陽性CD4 T細胞子集中之各者的百分比。當相較於未經治療CLP小鼠而言時，MVA-hIL-7-Fc顯著地增強IFNγ +TNFα +(各別地0.2%及0.9%)及IL2 +TNFα +(各別地6.9%及9.4%) CD4 T細胞子集(圖20A-B)。平行地，投與MVA-hIL-7-Fc之CLP小鼠中之三IFNγ +IL2 +TNFα +CD4 T細胞百分比相比於未經治療CLP小鼠而言較高(各別地2.3%及1.0%；圖20C)。
圖21繪示藉由MVA-hIL-7-Fc顯著地改進之總CD8 T細胞群體中單、雙或三細胞介素陽性CD8 T細胞子集之百分比。在單細胞介素陽性CD8 T細胞當中，經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠中之IFNγ +CD8 T細胞子集百分比相較於未經治療CLP小鼠而言顯著地增加2.2倍(各別地7.0%及3.2%) (圖21A)。關於雙細胞介素陽性CD8 T細胞，在MVA-hIL-7-Fc治療後在CLP小鼠中誘導相較於未經治療CLP小鼠而言大大增加的IFNγ +TNFα +CD8 T細胞子集(各別地18.8%及2.3%) (圖21B)。值得注意地，儘管三細胞介素陽性CD8 T細胞在Sham小鼠中幾乎不可偵測，但經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之脾細胞獲得相較於未經治療CLP小鼠之細胞而言重要的三IFNγ +IL2 +TNFα +CD8 T細胞之誘導(各別地7.7%及1.7%) (圖21C)。
綜合而言，來自ELISPOT及ICS分析之資料顯示MVA-hIL-7-Fc提高CLP小鼠中之CD4 T細胞及CD8 T細胞之功能性的能力。因此，MVA-hIL-7-Fc治療可促進藉由增加快速產生細胞介素之T細胞百分比來幫助危重病患者之免疫系統對抗或預防感染。 2 .3 .3 .4 .3 . T 細胞 釋放之細胞介素
亦藉由測定活體外活化T細胞受體後產生之促炎性細胞介素及抗炎性細胞介素之含量來評估T細胞功能性。在經抗CD3抗體塗佈之96孔盤中培養總脾細胞24小時且收取上清液用於給藥細胞介素。
所量測之細胞介素為IL-1β、IL-6、TNFα、IFNγ及IL-10 (圖22)。除了相較於Sham小鼠而言在來自未經治療CLP小鼠之細胞上清液中已顯著地較高之IL6 (圖22B)之外，來自Sham小鼠及未經治療CLP小鼠之細胞上清液展現類似量之細胞介素(圖22A；C-E)。明顯地，來自經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之細胞上清液始終展現相比於未經治療CLP小鼠及Sham小鼠而言顯著地較大量之所有測試細胞介素(圖22A-E)。值得注意地，IL1β之含量總體低於其他細胞介素中之一者。儘管如此，MVA-hIL-7-Fc使經刺激脾細胞上清液中之此細胞介素生產增加了6.4倍。對於IL6、TNFα、IFNγ及IL10，相較於未經治療CLP小鼠之細胞而言，在來自經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之細胞上清液中偵測到之量各別地增加4倍、3倍、5.5倍及2.5倍。
此額外讀數清楚地表明當與未經治療敗血性小鼠相比時MVA-hIL-7-Fc提高來自敗血性小鼠之脾細胞產生及分泌促炎性細胞介素及抗炎性細胞介素之能力的能力。吾人可預期MVA-hIL-7-Fc可藉此促進藉由提高T細胞功能性來幫助宿主免疫系統預防或對抗感染。 2 .4 活體內比較CLP 小鼠中之空MVA 與MVATG18897
為了界定MVA載體對一側之作用及hIL-7-Fc裝臂之作用，執行一項用於比較經空MVA (單獨的載體活性)及MVATG18897 (IL-7活性+載體活性)治療之CLP小鼠的實驗。值得注意地，健康未經治療小鼠用作用於免疫學分析之陽性對照，但在此處未示出。
在第0天在25隻小鼠中CLP誘發敗血症。在第4天仍存活之一半小鼠經空MVA治療且另一半經MVATG18897治療。追蹤小鼠直至第7天且將其處死以執行免疫分析。 2 .4 .1 存活
在所有CLP小鼠中自第0天至第4天，亦即在第4天之MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或MVATGN33.1 (空MVA)治療之前追蹤小鼠之存活(圖23A)。25隻CLP小鼠中之十八隻(72%)在第4天仍存活。在第4天，隨後，將存活CLP小鼠分成二組：在第4天投與MVA-hIL-7-Fc之CLP小鼠(n=9)及經空MVA治療之CLP小鼠(n=9)。在第7天，儘管6/9隻經空MVA治療之CLP小鼠(67%)仍存活，但所有經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠(9/9隻)均存活(圖23B)。
此結果顯示，與空MVA相比，MVA-hIL-7-Fc提高CLP誘發之敗血性小鼠之存活，此表明存活不僅歸因於MVA活性，且歸因於至少IL-7裝臂或甚至歸因於MVA載體與IL-7裝臂之組合。 2 .4 .2 .MVA -hIL -7 -Fc 相較於空MVA 而言對 血細胞子集之作用
藉由流式細胞量測術評估經空MVA及MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之血液內的細胞子集。圖24顯示相較於空MVA而言由MVA-hIL-7-Fc顯著地增加之細胞群體。當與空MVA治療相比時，CLP小鼠中之循環CD8+ T細胞之平均數目因MVA-hIL-7-Fc治療而幾乎加倍(圖24A)，NKT細胞亦如此(圖24B)。值得注意地，MVA-hIL-7-Fc治療相較於空MVA治療而言強烈地增加血液中之CD11b+細胞數目且增加超過3倍(圖24C)。
總體而言，此等資料證實在敗血性小鼠中IL-7在此等免疫細胞群體上裝臂之能力。此等細胞數目在敗血性情形下更改，此表明MVA-hIL-7-Fc引起該等T細胞數目增加之能力。
2.4.3. CLP 小鼠中MVA-hIL-7-Fc 相較於空MVA 而言對T 細胞 功能之比活性。
使用三重ICS分析(IFNγ、TNFα及IL2)評估經抗CD3及抗CD28刺激之脾細胞之功能性。
圖25顯示二組中用ICS偵測到之產生1、2或3種細胞介素之CD4+ T細胞百分比。圖25A顯示產生至少一種細胞介素之CD4+ T細胞總百分比。MVA-hIL-7-Fc誘導相較於空MVA而言顯著較高百分比之產生至少1種細胞介素之CD4+ T細胞(各別地44%相對於26%)。圖25B顯示所有產生IFNγ之CD4+ T細胞、所有產生TTNFα之CD4+ T細胞及所有產生IL2之CD4+ T細胞。資料明顯地證實MVA-hIL-7-Fc相較於空MVA而言增加此等產生細胞介素之群體中之各者的百分比的能力(對於經空MVA治療之小鼠，各別地為2,6%、10,1%及15,4%；且對於經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠，各別地為5,6%、38,7%及28,8%)。關於產生雙細胞介素及三細胞介素之細胞，圖25C顯示相較於空MVA而言由MVA-hIL-7-Fc顯著地改進之此等群體中之一者。相較於空MVA而言，MVA-hIL-7-Fc強烈地增加產生IFNγ/TNFα (1,22%相對於0,53%)、IFNγ/IL2 (0,45%相對於0,34%)、IL2/TNFα (20,2%相對於8,7%)及IFNγ/IL2/TNFα (3,6%相對於1,7%)之CD4+ T細胞。
圖26顯示二組中用ICS偵測到之產生1、2或3種細胞介素之CD8+ T細胞百分比。圖26A顯示產生至少一種細胞介素之CD8+ T細胞總百分比。MVA-hIL-7-Fc誘導相較於空MVA而言顯著較高百分比之產生至少1種細胞介素之CD8+ T細胞(各別地64%相對於28%)。圖26B顯示所有產生IFNγ之CD8+ T細胞、所有產生TTNFα之CD8+ T細胞及所有產生IL2之CD8+ T細胞。資料明顯地證實MVA-hIL-7-Fc相較於空MVA而言增加此等產生細胞介素之群體中之各者的百分比的能力(對於經空MVA治療之小鼠，各別地為8,7%、17,5%及4,3%；且對於經MVA-hIL-7-Fc治療之小鼠，各別地為29,6%、60,5%及15,1%)。相較於空MVA而言歸因於MVA-hIL-7-Fc之一定顯著增加亦針對僅產生IFNγ之CD8+ T細胞(4,6%相對於2,2%)及針對僅產生TNFα之CD8+ T細胞(27,9%相對於17,5%)偵測到且示於圖26C上。關於產生雙細胞介素及三細胞介素之細胞，圖26C顯示相較於空MVA而言由MVA-hIL-7-Fc顯著地改進之此等群體中之一者。相較於空MVA而言，MVA-hIL-7-Fc強烈地增加產生IFNγ/TNFα (16,8%相對於4,3%)、IL2/TNFα (6,5%相對於1,6%)及IFNγ/IL2/TNFα (7,9%相對於2%)之CD8+ T細胞。
總體而言，比較MVA-hIL-7-Fc與空MVA之作用之此實驗明顯地證實MVA表現之hIL-7-Fc之比活性，此係因為其在CLP小鼠中IV注射一次之後提高小鼠存活、增加血液中之CD8+ T細胞、NKT細胞及CD11b+細胞計數及提高脾中之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞功能性。 2 .5 比較CLP 小鼠中之MVATG18897 與 重組hIL -7 -Fc 蛋白
在CLP小鼠模型中，平行地測試MVATG18897及hIL-7-Fc蛋白。二者均在CLP後4天靜脈內注射一次，且追蹤存活直至CLP後第7天為止(對應於產品注射後3天)，且在CLP後第7天監測來自脾之一定免疫細胞。 2.5.1 存活
在對在第4天仍存活之小鼠(5隻在原始組中，5隻在MVA-IL-7-Fc或重組IL-7-Fc組中，且4隻在未經治療CLP小鼠中)進行隨機分組之後，觀測到所有注射MVA-hIL-7-Fc之小鼠(5/5隻)在CLP後第7天存活，此類似於在原始小鼠(5/5隻，無任何治療之非敗血性小鼠，亦即：存活之陽性對照)中觀測到之存活(圖30)。相比之下，各別地僅3/4隻及3/5隻未經治療CLP小鼠及經重組hIL-7-Fc治療之小鼠存活，此指示與MVA-hIL-7-Fc治療相關且與重組可溶性對應體治療不相關之存活優點。 2 .5 .2 CLP 小鼠中之免疫活性 2.5.2.1 經活化CD8 + T 細胞 及B 細胞
監測來自未經治療或經MVA-hIL-7-Fc或重組hIL-7-Fc治療之CLP小鼠之脾的展現CD69活化標記物之經活化CD8+ T細胞及B細胞(圖31)。對於CD69+ CD8+ T細胞(圖31A)，經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠當與未經治療CLP小鼠相比(增加約3倍)及與經hIL-7-Fc蛋白治療之CLP小鼠相比(增加約2倍)時展現顯著較高數目之此等經活化細胞。此結果表明，當與重組hIL-7-Fc蛋白相比時，MVA-hIL-7-Fc誘導在新感染之情況下應更具反應性之經活化CD8+ T細胞的能力更強。對於CD69+ B細胞，經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠展現數目顯著高於未經治療小鼠之此等細胞(增加約2倍)。經hIL-7-Fc蛋白治療之CLP小鼠傾向於展現相比於未經治療CLP小鼠而言略微較高數目之經活化B細胞，但此數目並不顯著，與MVA-hIL-7-Fc相反。當相較於hIL-7-Fc蛋白而言時，MVA-hIL-7誘導之CD69+ B細胞數目比蛋白質自身高約1.5倍。此表明MVA-hIL-7-Fc相較於蛋白hIL-7-Fc誘導該等細胞之優越性，該優越性將能夠在繼發性感染之情況下迅速引發免疫反應。 2 .5 .2 .2 CD8 + T 細胞之 功能性
評估3組小鼠之脾之CD8+ T細胞在TCR刺激之後產生IFNγ及/或TNFα及/或IL-2之能力(圖32)。相較於未經治療CLP小鼠而言，MVA-hIL-7-Fc誘導顯著較高百分比之產生IFNγ之CD8+ T細胞(圖32A)，且此情況係針對所有類型之產生IFNγ之CD8+ T細胞、僅產生IFNγ之CD8+ T細胞(圖32B)、產生IFNγ及TNFα之CD8+ T細胞(圖32C)及產生IFNγ及TNFα以及IL2之CD8+ T細胞(圖32D)來加以驗證。蛋白hIL-7-Fc傾向於亦增加所有此等細胞類型，但僅對於產生IFNγ及TNFα之CD8+ T細胞及產生IFNγ、TNFα及IL2之CD8+ T細胞，百分比顯著高於未經治療小鼠。因此，hIL-7-Fc之作用不如MVA-hIL-7-Fc中之一者重要，此表明MVA-hIL-7-Fc誘導功能性CD8+ T細胞之優越性。 2 .6 . 經最佳化MVA -hIL -7 -Fc
設計、構築且生產二種編碼hIL-7-Fc、MVATG18897及MVATG19791之MVA。其均在相同啟動子(pH5R)下但在MVATG19791中編碼hIL-7-Fc，密碼子經最佳化以在人類細胞中表現蛋白質。活體外比較MVATG18897與MVATG19791之hIL-7-Fc表現。如圖33 A及B上所示，CEF或A549細胞感染MVATG18897或MVATG19791。藉由西方墨點法使用抗IL-7抗體偵測細胞或上清液中之經表現hIL-7-Fc。在二種類型之細胞中、在細胞中及在上清液中，當相較於MVATG18897而言時，在MVATG19791之情況下偵測到較高量之hIL-7-Fc，如經由較大及較強頻帶所觀測。
藉由ELISA測定經感染細胞之上清液上2種細胞類型在感染MVATG18897或MVATG19791時產生hIL-7-Fc之量。如圖33C中所示，在MVATG19791之情況下偵測到之hIL-7-Fc之量優於在MVATG18897之情況下偵測到之量(在二種細胞類型中在MVATG19791之情況下偵測到之蛋白質多約1.5倍)，從而確認經由經最佳化MVATG19791進行之蛋白hIL-7-Fc表現更強。
在健康小鼠中，比較MVATG18897與MVATG19791，且其展現如所預期之相當hIL-7-Fc藥物動力學及免疫活性(資料未示出)。 2 .7 MVA -hIL -7 -Fc 所 產生之IL -7 接合相關免疫路徑且恢復免疫抑制患者中之免疫活性之能力 ， 其中該免疫抑制不由敗血症誘發
為了說明MVA-hIL-7-Fc在不同免疫抑制臨床環境中恢復免疫活性時之有益值，使用自不同患者群組獲得之全血及/或PBMC執行一系列分析。
要被測試之IL-7-Fc之來源通常在原代人類肝細胞以5之MOI感染MVATG18897感染之後獲得，且上清液係在感染之後24小時收取。使用ELISA hIL-7套組執行於上清液中之hIL-7-Fc之定量且將其儲存於-70℃下。陰性對照-上清液包括在感染空MVA (MVATGN33.1)之後收集之上清液及/或在與MVA-hIL-7-Fc相同之條件下收集之未經感染細胞。 2 .7 .1 . ICU Covid -19 免疫抑制患者 2 .7 .1 .1 CD3 + T 細胞中之pSTAT5 表現
細胞介素IL-7辨識介導信號傳導路徑之IL-7受體。IL-7信號傳導係經由Janus激酶1,3及磷酸肌醇3 (PI3k)引發，從而引起信號轉導子及轉錄活化子5 (STAT5)磷酸化。此初期路徑與IL-7之接合最終引起T細胞存活延長及增殖增加。在經來自MVA-hIL-7-Fc感染之上清液刺激之後，評估經由STAT5磷酸化進行之信號轉導，從而證實所產生之IL-7-Fc之活性。圖34顯示在用來自感染MVATG18897或MVATGN33.1細胞或未經感染細胞之上清液離體刺激COVID19+患者全血10分鐘之後在CD3+ T細胞中偵測到之表示為比率之pSTAT5表現(以未經刺激條件之值標準化在MVATG18897或MVATGN33.1感染或未經感染細胞之上清液之情況下獲得的值)。測試來自MVA感染之三種不同的上清液稀釋度(1/2.5、1/5及1/10)及未經感染細胞之一種上清液稀釋度(1/2.5)。如圖中所示，MVA-hIL-7-Fc上清液誘導強烈地增加之pSTAT5表現伴稀釋效應(對於1/2.5稀釋度、1/5稀釋度及1/10稀釋度，各別地乘以6.5、5.7及4.9)，而在經空MVA或未經感染上清液刺激之後未觀測到pSTAT5表現增加。
此等資料表明，MVA-hIL-7-Fc所產生之hIL-7-Fc由IL-7受體辨識且可經由STAT5磷酸化引發IL-7信號傳導。預期所觀測到之hIL-7-Fc介導之信號傳導會增加COVID19+患者之T淋巴球之增殖且提高其存活。 2 .7 .1 .2 CD4 + T 細胞 所產生之總IFNγ + 及IFNγ + TNFα + IL -2 +
藉由在經Duractive 1及來自MVA-hIL-7-Fc感染之上清液刺激之後由CD4+ T細胞產生之IFNγ或IFNγ TNFα IL-2之胞內染色來評估CD4+ T細胞之功能性。
圖35A及圖35B顯示各別地在用MVATG18897或MVATGN33.1或未經感染細胞之上清液離體刺激COVID19+患者全血3小時之後產生總IFNγ+或IFNγ+ TNFα+ IL-2+之CD4+ T細胞的表示為比率之百分比(以Duractive 1條件之值標準化Duractive 1 + MVATG18897或MVATGN33.1感染或未經感染細胞之上清液的值)。含有hIL-7-Fc之上清液增加產生總IFNγ之CD4+ T細胞百分比(圖35A)伴稀釋效應(對於1/2稀釋度，1.4比率，且對於1/10稀釋度，1.1比率)。觀測到來自空MVA感染之上清液在第一稀釋度(對於1/2稀釋度，1.18比率，且對於1/10稀釋度，1.0比率)中之貢獻，此表明病毒載體自身之作用。相較於其他上清液而言，觀測到未經感染細胞上清液之少量作用(1.09比率)。於上清液中之hIL-7-Fc增加由CD4+ T細胞進行之IFNγ+ TNFα+ IL-2+生產(圖35B)伴稀釋效應(對於1/2稀釋度，1.65比率，且對於1/10稀釋度，1.18比率)。在用呈二分之一稀釋度之來自空MVA及未經感染細胞之上清液刺激全血細胞之後觀測到類似作用(二者比率為1.3)，此表明經培養細胞所產生之可溶性分子的作用。在1/10稀釋度下未觀測到空MVA上清液之作用。
T細胞產生IFNγ之能力描述為在ICU中之COVID19+病患中減弱。所收集之資料指示，MVA-hIL-7-Fc所產生之IL-7-Fc促進IFN-γ生產且因此預期會加強免疫抑制COVID19+患者之適應性免疫反應以對抗感染且提高其存活。 2 .7 .2 衰老創傷患者 2 .7 .2 .1 CD8 T 細胞中之CD57 表現
吾等分析作為熟知T細胞衰老標記物之CD57在研究HIPAGE群組中之存在。如所預期且示於圖36中，來自衰老對照以及髖部骨折患者之CD8 T細胞高度表現CD57。此外，在髖部骨折患者中觀測到此標記物略微增加。 2.7.2.2 CD3+ T細胞中之pSTAT5表現
在經來自感染MVA-hIL-7-Fc之細胞之上清液刺激之後，評估經由STAT5磷酸化進行之信號轉導。圖37A顯示在用MVATG19791 (SN IL-7-Fc)或MVATGN33.1 (SN N33)之上清液離體刺激經解凍PBMC 10分鐘之後或在無刺激之後於CD3+細胞中的pSTAT5表現。
儘管pSTAT5不由未經刺激CD3+細胞表現，但在髖部骨折患者中僅經空MVA之上清液刺激之CD3+細胞不存在輕微增加。相反地，MVA-hIL-7-Fc上清液誘導二個患者組之CD3+細胞中之pSTAT5表現的大得多的增加。
此等資料表明，在上清液中產生之hIL-7-Fc由IL-7受體辨識且可經由STAT5磷酸化引發IL-7信號傳導。因此，預期hIL-7-Fc介導之信號傳導會增加T細胞增殖。 2 .7 .2 .3 T 細胞 增殖
在經來自感染MVA-hIL-7-Fc之細胞之上清液刺激之後評估增殖性CD3+細胞比例。圖37B顯示在用MVATG19791或MVATGN33.1之上清液離體刺激經解凍PBMC 5天之後或在無刺激之後於CD3+細胞中的增殖誘導。
儘管T細胞增殖在未經刺激CD3+細胞中及在經空MVA之上清液刺激之CD3+細胞中未經誘導，但MVA-hIL-7-Fc上清液強烈地誘導T細胞增殖，尤其在髖部骨折患者組中。
於上清液中產生之hIL-7-Fc增加T細胞增殖，且因此預期參與手術後衰老髖部骨折患者中之免疫恢復。 2 .7 .3 . ICU 創傷患者
藉由在經PMA/離子黴素或抗CD3/CD28抗體及來自MVA-hIL-7-Fc感染之上清液刺激之後由CD4+ T細胞產生之IFNγ或IFNγ TNFα IL-2之胞內染色來評估來自重大多創傷患者之CD4+ T細胞之功能性。
圖38A及圖38B顯示各別地在用強活化(PMA/離子黴素)或中等活化(抗CD3/CD28)離體刺激來自創傷患者之PBMC 5小時之後產生總IFNγ+或IFNγ+ TNFα+ IL-2+之CD4+ T細胞百分比。在來自感染MVATG19791或MVATGN33.1之原代肝細胞之上清液存在之情況下執行刺激。
含有hIL-7-Fc之上清液高度增加產生總IFNγ之CD4+ T細胞百分比(圖38A)。在用PMA/離子黴素進行強烈T細胞活化之後，與對照組中10,5%相比，在MVA-hIL7上清液存在之情況下18% CD4+ T細胞表現IFNγ。量測空MVA感染對上清液之貢獻(13.7%)。在SN IL7與對照組之間用抗CD3/CD28進行中等活化之後進行相同觀測(各別地3,8%及2,2%)。在未經刺激細胞中未觀測到IFNγ表現。
更具體而言，於上清液中之hIL-7-Fc增加表現IFNγ+、TNFα+及IL-2+之多功能CD4+ T細胞百分比(圖38B)。在用PMA/離子黴素進行強烈T細胞活化之後，與對照組中8%相比，在MVA-hIL7上清液存在之情況下13,5% CD4+ T細胞表現IFNγ。量測空MVA感染對上清液之貢獻(10,5%)。在SN IL7與對照組之間用抗CD3/CD28進行中等活化之後進行相同觀測(各別地2%及0,9%)。在未經刺激細胞中未觀測到IFNγ表現。
此等資料表明，於上清液中產生之hIL-7-Fc增強T細胞產生IFNγ之能力，且因此預期會參與重大多創傷性休克之後的免疫抑制患者中之適應性免疫反應之恢復。 2 .7 .3 . ICU 重大手術患者
藉由在經PMA/離子黴素或抗CD3/CD28抗體及來自MVA-hIL-7-Fc感染之上清液刺激之後由CD4+ T細胞產生之IFNγ或IFNγ TNFα IL-2之胞內染色來評估來自重大手術患者之CD4+ T細胞之功能性。
圖39A及圖39B顯示各別地在用強活化(PMA/離子黴素)或中等活化(抗CD3/CD28)離體刺激來自重大手術患者之PBMC 5小時之後產生總IFNγ+或IFNγ+ TNFα+ IL-2+之CD4+ T細胞百分比。在來自感染MVATG19791或MVATGN33.1之原代肝細胞之上清液存在之情況下執行刺激。
含有hIL-7-Fc之上清液高度增加產生總IFNγ之CD4+ T細胞百分比(圖39A)。在用PMA/離子黴素進行強烈T細胞活化之後，與對照組中5,5%相比，在MVA-hIL7上清液存在之情況下12,7% CD4+ T細胞表現IFNγ。在SN IL7與對照組之間用抗CD3/CD28進行中等活化之後觀測到相同觀測結果(各別地3,8%及2,2%)。在未經刺激細胞中未觀測到IFNγ表現。
更具體而言，於上清液中之hIL-7-Fc增加表現IFNγ+、TNFα+及IL-2+之多功能CD4+ T細胞百分比(圖39B)。在用PMA/離子黴素進行強烈T細胞活化之後，與對照組中2,5%相比，在MVA-hIL7上清液存在之情況下8,2% CD4+ T細胞表現IFNγ。在SN IL7與對照組之間用抗CD3/CD28進行中等活化之後觀測到相同觀測結果(各別地1,5%及0,6%)。在未經刺激細胞中未觀測到IFNγ表現。
此等資料表明，於上清液中產生之hIL-7-Fc增強T細胞產生IFNγ之能力，且因此預期會參與重大手術操作之後的免疫抑制患者中之適應性免疫反應之恢復，對抗繼發性感染且提高其存活。 2 .8 關於結果之一般結論
測試產品之主要作用可如下概述：
MVA-hIL-7-Fc誘導循環hIL-7產生，該循環hIL-7在注射之後在血液中迅速清楚地偵測到且在1次靜脈內注射之後至多4天仍偵測到。此注射亦誘導循環IFNγ短暫產生，該循環IFNγ在注射之後不久偵測到。此IFNγ生產係由MVA載體自身誘導。
在原始小鼠中，在IV注射一次MVA-hIL-7之後觀測到脾細胞數目增加，特定而言CD4+ T細胞、CD8+T細胞、嗜中性球、骨髓樹突狀細胞(mDC)及單核球(全部三個亞群LyC 高、Ly6C 中等及Ly6C 低)數目。在來自脾之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞當中，MVA-hIL-7-Fc特別地增加效應記憶CD4+ T細胞及中樞記憶CD4+ T細胞以及效應記憶CD8+ T細胞、中樞記憶CD8+ T細胞及急性效應CD8+ T細胞之數目。在此等CD4+ T細胞及CD8+ T細胞內，在IV注射一次MVA-hIL-7-Fc之後，抗細胞凋亡蛋白Bcl2之表現亦得到改進。在MVA-hIL-7-Fc注射之後亦觀測到胸腺細胞中之Bcl2表現增加及胸腺比例修改(雙陽性CD4+/CD8+減少及單陽性CD4+或CD8+增加)，此作用主要由MVA載體自身介導(在空MVA之情況下的類似觀測結果)。原始小鼠中所描述之所有此等活性均明顯地證實與經表現IL-7及空MVA主鏈中之任一者之貢獻有關的MVA-hIL-7-Fc藉由增加包括成熟免疫細胞之參與對抗感染之免疫細胞數目及改進此等關鍵細胞中之基因存活表現來活化免疫系統的能力。
在原始小鼠中，MVA-hIL-7-Fc顯示為誘導肺中之免疫活性，此活性部分歸因於主鏈且部分歸因於裝臂hIL-7-Fc。MVA-hIL-7-Fc增加經活化T細胞及NK細胞數目。
另外，在敗血性小鼠模型中，相較於未經治療小鼠以及經空MVA治療之小鼠而言，MVA-hIL-7顯示為提高存活，此表明MVA裝上hIL-7-Fc臂以達到保護之絕對必要性。在此相同模型中，證明MVA-hIL-7-Fc恢復正常脾細胞計數且至少部分恢復T細胞計數，特定而言CD8+ T細胞計數。在血液中，其增加數個免疫細胞之細胞計數。另外，其顯示為亦活化敗血性小鼠之脾及血液中之數個免疫細胞群體，此等細胞隨後準備好對抗新的感染性攻擊。MVA-hIL-7-Fc亦顯示為能夠加強T細胞之功能性，特定而言藉由提高產生IFNγ之細胞頻率來進行，各細胞亦能夠產生較高量之IFNγ。其亦加強能夠產生TNFα、IL2或在IFNγ、TNFα及IL2當中之2或3種細胞介素之細胞頻率。對免疫細胞活化之作用似乎主要由MVA載體自身介導，而所有其他活性似乎主要對編碼hIL-7-Fc之MVA具有特異性。
當與類似於MVA-hIL-7-Fc內經編碼之重組hIL-7-Fc的重組hIL-7-Fc之活性相比時，MVA-hIL-7-Fc顯示為優異的。作為實例，在原始健康小鼠中，MVA-hIL-7-Fc在肺中誘導顯著較高數目之經活化T細胞及NK細胞，且其亦在脾及肺中在TCR刺激之後誘導顯著較高百分比之產生細胞介素之CD8+ T細胞。在CLP小鼠中，MVA-hIL-7-Fc負責比hIL-7-Fc蛋白高之存活率且在脾中誘導更強的免疫活性。作為一實例，MVA-hIL-7-Fc誘導較高數目之經活化CD8+ T細胞及B細胞且優於hIL-7-Fc蛋白以誘導產生IFNγ (+/-其他細胞介素)之CD8+ T細胞。
另外，吾等已使用以來自三組免疫抑制臨床情境(ICU Covid-19免疫抑制患者、衰老創傷患者及ICU創傷患者)之全血及/或PBMC為主的離體分析證實，MVA-hIL-7-Fc所產生之IL-7-Fc可恢復多種免疫學減損。
總體而言，諸如使用MVA-hIL-7-Fc獲得之IL-7之載體化形式誘導寬陣列之免疫調節，該等免疫調節能夠恢復及/或改進各種ICU-臨床情境(敗血症、創傷、燒傷、大手術及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制)中或老年群體(衰老誘發之免疫抑制)中的多個免疫抑制路徑及功能。免疫反應之恢復及/或改進幫助患者對抗及/或預防感染且加速整體恢復。此等結果明顯地表明在免疫抑制之情形下投與表現IL-7之非複製型病毒載體之興趣。 書目參考文獻
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(無)
圖1 . 藉由MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 進行之hIL -7 -Fc 表現 之 活體外分析及功能性評估。
A . 西方墨點法分析。使A549細胞經空MVA (MVATGN33.1，陰性對照)或MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)活體外感染且收集上清液及細胞。在β-巰基乙醇存在或不存在之情況下經由西方墨點法分析於細胞中表現且於上清液中分泌之hIL-7-Fc。藉由抗IL-7抗體(對人類IL-7具有特異性之兔單株抗體)偵測所產生之IL-7。 B . 在活體外感染之後經由ELISA 分析hIL -7 -Fc 表現。使COS7細胞以0.3、1或3之MOI經空MVA (MVATGN33.1)或MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)感染。在感染後48至72小時收集經感染細胞之上清液，且遵循ELISA偵測經表現之hIL-7。視所使用之MOI及載體而定之所偵測之IL-7濃度(以ng/mL為單位表示)表示於圖式上。黑色條柱對應於感染MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之細胞且空心條柱表示感染空MVA之細胞。 C . 使用PB1 細胞對所產生之IL -7 進行 功能性評估。藉由評估上清液對作為視IL-7而定之細胞株之PB1細胞增殖之作用來測試所產生之IL-7於上清液中的功能性。在培育72 h之後，使用MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)分析評估反映細胞增殖活性之細胞代謝活性。視上清液測試稀釋度而定之在MTT分析結束時量測之OD (光學密度)呈現於圖式上。OD最高，則所誘導之PB1增殖愈多。在0.3、1及3之MOI下，在來自空MVA之上清液之情況下所觀測到之OD各別地由空心三角形、空心正方形及空心圓圈表示，且對於0.3、1及3之MOI，在來自MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之上清液之情況下所觀測到之OD各別地由黑色三角形、黑色正方形及黑色圓圈表示。
圖2 . 注射2 種不同劑量之MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之 健康C57BL6 /J 小鼠中之循環人類IL -7 及鼠類IFNγ 藥物動力學 ( 實驗1 ) 。
使用人類IL-7 ELISA及鼠類IFNγ ELISA，使用來自經注射小鼠之血清樣本量測循環hIL-7及mIFNγ。在0小時、2小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時、8天、15天及21天時收集血液樣本。對所有群組每個時間點對三隻小鼠進行取樣。所偵測之hIL-7之平均濃度(ng/mL)由黑色正方形表示且所偵測之mIFNγ之平均濃度(ng/mL)由空心正方形表示。具有大點之點線表示mIFNγ ELISA之定量極限且具有最小點之點線表示hIL-7 ELISA之定量極限。 圖 2A顯示隨時間推移之在IV注射一次空MVA (1.10 8pfu)之後所觀測到之循環hIL-7及mIFNγ之平均濃度值。 圖 2B顯示隨時間推移之在IV注射一次MVA-hIL-7-Fc (1.10 7pfu)之後所觀測到之循環hIL-7及mIFNγ之平均濃度值。 圖 2C顯示隨時間推移之在IV注射一次MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897) (1.10 8pfu)之後所觀測到之循環hIL-7及mIFNγ之平均濃度值。
圖3 . 注射MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之 健康C57BL6 /J 小鼠中之循環人類IL -7 及鼠類IFNγ 藥物動力學 ( 實驗2 ) 。
使用人類IL-7 ELISA及鼠類IFNγ ELISA，使用來自經注射小鼠之血清樣本量測循環hIL-7及mIFNγ。在0小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時、7天及9天時收集血液樣本。對所有群組每個時間點對三隻小鼠進行取樣。所偵測之hIL-7之平均濃度(ng/mL)由黑色正方形表示且所偵測之mIFNγ之平均濃度(ng/mL)由空心正方形表示。具有大點之點線表示mIFNγ ELISA之定量極限且具有最小點之點線表示hIL-7 ELISA之定量極限。 圖 3A顯示隨時間推移之在IV注射一次空MVA之後所觀測到之循環hIL-7及mIFNγ之平均濃度值。 圖 3B顯示隨時間推移之在IV注射一次MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之後所觀測到之循環hIL-7及mIFNγ之平均濃度值。
圖4 . 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之後健康C57BL6 /J 小鼠中之脾細胞總數分析。
在注射之後1、3、9及29天時評估空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，將3隻小鼠/組處死且對脾進行取樣以便計數脾細胞總數。每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之平均值以白色條柱表示，經空MVA (MVATGN33.1)治療之小鼠之平均值由灰色條柱表示，且經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之平均值由黑色條柱表示。使用GraphPad Prism執行使用雙向ANOVA進行之統計分析。對於多個比較測試使用Bonferroni校正計算P值，且＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示且＜ 0.0001之p值由****表示。
圖5 . 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之後健康C57BL6 /J 小鼠中之脾中之總CD4 + T 細胞 及4 個 亞群 ( 天然、 急性效應、效應記憶及中樞記憶 ) 數目分析。
在注射之後1、3、9及29天時評估空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，將3隻小鼠/組處死且對脾進行取樣以便表徵CD4+ T細胞及以下亞群中之各者之總數：天然CD4+ T細胞(CD3+ CD4+ CD62L+ CD44-)、CD4+ T效應記憶細胞(CD3+ CD4+ CD62L- CD44+)、CD4+中樞記憶細胞(CD3+ CD4+ CD62L+ CD44+)及CD4+急性效應細胞(CD3+ CD4+ CD62L- CD44-)。如材料及方法部分中所描述製備、染色及分析細胞。圖5A、圖5B、圖5C、圖5D及圖5E各別地表示CD4+ T細胞、天然CD4+ T細胞、CD4+ T效應記憶細胞、CD4+ T中樞記憶細胞及CD4+ T急性效應細胞之絕對數目/脾。每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之平均值以白色條柱表示，經空MVA (MVATGN33.1)治療之小鼠之平均值由灰色條柱表示，且經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之平均值由黑色條柱表示。使用GraphPad Prism執行使用雙向ANOVA進行之統計分析。對於多個比較測試使用Bonferroni校正計算P值，且＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示且＜ 0.0001之p值由****表示。
圖6 . 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之後健康C57BL6 /J 小鼠中之脾中之總CD8 + T 細胞 及4 個 亞群 ( 天然、 急性效應、效應記憶及中樞記憶 ) 數目分析。
在注射之後1、3、9及29天時評估空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，將3隻小鼠/組處死且對脾進行取樣以便表徵CD8+ T細胞及以下亞群中之各者之總數：天然CD8+ T細胞(CD3+ CD8+ CD62L+ CD44-)、CD8+ T效應記憶細胞(CD3+ CD8+ CD62L- CD44+)、CD8+中樞記憶細胞(CD3+ CD8+ CD62L+ CD44+)及CD8+急性效應細胞(CD3+ CD8+ CD62L- CD44-)。如材料及方法部分中所描述製備、染色及分析細胞。圖6A、圖6B、圖6C、圖6D及圖6E各別地表示CD8+ T細胞、天然CD8+ T細胞、CD8+ T效應記憶細胞、CD8+ T中樞記憶細胞及CD8+ T急性效應細胞之絕對數目/脾。每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之平均值以白色條柱表示，經空MVA (MVATGN33.1)治療之小鼠之平均值由灰色條柱表示，且經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之平均值由黑色條柱表示。使用GraphPad Prism執行使用雙向ANOVA進行之統計分析。對於多個比較測試使用Bonferroni校正計算P值，且＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示且＜ 0.0001之p值由****表示。
圖7 . 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之後健康C57BL6 /J 小鼠中之脾中之CD4 + T 細胞 及CD8 + T 細胞中 及胸腺細胞內的Bcl2 蛋白 ( 抗細胞凋亡蛋白 ) 表現分析。
在注射之後1及3天時評估空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，將3隻小鼠/組處死且對脾及胸腺進行取樣以便表徵來自脾之T細胞及胸腺細胞上之Bcl2表現。表現位準經表徵為於脾中之CD4+ T細胞(圖7A)、脾中之CD8+ T細胞(圖7B)及胸腺細胞(圖7C)上觀測到之Bcl2染色之平均螢光強度(MFI)。如材料及方法部分中所描述製備、染色及分析細胞。每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之平均值以白色條柱表示，經空MVA (MVATGN33.1)治療之小鼠之平均值由灰色條柱表示，且經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之平均值由黑色條柱表示。使用GraphPad Prism執行使用雙向ANOVA進行之統計分析。對於多個比較測試使用Bonferroni校正計算P值，且＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示且＜ 0.0001之p值由****表示。
圖8 . 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之後健康C57BL6 /J 小鼠中之胸腺內之細胞亞群比例。
在注射之後1及3天時評估空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，將3隻小鼠/組處死且對胸腺進行取樣以便表徵通常存在於胸腺中之細胞之4亞群：雙陰性(DN)細胞(CD4- CD8-)、雙陽性(DP)細胞(CD4+ CD8+)、單陽性(SP) CD4+細胞(CD4+ CD8-)及單陽性(SP) CD8+細胞(CD4- CD8+)。如材料及方法部分中所描述製備、染色及分析細胞。各細胞亞群比例在此處呈現為每組及每個時間點(在圖8A上第1天及在圖8B上第3天)之平均百分比。DP細胞由白色部分表示，DN細胞由黑色豎直影線部分表示，SP CD4+細胞由格紋圖案部分表示且SP CD8+細胞由黑色豎直影線部分表示。
圖9 . 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之後健康C57BL6 /J 小鼠中之脾中之嗜中性球及骨髓樹突狀細胞 (mDC ) 總數分析。
在注射之後1、3、9及29天時評估空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，將3隻小鼠/組處死且對脾進行取樣以便表徵嗜中性球(B220-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G+)及骨髓樹突狀細胞(B220-、NK1.1-、CD11b-、CD11c+)。如材料及方法部分中所描述製備、染色及分析細胞。圖9A及圖9B各別地表示嗜中性球及mDC之絕對數目/脾。每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之平均值以白色條柱表示，經空MVA (MVATGN33.1)治療之小鼠之平均值由灰色條柱表示，且經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之平均值由黑色條柱表示。使用GraphPad Prism執行使用雙向ANOVA進行之統計分析。對於多個比較測試使用Bonferroni校正計算P值，且＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示且＜ 0.0001之p值由****表示。
圖10 . 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之後健康C57BL6 /J 小鼠中之脾中之單核球亞群 (Ly6C 高 、Ly6C 中等 及Ly6C 低 ) 數目分析。
在注射之後1、3、9及29天時評估空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，將3隻小鼠/組處死且對脾進行取樣以便表徵劃分為3個亞群之單核球：具有促炎性且介導吞噬作用之Ly6C 高單核球(B220-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G、Ly6C 高)、具有促炎性之Ly6C 中等單核球(B220-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G-、Ly6C 中等)及作為巡邏型單核球之Ly6C 低單核球(B220-、NK1.1-、CD11b+、CD11c-、Ly6G-、Ly6C 低)。如材料及方法部分中所描述製備、染色及分析細胞。圖10A、圖10B及圖10C各別地表示Ly6C 高、Ly6C 中等及Ly6C 低單核球之絕對數目/脾。每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之平均值以白色條柱表示，經空MVA (MVATGN33.1)治療之小鼠之平均值由灰色條柱表示，且經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之平均值由黑色條柱表示。使用GraphPad Prism執行使用雙向ANOVA進行之統計分析。對於多個比較測試使用Bonferroni校正計算P值，且＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示且＜ 0.0001之p值由****表示。 圖11 ： 經MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 治療之CLP 小鼠之存活。
小鼠在第0天經歷CLP且在CLP後第4天在後眼眶竇處靜脈內注射一次100 µL之1 × 10 8pfu MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)。存活曲線顯示為以下中之用MVA-hIL-7-Fc進行之治療前(A)及治療後(B)：Sham小鼠(黑色圓圈及點線)、未經治療CLP小鼠(黑色圓圈)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色正方形及灰線)。MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療時間由豎直點線表示。二個獨立實驗之合併結果經顯示。使用對數等級檢定、接著為使用Tukey多重性調整檢定進行之各組之間的特定比較來執行統計分析(SAS® 9.4)。 圖12 ： 在MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 治療之後CLP 小鼠中之循環hIL -7 含量。
藉由hIL-7 ELISA評估Sham小鼠(白色條柱，N=5)、CLP小鼠(黑色條柱，N=7)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=15)之血清中的hIL-7含量。2個合併實驗之結果表示為以pg/mL為單位之hIL-7之平均值± SD值。 圖13 ： 在MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 治療之後CLP 小鼠中之循環IFNγ 含量。
藉由U-PLEX多重分析評估Sham小鼠(白色條柱，N=5)、CLP小鼠(黑色條柱，N=7)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=15)之血清中的IFNγ含量。2個合併實驗之結果顯示為以pg/mL為單位表示之平均值± SD值。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，且＜ 0.001之p值由***表示。 圖14 ： 經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897) 治療之CLP 小鼠之脾中之免疫細胞子集。
藉由流式細胞量測術使用經Sham操作小鼠(白色條柱，N=5)、CLP小鼠(黑色條柱，N=7)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=15)之脾細胞評估脾細胞(A)、T細胞(CD3 +) (B)、CD4 T細胞(CD3 +NK1.1 -CD4 +) (C)及CD8 T細胞(CD3 +NK1.1 -CD8 +) (D)總數。2個合併實驗之結果顯示為以10 6個細胞/脾為單位表示之平均值± SD值。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，且＜ 0.01之p值由**表示。 圖15 ： 經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897) 治療之CLP 小鼠之脾中之免疫細胞活化狀態。
藉由評估細胞表面CD69表現來測定來自經Sham操作小鼠(白色條柱，N=5)、CLP小鼠(黑色條柱，N=7)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=15)之脾細胞活化狀態。2個合併實驗之結果顯示為B細胞(CD19 +) (A)、CD4 T細胞(CD3 +NK1.1 -CD4 +) (B)、CD8 T細胞(CD3 +NK1.1 -CD8 +) (C)及NK細胞(CD3 -CD19 -NK1.1 +) (D)的以10 6個細胞/脾為單位表示之CD69 +細胞數目之平均值± SD值。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，且＜ 0.001之p值由***表示。 圖16 ： 經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897) 治療之CLP 小鼠之血液中之循環免疫細胞子集。
藉由流式細胞量測術評估經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=8)或未經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠(黑色條柱，N=3)之血液中之CD3 +(CD45 +CD3 +) (A)、CD4 T (CD45 +CD3 +NK1.1 -CD4 +) (B)、CD8 T (CD45 +CD3 +NK1.1 -CD8 +) (C)、NKT (CD45 +CD3 +NK1.1 +) (D)、NK (CD45 +CD3 -CD19 -NK1.1 +) (E)、B (CD45 +CD19 +) (F)、CD11c +(CD45 +CD19 -CD3 -NK1.1 -CD11c +) (G)及CD11b +(CD45 +CD19 -CD3 -NK1.1 -CD11b +) (H)細胞總數。一個實驗之結果顯示為每微升血液之細胞數目之平均值± SD值。使用Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示。 圖17 ： 經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897) 治療之CLP 小鼠中之免疫血細胞活化狀態。
藉由評估細胞表面CD69表現來測定經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色條柱)或未經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(黑色條柱)中之血細胞活化狀態。結果顯示為CD4 T細胞(CD45 +CD3 +NK1.1 -CD4 +) (A)、CD8 T細胞(CD45 +CD3 +NK1.1 -CD8 +) (B)、B細胞(CD45 +CD19 +) (C)及NK細胞(CD45 +CD3 -CD19 -NK1.1 +) (D)的每微升血液之CD69 +細胞數目之平均值± SD值(一個實驗，CLP：N=3及CLP+MVA-hIL-7-Fc：N=8)。使用Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示。 圖18 ：MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 治療增加CLP 小鼠中產生IFNγ 之T 細胞之 頻率。
藉由IFNγ ELISpot分析使用與抗CD3抗體及抗CD28抗體一起培養之經Sham操作小鼠(白色條柱，N=5)、CLP小鼠(黑色條柱，N=4)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=7)之脾細胞評估IFNγ斑點形成細胞。一個實驗之結果表示為每10 5個細胞之斑點形成單位之平均值± SD值(A)及以10 -3mm 2為單位表示之斑點尺寸之平均值± SD值(B)。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，且＜ 0.01之p值由**表示。 圖19 ： 經MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 治療之CLP 小鼠中之所有產生細胞介素之CD4 T 細胞 及CD8 T 細胞。
藉由三重胞內細胞介素染色分析量測在經抗CD3抗體及抗CD28抗體活體外刺激之後產生IFNγ、TNFα及IL2當中之至少一種細胞介素的經Sham操作小鼠(白色條柱，N=5)、CLP小鼠(黑色條柱，N=8)及經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=15)之脾中之CD4 T細胞(CD4 +) (A)及CD8 T細胞(CD8 +) (B)的頻率。2個合併實驗之結果表示為細胞介素陽性細胞之頻率之平均值± SD值。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，且＜ 0.001之p值由***表示。 圖20 ： 經MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 治療之CLP 小鼠中之產生細胞介素之CD4 T 細胞。
藉由三重胞內細胞介素染色分析量測在經抗CD3抗體及抗CD28抗體活體外刺激之後產生IFNγ、TNFα及/或IL2的經Sham操作小鼠(白色條柱，N=5)、CLP小鼠(黑色條柱，N=8)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=15)之脾中之CD4 T細胞的頻率。產生IFNγ/TNFα (A)、IL2/TNFα (B)或IFNγ/IL2/TNFα (C)之CD4 T細胞(CD4 +)頻率經顯示。結果表示為所有CD4 T細胞群體當中之各細胞介素陽性細胞子集之頻率之平均值+/- SD值。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，且＜ 0.001之p值由***表示。 圖21 ： 經MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 治療之CLP 小鼠中之產生細胞介素之CD8 T 細胞。
藉由三重胞內細胞介素染色分析量測在經抗CD3抗體及抗CD28抗體活體外刺激之後產生IFNγ、TNFα及/或IL2的經Sham操作小鼠(白色條柱，N=5)、CLP小鼠(黑色條柱，N=8)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=15)之脾中之CD8 T細胞的頻率。僅產生IFNγ (A)、IFNγ/TNFα (B)及IFNγ/IL2/TNFα (C)之CD8 T細胞(CD8 +)頻率經顯示。結果表示為所有CD8 T細胞群體當中之各細胞介素陽性細胞子集之頻率之平均值+/- SD值。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，且＜ 0.001之p值由***表示。 圖22 ： 在MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897) 治療之後由經活化T 細胞產生之促炎性細胞介素及抗炎性細胞介素。
將來自經Sham操作小鼠(白色條柱，N=5)、CLP小鼠(黑色條柱，N=7)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色條柱，N=15)之總脾細胞在經抗CD3抗體預塗之盤中培養，且藉由U-PLEX多重分析量測於上清液中釋放之IL-1β (A)、IL-6 (B)、TNFα (C)、IFNγ (D)及IL-10 (E)。2個合併實驗之結果顯示為屬於各細胞介素且以pg/mL為單位表示之平均值± SD值。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.01之p值由**表示，且＜ 0.001之p值由***表示。 圖23 ： 經MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 或空MVA (MVATGN33 .1 ) 治療之CLP 小鼠之存活。
小鼠在第0天經歷CLP且在CLP後第4天在後眼眶竇處靜脈內注射一次100 µL之1 × 10 8pfu MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或空MVA (MVATGN33.1)。存活曲線顯示為以下中之治療前(A)及治療後(B)：經空MVA治療之CLP小鼠(黑色圓圈及黑色點線)及經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠(灰色正方形及灰線)。MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或空MVA (MVATGN33.1)治療時間由豎直點線表示。
圖24 ： 經MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 或空MVA (MVATGN33 .1 ) 治療之CLP 小鼠之血液中之循環免疫細胞子集。
藉由流式細胞量測術評估經空MVA治療之CLP小鼠(黑色正方形，N=6)或經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠(灰色圓圈，N=9)之血液中之脾的各種細胞子集。CD8 T (CD45 +CD3 +NK1.1 -CD8 +) (A)、NKT (CD45 +CD3 +NK1.1 +) (B)及CD11b +(CD45 +CD19 -CD3 -NK1.1 -CD11b +) (C)細胞數目以及每微升血液之細胞數目之平均值± SD值示於此處。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示。 圖25 ： 經空MVA (MVATGN33 .1 ) 或MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 治療之CLP 小鼠中之產生細胞介素之CD4 T 細胞。
藉由三重胞內細胞介素染色分析量測在經抗CD3抗體及抗CD28抗體活體外刺激之後產生IFNγ、TNFα及/或IL2的經空MVA治療之CLP小鼠(黑色正方形，N=6)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色圓圈，N=9)之脾中之CD4 T細胞的頻率。所有產生至少一種細胞介素之CD4 T細胞(CD4 +) (A)、所有產生IFNγ之CD4 T細胞、所有產生TNFα之CD4 T細胞及所有產生IL2之CD4 T細胞(B)且更具體而言產生IFNγ及TNFα、或產生IFNγ及IL2、或產生IL2及TNFα、或產生IFNγ及IL2以及TNFα之CD4 T細胞(C)的頻率示於此處。個別值及平均值+/- SD經表示。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示。 圖26 ： 經空MVA (MVATGN33 .1 ) 或MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 治療之CLP 小鼠中之產生細胞介素之CD8 T 細胞。
藉由三重胞內細胞介素染色分析量測在經抗CD3抗體及抗CD28抗體活體外刺激之後產生IFNγ、TNFα及/或IL2的經空MVA治療之CLP小鼠(黑色正方形，N=6)及經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(灰色圓圈，N=9)之脾中之CD8 T細胞的頻率。所有產生至少一種細胞介素之CD8 T細胞(CD4 +) (A)、所有產生IFNγ之CD8 T細胞、所有產生TNFα之CD8 T細胞及所有產生IL2之CD8 T細胞(B)且更具體而言僅產生IFNγ之CD8 T細胞及僅產生TNFα之CD8 T細胞(C)、或產生IFNγ及TNFα、或產生IL2及TNFα、或產生IFNγ及IL2以及TNFα之CD8 T細胞(D)的頻率示於此處。個別值及平均值+/- SD經表示。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Mann-Whitney檢定執行統計分析：＜ 0.01之p值由**表示。
圖27 . 在IV 注射一次空MVA (MVATGN33 .1 ) 或MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 之後健康C57BL6 /J 小鼠中之肺細胞及經活化 (CD69 +) NK 、CD8 + T 細胞 及CD4 + T 細胞 總數分析。
在注射之後第3天及第9天時評估空MVA (MVATGN33.1)及MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)之生物學活性，將10隻小鼠/組處死且在製備肺之後對肺進行取樣以便計數肺細胞總數(圖27A)。亦經由流式細胞量測術監測經活化NK細胞(圖27B)及經活化CD8+ T細胞(圖27C)以及CD4+ T細胞(圖27D)數目。執行實驗二次，且將結果彙集。個別值及每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之個別值由空圓圈表示，經空MVA (MVATGN33.1)治療之小鼠之個別值由空正方形表示，且經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之個別值由全黑正方形表示。使用GraphPad Prism執行使用雙向ANOVA進行之統計分析。對於多個比較測試使用Bonferroni校正計算P值，且＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示且＜ 0.0001之p值由****表示。
圖28 . 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 或hIL -7 -Fc 蛋白之後健康C57BL6 /J 小鼠中之肺細胞及經活化 (CD69 +) NK 、CD8 + T 細胞 及CD4 + T 細胞 總數分析。
在注射之後第3天及第9天時評估MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)及hIL-7-Fc蛋白之生物學活性，將6隻小鼠/組處死且在製備肺之後對肺進行取樣以便計數肺細胞總數(圖28A)。亦經由流式細胞量測術監測經活化NK細胞(圖28B)及經活化CD8+ T細胞(圖28C)以及CD4+ T細胞(圖28D)數目。個別值及每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之個別值由空圓圈表示，經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之個別值由全黑正方形表示，且經IL-7-Fc蛋白治療之小鼠之個別值由全黑三角形表示。使用GraphPad Prism執行使用雙向ANOVA進行之統計分析。對於多個比較測試使用Bonferroni校正計算P值，且＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示且＜ 0.0001之p值由****表示。
圖29 ： 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 或hIL -7 -Fc 蛋白之後健康C57BL6 /J 小鼠中之脾及肺中的產生細胞介素之CD8 T 細胞 。
藉由三重胞內細胞介素染色分析評估未經治療或藉由IV途徑注射一次MVATG18897或hIL-7-Fc蛋白之C57BL6/J健康小鼠之脾及肺中的在經抗CD3抗體及抗CD28抗體活體外刺激之後產生IFNγ、TNFα及/或IL2之CD8 T細胞的頻率。脾(圖29A)或肺(圖29B)中之僅產生IFNγ之CD8+ T細胞、脾(圖29C)或肺(圖29D)中之產生IFNγ及TNFα之CD8+ T細胞以及脾(圖29E)或肺(圖29F)中之產生IFNγ、TNFα及IL2之CD8+ T細胞呈現於此處。個別值及每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之個別值由空圓圈表示，經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之個別值由全黑正方形表示，且經IL-7-Fc蛋白治療之小鼠之個別值由全黑三角形表示。使用GraphPad Prism執行使用雙向ANOVA進行之統計分析。對於多個比較測試使用Bonferroni校正計算P值，且＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示且＜ 0.0001之p值由****表示。
圖30 ： 經MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 或hIL -7 -Fc 蛋白治療之CLP 小鼠之存活。
小鼠在第0天經歷CLP且在CLP後第4天在後眼眶竇處靜脈內注射100 µL之1 × 10 7pfu MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或5 µg之hIL-7-Fc蛋白一次。存活曲線顯示為未經治療CLP小鼠(全黑正方形及黑線)、經MVA-hIL-7-Fc治療之CLP小鼠(半滿圓圈及點線)或經hIL-7-Fc治療之CLP小鼠(空圓圈及點線)中之治療後。MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或hIL-7-Fc蛋白治療時間由豎直點線表示。作為對照，原始及未經治療小鼠之存活亦由全黑菱形及點線表示。
圖31 . 在IV 注射一次MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 或hIL -7 -Fc 蛋白之後CLP 小鼠中之經活化 (CD69 +) CD8 + T 及B 細胞 分析。
在注射後第3天(CLP後7天)評估MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)及hIL-7-Fc蛋白之生物學活性，在CLP後第7天將各組中之存活小鼠處死。對脾進行取樣且經由流式細胞量測術監測經活化CD8+ T細胞(圖31A)及B細胞(圖31B)數目。個別值及每組及每個時間點之平均值+/- SD表示於圖式上。未經治療小鼠之個別值由全黑圓圈表示，經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之小鼠之個別值由全黑正方形表示，且經IL-7-Fc蛋白治療之小鼠之個別值由全黑三角形表示。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Dunns檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示。
圖32 經MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 ) 或經hIL -7 -Fc 蛋白治療之CLP 小鼠中之產生細胞介素之CD8 T 細胞。
藉由三重胞內細胞介素染色分析評估在經抗CD3抗體及抗CD28抗體活體外刺激之後產生至少IFNγ (僅IFNγ或IFNγ與其他細胞介素) (圖32A)、僅產生IFNγ (圖32B)、產生IFNγ及TNFα (圖32C)或產生IFNγ及TNFα以及IL2 (圖32D)的未經治療CLP小鼠(全黑圓圈)、經MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)治療之CLP小鼠(全黑正方形)或經hIL-7-Fc蛋白治療之CLP小鼠(全黑三角形)之脾中之CD8 T細胞的頻率。個別值及平均值+/- SD經表示。使用針對重複量測之單向ANOVA檢定、接著為針對組間比較之Dunns檢定執行統計分析：＜ 0.05之p值由*表示，＜ 0.01之p值由**表示，＜ 0.001之p值由***表示。
圖33 . 藉由MVA -hIL -7 -Fc (MVATG18897 或MVATG19791 ) 進行之hIL -7 -Fc 表現 之 活體外分析。
A 及B. 西方墨點法分析。使雞胚胎纖維母細胞CEF) (A)或A549細胞(B)經空MVA (MVATGN33.1，陰性對照)或MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897或MVATG19791)活體外感染且收集上清液及細胞。在β-巰基乙醇存在或不存在之情況下經由西方墨點法分析於細胞中表現且於上清液中分泌之hIL-7-Fc。藉由抗IL-7抗體(對人類IL-7具有特異性之兔單株抗體)偵測所產生之IL-7。 C. 在活體外感染之後經由ELISA 分析hIL-7-Fc 表現。收集經感染細胞(CEF或A549細胞)之上清液，且遵循ELISA偵測經表現之hIL-7。所偵測之IL7之濃度(以ng/mL為單位表示)表示於圖示上。灰色條柱對應於感染MVATG18897之細胞，黑色條柱表示感染MVATG19791之細胞，且空條柱對應於感染MVATGN33.1之細胞但在圖式上不可見，此係因為在此等上清液中未偵測到IL-7。
圖34. 在經來自感染MVA-IL-7-Fc 之細胞之上清液離體刺激之後的COVID19+ 患者之全血之CD3+ T 細胞中的pSTAT5 表現分析。
藉由流式細胞量測術分析在經來自感染MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或空MVA (MVATGN33.1)或未經感染之原代肝細胞之上清液刺激之後CD3+ T細胞中的pSTAT5表現。如材料及方法部分中所描述刺激、染色及分析全血。如下計算比率：以未經刺激情況之值標準化來自MVATG18897或MVATGN33.1或未經感染細胞之上清液之所獲得值。6位患者之比率平均值+/-標準差表示於圖式上。來自感染MVA-IL-7-Fc (SN IL-7-Fc)之細胞之上清液之平均值由黑色條柱表示，而來自空MVA (SN N33)或未經感染細胞(SN NI細胞)之上清液之平均值由灰色條柱表示。
圖35. 在經感染MVA-hIL-7-Fc 之細胞之上清液刺激之後COVID19+ 患者之全血之CD4+ T 細胞 所產生的總IFNγ 及IFNγ-TNFα-IL-2 分析。
除了來自感染MVA-hIL-7-Fc (MVATG18897)或空MVA (MVATGN33.1)或未經感染之原代肝細胞之上清液之外在經Duractive 1離體刺激3小時之後藉由胞內染色分析CD4+ T細胞的功能性。如材料及方法部分中所描述刺激、染色及分析全血。產生IFNγ (A)或IFNγ-TNFα-IL-2 (B)之CD4+ T細胞百分比經顯示。如下計算比率：以Duractive 1情況之值標準化Duractive 1 +感染MVATG18897或MVATGN33.1或未經感染之細胞之上清液的值。6位患者之比率平均值+/-標準差表示於圖式上。MVA-IL-7-Fc上清液(DA + SN IL-7-Fc)之平均值由黑色條柱表示，且空MVA (DA + SN N33)或未經感染之細胞上清液(DA + SN NI細胞)之平均值由灰色條柱表示。
圖36. 來自衰老對照及髖部骨折患者之PBMC 上之CD8 T 細胞中之CD57 表現分析。
如材料及方法部分中所描述將來自衰老對照及髖部骨折(HF)患者之PBMC解凍，對其進行染色，且藉由流式細胞量測術對其進行分析。CD8 T細胞中之CD57表現之平均值+/-標準差經表示。
圖37. 經來自感染MVA-hIL-7-Fc 之 細胞之上清液刺激之衰老創傷患者PBMC 評估。
A. pSTAT5 分析。藉由流式細胞量測術分析未經刺激之CD3+細胞中及經來自感染空MVA (MVATGN33.1，SN N33於圖式中)或MVA-hIL-7-Fc (MVATG19791，SN IL-7-Fc於圖式中)之細胞之上清液離體刺激之後的pSTAT5表現。如材料及方法部分中所描述將來自衰老對照及髖部骨折(HF)患者之PBMC解凍，對其進行刺激、染色及分析。 B. T 細胞增殖 。藉由流式細胞量測術分析未經刺激之CD3+細胞中及經來自感染空MVA (SN N33)或MVA-hIL-7-Fc (SN IL-7-Fc)之細胞之上清液離體刺激之後的增殖比例。如材料及方法中所描述將來自衰老對照及髖部骨折(HF)患者之PBMC解凍且對其進行染色、刺激5天，隨後對其進行染色及分析。平均值+/-標準差經表示。
圖38. 在來自感染MVA-hIL-7-Fc 之 細胞之上清液存在之情況下經離體刺激之後創傷患者之PBMC 的 產生總IFNγ 及IFNγ-TNFα-IL-2 之CD4+ T 細胞 分析。
藉由胞內染色分析除了來自感染MVA-hIL-7-Fc (黑色)或空MVA (灰色)之原代肝細胞或作為對照之培養基(白色)之上清液之外經PMA-離子黴素、抗CD3/抗CD28或未經刺激對照刺激之後的CD4+ T細胞的功能性。如材料及方法部分中所描述刺激、染色及分析經解凍PBMC。產生IFNγ (A)或IFNγ、TNFα及IL-2 (B)之CD4+ T細胞百分比經顯示。3位患者之平均值及+/-標準差表示於圖式上。SN IL-7-Fc : MVA-IL-7-Fc (MVATG19791)上清液；SN N33 :空MVA (MVATGN33.1)上清液；對照:培養基。
圖39. 在來自感染MVA-hIL-7-Fc 之 細胞之上清液存在之情況下經離體刺激之後重大手術患者之PBMC 的 產生總IFNγ 及IFNγ-TNFα-IL-2 之CD4+ T 細胞 分析。
藉由胞內染色分析除了來自感染MVA-hIL-7-Fc (黑色)或空MVA (灰色)之原代肝細胞或作為對照之培養基(白色)之上清液之外經PMA-離子黴素、抗CD3/抗CD28或未經刺激對照刺激之後的CD4+ T細胞的功能性。
如材料及方法部分中所描述刺激、染色及分析經解凍PBMC。產生IFNγ (A)或IFNγ、TNFα及IL-2 (B)之CD4+ T細胞百分比經顯示。3位患者之平均值及+/-標準差表示於圖式上。SN IL-7-Fc : MVA-IL-7-Fc (MVATG19791)上清液；SN N33 :空MVA (MVATGN33.1)上清液；對照:培養基。
 
                             序列表
          <![CDATA[<110>  法商傳斯堅公司 (TRANSGENE SA)]]>
          <![CDATA[<120>  免疫抑制之治療 ]]>
          <![CDATA[<140>  TW 110125715]]>
          <![CDATA[<141>  2021-07-13]]>
          <![CDATA[<150>  EP 20305798.9]]>
          <![CDATA[<151>  2020-07-13]]>
          <![CDATA[<160>  4     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 版本 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  154]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  家鼷鼠]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys 
                      20                  25                  30          
          Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu 
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          Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn 
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          Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu 
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          Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 
                          85                  90                  95      
          Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr 
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          <![CDATA[<211>  177]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 
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              50                  55                  60                  
          Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 
                          85                  90                  95      
          Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys 
                  115                 120                 125             
          Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile 
                          165                 170                 175     
          Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys 
                      180                 185                 190         
          Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 
                  195                 200                 205             
          Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln 
              210                 215                 220                 
          Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg 
                          245                 250                 255     
          Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 
                      260                 265                 270         
          Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro 
                  275                 280                 285             
          Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr 
              290                 295                 300                 
          Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly 
                          325                 330                 335     
          Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu 
                      340                 345                 350         
          Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 
                  355                 360                 365             
          His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 
              370                 375                 380     
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  405]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys 
                      20                  25                  30          
          Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu 
                  35                  40                  45              
          Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe 
              50                  55                  60                  
          Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr 
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu 
                          165                 170                 175     
          His Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 
                      180                 185                 190         
          Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
              210                 215                 220                 
          Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
                          245                 250                 255     
          Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu 
                      260                 265                 270         
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala 
                  275                 280                 285             
          Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
              290                 295                 300                 
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
                          325                 330                 335     
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                      340                 345                 350         
          Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                  355                 360                 365             
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
              370                 375                 380                 
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Ser Pro Gly Lys 
                          405
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007

Claims (25)

  1. 一種非繁殖病毒載體，其包含編碼至少一具有一IL-7活性之多肽之一核酸分子，其中該非繁殖病毒載體係使用於治療敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制。
  2. 如請求項1所用之非繁殖病毒載體，其中該病毒載體選自由以下組成之群：痘病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、水皰性口炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰白質炎病毒、馬拉巴病毒(Maraba Virus)及病毒樣粒子。
  3. 如請求項1至2中任一項所用之非繁殖病毒載體，其中該病毒載體為一非繁殖痘病毒、較佳地一非繁殖痘瘡病毒且更佳地一MVA。
  4. 如請求項1至2中任一項所用之非繁殖病毒載體，其中該病毒載體為一腺病毒、較佳地一人類腺病毒、甚至更佳地諸如血清型5、11、26及35之腺病毒的選自由物種B、C及D組成之群之一人類腺病毒。
  5. 如請求項1至4中任一項所用之非繁殖病毒載體，其中該多肽選自由以下組成之群：鼠類IL-7、人類IL-7、與一Fc域融合之鼠類IL-7及與一Fc域融合之人類IL-7。
  6. 如請求項5所用之非繁殖病毒載體，其中該鼠類IL-7包含與示於SEQ ID NO: 1中之胺基酸序列具有至少70%、較佳地至少80%、更佳地至少90%且甚至更佳地至少95%一致性之一胺基酸序列。
  7. 如請求項5所用之非繁殖病毒載體，其中該人類IL-7包含與示於SEQ ID NO: 2中之胺基酸序列具有至少70%、較佳地至少80%、更佳地至少90%且甚至更佳地至少95%一致性之一胺基酸序列。
  8. 如請求項5所用之非繁殖病毒載體，其中該與一Fc域融合之鼠類IL-7包含與示於SEQ ID NO: 3中之胺基酸序列具有至少70%、較佳地至少80%、更佳地至少90%且甚至更佳地至少95%一致性之一胺基酸序列。
  9. 如請求項5所用之非繁殖病毒載體，其中該與一Fc域融合之人類IL-7包含與示於SEQ ID NO: 4中之胺基酸序列具有至少70%、較佳地至少80%、更佳地至少90%且甚至更佳地至少95%一致性之一胺基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項所用之非繁殖病毒載體，其中該病毒載體包含具有一IL-7活性之一多肽在一宿主細胞或受試者中之表現所需的調節要素。
  11. 一種組合物，其包含如請求項1至10中任一項之非繁殖病毒載體及一可接受之醫藥媒劑，該組合物係使用於治療敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之免疫抑制。
  12. 如請求項11所用之組合物，其中該組合物包含一劑量包含於約10 6pfu與約10 12pfu之間、更佳地約10 7pfu與約10 11pfu之間、甚至更佳地約10 8pfu與約10 10pfu之間的非繁殖痘病毒，其中一劑量較佳地為10 9pfu。
  13. 如請求項11所用之組合物，其中該組合物包含一劑量包含於約10 6vp與約10 14vp之間、較佳地約10 7vp與約10 13vp之間、更佳地約10 8vp與約10 12vp之間、更佳地約10 9vp與約10 11vp之間的非繁殖腺病毒。
  14. 如請求項11至13中任一項所用之組合物，其中該組合物係經由非經腸途徑、更佳地經由靜脈內、皮下或肌內途徑且甚至更佳地經由靜脈內途徑投與。
  15. 如請求項11至14中任一項所用之組合物，其中該組合物較佳地在以下時間投與：(i)較佳地在該免疫抑制階段開始之後第一個月內之一初期，(ii)在該免疫抑制階段開始之後約1個月至約6個月範圍內變化之一時間段內，或(iii)在該免疫抑制階段開始之後6個月至6年內之一後期，或(iv)其任何組合。
  16. 如請求項1至15中任一項所用之非繁殖病毒載體或組合物，其中該使用包含在該免疫抑制階段開始之後1次與10次之間、較佳地在該免疫抑制階段開始之後1次與5次之間、更佳地在該免疫抑制階段開始之後1次與3次之間、甚至更佳地在該免疫抑制階段開始之後一次投與該非繁殖病毒載體或組合物。
  17. 如請求項11至16中任一項所用之組合物，其中該免疫抑制係由敗血症誘發。
  18. 如請求項11至16中任一項所用之組合物，其中該免疫抑制係由冠狀病毒誘發，較佳地由SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV2、229E、NL63、OC43或HKU1誘發。
  19. 如請求項1至18中任一項所用之非繁殖病毒載體或組合物，其中與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之一受試者相比，該使用增強投與該非繁殖病毒載體或組合物之一受試者之功能性先天性及/或適應性免疫系統。
  20. 如請求項1至18中任一項所用之非繁殖病毒載體或組合物，其中與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之一受試者相比，該使用增加投與該非繁殖病毒載體或組合物之一受試者之選自由CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞、NKT細胞、NK細胞、樹突狀細胞、單核球及嗜中性球組成之群之至少一種類型的免疫相關細胞的含量。
  21. 如請求項1至18中任一項所用之非繁殖病毒載體或組合物，其中與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之一受試者相比，該使用增加投與該非繁殖病毒載體或組合物之一受試者之選自由經活化CD4 T細胞、經活化CD8 T細胞、經活化B細胞及經活化NK細胞組成之群之至少一種類型的經活化免疫相關細胞的含量及/或百分比。
  22. 如請求項1至18中任一項所用之非繁殖病毒載體或組合物，其中與未投與該非繁殖病毒載體或組合物之一受試者相比，該使用增加投與該非繁殖病毒載體或組合物之一受試者之選自由IFNγ、TNFα、IL-6及IL-1β組成之群之至少一種類型的細胞介素的含量。
  23. 如請求項1至18中任一項所用之非繁殖病毒載體或組合物，其中該使用係用於治療展現與免疫相關細胞數目及/或經活化免疫相關細胞含量減少相關之一或多種生物標記物的一免疫抑制受試者。
  24. 如請求項23所用之非繁殖病毒載體或組合物，其中該一或多種生物標記物選自由以下組成之群：於循環單核球上之HLA-DR表現、循環IL-10、絕對CD3 T細胞計數、包括調節性T細胞之數個免疫抑制性淋巴球亞群量測結果以及如PD-1、PD-L1、CTLA-4、Lag3及BTLA之抑制受體的表現。
  25. 一種用於治療一有需要之受試者之敗血症、燒傷、創傷、大手術、衰老及/或冠狀病毒誘發之一免疫抑制的方法，其包含一或多次投與如請求項1至10中任一項之非繁殖病毒載體或如請求項11至18中任一項之組合物。
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