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TW202112752A - 胺基苯并氮呯化合物、免疫接合物及其用途 - Google Patents

胺基苯并氮呯化合物、免疫接合物及其用途 Download PDF

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TW202112752A
TW202112752A TW109119949A TW109119949A TW202112752A TW 202112752 A TW202112752 A TW 202112752A TW 109119949 A TW109119949 A TW 109119949A TW 109119949 A TW109119949 A TW 109119949A TW 202112752 A TW202112752 A TW 202112752A
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TW
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alkanediyl
seq
peg
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immunoconjugate
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TW109119949A
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English (en)
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雪莉 艾琳 阿克曼
麥克 Ｎ 阿隆索
羅瑪斯 庫迪爾卡
亞瑟 李
布萊恩 薩菲納
馬修 周
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美商博特生物治療公司
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Abstract

本發明提供式I或III之免疫接合物，其包含藉由接合至一或多個胺基苯并氮呯衍生物而連接之抗體。本發明亦提供式II之胺基苯并氮呯衍生物中間體組合物，其包含反應性官能基。此類中間體組合物為適合用於經由連接子或連接部分形成該等免疫接合物之基質。本發明進一步提供用該等免疫接合物治療癌症之方法。

Description

胺基苯并氮呯化合物、免疫接合物及其用途
本發明總體上係關於一種免疫接合物，該免疫接合物包含接合至一或多個胺基苯并氮呯分子之抗體。
需要用於遞送抗體及免疫佐劑之新組合物及方法，以達到難以接近之腫瘤及/或擴展用於癌症患者及其他個體之治療選項。本發明提供此類組合物及方法。
本發明總體上係關於免疫接合物，該等免疫接合物包含藉由接合而連接至一或多個胺基苯并氮呯衍生物之抗體。本發明進一步係關於包含反應性官能基之胺基苯并氮呯衍生物中間體組合物。此類中間體組合物為適合用於形成免疫接合物之基質，其中抗體可經由連接子或連接部分共價結合至一或多個胺基苯并氮呯衍生物。本發明進一步係關於此種免疫接合物在治療疾患，尤其癌症中之用途。
本發明之一個態樣為一種免疫接合物，該免疫接合物包含共價附接至連接子之抗體，該連接子共價附接至一或多個胺基苯并氮呯部分。
本發明之另一個態樣為一種胺基苯并氮呯-連接子化合物。
本發明之另一個態樣為一種用於治療癌症之方法，該方法包括投與治療有效量之免疫接合物，該免疫接合物包含藉由接合而連接至一或多個胺基苯并氮呯部分之抗體。
本發明之另一個態樣為一種免疫接合物用於治療癌症之用途，該免疫接合物包含藉由接合而連接至一或多個胺基苯并氮呯部分之抗體。
本發明之另一個態樣為一種藉由一或多個胺基苯并氮呯部分與抗體接合來製備免疫接合物之方法。
相關申請案之交叉引用
此非臨時申請案主張2020年1月21日申請之美國臨時申請案第62/963,884號及2019年6月13日申請之美國臨時申請案第62/861,139號之優先權益，該等臨時申請案中之每一者以全文引用之方式併入。
現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例以所附結構及化學式說明。儘管將結合所列舉之實施例描述本發明，但應了解，不欲將本發明限於彼等實施例。相反，本發明欲涵蓋可包括於如申請專利範圍所界定之本發明範疇內之所有替代物、修改及等效物。
熟習此項技術者將識別類似或等效於本文所述之彼等的的許多方法及材料，其可用於實施本發明。本發明決不限於所述方法及材料。 定義
術語「免疫接合物」係指經由連接子共價結合至佐劑部分之抗體構築體。術語「佐劑」係指能夠在暴露於佐劑之個體中引發免疫反應之物質。片語「佐劑部分」係指如本文所述，例如經由連接子共價鍵結至抗體構築體之佐劑。佐劑部分可在鍵結至抗體構築體時或在向個體投與免疫接合物後從抗體構築體裂解(例如酶促裂解)之後引發免疫反應。
「佐劑」係指能夠在暴露於佐劑之個體中引發免疫反應之物質。片語「佐劑部分」係指如本文所述，例如經由連接子共價鍵結至抗體構築體之佐劑。佐劑部分可在鍵結至抗體構築體時或在向個體投與免疫接合物後從抗體構築體裂解(例如，酶促裂解)之後引發免疫反應。
術語「Toll樣受體」及「TLR」係指高度保守之哺乳動物蛋白家族之任何成員，其識別病原體相關之分子模式且充當先天免疫中之關鍵信號傳導元件。TLR多肽共享特徵結構，該特徵結構包括具有富白胺酸重複之細胞外結構域、跨膜結構域及TLR信號傳導中所涉及之細胞內結構域。
術語「Toll樣受體7」及「TLR7」係指與公開可用之TLR7序列，例如人類TLR7多肽之GenBank寄存編號AAZ99026或鼠類TLR7多肽之GenBank寄存編號AAK62676共享至少約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性的核酸或多肽。
術語「Toll樣受體8」及「TLR8」係指與公開可用之TLR7序列，例如人類TLR8多肽之GenBank寄存編號AAZ95441或鼠類TLR8多肽之GenBank寄存編號AAK62677共享至少約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性的核酸或多肽。
「TLR促效劑」為直接或間接結合至TLR (例如TLR7及/或TLR8)以誘導TLR信號傳導之物質。TLR信號傳導中任何可偵測之差異皆可指示促效劑刺激或活化TLR。信號傳導差異可顯現為例如以下各者之變化：靶基因之表現、信號轉導組分之磷酸化、諸如核因子-κB (NF-κB)之下游元件之細胞內定位、某些組分(諸如IL-1受體相關激酶(IRAK))與其他蛋白質或細胞內結構之締合，或諸如激酶(諸如有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK))之組分的生物化學活性。
「抗體」係指包含來自免疫球蛋白基因之抗原結合區(包括互補決定區 (CDR))之多肽或其片段。術語「抗體」特定涵蓋展現所需生物活性之單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段。例示性免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體。各四聚體由兩對相同多肽鏈組成，各對具有由二硫鍵連接之一條「輕」鏈(約25 kDa)及一條「重」鏈(約50-70 kDa)。各鏈由結構域組成，該等結構域稱作免疫球蛋白結構域。此等結構域按大小及功能分為不同類別，例如，輕鏈及重鏈上之可變結構域或區(分別為VL 及VH )以及輕鏈及重鏈上之恆定結構域或區(分別為CL 及CH )。各鏈之N端界定約100至110個或更多個胺基酸之可變區，稱作互補位(paratope)，其主要負責抗原識別，亦即，抗原結合結構域。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，其依次分別定義免疫球蛋白種類IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。IgG抗體為由四條肽鏈組成之約150 kDa大分子。IgG抗體含有兩條約50 kDa之相同種類γ重鏈及兩條約25 kDa之相同輕鏈，由此為四聚四級結構。兩條重鏈係由二硫鍵彼此連接且各自連接至輕鏈。所得四聚體具有兩個相同半部分，其一起形成類Y形狀。叉形物之各末端含有相同抗原結合結構域。人類中存在四種IgG子類(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)，以其在血清中之豐度順序命名(亦即，IgG1最豐富)。典型地，抗體之抗原結合結構域在結合至癌細胞之特異性及親和力中將最為關鍵。
「抗體構築體」係指包含(i)抗原結合結構域及(ii) Fc結構域之抗體或融合蛋白。
在一些實施例中，結合劑為抗原結合抗體「片段」，其為至少包含抗體之抗原結合區之構築體，該抗原結合區為單獨的或與共同構成抗原結合構築體之其他組分一起。許多不同類型之抗體「片段」在此項技術中為已知的，包括例如(i) Fab片段，其為由VL 、VH 、CL 及CH1 結構域組成之單價片段；(ii) F(ab')2 片段，其為包含兩個在鉸鏈區由二硫橋聯接之Fab片段的二價片段；(iii) Fv片段，其由抗體之單一臂之VL 及VH 結構域組成；(iv) Fab'片段，其係藉由使用溫和還原條件使F(ab')2 片段之二硫橋斷裂而產生；(v)二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)；及(vi)單鏈Fv (scFv)，其為由Fv片段之經合成連接子連接之兩個結構域(亦即，VL 及VH )組成的單價分子，該合成連接子使兩個結構域能夠合成為單一多肽鏈。
抗體或抗體片段可為較大構築體之一部分，例如，抗體片段與額外區域之接合物或融合構築體。舉例而言，在一些實施例中，抗體片段可融合至如本文所述之Fc區。在其他實施例中，抗體片段(例如Fab或scFv)可為嵌合抗原受體或嵌合T細胞受體之一部分，例如，藉由融合至跨膜結構域(視情況具有中間連接子或「莖(stalk)」(例如鉸鏈區))及視情況存在之細胞間信號傳導結構域。舉例而言，抗體片段可融合至t細胞受體之γ及/或δ鏈，以提供結合PD-L1之T細胞受體樣構築體。在又一個實施例中，抗體片段為包含CD1或CD3結合結構域及連接子之雙特異性T細胞嚙合子(BiTE)之一部分。
「抗原決定基」意指與抗原結合結構域結合之抗原的任何抗原決定子或抗原決定基決定子(亦即，在抗原結合結構域之互補位處)。抗原決定子通常由分子之化學活性表面基團，諸如胺基酸或糖側鏈組成，且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。
術語「Fc受體」或「FcR」係指結合至抗體之Fc區的受體。存在三個主要種類之Fc受體：(1)結合至IgG之FcγR，(2)結合至IgA之FcαR，及(3)結合至IgE之FcεR。FcγR家族包括若干成員，諸如FcγI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16A)及FcγRIIIB (CD16B)。Fcγ受體對IgG之親和力不同，且對IgG子類(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)之親和力亦不同。
如本文所提及之核酸或胺基酸序列「一致性」可藉由將所關注之核酸或胺基酸序列與參考核酸或胺基酸序列進行比較來確定。百分比一致性為在最佳比對之所關注序列與參考序列之間相同(亦即，一致)之核苷酸或胺基酸殘基數除以最長序列之長度(亦即，所關注序列或參考序列任一者之長度，以較長者為準)。序列之比對及百分比一致性之計算可使用可用之軟體程式進行。此類程式之實例包括CLUSTAL-W、T-Coffee及ALIGN (用於核酸及胺基酸序列之比對)、BLAST程式(例如BLAST 2.1、BL2SEQ、BLASTp、BLASTn及類似程式)及FASTA程式(例如FASTA3x、FASTM及SSEARCH) (用於序列比對及序列相似性搜索)。序列比對演算法亦在以下文獻中揭示：例如Altschul 等人,J. Molecular Biol. , 215(3): 403-410 (1990)；Beigert 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,106 (10): 3770-3775 (2009)；Durbin 等人編,Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids , Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009)；Soding,Bioinformatics , 21(7): 951-960 (2005)；Altschul 等人,Nucleic Acids Res. , 25(17): 3389-3402 (1997)；及Gusfield,Algorithms on Strings, Trees and Sequences , Cambridge University Press, Cambridge UK (1997))。序列之百分比(%)一致性亦可計算為例如100 x [(一致位置)/min(TGA 、TGB )]，其中TGA 及TGB 為在比對中使TGA 及TGB 最小化之肽序列A及B中之殘基數與內部空位的總和。參見例如Russell等人,J. Mol Biol. , 244: 332-350 (1994)。
結合劑包含一起形成抗原結合位點之Ig重鏈及輕鏈可變區多肽。重鏈及輕鏈可變區中之每一者為包含由構架區連接之三個互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)之多肽。結合劑可為此項技術中已知的包含Ig重鏈及輕鏈之多種類型結合劑中之任一者。舉例而言，結合劑可為抗體、抗原結合抗體「片段」或T細胞受體。
「生物類似藥(biosimilar)」係指具有類似於以下抗體之活性特性的經核准之抗體構築體：例如，先前經核准之PD-L1靶向抗體構築體，諸如阿特珠單抗(atezolizumab) (TECENTRIQ™, Genentech, Inc.)、得瓦魯單抗(durvalumab) (IMFINZI™, AstraZeneca)及阿維魯單抗(avelumab) (BAVENCIO™, EMD Serono, Pfizer)；先前經核准之HER2靶向抗體構築體，諸如曲妥珠單抗(trastuzumab) (HERCEPTIN™, Genentech, Inc.)及帕妥珠單抗(pertuzumab) (PERJETA™, Genentech, Inc.)；或CEA靶向抗體，诸如拉貝妥單抗(labetuzumab) (CEA-CIDETM , MN-14, hMN14, Immunomedics) CAS登記號219649-07-7)。
「生物改良藥(biobetter)」係指經核准之抗體構築體，其為諸如阿特珠單抗、得瓦魯單抗、阿維魯單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗及拉貝妥單抗之先前經核准之抗體構築體的改良。生物改良藥相對於先前經核准之抗體構築體可具有一或多個修飾(例如經改變之聚醣譜，或獨特抗原決定基)。
「胺基酸」係指可併入肽、多肽或蛋白質中之任何單體單元。胺基酸包括天然存在之α-胺基酸及其立體異構體，以及非天然(非天然存在之)胺基酸及其立體異構體。給定胺基酸之「立體異構體」係指具有相同分子式及分子內鍵，但鍵及原子之三維排列不同的異構體(例如L-胺基酸及對應D-胺基酸)。胺基酸可經糖基化(例如N- 連接之聚醣、O- 連接之聚醣、磷酸聚醣、C- 連接之聚醣，或糖基化陽離子(glypication))或去糖基化。胺基酸在本文中可由通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦之單字母符號來提及。
天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼之彼等胺基酸，以及後來經修飾之彼等胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O- 磷酸絲胺酸。天然存在之α-胺基酸包括但不限於D及L立體異構體，其中存在丙胺酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、苯丙胺酸(Phe)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、天冬醯胺(Asn)、脯胺酸(Pro)、麩醯胺酸(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)及其組合。天然存在之α-胺基酸之立體異構體包括但不限於D-丙胺酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬胺酸(D-Asp)、D-麩胺酸(D-Glu)、D-苯丙胺酸(D-Phe)、D-組胺酸(D-His)、D-異白胺酸(D-Ile)、D-精胺酸(D-Arg)、D-離胺酸(D-Lys)、D-白胺酸(D-Leu)、D-甲硫胺酸(D-Met)、D-天冬醯胺(D-Asn)、D-脯胺酸(D-Pro)、D-麩醯胺酸(D-Gln)、D-絲胺酸(D-Ser)、D-蘇胺酸(D-Thr)、D-纈胺酸(D-Val)、D-色胺酸(D-Trp)、D-酪胺酸(D-Tyr)及其組合。
天然存在之胺基酸包括藉由轉譯後修飾在蛋白質中形成之彼等胺基酸，諸如瓜胺酸(Cit)。
非天然(非天然存在之)胺基酸包括但不限於胺基酸類似物、胺基酸模擬物、合成胺基酸、N -取代之甘胺酸及呈L-構型或D-構型之N- 甲基胺基酸，該等非天然胺基酸以類似於天然存在之胺基酸之方式發揮功能。舉例而言，「胺基酸類似物」可為具有與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構(亦即，鍵結至氫、羧基、胺基之碳)，但具有經修飾之側鏈基團或經修飾之肽主鏈的非天然胺基酸，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸及甲硫胺酸甲基鋶。「胺基酸模擬物」係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構，但以類似於天然存在之胺基酸之方式發揮功能的化合物。
「連接子」係指共價鍵結化合物或材料中之兩個或更多個部分之官能基。舉例而言，連接部分可用於將佐劑部分共價鍵結至免疫接合物中之抗體構築體。
「連接部分」係指共價鍵結化合物或材料中之兩個或更多個部分之官能基。舉例而言，連接部分可用於將佐劑部分共價鍵結至免疫接合物中之抗體。可用於將連接部分連接至蛋白質及其他材料之鍵包括但不限於醯胺、胺、酯、胺基甲酸酯、脲、硫醚、硫代胺基甲酸酯、硫代碳酸酯及硫脲。
「二價」係指含有用於連接兩個官能基之兩個附接點的化學部分；多價連接部分可具有用於連接其他官能基之額外附接點。二價基團可用詞尾「二基」表示。舉例而言，二價連接部分包括二價聚合物部分，諸如二價聚(乙二醇)、二價環烷基、二價雜環烷基、二價芳基及二價雜芳基。「二價環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基」係指具有用於共價連接分子或材料中之兩個部分之兩個附接點的環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基。環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基可經取代或未經取代。環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基可經一或多個選自鹵基、羥基、胺基、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基之基團取代。
波形線(
Figure 02_image001
)或星號(*)代表指定化學部分之附接點。若指定化學部分存在兩條波形線(
Figure 02_image001
)，則應了解，可雙向使用二價化學部分，亦即，自左至右或自右至左讀取。在一些實施例中，存在兩條波形線(
Figure 02_image001
)之指定部分視為以自左至右讀取來使用。
「烷基」係指具有所指示之碳原子數之直鏈或支鏈飽和脂族基團。烷基可包括任何數目之碳。舉例而言，C1 -C4 烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基及三級丁基。烷基亦可指具有至多30個碳原子之烷基，諸如但不限於庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可經取代或未經取代。「經取代之烷基」基團可經一或多個選自鹵基、羥基、胺基、側氧基 (=O)、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基之基團取代。
術語「烷二基」係指二價烷基。
「環烷基」係指含有3至12個環原子或所指示之原子數的飽和或部分不飽和單環、稠合雙環或橋聯多環組合體。飽和單環碳環包括例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環辛基。飽和雙環及多環碳環包括例如降莰烷、[2.2.2]雙環辛烷、十氫萘及金剛烷。碳環基團亦可為部分不飽和的，在環中具有一或多個雙鍵或參鍵。部分不飽和之代表性碳環基團包括但不限於環丁烯、環戊烯、環己烯、環己二烯(1,3-異構體及1,4-異構體)、環庚烯、環庚二烯、環辛烯、環辛二烯(1,3-異構體、1 4-異構體及1,5-異構體)、降莰烯及降莰二烯。
術語「環烷二基」係指二價環烷基。
「芳基」係指具有任何適合數目之環原子及任何適合數目之環的芳族環系統。芳基可為單環，稠合形成雙環或三環基團，或由鍵連接形成聯芳基。代表性芳基包括苯基、萘基及聯苯基。其他芳基包括具有亞甲基連接基團之苯甲基。一些芳基具有6至12個環成員，諸如苯基、萘基或聯苯基。其他芳基具有6至10個環成員，諸如苯基或萘基。
「雜環烷基」及「雜芳基」係指如本文所述之「環烷基」或「芳基」，其中一或多個碳原子視情況且獨立地經選自N、O及S之雜原子置換。單獨或作為另一取代基之一部分的「雜芳基」係指含有5至16個環原子之單環或稠合雙環或三環芳族環組合體，其中1至5個環原子為雜原子，諸如N、O或S。額外雜原子亦可用，包括但不限於B、Al、Si及P。雜原子可經氧化以形成諸如但不限於-S(O)-及-S(O)2 -之部分。雜芳基中可包括任何適合數目之雜原子，諸如1、2、3、4或5個，或1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、2至3個、2至4個、2至5個、3至4個或3至5個。雜芳基可包括諸如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、噠嗪、三嗪(1,2,3-異構體、1,2,4-異構體及1,3,5-異構體)、噻吩、呋喃、噻唑、異噻唑、噁唑及異噁唑之基團。雜芳基亦可稠合至芳族環系統，諸如苯環，以形成以下成員：包括但不限於苯并吡咯，諸如吲哚及異吲哚；苯并吡啶，諸如喹啉及異喹啉；苯并吡嗪(喹噁啉)；苯并嘧啶(喹唑啉)；苯并噠嗪，諸如呔嗪及噌啉；苯并噻吩；及苯并呋喃。其他雜芳基包括由鍵連接之雜芳基環，諸如聯吡啶。雜芳基可經取代或未經取代。「經取代之雜芳基」基團可經一或多個選自鹵基、羥基、胺基、側氧基 (=O)、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基之基團取代。
術語「雜環烷二基」係指二價雜環烷基。
雜芳基可經由環上之任何位置連接。舉例而言，吡咯包括1-吡咯、2-吡咯及3-吡咯；吡啶包括2-吡啶、3-吡啶及4-吡啶；咪唑包括1-咪唑、2-咪唑、4-咪唑及5-咪唑；吡唑包括1-吡唑、3-吡唑、4-吡唑及5-吡唑；三唑包括1-三唑、4-三唑及5-三唑；四唑包括1-四唑及5-四唑；嘧啶包括2-嘧啶、4-嘧啶、5-嘧啶及6-嘧啶；噠嗪包括3-噠嗪及4-噠嗪；1,2,3-三嗪包括4-三嗪及5-三嗪；1,2,4-三嗪包括3-三嗪、5-三嗪及6-三嗪；1,3,5-三嗪包括2-三嗪；噻吩包括2 -噻吩及3-噻吩；呋喃包括2-呋喃及3-呋喃；噻唑包括2-噻唑、4-噻唑及5-噻唑；異噻唑包括3-異噻唑、4-異噻唑及5-異噻唑；噁唑包括2-噁唑、4-噁唑及5-噁唑；異噁唑包括3-異噁唑、4-異噁唑及5-異噁唑；吲哚包括1-吲哚、2-吲哚及3-吲哚；異吲哚包括1-異吲哚及2-異吲哚；喹啉包括2-喹啉、3-喹啉及4-喹啉；異喹啉包括1-異喹啉、3-異喹啉及4-異喹啉；喹唑啉包括2-喹唑啉及4-喹唑啉；噌啉包括3-噌啉及4-噌啉；苯并噻吩包括2-苯并噻吩及3-苯并噻吩；且苯并呋喃包括2-苯并呋喃及3-苯并呋喃。
術語「雜芳二基」係指二價雜芳基。
單獨或作為另一取代基之一部分的「雜環烷基」係指具有3至12個環成員及1至4個N、O及S雜原子之飽和環系統。額外雜原子亦可用，包括但不限於B、Al、Si及P。雜原子可經氧化以形成諸如但不限於-S(O)-及-S(O)2 -之部分。雜環烷基可包括任何數目之環原子，諸如3至6個、4至6個、5至6個、3至8個、4至8個、5至8個、6至8個、3至9個、3至10個、3至11個或3至12個環成員。雜環烷基中可包括任何適合數目之雜原子，諸如1、2、3或4個，或1至2個、1至3個、1至4個、2至3個、2至4個或3至4個。雜環烷基可包括諸如氮雜環丙烷、氮雜環丁烷、吡咯啶、哌啶、氮雜環庚烷、氮雜環辛烷、奎寧環(quinuclidine)、吡唑啶、咪唑啶、哌嗪(1,2-異構體、1,3-異構體及1,4-異構體)、環氧乙烷、氧雜環丁烷、四氫呋喃、噁烷(四氫哌喃)、氧雜環己烷、硫雜環丙烷、硫雜環丁烷、硫雜環戊烷(四氫噻吩)、噻烷(四氫噻喃)、噁唑啶、異噁唑啶、噻唑啶、異噻唑啶、二氧雜環戊烷、二硫雜環戊烷、嗎啉、硫代嗎啉、二噁烷或二噻烷之基團。雜環烷基亦可稠合至芳族或非芳族環系統以形成包括但不限於吲哚啉之成員。雜環烷基可未經取代或經取代。
雜環烷基可經由環上之任何位置連接。舉例而言，氮雜環丙烷可為1-氮雜環丙烷或2-氮雜環丙烷；氮雜環丁烷可為1-氮雜環丁烷或2-氮雜環丙烷；吡咯啶可為1-吡咯啶、2-吡咯啶或3-吡咯啶；哌啶可為1-哌啶、2-哌啶、3-哌啶或4-哌啶；吡唑啶可為1-吡唑啶、2-吡唑啶、3-吡唑啶或4-吡唑啶；咪唑啶可為1-咪唑啶、2-咪唑啶、3-咪唑啶或4-咪唑啶；哌嗪可為1-哌嗪、2-哌嗪、3-哌嗪或4-哌嗪；四氫呋喃可為1-四氫呋喃或2-四氫呋喃；噁唑啶可為2-噁唑啶、3-噁唑啶、4-噁唑啶或5-噁唑啶；異噁唑啶可為2-異噁唑啶、3-異噁唑啶、4-異噁唑啶或5-異噁唑啶；噻唑啶可為2-噻唑啶、3-噻唑啶、4-噻唑啶或5-噻唑啶；異噻唑啶可為2-異噻唑啶、3-異噻唑啶、4-異噻唑啶或5-異噻唑啶；且嗎啉可為2-嗎啉、3-嗎啉或4-嗎啉。
術語「雜環烷二基」係指二價雜環烷基。
單獨或作為另一取代基之一部分的術語「鹵基」及「鹵素」係指氟、氯，溴或碘原子。
單獨或作為另一取代基之一部分的術語「羰基」係指C(=O)或-C(=O)-，亦即，碳原子雙鍵鍵結至氧且結合至具有羰基之部分中之兩個其他基團。
如本文所用之片語「四級銨鹽」係指已用烷基取代基(例如C1 -C4 烷基，諸如甲基、乙基、丙基或丁基)四級化之三級胺。
術語「治療(treat/treatment)」係指成功治療或改善損傷、病變、疾患(例如癌症)或症狀(例如認知障礙)之任何指標，包括任何客觀或主觀參數，諸如消除；緩解；減輕症狀或使患者更能忍受症狀、損傷、病變或疾患；症狀進展之速率降低；減少症狀或疾患之頻率或持續時間；或在一些情況下預防症狀發作。症狀之治療或改善可基於任何客觀或主觀參數，包括例如身體檢查之結果。
術語「癌症」、「贅瘤」及「腫瘤」在本文中用於指展現自主、不受調控之生長的細胞，使得細胞展現以對細胞增殖之控制顯著損失為特徵之異常生長表型。在本發明之情形中用於偵測、分析及/或治療之所關注細胞包括癌細胞(例如，來自患有癌症之個體的癌細胞)、惡性癌細胞、轉移前癌細胞、轉移性癌細胞及非轉移性癌細胞。幾乎每個組織之癌症皆為已知的。片語「癌症負擔」係指個體中之癌細胞數量或癌症體積。因此，減少癌症負擔係指減小個體中之癌細胞數目或癌細胞體積。如本文所用之術語「癌細胞」係指為癌細胞(例如，來自可治療個體之任何癌症，例如自患有癌症之個體分離)或來源於癌細胞，例如癌細胞純系之任何細胞。舉例而言，癌細胞可來自已建立之癌細胞株，可為自患有癌症之個體分離之初生細胞，可為來自於自患有癌症之個體分離之初生細胞的子代細胞，及類似細胞。在一些實施例中，該術語亦可指癌細胞之一部分，諸如癌細胞之次細胞部分、細胞膜部分或細胞溶解產物。熟習此項技術者已知許多類型之癌症，包括實體腫瘤，諸如癌瘤、肉瘤、神經膠質母細胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤及骨髓瘤，以及循環癌，諸如白血病。
如本文所用之術語「癌症」包括任何形式之癌症，包括但不限於實體腫瘤癌(例如皮膚癌、肺癌、前列腺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌、胰臟癌、腎癌、肝癌、神經膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤、平滑肌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、黑色素瘤及神經內分泌癌)及液體癌(例如血液學癌症)；癌瘤；軟組織腫瘤；肉瘤；畸胎瘤；黑色素瘤；白血病；淋巴瘤；及腦癌，包括微小残留病，且包括原發性及轉移性腫瘤。
「PD-L1表現」係指在細胞表面上具有PD-L1受體之細胞。如本文所用之「PD-L1過表現」係指與對應非癌細胞相比具有更多PD-L1受體之細胞。
「HER2」係指蛋白質人類表皮生長因子受體2。
「HER2表現」係指在細胞表面上具有HER2受體之細胞。舉例而言，細胞在細胞表面上可具有約20,000個至約50,000個HER2受體。如本文所用之「HER2過表現」係指具有超過約50,000個HER2受體之細胞。舉例而言，與對應非癌細胞相比，細胞之HER2受體數目為2、5、10、100、1,000、10,000、100,000或1,000,000倍(例如，約1百萬或2百萬個HER2受體)。據估計，HER2在約25%至約30%之乳癌中過表現。
癌症之「病變」包括所有損害患者健康之現象。此包括但不限於異常或不可控之細胞生長、轉移、干擾鄰近細胞正常發揮功能、以異常水準釋放細胞激素或其他分泌產物、抑制或加重炎症或免疫反應、贅瘤、癌前病變、惡性病及侵入周圍或遠端組織或器官(諸如淋巴結)。
如本文所用之片語「癌症復發」及「腫瘤復發」及其文法变型係指在診斷出癌症之後贅生性細胞或癌細胞之進一步生長。特別地，當癌組織中發生癌細胞進一步生長時可能會發生復發。類似地，當腫瘤細胞播散至局部或遠端組織及器官中時發生「腫瘤擴散」，因此，腫瘤擴散涵蓋腫瘤轉移。當腫瘤生長局部擴散開以藉由壓縮、破壞或阻止正常器官功能來損害所涉及組織之功能時發生「腫瘤侵入」。
如本文所用之術語「轉移」係指癌性腫瘤在器官或身體部分中之生長，該器官或身體部分不直接連接至原始癌性腫瘤之器官。轉移應理解為包括微轉移，其為在不直接連接至原始癌性腫瘤之器官的器官或身體部分中存在不可偵量測之癌細胞。轉移亦可定義為過程之若干步驟，諸如癌細胞自原始腫瘤部位離開以及癌細胞遷移及/或侵入身體之其他部分。
片語「有效量」及「治療有效量」係指對於投藥而言產生治療作用之物質，諸如免疫接合物之劑量或量。確切劑量將視治療目的而定，且將由熟習此項技術者使用已知技術可確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms (第1-3卷, 1992)；Lloyd,The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar,Dosage Calculations (1999)；Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics , 第11版 (McGraw-Hill, 2006)；及Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第22版, (Pharmaceutical Press, London, 2012))。在癌症之情況下，治療有效量之免疫接合物可減少癌細胞之數目；減小腫瘤大小；抑制(亦即，在一定程度上减缓且較佳停止)癌細胞浸潤至周邊器官中；抑制(亦即，在一定程度上減緩且較佳停止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上緩解一或多種與癌症相關之症狀。在免疫接合物可阻止現有癌細胞生長及/或殺死現有癌細胞之程度上，其可能具有細胞生長抑制性及/或細胞毒性。對於癌症療法，可例如藉由評估疾病進展時間(TTP)及/或確定反應率(RR)來量測功效。
「接受者」、「個人」、「個體」、「宿主」及「患者」可互換使用且係指需要診斷、治療或療法之任何哺乳動物個體(例如人類)。用於治療目的之「哺乳動物」係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家養及農場動物以及動物園動物、運動型動物或寵物，諸如犬、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬、駱駝等。在某些實施例中，哺乳動物為人類。
在本發明之情形中，片語「協同佐劑」或「協同組合」包括兩種免疫調節劑之組合，諸如受體促效劑、細胞激素及佐劑多肽，該等免疫調節劑以組合形式相對於單獨投與之任一者對免疫引發協同作用。特別地，本文所揭示之免疫接合物包含所主張之佐劑與抗體構築體之協同組合。舉例而言，相對於在不存在其他部分之情況下投與抗體構築體或佐劑時，此等協同組合在投與後對免疫引發更大作用。此外，與單獨投與抗體構築體或佐劑時相比，可投與減少量之免疫接合物(如由作為免疫接合物之一部分投與之抗體構築體之總數或佐劑之總數來量測)。
如本文所用之術語「投與」係指向個體非經腸、靜脈內、腹膜內、肌肉內、腫瘤內、病灶內、鼻內或皮下投與、經口投與、以栓劑投與、局部接觸、鞘內投與或植入緩釋裝置，例如微型滲透泵。
如本文中用於修飾數值之術語「約」及「左右」指示在該數值周圍之接近範圍。因此，若「X」為該值，則「約X」或「X左右」指示0.9X至1.1X，例如0.95X至1.05X或0.99X至1.01X之值。提及「約X」或「X左右」特定指示至少值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X及1.05X。因此，「約X」及「X左右」欲教示且提供對例如「0.98X」之技術方案限制的書面描述支持。 抗體
本發明之免疫接合物包含抗體。本發明之實施例之範疇內包括本文所述之抗體構築體或抗原結合結構域之功能變異體。如本文所用之術語「功能變異體」係指具有與親本抗體構築體或抗原結合結構域具有實質或顯著序列一致性或相似性之抗原結合結構域的抗體構築體，該功能變異體保留為其變異體之抗體構築體或抗原結合結構域之生物活性。功能變異體包括，例如，本文所述之抗體構築體或抗原結合結構域(親本抗體構築體或抗原結合結構域)的彼等變異體，其保留以相似程度識別表現PD-L1，HER2或CEA的靶細胞的能力，與親本抗體構築體或抗原結合結構域相同或更高程度。
關於抗體構築體或抗原結合結構域，功能變異體之胺基酸序列與抗體構築體或抗原結合結構域可例如具有至少約30%、約50%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高一致性。
功能變異體可例如包含具有至少一個保守胺基酸取代之親本抗體構築體或抗原結合結構域之胺基酸序列。替代地或另外，功能變異體可包含具有至少一個非保守胺基酸取代之親本抗體構築體或抗原結合結構域之胺基酸序列。在此種情況下，非保守胺基酸取代較佳不干擾或抑制功能變異體之生物活性。非保守胺基酸取代可增強功能變異體之生物活性，使得功能變異體之生物活性與親本抗體構築體或抗原結合結構域相比增加。
包含本發明之免疫接合物之抗體包括Fc工程改造之變異體。在一些實施例中，在Fc區中調節與一或多種Fc受體之結合的突變可包括以下突變中之一或多者：SD (S239D)、SDIE (S239D/I332E)、SE (S267E)、SELF (S267E/L328F)、SDIE (S239D/I332E)、SDIEAL (S239D/I332E/A330L)、GA (G236A)、ALIE (A330L/I332E)、GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E)、V9 (G237D/P238D/P271G/A330R)及V11 (G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)；及/或以下胺基酸處之一或多個突變：E345R、E233、G237、P238、H268、P271、L328及A330。用於調節Fc受體結合之額外Fc區修飾在例如美國專利申請公開案2016/0145350以及美國專利7,416,726及5,624,821中描述，該等文獻藉此以全文引用之方式併入本文中。
包含本發明之免疫接合物之抗體包括聚醣變異體，諸如去岩藻糖基化。在一些實施例中，結合劑之Fc區經修飾以與原生未經修飾之Fc區相比具有改變之Fc區糖基化模式。
本發明抗體構築體或抗原結合結構域之胺基酸取代較佳為保守胺基酸取代。保守胺基酸取代在此項技術中為已知的，且包括用一個具有某些物理及/或化學特性之胺基酸交換另一個具有相同或類似化學或物理特性之胺基酸的胺基酸取代。舉例而言，保守胺基酸取代可為酸性/帶負電荷極性胺基酸取代另一個酸性/帶負電荷極性胺基酸(例如Asp或Glu)、具有非極性側鏈之胺基酸取代另一個具有非極性側鏈之胺基酸(例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、鹼性/帶正電荷極性胺基酸取代另一個鹼性/帶正電荷極性胺基酸(例如Lys、His、Arg等)、具有極性側鏈之不帶電荷胺基酸取代另一個具有極性側鏈之不帶電荷胺基酸(例如Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)、具有β分支側鏈之胺基酸取代另一個具有β分支側鏈之胺基酸(例如Ile、Thr及Val)、具有芳族側鏈之胺基酸取代另一個具有芳族側鏈之胺基酸(例如His、Phe、Trp及Tyr)等。
抗體構築體或抗原結合結構域可基本上由本文所述之一或多個指定胺基酸序列組成，使得其他組分(例如其他胺基酸)不會本質上改變抗體構築體或抗原結合結構域功能變異體之生物活性。
用於產生抗體之方法在例如Köhler及Milstein,Eur. J. Immunol ., 5: 511-519 (1976)；Harlow及Lane (編),Antibodies: A Laboratory Manual , CSH Press (1988)；及Janeway等人 (編),Immunobiology, 第 9 版 ., Garland Publishing, New York, NY (2017)中描述。在某些實施例中，可使用其中一或多個內源性免疫球蛋白基因經一或多個人類免疫球蛋白基因置換之轉殖基因動物(例如小鼠)產生人類或嵌合抗體或抗體片段。其中內源性抗體基因經人類抗體基因有效置換之轉殖基因小鼠之實例包括但不限於Medarex HUMAB-MOUSE™、Kirin TC MOUSE™及Kyowa Kirin KM-MOUSE™ (參見例如Lonberg,Nat. Biotechnol ., 23(9): 1117-25 (2005)；及Lonberg,Handb. Exp. Pharmacol. , 181: 69-97 (2008))。可使用此項技術中已知之任何適合方法來產生人源化抗體(參見例如An, Z. (編),Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic , John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009))，包括例如非人類CDR移植至人類抗體支架上(參見例如Kashmiri等人,Methods , 36(1): 25-34 (2005)；及Hou等人,J. Biochem ., 144(1): 115-120 (2008))及使用噬菌體顯示(參見例如Fellouse等人,Journal of Molecular Biology , 373(4): 924-940 (2007)；及Glanville等人, PNAS, 106(48): 20216-20221 (2009))。
在一個例示性實施例中，本發明之免疫接合物包含抗體構築體，該抗體構築體包含特異性識別並結合PD-L1之抗原結合結構域。
程式性死亡配位體1 (PD-L1、分化簇274、CD274、B7-同源物1或B7-H1)屬於B7蛋白質超家族，且為程式性細胞死亡蛋白1 (PD-1、PDCD1、分化簇279或CD279)之配位體。PD-L1亦可與B7.1 (CD80)相互作用，且據信此種相互作用可抑制T細胞啟動。PD-L1/PD-1軸在抑制適應性免疫反應中起重要作用。更特定而言，據信PD-L1與其受體PD-1之嚙合遞送抑制T細胞活化及增殖之信號。結合至PD-L1且阻止配位體與PD-1受體之結合的劑可防止此種免疫抑制，且因此可在需要時增強免疫反應，諸如用於治療癌症或感染。PD-L1/PD-1路徑亦有助於防止自體免疫，且因此針對PD-L1之促效劑或遞送免疫抑制性有效負荷之劑可幫助治療自體免疫病症。
已開發若干靶向PD-L1之抗體用於治療癌症，包括阿特珠單抗(TECENTRIQTM )、得瓦魯單抗(IMFINZITM )及阿維魯單抗(BAVENCIOTM )。儘管如此，持續需要新PD-L1結合劑，包括以高親和力結合PD-L1且有效防止PD-L1/PD-1信號傳導之劑以及可將治療有效負荷遞送至PD-L1表現細胞之劑。另外，需要新PD-L1結合劑以治療自體免疫病症及感染。
提供一種將胺基苯并氮呯衍生物有效負荷遞送至表現PD-L1之細胞的方法，該方法包括向該細胞或包含該細胞之哺乳動物投與免疫接合物，該免疫接合物包含共價附接至連接子之抗PD-L1抗體，該連接子共價附接至一或多個胺基苯并氮呯部分。
亦提供一種用於增強或減少或抑制哺乳動物之免疫反應的方法及用於治療對PD-L1抑制有反應之哺乳動物之疾病、病症或疾患之方法，該等方法包括向哺乳動物投與其PD-L1免疫接合物。
本發明提供一種PD-L1結合劑，該PD-L1結合劑包含免疫球蛋白重鏈可變區多肽及免疫球蛋白輕鏈可變區多肽。
PD-L1結合劑特異性結合PD-L1。該劑之結合特異性允許靶向PD-L1表現細胞，例如，以將治療有效負荷遞送至此類細胞。
在一些實施例中，PD-L1結合劑(A型或B型)結合至人類PD-L1，例如，包含SEQ ID NO: 307之蛋白質。然而，亦涵蓋結合至任何PD-L1同源物或同種同源物之結合劑。在一些實施例中，PD-L1蛋白質與SEQ ID NO: 307包含至少約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性。在一些實施例中，結合劑結合人類PD-L1及食蟹猴PD-L1；或人類、食蟹猴及小鼠PD-L1。
Figure 02_image003
在一些實施例中，PD-L1結合劑結合PD-L1，而實質上不抑制或阻止PD-L1與其受體PD-1之結合。然而，在其他實施例中，PD-L1結合劑可完全或部分阻斷(抑制或阻止) PD-L1與其受體PD-1之結合，使得該抗體可用於抑制PD-L1/PD-1信號傳遞(例如用於治療目的)。
抗體或抗原結合抗體片段可對PD-L1具有單特異性，或可為雙特異性或多特異性的。舉例而言，在二價或多價抗體或抗體片段中，結合結構域可為不同的，其靶向相同抗原之不同抗原決定基或靶向不同抗原。構築多價結合構築體之方法在此項技術中為已知的。雙特異性及多特異性抗體在此項技術中為已知的。此外，可提供雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體，其為多肽鏈之二聚體、三聚體或四聚體，該等多肽鏈各自包含由肽連接子連接至VL 之VH ，該肽連接子過短而不允許同一多肽鏈上之VH 與VL 之間配對，從而驅動不同VH -VL 多肽鏈上之互補結構域之間配對，以產生具有兩個、三個或四個功能性抗原結合位點之多聚分子。同樣，可產生雙scFv片段，其為具有兩個不同可變結構域之小scFv片段，以產生能夠結合兩個不同抗原決定基之雙特異性雙scFv片段。可使用遺傳工程改造方法產生Fab二聚體(Fab2)及Fab三聚體(Fab3)，以基於Fab片段創建多特異性構築體。
PD-L1結合劑亦可為抗體接合物。就此而言，PD-L1結合劑可為(1)抗體、替代性支架或其片段與(2)蛋白質或非蛋白質部分之接合物。舉例而言，PD-L1結合劑可接合至肽、螢光分子、化學治療性或其他細胞毒性有效負荷、免疫活化劑或免疫抑制劑。
PD-L1結合劑可為或可獲自人類抗體、非人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體或對應抗體片段。「嵌合」抗體為典型地包含人類恆定區及非人類可變區之抗體或其片段。「人源化」抗體為典型地包含人類抗體支架，但在至少一個CDR (例如1個、2個、3個、4個、5個或全部六個CDR)中具有非人類來源之胺基酸或序列的單株抗體。 PD-L1結合劑 - A型
本文提供PD-L1結合劑，該等PD-L1結合劑包含免疫球蛋白重鏈可變區多肽及免疫球蛋白輕鏈可變區多肽。在一些實施例中，PD-L1結合劑(A型)包含SEQ ID NO: 223-264中之任一者的免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR；及SEQ ID NO: 265-306中之任一者的免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR。在其他實施例中，PD-L1結合劑(A型)包含具有與SEQ ID NO: 223-264中之任一者至少90%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區多肽，及具有與SEQ ID NO: 265-306中之任一者至少90%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區多肽。在PD-L1結合劑(A型)之其他實施例中，免疫球蛋白重鏈可變區多肽包含：包含SEQ ID NO: 1-23中之任一者的互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 24-57中之任一者的互補決定區2 (HCDR2)，及包含SEQ ID NO: 58-95中之任一者的互補決定區3 (HCDR3)；及/或免疫球蛋白輕鏈可變區多肽包含：包含SEQ ID NO: 96-128中之任一者的互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 129-151中之任一者的互補決定區2 (LCDR2)，及包含SEQ ID NO: 152-155中之任一者的互補決定區3 (LCDR3)。亦提供編碼PD-L1結合劑或其個別重鏈及輕鏈之核酸；包含核酸之載體及細胞；及包含結合劑或核酸之組合物。
此外，在一些實施例中，本文所提供之PD-L1結合劑(A型)在結合至細胞表面上之PD-L1後引起PD-L1或PD-L1/PD-L1結合劑複合物之細胞內化。不希望受任何特定理論或作用機制束縛，據信根據此實施例之PD-L1結合劑在結合後引起PD-L1內化，且在內化期間保持結合至PD-L1，從而促使結合劑連同PD-L1一起內化。PD-L1及所結合之PD-L1結合劑之細胞內化可藉由任何適合方法來確定，諸如檢定在細胞表面上之持久性及/或偵測內化抗體。在一些實施例中，PD-L1結合劑足夠強地內化，使得至少約25% (例如至少約35%、至少約50%、至少約75%或至少約90%)之結合細胞表面上之PD-L1的PD-L1結合劑內化(例如使用表面持久性檢定，約75%或以下、約65%或以下、約50%或以下、約25%或以下或約10%或以下之在檢定開始時結合至細胞表面上之PD-L1的PD-L1結合劑分子在檢定結束時保持結合)。
在一個實施例中，PD-L1結合劑(A型)包含SEQ ID NO: 223-264中之任一者的免疫球蛋白重鏈可變區，其序列與SEQ ID NO: 223-264至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致，或至少其CDR；及/或SEQ ID NO: 265-306中之任一者的免疫球蛋白輕鏈可變區，其序列與SEQ ID NO: 265-306至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致，或至少其CDR。
為作進一步說明，PD-L1結合劑(A型)可包含： (1)     SEQ ID NO: 223之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 265之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (2)     SEQ ID NO: 224之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 266之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (3)     SEQ ID NO: 225之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 267之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (4)     SEQ ID NO: 226之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 268之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (5)     SEQ ID NO: 227之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 269之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (6)     SEQ ID NO: 228之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 270之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (7)     SEQ ID NO: 229之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 271之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (8)     SEQ ID NO: 230之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 272之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (9)     SEQ ID NO: 231之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 273之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (10)   SEQ ID NO: 232之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 274之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (11)    SEQ ID NO: 233之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 275之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (12)   SEQ ID NO: 234之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 276之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (13)   SEQ ID NO: 235之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 277之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (14)   SEQ ID NO: 236之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 278之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (15)   SEQ ID NO: 237之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 279之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (16)   SEQ ID NO: 238之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 280之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (17)   SEQ ID NO: 239之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 281之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (18)   SEQ ID NO: 240之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 282之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (19)   SEQ ID NO: 241之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 283之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (20)   SEQ ID NO: 242之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 284之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (21)   SEQ ID NO: 243之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 285之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (22)   SEQ ID NO: 244之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 286之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (23)   SEQ ID NO: 245之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 287之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (24)   SEQ ID NO: 246之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 288之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (25)   SEQ ID NO: 247之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 289之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (26)   SEQ ID NO: 248之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 290之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (27)   SEQ ID NO: 249之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 291之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (28)   SEQ ID NO: 250之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 292之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (29)   SEQ ID NO: 251之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 293之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (30)   SEQ ID NO: 252之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 294之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (31)   SEQ ID NO: 253之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 295之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (32)   SEQ ID NO: 254之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 296之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (33)   SEQ ID NO: 255之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 297之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (34)   SEQ ID NO: 256之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 298之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (35)   SEQ ID NO: 257之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 299之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (36)   SEQ ID NO: 258之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 300之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (37)   SEQ ID NO: 259之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 301之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (38)   SEQ ID NO: 260之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 302之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (39)   SEQ ID NO: 261之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 303之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (40)   SEQ ID NO: 262之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 304之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (41)   SEQ ID NO: 263之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 305之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (42)   SEQ ID NO: 164之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 306之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR；及/或 (43)   圖4A-D之免疫球蛋白重鏈可變區及/或圖4E-G之免疫球蛋白輕鏈可變區，或至少其CDR。
給定重鏈或輕鏈Ig序列之CDR可根據各種已知Ig編號方案中之任一者(例如Kabat、Chothia、Martin (增強型Chothia)、IGMT、AbM)來確定。在某些實施例中，PD-L1結合劑(A型)包含以下CDR中之一或多者： HCDR1，其包含或由SEQ ID NO: 1-23中之任一者或與SEQ ID NO: 1-23至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成； HCDR2，其包含或由SEQ ID NO: 24-57中之任一者或與SEQ ID NO: 24-57至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成；及 HCDR3，其包含或由SEQ ID NO: 58-95中之任一者或與SEQ ID NO: 58-95至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含 LCDR1，其包含或由SEQ ID NO: 96-128中之任一者或與SEQ ID NO: 96-128至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成； LCDR2，其包含或由SEQ ID NO: 129-151中之任一者或與SEQ ID NO: 129-151至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成；及 LCDR3，其包含或由SEQ ID NO: 152-155中之任一者或與SEQ ID NO: 152-155至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成。
在特定實施例中，結合劑(A型)包含免疫球蛋白重鏈多肽及免疫球蛋白輕鏈多肽，其中： (1)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 1組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 24組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 58組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 96組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 152組成之LCDR3； (2)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 25組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 59組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 97組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 153組成之LCDR3； (3)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 3組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 26組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 60組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 98組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 154組成之LCDR3； (4)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 4組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 27組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 61組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 99組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 130組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 155組成之LCDR3； (5)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 5組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 28組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 62組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 100組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 153組成之LCDR3； (6)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 6組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 29組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 63組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 101組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 131組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 156組成之LCDR3； (7)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 7組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 30組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 64組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 102組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 132組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 157組成之LCDR3； (8)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 31組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 65組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 103組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 133組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 155組成之LCDR3； (9)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 8組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 32組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 66組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 104組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 134組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 158組成之LCDR3； (10)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 9組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 33組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 67組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 97組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 135組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 159組成之LCDR3； (11)    免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 7組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 34組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 64組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 102組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 132組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 160組成之LCDR3； (12)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 10組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 35組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 68組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 105組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 136組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 161組成之LCDR3； (13)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 25組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 69組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 106組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 162組成之LCDR3； (14)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 11組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 36組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 70組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 107組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 163組成之LCDR3； (15)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 12組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 37組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 71組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 108組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 137組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 164組成之LCDR3； (16)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 1組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 38組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 72組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 109組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 138組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 165組成之LCDR3； (17)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 13組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 39組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 73組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 98組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 155組成之LCDR3； (18)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 40組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 74組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 110組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 137組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 166組成之LCDR3； (19)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 14組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 41組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 75組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 111組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 111組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 165組成之LCDR3； (20)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 15組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 42組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 74組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 97組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 139組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 152組成之LCDR3； (21)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 14組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 43組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 76組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 112組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 137組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 155組成之LCDR3； (22)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 16組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 44組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 77組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 113組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 140組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 165組成之LCDR3； (23)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 9組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 45組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 78組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 114組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 141組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 165組成之LCDR3； (24)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 17組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 46組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 79組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 98組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 155組成之LCDR3； (25)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 9組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 25組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 80組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 115組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 142組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 165組成之LCDR3； (26)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 17組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 41組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 81組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 116組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 143組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 167組成之LCDR3； (27)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 7組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 47組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 82組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 117組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 144組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 155組成之LCDR3； (28)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 41組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 83組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 118組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 131組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 168組成之LCDR3； (29)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 18組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 48組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 84組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 119組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 145組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 165組成之LCDR3； (30)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 19組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 49組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 85組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 120組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 146組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 155組成之LCDR3； (31)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 50組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 86組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 121組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 147組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 169組成之LCDR3； (32)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 51組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 87組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 122組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 137組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 155組成之LCDR3； (33)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 20組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 44組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 88組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 123組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 148組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 170組成之LCDR3； (34)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 3組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 52組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 60組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 98組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 171組成之LCDR3； (35)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 53組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 89組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 97組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 147組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 172組成之LCDR3； (36)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 21組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 38組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 90組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 109組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 150組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 165組成之LCDR3； (37)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 22組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 41組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 91組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 124組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 151組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 173組成之LCDR3； (38)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 54組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 92組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 126組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 129組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 165組成之LCDR3； (39)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 2組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 55組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 93組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 97組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 149組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 174組成之LCDR3； (40)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 23組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 56組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 94組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 125組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 142組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 175組成之LCDR3； (41)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 14組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 43組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 76組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 127組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 137組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 176組成之LCDR3； (42)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 3組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 57組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 95組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 128組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 137組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 155組成之LCDR3；及/或 (43)   免疫球蛋白重鏈多肽及輕鏈多肽包含圖1A-D中所列之PD-L1 A型結合劑1-42之CDR的任何組合
在特定實施例中，結合劑包含免疫球蛋白重鏈多肽及免疫球蛋白輕鏈多肽，其中免疫球蛋白重鏈多肽包含第一構架區、第二構架區、第三構架區及/或第四構架區；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含第一構架區、第二構架區、第三構架區及/或第四構架區；及/或免疫球蛋白重鏈多肽及輕鏈多肽分別包含圖2A-D及圖3A-D中所列之構架區的任何組合。 PD-L1結合劑 - B型
本文提供PD-L1結合劑(B型)，該等PD-L1結合劑包含免疫球蛋白重鏈可變區多肽及免疫球蛋白輕鏈可變區多肽。在一些實施例中，PD-L1結合劑(B型)包含SEQ ID NO: 430-450中之任一者的免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR；及SEQ ID NO: 451-471中之任一者的免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR。在其他實施例中，PD-L1結合劑包含具有與SEQ ID NO: 430-450中之任一者至少90%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區多肽，及具有與SEQ ID NO: 451-471中之任一者至少90%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區多肽。在PD-L1結合劑之其他實施例中，免疫球蛋白重鏈可變區多肽包含：包含SEQ ID NO: 308-321中之任一者的互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 322-338中之任一者的互補決定區2 (HCDR2)，及包含SEQ ID NO: 339-359中之任一者的互補決定區3 (HCDR3)；及/或免疫球蛋白輕鏈可變區多肽包含：包含SEQ ID NO: 360-374中之任一者的互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 375-386中之任一者的互補決定區2 (LCDR2)，及包含SEQ ID NO: 387-398中之任一者的互補決定區3 (LCDR3)。亦提供編碼PD-L1結合劑或其個別重鏈及輕鏈之核酸；包含核酸之載體及細胞；及包含結合劑或核酸之組合物。
在一個實施例中，PD-L1結合劑(B型)包含SEQ ID NO: 430-450中之任一者的免疫球蛋白重鏈可變區，其序列與SEQ ID NO: 430-450至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致，或至少其CDR；及/或SEQ ID NO: 451-471中之任一者的免疫球蛋白輕鏈可變區，其序列與SEQ ID NO: 451-471至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致，或至少其CDR。
為作進一步說明，PD-L1結合劑(B型)可包含： (1)     SEQ ID NO: 429之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 450之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (2)     SEQ ID NO: 430之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 451之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (3)     SEQ ID NO: 431之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 452之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (4)     SEQ ID NO: 432之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 453之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (5)     SEQ ID NO: 433之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 454之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (6)     SEQ ID NO: 434之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 455之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (7)     SEQ ID NO: 435之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 456之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (8)     SEQ ID NO: 436之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 457之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (9)     SEQ ID NO: 437之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 458之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (10)   SEQ ID NO: 438之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 459之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (11)    SEQ ID NO: 439之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 460之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (12)   SEQ ID NO: 440之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 461之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (13)   SEQ ID NO: 441之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 462之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (14)   SEQ ID NO: 442之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 463之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (15)   SEQ ID NO: 443之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 464之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (16)   SEQ ID NO: 444之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 465之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (17)   SEQ ID NO: 445之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 466之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (18)   SEQ ID NO: 446之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 467之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (19)   SEQ ID NO: 447之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 468之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； (20)   SEQ ID NO: 448之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 469之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR；及/或 (21)   SEQ ID NO: 449之免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR，及/或SEQ ID NO: 470之免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR；及/或 (22)   圖8A-B之免疫球蛋白重鏈可變區及/或圖8C-D之免疫球蛋白輕鏈可變區，或至少其CDR。
給定重鏈或輕鏈Ig序列之CDR可根據各種已知Ig編號方案中之任一者(例如Kabat、Chothia、Martin (增強型Chothia)、IGMT、AbM)來確定。在某些實施例中，PD-L1結合劑包含以下CDR中之一或多者： HCDR1，其包含或由SEQ ID NO: 308-321中之任一者或與SEQ ID NO: 308-321至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成； HCDR2，其包含或由SEQ ID NO: 322-338中之任一者或與SEQ ID NO: 322-338至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成；及 HCDR3，其包含或由SEQ ID NO: 339-359中之任一者或與SEQ ID NO: 339-359至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含 LCDR1，其包含或由SEQ ID NO: 360-374中之任一者或與SEQ ID NO: 360-374至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成； LCDR2，其包含或由SEQ ID NO: 375-386中之任一者或與SEQ ID NO: 375-386至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成；及 LCDR3，其包含或由SEQ ID NO: 387-398中之任一者或與SEQ ID NO: 387-398至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之序列組成。
在特定實施例中，結合劑包含免疫球蛋白重鏈多肽及免疫球蛋白輕鏈多肽，其中： (1)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 308組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 322組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 339組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 360組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 375組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 387組成之LCDR3； (2)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 309組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 323組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 340組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 361組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 376組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 388組成之LCDR3； (3)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 310組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 324組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 341組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 360組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 375組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 387組成之LCDR3； (4)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 311組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 325組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 342組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 362組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 377組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 389組成之LCDR3； (5)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 312組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 326組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 343組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 360組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 378組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 387組成之LCDR3； (6)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 313組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 327組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 344組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 363組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 379組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 390組成之LCDR3； (7)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 314組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 327組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 345組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 364組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 380組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 391組成之LCDR3； (8)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 312組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 328組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 346組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 365組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 375組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 387組成之LCDR3； (9)     免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 314組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 329組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 347組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 366組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 375組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 389組成之LCDR3； (10)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 309組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 330組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 348組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 360組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 381組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 392組成之LCDR3； (11)    免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 309組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 327組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 349組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 367組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 382組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 389組成之LCDR3； (12)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 309組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 322組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 350組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 360組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 383組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 387組成之LCDR3； (13)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 315組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 323組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 351組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 368組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 375組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 393組成之LCDR3； (14)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 316組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 331組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 352組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 365組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 375組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 389組成之LCDR3； (15)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 317組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 332組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 353組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 369組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 384組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 394組成之LCDR3； (16)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 318組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 333組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 354組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 370組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 379組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 395組成之LCDR3； (17)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 310組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 334組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 355組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 371組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 375組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 387組成之LCDR3； (18)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 310組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 335組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 356組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 360組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 385組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 396組成之LCDR3； (19)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 319組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 336組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 357組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 372組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 386組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 397組成之LCDR3； (20)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 320組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 337組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 358組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 373組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 379組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 398組成之LCDR3； (21)   免疫球蛋白重鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 321組成之HCDR1、包含或由SEQ ID NO: 338組成之HCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 359組成之HCDR3；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含：包含或由SEQ ID NO: 374組成之LCDR1、包含或由SEQ ID NO: 379組成之LCDR2，及包含或由SEQ ID NO: 389組成之LCDR3；及/或 (22)   免疫球蛋白重鏈多肽及輕鏈多肽包含圖5A-B中所列之CDR的任何組合(B型)。
在特定實施例中，結合劑包含免疫球蛋白重鏈多肽及免疫球蛋白輕鏈多肽，其中免疫球蛋白重鏈多肽包含第一構架區、第二構架區、第三構架區及/或第四構架區；及/或免疫球蛋白輕鏈多肽包含第一構架區、第二構架區、第三構架區及/或第四構架區；及/或免疫球蛋白重鏈多肽及輕鏈多肽分別包含圖6A-B及/或圖7A-B中所列之構架區的任何組合(B型)。
在一個例示性實施例中，本發明之免疫接合物包含抗體構築體，該抗體構築體包含特異性識別並結合HER2之抗原結合結構域。
在某些實施例中，本發明之免疫接合物包含抗HER2抗體。在本發明之一個實施例中，本發明之免疫接合物之抗HER2抗體包含人源化抗HER2抗體，例如huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7及huMAb4D5-8，如US 5821337之表3中所述，該文獻以引用之方式特別併入本文中。彼等抗體含有人類構架區與結合至HER2之鼠類抗體(4D5)之互補決定區。人源化抗體huMAb4D5-8亦稱作曲妥珠單抗，以商品名HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.)商購可得。
曲妥珠單抗(CAS 180288-69-1，HERCEPTIN®，huMAb4D5-8，rhuMAb HER2，Genentech)為源自DNA之重組IgG1 κ單株抗體，其為鼠類抗HER2抗體(4D5)之人源化型式，該人源化型式在基於細胞之檢定中以高親和力(Kd = 5 nM)選擇性結合至HER2之細胞外結構域(US 5677171；US 5821337；US 6054297；US 6165464；US 6339142；US 6407213；US 6639055；US 6719971；US 6800738；US 7074404；Coussens等人 (1985) Science 230:1132-9；Slamon等人 (1989) Science 244:707-12；Slamon等人 (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792)。
在本發明之一個實施例中，抗體構築體或抗原結合結構域包含曲妥珠單抗之CDR區。在本發明之一個實施例中，抗HER2抗體進一步包含曲妥珠單抗之構架區。在本發明之一個實施例中，抗HER2抗體進一步包含曲妥珠單抗之一或兩個可變區。
在本發明之另一個實施例中，如US 7862817中所述，本發明之免疫接合物之抗HER2抗體包含人源化抗HER2抗體，例如人源化2C4。例示性人源化2C4抗體為帕妥珠單抗(CAS登記號380610-27-5)、PERJETA™ (Genentech, Inc.)。帕妥珠單抗為HER二聚抑制劑(HDI)且發揮功能以抑制HER2與其他HER受體(諸如EGFR/HER1、HER2、HER3及HER4)形成活性異二聚體或同二聚體之能力。參見例如Harari及Yarden, Oncogene 19:6102-14 (2000)；Yarden及Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001)；Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003)；Cho等人 Nature 421:756-60 (2003)；及Malik等人 Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)。PERJETA™經核准用於治療乳癌。
在本發明之一個實施例中，抗體構築體或抗原結合結構域包含帕妥珠單抗之CDR區。在本發明之一個實施例中，抗HER2抗體進一步包含帕妥珠單抗之構架區。在本發明之一個實施例中，抗HER2抗體進一步包含帕妥珠單抗之一或兩個可變區。
在一個例示性實施例中，本發明之免疫接合物包含抗體構築體，該抗體構築體包含特異性識別並結合Caprin-1之抗原結合結構域(Ellis JA, Luzio JP (1995)J Biol Chem . 270(35):20717-23；Wang B等人, (2005)J Immunol. 175 (7):4274-82；Solomon S等人, (2007)Mol Cell Biol . 27(6):2324-42)。Caprin-1亦稱為GPIAP1、GPIP137、GRIP137、M11S1、RNG105、p137GPI及細胞週期相關蛋白1。
細胞質活化/增殖相关蛋白-1 (caprin-1)為參與細胞週期控制相關基因之調控的RNA結合蛋白。Caprin-1選擇性結合至c-Myc及週期蛋白D2 mRNA，此加速細胞經G1 期進展至S期，增強細胞活力且促進細胞生長，指示其可在腫瘤形成中起重要作用(Wang B等人, (2005)J Immunol . 175:4274-4282)。Caprin-1單獨或與其他RNA結合蛋白(諸如RasGAP SH3結構域結合蛋白1及脆弱X智能遲緩蛋白)組合起作用。在腫瘤形成過程中，caprin-1主要藉由活化細胞增殖且上調免疫檢查點蛋白之表現來發揮功能。經由形成應激顆粒，caprin-1亦涉及於腫瘤細胞適應不良條件之過程中，此有助於放射線及化學療法耐藥性。鑑於其在各種臨床惡性病中之作用，caprin-1具有用作生物標誌物及用於開發新穎治療劑之標靶的潛力(Yang, Z-S等人, (2019)Oncology Letters 18:15-21)。
已描述用於治療及偵測之靶向caprin-1之抗體(WO 2011/096519；WO 2013/125654；WO 2013/125636；WO 2013/125640；WO 2013/125630；WO 2013/018889；WO 2013/018891；WO 2013/018883；WO 2013/018892；WO 2014/014082；WO 2014/014086；WO 2015/020212；WO 2018/079740)。
在一個例示性實施例中，本發明之免疫接合物包含抗體構築體，該抗體構築體包含特異性識別並結合CEA之抗原結合結構域。
癌胚抗原(CEA、CD66e、CEACAM5)之表現升高已牽涉於贅瘤之各種生物態樣中，尤其腫瘤細胞黏附、轉移、阻斷細胞免疫機制及具有抗凋亡功能。CEA亦用作許多癌瘤之血液標誌物。拉貝妥單抗(CEA-CIDETM , Immunomedics, CAS登記號219649-07-7) (亦稱為MN-14及hMN14)為人源化IgG1單株抗體且已研究用於治療結腸直腸癌(Blumenthal, R.等人 (2005) Cancer Immunology Immunotherapy 54(4):315-327)。接合至喜樹鹼類似物之拉貝妥單抗(拉貝妥單抗戈維替康(labetuzumab govitecan)，IMMU-130)靶向癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5)且正在患有復發性或難治性轉移性結腸直腸癌之患者中進行研究(Sharkey, R.等人, (2018), Molecular Cancer Therapeutics 17(1):196-203；Cardillo, T.等人 (2018) Molecular Cancer Therapeutics 17(1):150-160)。
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hMN-14/拉貝妥單抗SEQ ID NO. 472 (US 6676924)之可變輕鏈(VL κ)。
Figure 02_image005
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hMN-14/拉貝妥單抗SEQ ID NO. 473-479 (US 6676924)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC 1 - 23 23 473
CDR-L1 KASQDVGTSVA 24 - 34 11 474
LFR2 WYQQKPGKAPKLLIY 35 - 49 15 475
CDR-L2 WTSTRHT 50 - 56 7 476
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC 57 - 88 32 477
CDR-L3 QQYSLYRS 89 - 96 8 478
LFR4 FGQGTKVEIK 97 - 106 10 479
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hMN-14/拉貝妥單抗SEQ ID NO. 480 (US 6676924)之可變重鏈(VH)。
Figure 02_image007
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hMN-14/拉貝妥單抗SEQ ID NO. 481-487 (US 6676924)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFDFT 1 - 30 30 481
CDR-H1 TYWMS 31 - 35 5 482
HFR2 WVRQAPGKGLEWVA 36 - 49 14 483
CDR-H2 EIHPDSSTINYAPSLKD 50 - 66 17 484
HFR3 RFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCAS 67 - 98 32 485
CDR-H3 LYFGFPWFAY 99 - 108 10 486
HFR4 WGQGTPVTVSS 109 - 119 11 487
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hPR1A3 SEQ ID NO. 488 (US 8642742)之可變輕鏈(VL κ)。
Figure 02_image009
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hPR1A3 SEQ ID NO. 489-495 (US 8642742)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 1 - 23 23 489
CDR-L1 KASAAVGTYVA 24 - 34 11 490
LFR2 WYQQKPGKAPKLLIY 35 - 49 15 491
CDR-L2 SASYRKR 50 - 56 7 492
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 57 - 88 32 493
CDR-L3 HQYYTYPLFT 89 - 98 10 494
LFR4 FGQGTKLEIK 99 - 108 10 495
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hPR1A3 SEQ ID NO. 496-502 (US 8642742)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 1 - 30 30 496
CDR-H1 EFGMN 31 - 35 5 497
HFR2 WVRQAPGQGLEWMG 36 - 49 14 498
CDR-H2 WINTKTGEATYVEEFKG 50 - 66 17 499
HFR3 RVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR 67 - 98 32 500
CDR-H3 WDFAYYVEAMDY 99 - 110 12 501
HFR4 WGQGTTVTVSS 111 - 121 11 502
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hMFE-23 SEQ ID NO. 503 (US 723288)之可變輕鏈(VL κ)。
Figure 02_image011
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hMFE-23 SEQ ID NO. 504-510 (US 723288)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 ENVLTQSPSSMSASVGDRVNIAC 1 - 23 23 504
CDR-L1 SASSSVSYMH 24 - 33 10 505
LFR2 WFQQKPGKSPKLWIY 34 - 48 15 506
CDR-L2 STSNLAS 49 - 55 7 507
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDYSLTISSMQPEDAATYYC 56 - 87 32 508
CDR-L3 QQRSSYPLT 88 - 96 9 509
LFR4 FGGGTKLEIK 97 - 106 10 510
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hMFE-23 SEQ ID NO. 511 (US 723288)之可變重鏈(VH)。
Figure 02_image013
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hMFE-23 SEQ ID NO. 512-518 (US 723288)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIK 1 - 30 30 512
CDR-H1 DSYMH 31 - 35 5 513
HFR2 WLRQGPGQRLEWIG 36 - 49 14 514
CDR-H2 WIDPENGDTEYAPKFQG 50 - 66 17 515
HFR3 KATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNE 67 - 98 32 516
CDR-H3 GTPTGPYYFDY 99 - 109 11 517
HFR4 WGQGTLVTVSS 110 - 120 11 518
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含SM3E SEQ ID NO. 519 (US 723288)之可變輕鏈(VL κ)。
Figure 02_image015
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含SM3E SEQ ID NO. 520-526 (US 723288)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 ENVLTQSPSSMSVSVGDRVTIAC 1 - 23 23 520
CDR-L1 SASSSVPYMH 24 - 33 10 521
LFR2 WLQQKPGKSPKLLIY 34 - 48 15 522
CDR-L2 LTSNLAS 49 - 55 7 523
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYC 56 - 87 32 524
CDR-L3 QQRSSYPLT 88 - 96 9 525
LFR4 FGGGTKLEIK 97 - 106 10 526
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含SM3E SEQ ID NO. 527 (US 723288)之可變重鏈(VH)。
Figure 02_image017
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含SM3E SEQ ID NO. 528-534 (US 723288)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIK 1 - 30 30 528
CDR-H1 DSYMH 31 - 35 5 529
HFR2 WLRQGPGQRLEWIG 36 - 49 14 530
CDR-H2 WIDPENGDTEYAPKFQG 50 - 66 17 531
HFR3 KATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNE 67 - 98 32 532
CDR-H3 GTPTGPYYFDY 99 - 109 11 533
HFR4 WGQGTLVTVSS 110 - 120 11 534
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含NP-4/阿西莫單抗(arcitumomab) SEQ ID NO. 535-541之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTC 1 - 23 23 535
CDR-L1 RASSSVTYIH 24 - 33 10 536
LFR2 WYQQKPGSSPKSWIY 34 - 48 15 537
CDR-L2 ATSNLAS 49 - 55 7 538
LFR3 GVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC 56 - 87 32 539
CDR-L3 QHWSSKPPT 88 - 96 9 540
LFR4 FGGGTKLEIK 97 - 106 10 541
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含NP-4/阿西莫單抗SEQ ID NO. 542之可變重鏈(VH)。
Figure 02_image019
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含NP-4 SEQ ID NO. 543-549之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFT 1 - 30 30 543
CDR-H1 DYYMN 31 - 35 5 544
HFR2 WVRQPPGKALEWLG 36 - 49 14 545
CDR-H2 FIGNKANGYTTEYSASVKG 50 - 68 19 546
HFR3 RFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTR 69 - 100 32 547
CDR-H3 DRGLRFYFDY 101 - 110 10 548
HFR4 WGQGTTLTVSS 111 - 121 11 549
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含M5A/hT84.66 SEQ ID NO. 550 (US 7776330)之可變輕鏈(VL κ)。
Figure 02_image021
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含M5A/hT84.66 SEQ ID NO. 551-557 (US 7776330)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC 1 - 23 23 551
CDR-L1 RAGESVDIFGVGFLH 24 - 38 15 552
LFR2 WYQQKPGKAPKLLIY 39 - 53 15 553
CDR-L2 RASNLES 54 - 60 7 554
LFR3 GVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYC 61 - 92 32 555
CDR-L3 QQTNEDPYT 93 - 101 9 556
LFR4 FGQGTKVEIK 102 - 111 10 557
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含M5A/hT84.66 SEQ ID NO. 558 (US 7776330)之可變重鏈(VH)。
Figure 02_image023
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含M5A/hT84.66 SEQ ID NO. 559-565 (US 7776330)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIK 1 - 30 30 559
CDR-H1 DTYMH 31 - 35 5 560
HFR2 WVRQAPGKGLEWVA 36 - 49 14 561
CDR-H2 RIDPANGNSKYADSVKG 50 - 66 17 562
HFR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAP 67 - 98 32 563
CDR-H3 FGYYVSDYAMAY 99 - 110 12 564
HFR4 WGQGTLVTVSS 111 - 121 11 565
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hAb2-3 SEQ ID NO. 566 (US 9617345)之可變輕鏈(VL κ)。
Figure 02_image025
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hAb2-3 SEQ ID NO. 567-573 (US 9617345)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 DIQMTQSPASLSASVGDRVTITC 1 - 23 23 567
CDR-L1 RASENIFSYLA 24 - 34 11 568
LFR2 WYQQKPGKSPKLLVY 35 - 49 15 569
CDR-L2 NTRTLAE 50 - 56 7 570
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYC 57 - 88 32 571
CDR-L3 QHHYGTPFT 89 - 97 9 572
LFR4 FGSGTKLEIK 98 - 107 10 573
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含SEQ ID NO. 574 (US 9617345)之可變重鏈(VH)。
Figure 02_image027
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含hAb2-3 SEQ ID NO. 575-581之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFS 1 - 30 30 575
CDR-H1 SYDMS 31 - 35 5 576
HFR2 WVRQTPERGLEWVA 36 - 49 14 577
CDR-H2 YISSGGGITYAPSTVKG 50 - 66 17 578
HFR3 RFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAA 67 - 98 32 579
CDR-H3 HYFGSSGPFAY 99 - 109 11 580
HFR4 WGQGTLVTVSS 110 - 120 11 581
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含A240VL-B9VH/AMG-211 SEQ ID NO. 582 (US 9982063)之可變輕鏈(VL κ)。
Figure 02_image029
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含A240VL-B9VH/AMG-211 SEQ ID NO. 583-589 (US 9982063)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 QAVLTQPASLSASPGASASLTC 1 - 22 22 583
CDR-L1 TLRRGINVGAYSIY 23 - 36 14 584
LFR2 WYQQKPGSPPQYLLR 37 - 51 15 585
CDR-L2 YKSDSDKQQGS 52 - 62 11 586
LFR3 GVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYC 63 - 96 34 587
CDR-L3 MIWHSGASAV 97 - 106 10 588
LFR4 FGGGTKLTVL 107 - 116 10 589
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含B9VH SEQ ID NO. 590 (US 9982063)之可變重鏈(VH)。
Figure 02_image031
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含SEQ ID NO. 591-598 (US 9982063)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。該實施例包括CDR-H2之兩個變異體SEQ ID NO.:594及SEQ ID NO.:595。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVS 1 - 30 30 591
CDR-H1 SYWMH 31 - 35 5 592
HFR2 WVRQAPGKGLEWVG 36 - 49 14 593
CDR-H2 FIRNKANGGTTEYAASVKG 50 - 68 19 594
CDR-H2 FIRNKANSGTTEYAASVKG 50 - 68 19 595
HFR3 RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 69 - 100 32 596
CDR-H3 DRGLRFYFDY 101 - 110 10 597
HFR4 WGQGTTVTVSS 111 - 121 11 598
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含E12VH SEQ ID NO. 599 (US 9982063)之可變重鏈(VH)。
Figure 02_image033
在本發明之一個實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合結構域包含SEQ ID NO. 600-606 (US 9982063)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVS 1 - 30 30 600
CDR-H1 SYWMH 31 - 35 5 601
HFR2 WVRQAPGKGLEWVG 36 - 49 14 602
CDR-H2 FILNKANGGTTEYAASVKG 50 - 68 19 603
HFR3 RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 69 - 100 32 604
CDR-H3 DRGLRFYFDY 101 - 110 10 605
HFR4 WGQGTTVTVSS 111 - 121 11 606
在一些實施例中，抗體構築體進一步包含Fc結構域。在某些實施例中，抗體構築體為抗體。在某些實施例中，抗體構築體為融合蛋白。抗原結合結構域可為單鏈可變區片段(scFv)。可使用常規重組DNA技術工藝產生單鏈可變區片段(scFv)，該片段為截短之Fab片段，包括經由合成肽連接至輕抗體鏈之V結構域的抗體重鏈之可變(V)結構域。類似地，可藉由重組DNA技術製備二硫鍵穩定之可變區片段(dsFv)。抗體構築體或抗原結合結構域可包含抗PD-L1抗體、抗HER2抗體或抗CEA抗體之抗原結合結構域之一或多個可變區(例如兩個可變區)，各可變區包含CDR1、CDR2及CDR3。
在一些實施例中，免疫接合物中之抗體含有經修飾之Fc區，其中修飾調節Fc區與一或多種Fc受體之結合。
在一些實施例中，藉由包含能夠結合TGFβ1之轉化生長因子β1 (TGFβ1)受體或其片段來修飾Fc區。舉例而言，受體可為TGFβ受體II (TGFβRII)。在一些實施例中，TGFβ受體為人類TGFβ受體。在一些實施例中，IgG具有與TGFβRII細胞外結構域(ECD)之C端融合，如併入本文中之US 9676863所述。可使用「Fc連接子」將IgG附接至TGFβRII細胞外結構域，例如G4 S4 G Fc連接子(SEQ ID NO: 608)。Fc連接子可為短可撓性肽，其允許分子之適當三維折疊，同時維持與標靶之結合特異性。在一些實施例中，TGFβ受體之N端融合至抗體構築體之Fc (在存在或不存在Fc連接子之情況下)。在一些實施例中，抗體構築體重鏈之C端融合至TGFβ受體(在存在或不存在Fc連接子之情況下)。在一些實施例中，抗體構築體重鏈之C端離胺酸殘基突變為丙胺酸。
在一些實施例中，免疫接合物中之抗體經糖基化。
在一些實施例中，免疫接合物中之抗體為半胱胺酸工程改造之抗體，其經由某些位點處之半胱胺酸取代而提供佐劑、標記或藥物部分與抗體之位點特異性接合，在該等位點處工程改造之半胱胺酸可用於接合但不擾亂免疫球蛋白折疊及裝配或改變抗原結合及效應功能(Junutula等人, 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932；Dornan等人 (2009) Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；US 2012/0121615；WO 2009/052249)。「半胱胺酸工程改造之抗體」或「半胱胺酸工程改造之抗體變異體」為其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代之抗體。半胱胺酸工程改造之抗體可按均勻化學計量(例如，在具有單一工程改造之半胱胺酸位點之抗體中，每個抗體至多2個胺基苯并氮呯部分)接合至呈胺基苯并氮呯-連接子化合物之胺基苯并氮呯佐劑部分。
在一些實施例中，用於製備表3之免疫接合物的半胱胺酸工程改造之抗體具有在輕鏈之149-離胺酸位點處引入之半胱胺酸殘基(LC K149C)。在其他實施例中，半胱胺酸工程改造之抗體具有在重鏈之118-丙胺酸位點(EU編號)處引入之半胱胺酸殘基(HC A118C)。或者，此位點藉由依序編號而編號為121或藉由Kabat編號而編號為114。在其他實施例中，半胱胺酸工程改造之抗體具有在輕鏈中根據Kabat編號之G64C或R142C處或在重鏈中根據Kabat編號之D101C、V184C或T205C處引入之半胱胺酸殘基。 胺基苯并氮呯佐劑化合物
本發明之免疫接合物包含胺基苯并氮呯佐劑部分。本文所述之佐劑部分為引發免疫反應之化合物(亦即，免疫刺激劑)。一般而言，本文所述之佐劑部分為TLR促效劑。TLR為負責脊椎動物中先天免疫反應之起始的I型跨膜蛋白。TLR識別來自細菌、病毒及真菌之多種病原體相關分子模式且充當對抗侵入性病原體之第一道防線。歸因於細胞表現及TLR起始之信號傳導路徑不同，TLR引發重疊但截然不同之生物反應。一旦嚙合(例如藉由天然刺激或合成性TLR促效劑)，TLR起始信號轉導級聯，從而經由轉接蛋白髓樣分化初級反應基因88 (MyD88)活化核因子-κB (NF-κB)及募集IL-1受體相關激酶(IRAK)。IRAK之磷酸化接著募集TNF受體相關因子6 (TRAF6)，此引起NF-κB抑制劑I-κB磷酸化。因此，NF-κB進入細胞核且起始其啟動子含有NF-κB結合位點之基因(諸如細胞激素)的轉錄。用於TLR信號傳導之額外調控模式包括含TIR-結構域之轉接子誘導干擾素-β (TRIF)依賴性TNF-受體相關因子6 (TRAF6)誘導以及經由TRIF及TRAF3活化MyD88非依賴性路徑，從而引起干擾素反應因子3 (IRF3)之磷酸化。類似地，MyD88依賴性路徑亦活化若干IRF家族成員，包括IRF5及IRF7，而TRIF依賴性路徑亦活化NF-κB路徑。
典型地，本文所述之佐劑部分為TLR7及/或TLR8促效劑。TLR7及TLR8兩者均在髓樣譜系之細胞(例如單核細胞及樹突狀細胞)中表現。在人類中，TLR7亦在漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)及B細胞中表現。TLR8主要在髓樣來源之細胞，亦即，單核細胞、粒細胞及髓樣樹突狀細胞中表現。TLR7及TLR8能夠偵測細胞內「外來」單股RNA之存在，以此作為對病毒侵入作出反應之手段。用TLR8促效劑處理TLR8表現細胞可產生高水準之IL-12、IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6及其他炎性細胞激素。類似地，用TLR7促效劑刺激TLR7表現細胞(諸如pDC)可產生高水準之IFN-α及其他炎性細胞激素。TLR7/TLR8嚙合及所得細胞激素產生可活化樹突狀細胞及其他抗原呈現細胞，從而驅動造成腫瘤破壞之各種先天及後天免疫反應機制。
本發明之例示性胺基苯并氮呯化合物(Bz)示於表1a、1b及1c中。各化合物係藉由本文所提供之實例中之方法合成及純化，藉由質譜法特徵化，且顯示具有所指示之質量。根據實例68量測針對表現人類TLR7或人類TLR8之HEK293 NFKB報導體細胞之活性。表1a、1b及1c之胺基苯并氮呯化合物證明TLR8促效劑選擇性之令人驚訝且意想不到之特性，其可預測可用與治療癌症及其他病症之治療活性。 表1a：胺基苯并氮呯化合物(Bz)
Figure 02_image035
Figure 02_image037
Figure 02_image039
Figure 02_image041
Figure 02_image043
Figure 02_image045
表1b：胺基苯并氮呯化合物(Bz)
Figure 02_image047
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Figure 02_image053
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表1c：胺基苯并氮呯化合物(Bz)
Figure 02_image059
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Figure 02_image083
胺基苯并氮呯-連接子化合物
本發明之免疫接合物係藉由使抗體與胺基苯并氮呯-連接子化合物接合來製備。胺基苯并氮呯-連接子化合物包含共價附接至連接子單元之胺基苯并氮呯部分。連接子單元包含影響免疫接合物之穩定性、滲透性、溶解性及其他藥物動力學、安全性及功效特性之官能基及次單元。連接子單元包括反應性官能基，其與抗體之反應性官能基反應，亦即，接合。舉例而言，抗體之親核基團，諸如離胺酸側鏈胺基與胺基苯并氮呯-連接子化合物之親電反應性官能基反應以形成免疫接合物。同樣，舉例而言，抗體之半胱胺酸硫醇與胺基苯并氮呯-連接子化合物之順丁烯二醯亞胺或溴乙醯胺基團反應以形成免疫接合物。
適用於胺基苯并氮呯-連接子化合物之親電反應性官能基包括但不限於N-羥基丁二醯亞胺基(NHS)酯及N-羥基磺基丁二醯亞胺基(磺基-NHS)酯(胺反應性)；碳二亞胺(胺及羧基反應性)；羥甲基膦(胺反應性)；順丁烯二醯亞胺(硫醇反應性)；鹵化乙醯胺，諸如N- 碘乙醯胺(硫醇反應性)；芳基疊氮化物(一級胺反應性)；氟化芳基疊氮化物(經由碳-氫(C-H)插入而具有反應性)；五氟苯基(PFP)酯(胺反應性)；四氟苯基(TFP)酯(胺反應性)；亞胺基酯(胺反應性)；異氰酸酯(羥基反應性)；乙烯基砜(硫醇、胺及羥基反應性)；吡啶基二硫化物(硫醇反應性)；及二苯甲酮衍生物(經由C-H鍵插入而具有反應性)。其他試劑包括但不限於Hermanson,Bioconjugate Techniques 第2版, Academic Press, 2008中所述之彼等試劑。
本發明提供針對免疫接合物之設計、製備及使用之局限性及挑戰的解決方案。一些連接子可能在血流中不穩定，從而在靶細胞中內化之前釋放不可接受量之佐劑/藥物(Khot, A.等人 (2015)Bioanalysis 7(13):1633-1648)。其他連接子可能在血流中提供穩定性，但細胞內釋放有效性可能受負面影響。提供所需細胞內釋放之連接子典型地在血流中具有較差穩定性。換言之，血流穩定性與細胞內釋放典型地呈逆相關。另外，在標準接合過程中，負載與抗體上之佐劑/藥物部分之量(亦即，藥物負荷)、在接合反應中形成之聚集體之量及可獲得之最終純化接合物之產量相互關聯。舉例而言，聚集體形成一般與接合至抗體之佐劑/藥物部分及其衍生物之當量數呈正相关。在高藥物負荷下，必須移除所形成之聚集體以用於治療應用。因此，藥物負荷介導之聚集體形成會降低免疫接合物產量且可使製程規模擴大變得困難。
例示性實施例包括式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物：
Figure 02_image085
II 其中 Z係選自H、-O(C1 -C8 烷基)及N(X2 R2 )(X3 R3 )； R1 、R2 、R3 及R4 係獨立地選自由H、C1 -C12 烷基、C2 -C6 烯基、C2 -C6 炔基、C3 -C12 碳環基、C6 -C20 芳基、C2 -C9 雜環基及C1 -C20 雜芳基組成之群，其中烷基、烯基、炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基獨立地且視情況經一或多個選自以下之基團取代： -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C3 -C12 碳環基)； -(C3 -C12 碳環基)-*； -(C3 -C12 碳環基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -(C3 -C12 碳環基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C3 -C12 碳環基)-NR5 -C(=NR5 )NR5 -*； -(C6 -C20 芳基)； -(C6 -C20 芳基)-*； -(C6 -C20 芳二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -C(=NR5a )N(R5 )-*； -(C2 -C20 雜環基)； -(C2 -C20 雜環基)-*； -(C2 -C9 雜環基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -(C2 -C9 雜環基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C2 -C9 雜環基)-NR5 -C(=NR5a )NR5 -*； -(C1 -C20 雜芳基)； -(C1 -C20 雜芳基)-*； -(C1 -C20 雜芳基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C20 雜芳基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C1 -C20 雜芳基)-NR5 -C(=NR5a )N(R5 )-*； -C(=O)-*； -C(=O)-(C2 -C20 雜環二基)-*； -C(=O)N(R5 )2 ； -C(=O)N(R5 )-*； -C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)R5 ； -C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )CO2 R5 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=NR5a )N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 C(=NR5a )R5 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C8 烷二基)-NR5 (C2 -C5 雜芳基)； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-N(R5 )-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -N(R5 )2 ； -N(R5 )-*； -N(R5 )C(=O)R5 ； -N(R5 )C(=O)-*； -N(R5 )C(=O)N(R5 )2 ； -N(R5 )C(=O)N(R5 )-*； -N(R5 )CO2 R5 ； -NR5 C(=NR5a )N(R5 )2 ； -NR5 C(=NR5a )N(R5 )-*； -NR5 C(=NR5a )R5 ； -N(R5 )-(C2 -C5 雜芳基)； -O-(C1 -C12 烷基)； -O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-*； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*；及 -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-OH； 或R2 與R3 一起形成5員或6員雜環基環； X1 、X2 、X3 及X4 係獨立地選自由一鍵、C(=O)、C(=O)N(R5 )、O、N(R5 )、S、S(O)2 及S(O)2 N(R5 )組成之群； R5 係選自由H、C6 -C20 芳基、C6 -C20 芳二基、C1 -C12 烷基及C1 -C12 烷二基組成之群，或兩個R5 基團一起形成5員或6員雜環基環； R5a 係選自由C6 -C20 芳基及C1 -C20 雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之附接位點，且其中R1 、R2 、R3 及R4 中之一者附接至L； L為選自由以下組成之群的連接子： Q-C(=O)-(PEG)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-； Q-C(=O)-(PEG)-O-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-(MCgluc)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-N(R5 )-； Q-C(=O)-(PEG)-N(R5 )-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(PEG)-N+ (R5 )2 -(PEG)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-N(R5 )CH(AA1 )C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-N(R5 )CH(AA1 )C(=O)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-SS-(C1 -C12 烷二基)-OC(=O)-； Q-C(=O)-(PEG)-SS-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-； Q-C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； Q-C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-C(=O)； Q-C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； Q-C(=O)-CH2 CH2 OCH2 CH2 -(C1 -C20 雜芳二基)-CH2 O-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-； Q-C(=O)-CH2 CH2 OCH2 CH2 -(C1 -C20 雜芳二基)-CH2 O-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-；及 Q-(CH2 )m -C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； 其中PEG具有下式：-(CH2 CH2 O)n -(CH2 )m -；m為1至5之整數，且n為2至50之整數； PEP具有下式：
Figure 02_image087
其中AA1 及AA2 係獨立地選自胺基酸側鏈，或AA1 或AA2 及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波形線指示附接點；且 R6 係選自由C6 -C20 芳二基及C1 -C20 雜芳二基組成之群，經-CH2 O-C(=O)-且視情況經以下基團取代：
Figure 02_image089
；且 MCgluc係選自下群：
Figure 02_image091
；
Figure 02_image093
；及
Figure 02_image095
其中q為1至8，且AA為胺基酸側鏈；且 Q係選自由N-羥基丁二醯亞胺基、N-羥基磺基丁二醯亞胺基、順丁烯二醯亞胺及苯氧基組成之群，經一或多個獨立地選自F、Cl、NO2 及SO3 - 之基團取代； 其中烷基、烷二基、烯基、烯二基、炔基、炔二基、芳基、芳二基 碳環基、碳環二基、雜環基、雜環二基、雜芳基及雜芳二基視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3 、-CH2 CH3 、-CH=CH2 、-C≡CH、-C≡CCH3 、-CH2 CH2 CH3 、-CH(CH3 )2 、-CH2 CH(CH3 )2 、-CH2 OH、-CH2 OCH3 、-CH2 CH2 OH、-C(CH3 )2 OH、-CH(OH)CH(CH3 )2 、-C(CH3 )2 CH2 OH、-CH2 CH2 SO2 CH3 、-CH2 OP(O)(OH)2 、-CH2 F、-CHF2 、-CF3 、-CH2 CF3 、-CH2 CHF2 、-CH(CH3 )CN、-C(CH3 )2 CN、-CH2 CN、-CH2 NH2 、-CH2 NHSO2 CH3 、-CH2 NHCH3 、-CH2 N(CH3 )2 、-CO2 H、-COCH3 、-CO2 CH3 、-CO2 C(CH3 )3 、-COCH(OH)CH3 、-CONH2 、-CONHCH3 、-CON(CH3 )2 、-C(CH3 )2 CONH2 、-NH2 、-NHCH3 、-N(CH3 )2 、-NHCOCH3 、-N(CH3 )COCH3 、-NHS(O)2 CH3 、-N(CH3 )C(CH3 )2 CONH2 、-N(CH3 )CH2 CH2 S(O)2 CH3 、-NHC(=NH)H、-NHC(=NH)CH3 、-NHC(=NH)NH2 、-NHC(=O)NH2 、-NO2 、=O、-OH、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-OCH2 CH2 OCH3 、-OCH2 CH2 OH、-OCH2 CH2 N(CH3 )2 、-O(CH2 CH2 O)n -(CH2 )m CO2 H、-O(CH2 CH2 O)n H、-OP(O)(OH)2 、-S(O)2 N(CH3 )2 、-SCH3 、-S(O)2 CH3 及-S(O)3 H。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中PEP係選自下群：
Figure 02_image097
；
Figure 02_image091
；
Figure 02_image093
；及
Figure 02_image099
其中n為1或大於1，且AA為胺基酸側鏈。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中AA1 及AA2 係獨立地選自天然存在之胺基酸之側鏈。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中AA1 及AA2 係獨立地選自H、-CH3 、-CH(CH3 )2 、-CH2 (C6 H5 )、-CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 、-CH2 CH2 CH2 NHC(NH)NH2 、-CH2 CH(CH3 )2 、-CH2 SO3 H及-CH2 CH2 CH2 NHC(O)NH2 。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中AA1 為-CH(CH3 )2 ，且AA2 為-CH2 CH2 CH2 NHC(O)NH2 。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中AA1 及AA2 係獨立地選自GlcNAc天冬胺酸、-CH2 SO3 H及-CH2 OPO3 H。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例係選自式IIa-d：
Figure 02_image101
。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例係選自式IIe及IIf：
Figure 02_image103
其中式IIf之R5a 為苯基，視情況經一或多個選自F、Cl、Br、I、-CN及-NO2 之基團取代。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中L為Q-C(=O)-(PEG)-或Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例係選自式IIg及IIh：
Figure 02_image105
。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中L為-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中R2 及R3 各自為C1 -C8 烷基。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中R2 及R3 各自為-CH2 CH2 CH3 。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中X2 及X3 各自為一鍵，且R2 或R3 為-O-(C1 -C12 烷基)。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中X2 及X3 各自為一鍵，且R2 或R3 為-OCH2 CH3 。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中R1 及R4 中之一者係選自-(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 及-(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-OH。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中C6 -C20 芳二基為苯二基且C2 -C20 雜環二基為氮雜環丁二基。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例係選自下式：
Figure 02_image107
。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中R1 及R4 中之一者為-C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -L。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中C1 -C20 雜芳二基為吡啶二基且C2 -C20 雜環二基為哌啶二基。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例包括其中Q係選自：
Figure 02_image109
本發明包括式II實施例之所有合理組合及特徵排列。
式II 之胺基苯并氮呯-連接子化合物之例示性實施例係選自表2a、2b及2c化合物。各化合物係藉由本文所提供之實例中之方法合成及純化，藉由質譜法特徵化，且顯示具有所指示之質量。表2a、2b及2c之胺基苯并氮呯-連接子化合物證明TLR8促效劑選擇性之令人驚訝且意想不到之特性，其可預測可用與治療癌症及其他病症之治療活性。 表2a：胺基苯并氮呯-連接子式II化合物(BzL)及中間體
Figure 02_image111
Figure 02_image113
Figure 02_image115
Figure 02_image117
Figure 02_image119
Figure 02_image121
Figure 02_image123
Figure 02_image125
表2b：胺基苯并氮呯-連接子式II化合物(BzL)及中間體
Figure 02_image127
Figure 02_image129
Figure 02_image131
Figure 02_image133
Figure 02_image135
表2c：胺基苯并氮呯-連接子式II化合物(BzL)及中間體
Figure 02_image137
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Figure 02_image145
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Figure 02_image161
Figure 02_image163
Figure 02_image165
免疫接合物
免疫接合物之例示性實施例包含共價附接至二價連接子之抗體，該二價連接子共價附接至一或多個胺基苯并氮呯部分，且該等免疫接合物具有式I ： Ab-[L-Bza]p I 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： Ab為抗體； p為1至8之整數； Bza為具有下式之胺基苯并氮呯部分：
Figure 02_image167
R1 、R2 、R3 及R4 係獨立地選自由H、C1 -C12 烷基、C2 -C6 烯基、C2 -C6 炔基、C3 -C12 碳環基、C6 -C20 芳基、C2 -C9 雜環基及C1 -C20 雜芳基組成之群，其中烷基、烯基、炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基獨立地且視情況經一或多個選自以下之基團取代： -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C3 -C12 碳環基)； -(C3 -C12 碳環基)-*； -(C3 -C12 碳環基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -(C3 -C12 碳環基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C3 -C12 碳環基)-NR5 -C(=NR5 )NR5 -*； -(C6 -C20 芳基)； -(C6 -C20 芳基)-*； -(C6 -C20 芳二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -C(=NR5a )N(R5 )-*； -(C2 -C20 雜環基)； -(C2 -C20 雜環基)-*； -(C2 -C9 雜環基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -(C2 -C9 雜環基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C2 -C9 雜環基)-NR5 -C(=NR5a )NR5 -*； -(C1 -C20 雜芳基)； -(C1 -C20 雜芳基)-*； -(C1 -C20 雜芳基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C20 雜芳基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C1 -C20 雜芳基)-NR5 -C(=NR5a )N(R5 )-*； -C(=O)-*； -C(=O)-(C2 -C20 雜環二基)-*； -C(=O)N(R5 )2 ； -C(=O)N(R5 )-*； -C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)R5 ； -C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )CO2 R5 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=NR5a )N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 C(=NR5a )R5 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C8 烷二基)-NR5 (C2 -C5 雜芳基)； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-N(R5 )-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -N(R5 )2 ； -N(R5 )-*； -N(R5 )C(=O)R5 ； -N(R5 )C(=O)-*； -N(R5 )C(=O)N(R5 )2 ； -N(R5 )C(=O)N(R5 )-*； -N(R5 )CO2 R5 ； -NR5 C(=NR5a )N(R5 )2 ； -NR5 C(=NR5a )N(R5 )-*； -NR5 C(=NR5a )R5 ； -N(R5 )-(C2 -C5 雜芳基)； -O-(C1 -C12 烷基)； -O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-*； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*；及 -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-OH； 或R2 與R3 一起形成5員或6員雜環基環； X1 、X2 、X3 及X4 係獨立地選自由一鍵、C(=O)、C(=O)N(R5 )、O、N(R5 )、S、S(O)2 及S(O)2 N(R5 )組成之群； R5 係選自由H、C6 -C20 芳基、C6 -C20 芳二基、C1 -C12 烷基及C1 -C12 烷二基組成之群，或兩個R5 基團一起形成5員或6員雜環基環； R5a 係選自由C6 -C20 芳基及C1 -C20 雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之附接位點，且其中R1 、R2 、R3 及R4 中之一者附接至L； L為選自由以下組成之群的連接子： -C(=O)-(PEG)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-； -C(=O)-(PEG)-O-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-(MCgluc)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； -C(=O)-(PEG)-N(R5 )-； -C(=O)-(PEG)-N(R5 )-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(PEG)-N+ (R5 )2 -(PEG)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-N(R5 )CH(AA1 )C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-N(R5 )CH(AA1 )C(=O)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； -C(=O)-(PEG)-SS-(C1 -C12 烷二基)-OC(=O)-； -C(=O)-(PEG)-SS-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-； -C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； -C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-C(=O)； -C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； -C(=O)-CH2 CH2 OCH2 CH2 -(C1 -C20 雜芳二基)-CH2 O-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-； -C(=O)-CH2 CH2 OCH2 CH2 -(C1 -C20 雜芳二基)-CH2 O-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-；及 -(丁二醯亞胺基)-(CH2 )m -C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； PEG具有下式：-(CH2 CH2 O)n -(CH2 )m -；m為1至5之整數，且n為2至50之整數； PEP具有下式：
Figure 02_image087
其中AA1 及AA2 係獨立地選自胺基酸側鏈，或AA1 或AA2 及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波形線指示附接點； R6 係選自由C6 -C20 芳二基及C1 -C20 雜芳二基組成之群，經-CH2 O-C(=O)-且視情況經以下基團取代：
Figure 02_image089
；且 MCgluc係選自下群：
Figure 02_image091
；
Figure 02_image093
；及
Figure 02_image095
其中q為1至8，且AA為胺基酸側鏈；且 烷基、烷二基、烯基、烯二基、炔基、炔二基、芳基、芳二基、碳環基、碳環二基、雜環基、雜環二基、雜芳基及雜芳二基獨立地且視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3 、-CH2 CH3 、-CH=CH2 、-C≡CH、-C≡CCH3 、-CH2 CH2 CH3 、-CH(CH3 )2 、-CH2 CH(CH3 )2 、-CH2 OH、-CH2 OCH3 、-CH2 CH2 OH、-C(CH3 )2 OH、-CH(OH)CH(CH3 )2 、-C(CH3 )2 CH2 OH、-CH2 CH2 SO2 CH3 、-CH2 OP(O)(OH)2 、-CH2 F、-CHF2 、-CF3 、-CH2 CF3 、-CH2 CHF2 、-CH(CH3 )CN、-C(CH3 )2 CN、-CH2 CN、-CH2 NH2 、-CH2 NHSO2 CH3 、-CH2 NHCH3 、-CH2 N(CH3 )2 、-CO2 H、-COCH3 、-CO2 CH3 、-CO2 C(CH3 )3 、-COCH(OH)CH3 、-CONH2 、-CONHCH3 、-CON(CH3 )2 、-C(CH3 )2 CONH2 、-NH2 、-NHCH3 、-N(CH3 )2 、-NHCOCH3 、-N(CH3 )COCH3 、-NHS(O)2 CH3 、-N(CH3 )C(CH3 )2 CONH2 、-N(CH3 )CH2 CH2 S(O)2 CH3 、-NHC(=NH)H、-NHC(=NH)CH3 、-NHC(=NH)NH2 、-NHC(=O)NH2 、-NO2 、=O、-OH、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-OCH2 CH2 OCH3 、-OCH2 CH2 OH、-OCH2 CH2 N(CH3 )2 、-O(CH2 CH2 O)n -(CH2 )m CO2 H、-O(CH2 CH2 O)n H、-OP(O)(OH)2 、-S(O)2 N(CH3 )2 、-SCH3 、-S(O)2 CH3 及-S(O)3 H。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體為具有結合PD-L1之抗原結合結構域之抗體構築體。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體係選自由阿特珠單抗、得瓦魯單抗及阿維魯單抗或其生物類似藥或生物改良藥組成之群。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體為具有結合HER2之抗原結合結構域之抗體構築體。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體係選自由曲妥珠單抗及帕妥珠單抗或其生物類似藥或生物改良藥組成之群。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體為具有結合CEA之抗原結合結構域之抗體構築體。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體為拉貝妥單抗或其生物類似藥或生物改良藥。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中PEP係選自下群：
Figure 02_image097
；
Figure 02_image091
；
Figure 02_image093
；及
Figure 02_image099
其中n為1或大於1，且AA為胺基酸側鏈。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中AA1 及AA2 係獨立地選自天然存在之胺基酸之側鏈。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中AA1 及AA2 係獨立地選自H、-CH3 、-CH(CH3 )2 、-CH2 (C6 H5 )、-CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 、-CH2 CH2 CH2 NHC(NH)NH2 、-CH2 CH(CH3 )2 、-CH2 SO3 H及-CH2 CH2 CH2 NHC(O)NH2 。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中AA1 為-CH(CH3 )2 ，且AA2 為-CH2 CH2 CH2 NHC(O)NH2 。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中AA1 及AA2 係獨立地選自GlcNAc天冬胺酸、-CH2 SO3 H及-CH2 OPO3 H。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中Bza係選自式Ia-d：
Figure 02_image169
。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中Bza係選自式Ie及If：
Figure 02_image171
其中式If之R5a 為苯基，視情況經一或多個選自F、Cl、Br、I、-CN及-NO2 之基團取代。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中L為-C(=O)-(PEG)-或-C(=O)-(PEG)-C(=O)-。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中Bza係選自式Ig及Ih：
Figure 02_image173
。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中L為-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中R2 及R3 各自為C1 -C8 烷基。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中R2 及R3 各自為-CH2 CH2 CH3 。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中X2 及X3 各自為一鍵，且R2 或R3 為-O-(C1 -C12 烷基)。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中X2 及X3 各自為一鍵，且R2 或R3 為-OCH2 CH3 。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中R1 及R4 中之一者係選自： -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=NR5 )N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-*； -(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-C(=O)-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-C(=O)-(C2 -C20 雜環二基)-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-*；及 -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中R2 及R3 中之一者係選自： -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=NR5 )-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-C(=NR5 )N(R5 )-*； -(C2 -C6 炔二基)-N(R5 )-*；及 -(C2 -C6 炔二基)-N(R5 )C(=NR5 )N(R5 )-*； X2 及X3 為一鍵，且其中星號*指示L之附接位點。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中R1 及R4 中之一者係選自-(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 及-(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-OH。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中C6 -C20 芳二基為苯二基且C2 -C20 雜環二基為氮雜環丁二基。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中R1 及R4 中之一者係選自下式：
Figure 02_image107
。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中R1 及R4 中之一者為-C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -L。
式I 之免疫接合物之例示性實施例包括其中C1 -C20 雜芳二基為吡啶二基且C2 -C20 雜環二基為哌啶二基。
在一個例示性實施例中，p為1、2、3或4。
免疫接合物之例示性實施例包含共價附接至連接子之抗體，該連接子共價附接至一或多個胺基苯并氮呯部分，且該等免疫接合物具有式III ：
Figure 02_image176
III ， 其醫藥學上可接受之鹽或其四級銨鹽， 其中 R1 、R2 、R3 及R4 獨立地為Y或Z，其中R1 、R2 、R3 及R4 中之一者為Y，具有下式：
Figure 02_image178
或
Figure 02_image180
； 各Z獨立地為氫或選自下式：
Figure 02_image182
； U視情況存在且為CH2 、C(=O)、CH2 C(=O)或C(=O)CH2 ， A視情況存在且為NR10 或選自下式：
Figure 02_image184
R10 及W獨立地為氫、Ar1 或具有下式：
Figure 02_image186
V視情況存在且具有下式：
Figure 02_image188
、
Figure 02_image190
或
Figure 02_image192
， J1 及J2 獨立地為CH或N， 除m1 、m2 及m3 中之至少一者為非零整數外，m1 、m2 及m3 獨立地為0至25之整數， n1 、n2 、n3 、n4 、n5 及n6 獨立地為0至10之整數， t1 及t2 獨立地為1至3之整數， G1 、G2 、G3 及G4 獨立地為CH2 、C(=O)、CH2 C(=O)、C(=O)CH2 或一鍵， X1 、X2 、X3 及X4 各自視情況存在且獨立地為O、NR7 、CHR7 、SO2 、S或一個或兩個環烷二基、雜環烷二基、芳二基或雜芳二基，且當多於一個環烷二基、雜環烷二基、芳二基或雜芳二基存在時，多於一個環烷二基、雜環烷二基、芳二基或雜芳二基經連接或稠合，其中連接之環烷二基、雜環烷二基、芳二基或雜芳二基經一鍵或-CO-連接， R9 為氫、C1 -C4 烷基或選自下式：
Figure 02_image194
， R8 獨立地為氫或C1 -C4 烷基， Ar1 及Ar2 獨立地為芳基或雜芳基，視情況經一或多個鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、腈、羥基、C1 -C4 烷基或其組合取代， LM 為連接部分，其包含選自醯胺、胺、酯、胺基甲酸酯、脲、硫醚、硫代胺基甲酸酯、硫代碳酸酯及硫脲之官能基， r為1至10之整數， Ab為抗體，且 各波形線(
Figure 02_image001
)代表附接點。
式III 之免疫接合物之例示性實施例包括其中下標r為1。
式I 或III 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體為具有結合PD-L1之抗原結合結構域之抗體構築體。
式I 或III 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體係選自由阿特珠單抗、得瓦魯單抗及阿維魯單抗或其生物類似藥或生物改良藥組成之群。
式I 或III 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體為具有結合HER2之抗原結合結構域之抗體構築體。
式I 或III 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體係選自由曲妥珠單抗及帕妥珠單抗或其生物類似藥或生物改良藥組成之群。
式I 或III 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體為具有結合CEA之抗原結合結構域之抗體構築體。
式I 或III 之免疫接合物之例示性實施例包括其中抗體係選自由拉貝妥單抗(亦稱為MN-14、hMN14或CEA-CIDETM )、PR1A3、MFE-23、SM3E或其生物類似藥或生物改良藥組成之群。
本發明包括式I及III實施例之所有合理組合及特徵排列。
在某些實施例中，本發明之免疫接合物化合物包括具有免疫刺激活性之彼等。本發明之抗體-藥物接合物選擇性地將有效劑量之胺基苯并氮呯藥物遞送至腫瘤組織，藉此可達成相對於未接合之胺基苯并氮呯更大之選擇性(亦即，較低有效劑量)，同時增加治療指數(「治療窗」)。
藥物負荷由p表示，亦即，式I或III之免疫接合物中每個抗體之胺基苯并氮呯部分的數目。藥物(胺基苯并氮呯)負荷可在每個抗體1個至約8個藥物部分(D)之範圍內。式I及III之免疫接合物包括與1個至約8個範圍內之藥物部分接合之抗體混合物或集合。在一些實施例中，可接合至抗體之藥物部分的數目受反應性或可用胺基酸側鏈殘基，諸如離胺酸及半胱胺酸之數目限制。在一些實施例中，藉由本文所述之方法將游離半胱胺酸殘基引入抗體胺基酸序列中。在此類態樣中，p可為1、2、3、4、5、6、7或8及其範圍，諸如1至8或2至5。在任何此類態樣中，p及n相等(亦即，p = n = 1、2、3、4、5、6、7或8或介於之間的某個範圍)。式I之例示性抗體-藥物接合物包括但不限於具有1、2、3或4個工程改造之半胱胺酸胺基酸之抗體(Lyon, R.等人 (2012)Methods in Enzym . 502:123-138)。在一些實施例中，在不使用工程改造之情況下形成鏈內二硫鍵之抗體中已存在一或多個游離半胱胺酸殘基，在此種情況下可使用現有游離半胱胺酸殘基將抗體接合至藥物。在一些實施例中，在抗體接合之前使抗體暴露於還原條件，以產生一或多個游離半胱胺酸殘基。
對於一些免疫接合物，p可能受抗體上之附接位點的數目限制。舉例而言，在附接半胱胺酸硫醇之情況下，如在本文所述之某些例示性實施例中，抗體可僅具有一個或有限數目之半胱胺酸硫醇基團，或可僅具有一個或有限數目之充分反應性硫醇基團，藥物可附接至該等基團。在其他實施例中，抗體中之一或多個離胺酸胺基對於與式II之胺基苯并氮呯-連接子化合物接合而言可為可用的且具反應性。在某些實施例中，較高藥物負荷，例如p ＞5，可導致某些抗體-藥物接合物之聚集、不溶性、毒性或細胞滲透性損失。在某些實施例中，免疫接合物之平均藥物負荷在1至約8、約2至約6或約3至約5之範圍內。在某些實施例中，使抗體經受變性條件以顯露反應性親核基團，諸如離胺酸或半胱胺酸。
免疫接合物之負荷(藥物/抗體比率)可按不同方式控制，且例如藉由：(i)限制胺基苯并氮呯-連接子中間化合物相對於抗體之莫耳過量；(ii)限制接合反應時間或溫度；及(iii)用於最佳化抗體反應性之部分或限制性還原變性條件。
應了解，在抗體之多於一個親核基團與藥物反應之情況下，則所得產物為抗體-藥物接合物化合物之混合物，其具有一或多個藥物部分附接至抗體之分佈。可藉由對抗體具有特異性且對藥物具有特異性之雙重ELISA抗體檢定自混合物計算每個抗體之平均藥物數。可藉由質譜法在混合物中鑒別個別免疫接合物分子，且藉由HPLC，例如疏水相互作用層析進行分離(參見例如McDonagh等人 (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307；Hamblett等人 (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070；Hamblett, K.J.等人  「Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」, 摘要號624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日, Proceedings of the AACR, 第45卷, 2004年3月；Alley, S.C.等人 「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates」, 摘要號627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日, Proceedings of the AACR, 第45卷, 2004年3月)。在某些實施例中，可藉由電泳或層析自接合混合物中分離具有單一負荷值之均質免疫接合物。
式I 之免疫接合物之例示性實施例係選自表3a、3b、3c免疫接合物。 表3a：免疫接合物(IC)
免疫接合物編號 BzL 連接子-佐劑 表2a Ab 抗原 DAR 髓樣TNFα分泌 EC50 nM
IC-1 BzL-2 曲妥珠單抗 HER2 2.33 ＞1000
IC-2 BzL-3 曲妥珠單抗 HER2 2.06 14.8
IC-3 BzL-4 曲妥珠單抗 HER2 2.05 ＞1000
IC-4 BzL-5 曲妥珠單抗 HER2 1.82 ＞1000
IC-5 BzL-7 曲妥珠單抗 HER2 1.6 nd
IC-6 BzL-8 曲妥珠單抗 HER2 0.5 nd
IC-7 BzL-9 曲妥珠單抗 HER2 1.6 nd
IC-8 BzL-15 曲妥珠單抗 HER2 1.9 233.7
IC-9 BzL-15 阿維魯單抗 PD-L1 2.16 161.03
IC-10 BzL-16 曲妥珠單抗 HER2 2.49 ＞1000
IC-11 BzL-17 曲妥珠單抗 HER2 1.84 ＞1000
IC-12 BzL-18 曲妥珠單抗 HER2 2.49 ＞1000
IC-13 BzL-19 曲妥珠單抗 HER2 2.05 ＞1000
IC-14 BzL-20 曲妥珠單抗 HER2 1.91 ＞1000
IC-15 BzL-21 阿維魯單抗 PD-L1 2.85 199.5
IC-16 BzL-21 曲妥珠單抗 HER2 1.74 ＞1000
IC-17 BzL-22 曲妥珠單抗 HER2 2.65 ＞1000
IC-18 BzL-25 曲妥珠單抗 HER2 nd nd
IC-19 BzL-27 曲妥珠單抗 HER2 1.61 ＞1000
IC-20 BzL-31 曲妥珠單抗 HER2 2.57 788
IC-21 BzL-28 曲妥珠單抗 HER2 2.39 ＞1000
表3b：免疫接合物(IC)
免疫接合物編號 BzL 連接子-佐劑 表2b Ab 抗原 DAR 髓樣TNFα分泌 EC50 nM
IC-22 BzL-33 曲妥珠單抗 HER2 2.37 ＞1000
IC-23 BzL-35 曲妥珠單抗 HER2 2.65 464
IC-24 BzL-36 曲妥珠單抗 HER2 2.60 ＞1000
IC-25 Bzl-37 曲妥珠單抗 HER2 2.28 ＞1000
IC-26 Bzl-38 曲妥珠單抗 HER2 2.0 62
IC-27 BzL-34 曲妥珠單抗 HER2 2.06 97
IC-28 BzL-39 曲妥珠單抗 HER2 2.32 ＞1000
IC-29 BzL-40 曲妥珠單抗 HER2 2.95 ＞1000
IC-30 BzL-41 曲妥珠單抗 HER2 2.83 459
IC-31 BzL-42 曲妥珠單抗 HER2 2.05 17.2
IC-32 BzL-43 曲妥珠單抗 HER2 2.05 133
IC-33 BzL-44 曲妥珠單抗 HER2 2.0 71
IC-34 BzL-45 曲妥珠單抗 HER2 2.26 78
IC-35 BzL-46 曲妥珠單抗 HER2 1.54 68
表3c：免疫接合物(IC)
免疫接合物編號 BzL 連接子-佐劑 表2a-c Ab 抗原 DAR
IC-36 BzL-40 PDL1.24-G1f 2.39
IC-37 BzL-39 PDL1.24-G1f 1.6
IC-38 Bzl-49 曲妥珠單抗 HER2 2.24
IC-39 BzL-35 利妥昔單抗(Rituximab) CD20 2.40
IC-40 BzL-50 曲妥珠單抗 HER2 2.48
IC-41 BzL-51 曲妥珠單抗 HER2 2.57
IC-42 BzL-52 曲妥珠單抗 HER2 2.62
IC-43 BzL-53 曲妥珠單抗 HER2 2.18
IC-44 BzL-55 曲妥珠單抗 HER2 2.18
IC-45 BzL-56 曲妥珠單抗 HER2 1.96
IC-46 BzL-35 抗mPD-L1 2.27
IC-47 BzL-35 大鼠IgG2b 同型對照 2.4
IC-48 Bzl-49 PDL1.85-G1f 2.21
IC-49 Bzl-49 PDL1.85-G1f 2.21
IC-50 BzL-54 曲妥珠單抗 HER2 2.13 2.36
IC-51 Bzl-49 CEA.5G1fhL2 2.35
IC-52 BzL-57 曲妥珠單抗 HER2 2.58
IC-53 BzL-60 曲妥珠單抗 HER2 2.11
IC-54 BzL-62 曲妥珠單抗 HER2 2.46
IC-55 BzL-58 曲妥珠單抗 HER2 2.35
IC-56 BzL-65 曲妥珠單抗 HER2 1.80
IC-57 BzL-35 CEA.5G1fhL2 2.21
IC-58 BzL-35 Tras-G1f-N297A 2.34
IC-59 BzL-66 曲妥珠單抗 HER2 2.38
IC-60 BzL-67 曲妥珠單抗 HER2 2.15 1.93
IC-61 BzL-68 曲妥珠單抗 HER2 2.36
IC-62 BzL-69 曲妥珠單抗 HER2 2.15 2.99
IC-63 BzL-69 利妥昔單抗 CD20 2.60
IC-64 BzL-69 Tras-G1f-N297A 2.41
IC-65 BzL-70 曲妥珠單抗 HER2 2.39
IC-66 BzL-72 曲妥珠單抗 HER2 2.39
IC-67 BzL-41 CEA.9-G1fhL2 2.26
IC-68 BzL-35 CEA.9-G1fhL2 2.37
IC-69 BzL-69 CEA.9-G1fhL2 2.41
IC-70 BzL-63 曲妥珠單抗 HER2 2.24
IC-71 BzL-64 曲妥珠單抗 HER2 2.34
IC-72 BzL-35 PDL1.24-G1f 2.66
IC-73 BzL-35 PDL1.85-G1f 2.84
IC-74 BzL-73 曲妥珠單抗 HER2 2.17
IC-75 BzL-74 曲妥珠單抗 HER2 2.74
IC-76 BzL-77 曲妥珠單抗 HER2 2.43
IC-77 BzL-76 曲妥珠單抗 HER2 1.19
IC-78 BzL-78 曲妥珠單抗 HER2 2.10
IC-79 BzL-75 曲妥珠單抗 HER2 1.45
IC-80 BzL-69 CEACAM5 1.84 2.74
IC-81 BzL-77 CEA.9-G1fhL2 2.39 2.45
IC-82 BzL-72 CEA.9-G1fhL2 2.70
IC-83 BzL-74 CEA.9-G1fhL2 2.41
IC-84 BzL-80 CEA.9-G1fhL2 1.81
IC-85 BzL-69 PDL1.85-G1f 2.69
IC-86 BzL-80 曲妥珠單抗 HER2 2.92
IC-87 BzL-82 曲妥珠單抗 HER2 2.56
IC-88 BzL-77 PDL1.85-G1f 2.55
IC-89 BzL-74 PDL1.85-G1f 2.68
IC-90 BzL-81 曲妥珠單抗 HER2 1.91
IC-91 BzL-85 曲妥珠單抗 HER2 2.18
IC-92 BzL-69 曲妥珠單抗 HER2 3.07
免疫接合物之組合物
本發明提供一種組合物，例如醫藥學上或藥理學上可接受之組合物或調配物，其包含複數種如本文所述之免疫接合物及其視情況存在之載劑，例如醫藥學上或藥理學上可接受之載劑。免疫接合物在組成上可相同或不同，亦即，組合物可包含具有連接至抗體構築體上之相同位置之相同數目之佐劑的免疫接合物及/或具有連接至抗體構築體上之不同位置之相同數目之佐劑，具有連接至抗體構築體上之相同位置之不同數目之佐劑，或具有連接至抗體構築體上之不同位置之不同數目之佐劑的免疫接合物。
在一個例示性實施例中，包含免疫接合物化合物之組合物包含免疫接合物化合物之混合物，其中免疫接合物化合物之混合物中每個抗體之平均藥物負荷為約2至約5。
本發明之免疫接合物之組合物可具有約0.4至約10之平均佐劑與抗體構築體比率。熟習此項技術者將認識到，在包含本發明之多種免疫接合物之組合物中，接合至抗體構築體之胺基苯并氮呯佐劑之數目可隨免疫接合物的不同而變化，且因此，可以平均值量測佐劑與抗體構築體(例如抗體)比率，此可稱作藥物與抗體比率(DAR)。佐劑與抗體構築體(例如抗體)比率可藉由任何適合之方法來評估，其中許多方法在此項技術中為已知的。
在自接合反應製備免疫接合物中每個抗體之佐劑部分之平均數目(DAR)可藉由習用手段，諸如質譜法、ELISA檢定及HPLC來特徵化。亦可確定免疫接合物在組合物中之定量分佈，以p表示。在一些情況下，可藉由諸如逆相HPLC或電泳之手段，自具有其他藥物負荷之免疫接合物中分離、純化及特徵化其中p為一定值之均質免疫接合物。 醫藥組合物及投藥方法
在其他實施例中，本發明之另一個態樣係關於醫藥組合物或劑型，其包括治療有效量之本發明之免疫接合物及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、媒劑、載劑或賦形劑。
醫藥組合物可為允許向患者投與之任何形式。舉例而言，醫藥組合物可呈固體或液體形式。典型投藥途徑包括但不限於非經腸、經眼及腫瘤內。非經腸投藥包括皮下注射、靜脈內、肌肉內或胸骨內注射或輸注技術。在一個實施例中，非經腸投與組合物。在特定實施例中，靜脈內投與組合物。
在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種醫藥學上或藥理學上可接受之賦形劑。舉例而言，本發明之免疫接合物可經調配用於非經腸投與，諸如靜脈內投與或向器官之體腔或內腔中投與。或者，可腫瘤內注射免疫接合物。注射用組合物通常將包含免疫接合物溶解於醫藥學上可接受之載劑中之溶液。可採用之可接受媒劑及溶劑為水及一或多種鹽之等張溶液，諸如氯化鈉，例如林格氏溶液(Ringer's solution)。另外，無菌非揮發性油可慣常用作溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和非揮發性油，包括合成單酸甘油酯或二酸甘油酯。另外，諸如油酸之脂肪酸同樣可用於可注射劑之製備中。此等組合物理想地為無菌的且一般不含非所需之物質。此等組合物可藉由習用之熟知滅菌技術進行滅菌。組合物可含有接近生理條件所需之醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節劑及緩沖劑、毒性調節劑，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉及類似物。
組合物可含有任何適合濃度之免疫接合物。組合物中免疫接合物之濃度可廣泛變化，且將根據所選特定投藥模式及患者需要，主要基於流體體積、黏度、體重及類似因素來選擇。在某些實施例中，注射用溶液調配物中免疫接合物之濃度將在約0.1% (w/w)至約10% (w/w)之範圍內。 用免疫接合物治療癌症之方法
本發明提供一種用於治療癌症之方法。該方法包括向有需要之個體，例如患有癌症且需要治療癌症之個體投與治療有效量之如本文所述之免疫接合物(例如，如本文所述之醫藥組合物)。該方法包括投與治療有效量之選自表3之免疫接合物(IC)。
預期本發明之免疫接合物可用於治療各種過度增生性疾病或病症，例如以腫瘤抗原之過表現為特徵。例示性過度增生性病症包括良性或惡性實體腫瘤及血液學病症，諸如白血病及淋巴樣惡性病。
在另一個態樣中，提供一種用作藥劑之免疫接合物。在某些實施例中，本發明提供一種用於治療個體之方法中的免疫接合物，該方法包括向個體投與有效量之免疫接合物。在一個此類實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如，如本文所述。
在另一個態樣中，本發明提供免疫接合物在藥劑製造或製備中之用途。在一個實施例中，藥劑用於治療癌症，該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之藥劑。在一個此類實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如，如本文所述。
癌瘤為起源於上皮組織之惡性病。上皮細胞覆蓋身體之外表面，內襯於內腔，且形成腺組織之襯裡。癌瘤之實例包括但不限於腺癌(始於腺(分泌)細胞之癌症，諸如乳癌、胰臟癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、胃食管連接部癌症及結腸癌)；腎上腺皮質癌；肝細胞癌；腎細胞癌；卵巢癌；原位癌；導管癌；乳癌；基底細胞癌；鱗狀細胞癌；移行細胞癌；結腸癌；鼻咽癌；多房囊性腎細胞癌；燕麥細胞癌；大細胞肺癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；及類似癌瘤。在前列腺、胰臟、結腸、腦(通常為繼發性轉移)、肺、乳房及皮膚中可發現癌瘤。在一些實施例中，用於治療非小細胞肺癌之方法包括投與含有能夠結合PD-L1之抗體構築體(例如阿特珠單抗、得瓦魯單抗、阿維魯單抗、其生物類似藥或其生物改良藥)的免疫接合物。在一些實施例中，用於治療乳癌之方法包括投與含有能夠結合PD-L1之抗體構築體(例如阿特珠單抗、得瓦魯單抗、阿維魯單抗、其生物類似藥或其生物改良藥)的免疫接合物。在一些實施例中，用於治療三陰性乳癌之方法包括投與含有能夠結合PD-L1之抗體構築體(例如阿特珠單抗、得瓦魯單抗、阿維魯單抗、其生物類似藥或其生物改良藥)的免疫接合物。
軟組織腫瘤為來源於結締組織之罕見腫瘤之高度多樣化群組。軟組織腫瘤之實例包括但不限於肺泡狀軟組織肉瘤；血管瘤樣纖維組織細胞瘤；軟骨黏液樣纖維瘤；骨骼軟骨肉瘤；骨骼外黏液樣軟骨肉瘤；透明細胞肉瘤；促結締組織增生性小圓細胞瘤；隆突性皮膚纖維肉瘤；子宮內膜間質瘤；尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)；纖維瘤病(硬纖維)；嬰兒纖維肉瘤；胃腸道間質瘤；骨巨細胞瘤；腱鞘巨細胞瘤；炎性肌纖維母細胞瘤；子宮平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；脂肪母細胞瘤；典型脂肪瘤；梭形細胞或多形性脂肪瘤；非典型脂肪瘤；軟骨樣脂肪瘤；高分化脂肪肉瘤；黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤；多形性脂肪肉瘤；黏液樣惡性纖維組織細胞瘤；高度惡性纖維組織細胞瘤；黏液性纖維肉瘤；惡性周邊神經鞘瘤；間皮瘤；神經母細胞瘤；骨軟骨瘤；骨肉瘤；原始神經外胚層腫瘤；肺泡狀橫紋肌肉瘤；胚胎橫紋肌肉瘤；良性或惡性神經鞘瘤；滑膜肉瘤；埃文氏腫瘤(Evan's tumor)；結節性筋膜炎；硬纖維型纖維瘤病；孤立性纖維瘤；隆突性皮膚纖維肉瘤(DFSP)；血管肉瘤；上皮樣血管內皮瘤；腱鞘巨細胞瘤(TGCT)；色素絨毛結節性滑膜炎(PVNS)；纖維性發育不良；黏液性纖維肉瘤；纖維肉瘤；滑膜肉瘤；惡性周邊神經鞘瘤；神經纖維瘤；軟組織多形性腺瘤；及來源於纖維母細胞、肌纖維母細胞、組織細胞、血管細胞/內皮細胞及神經鞘細胞之贅瘤。
肉瘤為罕見類型之癌症，其出現於間葉來源之細胞中，例如身體之骨骼中或軟組織中，該等軟組織包括軟骨、脂肪、肌肉、血管、纖維組織或其他結締組織或支持組織。不同類型之肉瘤係基於癌症形成之部位。舉例而言，骨肉瘤在骨骼中形成，脂肪肉瘤在脂肪中形成，且橫紋肌肉瘤在肌肉中形成。肉瘤之實例包括但不限於阿斯金氏腫瘤(askin's tumor)；葡萄狀肉瘤；軟骨肉瘤；尤因氏肉瘤；惡性血管內皮瘤；惡性神經鞘瘤；骨肉瘤；及軟組織肉瘤(例如肺泡狀軟組織肉瘤；血管肉瘤；叶狀囊性肉瘤；隆突性皮膚纖維肉瘤(DFSP)；硬纖維瘤；促結締組織增生性小圓細胞瘤；上皮樣肉瘤；骨骼外軟骨肉瘤；骨骼外骨肉瘤；纖維肉瘤；胃腸道間質瘤(GIST)；血管外皮細胞瘤；血管肉瘤(hemangiosarcoma) (更通常稱作「血管肉瘤(angiosarcoma)」)；卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)；平滑肌肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；惡性周邊神經鞘瘤(MPNST)；神經纖維肉瘤；滑膜肉瘤；及未分化多形性肉瘤)。
畸胎瘤為一種類型之生殖細胞腫瘤，其可含有若干不同類型之組織(例如可包括來源於以下三個胚層中之任一者及/或全部之組織：內胚層、中胚層及外胚層)，包括例如毛髮、肌肉及骨骼。畸胎瘤最常出現於女性之卵巢、男性之睪丸及兒童之尾骨中。
黑色素瘤為始於黑色素細胞(製造黑色素之細胞)之癌症形式。黑色素瘤可始於黑痣(皮膚黑色素瘤)，但亦可始於其他有色素組織，諸如眼中或腸中。
默克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)為一種罕見類型之皮膚癌，其通常以肉色或藍紅色結節出現於面部、頭部或頸部。默克爾細胞癌亦稱為皮膚神經內分泌癌。在一些實施例中，用於治療默克爾細胞癌之方法包括投與含有能夠結合PD-L1之抗體構築體(例如阿特珠單抗、得瓦魯單抗、阿維魯單抗、其生物類似藥或其生物改良藥)的免疫接合物。在一些實施例中，當進行投藥時默克爾細胞癌已轉移。
白血病為始於血液形成組織(諸如骨髓)之癌症，且導致大量異常血細胞產生且進入血流。舉例而言，白血病可起源於通常在血流中成熟之骨髓源性細胞。白血病以疾病發展及進展之速度(例如急性對比慢性)及受影響之白血球類型(例如髓樣對比淋巴樣)而命名。髓樣白血病亦稱為骨髓性或骨髓母細胞性白血病。淋巴樣白血病亦稱為淋巴母細胞性或淋巴細胞性白血病。淋巴樣白血病細胞可聚集於淋巴結中，從而淋巴結可變得腫脹。白血病之實例包括但不限於急性髓樣白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性髓樣白血病(CML)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
淋巴瘤為始於免疫系統細胞之癌症。舉例而言，淋巴瘤可起源於通常在淋巴系統中成熟之骨髓源性細胞。淋巴瘤存在兩種基本類別。一種類別之淋巴瘤為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)，其以稱為裏-斯二氏細胞(Reed-Sternberg cell)之細胞類型的存在為標誌。當前存在6種公認之HL類型。霍奇金淋巴瘤之實例包括結節性硬化經典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、混合細胞型CHL、淋巴細胞耗竭型CHL、富淋巴細胞型CHL及結節性淋巴細胞為主型HL。
另一種類別之淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)，其包括免疫系統細胞癌之大型多樣化群組。非霍奇金淋巴瘤可進一步分為具有無痛性(緩慢生長)病程之癌症及具有侵襲性(快速生長)病程之癌症。當前存在61種公認之NHL類型。非霍奇金淋巴瘤之實例包括但不限於AIDS相關淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴瘤、母細胞性NK細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、伯基特樣淋巴瘤(Burkitt-like lymphoma) (小無裂細胞淋巴瘤)、慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、皮膚性T細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、腸病型T細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、肝脾γ-δ T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、淋巴母細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、鼻部T細胞淋巴瘤、小兒淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、轉化性淋巴瘤、治療相關T細胞淋巴瘤及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)。
腦癌包括腦組織之任何癌症。腦癌之實例包括但不限於神經膠質瘤(例如神經膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、室管膜瘤及類似癌症)、腦膜瘤、垂體腺瘤及前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層腫瘤(髓母細胞瘤)。
本發明之免疫接合物可單獨或與其他劑組合用於療法中。舉例而言，免疫接合物可與至少一種額外治療劑，諸如化學治療劑共同投與。此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於相同或獨立調配物中)；及獨立投與，在此種情況下，免疫接合物之投與可在額外治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後進行。免疫接合物亦可與放射線療法組合使用。
本發明之免疫接合物(及任何額外治療劑)可藉由任何適合之手段投與，包括非經腸、肺內及鼻內，且必要時對於局部治療，病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥可藉由任何適合之途徑進行，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，在部分程度上視投藥為短暫抑或長期而定。本文預期各種給藥方案，包括但不限於單次投藥或經多個時間點之多次投藥、推注投藥及脈衝輸注。
已知阿特珠單抗、得瓦魯單抗、阿維魯單抗、其生物類似藥及其生物改良藥可用於治療癌症，特別為乳癌，尤其三陰性(對雌激素受體、黃體酮受體及過量HER2蛋白質測試呈陰性)乳癌、膀胱癌及默克爾細胞癌。本文所述之免疫接合物與阿特珠單抗、得瓦魯單抗、阿維魯單抗、其生物類似藥及其生物改良藥可用於治療相同類型之癌症，特別為乳癌，尤其三陰性(對雌激素受體、黃體酮受體及過量HER2蛋白質測試呈陰性)乳癌、膀胱癌及默克爾細胞癌。
使用任何適合之給藥方案，諸如用於阿特珠單抗、得瓦魯單抗、阿維魯單抗、其生物類似藥及其生物改良藥之給藥方案，以任何治療有效量向有需要之個體投與免疫接合物。舉例而言，該等方法可包括投與免疫接合物以向個體提供約100 ng/kg至約50 mg/kg之劑量。免疫接合物劑量可在約5 mg/kg至約50 mg/kg、約10 µg/kg至約5 mg/kg、或約100 µg/kg至約1 mg/kg之範圍內。免疫接合物劑量可為約100、200、300、400或500 µg/kg。免疫接合物劑量可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg。視特定接合物以及所治療之癌症之類型及嚴重性而定，免疫接合物劑量亦可在此等範圍之外。投藥頻率可在每週單次給藥至多次給藥之範圍內，或更高頻率。在一些實施例中，每月約一次至每週約五次投與免疫接合物。在一些實施例中，每週一次投與免疫接合物。
在另一個態樣中，本發明提供一種用於預防癌症之方法。該方法包括向個體投與治療有效量之免疫接合物(例如，如上文所述之組合物)。在某些實施例中，個體易患某種有待預防之癌症。舉例而言，該等方法可包括投與免疫接合物以向個體提供約100 ng/kg至約50 mg/kg之劑量。免疫接合物劑量可在約5 mg/kg至約50 mg/kg、約10 µg/kg至約5 mg/kg、或約100 µg/kg至約1 mg/kg之範圍內。免疫接合物劑量可為約100、200、300、400或500 µg/kg。免疫接合物劑量可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg。視特定接合物以及所治療之癌症之類型及嚴重性而定，免疫接合物劑量亦可在此等範圍之外。投藥頻率可在每週單次給藥至多次給藥之範圍內，或更高頻率。在一些實施例中，每月約一次至每週約五次投與免疫接合物。在一些實施例中，每週一次投與免疫接合物。
本發明之一些實施例提供用於治療如上文所述之癌症的方法，其中該癌症為乳癌。乳癌可起源於乳房之不同區域，且許多不同類型之乳癌已特徵化。舉例而言，本發明之免疫接合物可用於治療原位導管癌；浸潤性導管癌(例如小管癌；髓質癌；黏液癌；乳突癌；或乳房篩狀癌)；原位小葉癌；浸潤性小葉癌；炎性乳癌；及其他形式之乳癌，諸如三陰性(對雌激素受體、黃體酮受體及過量HER2蛋白質測試呈陰性)乳癌。在一些實施例中，用於治療乳癌之方法包括投與含有能夠結合HER2之抗體構築體(例如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、其生物類似藥或生物改良藥)及能夠結合PD-L1之抗體構築體(例如阿特珠單抗、得瓦魯單抗、阿維魯單抗、其生物類似藥或生物改良藥)的免疫接合物。在一些實施例中，用於治療結腸癌、肺癌、腎癌、胰臟癌、胃癌及食管癌之方法包括投與含有能夠結合CEA或過表現CEA之腫瘤之抗體構築體(例如拉貝妥單抗、其生物類似藥或生物改良藥)的免疫接合物。
在一些實施例中，癌症容易發生由TLR7及/或TLR8誘導之促炎反應。 實例 製備胺基苯并氮呯化合物(Bz)及中間體 實例1 合成Bz-1
Figure 02_image196
合成(3-(苯甲基(丙基)胺基)丙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-1a.
在70℃下將含N-(3-胺基丙基)胺基甲酸三級丁酯(10 g，57.39 mmol，10.02 mL，1當量)及苯甲醛(6.09 g，57.39 mmol，5.80 mL，1當量)之DCE (100 mL)攪拌24小時。在0℃下將MeOH (100 mL)及NaBH3 CN (16.23 g，258.26 mmol，4.5當量)逐份添加至混合物中。在0℃下攪拌混合物2小時，接著在0℃下添加丙醛(16.67 g，286.96 mmol，20.89 mL，5當量)且攪拌2小時。LCMS顯示反應完成。向混合物中添加數滴水且在40℃下減壓濃縮。將殘餘物傾倒至冰水(200 mL)中且攪拌5分鐘。用乙酸乙酯(200 mL x 3)萃取水相。用鹽水(300 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(石油醚/乙酸乙酯=10/1、3/1)純化殘餘物，得到呈淺黃色油狀之N-[3-[苯甲基(丙基)胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1a (16 g，52.21 mmol，產率90.98%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 7.39-7.29 (m, 5H), 3.60-3.52 (m, 2H), 3.20-3.08 (m, 2H), 2.56-2.45 (m, 2H), 2.39 (s, 2H), 1.73-1.61 (m, 2H), 1.58-1.48 (m, 2H), 1.42 (s, 1H), 1.45 (s, 9H), 0.89 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。 合成N-[3-(丙基胺基)丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1b.
在N2 下向N-[3-[苯甲基(丙基)胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1a (10 g，32.63 mmol，1當量)於MeOH (150 mL)中之溶液中添加Pd(OH)2 /C (10%，3 g)。將懸浮液在真空下脫氣且用H2 吹掃數次。在50℃下於H2 (50 psi)下攪拌混合物12小時。TLC (石油醚/乙酸乙酯=3:1) 顯示起始物質完全消耗。過濾反應混合物且濃縮濾液，得到呈無色油狀之N-[3-(丙基胺基)丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1b (5 g，23.11 mmol，產率70.83%)，其未經進一步純化即用於下一步驟中。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 3.13-3.05 (m, 2H), 2.60 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.56-2.50 (m, 2H), 1.66 (m, 2H), 1.58-1.48 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 0.94 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。 合成N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1.
在15℃下向N-[3-(丙基胺基)丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1b (202.42 mg，935.73 µmol (微莫耳)，2當量)及來自實例6之2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-10c (0.2 g，467.87 µmol，1當量)於DMF(2 mL)中之混合物中一次性添加HATU (213.48 mg，561.44 µmol，1.2當量)及Et3 N (94.69 mg，935.73 µmol，130.24 µL (微升)，2當量)。在15℃下攪拌混合物30分鐘。LCMS及HPLC顯示反應完成。過濾混合物且藉由製備型HPLC (管柱：Waters Xbridge 150x25 mm，5微米粒度；移動相：[水(10mM NH4 HCO3 )-ACN]；B%：30%-50%，20分鐘)純化，得到呈淺黃色固體狀之N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1 (0.087 g，139.03 µmol，產率29.72%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.07 (s, 1H), 8.03 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.86-7.81 (m, 1H), 7.79-7.73 (m, 1H), 7.50-7.45 (m, 2H), 7.39 (m, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.86 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.61-3.58 (m, 2H), 3.52-3.48 (m, 2H), 3.45-3.41 (m, 4H), 3.10 (s, 4H), 2.62-2.52 (m, 1H), 1.86-1.79 (m, 2H), 1.71-1.65 (m, 2H), 1.42-1.50 (m, 9H), 0.87-0.95 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 626.30 (計算值)；LC/MS [M+H] 626.40 (觀測值)。 實例2 合成Bz-3
Figure 02_image198
合成(3-(苯甲基(丙基)胺基)丙基)(甲基)胺基甲酸三級丁酯
在25℃下於N2 下向苯甲醛(310.02 mg，2.92 mmol，295.26 µL，1當量)於DCE (10 mL)中之混合物中添加N-(3-胺基丙基)-N-甲基-胺基甲酸三級丁酯(0.55 g，2.92 mmol，1當量)。在60℃下攪拌混合物12小時，接著冷卻至0℃，將MeOH (10 mL)添加至混合物中，將NaBH3 CN (550.48 mg，8.76 mmol，3當量)添加至混合物中攪拌1小時。將丙醛(339.18 mg，5.84 mmol，425.04 μL，2當量)添加至混合物中且在0℃下攪拌1小時。LCMS顯示反應完成。真空濃縮混合物。藉由製備型HPLC管柱純化殘餘物：Luna C18 100x30 5u；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%，10分鐘，得到呈無色油狀之N-[3-[苯甲基(丙基)胺基]丙基]-N-甲基-胺基甲酸三級丁酯(0.4 g，1.25 mmol，產率42.75%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 7.18-7.37 (m, 5H), 3.57 (s, 2H), 3.20 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.78 (s, 3H), 2.35-2.52 (m, 4H), 1.70 (五重峰,J = 7.2 Hz, 2H), 1.47-1.57 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 0.88 (t,J = 7.2 Hz, 3H) 合成甲基(3-(丙基胺基)丙基)胺基甲酸三級丁酯
在N2 下向N-[3-[苯甲基(丙基)胺基]丙基]-N-甲基-胺基甲酸三級丁酯(0.4 g，1.25 mmol，1當量)於MeOH (20 mL)中之溶液中添加Pd(OH)2 /C (0.2 g，純度5%)。將懸浮液在真空下脫氣且用H2 吹掃數次。在50℃下於H2 (50 psi)下攪拌混合物12小時。LCMS顯示反應物已消耗，偵測到所需質量。過濾混合物且真空濃縮。得到呈無色油狀之N-甲基-N-[3-(丙基胺基)丙基]胺基甲酸三級丁酯(0.25 g，1.09 mmol，產率86.95%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 3.26-3.31 (m, 2H), 2.85 (s, 3H), 2.56 (q,J = 8.0 Hz, 4H), 1.74 (五重峰,J = 7.2 Hz, 2H), 1.48-1.59 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 0.94 (t,J = 7.2 Hz, 3H) 合成(3-(2-胺基-8-溴-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)(甲基)胺基甲酸三級丁酯Bz-3b
在25℃下於N2 下向2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-3a (80 mg，284.59 µmol，1當量)及N-甲基-N-[3-(丙基胺基)丙基]胺基甲酸三級丁酯(78.67 mg，341.51 μmol，1.2當量)於DMF (1 mL)中之混合物中添加HATU (162.32 mg，426.89 μmol，1.5當量)、Et3 N (57.60 mg，569.18 μmol，79.22 μL，2當量)。在25℃下攪拌混合物1小時。LCMS顯示所需主要物質。將混合物傾倒至水(20 mL)中。用乙酸乙酯(20 mLx3)萃取水相。用鹽水(20 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由製備型TLC (石油醚/乙酸乙酯=0/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之Bz-3b (60 mg，121.60 µmol，產率42.73%)。 合成(3-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)(甲基)胺基甲酸三級丁酯Bz-3
在25℃下於N2 下向[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲醇(155.12 mg，506.65 µmol，1當量)、Pin2 B2 (154.39 mg，607.98 µmol，1.2當量)、乙酸鉀KOAc (124.31 mg，1.27 mmol，2.5當量)於二噁烷(30 mL)中之混合物中添加Pd(dppf)Cl2 .CH2 Cl2 (41.38 mg，50.67 µmol，0.1當量)。在90℃下攪拌混合物2小時。將含N-[3-[(2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羰基)-丙基-胺基]丙基]-N-甲基-胺基甲酸三級丁酯Bz-3b (0.25 g，506.65 μmol，1當量)、K2 CO3 (140.04 mg，1.01 mmol，2當量)之H2 O (2 mL)添加至混合物中，在90℃下於氮氣N2 下攪拌2小時。LCMS顯示反應完成。過濾混合物且真空濃縮。藉由製備型TLC (EtOAc/MeOH=7:1)純化殘餘物，得到呈淺黃色固體狀之Bz-3 (112 mg，175.05 µmol，產率34.55%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.07 (s, 1H), 8.03 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.85 (br d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.73-7.79 (m, 1H), 7.41-7.54 (m, 3H), 6.95 (s, 1H), 3.86 (t,J = 8.2 Hz, 2H), 3.60 (dd,J = 8.0, 6.0 Hz, 2H), 3.39-3.52 (m, 6H), 3.17-3.29 (m, 2H), 2.82-2.90 (m, 4H), 2.53-2.67 (m, 1H), 1.89-1.92 (m, 2H), 1.66-1.72 (m, 2H), 1.42-1.46 (m, 9H), 0.80-1.05 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 640.32 (計算值)；LC/MS [M+H] 640.30 (觀測值)。 實例3 合成Bz-5
Figure 02_image200
合成5-溴-1-碘-2-甲基-3-硝基苯Bz-5b
在0℃下於N2 下向4-溴-1-甲基-2-硝基-苯Bz-5a (20 g，92.58 mmol，20.00 mL，1當量)於H2 SO4 (20 mL)中之混合物中添加NIS (37.49 g，166.64 mmol，1.8當量)。在0℃下攪拌混合物1小時。TLC顯示反應物已消耗且形成兩個點。將混合物緩慢傾倒至冰水(200 mL)中。用乙酸乙酯(150 mLx2)萃取水相。用鹽水(150 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=100/1、20/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之Bz-5b (14 g，40.94 mmol，產率44.23%)。1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.20 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 7.87 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 2.55 (s, 3H)。 合成5-溴-2-(溴甲基)-1-碘-3-硝基苯Bz-5c
在25℃下於N2 下向5-溴-1-碘-2-甲基-3-硝基-苯Bz-5b (13 g，38.02 mmol，1當量)於CCl4 (100 mL)中之混合物中添加NBS (10.15 g，57.03 mmol，1.5當量)、BPO (920.94 mg，3.80 mmol，0.1當量)。在90℃下攪拌混合物12小時。TLC顯示形成一個新的點，HPLC及LCMS顯示所需約50%及剩餘約50%反應物。真空濃縮混合物。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=50/1、10/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之Bz-5c (7 g，16.63 mmol，產率43.75%)。1 H NMR (CDCl3-d6 , 400 MHz) δ 8.29 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 8.02 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 4.82 (s, 3H)。 合成4-溴-2-碘-6-硝基苯甲醛Bz-5d
在25℃下於N2 下向5-溴-2-(溴甲基)-1-碘-3-硝基-苯Bz-5c (7 g，16.63 mmol，1當量)於CH3 CN (10 mL)中之混合物中添加NMO (3.90 g，33.27 mmol，3.51 mL，2當量)。在25℃下攪拌混合物2小時。TLC顯示反應完成。真空濃縮混合物。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=20/1、4/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之Bz-5d (5 g，14.05 mmol，產率84.46%)。1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 10.00 (s, 1H), 8.37 (d,J = 1.6 Hz, 1H), 8.15 (d,J = 1.6 Hz, 1H) 合成(E)-3-(4-溴-2-碘-6-硝基苯基)-2-(氰基甲基)丙烯酸乙酯Bz-5e
在25℃下於N2 下向4-溴-2-碘-6-硝基-苯甲醛Bz-5d (3.5 g，9.83 mmol，1當量)於甲苯(30 mL)中之混合物中添加3-氰基-2-(三苯基-亞膦基)丙酸乙酯(5.71 g，14.75 mmol，1.5當量)。在85℃下攪拌混合物12小時。TLC顯示所需主要物質。真空濃縮混合物。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=10/1、1/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之Bz-5e (2 g，4.30 mmol，產率43.73%)。1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.62 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.42 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 4.32 (q,J = 7.2 Hz, 2H), 3.33 (s, 2H), 1.31 (t,J = 7.2 Hz, 3H) 合成2-胺基-8-溴-6-碘-3H-苯并[b]氮呯-4-甲酸乙酯Bz-5f
在25℃下於N2 下向(E)-3-(4-溴-2-碘-6-硝基-苯基)-2-(氰基甲基)丙-2-烯酸乙酯Bz-5e (2 g，4.30 mmol，1當量)於乙酸AcOH (20 mL)中之混合物中添加Fe (1.20 g，21.50 mmol，5當量)。在80℃下攪拌混合物5小時。LCMS顯示所需主要物質且反應物已消耗。過濾反應物且真空濃縮濾液。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/1、0/1)純化殘餘物，得到呈灰白色固體狀之Bz-5f (1.8 g，4.14 mmol，產率96.20%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 7.71 (s, 1H), 7.69 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 7.22 (br d,J = 2.0 Hz, 1H), 4.26 (q,J = 7.0 Hz, 3H), 2.83 (s, 2H), 1.30 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。 合成2-胺基-8-溴-6-碘-3H-苯并[b]氮呯-4-甲酸Bz-5g
在25℃下於N2 下向2-胺基-8-溴-6-碘-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯Bz-5f (1.8 g，4.14 mmol，1當量)於EtOH (40 mL)中之混合物中添加含LiOH.H2 O (1.04 g，24.82 mmol，6當量)之H2 O (10 mL)。在35℃下攪拌混合物2小時。LCMS顯示反應完成。濃縮混合物以移除EtOH，接著由HCl水溶液(4M)將PH植調節至5，過濾獲得所需固體，得到呈白色固體狀之Bz-5g (1.2 g，2.95 mmol，產率71.26%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 7.77 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.29 (s, 1H), 2.92 (s, 2H) 合成2-胺基-8-溴-6-碘-N ,N -二丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺Bz-5h
在25℃下向N-丙基丙-1-胺(186.47 mg，1.84 mmol，254.04 µL，1.5當量)及2-胺基-8-溴-6-碘-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-5g (0.5 g，1.23 mmol，1當量)於DMF (10 mL)中之混合物中添加HATU (700.67 mg，1.84 mmol，1.5當量)、Et3 N (186.47 mg，1.84 mmol，256.49 µL，1.5當量)。在25℃下攪拌混合物30分鐘。LCMS顯示反應完成。將混合物傾倒至水(50 mL)中，自混合物中分離出，且過濾獲得呈黃色固體狀之Bz-5h (0.55 g，1.12 mmol，產率91.33%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 7.74 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 7.33 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 3.43-3.47 (m, 4H), 1.66-1.72 (m, 4H), 0.93 (s, 6H) 合成(4-(2-胺基-8-溴-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-6-基)丁-3-炔-1-基)胺基甲酸三級丁酯Bz-5i
在25℃下於N2 下向2-胺基-8-溴-6-碘-N,N-二丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-5h (200 mg，408.02 μmol，1當量)及N-丁-3-炔基胺基甲酸三級丁酯(72.50 mg，428.42 µmol，1.05當量)於DMF (5 mL)、Et3 N (1 mL)中之混合物中添加Pd(PPh3 )2 Cl2 (14.32 mg，20.40 µmol，0.05當量)、Et3 N (0.5 mL)、CuI (15.54 mg，81.60 µmol，0.2當量)。在80℃下攪拌混合物1小時。LCMS顯示所需主要物質。將混合物傾倒至水(20 mL)中。用乙酸乙酯(20 mLx3)萃取水相。用鹽水(20 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由製備型TLC (石油醚/乙酸乙酯=0/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之Bz-5i (0.2 g，376.31 µmol，產率92.23%)。1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.40 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 3.46-3.52 (m, 4H), 3.35-3.40 (m, 2H), 2.65 (s, 2H), 1.58-1.78 (m, 4H), 1.46 (s, 9H), 0.93 (t,J = 7.2 Hz, 6H) 合成(4-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H-苯并[b]氮呯-6-基)丁-3-炔-1-基)胺基甲酸三級丁酯Bz-5j
在25℃下於N2 下向N-[4-[2-胺基-8-溴-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-6-基]丁-3-炔基]胺基甲酸三級丁酯Bz-5i (0.18 g，338.67 µmol，1當量)及 [1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲醇(179.45 mg，508.01 µmol，1.5當量)於二噁烷(10 mL)、H2 O (1 mL)中之混合物中添加Pd(dppf)Cl2 (12.39 mg，16.93 µmol，0.05當量)、K2 CO3 (93.61 mg，677.35 µmol，2當量)。在90℃下攪拌混合物2小時。LCMS顯示偵測到所需質量。真空濃縮混合物，得到呈黃色固體狀之Bz-5j (0.2 g，粗物質)。 合成(4-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H-苯并[b]氮呯-6-基)丁基)胺基甲酸三級丁酯Bz-5
在N2 下向N-[4-[2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-6-基]丁-3-炔基]胺基甲酸三級丁酯Bz-5j (140 mg，206.53 µmol，1當量)於MeOH (20 mL)中之溶液中添加Pd(OH)2 /C (0.1 g，純度5%)。將懸浮液在真空下脫氣且用H2 吹掃數次。在25℃下於H2 (50 psi)下攪拌混合物2小時。LCMS顯示反應完成。過濾混合物且真空濃縮。藉由製備型HPLC管柱純化殘餘物：Xtimate C18 150x25mm，5微米粒度；移動相：[水(0.04%NH3 H2 O+10mM NH4 HCO3 )-ACN]；B%：50%-60%，10.5分鐘。得到呈白色固體狀之Bz-5 (45 mg，65.99 µmol，產率31.95%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.00-8.08 (m, 2H), 7.83 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.71-7.79 (m, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 3.86 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.57-3.66 (m, 2H), 3.38-3.51 (m, 6H), 3.06 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 2.84 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 2.52-2.63 (m, 1H), 1.50-1.77 (m, 8H), 1.41 (s, 9H), 0.94 (s, 6H)。LC/MS [M+H] 682.36 (計算值)；LC/MS [M+H] 682.40 (觀測值)。 實例4 合成Bz-6
Figure 02_image202
合成((1-((3-溴苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺基甲酸三級丁酯Bz-6a
在0℃下向N-(氮雜環丁-3-基甲基)胺基甲酸三級丁酯(1.6 g，8.59 mmol，1.2當量)於DCM (5 mL)中之混合物中添加TEA (1.45 g，14.32 mmol，1.99 mL，2當量)及3-溴苯磺醯氯(1.83 g，7.16 mmol，1.03 mL，1當量)。在20℃下攪拌混合物1小時。用水(50 mL)稀釋混合物且用DCM (25 ml x 3)萃取。用鹽水(25 mL)洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由急驟矽膠層析(ISCO®；4 g SepaFlash®二氧化矽急驟管柱，溶離劑0至100%乙酸乙酯/石油醚梯度，在35 mL/min下)純化殘餘物。獲得呈白色固體狀之化合物N-[[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸三級丁酯Bz-6a (2.5 g，6.17 mmol，產率86.16%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 7.99 (t,J = 4.0 Hz, 1H), 7.74-7.81 (m, 2H), 7.47 (t,J = 8.0 Hz, 1H), 4.61 (s, 1H), 3.86 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.50-3.58 (m, 2H), 3.19 (t,J = 4.0 2H), 2.58-2.70 (m, 1H), 1.42 (s, 9H)。 製備N-[[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸三級丁酯Bz-6b
在15℃下於N2 下向N-[[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸三級丁酯Bz-6a (1 g，2.47 mmol，1當量)於二噁烷(10 mL)中之混合物中添加Pin2 B2 (939.80 mg，3.70 mmol，1.5當量)及KOAc (484.29 mg，4.93 mmol，2當量)、Pd(dppf)Cl2 (90.27 mg，123.36 µmol，0.05 當量)。在110℃下攪拌混合物2小時。產物N-[[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸三級丁酯Bz-6b未經分離且用於下一步驟中。 合成((1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺基甲酸三級丁酯Bz-6
在15℃下於N2 下向N-[[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸三級丁酯Bz-6b (1.12 g，2.48 mmol，1當量)及2-胺基-8-溴-N,N-二丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-6c (901.90 mg，2.48 mmol，1當量)於二噁烷(3 mL)中之混合物中添加K2 CO3 (684.35 mg，4.95 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl2 (90.58 mg，123.79 µmol，0.05當量)。在120℃下攪拌混合物2小時。過濾混合物且濃縮。藉由急驟矽膠層析(ISCO®；2 g SepaFlash®二氧化矽急驟管柱，溶離劑0至100%乙酸乙酯/石油醚梯度，在60 mL/min下)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之Bz-6 (600 mg，983.97 µmol，產率39.74%，純度100%)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ 7.99-8.10 (m, 2H), 7.74-7.86 (m, 2H), 7.36-7.52 (m, 3H), 6.89 (s, 1H), 3.83 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.54 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.34-3.48 (m, 6H), 3.02 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 2.48-2.64 (m, 1H), 1.59-1.76 (m, 4H), 1.37 (s, 9H), 0.96-0.89 (m, 6H)。LC/MS [M+H] 610.31 (計算值)；LC/MS [M+H] 610.40 (觀測值)。 實例5 合成Bz-9
Figure 02_image204
合成(5-(苯甲基(丙基)胺基)戊基)胺基甲酸三級丁酯Bz-9a
向N-(5-胺基戊基)胺基甲酸三級丁酯(1 g，4.94 mmol，1.03 mL，1當量)及苯甲醛(524.59 mg，4.94 mmol，499.61 µL，1當量)於DCE (10 mL)中之混合物中且在60℃下攪拌12小時。接著將混合物冷卻至0℃且將MeOH (10 mL)添加至混合物中。將NaBH3 CN (931.94 mg，14.83 mmol，3當量)添加至混合物中且在0℃下攪拌1小時。將丙醛(574.20 mg，9.89 mmol，719.55 µL，2當量)添加至混合物中且攪拌1小時。LCMS顯示反應完成。濃縮混合物。藉由製備型HPLC (管柱：Luna C18 100x30，5微米粒度；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-40%，10分鐘)進一步純化殘餘物，得到呈黃色油狀之N-[5-[苯甲基(丙基)胺基]戊基]胺基甲酸三級丁酯Bz-9a (0.5 g，1.49 mmol，產率30.24%)。1 H NMR (400MHz, 甲醇-d4 ) δ = 7.33-7.28 (m, 3H), 7.27-7.19 (m, 1H), 3.58 (s, 2H), 3.00 (t,J =7.2 Hz, 2H), 2.47-2.37 (m, 4H), 1.58-1.46 (m, 6H), 1.47 (s, 9H) 1.37-1.20 (m, 3H), 0.87 (t,J =7.6 Hz, 3H)  合成(5-(丙基胺基)戊基)胺基甲酸三級丁酯Bz-9b
在25℃下於N2 下向N-[5-[苯甲基(丙基)胺基]戊基]胺基甲酸三級丁酯Bz-9a (0.5 g，1.49 mmol，1當量)於MeOH (20 mL)中之溶液中添加Pd(OH)2/C (0.2 g，純度5%)。將懸浮液在真空下脫氣且用H2 吹掃數次。在50℃下於H2 (50psi)下攪拌混合物12小時。LCMS顯示反應完成。過濾混合物且濃縮。得到呈無色油狀之產物N-[5-(丙基胺基)戊基]胺基甲酸三級丁酯Bz-9b (0.3 g，粗物質)。1 H NMR (400MHz, 甲醇-d4 ) δ = 3.03 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.55 (d,J = 7.6, 13.6 Hz, 4H), 1.59-1.44 (m, 6H), 1.47 (s. 9H)1.43-1.20 (m, 2H), 0.97-0.88 (m, 3H)。
在25℃下向N-[5-(丙基胺基)戊基]胺基甲酸三級丁酯Bz-9b (57.17 mg，233.93 µmol，1當量)及2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-10c (0.1 g，233.93 µmol，1當量)於DMF (4 mL)中之混合物中一次性添加HATU (133.42 mg，350.90 µmol，1.5當量)及Et3 N (71.02 mg，701.80 µmol，97.68 µL，3當量)。在25℃下攪拌混合物0.5小時。LCMS顯示反應完成。用水稀釋混合物且用EA (30 mlx3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Xtimate C18 150x25mm，5微米粒度；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：32%-62%，10.5分鐘)進一步純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之N-[5-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]戊基]胺基甲酸三級丁酯Bz-9 (0.128 g，179.48 µmol，產率76.72%，純度91.68%)。1 H NMR (400MHz, 甲醇-d4 ) δ = 8.10 (s, 1H), 8.07 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.89 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 7.83-7.78 (m, 1H), 7.77-7.65 (m, 3H), 7.09 (s, 1H), 3.86 (t,J = 8.2 Hz, 2H), 3.61 (J = 5.6, 8.0 Hz, 2H), 3.56-3.35 (m, 8H), 3.31 (s, 2H), 3.10-2.99 (m, 2H), 2.64-2.53 (m, 1H), 1.80-1.59 (m, 4H), 1.57-1.47 (m, 2H), 1.40 (s, 9H), 1.03-0.86 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 654.33 (計算值)；LC/MS [M+H] 654.50 (觀測值)。 實例6 合成Bz-10
Figure 02_image206
製備Bz-10c：在15℃下向3-(羥甲基)氮雜環丁烷-1-甲酸三級丁酯Bz-10d (15 g，80.11 mmol)於DCM (100 mL)中之混合物中添加TFA (63.94 g，560.79 mmol，41.52 mL，7當量)。在15℃下攪拌混合物1小時。濃縮混合物，得到呈黃色油狀之氮雜環丁-3-基甲醇Bz-10e (36 g，粗物質，TFA)。1 H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ 4.50-4.56 (m, 2H), 3.94-4.10 (m, 2H), 3.80-3.93 (m, 2H), 3.15-3.30 (m, 1H)。
製備[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲醇Bz-10f：在0℃下向氮雜環丁-3-基甲醇(33.06 g，164.37 mmol，2當量，TFA)及3-溴苯磺醯氯(21 g，82.19 mmol，11.86 mL，1當量)於DCM (200 mL)中之混合物中添加TEA (33.27 g，328.75 mmol，45.76 mL，4當量)。在15℃下攪拌混合物1小時。將殘餘物傾倒至飽和碳酸氫鈉水溶液(200 mL)中且攪拌10分鐘。用DCM (100 mL x 3)萃取水相。用鹽水(100 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由急驟矽膠層析(ISCO®；1 g SepaFlash®二氧化矽急驟管柱，溶離劑0至100%乙酸乙酯/石油醚梯度，在50 mL/min下)純化殘餘物。獲得呈白色固體狀之化合物[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲醇Bz-10f (21 g，68.59 mmol，產率83.45%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 7.89-8.11 (m, 1H), 7.78 (dd,J = 8.0, 2.0 Hz, 2H), 7.39-7.54 (m, 1H), 3.78-3.97 (m, 2H), 3.49-3.74 (m, 4H), 2.41-2.77 (m, 1H)。
製備[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲醇Bz-10g：在15℃下向[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲醇(8 g，26.13 mmol，1當量)於二噁烷(10 mL)中之混合物中添加Pin2 B2 (9.95 g，39.19 mmol，1.5當量)、KOAc (5.13 g，52.26 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl2 (1.91 g，2.61 mmol，0.1當量)。在110℃下攪拌混合物3小時。LC-MS顯示反應物1完全消耗且偵測到具有所需質量之一個主峰。過濾混合物，藉由使用乙酸乙酯洗滌。接著真空濃縮濾液。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/1、0/1)純化殘餘物，得到12g粗產物。用庚烷/甲基三級丁基醚=5/1 (50mL)濕磨粗產物，過濾，真空乾燥濾餅。獲得呈粉紅色固體狀之化合物[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲醇(8.2 g，23.21 mmol，產率88.84%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 8.28 (s, 1H), 8.06 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.89-7.95 (m, 1H), 7.58 (t,J = 8.0 Hz, 1H), 3.87 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.62-3.68 (m, 4H), 2.55-2.65 (m, 1H), 1.37 (s, 12H)。
製備2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯Bz-10h：在15℃下於N2 下向[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲醇Bz-10g (4.11 g，11.64 mmol，1.2當量)及2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯(3 g，9.70 mmol，1當量)於二噁烷(40 mL)及H2 O (3 mL)中之混合物中添加K2 CO3 (2.68 g，19.41 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl2 (355.02 mg，485.19 µmol，0.05當量)。在110℃下攪拌混合物3小時。LC-MS顯示反應物1完全消耗且偵測到具有所需質量之一個主峰。濃縮混合物。在0℃下將粗產物用EtOAc/H2O=1:1 (200 mL)濕磨10分鐘且過濾，真空乾燥濾餅。獲得呈白色固體狀之化合物2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯Bz-10h (4 g，粗物質)。1 H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ 8.06-8.15 (m, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.71-7.85 (m, 3H), 7.57 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.29-7.38 (m, 2H), 6.94 (s, 2H), 4.17-4.30 (m, 2H), 3.77 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.49 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.2 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 2.93 (s, 2H), 2.43-2.49 (m, 1H), 1.31 (t,J = 8.0 Hz, 3H)。 2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-10c
向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯Bz-10h (4 g，8.78 mmol，1當量)於MeOH (50 mL)及H2 O (10 mL)中之溶液中添加LiOH.H2 O (1.84 g，43.91 mmol ，5當量)。在30℃下攪拌混合物12小時。LC-MS顯示反應物1完全消耗且偵測到具有所需質量之一個主峰。在減壓下濃縮反應混合物以移除MeOH。過濾混合物。藉由逐步添加HCl溶液(1 M)將濾液之pH值調節至約6，接著過濾得到粗產物。在0℃下將粗產物用CH3 CN (100 mL)濕磨10分鐘。真空乾燥產物。獲得呈灰色固體狀之化合物2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-10c (2.51 g，5.72 mmol，產率65.11%，純度97.375%)。1 H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ 8.11-8.16 (m, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.78-7.88 (m, 4H), 7.75 (s, 1H), 3.76 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.45-3.54 (m, 4H), 3.20 (d,J = 4.0 Hz, 2H), 2.45-2.49 (m, 1H)。LC/MS [M+H] 428.13 (計算值)；LC/MS [M+H] 428.20 (觀測值)。
Figure 02_image208
合成N-[2-[苯甲基(丙基)胺基]乙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-10a
在0℃下向苯甲醛(2 g，18.85 mmol，1.90 mL，1當量)及N-(2-胺基乙基)胺基甲酸三級丁酯(3.32 g，20.73 mmol，3.26 mL，1.1當量)於DCE (30 mL)中之混合物中添加NaBH3 CN (2.37 g，37.69 mmol，2當量)。在0℃下攪拌混合物30分鐘，將丙醛(5.47 g，94.23 mmol，6.86 mL，5當量)添加至混合物中且在25℃下攪拌1小時。將混合物傾倒至冰水(50 mL)中且用乙酸乙酯(50 mL x 3)萃取水相。用鹽水(50 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=5/1、1/1)純化殘餘物，得到呈無色油狀之N-[2-[苯甲基(丙基)胺基]乙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-10a (3 g，10.26 mmol，產率54.44%)。 合成N-[2-(丙基胺基)乙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-10b
在N2 下向N-[2-[苯甲基(丙基)胺基]乙基]胺基甲酸三級丁酯(2 g，6.84 mmol，1當量)於MeOH (50 mL)中之溶液中添加Pd(OH)2 /C (10%，1 g)。將懸浮液在真空下脫氣且用H2 吹掃數次。在50℃下於H2 (50 psi)下攪拌混合物12小時。TLC (石油醚/乙酸乙酯=3:1)顯示起始物質完全消耗。過濾反應混合物且濃縮濾液，得到呈無色油狀之粗產物N-[2-(丙基胺基)乙基]胺基甲酸三級丁酯(1.3 g，6.43 mmol，產率93.96%)，其未經進一步純化即用於下一步驟中。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ 3.18 (t,J = 6.0 Hz, 2H), 2.68 (t,J = 6.0 Hz, 2H), 2.56 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 1.58-1.48 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 0.94 (t,J = 8.0 Hz, 3H)。 合成(2-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)乙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-10
在25℃下向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-10c (0.15 g，350.90 µmol，1當量)及N-[2-(丙基胺基)乙基]胺基甲酸三級丁酯(141.97 mg，701.80 µmol，2當量)於DMF (4 mL)中之混合物中一次性添加HATU (160.11 mg，421.08 µmol，1.2當量)、Et3 N (106.52 mg，1.05 mmol，146.52 µL，3當量)。在25℃下攪拌混合物12小時。LCMS顯示反應完成。過濾混合物且藉由製備型HPLC (管柱：Waters Xbridge 150x25 5u；移動相：[水(10mM NH4 HCO3 ) - ACN]；B%：25%-45%，20分鐘)純化，得到呈黃色固體狀之N-[2-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]乙基]胺基甲酸三級丁酯(0.036 g，55.05 µmol，產率15.69%，純度93.54%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ 8.07 (s, 1H), 8.03 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.86-7.81 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.78-7.73 (m, 1H), 7.47 (s, 2H), 7.41-7.36 (m, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.86 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.62-3.53 (m, 4H), 3.49-3.44 (m, 2H), 3.41 (d,J = 6.4 Hz, 2H), 3.32-3.29 (m, 3H), 2.63-2.51 (m, 1H), 1.68 (d,J = 7.2 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H), 0.98-0.83 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 612.29 (計算值)；LC/MS [M+H] 612.40 (觀測值)。 實例7 合成Bz-11 合成2-胺基-N-(3-胺基丙基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-11a.
Figure 02_image210
在15℃下向N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1 (0.5 g，799.01 μmol，1當量)於DCM (20mL)中之混合物中一次性添加TFA (1.82 g，15.98 mmol，1.18 mL，20當量)。在15℃下攪拌混合物3小時。LCMS顯示反應物已消耗。真空濃縮混合物，將殘餘物傾倒至冰水(30 mL)中且用Na2 CO3 水溶液調節至pH=11。用DCM/i-PrOH=3/1 (20 mL x 3)萃取水相。用鹽水(10 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。呈黃色油狀之粗產物2-胺基-N-(3-胺基丙基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-11a (0.4 g，粗物質)未經進一步純化即用於下一步驟中。 合成2-胺基-N-[3-(三級丁基胺甲醯基胺基)丙基]-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-11
Figure 02_image212
在15℃下向2-胺基-N-(3-胺基丙基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-11a (0.1 g，190.24 μmol，1當量)於DMF (2 mL)中之溶液中一次性添加2-異氰酸基-2-甲基-丙烷(18.86 mg，190.24 μmol，22.45 μL，1當量)。在15℃下攪拌混合物12小時。LCMS顯示反應完成。過濾混合物且藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil® (Nouryon) C18 100x30mm，5微米粒度；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-45%，10分鐘)純化，得到粗產物，接著藉由製備型HPLC (管柱：Welch Xtimate C18 150x25mm，5微米粒度；移動相：[水(10mM NH4 HCO3 )-ACN]；B%：25%-65%，10.5分鐘)純化，得到呈淺黃色固體狀之Bz-11 (0.007 g，11.20 µmol，產率5.89%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.09 (s, 1H), 8.05 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.87-7.85 (m, 1H), 7.80-7.76 (m, 1H), 7.51-7.49 (m, 2H), 7.43-7.41 (m, 1H), 6.94 (s, 1H), 3.88 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.63-3.60 (m, 2H), 3.54-3.50 (m, 2H), 3.44-3.43 (m, 4H), 3.15-2.91 (m, 4H), 2.67-2.58 (m, 1H), 1.84-1.79 (m, 2H), 1.73-1.66 (m, 2H), 1.40-1.14 (m, 9H), 1.00-0.90 (m, 3H)。 實例8 合成Bz-12
Figure 02_image214
在15℃下向2-胺基-N-(3-胺基丙基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-11a (0.1 g，190.24 µmol，1當量)於DMF (0.3 mL)中之溶液中一次性添加3-異氰酸基苯甲腈(27.42 mg，190.24 µmol，1當量)。在15℃下攪拌混合物12小時。LCMS顯示反應完成。過濾混合物且藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100x30mm 5um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-45%，10分鐘)純化，得到呈黃色固體狀之2-胺基-N-[3-[(3-氰基苯基)胺甲醯基胺基]丙基]-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-12 (10 mg，14.93 µmol，產率7.85%)。1 H NMR (CD3 OD, 400 MHz) δ 8.21-7.88 (m, 4H), 7.86-7.80 (m, 1H), 7.68 (s, 3H), 7.59-7.24 (m, 3H), 7.15 (s, 1H), 3.89 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.64 (m, 4H), 3.51 (s, 2H), 3.46 (d,J = 6.0 Hz, 2H), 3.40 (s, 2H), 3.30-3.19 (m, 2H), 2.63-2.60 (m, 1H), 1.96-1.92 (m, 2H), 1.77-1.71 (m, 2H), 1.07-0.86 (m, 3H)。 實例9 合成Bz-13
Figure 02_image216
在15℃下向2-胺基-N-(3-胺基丙基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-11a (0.1 g，190.24 µmol，1當量)於DMF (2 mL)中之混合物中一次性添加氯甲酸乙酯(61.94 mg，570.72 µmol，54.33 µL，3當量)。在15℃下攪拌混合物1小時。LCMS及HPLC顯示偵測到所需物質。過濾混合物且藉由製備型HPLC (管柱：Waters Xbridge BEH C18 100x25mm，5um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-45%，20分鐘)純化，得到呈淺黃色固體狀之N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸乙酯Bz-13 (0.018 g，30.11 µmol，產率15.83%)。1 H NMR (CD3 OD, 400 MHz) δ 8.11 (s, 1H), 8.08 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.91 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.83 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.81-7.75 (m, 1H), 7.74-7.68 (m, 2H), 7.12 (s, 1H), 4.07 (brs, 2H), 3.87 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.61 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.48 (m, 2H), 3.42 (d,J = 6.4 Hz, 2H), 3.37 (s, 2H), 3.14 (m, 2H), 2.67-2.51 (m, 1H), 1.93-1.80 (m, 2H), 1.77-1.64 (m, 2H), 1.33-1.06 (m, 3H), 0.95 (s, 3H)。 實例10 合成Bz-14
Figure 02_image218
根據針對Bz-11a所述之程序自Bz-5合成2-胺基-6-(4-胺基丁基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N ,N -二丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺Bz-14 。LC/MS [M+H] 582.31 (計算值)；LC/MS [M+H] 582.57 (觀測值)。 實例11 合成Bz-15
Figure 02_image220
在25℃下向N-[[1-[3- [2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸三級丁酯Bz-6 (0.15 g，245.99 μmol，1當量)於DCM (20 mL)中之溶液中添加TFA (56.10 mg，491.98 μmol，36.43 μL，2當量)且攪拌1小時。在40℃下減壓濃縮混合物。藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100 x 30mm 5um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-50%，10分鐘)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之2-胺基-8-[3-[3-(胺基甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N,N-二丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-15 (0.0546 g，105.69 µmol，產率42.97%，純度98.66%)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ 8.16-8.07 (m, 2H), 7.92 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.83 (t,J = 7.6 Hz, 1H), 7.79-7.72 (m, 2H), 7.68 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.09 (s, 1H), 3.96 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.67-3.63 (m, 2H), 3.50-3.42 (m, 4H), 3.37 (s, 2H), 3.05 (d,J = 7.4 Hz, 2H), 2.78-2.65 (m, 1H), 1.75-1.66 (m, 4H), 1.08-0.82 (m, 6H)。LC/MS [M+H] 510.25 (計算值)；LC/MS [M+H] 510.10 (觀測值)。 實例12 合成Bz-16
Figure 02_image222
合成N-(2-乙醯胺基乙基)-1-(5-硝基吡啶-2-基)哌啶-4-甲醯胺Bz-16a.
在25℃下於N2 下向乙醯氯(142.82 mg，1.82 mmol，129.83 µL，3當量)及N-(2-胺基乙基)-1-(5-硝基-2-吡啶基)哌啶-4-甲醯胺BzL-23b (0.2 g，606.46 µmol，1當量，HCl)於THF (10 mL)中之混合物中添加Et3 N (245.47 mg，2.43 mmol，337.65 µL，4當量)。在25℃下攪拌混合物1小時。LCMS顯示反應完成。將混合物傾倒至水(20 mL)中。過濾混合物，得到呈黃色固體狀之Bz-16a (0.2 g，596.38 μmol，產率98.34%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 8.95 (d,J = 2.4 Hz, 1H), 8.19 (dd,J = 9.6, 2.4 Hz, 1H), 7.78-7.98 (m, 2H), 6.95 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 4.50 (d,J = 9.6 Hz, 2H), 2.93-3.15 (m, 7H), 1.73-1.80 (m, 5H), 1.43-1.62 (m, 2H), 1.07-1.28 (m, 3H)。 合成N-(2-乙醯胺基乙基)-1-(5-胺基吡啶-2-基)哌啶-4-甲醯胺Bz-16b.
在N2 下向N-(2-乙醯胺基乙基)-1-(5-硝基-2-吡啶基)哌啶-4-甲醯胺Bz-16a (0.2，596.38 µmol，1當量)於MeOH (20 mL)中之溶液中添加Pd/C (0.2 g，純度5%)。將懸浮液在真空下脫氣且用H2 吹掃數次。在25℃下於H2 (15psi)下攪拌混合物4小時。LCMS顯示反應完成。過濾混合物且濃縮，得到呈黃色固體狀之Bz-16b (0.18 g，589.44 μmol，產率98.84%)。 合成(3-(8-((6-(4-((2-乙醯胺基乙基)胺甲醯基)哌啶-1-基)吡啶-3-基)胺甲醯基)-2-胺基-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-16.
在25℃下向2-胺基-4-[3-(三級丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-甲酸Bz-16c (0.22 g，494.91 μmol，1當量)、HATU (225.82 mg，593.90 μmol，1.2當量)於DMF (5 mL)中之混合物中添加Et3 N (150.24 mg，1.48 mmol，206.66 μL，3當量)。在25℃下攪拌混合物5分鐘，接著將N-(2-乙醯胺基乙基)-1-(5-胺基-2-吡啶基)哌啶-4-甲醯胺Bz-16b (151.13 mg，494.91 µmol，1當量)添加至混合物中，攪拌30分鐘。將混合物傾倒至水(50mL)中。用乙酸乙酯(50 mL)萃取水相。用鹽水(50 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由製備型HPLC管柱純化殘餘物：Welch Xtimate C18 150x25mm，5um；移動相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B%：30%-50%，10.5分鐘，得到呈灰白色固體狀之Bz-16 (96 mg，131.17 μmol，產率26.50%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.39 (d,J = 2.6 Hz, 1H), 7.90 (dd,J = 9.2, 2.6 Hz, 1H), 7.69 (d,J = 1.2 Hz, 1H), 7.54-7.60 (m, 1H), 7.46 (br d,J = 8.0 Hz, 1H), 6.85-6.95 (m, 2H), 4.30 (d,J = 13.6 Hz, 2H), 3.39-3.53 (m, 4H), 3.28 (s, 2H), 3.08-3.12 (m, 2H), 2.83-2.93 (m, 2H), 2.37-2.47 (m, 1H), 1.94 (s, 3H), 1.60-1.90 (m, 8H), 1.24-1.50 (m, 9H)。LC/MS [M+H] 732.42 (計算值)；LC/MS [M+H] 732.40 (觀測值)。 實例13 合成Bz-17
Figure 02_image224
在25℃下於N2 下向N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1 (1.5 g，2.40 mmol，1當量)於DCM (20 mL)中之溶液中添加TFA (6.16 g，54.03 mmol，4 mL，22.54當量)，接著在此溫度下攪拌1小時。減壓濃縮反應混合物。在0℃下用CH3 CN (30 mL)及H2 O (10 mL)稀釋殘餘物且用NaHCO3 水溶液調節至pH = 8-9。在25℃下攪拌混合物30分鐘，接著在減壓下濃縮以移除CH3 CN。用DCM/i-PrOH = 3/1 (20 mL x 3)萃取水相，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：luna® (Phenomenex) C18 250*80mm*10 µm (微米)；移動相[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%，20分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-胺基-N-(3-胺基丙基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-17 (1.00 g，1.57 mmol，產率65.48%，TFA鹽)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ8.14-8.05 (m, 2H), 7.91 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.86-7.81 (m, 1H), 7.80-7.72 (m, 2H), 7.71-7.67 (m, 1H), 7.15 (s, 1H), 3.87 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.65-3.57 (m, 4H), 3.55-3.52 (m, 2H), 3.45-3.36 (m, 4H), 3.04-3.01 (m, 2H), 2.63-2.53 (m, 1H), 2.04 (五重峰,J = 7.2 Hz, 2H), 1.77-1.70 (m, 2H), 0.94 (br t,J = 6.8 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 526.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 526.2 (觀測值)。 實例14 合成Bz-18
Figure 02_image226
製備(3-(3-((N-苯甲基-2-硝基苯基)磺醯胺基)丙氧基)丙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-18a.
將3,3′-氧基雙(丙-1-胺) (0.5 g，3.8 mmol，1當量)及碳酸鉀(1.3 g，9.5 mmol，2.5當量)溶於10 ml DMF中。添加2-硝基苯基磺醯氯(0.84 g，3.8 mmol，1當量)且藉由LCMS監測反應。隨後添加二碳酸二-三級丁酯(0.87 ml，3.8 mmol，1當量)。再過約一小時後，添加苯甲基溴(0.45 ml，3.8 mmol，1當量)且將反應物加熱至75℃。完成後，過濾反應物，濃縮且藉由急驟層析純化，得到Bz-18a (0.47 g，0.93 mmol，25%)。LC/MS [M+H] 508.21 (計算值)；LC/MS [M+H] 508.43 (觀測值)。 製備(3-(3-(苯甲基胺基)丙氧基)丙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-18b
將Bz-18a (0.47 g，0.93 mmol，1當量)溶解於DMF中。添加碳酸鉀(0.19 g，1.4 mmol，1.5當量)，繼而添加十二硫醇(0.33 ml，1.4 mmol，1.5當量)。在60℃下攪拌反應物隔夜，接著藉由管柱層析純化，得到Bz-18b (0.18 g，0.57 mmol，61%)。LC/MS [M+H] 323.23 (計算值)；LC/MS [M+H] 323.38 (觀測值)。 製備(3-(3-(苯甲基(丙基)胺基)丙氧基)丙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-18c
將Bz-18b (0.183 g，0.57 mmol，1當量)溶解於DCM中。添加丙醛(0.1 ml，1.4 mmol，2.5當量)及三乙醯氧基硼氫化鈉(0.3 g，1.4 mmol，2.5當量)。在室溫下攪拌反應物，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到Bz-18c (0.058 g，0.159 mmol，31%)。LC/MS [M+H] 365.28 (計算值)；LC/MS [M+H] 365.44 (觀測值)。 製備(3-(3-(丙基胺基)丙氧基)丙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-18d
將Bz-18c (0.058 g，0.159 mmol，1當量)溶解於4 ml甲醇中。向溶液中添加三乙胺(0.067 ml，0.48 mmol，3當量)，繼而添加甲酸(0.015 ml，0.40 mmol，2.5當量)，接著添加Pd/C (5 mg，10 wt%)。將混合物加熱至60℃。起始物質消耗後，過濾反應混合物且濃縮，得到Bz-18d (0.007 g，0.0092 mmol，26%)。LC/MS [M+H] 275.23 (計算值)；LC/MS [M+H] 275.27 (觀測值)。 製備Bz-18
將2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H-苯并[b]氮呯-4-甲酸Bz-18e (0.025 g，0.075 mmol，1當量)、Bz-18d (0.02 g，0.075 mmol，1當量)及二異丙基乙胺(0.065 ml，0.38 mmol，5當量)溶解於DMF中。添加HATU (0.043 g，0.113 mmol，1.5當量)且在室溫下攪拌混合物。完成時，濃縮反應混合物且藉由RP-HPLC純化。濃縮經分離之產物，溶解於最少量之TFA中，且在室溫下靜置15分鐘。接著濃縮溶液，藉由RP-HPLC純化且凍乾，得到呈白色粉末狀之2-胺基-N-(3-(3-胺基丙氧基)丙基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺Bz-18 (1.2 mg，0.002 mmol，3%)。LC/MS [M+H] 584.29 (計算值)；LC/MS [M+H] 584.50 (觀測值)。 實例15 合成Bz-19
Figure 02_image228
向小瓶中裝入Bz-17 (0.0275 mmol)、二異丙基乙胺(15 µL，0.0825 mmol)、三級丁基乙醯氯(0.0275 mmol)、250 µL DCM及250 µL DMF。使反應維持三小時且藉由使用0-10% MeOH:DCM梯度進行正相層析來純化，得到6.6 mg 2-胺基-N-(3-(3,3-二甲基丁醯胺基)丙基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺Bz-19，產率39%。LC/MS [M+H] 624.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 624.3 (觀測值)。 實例16 合成Bz-20
Figure 02_image230
向小瓶中裝入Bz-9 (28 mg，0.043 mmol)、300 µL DCM及100 µL三氟乙酸。使反應維持1小時，此後將其在減壓下濃縮。將所得油狀物與1 mL甲苯共沸三次，此後添加1 mL甲醇及K2 CO3 (38 mg，0.28 mmol)。攪拌16小時後，過濾反應物且在減壓下濃縮，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到5.8 mg 2-胺基-N-(5-胺基戊基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺Bz-20，產率24%。LC/MS [M+H] 554.28 (計算值)；LC/MS [M+H] 554.47 (觀測值)。 實例17 合成Bz-21
Figure 02_image232
製備(2-(2-(3-(3-羥基丙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-21a
将3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙酸三級丁酯(0.5 g，2.1 mmol，1當量)溶解於THF中。添加氫化鋰鋁(0.244 g，6.4 mmol，3當量)，且將反應物加熱至60℃。酯完全還原後，在冰上冷卻反應物且添加飽和碳酸氫鈉水溶液。攪拌混合物10分鐘，接著添加二碳酸二-三級丁酯(0.49 ml，2.1 mmol，1當量)。在室溫下攪拌反應物，接著濃縮以移除THF，隨後进行HPLC純化，得到Bz-21a (0.205 g，0.78 mmol，36%)。LC/MS [M+H] 264.18 (計算值)；LC/MS [M+H] 264.27 (觀測值)。 製備(2-(2-(3-(苯甲基(丙基)胺基)丙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-21b
在-78℃下將乙二醯氯(0.205 ml，2.4 mmol，3當量)溶解於0.5 ml DCM中。逐滴添加DMSO (0.34 ml，4.8 mmol，6當量)。在-78℃下攪拌反應物15分鐘，接著逐滴添加Bz-21a (0.21 g，0.80 mmol，1當量)於0.5 ml DCM中之溶液。在-78℃下攪拌反應物30分鐘，接著逐滴添加三乙胺(1 ml，7.2 mmol，9當量)。在-78℃下再攪拌反應物30分鐘，接著自冷卻中移出且經30分鐘升溫至周圍溫度。將N-苯甲基丙-1-胺(0.119 g，0.80 mmol，1當量)及三乙醯氧基硼氫化鈉STAB (0.845 g，4.0 mmol，5當量)懸浮於2 ml DCM中。將粗醛溶液添加至攪拌之胺溶液中。30分鐘後，將反應物添加至分液漏斗中且依序用飽和NaHCO3 、水及鹽水洗滌。經硫酸鈉乾燥有機部分，過濾，濃縮，接著藉由RP-HPLC純化，得到Bz-21b (0.228 g，0.58 mmol，73%)。LC/MS [M+H] 395.29 (計算值)；LC/MS [M+H] 395.44 (觀測值)。 製備(2-(2-(3-(丙基胺基)丙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-21c
将Bz-21b (0.228 g，0.58 mmol，1當量)溶解於甲醇中。添加甲酸(0.033 mol，0.87 mmol，1.5當量)，繼而添加10 wt% Pd/C (0.02 g)。在60℃下攪拌反應物，接著過濾，濃縮，且藉由HPLC純化，得到呈TFA鹽形式之Bz-21c (0.193 g，0.46 mmol，80%)。LC/MS [M+H] 305.24 (計算值)；LC/MS [M+H] 305.38 (觀測值)。
製備Bz-21：将2-胺基-8-(3-(((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b]氮呯-4-甲酸Bz-21d (0.042 g，0.099 mmol，1當量)、Bz-21c (0.03 g，0.099 mmol，1當量)及二異丙基乙胺(0.1 ml，0.57 mmol，5.8當量)溶解於DMF中。添加六氟磷酸7-氮雜-苯并三唑-1-基氧基-三吡咯啶基-鏻PyAOP CAS登記號156311-83-0 (0.077 g，0.15 mmol，1.5當量)且在室溫下攪拌混合物。完成時，濃縮反應混合物且藉由HPLC純化。濃縮經分離之產物，溶解於最少量之TFA中，且在室溫下靜置15分鐘。接著濃縮溶液且藉由HPLC純化，得到油狀物，將其用乙醚濕磨，得到呈白色固體狀之2-胺基-N -(3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b]氮呯-4-甲醯胺Bz-21 (0.037 g，0.060 mmol，61%)。LC/MS [M+H] 614.30 (計算值)；LC/MS [M+H] 614.58 (觀測值)。 實例18 合成Bz-22
Figure 02_image234
Figure 02_image236
製備(E)-2-(4-溴丁-2-烯-1-基)異吲哚啉-1,3-二酮Bz-22a
向(1,3-二側氧基異吲哚啉-2-基)鉀(7.5 g，40.5 mmol，1當量)於DMF(100 mL)中之溶液中添加(E)-1,4-二溴丁-2-烯(17.3 g，80.9 mmol，2當量)。在20℃下攪拌混合物12小時，接著用水(200 mL)稀釋且用EtOAc (80 mL x 3)萃取。用鹽水(50 mL)洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由急驟矽膠層析(ISCO®；12 g SepaFlash®二氧化矽急驟管柱，溶離劑0至60%乙酸乙酯/石油醚梯度，在60 mL/min下)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之Bz-22a (8.6 g，30.7 mmol，產率75.82%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ7.90-7.83 (m, 2H), 7.78-7.70 (m, 2H), 6.01-5.90 (m, 1H), 5.89-5.79 (m, 1H), 4.32 (d,J = 5.6 Hz, 2H), 3.92 (d,J = 7.2 Hz, 2H)。 製備N-三級丁氧基羰基-N-[(E)-4-(1,3-二側氧基異吲哚啉-2-基)丁-2-烯基]胺基甲酸三級丁酯Bz-22b
向Bz-22a (11 g，39.3 mmol，1當量)於DMF (200 mL)中之溶液中添加Cs2 CO3 (19.2 g，58.9 mmol，1.5當量)及N-三級丁氧羰基胺基甲酸三級丁酯(11.1 g，51.1 mmol，1.3當量)。在20℃下攪拌混合物12小時，接著用水(400 mL)稀釋且用EtOAc (100 mL x 3)萃取。用鹽水(80 mL x 3)洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由急驟矽膠層析(ISCO®；5 g SepaFlash®二氧化矽急驟管柱，溶離劑0至70%乙酸乙酯/石油醚梯度，在65 mL/min下)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之Bz-22b (16 g，38.4 mmol，產率97.83%)。1 H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ7.90-7.83 (m, 4H), 5.63-5.53 (m, 2H), 4.20-4.12 (m, 2H), 4.05-3.99 (m, 2H), 1.36 (s, 18H) 製備N-[(E)-4-胺基丁-2-烯基]-N-三級丁氧基羰基-胺基甲酸三級丁酯Bz-22c
在20℃下向Bz-22b (18 g，43.2 mmol，1當量)於MeOH (200 mL)中之溶液中添加水合肼(10.2 g，173 mmol，9.90 mL，純度85%，4當量)，接著在70℃下攪拌3小時。過濾混合物且濃縮濾液。在20℃下將粗產物用CH3 CN濕磨20分鐘且過濾，濃縮濾液，得到呈淺黃色油狀之Bz-22c (10 g，34.9 mmol，產率80.80%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 5.78-5.69 (m, 1H), 5.64-5.54 (m, 1H), 4.17-4.09 (m, 2H), 3.31-3.23 (m, 2H), 1.49 (s, 18H) 製備N-三級丁氧基羰基-N-[(E)-4-[(4-硝基苯基)磺醯基胺基]丁-2-烯基]胺基甲酸三級丁酯Bz-22d
在0℃下於N2 下向Bz-22c (1 g，3.49 mmol，1當量)於DCM (10 mL)中之溶液中添加TEA (706.72 mg，6.98 mmol，972.10 uL (微升)，2當量)及4-硝基苯磺醯氯(851.29 mg，3.84 mmol，1.1當量)。在25℃下攪拌混合物1小時，接著藉由在0℃下添加H2 O (20 mL)淬滅，接著用EtOAc( 10 mL x 3)萃取。用鹽水(5 mL)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物，將其藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯 = 1/0至1/1)純化，得到呈淺黃色油狀之Bz-22d (1.2 g，2.54 mmol，產率72.74%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 8.41-8.35 (m, 2H), 8.05 (d,J = 9.2 Hz, 2H), 5.71-5.61 (m, 1H), 5.57-5.47 (m, 1H), 4.61 (t,J = 5.6 Hz, 1H), 4.10 (d,J = 5.6 Hz, 2H), 3.67 (t,J = 6.0 Hz, 2H), 1.49 (s, 18H)。 製備N-三級丁氧基羰基-N-[(E)-4-[(4-硝基苯基)磺醯基-丙基-胺基]丁-2-烯基]胺基甲酸三級丁酯Bz-22e
在25℃下向Bz-22d (1 g，2.12 mmol，1當量)於DMF (10 mL)中之溶液中添加Cs2 CO3 (1.38 g，4.24 mmol，2當量)及1-碘丙烷(360.52 mg，2.12 mmol，207.19 uL，1當量)，接著在此溫度下攪拌12小時。在0℃下藉由添加H2 O (50 mL)淬滅反應混合物，接著用EtOAc (30 mL x 3)萃取。用鹽水( 10 mL x 3)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯 = 1/0至3/ 1)純化殘餘物，得到呈淺黃色固體狀之Bz-22e (0.89 g，1.73 mmol，產率81.71%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ8.36 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 7.99 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 5.74-5.60 (m, 1H), 5.51-5.37 (m, 1H), 4.11 (d,J = 7.2 Hz, 2H), 3.86 (d,J = 6.4 Hz, 2H), 3.16-3.07 (m, 2H), 1.55-1.46 (m, 20H), 0.86 (t,J = 7.6 Hz, 3H) 製備N-三級丁氧基羰基-N-[(E)-4-(丙基胺基)丁-2-烯基]胺基甲酸三級丁酯Bz-22f
在0℃下向Bz-22e (0.79 g，1.54 mmol，1當量)於CH3 CN (10 mL)中之溶液中添加LiOH.H2 O (387.25 mg，9.23 mmol，6當量)及2-硫烷基乙酸甲酯(490 mg，4.61 mmol，419 uL，3當量)。在25℃下攪拌所得混合物12小時，接著過濾且在減壓下濃縮。在0℃下用H2 O (20 mL)稀釋殘餘物，接著用1 M HCl調節至pH = 2-3且用MTBE (10 mL x 3)萃取。用K2 CO3 水溶液將水相之pH值調節至約10且用(10 mL x 3)萃取。經Na2 SO4 乾燥經合併之有機層，過濾且在減壓下濃縮，得到呈無色油狀之Bz-22f (0.35 g，1.07 mmol，產率69.28%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ5.79-5.58 (m, 2H), 4.15 (d,J = 5.2 Hz, 2H), 3.23 (d,J = 5.6 Hz, 2H), 2.56 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 1.56-1.42 (m, 20H), 0.92 (t,J = 7.6 Hz, 3H)。 製備N-[(E)-4-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丁-2-烯基]-N-三級丁氧基羰基-胺基甲酸三級丁酯Bz-22g
在25℃下向2-胺基-8-(3-(((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b]氮呯-4-甲酸Bz-21d (0.45 g，1.05 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之混合物中添加HATU (440 mg，1.16 mmol，1.1當量)及DIPEA (408 mg，3.16 mmol，550 uL，3當量)。10分鐘後，在25℃下將Bz-22f (345.75 mg，1.05 mmol，1當量)添加至混合物中，接著在此溫度下攪拌1小時。在0℃下將反應混合物傾倒至冰水(30 mL)中，且用DCM/i-PrOH = 3/1 (20 mL x 3)萃取。經Na2 SO4 乾燥經合併之有機層，過濾且在減壓下濃縮，得到呈棕色固體狀之Bz-22g (0.41 g，粗物質)。
製備Bz-22：在25℃下向N-[(E)-4-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丁-2-烯基]-N-三級丁氧基羰基-胺基甲酸三級丁酯(13 mg，17.6 umol (微莫耳)，1當量)於DCM (1 mL)中之溶液中添加TFA (154 mg，1.35 mmol，0.1 mL，76.7當量)，接著在此溫度下攪拌1小時。在減壓下濃縮反應混合物。在0℃下用CH3 CN (10 mL)及H2 O (1 mL)溶解殘餘物且用LiOH水溶液調節至pH = 9。在減壓下濃縮混合物。藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Welch Xtimate C18 100*25mm*3um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：5%-35%，12分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-胺基-N-[(E)-4-胺基丁-2-烯基]-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-22 (7 mg，10.74 umol，產率60.97%，TFA)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ8.15-8.04 (m, 2H), 7.91 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.86-7.72 (m, 3H), 7.68 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.07-5.94 (m, 1H), 5.89-5.77 (m, 1H), 4.21 (br s, 2H), 3.87 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.67-3.56 (m, 4H), 3.48 (br s, 2H), 3.45-3.37 (m, 4H), 2.68-2.50 (m, 1H), 1.77-1.61 (m, 2H), 0.95-0.93 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 538.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 538.3 (觀測值)。 實例19 合成Bz-23
Figure 02_image238
製備N'-苯甲基-N'-丙基-N-嘧啶-2-基-丙-1,3-二胺Bz-23b
在25℃下將N'-苯甲基-N'-丙基-丙-1,3-二胺Bz-23a (0.2 g，823.77 umol，1當量，HCl)、DIEA (426 mg，3.30 mmol，574 uL，4當量)於二噁烷(4 mL)中之混合物攪拌10分鐘，接著添加2-氯嘧啶(188.70 mg，1.65 mmol，2當量)，接著在25℃下攪拌混合物16小時。用H2 O (15 mL)淬滅反應物且用乙酸乙酯(15 mL x 3)萃取。用鹽水(10 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由製備型TLC (SiO2 ，DCM:MeOH = 7:1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之Bz-23b (130 mg，457 umol，產率55.49%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 8.26 (d,J = 4.8 Hz, 2H), 7.38-7.32 (m, 2H), 7.30 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 7.26-7.20 (m, 1H), 6.49 (t,J = 5.2 Hz, 1H), 5.74 (br s, 1H), 3.58 (s, 2H), 3.47-3.39 (m, 2H), 2.54 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.44-2.38 (m, 2H), 1.77 (五重峰,J = 6.4 Hz, 2H), 1.57-1.50 (m, 2H), 0.88 (t,J = 7.2 Hz, 3H) 製備N-丙基-N'-嘧啶-2-基-丙-1,3-二胺Bz-23c
在N2 氛圍下向Bz-23b (130 mg，457 umol，1當量)於MeOH (10 mL)中之溶液中添加Pd/C (0.1 g，純度10%)。將懸浮液脫氣且用氫氣H2 吹掃三次，在25℃下攪拌混合物16小時，接著過濾且在減壓下濃縮。藉由製備型TLC (SiO2 ，DCM:MeOH = 5: 1)純化殘餘物，得到呈棕色油狀之Bz-23c (80 mg，412 umol，產率90.09%)。
製備BZ-23：向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-21d (264 mg，618 umol，1當量)於DMF (2 mL)中之溶液中添加DIEA (240 mg，1.85 mmol，323 uL，3當量)、六氟磷酸7-氮雜-苯并三唑-1-基氧基-三吡咯啶基-鏻PYAOP (483 mg，927 umol，1.5當量)及Bz-23c (120 mg，618 umol，1當量)。在25℃下攪拌混合物1小時，接著過濾且在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (WelchXtimateC18100 x 25mm x 3um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-35%，12分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-N-[3-(嘧啶-2-基胺基)丙基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-23 (16 mg，26.5 umol，產率4.29%)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ8.38 (br s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 8.08 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.92 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.85-7.79 (m, 1H), 7.75 (br s, 1H), 7.71 (br s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.11 (br s, 1H), 6.74 (br s, 1H), 3.87 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.62 (dd,J = 6.0, 8.0 Hz, 4H), 3.54-3.49 (m, 2H), 3.42 (d,J = 6.8 Hz, 2H), 3.35 (br s, 2H), 2.64-2.51 (m, 1H), 2.08-1.95 (m, 2H), 1.77-1.66 (m, 2H), 0.99-0.94 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 604.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 604.3 (觀測值)。 實例20 合成Bz-24
Figure 02_image240
Figure 02_image242
製備N-[4-[(4-硝基苯基)磺醯基胺基]丁基]胺基甲酸三級丁酯Bz-24a
在0℃下向N-(4-胺基丁基)胺基甲酸三級丁酯(0.5 g，2.66 mmol，1當量)及Et3 N (537 mg，5.31 mmol，739 uL，2當量)於DCM (5 mL)中之溶液中添加4-硝基苯磺醯氯(647 mg，2.92 mmol，1.1當量)。添加後，在25℃下攪拌所得混合物1小時，接著藉由在0℃下添加H2 O (20 mL)淬滅，接著用DCM( 10 mL x 3)萃取。用鹽水(5 mL)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。用PE/MTBE = 10/1 (20 mL)濕磨殘餘物且攪拌30分鐘，過濾且在減壓下乾燥濾餅，得到呈白色固體狀之Bz-24a (0.99 g，2.65 mmol，產率99.82%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 8.37 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 8.07 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 5.28 (br s, 1H), 4.59 (br s, 1H), 3.12-3.03 (m, 4H), 1.58-1.48 (m, 4H), 1.44 (s, 9H) 製備N-[4-[(4-硝基苯基)磺醯基-丙基-胺基]丁基]胺基甲酸三級丁酯Bz-24b
在0℃下向Bz-24a (0.99 g，2.65 mmol，1當量)於DMF (7 mL)中之溶液中添加Cs2 CO3 (1.73 g，5.30 mmol，2當量)及1-碘丙烷(451 mg，2.65 mmol，259 uL，1當量)。在25℃下攪拌混合物12小時，接著在0℃下傾倒至冰水(30 mL)中，接著用EtOAc( 20 mL x 3)萃取。用鹽水(10 mL x 3)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。用PE/MTBE = 10/1 (20 mL)濕磨殘餘物且在25℃下攪拌30分鐘，過濾且在減壓下乾燥濾餅，得到呈淺黃色固體狀之Bz-24b (0.97 g，2.33 mmol，產率88.06%)。1 H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ8.39 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 8.07 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 6.79 (br t,J = 6.0 Hz, 1H), 3.13-3.05 (m, 4H), 2.88 (q,J = 6.4 Hz, 2H), 1.54-1.40 (m, 4H), 1.39-1.27 (m, 11H), 0.81 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。 製備N-[4-(丙基胺基)丁基]胺基甲酸三級丁酯Bz-24c
在0℃下向Bz-24b (0.97 g，2.33 mmol，1當量)於CH3 CN (10 mL)中之溶液中添加LiOH.H2 O (587.74 mg，14.01 mmol，6當量)及2-硫烷基乙酸甲酯(744 mg，7.00 mmol，635 uL，3當量)。在25℃下攪拌所得混合物12小時，接著過濾且在減壓下濃縮。在0℃下用H2 O (20 mL)稀釋殘餘物，接著用1 M HCl調節至pH = 2-3且用MTBE (10 mL x 3)萃取。用K2 CO3 水溶液將水相之pH值調節至約10且用EtOAc( 10 mL x 3)萃取。經Na2 SO4 乾燥經合併之有機層，過濾且在減壓下濃縮，得到呈棕色油狀之Bz-24c (445 mg，1.93 mmol，產率82.75%)。1 H NMR (DMSO-d6 , 400 MHz) δ6.81 (br s, 1H), 2.89 (q,J = 6.4 Hz, 2H), 2.47-2.39 (m, 4H), 1.44-1.31 (m, 15H), 0.85 (t,J = 7.6 Hz, 3H)。 製備N-[4-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丁基]胺基甲酸三級丁酯Bz-24d
在25℃下向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯甲氮雜-4-甲酸Bz-21d (100 mg，234 umol，1當量)及DIPEA (90.7 mg，702 umol，122.24 uL，3當量)於DMF(1 mL)中之溶液中添加HATU (97.8 mg，257 umol，1.1當量)。10分鐘後，在25℃下添加Bz-24c (64.66 mg，280.72 umol，1.2當量)，接著在此溫度下攪拌1小時。過濾反應混合物且在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Welch Xtimate C18 100*25mm*3um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：30%-45%，12分鐘)純化殘餘物。獲得呈黃色固體狀之Bz-24d (8 mg，12.50 umol，產率5.35%)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ8.14-8.04 (m, 2H), 7.92 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.85-7.81 (m, 1H), 7.81-7.76 (m, 1H), 7.73-7.68 (m, 2H), 7.11 (s, 1H), 3.87 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 3.61 (dd,J = 6.0Hz, 7.6 Hz, 2H), 3.58-3.45 (m, 4H), 3.44-3.35 (m, 4H), 3.12-3.04 (m, 2H), 2.65-2.52 (m, 1H), 1.78-1.63 (m, 4H), 1.55-1.40 (m, 11H), 0.95-0.93 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 640.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 640.3 (觀測值)。
製備Bz-24：在25℃下向Bz-24d (0.1 g，156 umol，1當量)於DCM (2 mL)中之溶液中添加TFA (308 mg，2.70 mmol，0.2 mL，17.28當量)，接著在此溫度下攪拌1小時。在減壓下濃縮反應混合物。在0℃下用CH3 CN (10 mL)及H2 O (1 mL)溶解殘餘物且用LiOH水溶液調節至pH = 9。在25℃下攪拌混合物1小時，接著過濾且在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Welch Xtimate C18 100*25mm*3um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：5%-30%，12分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-胺基-N-(4-胺基丁基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-24 (34 mg，52.01 umol，產率33.28%，TFA)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ8.13-8.05 (m, 2H), 7.90 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.85-7.78 (m, 1H), 7.77-7.72 (m, 2H), 7.71-7.65 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 3.86 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.61 (dd,J = 5.6 Hz, 7.6 Hz, 2H), 3.58-3.46 (m, 4H), 3.44-3.36 (m, 4H), 3.05-2.94 (m, 2H), 2.64-2.52 (m, 1H), 1.84-1.62 (m, 6H), 1.03-0.85 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 540.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 540.3 (觀測值)。 實例21 合成Bz-25
Figure 02_image244
製備N-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-25a
向2-(4-甲氧基苯基)乙胺(1 g，6.61 mmol，970.87 uL，1當量)於THF及H2 O (10 mL)中之混合物中添加Boc2 O (2.17 g，9.92 mmol，2.28 mL，1.5當量)，接著在25℃下於N2 氛圍下攪拌30分鐘。用水稀釋混合物且用EtOAc (50 ml x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=5/1-1/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之Bz-25a (1.60 g，6.37 mmol，產率96.26%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ7.12 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 6.85 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 4.53(br s, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.37-3.33 (m, 2H), 2.74 (br t,J = 6.4 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H) 製備4-甲氧基苯乙基(丙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-25b
在0℃下向Bz-25a (0.8 g，3.18 mmol，1當量)及1-碘丙烷(1.08 g，6.37 mmol，621 uL，2當量)於DMF (8 mL)中之混合物中添加NaH (191 mg，4.77 mmol，純度60%，1.5當量)，接著在25℃下攪拌2小時。將混合物傾倒至水(20 mL)中。用乙酸乙酯(15 mL x 3)萃取水相。用鹽水(10 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=5/1、1/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之Bz-25b (365 mg，1.24 mmol，產率39.08%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 7.11 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 6.84 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.36-3.30 (m, 2H), 3.15-3.09 (m, 2H), 2.79-2.71 (m, 2H), 1.57-1.50 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 0.87 (t,J = 7.6 Hz, 3H)。 製備N-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]丙-1-胺Bz-25c
向Bz-25b (365 mg，1.24 mmol，1當量)於EtOAc (5 mL)中之溶液中添加HCl/EtOAc (5 mL)。在25℃下攪拌混合物3小時，接著真空濃縮，得到Bz-25c。
製備Bz-25：向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-21d (186 mg，435 umol，1當量)於DMF (1.00 mL)中之溶液中添加PYAOP (340 mg，653 umol，1.5當量)及DIEA (393 mg，3.05 mmol，531 uL，7當量)，接著添加Bz-25c (100 mg，435 umol，1當量，HCl)。在25℃下攪拌混合物3小時，接著過濾且濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil® C18 100*30mm 8um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-55%，10分鐘])純化殘餘物，得到呈淺黃色固體狀之2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-25 (14 mg，23.23 umol，產率5.34%)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ 8.13-8.03 (m, 2H), 7.93-7.87 (m, 1H), 7.84-7.80 (m, 1H), 7.79-7.74 (m, 1H), 7.69 (br s, 1H), 7.60 (br d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.08 -6.51 (m, 5H), 3.86 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.75 (s, 4H), 3.61 (dd,J = 5.8, 8.1 Hz, 2H), 3.56-3.45 (m, 1H), 3.54-3.49 (m, 1H), 3.42 (d,J = 6.2 Hz, 2H), 2.93-2.87 (m, 2H), 2.65-2.47 (m, 1H), 1.75-1.68 (m, 2H), 1.03-0.94 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 603.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 603.3 (觀測值)。 實例22 合成Bz-26.
Figure 02_image246
製備Bz-26b：在25℃下向2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-26a (0.5 g，1.78 mmol，1.0當量)、PYAOP (1.02 g，1.96 mmol，1.1當量)及DIEA (920 mg，7.11 mmol，1.24 mL，4.0當量)於DMF (8 mL)中之混合物中添加N-[4-(丙基胺基)丁-2-炔基]胺基甲酸三級丁酯(400 mg，1.78 mmol，1.0當量)，接著在此溫度下攪拌0.5小時。將混合物傾倒至水(40 mL)中。用乙酸乙酯(30 mL x 3)萃取水相。用鹽水(30 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/1、0/1)純化殘餘物，得到呈淺黃色固體狀之N-[4-[(2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羰基)-丙基-胺基]丁-2-炔基]胺基甲酸三級丁酯Bz-26b (0.5 g，1.02 mmol，產率57.4%)。1 H NMR (CDCl3 , 400MHz) δ 7.52 (s, 1H), 7.39 (s, 2H), 7.07 (br s, 1H), 4.37 (s, 2H), 4.06 (d,J = 5.2 Hz, 2H), 3.65 (s, 2H), 2.91 (s, 2H), 1.88-1.74 (m, 2H), 1.57 (s, 9H), 1.06 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。
製備Bz-26：在25℃下於N2 下向[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲醇(1.73 g，4.90 mmol，1.2當量)、Bz-26b (2.0 g，4.09 mmol，1.0當量)及Pd(dppf)Cl2 (150 mg，204 umol，0.05當量)於二噁烷(40 mL)中之混合物中添加含K2 CO3 (1.13 g，8.17 mmol，2當量)之H2 O (5 mL)，接著在100℃下攪拌1小時。過濾混合物且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/1、0/1)純化殘餘物，得到呈淺黃色固體狀之N-[4-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丁-2-炔基]胺基甲酸三級丁酯Bz-26 (2.0 g，3.15 mmol，產率76.9%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ 8.07 (s, 1H), 8.04 (br d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.88-7.82 (m, 1H), 7.79-7.73 (m, 1H), 7.53-7.46 (m, 2H), 7.43-7.37 (m, 1H), 7.12 (s, 1H), 4.29 (s, 2H), 3.93-3.82 (m, 4H), 3.62-3.50 (m, 4H), 3.42 (d,J = 6.4 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 2.64-2.52 (m, 1H), 1.76-1.70 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 0.99-0.91 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 636.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 636.3 (觀測值)。LCMS (ESI)：C33 H41 N5 O6 S計算質量635.28，m/z實驗值636.3 [M+H]+ 實例23 合成Bz-27：
Figure 02_image248
製備Bz-27a：向N-[(4-甲醯基苯基)甲基]胺基甲酸三級丁酯(400 mg，1.70 mmol，1當量)、丙-1-胺(1.00 g，17.0 mmol，1.40 mL，10當量)及AcOH (10 mg，170 umol，9.72 uL，0.1當量)於MeOH (1 mL)中之溶液中添加NaBH3 CN (213 mg，3.40 mmol，2當量)，在25℃下攪拌混合物3小時。將反應混合物傾倒至水(10 mL)中，接著用EtOAc (5 mL x 3)萃取。用鹽水(5 mL x 1)洗滌經合併之有機層，經乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由製備型TLC (SiO2 ，EtOAC:MeOH=5:1)純化殘餘物，得到呈無色油狀之N-[[4-(丙基胺基甲基)苯基]甲基]胺基甲酸三級丁酯Bz-27a (200 mg，718 umol，產率42.26%)。1 H NMR (MeOD-d4, 400 MHz) δ7.43 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.37 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 4.24 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 3.00-2.96 (m, 2H), 1.77-1.67 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.01 (t,J = 7.6 Hz, 3H)。
製備Bz-27b：向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-21d (122 mg，287 umol，1當量)於DMF (0.80 mL)中之溶液中添加PYAOP (224 mg，431.05 umol，1.5當量)及DIEA (111 mg，862.10 umol，150.16 uL，3當量)。接著添加N-[[4-(丙基胺基甲基)苯基]甲基]胺基甲酸三級丁酯(80 mg，287 umol，1當量)。在25℃下攪拌混合物3小時，將其過濾且濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Welch Xtimate C18100*25mm*3um；移動相[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：30%-50%，12分鐘])純化殘餘物。獲得呈淺黃色固體狀之N-[[4-[[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]甲基]苯基]甲基]胺基甲酸三級丁酯(27 mg，39.3 umol，產率13.66%)。1 H NMR (MeOD-d4, 400 MHz) δ8.08 (t,J = 9.6Hz, 2H), 7.92-7.90 (m, 1H),7.82 (t,J = 8.4 Hz, 1H), 7.81-7.79 (m, 1H), 7.69-7.64 (m, 4H), 7.57(s, 1H), 7.30-7.29 (m, 4H), 7.13 (s, 1H), 4.23 (s, 2H), 3.87 (t,J = 8.4Hz, 2H), 3.61 (t,J = 6.0Hz, 2H), 3.42-3.41 (m, 2H), 3.31 (t,J = 1.6Hz, 2H), 2.60-2.55 (m, 1H), 1.71-1.70 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 0.99-0.90 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 688.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 688.3 (觀測值)。
製備Bz-27：向Bz-27b (50 mg，72.7 umol，1當量)於DCM(1 mL)中之溶液中添加TFA (165 mg，1.45 mmol，108 uL，20當量)，接著在25℃下攪拌2小時。過濾混合物且濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100*30mm8um；移動相：[水(0.1%TFA)-CAN]；B%：5%-30%，10分鐘])純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-胺基-N-[[4-(胺基甲基)苯基]甲基]-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-27 (4 mg，6.81 umol，產率9.36%)。1 H NMR (MeOH-d4 , 400 MHz) δ 8.13-8.03 (m, 2H), 7.91 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.85-7.78 (m, 1H), 7.75-7.70 (m, 2H), 7.59-7.33 (m, 5H), 7.15 (s, 1H), 4.13 (s, 2H), 3.86 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.61 (dd,J = 6.1, 7.8 Hz, 2H), 3.48 (br d,J = 7.6 Hz, 2H), 3.42 (d,J = 6.2 Hz, 4H), 3.32 (br s, 1H), 3.31-3.31 (m, 1H), 3.31-3.30 (m, 2H), 2.63-2.52 (m, 1H), 1.76-1.61 (m, 2H), 0.91 (br s, 3H)。LC/MS [M+H] 588.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 588.3 (觀測值)。 實例24 合成Bz-28
Figure 02_image250
製備Bz-28b：將1-[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]-N,N-二甲基-甲胺Bz-28a (0.3 g，900.24 umol，1當量)、Pin2 B2 (342.91 mg，1.35 mmol，1.5當量)、Pd(dppf)Cl2 (32.94 mg，45.01 umol，0.05當量)及KOAc (176.70 mg，1.80 mmol，2當量)於二噁烷(6 mL)中之混合物脫氣且用N2 吹掃3次，接著在90℃下於N2 氛圍下攪拌2小時。將反應混合物冷卻至25℃，且添加de-Pd矽膠 (1 g)，接著在25℃下攪拌30分鐘。過濾混合物且用EtOAc (10 mL x 5)洗滌，且在減壓下濃縮，得到呈黃色油狀之N,N-二甲基-1-[1-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲胺Bz-28b (0.6 g，粗物質)。
製備Bz-28：將Bz-28b (699 mg，920 umol，1.5當量)、N-[4-[(2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羰基)-丙基-胺基]丁-2-炔基]胺基甲酸三級丁酯Bz-26b (300 mg，613 umol，1當量)、Pd(dppf)Cl2 (22.4 mg，30.6 umol，0.05當量)及K2 CO3 (169 mg，1.23 mmol，2當量)於二噁烷(20 mL)及H2 O (2 mL)中之混合物脫氣且用N2 吹掃3次，接著在90℃下於N2 氛圍下攪拌2小時。藉由在0℃下添加H2 O (60 mL)淬滅反應混合物，接著用EtOAc( 30 mL x 3)萃取。用鹽水( 10 mL x 3)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚:乙酸乙酯 = 1:0至0: 1)繼之以(SiO2 ，EtOAc:MeOH = 1:0至1:1)純化殘餘物，得到呈棕色固體狀之N-[4-[[2-胺基-8-[3-[3-[(二甲基胺基)甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丁-2-炔基]胺基甲酸三級丁酯Bz-28 (230 mg粗產物，347 umol，產率56.61%)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ8.16-8.06 (m, 2H), 7.97-7.90 (m, 1H), 7.89-7.65 (m, 4H), 7.34 (br s, 1H), 4.34 (s, 2H), 4.01 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.87 (s, 2H), 3.69 (dd,J = 5.6, 8.4 Hz, 2H), 3.56 (br s, 2H), 3.39 (s, 2H), 3.33 (s, 2H), 3.03-2.89 (m, 1H), 2.82 (s, 6H), 1.81-1.67 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 0.97 (br t,J = 6.8 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 663.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 663.3 (觀測值)。 實例25 合成Bz-29
Figure 02_image252
製備Bz-29a：在25℃下向O-乙基羥胺(3 g，30.8 mmol，1當量，HCl)及Na2 CO3 (32.6 g，307.55 mmol，10當量)於DCM (30 mL)及水(30 mL)中之混合物中添加碳酸三級丁氧羰基三級丁酯(8.05 g，36.9 mmol，8.48 mL，1.2當量)，接著攪拌3小時。分離混合物，且經Na2 SO4 乾燥有機層，濃縮成殘餘物。藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯=1:0-5:1)純化粗物質，得到呈無色油狀之N-乙氧基胺基甲酸三級丁酯Bz-29a (4 g，24.81 mmol，產率80.68%)。1 H NMR (400MHz, 氯仿-d) δ3.87 (q,J = 7.2 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.20 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。
製備Bz-29b：在0℃下向Bz-29a (1 g，6.20 mmol，1當量)於DMF (10 mL)中之混合物中添加NaH (298 mg，7.44 mmol，純度60%，1.2當量) ，接著在0℃下攪拌0.5小時，在0℃下將1-碘丙烷(1.16 g，6.82 mmol，666.67 uL，1.1當量)添加至混合物中且在25℃下攪拌10小時。用飽和NH4 Cl溶液(10mL)淬滅混合物，接著用EtOAc (3*10 mL)萃取。經Na2 SO4 乾燥有機層，濃縮得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯=1:0-5:1)純化殘餘物，得到呈無色油狀之N-乙氧基-N-丙基-胺基甲酸三級丁酯Bz-29b (0.84 g，4.13 mmol，產率66.61%)。1 H NMR (400MHz, 氯仿-d) δ3.89 (q,J = 7.2 Hz, 2H), 3.47-3.25 (m, 2H), 1.69-1.59 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.23 (t,J = 7.2 Hz, 3H), 0.91 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。
製備Bz-29c：向Bz-29b (0.84 g，4.13 mmol，1當量)於EtOAc (10 mL)中之混合物中添加HCl/EtOAc (4 M，5 mL，4.84當量)。在25℃下攪拌混合物2小時。濃縮混合物，得到呈白色固體狀之N-乙氧基丙-1-胺Bz-29c (0.4 g，2.86 mmol，產率69.33%，HCl)。1 H NMR (400MHz, 甲醇-d4 ) δ4.16 (dq,J = 2.0, 7.2 Hz, 2H), 3.29-3.23 (m, 2H), 1.76 (sxt,J = 7.6 Hz, 2H), 1.32 (t,J = 7.2 Hz, 3H), 1.05 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。
製備Bz-29：向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸(200 mg，468 umol，1當量)於DMF (2 mL)中之混合物中添加PYAOP (293 mg，561 umol，1.2當量)及DIEA (181 mg，1.40 mmol，245 uL，3當量)，3分鐘後，添加N-乙氧基丙-1-胺(71.86 mg，514.65 umol，1.1當量，HCl)。在25℃下攪拌混合物1小時，接著濃縮得到殘餘物。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Gemini-NX C18 75*30mm*3um；移動相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B%：30%-60%, 10.5分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-胺基-N-乙氧基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-29 (3.5 mg，6.36 umol，產率1.36%，純度93.17%)。1 H NMR (400MHz, 甲醇-d4 ) δ8.10-8.02 (m, 2H), 7.89-7.73 (m, 2H), 7.53-7.48 (m, 2H), 7.46-7.40 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 3.95 (q,J = 7.2 Hz, 2H), 3.86 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.74 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 3.60 (dd,J = 6.4, 8.2 Hz, 2H), 3.41 (d,J = 6.4 Hz, 2H), 3.34-3.31 (m, 2H), 2.67-2.43 (m, 1H), 1.77 (sxt,J = 7.2 Hz, 2H), 1.18 (t,J = 7.2 Hz, 3H), 0.99 (t,J = 7.6 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 513.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 513.4 (觀測值)。 實例26 合成Bz-30
Figure 02_image254
Figure 02_image256
製備Bz-30a：在25℃下向1,4-雙(溴甲基)苯(6.48 g，24.6 mmol，2.0當量)及4-硝基-N-丙基-苯磺醯胺(3.0 g，12.3 mmol，1.0當量)於DMF (40 mL)中之混合物中一次性添加Cs2 CO3 (4.80 g，14.7 mmol，1.2當量)，接著攪拌12小時。用水(100 mL)稀釋反應物且用EtOAc (50 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(石油醚/乙酸乙酯=1/0、3/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之N-[[4-(溴甲基)苯基]甲基]-4-硝基-N-丙基-苯磺醯胺Bz-30a (1.5 g，3.51 mmol，產率28.6%)。1 H NMR (CDCl3 , 400MHz) δ8.35 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 7.98 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 7.35 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.24 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 4.48 (s, 2H), 4.40 (s, 2H), 3.19-3.11 (m, 2H), 1.42 (m, 2H), 0.76 (t,J = 7.6 Hz, 3H)。
製備Bz-30b：在25℃下向Bz-30a (1.3 g，3.04 mmol，1.0當量)及哌嗪-1-甲酸三級丁酯(2.27 g，12.2 mmol，4.0當量)於DMF (15 mL)中之混合物中添加Et3 N (1.23 g，12.2 mmol，1.69 mL，4.0當量)，接著在80℃下攪拌12小時。用水(50 mL)稀釋混合物且用EtOAc (50 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(石油醚/乙酸乙酯=1/0、3/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之4-[[4-[[(4-硝基苯基)磺醯基-丙基-胺基]甲基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸三級丁酯Bz-30b (1.7 g，粗物質)。1 H NMR (DMSO, 400MHz) δ8.39 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 8.11 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 7.21 (s, 4H),4.36 (s, 2H), 3.45 (s, 2H), 3.31-2.27 (m, 4H), 3.12-3.05 (m, 2H), 2.28-2.26 (m, 4H), 1.38 (s, 9H), 1.33-1.25 (m, 2H), 0.65 (t,J = 7.6 Hz, 3H)。
製備Bz-30c：在0℃下向Bz-30b (1.0 g，1.88 mmol，1.0當量)於CH3 CN (6 mL)中之溶液中一次性添加LiOH • H2 O (473 mg，11.3 mmol，6.0當量)。接著添加2-硫烷基乙酸甲酯(598 mg，5.63 mmol，511 uL，3.0當量)且在25℃下攪拌2小時。過濾混合物且濃縮。用MTBE (5 ml)稀釋殘餘物，接著用HCl水溶液(1M)將混合物之pH值調節至約2，用MTBE (20 mL) 萃取(棄去)。用NaHCO3 水溶液將水相調節至pH = 9，接著用EtOAc (30 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮，獲得呈黃色油狀之4-[[4-(丙基胺基甲基)苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸三級丁酯Bz-30c (0.5 g，粗物質)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ7.32-7.30 (m, 4H), 3.73 (s, 2H), 3.53 (s, 2H), 3.43-3.40 (m, 4H), 2.57-2.50 (m, 2H), 2.41-2.48 (m, 4H), 1.58-1.51 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 0.92 (t,J = 7.6 Hz, 3H)。
製備Bz-30：在25℃下向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-21d (400 mg，936 umol，1.0當量)於DMF (8 mL)中之混合物中一次性添加PYAOP (585 mg，1.12 mmol，1.2當量)、DIEA (363 mg，2.81 mmol，489 uL，3.0當量)及Bz-30c (358 mg，1.03 mmol，1.1當量)，接著攪拌1小時。過濾混合物且濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna C18 100 * 30mm * 5um；移動相：[水(0.1%TFA) - ACN]；B%：15%-45%，10分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之4-[[4-[[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]甲基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸三級丁酯Bz-30 (0.35 g，462 umol，產率49.4%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ 8.14-8.05 (m, 2H), 7.92 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.82 (t,J = 7.6 Hz, 1H), 7.78-7.69 (m, 2H), 7.63-7.42 (m, 5H), 7.17 (s, 1H), 4.37 (s, 2H), 3.86 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.61 (dd,J = 6.0, 8.0 Hz, 2H), 3.53-3.49 (m, 2H), 3.43-3.41 (m, 6H), 3.31-3.29 (m, 8H), 2.63-2.54 (m, 1H), 1.76-1.65 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 0.95-0.89 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 757.4 (計算值)；LC/MS [M+H] 757.4 (觀測值)。 實例27 合成Bz-31
Figure 02_image258
製備Bz-31a：向3,3,3-三氟丙-1-胺(0.5 g，3.34 mmol，1當量，HCl)及NaHCO3 (842.64 mg，10.03 mmol，390.11 uL，3當量)於THF (3 mL)及H2 O (3 mL)中之混合物中添加碳酸三級丁氧基羰基三級丁酯(730 mg，3.34 mmol，768 uL，1當量)，接著在25℃下於N2 氛圍下攪拌1小時。將混合物傾倒至H2 O (15 mL)中，用乙酸乙酯(15 mL x 3)萃取。用鹽水(15 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由用(石油醚:乙酸乙酯 = 5:0至1:1)溶離進行矽膠層析來純化粗產物，得到呈無色油狀之N-(3,3,3-三氟丙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-31a (500 mg，2.35 mmol，產率70.14%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ4.75 (br s, 1H), 3.40 (q,J = 6.4 Hz, 2H), 2.40-2.27 (m, 2H), 1.45 (s, 9H)。
製備Bz-31b：在0℃下向Bz-31a (400 mg，1.88 mmol，1當量)於DMF (5 mL)中之溶液中添加NaH (113 mg，2.81 mmol，純度60%，1.5當量)。30分鐘後，將1-碘丙烷(637.88 mg，3.75 mmol，366 uL，2當量)添加至混合物中，接著在20℃下攪拌2小時。在0℃下藉由添加飽和NH4 Cl (10 mL)淬滅反應混合物，接著用EtOAc (10 mL x 3)萃取。用無水Na2 SO4 乾燥有機相，過濾且真空濃縮。藉由矽膠管柱層析(石油醚:乙酸乙酯 = 5:1至1:1)純化反應混合物。獲得呈無色油狀之化合物N-丙基-N-(3,3,3-三氟丙基)胺基甲酸三級丁酯Bz-31b (400 mg，1.57 mmol，產率83.52%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ3.41 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 3.19-3.12 (m, 1H), 2.40-2.32 (m, 2H), 1.58-1.50 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 0.89 (t,J = 7.6 Hz, 3H)。
製備Bz-31c：向N-丙基-N-(3,3,3-三氟丙基)胺基甲酸三級丁酯(400 mg，1.57 mmol，1當量)於EtOAc (3 mL)中之溶液中添加HCl/EtOAc (4 M，5.88 mL，15當量)，接著在20℃下攪拌2小時。過濾混合物且真空濃縮，得到呈白色固體狀之3,3,3-三氟-N-丙基-丙-1-胺Bz-31c (240 mg，粗物質，HCl)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ3.34-3.31 (m, 2H), 3.06-3.00 (m,
製備Bz-31：向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸Bz-21d (100 mg，233 umol，1當量)、DIEA (90.7 mg，702 umol，122 uL，3當量)及PYAOP (183 mg，351 umol，1.5當量)於DMF (1 mL)中之溶液中添加Bz-31c (44.8 mg，234 umol，1當量，HCl)，接著在20℃下攪拌1小時。過濾混合物且真空濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Waters Xbridge BEH C18 100*30mm*10um；移動相：[水(10mM NH4 HCO3 )-ACN]；B%：30%-60%，8分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-N-(3,3,3-三氟丙基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-31 (7 mg，12.40 umol，產率5.30%)。1 H NMR (MeOD-d4 ,400MHz) δ8.07 (s, 1H), 8.04 (br d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.86-7.81 (m, 1H), 7.80-7.73 (m, 1H), 7.49-7.44 (m, 2H), 7.42-7.37 (m, 1H), 6.94 (s, 1H), 3.86 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.73 (br s, 2H), 3.60 (dd,J = 6.0, 8.0 Hz, 2H), 3.52-3.45 (m, 2H), 3.42 (d,J = 6.4 Hz, 2H), 3.33-3.32 (m, 2H), 2.68-2.53 (m, 3H), 1.74-1.64 (m, 2H), 0.91 (br s, 3H)。LC/MS [M+H] 565.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 565.3 (觀測值)。 實例28 合成Bz-32
Figure 02_image260
製備Bz-32：在25℃下向4-[[4-[[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]甲基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸三級丁酯Bz-30 (0.16 g，211 umol，1.0當量)於MeOH (10 mL)中之溶液中添加乙醯氯(49.8 mg，634 umol，45.3 uL，3.0當量)且在50℃下攪拌2小時。真空濃縮混合物，且藉由製備型HPLC (管柱：Waters Xbridge BEH C18 100*25mm*5um；移動相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B%：25%-55%，10分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]- N-[[4-(哌嗪-1-基甲基)苯基]甲基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-32 (36 mg，54.8 umol，產率25.9%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ8.06 (s, 1H), 8.02 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.83 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.79-7.72 (m, 1H), 7.46 (s, 2H), 7.40-7.22 (m, 5H), 6.93 (s, 1H), 4.74 (s, 2H), 3.85 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.62-3.56 (m, 2H), 3.52 (s, 2H), 3.45-3.34 (m, 4H), 2.85 (t,J = 4.4 Hz, 4H), 2.66-2.52 (m, 2H), 2.48-2.44 (m, 4H), 1.72-1.60 (m, 2H), 0.90-0.88 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 657.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 657.5 (觀測值)。 實例29 合成Bz-33
Figure 02_image262
將2-胺基-N -(3-胺基丙基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺Bz-17 (0.01 g，0.019 mmol，1當量)溶解於DCM中。添加三乙胺(4 μl，0.029 mmol，1.5當量)，繼而添加4-乙氧基苯甲醯氯(0.004 g，0.019 mmol，1當量)。在室溫下攪拌反應物，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到2-胺基-N -(3-(4-乙氧基苯甲醯胺基)丙基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺Bz-33 (0.0028 g，0.0042 mmol，22%)。LC/MS [M+H] 674.30 (計算值)；LC/MS [M+H] 674.74 (觀測值)。 實例30 合成Bz-34
Figure 02_image264
將2-胺基-N 4 -(3-胺基丙基)-N 8 -苯基-N 4 -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4,8-二甲醯胺Bz-34a (0.01 g，0.024 mmol，1當量)溶解於DCM中。添加三乙胺(5 µl，0.036 mmol，1.5當量)，繼而添加4-乙氧基苯甲醯氯(0.004 g，0.024 mmol，1當量)。在室溫下攪拌反應物，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到2-胺基-N 4 -(3-(4-乙氧基苯甲醯胺基)丙基)-N 8 -苯基-N 4 -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4,8-二甲醯胺Bz-34 (0.005 g，0.009 mmol，38%)。LC/MS [M+H] 568.29 (計算值)；LC/MS [M+H] 568.50 (觀測值)。 製備胺基苯并氮呯-連接子式II化合物(BzL)及中間體 實例31 合成BzL-1
按照本文所述之程序，製備2-胺基-8-(3-((2-(2-(3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基)乙氧基)乙基)胺甲醯基)苯基)-3H-苯并[b]氮呯-4-甲酸乙酯BzL-1且進行特徵化。 實例32 合成BzL-2
Figure 02_image266
Figure 02_image268
合成2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -(3-(甲基胺基)丙基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺BzL-2a
根據針對Bz-11a所述之程序自Bz-3合成BzL-2a。LC/MS [M+H] 540.26 (計算值)；LC/MS [M+H] 540.53 (觀測值)。 合成80-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-76-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73-二十四氧雜-76,80-二氮雜八十三烷酸三級丁酯BzL-2b.
向小瓶中裝入含BzL-2a (15.1 mg，0.028 mmol)、1-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧雜七十五烷-75-酸三級丁酯(0.042 mmol)、三乙醯氧基硼氫化鈉(30 mg，0.14 mmol)之100 µL DMF。攪拌反應物5小時，此後添加100 μL 10%碳酸鈉且攪拌1小時。過濾混合物且藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到40.7 mg BzL-2b，產率84%。LC/MS [M+H] 1724.98 (計算值)；LC/MS [M+H] 1726.52 (觀測值)。 合成80-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-76-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73-二十四氧雜-76,80-二氮雜八十三烷酸BzL-2c.
向小瓶中裝入BzL-2b (18 mg，0.010 mmol)、300 µL DCM及100 µL三氟乙酸。使反應維持45分鐘，在真空下濃縮，且與1 mL甲苯共沸三次。反應物未經任何進一步純化即繼續使用。
根據針對BzL-22所述之程序合成80-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-76-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73-二十四氧雜-76,80-二氮雜八十三烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-2。LC/MS [M+H] 1816.91 (計算值)；LC/MS [M+H] 1818.51 (觀測值)。 實例33 合成BzL-3
Figure 02_image270
合成2-苯甲基硫烷基-4-溴-苯甲腈BzL-3b
在25℃下向苯甲硫醇(3.10 g，25.00 mmol，2.93 mL，1當量)及4-溴-2-氟-苯甲腈BzL-3a (5 g，25.00 mmol，1當量)於DMF(10 mL)中之混合物中添加Cs2 CO3 (12.22 g，37.50 mmol，1.5當量)。在25℃下攪拌混合物1小時。TLC及LCMS顯示反應完成。將混合物傾倒至冰水(100 mL)中，攪拌5分鐘且過濾，得到呈白色固體狀之BzL-3b (4 g，13.15 mmol，產率52.60%)，其未經進一步純化即用於下一步驟中。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 7.50 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 7.47-7.43 (m, 1H), 7.41-7.38 (m, 1H), 7.35-7.28 (m, 5H), 4.23 (s, 2H)。 合成5-溴-2-氰基-苯磺醯氯BzL-3c
在0℃下向2-苯甲基硫烷基-4-溴-苯甲腈(1 g，3.29 mmol，1當量)於CH3 CN (20 mL)、AcOH (0.7 mL)及H2 O (0.5 mL)中之混合物中逐份添加1,3-二氯-5,5-二甲基-咪唑啶-2,4-二酮(1.30 g，6.57 mmol，2當量)。在0℃下攪拌混合物30分鐘。TLC及LCMS顯示反應完成。將混合物傾倒至冰水(50 mL)中且攪拌2分鐘。用DCM (20 mL x 2)萃取水相。用鹽水(30 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(石油醚/乙酸乙酯=20/1、10/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之BzL-3c (0.8 g，2.85 mmol，產率86.75%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 8.34 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 7.99 (dd,J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.83 (d,J = 8.4 Hz, 1H)。 合成4-溴-2-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯甲腈BzL-3d
在0℃下向氮雜環丁-3-基甲醇(1.54 g，12.48 mmol，1當量，HCl)於DCM (100 mL)中之混合物中逐滴添加DBU (3.80 g，24.95 mmol，3.76 mL，2當量)且攪拌10分鐘。向混合物中添加5-溴-2-氰基-苯磺醯氯BzL-3c (3.5 g，12.48 mmol，1當量)且在0℃下攪拌30分鐘。TLC顯示反應完成。將混合物傾倒至冰水(100 mL)中且攪拌2分鐘。用DCM (50 mL x 3)萃取水相。用鹽水(20 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮，獲得呈無色油狀之BzL-3d (3.5g，粗物質)，其未經進一步純化即用於下一步驟中。 合成4-溴-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯甲腈BzL-3e
在25℃下向4-溴-2-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯甲腈BzL-3d (3.5 g，10.57 mmol，1當量)及三級丁基二甲基矽基氯TBSCl (1.91 g，12.68 mmol，1.55 mL，1.2當量)於DCM (30 mL)中之混合物中一次性添加咪唑(1.08 g，15.85 mmol，1.5當量)。在25℃下攪拌混合物2小時。LCMS顯示反應完成。將混合物傾倒至冰水(200 mL)中且攪拌2分鐘。用DCM (100 mL x 3)萃取水相。用鹽水(50 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(石油醚/乙酸乙酯=20/1、10/1)純化殘餘物，得到呈無色油狀之BzL-3e (3.8 g，8.53 mmol，產率80.72%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 8.20 (d,J = 2.0 Hz, 1H), 7.82 (dd,J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.72 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 4.10-4.06 (m, 2H), 3.96-3.93 (m, 2H), 3.68 (d,J = 5.2 Hz, 2H), 2.82-2.76 (m, 1H), 0.86 (s, 9H), 0.00 (s, 6H)。
Figure 02_image272
合成4-溴-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯甲醛BzL-3f
在0℃下於N2 下向4-溴-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯甲腈BzL-3e (3.8 g，8.53 mmol，1當量)於DCM (100 mL)中之溶液中逐滴添加氫化二異丙基鋁DIBAL-H (1 M，9.38 mL，1.1當量)。在0℃下攪拌混合物1小時。LCMS顯示反應完成。向混合物中添加飽和NH4 Cl水溶液(3 mL)，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=20/1、5/1)純化殘餘物，得到呈淺黃色油狀之BzL-3f (3.5 g，7.80 mmol，產率91.49%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 10.69 (s, 1H), 8.16 (d,J = 1.6 Hz, 1H), 7.97 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.86 (dd,J = 1.6, 8.4 Hz, 1H), 3.95-3.88 (m, 2H), 3.81-3.76 (m, 2H), 3.65-3.64 (m, 2H), 2.85-2.71 (m, 1H), 0.85 (s, 8H), 0.03 (s, 6H)。 合成1-[4-溴-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯基]-N-甲基-甲胺BzL-3g
向甲胺(4.16 g，40.14 mmol，5當量) (30%，於MeOH中)及4-溴-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯甲醛BzL-3f (3.6 g，8.03 mmol，1當量)於MeOH (15 mL)及DCE (15 mL)中之溶液中添加AcOH (482.08 mg，8.03 mmol，459.12 µL，1當量)及NaBH3 CN (1.26 g，20.07 mmol，2.5當量)。在25℃下攪拌混合物18小時。向混合物中添加數滴水且濃縮。藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯=1:1)純化殘餘物，獲得呈無色油狀之BzL-3g (2 g，4.31 mmol，產率53.75%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 8.09-8.06 (m, 1H), 8.01-7.99 (m, 1H), 7.71 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 4.27 (s, 2H), 3.85-3.80 (m, 2H), 3.62-3.58 (m, 2H), 3.55 (d,J = 5.2 Hz, 2H), 2.69-2.75 (m, 1H), 2.56 (s, 3H), 0.82 (s, 9H)，0.00 (s, 6H) 合成N-[[4-溴-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸三級丁酯BzL-3h
在25℃下向1-[4-溴-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯基]-N-甲基-甲胺BzL-3g (2 g，4.31 mmol，1當量)於THF (15 mL)及H2 O (3 mL)中之混合物中一次性添加Na2 CO3 (914.68 mg，8.63 mmol，2當量)及Boc2 O (1.41 g，6.47 mmol，1.49 mL，1.5當量)。在25℃下攪拌混合物1小時。將混合物傾倒至冰水(10 mL)中且攪拌1分鐘。用乙酸乙酯(10 mL x 3)萃取水相。用鹽水(20 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由急驟矽膠層析(ISCO®；2 g SepaFlash®二氧化矽急驟管柱，溶離劑0至50%乙酸乙酯/石油醚梯度，在45 mL/min下)純化殘餘物，獲得呈無色油狀之BzL-3h (1.4 g，2.48 mmol，產率57.57%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 8.00-7.99 (m, 2H), 7.23 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 4.66 (s, 2H), 3.85-3.79 (m, 2H), 3.61-3.57 (m, 4H), 2.85 (s, 3H), 2.51-2.49 (m, 1H), 1.47-1.31 (m, 9H), 0.81 (s, 9H), -0.01 (s, 6H) 合成N-[[4-[2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸三級丁酯BzL-3i
在25℃下於N2 下向[2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]硼酸(360 mg，1.09 mmol，1當量)及N-[[4-溴-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸三級丁酯BzL-3h (616.35 mg，1.09 mmol，1當量)於二噁烷(3 mL)及H2 O (0.5 mL)中之混合物中一次性添加Pd(dppf)Cl2 (80.02 mg，109.36 µmol，0.1當量)及Na2 CO3 (231.81 mg，2.19 mmol，2當量)。在90℃下攪拌混合物2小時。過濾混合物且濃縮。將殘餘物傾倒至H2 O (20 mL)中且用乙酸乙酯(20 mL x 2)萃取。用鹽水(20 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由急驟矽膠層析(ISCO®；1 g SepaFlash®二氧化矽急驟管柱，溶離劑0至100%乙酸乙酯/石油醚梯度，在75 mL/min下)純化殘餘物，獲得呈黃色固體狀之BzL-3i (360 mg，468.69 µmol，產率42.86%)。
Figure 02_image274
Figure 02_image276
Figure 02_image278
Figure 02_image280
合成2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基-4-(甲基胺基甲基)苯基]-N,N-二丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺BzL-3j
向N-[[4-[2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]-2-[3-[[三級丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸三級丁酯BzL-3i (170 mg，221.33 µmol，1當量)於THF (5 mL)及H2 O (1 mL)中之混合物中添加TFA (504.72 mg，4.43 mmol，327.74 µL，20當量)，在50℃下攪拌混合物12小時。LC-MS顯示反應物1完全消耗且偵測到具有所需質量之一個主峰。過濾反應混合物，且在減壓下濃縮濾液。藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100 x 30mm 5um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-45%，10分鐘)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之BzL-3j (95 mg粗物質)產物。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 12.49 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 9.50 (s, 1H), 8.87 (s, 2H), 8.24-8.22 (m, 1H), 8.17-8.16 (m, 1H), 7.92-7.90 (m, 1H), 7.74-7.71 (m, 1H), 7.67-7.70 (m, 2H), 7.06 (s, 1H), 4.79 (s, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.85 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.61 (t,J = 4.0 Hz, 2H), 3.35 (s, 4H), 2.67 (s, 3H), 2.64-2.55 (m, 2H), 1.74-1.39 (m, 4H), 0.86-0.80 (m, 6H)。LC/MS [M+H] 554.28 (計算值)；LC/MS [M+H] 554.40 (觀測值)。 合成3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]-2-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯基]甲基-甲基-胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯BzL-3k
在25℃下向2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基-4-(甲基胺基甲基)苯基]-N,N-二丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺BzL-3j (0.05 g，90.30 µmol，1當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-側氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯t-BuOOC-PEG10-CHO (52.80 mg，90.30 μmol，1當量)於MeOH (2 mL)中之混合物中添加Et3 N (27.41 mg，270.90 μmol，37.71 μL，3當量)及AcOH (5.42 mg，90.30 μmol，5.16 µL，1當量)及NaBH3 CN (14.19 mg，225.75 µmol，2.5當量)。攪拌混合物12小時。真空濃縮混合物，得到呈黃色油狀之BzL-3k (100mg粗物質)。 合成3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[4-[2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]-2-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基-苯基]甲基-甲基-胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸BzL-3l
向BzL-3k (100 mg，89.09 µmol，1當量)於H2 O (1 mL)中之溶液中添加TFA (203.18 mg，1.78 mmol，131.93 µL，20當量)。在60℃下攪拌混合物12小時。過濾反應混合物，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由製備型HPLC (管柱：Luna C18 100 x 30 5u；液相：[A-TFA/H2 O=0.075% v/v；B-ACN]，B%：20%-45%，10分鐘])純化殘餘物，獲得呈無色油狀之BzL-3l (20 mg，18.38 µmol，產率20.63%，純度97.989%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.39-8.38 (m, 1H), 8.23-8.20 (m, 1H), 7.98-7.96 (m, 1H), 7.83-7.81 (m, 2H), 7.73-7.71 (m, 1H), 7.11 (s, 1H), 4.02-4.00 (m, 2H), 3.94-3.88 (m, 2H), 3.79-3.74 (m, 2H), 3.74-3.40 (m, 45H), 3.40-3.35 (m, 2H), 2.98-2.94 (m, 3H), 2.79-2.71 (m, 2H), 2.56-2.51 (m, 2H), 1.80-1.66 (m, 5H), 0.95 (s, 6H)。LC/MS [M+2H/2] 533.78 (計算值)；LC/MS [M+2H/2] 534.20 (觀測值)。
根據針對BzL-22所述之程序合成1-(4-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)-2-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-2-甲基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十五烷-35-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-3。LC/MS [M+H] 1214.56 (計算值)；LC/MS [M+H] 1214.97 (觀測值)。 實例34 合成BzL-4
Figure 02_image282
根據針對BzL-15所述之程序合成84-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-80-甲基-79-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜-80,84-二氮雜八十七烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-4。LC/MS [M+H] 1888.93 (計算值)；LC/MS [M+H] 1889.53 (觀測值)。 實例35 合成BzL-5
Figure 02_image284
根據針對BZL-26a所述之程序合成(3-(2-胺基-8-(3-(((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)(甲基)胺基甲酸4-((S )-2-((S )-2-((((9H -茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯BzL-5a。
根據針對BzL-26所述之程序合成(3-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)(甲基)胺基甲酸4-((S )-2-((S )-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯BzL-5b。LC/MS [M+H] 945.47 (計算值)；LC/MS [M+H] 945.82 (觀測值)。
根據針對BzL-15所述之程序合成(6S ,9S )-1-胺基-6-((4-((((3-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)(甲基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺甲醯基)-9-異丙基-1,8,11-三側氧基-14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86-二十五氧雜-2,7,10-三氮雜八十九烷-89-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-5。LC/MS [M+2H/2] 1147.57 (計算值)；LC/MS [M+H] 1148.37 (觀測值)。 實例36 合成BzL-13
Figure 02_image286
根據針對BzL-15所述之程序自BzL-13a及TFP-PEG25-TFP合成(6S ,9S )-1-胺基-6-((4-((((2-(1-(5-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-甲醯胺基)吡啶-2-基)哌啶-4-甲醯胺基)乙基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺甲醯基)-9-異丙基-1,8,11-三側氧基-14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86-二十五氧雜-2,7,10-三氮雜八十九烷-89-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-13。LC/MS [M+2H/2] 1165.10 (計算值)；LC/MS [M+H] 1165.91 (觀測值)。 實例37 合成BzL-14
Figure 02_image288
根據針對BzL-15所述之程序自BzL-11及TFP-PEG25-TFP合成(6S ,9S )-1-胺基-6-((4-(((((6-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-甲醯胺基)吡啶-3-基)甲基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺甲醯基)-9-異丙基-1,8,11-三側氧基-14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86-二十五氧雜-2,7,10-三氮雜八十九烷-89-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-14。LC/MS [M+2H/2] 1095.06 (計算值)；LC/MS [M+H] 1095.87 (觀測值)。 實例38 合成BzL-15
Figure 02_image290
合成(6S ,9S )-1-胺基-6-((4-(((((1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺甲醯基)-9-異丙基-1,8,11-三側氧基-14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86-二十五氧雜-2,7,10-三氮雜八十九烷-89-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-15) 合成4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜七十九烷二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯TFP-PEG25-TFP
Figure 02_image292
向小瓶中裝入4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜七十九烷二酸(269 mg，0.221 mmol)、2,3,5,6-四氟苯酚(110 mg，0.662 mmol)、柯林鹼(collidine) (176 µL，1.33 mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(127 mg，0.221 mmol)及3 mL DMF。攪拌反應物16小時，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到266 mg TFP-PEG25-TFP，產率79%。LC/MS [M+H] 1515.68 (計算值)；LC/MS [M+H] 1516.00 (觀測值)。
向小瓶中裝入含BzL-26 (11.9 mg，0.013 mmol)、TFP-PEG25-TFP (19.7 mg，0.013 mmol)、柯林鹼(5.6 µL，0.042 mmol)之300 µL DMF。使反應維持5小時，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到7.7 mg BzL-15，產率26%。LC/MS [M+2H/2] 1132.56 (計算值)；LC/MS [M+2H/2] 1133.30 (觀測值)。 實例39 合成BzL-16
Figure 02_image294
根據針對Bz-31所述之程序自BzL-10及TFP-PEG25-TFP合成1-(1-(5-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-甲醯胺基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)-1,6-二側氧基-9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81-二十五氧雜-2,5-二氮雜八十四烷-84-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-16。LC/MS [M+H] 1924.01 (計算值)；LC/MS [M+H] 1925.23 (觀測值)。 實例40 合成BzL-17
Figure 02_image296
合成2-胺基-N -(5-胺基戊基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺BzL-17a. 向小瓶中裝入Bz-9 (28 mg，0.043 mmol)、300 µL DCM及100 µL三氟乙酸。使反應維持1小時，此後將其在減壓下濃縮。將所得油狀物與1 mL甲苯共沸三次，此後添加1 mL甲醇及K2 CO3 (38 mg，0.28 mmol)。攪拌16小時後，過濾反應物且在減壓下濃縮，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到5.8 mg BzL-17a，產率24%。LC/MS [M+H] 554.28 (計算值)；LC/MS [M+H] 554.47 (觀測值)。
合成86-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-79-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜-80,86-二氮雜八十九烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-17. 向小瓶中裝入含BzL-17a (5.8 mg，0.011 mmol)、TFP-PEG25-TFP (23.8 mg，0.016 mmol)、柯林鹼(5.6 µL，0.042 mmol)之300 µL DMF。使反應維持5小時，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸(TFA)之乙腈:水(ACN:H2O)之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到5.0 mg BzL-17，產率25%。LC/MS [M+H] 1902.95 (計算值)；LC/MS [M+H] 1903.37 (觀測值)。 實例41 合成BzL-18
Figure 02_image298
根據針對BzL-15所述之程序自BzL-18a及TFP-PEG25-TFP合成1-(6-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-甲醯胺基)吡啶-3-基)-3-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧雜-2-氮雜八十一烷-81-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-18。LC/MS [M+H] 1783.92 (計算值)；LC/MS [M+H] 1784.19 (觀測值)。 實例42 合成BzL-19
Figure 02_image300
根據針對BzL-15所述之程序自Bz-14及TFP-PEG25-TFP合成84-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-6-基)-79-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜-80-氮雜八十四烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-19。LC/MS [M+H] 1930.98 (計算值)；LC/MS [M+H] 1931.24 (觀測值)。 實例43 合成BzL-20
Figure 02_image302
根據針對BzL-15所述之程序自TFP-PEG25-TFP與Bz-15之反應合成1-(1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)-3-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧雜-2-氮雜八十一烷-81-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-20。LC/MS [M+H] 1858.92 (計算值)；LC/MS [M+H] 1859.59 (觀測值)。 實例44 合成BzL-21
Figure 02_image304
合成2-胺基-N-[3-[(3-氰基苯基)硫代胺甲醯基胺基]丙基]-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺BzL-21a
在15℃下向2-胺基-N-(3-胺基丙基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-11a (0.1 g，190.24 µmol，1當量)於DMF (2 mL)中之混合物中一次性添加3-異硫氰基苯甲腈(30.48 mg，190.24 µmol，1當量)。在15℃下攪拌混合物3小時。LCMS顯示偵測到所需物質。過濾混合物且藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100x30mm，5um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-60%，10分鐘)純化，獲得呈淺黃色固體狀之2-胺基-N-[3-[(3-氰基苯基)硫代胺甲醯基胺基]丙基]-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺BzL-21a (0.06 g，87.48 μmol，產率45.99%)。 合成3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(Z)-[[3-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基胺基]-(3-氰基苯胺基)亞甲基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯BzL-21b
向BzL-21a (0.06 g，87.48 µmol，1當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯(61.49 mg，104.98 µmol，1.2當量)於DMF (2 mL)中之混合物中添加Et3 N (17.70 mg，174.96 µmol，24.35 µL，2當量)及HgCl2 (28.50 mg，104.98 µmol，5.24 µL，1.2當量)。在15℃下攪拌混合物18小時。LCMS顯示反應物已消耗。過濾混合物且傾倒至水(10 mL)中。用乙酸乙酯(10 mL x 3)萃取水相。濃縮經合併之有機相，得到呈淺黃色油狀之BzL-21b (0.1 g，粗物質)，其未經進一步純化即用於下一步驟中。 合成3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(Z)-[[3-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基胺基]-(3-氰基苯胺基)亞甲基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸BzL-21c
在15℃下向BzL-21b (86.04 mg，69.52 μmol，1當量)於H2 O (10 mL)中之混合物中一次性添加TFA (396.36 mg，3.48 mmol，257.38 μL，50當量)。在85℃下攪拌混合物10分鐘。LCMS顯示反應物已消耗。濃縮混合物。藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100x30mm，5um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%，10分鐘)純化殘餘物，獲得呈白色固體狀之BzL-21c (18 mg，13.71 μmol，產率19.72%，純度90%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.12-8.08 (m, 2H), 7.92 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.84-7.81 (m, 4H), 7.64 (s, 3H), 7.12 (s, 1H), 3.87 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.72-3.70 (m, 9H), 3.63-3.58 (m, 38H), 3.43 -3.41 (m, 6H), 2.62-2.57 (m, 1H), 2.52 (t,J = 6.0 Hz, 2H), 2.04 (s, 2H), 1.75-1.70 (m, 3H), 0.96-0.92 (m, 3H)。
根據針對BzL-22所述之程序合成(Z )-40-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-35-((3-氰基苯基)亞胺基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜-34,36,40-三氮雜四十三烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-21。LC/MS [M+H] 1329.57 (計算值)；LC/MS [M+H] 1329.77 (觀測值)。 實例45 合成BzL-22
Figure 02_image306
Figure 02_image308
合成(R )-2-(((((9H -茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(((1-((3-(2-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺基)-3-側氧基丙烷-1-磺酸BzL-22a.
向小瓶中裝入Bz-15 (14.7 mg，0.024 mmol)、Fmoc-L-半胱胺酸(11.2 mg，0.024 mmol)、柯林鹼(12 µL，0.090 mmol)、HATU (12 mg，0.032 mmol)及500 µL DMF。攪拌反應物直至藉由LCMS顯示Bz-15已消耗。藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化粗混合物。合併經純化之溶離份且凍乾 ，得到8.6 mg BzL-22a，產率41%。LC/MS [M+H] 883.32 (計算值)；LC/MS [M+H] 883.49 (觀測值)。 合成(R )-2-胺基-3-(((1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺基)-3-側氧基丙烷-1-磺酸BzL-22b.
向小瓶中裝入BzL-22a (8.6 mg，0.01 mmol)、二乙胺(10 µL，0.10 mmol)、100 µL乙腈及50 µL DMF。攪拌反應物3小時，接著在減壓下濃縮。將粗反應物與2 mL甲苯共沸三次且繼續進行後續步驟。 合成(R )-1-(1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)-3,6-二側氧基-4-(磺甲基)-9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45-十三氧雜-2,5-二氮雜四十八烷-48-酸BzL-22c
向小瓶中裝入粗BzL-22b (0.01 mmol)、43-((2,5-二氧雜吡咯啶-1-基)氧基)-43-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十三氧雜四十三烷酸(7.7 mg，0.01 mmol)、二異丙基乙胺(5.3 µL，0.03 mmol)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑HOAt CAS登記號39968-33-7 (4 mg，0.03 mmol)及140 µL DMF。攪拌反應物8小時，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾 ，得到8.4 mg BzL-22c，產率64%。LC/MS [M+H] 1333.60 (計算值)；LC/MS [M+H] 1333.69 (觀測值)。 合成(R )-2-(((1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺甲醯基)-4,46-二側氧基-46-(2,3,5,6-四氟苯氧基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43-十三氧雜-3-氮雜四十六烷-1-磺酸BzL-22.
向小瓶中裝入BzL-22c (7.2 mg，0.005 mmol)、2,3,5,6-四氟苯酚(1.8 mg，0.011 mmol)、柯林鹼(2.2 µL，0.016 mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(1 mg，0.005 mmol)及100 µL DMF。攪拌反應物16小時，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾 ，得到5.3 mg BzL-22，產率66%。LC/MS [M+H] 1481.60 (計算值)；LC/MS [M+H] 1481.82 (觀測值)。 實例46 合成BzL-23
Figure 02_image310
合成N-(2-胺基乙基)-1-(5-硝基吡啶-2-基)哌啶-4-甲醯胺BzL-23b
在25℃下向N-[2-[[1-(5-硝基-2-吡啶基)哌啶-4-羰基]胺基]乙基]胺基甲酸三級丁酯BzL-23a (0.5 g，1.27 mmol，1當量)於EtOAc (10 mL)中之混合物中添加HCl/EtOAc (4 M，3.18 mL，10當量)。在25℃下攪拌混合物2小時。LCMS顯示反應完成。真空濃縮反應物，得到呈黃色固體狀之BzL-23b (0.4 g，1.21 mmol，產率95.44%，HCl)。 合成1-(5-硝基吡啶-2-基)-N-(2-(2,2,2-三氟乙醯胺基)乙基)哌啶-4-甲醯胺BzL-23c
在25℃下向N-(2-胺基乙基)-1-(5-硝基-2-吡啶基)哌啶-4-甲醯胺BzL-23b (0.4 g，1.21 mmol，1當量，HCl)於THF (10 mL)中之混合物中添加Et3 N (368.21 mg，3.64 mmol，506.47 µL，3當量)及(2,2,2-三氟乙醯基) 2,2,2-三氟乙酸酯(382.13 mg，1.82 mmol，253.06 µL，1.5當量)。在25℃下攪拌混合物1小時。LCMS顯示所需主要物質。將混合物傾倒至水(50 mL)中。用乙酸乙酯(30 mLx3)萃取水相。用鹽水(30 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。殘餘物直接用於下一步驟，其含有呈黃色固體狀之BzL-23c (0.4 g，1.03 mmol，產率84.71%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 9.37-9.45 (m, 1H), 8.95 (d,J = 2.8 Hz, 1H), 8.19 (dd,J = 9.6, 2.8 Hz, 1H), 8.03 (br t,J = 5.2 Hz, 1H), 6.96 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 4.47-4.53 (m, 2H), 2.99-3.25 (m, 6H), 2.38-2.47 (m, 3H), 1.73-1.80 (m, 2H), 1.41-1.58 (m, 2H) 合成1-(5-胺基吡啶-2-基)-N-(2-(2,2,2-三氟乙醯胺基)乙基)哌啶-4-甲醯胺BzL-23d
在N2 下向1-(5-硝基-2-吡啶基)-N-[2-[(2,2,2-三氟乙醯基)胺基]乙基]哌啶-4-甲醯胺BzL-23c (0.4 g，1.03 mmol，1當量) 於MeOH (30 mL)中之溶液中添加Pd/C (0.5 g，純度5%)。將懸浮液在真空下脫氣且用H2 吹掃數次。在25℃下於H2 (50 psi)下攪拌混合物2小時。TLC顯示反應完成。過濾混合物且真空濃縮，得到呈灰色固體狀之BzL-23d (0.3 g，834.85 μmol，產率81.26%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 9.39-9.46 (m, 1H), 7.97 (t,J = 5.2 Hz, 1H), 7.59 (d,J = 2.8 Hz, 1H), 6.90 (dd,J = 8.8, 2.8 Hz, 1H), 6.64 (d,J = 8.8 Hz, 1H), 3.99 (d,J = 12.8 Hz, 2H), 3.15-3.26 (m, 6H), 2.54-2.63 (m, 2H), 2.16-2.26 (m, 1H), 1.65-1.71 (m, 2H), 1.48-1.60 (m, 2H)
Figure 02_image312
合成(3-(2-胺基-8-溴-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)胺基甲酸三級丁酯BzL-23g
在25℃下向2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸BzL-23f (4.09 g，14.56 mmol，1當量)及N-[3-(丙基胺基)丙基]胺基甲酸三級丁酯(3.78 g，17.47 mmol，1.2當量)於DMF(10 mL)中之混合物中一次性添加HATU (6.64 g，17.47 mmol，1.2當量)及Et3 N (2.95 g，29.12 mmol，4.05 mL，2當量)。在25℃下攪拌混合物1小時。LCMS顯示反應完成。用水稀釋混合物且用EtOAc (50 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/0、0/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之BzL-23g (6 g，12.52 mmol，產率85.95%)。 合成2-胺基-4-[3-(三級丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-甲酸甲酯BzL-23h
在N2 下向N-[3-[(2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羰基)-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯BzL-23g (5 g，10.43 mmol，1當量)於MeOH (50 mL)中之溶液中添加Et3 N (3.17 g，31.29 mmol，4.35 mL，3當量)及Pd(dppf)Cl2 (763.13 mg，1.04 mmol，0.1當量)。將懸浮液在真空下脫氣且用CO (10.43 mmol，1當量)吹掃數次。在80℃下於CO (50psi)下攪拌混合物12小時。LCMS顯示反應完成。過濾混合物且濃縮，得到呈黃色油狀之BzL-23h (7 g，粗物質)。 合成2-胺基-4-((3-((三級丁氧基羰基)胺基)丙基)(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-甲酸BzL-23e
在30℃下向2-胺基-4-[3-(三級丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-甲酸甲酯BzL-23h (6 g，13.08 mmol，1當量)於MeOH (80 mL)中之溶液中一次性添加LiOH (1.25 g，52.34 mmol，4當量)。在30℃下攪拌混合物12小時。LCMS顯示反應完成。在25℃下用HCl水溶液(1 M)將混合物調節至pH 6。濃縮混合物。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex luna C18 250x50mm，10 um (微米)；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%，20分鐘)進一步純化混合物，得到呈黃色油狀之BzL-23e (1.4 g，3.09 mmol，產率23.64%，純度98.23%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ 8.06 (d,J =1.2 Hz, 1H), 8.02 (dd,J =1.6, 8.0 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 3.58-3.44 (m, 4H), 3.37 (s, 2H), 3.10 (m, 2H), 1.85 (m, 2H), 1.71 (m, 2H), 1.51-1.33 (m, 9H), 0.92-0.98 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 445.25 (計算值)；LC/MS [M+H] 445.10 (觀測值)。
Figure 02_image314
合成(3-(2-胺基-N-丙基-8-((6-(4-((2-(2,2,2-三氟乙醯胺基)乙基)胺甲醯基)哌啶-1-基)吡啶-3-基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)胺基甲酸三級丁酯BzL-23i
在25℃下向2-胺基-4-[3-(三級丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-甲酸BzL-23e (200 mg，449.92 µmol，1 當量)、HATU (205.29 mg，539.90 µmol，1.2當量)於DMF (3 mL)中之混合物中添加Et3 N (136.58 mg，1.35 mmol，187.87 µL，3 當量)。在25℃下攪拌混合物5分鐘，接著將1-(5-胺基-2-吡啶基)-N-[2-[(2,2,2-三氟乙醯基)胺基]乙基]哌啶-4-甲醯胺BzL-23d (161.68 mg，449.92 μmol，1當量)添加至混合物中，攪拌30分鐘。LCMS顯示所需主要物質。將混合物傾倒至水(50mL)中。用乙酸乙酯(50 mL)萃取水相。用鹽水(50 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮，得到呈黃色油狀之BzL-23i (0.3 g，381.75 µmol，產率84.85%)。 合成(3-(2-胺基-8-((6-(4-((2-胺基乙基)胺甲醯基)哌啶-1-基)吡啶-3-基)胺甲醯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)胺基甲酸三級丁酯BzL-23
在25℃下向N-[3-[[2-胺基-8-[[6-[4-[2-[(2,2,2-三氟乙醯基)胺基]乙基胺甲醯基]-1-哌啶基]-3-吡啶基]胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯BzL-23i (0.25 g，318.13 μmol，1當量)於MeOH (10 mL)中之混合物中添加含LiOH.H2 O (40.05 mg，954.38 μmol，3當量)之H2 O (1 mL)。在40℃下攪拌混合物12小時。LCMS顯示所需主要物質。真空濃縮混合物。藉由製備型HPLC管柱純化殘餘物：Nano-micro Kromasil C18 100x30mm 5um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-45%，10分鐘，得到呈白色固體狀之BzL-23 (45 mg，65.23 µmol，產率20.51%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.73 (d,J = 2.4 Hz, 1H), 8.24 (dd,J = 9.8, 2.4 Hz, 1H), 7.75 (br s, 1H), 7.45 (d,J = 9.8 Hz, 1H), 7.15 (br s, 1H), 4.24 (br d,J = 13.6 Hz, 2H), 3.35-3.62 (m, 9H), 3.05-3.12 (m, 4H), 2.59-2.72 (m, 1H), 1.99-2.09 (m, 2H), 1.65-1.94 (m, 6H), 1.45 (s, 9H), 0.90-0.98 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 690.41 (計算值)；LC/MS [M+H] 690.40 (觀測值)。 實例47 合成BzL-24
Figure 02_image316
Figure 02_image318
根據針對BzL-26a所述之程序自Bz-14合成(4-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-6-基)丁基)胺基甲酸4-((S )-2-((S )-2-((((9H -茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯BzL-24a。LC/MS [M+H] 1209.58 (計算值)；LC/MS [M+H] 1209.85 (觀測值)。
根據針對BzL-26所述之程序合成(4-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-6-基)丁基)胺基甲酸4-((S )-2-((S )-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯BzL-24b。LC/MS [M+H] 987.51 (計算值)；LC/MS [M+H] 987.75 (觀測值)。
根據針對BzL-15所述之程序合成(6S ,9S )-1-胺基-6-((4-((((4-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-6-基)丁基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺甲醯基)-9-異丙基-1,8,11-三側氧基-14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86-二十五氧雜-2,7,10-三氮雜八十九烷-89-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-24。LC/MS [M+2H/2] 1168.59 (計算值)；LC/MS [M+2H/2] 1169.36 (觀測值)。 實例48 合成BzL-26
Figure 02_image320
合成((S)-1-(((S)-1-((4-(((((1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯BzL-26a
在15℃下於N2 下向碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]-5-脲基-戊醯基]胺基]苯基]甲酯(4-硝基苯基)酯(200 mg，260.83 μmol，1當量)於DMF (1 mL)中之溶液中添加2-胺基-8-[3-[3-(胺基甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N,N-二丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-15 (325.35 mg，521.65 µmol，2當量，TFA)及DIPEA (67.42 mg，521.65 µmol，90.86 µL，2當量)於DMF(1 mL)中之溶液。在15℃下攪拌混合物1小時。過濾混合物。藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100 x 30mm 5um；液相：[A-TFA/H2O=0.1% v/v；B-ACN] B%：30%-60%，12分鐘])純化殘餘物，得到呈白色固體狀之N-[[1-[3-[2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]-5-脲基-戊醯基]胺基]苯基]甲酯BzL-26a (73 mg，63.07 µmol，產率24.18%，純度98.259%)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ 8.05-8.09 (m, 1H), 7.92-7.98 (m, 1H), 7.84-7.90 (m, 1H), 7.58-7.83 (m, 8H), 7.46-7.57 (m, 2H), 7.33-7.42 (m, 2H), 7.25-7.33 (m, 2H), 7.11-7.23 (m, 2H), 7.04-7.09 (m, 1H), 4.87-4.94 (m, 2H), 4.46-4.56 (m, 1H), 4.31-4.45 (m, 2H), 4.16-4.26 (m, 1H), 3.95 (br d,J = 7.0 Hz, 1H), 3.85 (br t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.52-3.63 (m, 2H), 3.46 (br d,J = 2.0 Hz, 4H), 3.35 (s, 3H), 3.15-3.23 (m, 1H), 3.01-3.13 (m, 3H), 2.58-2.71 (m, 1H), 2.00-2.16 (m, 1H), 1.84-1.96 (m, 1H), 1.64-1.77 (m, 4H), 1.49-1.62 (m, 2H), 0.75-1.09 (m, 12H) LC/MS [M+H] 1137.52 (計算值)；LC/MS [M+H] 1137.10 (觀測值)。 合成((1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯BzL-26
Figure 02_image322
在25℃下向N-[[1-[3-[2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸[4-[[(2S)-2- [[(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]-5-脲基-戊醯基]胺基]苯基]甲酯BzL-26a (0.12 g，105.51 µmol，1當量)於DMF (2 mL)中之溶液中添加哌啶(44.92 mg，527.54 µmol，52.10 µL，5當量)且攪拌1小時。過濾反應混合物且濃縮濾液。藉由製備型HPLC (管柱：Welch Xtimate C18 100 x 25mm x 3um；移動相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B%：25%-65%，12分鐘)純化殘餘物。獲得呈黃色固體狀之化合物N-[[1-[3-[2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-8-基]苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-胺基-3-甲基-丁醯基]胺基]-5-脲基-戊醯基]胺基]苯基]甲酯BzL-26 (0.037 g，38.51 μmol，產率36.50%，純度95.25%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.06 (s, 1H), 7.98 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 7.82 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 7.74 (t,J = 7.4 Hz, 1H), 7.54 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 7.50-7.43 (m, 2H), 7.38 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.23 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 6.90 (s, 1H), 4.95-4.90 (m, 2H), 4.62-4.54 (m, 2H), 3.84 (t,J = 8.2 Hz, 2H), 3.56 (t,J = 4.2 Hz, 2H), 3.44 (t,J = 4.0 Hz, 4H), 3.23 (d,J = 5.2 Hz, 2H), 3.14-3.03 (m, 2H), 2.68-2.62 (m, 1H), 2.04-1.99 (m, 2H), 1.92-1.84 (m, 2H), 1.79-1.47 (m, 8H), 1.08-0.75 (m, 12H)。LC/MS [M+H] 915.46 (計算值)；LC/MS [M+H] 915.10 (觀測值)。 實例49 合成BzL-27
Figure 02_image324
根據針對Bz-31所述之程序自BzL-23及TFP-PEG25-TFP合成1-(1-(5-(2-胺基-4-((3-((三級丁氧基羰基)胺基)丙基)(丙基)胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-甲醯胺基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)-1,6-二側氧基-9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81-二十五氧雜-2,5-二氮雜八十四烷-84-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-27。LC/MS [M+H] 2039.07 (計算值)；LC/MS [M+H] 2039.40 (觀測值)。 實例50 合成BzL-28.
Figure 02_image326
Figure 02_image328
合成3,5-二溴苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28b
在0℃下向N-甲基胺基甲酸三級丁酯(2.5 g，19.06 mmol，1當量)於DMF (80 mL)中之溶液中緩慢添加NaH (914.82 mg，22.87 mmol，純度60%，1.2當量)。添加後，在15℃下攪拌混合物30分鐘，接著在0℃下添加1,3-二溴-5-(溴甲基)苯BzL-28a (8.77 g，26.68 mmol，1.4當量)。在15℃下攪拌所得混合物2小時。TLC指示反應物完全消耗。藉由在0℃下添加NH4 Cl水溶液(250 mL)淬滅反應混合物，接著用EtOAc (100 mL x 3)萃取。用鹽水(30 mL x 3)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚:乙酸乙酯 = 1:0至5: 1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之BzL-28b (6.6 g，17.41 mmol，產率91.35%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 7.59-7.56 (m, 1H), 7.31 (s, 2H), 4.36 (s, 2H), 2.87 (s, 3H), 1.49 (s, 9H)。 合成3-(苯甲硫基)-5-溴苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28c
在-78℃下於N2 下向3,5-二溴苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28b (3.6 g，9.50 mmol，1當量)於THF (70 mL)中之溶液中逐滴添加n-BuLi (2.5 M，3.80 mL，1當量)。添加後，在-78℃下攪拌混合物15分鐘，接著在-78℃下添加硫S (304.55 mg，9.50 mmol，1當量)。添加後，在-78℃下攪拌混合物45分鐘，接著在-78℃下添加溴甲基苯(1.62 g，9.50 mmol，1.13 mL，1當量)。將所得混合物升溫至15℃且在15℃下攪拌30分鐘。TLC指示BzL-28b完全消耗。藉由在0℃下添加NH4 Cl水溶液(70 mL)淬滅反應混合物，接著用EtOAc (50 mL x 3)萃取。用鹽水(20 mL)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚:乙酸乙酯 = 1:0至5:1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之BzL-28c (0.97 g，2.30 mmol，產率24.18%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 7.35-7.26 (m, 5H), 7.26-7.21 (m, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 4.34 (s, 2H), 4.12 (s, 2H), 2.79 (s, 3H), 1.48 (s, 9H)。 合成3-溴-5-(氯磺醯基)苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28d
在0℃下向3-(苯甲硫基)-5-溴苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28c (1.22 g，2.89 mmol，1當量)於CH3 CN (25 mL)及H2 O (1 mL)及乙酸AcOH (520.35 mg，8.67 mmol，495.57 µL，3當量)中之溶液中添加1,3-二氯-5,5-二甲基-咪唑啶-2,4-二酮DCDMH (1.14 g，5.78 mmol，2當量)。在0℃下攪拌混合物1小時。TLC指示BzL-28c完全消耗。在減壓下濃縮反應混合物，得到殘餘物。用H2 O (20 mL)稀释殘餘物且用EtOAc (20 mL x 3)萃取。用鹽水(10 mL)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚:乙酸乙酯 = 1:0至5:1)純化殘餘物，得到呈淺黃色油狀之BzL-28d (0.51 g，1.28 mmol，產率44.29%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 8.08 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 4.50 (s, 2H), 2.91 (s, 3H), 1.49 (s, 9H)。 合成3-溴-5-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28e
在0℃下向3-溴-5-(氯磺醯基)苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28d (0.74 g，1.86 mmol，1當量)及氮雜環丁-3-基甲醇(746.66 mg，3.71 mmol，2當量，TFA)於DCM (15 mL)中之溶液中添加TEA (751.25 mg，7.42 mmol，1.03 mL，4當量)。在15℃下攪拌混合物1小时。TLC指示反應物1完全消耗。藉由在0℃下添加H2 O (15 mL)淬滅反應混合物，接著用EtOAc (15 mL x 3)萃取。用鹽水(10 mL)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物，藉由管柱層析(SiO2 ，石油醚:乙酸乙酯 = 10:1至0: 1)純化，得到呈淺黃色油狀之BzL-28e (640 mg，1.42 mmol，產率76.74%)。1 H NMR (CDCl3 , 400 MHz) δ 7.90 (s, 1H), 7.69-7.53 (m, 2H), 4.48 (s, 2H), 3.89 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.64 (d,J = 6.0 Hz, 3H), 3.42 (s, 1H), 2.95 (s, 3H), 2.65 (s, 1H), 1.49 (s, 9H)。 合成3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)-5-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28g
将3-溴-5-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28e (590 mg，1.31 mmol，1當量)、2-胺基-N,N-二丙基-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺BzL-28f (702.11 mg，1.71 mmol，1.3當量)、Pd(dppf)Cl2 (48.0 mg，65.7 µmol，0.05當量)、K2 CO3 (362.9 mg，2.63 mmol，2當量)於二噁烷(10 mL)及H2 O (1 mL)中之混合物脫氣且用N2 吹掃3次，接著在90℃下於N2 氛圍下攪拌混合物3小时。過濾反應混合物且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由製備型HPLC (TFA條件：管柱：Nano-micro Kromasil C18 100x30mm，5um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：40%-60%，10分钟)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之BzL-28g (180 mg，275.30 µmol，產率20.97%)。 合成2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)-5-((甲基胺基)甲基)苯基)-N,N-二丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺BzL-28h
在15℃下向3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)-5-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯甲基(甲基)胺基甲酸三級丁酯BzL-28g (180 mg，275.30 µmol，1當量)於DCM (2 mL)中之溶液中添加TFA (627.80 mg，5.51 mmol，407.66 µL，20當量)。在15℃下攪拌混合物1小時。LC-MS顯示反應物1已消耗。在減壓下濃縮反應混合物，得到殘餘物。在0℃下向殘餘物中添加THF (5 mL)及NaHCO3 水溶液(5 mL)以達到pH 8-9，接著在15℃下攪拌30分鐘。在減壓下濃縮反應混合物，得到殘餘物，且用EtOAc (10 mL x 3)萃取。用鹽水(5 mL)洗滌經合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到呈黃色油狀之BzL-28h (110 mg，198.66 µmol，產率72.16%)。LC/MS [M+H] 554.28 (計算值)；LC/MS [M+H] 554.30 (觀測值)。 合成1-(3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)-5-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-2-甲基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十五烷-35-酸甲酯BzL-28i
在15℃下向2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)-5-((甲基胺基)甲基)苯基)-N,N-二丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺BzL-28h (110 mg，198.66 µmol，1當量)及1-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十三烷-33-酸甲酯(140.13 mg，258.26 µmol，1.3當量)於MeOH (2 mL)中之溶液中添加AcOH (11.93 mg，198.66 µmol，11.36 µL，1當量)。添加後，在15℃下攪拌混合物15分鐘，接著在15℃下添加NaBH3 CN (24.97 mg，397.32 μmol，2當量)。在15℃下攪拌所得混合物12小時。反應混合物直接用於下一步驟，其含有呈淺黃色液體狀之BzL-28i (0.22 g，粗物質) (於MeOH中)。LC/MS [M+2H/2] 540.79 (計算值)；LC/MS [M+H] 541.1 (觀測值)。 合成1-(3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)-5-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-2-甲基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十五烷-35-酸BzL-28j
在15℃下向1-(3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)-5-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-2-甲基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十五烷-35-酸甲酯BzL-28i (0.22 g，203.64 μmol，1當量)於MeOH (2 mL)及H2 O (1 mL)中之溶液中添加LiOH.H2 O (68.36 mg，1.63 mmol，8當量)。在15℃下攪拌混合物5小時。LC-MS顯示BzL-28i已消耗。在0℃下用1 N HCl將反應混合物調節至pH 6-7，接著在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (TFA條件：管柱：Welch Xtimate C18 100x25mm，3um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-40%，12分鐘)純化殘餘物兩次，得到呈淺黃色油狀之BzL-28j (104 mg，94.31 µmol，產率46.31%，HCl)。1 H NMR (MeOD-d4 , 400 MHz) δ 8.33 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.90-7.84 (m, 2H), 7.74 (d,J = 8.8 Hz, 1H), 7.12 (s, 1H), 3.96-3.88 (m, 4H), 3.76-3.67 (m, 8H), 3.66-3.52 (m, 33H), 3.51-3.37 (m, 9H), 3.02 (s, 3H), 2.71-2.59 (m, 1H), 2.53 (t,J = 6.0 Hz, 2H), 1.77-1.63 (m, 4H), 0.95 (br s, 6H)。LC/MS [M+H] 1066.56 (計算值)；LC/MS [M+H] 1066.10 (觀測值)。
根據針對BzL-22所述之程序藉由與2,3,5,6-四氟苯酚反應來合成1-(3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)-5-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-2-甲基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十五烷-35-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-28。LC/MS [M+H] 1214.56 (計算值)；LC/MS [M+H] 1214.83 (觀測值)。 實例51 合成BzL-29.
Figure 02_image330
合成(Z )-40-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-6-基)-35-((3-氰基苯基)亞胺基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜-34,36-二氮雜四十烷酸三級丁酯BzL-29a
向4 mL小瓶中裝入1-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十三烷-33-酸三級丁酯(0.011 mmol，6.9 mg)、三苯膦(0.011 mmol，3 mg)及200 µL無水二氯甲烷。在30℃下使反應維持90分鐘，屆時添加異氰酸3-氰基苯酯(0.011 mmol，1.6 mg)。45分鐘後，添加含有Bz-14 (0.011 mmol)及二異丙基乙胺休格氏鹼(Hunig base) (0.034 mmol)於200 µL DMF中之溶液。使反應維持2小時，接著在減壓下濃縮。使用逆相製備型HPLC利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度純化粗反應物。合併經純化之溶離份且凍乾，得到4.1mg BzL-29a，產率63%。LC/MS [M+H] 1293.71 (計算值)；LC/MS [M+H] 1294.04 (觀測值)。 合成(Z )-40-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-6-基)-35-((3-氰基苯基)亞胺基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜-34,36-二氮雜四十烷酸BzL-29b
向小瓶中裝入BzL-29a (4.1 mg，0.003 mmol)、500 µL DCM及100 µL三氟乙酸。使反應維持1小時，在減壓下濃縮，且與1 mL甲苯共沸三次。粗產物BzL-29b繼續進行後續步驟。
根據針對Bz-22所述之程序藉由BzL-29b與2,3,5,6-四氟苯酚反應來合成(Z )-40-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-6-基)-35-((3-氰基苯基)亞胺基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜-34,36-二氮雜四十烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-29。LC/MS [M+H] 1385.64 (計算值)；LC/MS [M+H] 1385.84 (觀測值)。 實例52 合成BzL-31
Figure 02_image332
Figure 02_image334
合成三乙酸外消旋 -(2R ,3S ,4R ,5R ,6R )-2-(2-(3-((((9H -茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-(((((1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H -哌喃-3,4,5-三基酯BzL-31b
向Bz-15 (50 mg，0.098 mmol，1當量)及三乙酸外消旋-(2R,3S,4R,5R,6R)-2-(2-(3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三基酯BzL-31a (90 mg，0.098 mmol，1當量)於DMF (0.2 ml)中之溶液中添加HOAt (13.3 mg，0.098 mmol，1當量)。在周圍溫度下攪拌反應物且藉由LCMS監測。用1:1水:乙腈稀釋反應混合物且藉由HPLC純化，得到BzL-31b (67 mg，0.052 mmol，53%)。LC/MS [M+H] 1284.48 (計算值)；LC/MS [M+H] 1284.81 (觀測值)。 合成外消旋 -(2R ,3R ,4R ,5S ,6R )-6-(4-(((((1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺甲醯基)氧基)甲基)-2-(3-胺基丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H -哌喃-2-甲酸BzL-31c
將BzL-31b (67 mg，0.052 mmol，1當量)溶解於20 mM LiOH於5:2:1 THF:MeOH:H2 O (2.6 ml)中之溶液中。在周圍溫度下攪拌反應物1小時，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到呈白色固體狀之BzL-31c (25 mg，0.027 mmol，52%)。LC/MS [M+H] 922.37 (計算值)；LC/MS [M+H] 922.56 (觀測值)。
Figure 02_image336
根據針對TFP-PEG25-TFP所述之程序自4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜三十四烷二酸合成4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜三十四烷二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯。LC/MS [M+H] 855.28 (計算值)；LC/MS [M+H] 855.53 (觀測值)。 合成外消旋 -(2R ,3R ,4R ,5S ,6R )-6-(4-(((((1-((3-(2-胺基-4-(二丙基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺甲醯基)氧基)甲基)-2-(1,34-二側氧基-1-(2,3,5,6-四氟苯氧基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜-35-氮雜三十八烷-38-醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H -哌喃-2-甲酸BzL-31
將BzL-31c (25 mg，0.027 mmol，1當量)及TFP-PEG10-TFP 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜三十四烷二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(35 mg，0.040 mmol，1.5當量)溶解於DMF (5 ml)中。用DIPEA將反應物中和至約pH 7且加熱至70℃。1小時後，將另一份4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜三十四烷二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(35 mg，0.040 mmol，1.5 當量)添加至反應混合物中。BzL-31c消耗後，將反應物濃縮成黃色膜狀物，接著用6 x 3 ml乙醚濕磨，得到黃色固體，藉由HPLC純化，得到BzL-31 (14.3 mg，0.0089 mmol，33%)。LC/MS [M+H] 1610.64 (計算值)；LC/MS [M+H] 1610.99 (觀測值)。 實例53 合成BzL-33
Figure 02_image338
向小瓶中裝入4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜七十九烷二酸(269 mg，0.221 mmol)、2,3,5,6-四氟苯酚(110 mg，0.662 mmol)、柯林鹼(176 µL，1.33 mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(127 mg，0.221 mmol)及3 mL DMF。攪拌反應物16小時，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到266 mg 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜七十九烷二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯TFP-PEG25-TFP，產率79%。LC/MS [M+H] 1515.68 (計算值)；LC/MS [M+H] 1516.00 (觀測值)。
向小瓶中裝入含2-胺基-N-(3-胺基丙基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺Bz-17 (0.0275 mmol)、TFP-PEG25-TFP (0.0275 mmol)、柯林鹼(0.0825 mmol)之300 µL DMF。使反應維持5小時，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到8.2 mg 84-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H-苯并[b]氮呯-4-羰基)-79-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜-80,84-二氮雜八十七烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-33，產率25%。LC/MS [M+H] 1874.9 (計算值)；LC/MS [M+H] 1874.9 (觀測值)。 實例54 合成BzL-34
Figure 02_image340
Figure 02_image342
Figure 02_image344
Figure 02_image346
Figure 02_image348
製備BzL-34b：在15℃下於N2 下向N-[3-[(2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羰基)-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯BzL-34a (0.80 g，1.67 mmol，1.0當量)於二噁烷(10 mL)中之混合物中一次性添加4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-雙(1,3,2-二氧雜硼烷)、Pin2 B2 (509 mg，2.00 mmol，1.2當量)、KOAc (246 mg，2.50 mmol，1.5當量)及Pd(dppf)Cl2 (122 mg，167 umol，0.1當量)，接著在90℃下攪拌12小時。過濾混合物且濃縮，得到呈黑色固體狀之N-[3-[[2-胺基-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯BzL-34b (0.90 g，粗物質)。
製備BzL-34c：在15℃下於N2 下向[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲胺(0.40 g，1.17 mmol，1當量，HCl)及BzL-34b (493 mg，937 umol，0.8當量)於二噁烷(4 mL)中之混合物中添加K2 CO3 (728 mg，5.27 mmol，4.5當量)於H2 O (0.4 mL)及Pd(dppf)Cl2 (85.7 mg，117 umol，0.1當量)中之溶液，接著在90℃下攪拌2小時。過濾混合物且濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Welch Xtimate C18 100*25mm*3um；移動相：[水(0.1% TFA)-ACN]；B%：20%-45%，10.5分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-(胺基甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯BzL-34c (0.223 g，357 umol，產率30.5%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ8.14-8.07 (m, 2H), 7.92 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.86-7.81 (m, 1H), 7.79-7.70 (m, 3H), 7.12 (s, 1H), 3.96 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.65 (dd,J = 5.2, 8.4 Hz, 2H), 3.58-3.42 (m, 4H), 3.37 (s, 2H), 3.06 (d,J = 7.2 Hz, 4H), 1.90-1.78 (m, 2H), 1.74-1.64 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 0.96-0.90 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 625.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 625.0 (觀測值)。
製備BzL-34d：在15℃下向BzL-34c (0.18 g，288 umol，1.0當量)及碳酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]-5-脲基-戊醯基]胺基]苯基]甲酯(4-硝基苯基)酯(176.7 mg，230 umol，0.8當量)於DMF (2 mL)中之混合物中一次性添加DIEA (74.5 mg，576 umol，100 uL，2.0當量)。在相同溫度下攪拌混合物0.5小時。接著將其過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Welch Xtimate C18 150*25mm*5um；移動相：[水(10mM NH4 HCO3 )-ACN]；B%：55%-75%，10.5分鐘)純化，得到呈黃色固體狀之N-[[1-[3-[2-胺基-4-[3-(三級丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]-5-脲基-戊醯基]胺基]苯基]甲酯BzL-34d (0.024 g，19.16 umol，產率6.65%)。1 H NMR (MeOH,400MHz) δ8.04 (s, 1H), 7.95 (d,J = 6.4 Hz, 1H), 7.81-7.79 (m, 3H), 7.73 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.65 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 7.54 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.48-7.43 (m, 2H), 7.41-7.33 (m, 3H), 7.32-7.27 (m, 2H), 7.20 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 6.91 (s, 1H), 4.59 (s, 2H), 4.52 (s, 1H), 4.42-4.32 (m, 2H), 4.24-4.17 (m, 1H), 3.95 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 3.86-3.77 (m, 2H), 3.58-3.47 (m, 4H), 3.46-3.39 (m, 2H), 3.19-3.02 (m, 6H), 2.62 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 2.13-2.01 (m, 1H), 1.97-1.80 (m, 3H), 1.66 (s, 3H), 1.57 (s, 2H), 1.49-1.28 (m, 8H), 1.00-0.95 (m, 10H)。LC/MS [M+H] 1252.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1252.2 (觀測值)。
製備BzL-34e：向小瓶中裝入Bz-34d (20 mg，0.016 mmol)、二乙胺(0.08 mmol)及150 µL DMF。使反應維持6小時，接著在減壓下濃縮，得到((1-((3-(2-胺基-4-((3-((三級丁氧基羰基)胺基)丙基)(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯BzL-34e，其未經進一步純化即用於後續步驟中。
製備BzL-34：使用針對BzL-33所述之程序，獲得(6S,9S)-1-胺基-6-((4-(((((1-((3-(2-胺基-4-((3-((三級丁氧基羰基)胺基)丙基)(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)甲基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺甲醯基)-9-異丙基-1,8,11-三側氧基-14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86-二十五氧雜-2,7,10-三氮雜八十九烷-89-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-34。LC/MS [M+H] 2379.2 (計算值)；LC/MS [M+2H/2] 1190.1 (觀測值)。 實例55 合成BzL-35
Figure 02_image350
製備BzL-35a：將(3-(2-胺基-8-(3-((3-(胺基甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺基)丙基)胺基甲酸三級丁酯BzL-34c (0.04 g，0.064 mmol，1當量)及79-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)-79-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜七十九烷酸(0.084 mg，0.064 mmol，1當量)與二異丙基乙胺(0.033 ml，0.192 mmol，3當量)一起溶解於DMF中。藉由LCMS監測反應且藉由HPLC純化，得到1-(1-((3-(2-胺基-4-((3-((三級丁氧基羰基)胺基)丙基)(丙基)胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)-3-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧雜-2-氮雜八十一烷-81-酸BzL-35a (0.056，0.031 mmol，48%)。LC/MS [M+H] 1825.99 (計算值)；LC/MS [M+H] 1826.24 (觀測值)。
製備BzL-35：將BzL-35a (0.060 g，0.033 mmol，1當量)及2,3,5,6-四氟苯酚TFP (0.011 g，0.065 mmol，2當量)溶解於1 ml DMF中。添加柯林鹼2,4,6-三甲基吡啶(0.022 ml，0.16 mmol，5當量)，繼而添加N -(3-二甲基胺基丙基)-N '-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC-HCl CAS登記號25952-53-8 (0.019 g，0.098 mmol，3當量)。在室溫下攪拌反應物且藉由LCMS監測，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到1-(1-((3-(2-胺基-4-((3-((三級丁氧基羰基)胺基)丙基)(丙基)胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)-3-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78-二十五氧雜-2-氮雜八十一烷-81-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-35 (0.027 g，0.014 mmol，42%)。LC/MS [M+H] 1973.98 (計算值)；LC/MS [M+H] 1974.62 (觀測值)。 實例56 合成BzL-36：
Figure 02_image352
Figure 02_image354
Figure 02_image356
Figure 02_image358
Figure 02_image360
製備BzL-36b：向小瓶中裝入1-羥基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四氧雜七十五烷-75-酸三級丁酯BzL-36a (148 mg，0.123 mmol)、二異丙基乙胺(0.369 mmol)及0.6 mL無水DMF。將小瓶冷卻至0℃，接著逐份添加氯甲酸4-硝基苯酯(0.123 mmol)。將反應物升溫至室溫且維持3小時，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到42.5 mg 1-(4-硝基苯氧基)-1-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74-二十五氧雜七十七烷-77-酸三級丁酯BzL-36b。LC/MS [M+H] 1368.7 (計算值)；LC/MS [M+H] 1368.7 (觀測值)。
製備BzL-36c：向小瓶中裝入Bz-17 (0.0275 mmol)、BzL-36b (0.0275 mmol)、HOAT (0.02 mmol)、二異丙基乙胺(0.0825 mmol)、250 µL DCM及250 µL DMF。維持反應直至藉由LCMS顯示所有起始物質皆消耗。藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化粗反應物。合併經純化之溶離份且凍乾 ，得到22.5 mg 82-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H-苯并[b]氮呯-4-羰基)-77-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜-78,82-二氮雜八十五烷酸三級丁酯BzL-36c。LC/MS [M+H] 1754.9 (計算值)；LC/MS [M+H] 1754.9 (觀測值)。
製備BzL-36d：向小瓶中裝入BzL-36c (0.0128 mmol)、1 mL DCM及0.2 mL三氟乙酸。使反應維持3小時，接著在減壓下濃縮。將所得殘餘物與甲苯共沸三次，得到82-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H-苯并[b]氮呯-4-羰基)-77-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜-78,82-二氮雜八十五烷酸BzL-36d，其立即用於後續步驟中。
製備BzL-36：向小瓶中裝入BzL-36d (8.9 mg，0.005 mmol)、2,3,5,6-四氟苯酚(1.8 mg，0.011 mmol)、柯林鹼(2.2 µL，0.016 mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(1 mg，0.005 mmol)及100 µL DMF。攪拌反應物6小時，接著藉由利用含有0.1%三氟乙酸之乙腈:水之25-75%梯度進行逆相製備型HPLC來純化。合併經純化之溶離份且凍乾，得到6.3 mg 82-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H-苯并[b]氮呯-4-羰基)-77-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜-78,82-二氮雜八十五烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-36。LC/MS [M+H] 1846.9 (計算值)；LC/MS [M+H] 1846.9 (觀測值)。 實例57 合成BzL-37
Figure 02_image362
Figure 02_image364
製備BzL-37a：將(3-(3-(苯甲基(丙基(胺基)丙氧基)丙基)胺基甲酸三級丁酯(0.032 g，0.088 mmol，1當量)溶解於THF中。添加氫化鋰鋁(0.01 g，0.26 mmol，3當量)且將反應物加熱至60℃。濃縮反應物且藉由HPLC純化，得到N -苯甲基-3-(3-(甲基胺基)丙氧基)-N -丙基丙-1-胺BzL-37a (0.01 g，0.036 mmol，41%)。LC/MS [M+H] 279.24 (計算值)；LC/MS [M+H] 279.33 (觀測值)。
製備BzL-37c：將BzL-37a (0.01 g，0.036 mmol，1當量)及1-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十三烷-33-酸酯BzL-37b (0.02 g，0.036 mmol，1當量)溶解於DCM中。添加三乙醯氧基硼氫化鈉STAB (0.022 g，0.11 mmol，3當量)且在室溫下攪拌反應物。濃縮溶液且藉由HPLC純化。將經純化之產物與三乙胺一起溶於甲醇中。添加甲酸，繼而添加10 wt% Pd/C，且將反應物加熱至60℃。起始物質消耗後，過濾反應混合物且濃縮，得到34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,38-十一氧雜-34,42-二氮雜四十五烷酸三級丁酯BzL-37c (0.007 g，0.0092 mmol，26%)。LC/MS [M+H] 757.74 (計算值)；LC/MS [M+H] 757.85 (觀測值)。
製備BzL-37d：將2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b]氮呯-4-甲酸Bz-21d (0.0040 g，0.0092 mmol，1當量)、BzL-37c (0.007 g，0.0092 mmol，1當量)及柯林鹼(0.004 ml，0.028 mmol，3當量)溶解於DMF中。添加PyAOP (0.0072 g，0.014 mmol，1.5當量)且在室溫下攪拌混合物。完成時，濃縮反應混合物且藉由RP-HPLC純化。濃縮經分離之產物，溶解於最少量之TFA中，且在室溫下靜置15分鐘。接著濃縮溶液且藉由RP-HPLC純化，得到42-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b]氮呯-4-羰基)-34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,38-十一氧雜-34,42-二氮雜四十五烷酸BzL-37d (0.004 g，0.0036 mmol，39%)。LC/MS [M+H] 1110.59 (計算值)；LC/MS [M+H] 1110.93 (觀測值)。
製備 BzL-37：將BzL-37d (0.004 g，0.0036 mmol，1當量)及TFP (0.0033 g，0.018 mmol，5當量)溶解於1 ml DMF中。添加柯林鹼(0.005 ml，0.036 mmol，10當量)，繼而添加EDC-HCl (0.0035 g，0.018 mmol，5當量)。在室溫下攪拌反應物且藉由LCMS監測，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到42-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b]氮呯-4-羰基)-34-甲基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,38-十一氧雜-34,42-二氮雜四十五烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-37 (0.0016 g，0.0013 mmol，35%)。LC/MS [M+H] 1258.58 (計算值)；LC/MS [M+H] 1258.96 (觀測值)。 實例58 合成BzL-38
Figure 02_image366
Figure 02_image368
製備BzL-38a：使用與合成BzL-42所述相同之方法製備此物質。LC/MS [M+H] 1265.7 (計算值)；LC/MS [M+H] 1265.7 (觀測值)。
製備BzL-38b：使用與合成BzL-42所述相同之方法製備此物質。LC/MS [M+H] 1209.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1209.6 (觀測值)。
製備BzL-38：使用與合成BzL-42所述相同之方法製備此物質。LC/MS [M+H] 1357.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1357.6 (觀測值)。 實例59 合成BzL-39
Figure 02_image370
製備BzL-39b：向N-[[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸三級丁酯BzL-39a (1.0 g，2.47 mmol，1.0當量)於DMF (10 mL)中之溶液中逐份添加氫化鈉NaH (148 mg，3.70 mmol，純度60%，1.5當量)且在0℃下攪拌0.5小時。接著添加碘甲烷CH3 I (1.05 g，7.40 mmol，461 uL，3.0當量)，接著在25℃下攪拌1小時。用水淬滅反應物且用EtOAc (30 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮，得到呈黃色油狀之N-[[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸三級丁酯BzL-39b (1.3 g，粗物質)。1 H NMR (CDCl3 , 400MHz) δ7.99 (t,J = 2.0 Hz, 1H), 7.80-7.75 (m, 2H), 7.47 (t,J = 8.0 Hz, 1H), 3.85 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 3.57 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 3.29 (d,J = 7.2 Hz, 2H), 2.75 (s, 3H), 2.74-2.70 (m, 1H), 1.43 (s, 9H), 1.26 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。
製備BzL-39c：在25℃下向BzL-39b (1.3 g，3.10 mmol，1.0當量)於MeOH (20 mL)中之溶液中添加乙醯氯(1.22 g，15.5 mmol，1.11 mL，5.0當量)且在50℃下攪拌1小時。接著濃縮混合物，得到呈白色固體狀之1-[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]-N-甲基-甲胺BzL-39c (1 g，粗物質)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ 8.00-7.98 (m, 1H), 7.93 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.84 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.64-7.59 (m, 1H), 3.94 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.64 (dd,J = 5.6, 8.4 Hz, 2H), 3.14 (d,J = 7.6 Hz, 2H), 2.84-2.77 (m, 1H), 2.66 (s, 3H)。
製備BzL-39d：在15℃下於N2 下向N-[3-[[2-胺基-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯(0.44 g，835 umol，1.0當量)及Bzl-39c (357 mg，1.00 mmol，1.2當量，HCl)於二噁烷(4 mL)及H2 O (0.5 mL)中之混合物中添加Pd(dppf)Cl2 (30.6 mg，41.79 umol，0.05當量)及K2 CO3 (231.0 mg，1.67 mmol，2.0當量)。在90℃下攪拌混合物3小時。將反應物冷卻至15℃，接著過濾。將濾液傾倒至冰水(30 mL)中且攪拌5分鐘。用乙酸乙酯(20 mL x 3)萃取水相且用鹽水(20 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮。藉由急驟矽膠層析(ISCO®；40 g SepaFlash®二氧化矽急驟管柱，溶離劑0至100%乙酸乙酯/石油醚至EtOAc/MeOH=3/1梯度，在60 mL/min下)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-(甲基胺基甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯BzL-39d (0.32 g，500.92 umol，產率59.94%)。
製備BzL-39e：在25℃下向BzL-39d (0.2 g，313 umol，1.0當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-側氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸甲酯(170 mg，313 umol，1.0當量)於MeOH (20 mL)中之混合物中添加乙酸AcOH (94.0 mg，1.57 mmol，5.0當量)。在此溫度下攪拌混合物10分鐘，接著添加氰基硼氫化鈉NaBH3 CN (39.3 mg，626. umol，2.0當量)且在25℃下攪拌混合物18小時。濃縮反應混合物，得到粗產物3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[1-[3-[2-胺基-4-[3-(三級丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基-甲基-胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸甲酯BzL-39e (0.36 g，粗產物)。
製備BzL-39f：在25℃下向BzL-39e (0.36 g，308 umol，1.0 當量)於MeOH (20 mL)中之混合物中添加水合氫氧化鋰LiOH • H2 O (130 mg，3.09 mmol，10.0當量)於H2 O (2 mL)中之混合物，接著在25℃下攪拌18小時。用HCl水溶液(4 M)淬滅反應混合物直至pH = 7且在40℃下濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Welch Xtimate C18 100*25mm*3um；移動相：[水(0.1% TFA) - ACN]；B%：20%-40%，12分鐘)純化殘餘物，得到呈淺黃色油狀之3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[1-[3-[2-胺基-4-[3-(三級丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]苯基]磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基-甲基-胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸BzL-39f (56 mg，48.64 umol，產率16%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ8.19-8.03 (m, 2H), 7.97-7.88 (m, 1H), 7.88-7.82 (m, 1H), 7.82-7.76 (m, 2H), 7.73-7.71 (m, 1H), 7.13 (s, 1H), 4.02 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.79 (t,J = 4.8 Hz, 2H), 3.75-3.68 (m, 4H), 3.64-3.45 (m, 42H), 3.38 (s, 2H), 3.17-2.94 (m, 4H), 2.86 (s, 3H), 2.53 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 1.89-1.80 (m, 2H), 1.75-1.63 (m, 2H), 1.47-1.42 (m, 9H), 1.02-0.86 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 1151.61 (計算值)；LC/MS [M+2H/2] 576.5 (觀測值)。
製備BzL-39. 將BzL-39f (0.056 g，0.049 mmol，1當量)及TFP (0.040 g，0.24 mmol，5當量)溶解於2 ml DMF中。添加柯林鹼(0.064 ml，0.49 mmol，10當量)，繼而添加EDC-HCl (0.047 g，0.24 mmol，5當量)。在室溫下攪拌反應物且藉由LCMS監測，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到1-(1-((3-(2-胺基-4-((3-((三級丁氧基羰基)胺基)丙基)(丙基)胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-8-基)苯基)磺醯基)氮雜環丁-3-基)-2-甲基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十五烷-35-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-39 (0.027 g，0.021 mmol，42%)。LC/MS [M+H] 1299.61 (計算值)；LC/MS [M+H] 1300.00 (觀測值)。 實例60 合成BzL-40
Figure 02_image372
製備BzL-40a：在25℃下於N2 下向N-[4-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丁-2-炔基]胺基甲酸三級丁酯Bz-26 (800 mg，1.26 mmol，1.0當量)於MeOH (20 mL)中之混合物中添加乙醯氯(395 mg，5.03 mmol，360 uL，4.0當量)，接著在50℃下攪拌1小時。用固體NaHCO3 淬滅混合物直至pH值約為8，接著過濾且真空濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10um；移動相：[水(10mM NH4 HCO3 )-ACN]；B%：10%-40%，10分鐘)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之2-胺基-N-(4-胺基丁-2-炔基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺BzL-40a (220 mg，411 umol，產率32.6%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ8.12-8.01 (m, 2H), 7.90-7.82 (m, 1H), 7.80-7.72 (m, 1H), 7.56-7.47 (m, 2H), 7.44-7.38 (m, 1H), 7.15 (s, 1H), 4.32 (s, 2H), 3.86 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.69-3.47 (m, 6H), 3.41 (d,J = 6.4 Hz, 2H), 2.64-2.51 (m, 1H), 1.84-1.63 (m, 2H), 0.99-0.91 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 536.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 536.3 (觀測值)。
製備BzL-40b：將BzL-40a (0.045 g，0.084 mmol，1當量)及79-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)-79-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜七十九烷酸NHS-PEG25-CO2 H (0.11 g，0.084 mmol，1當量)溶解於DMF中，繼而溶解柯林鹼(0.054 ml，0.42 mmol，5當量)。藉由HPLC純化反應物，得到85-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-79-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜-80,85-二氮雜八十八-82-炔酸BzL-40b (0.1 g，0.0058 mmol，69%)。LC/MS [M+H] 1736.90 (計算值)；LC/MS [M+H] 1737.32 (觀測值)。
製備BzL-40：將BzL-40b (0.1 g，0.0058 mmol，1當量)及TFP (0.014 g，0.086 mmol，1.5當量)溶解於DMF中。添加柯林鹼(0.038 ml，0.29 mmol，5當量)，繼而添加EDC-HCl (0.022 g，0.115 mmol，2當量)。在室溫下攪拌反應物且藉由LCMS監測，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到85-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-79-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76-二十五氧雜-80,85-二氮雜八十八-82-炔酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-40 (0.014 g，0.0076 mmol，13%)。LC/MS [M+H] 1884.90 (計算值)；LC/MS [M+H] 1885.44 (觀測值)。 實例61 合成BzL-41
Figure 02_image374
製備BzL-41a：將2-胺基-N -(4-胺基丁-2-炔-1-基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H-苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺BzL-40a (0.05 g，0.093 mmol，1當量)及1-((3-氰基苯基)亞胺基)-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十五-1-烯-35-酸三級丁酯(0.066 g，0.093 mmol，1當量)溶解於DMF中。添加三乙胺(0.05 ml，0.36 mmol，3.8當量)，且在周圍溫度下攪拌反應物。胺起始物質消耗後，濃縮反應物且藉由HPLC純化。將經分離之三級丁酯產物溶於最少量之TFA中持續10分鐘，接著濃縮，得到41-(2-胺基-8-(3-(((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-35-((3-氰基苯基)亞胺基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜-34,36,41-三氮雜四十四-38-炔酸BzL-41a (0.05 g，0.042 mmol，45%)。LC/MS [M+H] 1191.56 (計算值)；LC/MS [M+H] 1192.00 (觀測值)。
製備BzL-41：將BzL-41a (0.05 g，0.042 mmol，1當量)及TFP (0.01 g，0.063 mmol，1.5當量)溶解於DMF中。添加柯林鹼(0.028 ml，0.21 mmol，5當量)，繼而添加EDC-HCl (0.016 g，0.084 mmol，2當量)。在室溫下攪拌反應物且藉由LCMS監測，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到41-(2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3I-苯并[I]氮呯-4-羰基)-35-((3-氰基苯基)亞胺基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜-34,36,41-三氮雜四十四-38-炔酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-41 (0.019 g，0.014 mmol，35%)。LC/MS [M+H] 1339.56 (計算值)；LC/MS [M+H] 1340.04 (觀測值)。 實例62 合成BzL-42
Figure 02_image376
Figure 02_image378
製備BzL-42a：在0℃下向3-溴苯磺醯氯(8.23 g，32.2 mmol，4.65 mL，1.0當量)及N-(氮雜環丁-3-基甲基)胺基甲酸三級丁酯(6.0 g，32.2 mmol，1.0當量)於DCM (100mL)中之混合物中添加Et3 N (6.52 g，64.4 mmol，8.97 mL，2.0當量)，接著在此溫度下攪拌1小時。用水稀釋反應物且用EtOAc (50 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮，得到呈白色固體狀之N-[[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲基]胺基甲酸三級丁酯BzL-42a (12 g，粗物質)。1 H NMR (CDCl3 , 400MHz) δ7.99 (t,J = 1.6 Hz, 1H), 7.78 (m, 2H), 7.47 (t,J = 8.0 Hz, 1H), 4.63 (s, 1H), 3.85 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.54 (dd,J = 5.6, 8.0 Hz, 2H), 3.21-3.16 (m, 2H), 2.67-2.62 (m, 1H), 1.42 (s, 9H)。LC/MS [M+Na] 427.0 (計算值)；LC/MS [M+Na] 427.0 (觀測值)。
製備BzL-42b：在25℃下向BzL-42a (2 g，4.93 mmol，1.0 當量)於MeOH (30 mL)中之混合物中添加乙醯氯(1.94 g，24.67 mmol，1.76 mL，5.0當量)，接著在此溫度下攪拌2小時。濃縮混合物，得到呈白色固體狀之[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]甲胺BzL-42b (1.5 g，粗物質)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ7.99 (t,J = 1.6 Hz, 1H), 7.93 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.84 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 7.62 (t,J = 8.0 Hz, 1H), 3.93 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.61 (m, 2H), 3.06-3.03 (m, 2H), 2.78-2.66 (m, 1H)。
製備BzL-42c：在25℃下向BzL-42b (4.0 g，13.1 mmol，1.0當量)於MeOH (40 mL)中之混合物中添加Et3 N (1.99 g，19.7 mmol，2.74 mL，1.5當量)、甲醛(4.25 g，52.4 mmol，3.90 mL，純度37%，4.0當量)及NaBH3 CN (1.65 g，26.2 mmol，2.0當量)且在25℃下攪拌2小時。用水稀釋混合物且用EtOAc (30 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，EtOAc (1.5% NH3 . H2 O) : MeOH = 1/0、1/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之1-[1-(3-溴苯基)磺醯基氮雜環丁-3-基]-N,N-二甲基-甲胺BzL-42c (1.6 g，4.80 mmol，產率36.6%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ8.01 (t,J = 1.6 Hz, 1H), 7.96-7.91 (m, 1H), 7.86 (d,J = 8.0Hz, 1H), 7.66-7.60 (m, 1H), 3.98-3.90 (m, 2H), 3.47 (dd,J = 6.0, 8.4 Hz, 2H), 2.74-2.60 (m, 1H), 2.28 (d,J = 7.6Hz, 2H), 2.15 (s, 6H)。LC/MS [M+H] 333.0 (計算值)；LC/MS [M+H] 333.0 (觀測值)。
製備BzL-42d：在25℃下於N2 下向BzL-42c (299 mg，898 umol，1.1當量)及N-[3-[[2-胺基-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2- 二氧雜硼烷-2-基)-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯(0.43 g，817 umol，1.0當量)於二噁烷(10 mL)、H2 O (1 mL)中之混合物中添加K2 CO3 (395 mg，2.86 mmol，3.5當量)、Pd(dppf)Cl2 (29.9 mg，40.8 umol，0.05當量)，接著在100℃下攪拌2小時。過濾混合物，用水稀釋且用EtOAc (30 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯=1/0、0/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-[(二甲基胺基)甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯BzL-42d (0.3 g，459 umol，產率56.3%)。
製備BzL-42e：在25℃下向BzL-42d (0.25 g，383 umol，1.0當量)於DCM (2 mL)中之混合物中一次性添加TFA (1.31 g，11.5 mmol，851 uL，30.0當量)，接著攪拌1小時。濃縮混合物，得到呈黃色油狀之2-胺基-N-(3-胺基丙基)-8-[3-[3-[(二甲基胺基)甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺BzL-42e (0.2克，粗物質)。
製備BzL-42f：在25℃下向BzL-42e (0.2 g，362 umol，1.0當量)於DMF (0.5 mL)中之混合物中添加Et3 N (256 mg，2.53 mmol，353 uL，7.0當量)及3-異硫氰基苯甲腈(52.2 mg，326 umol，0.9當量)，接著在此溫度下攪拌1小時。過濾混合物且藉由製備型HPLC (管柱：Welch Xtimate C18 100*25mm*3um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%，12分鐘)純化濾液，得到呈黃色固體狀之2-胺基-N-[3-[(3-氰基苯基)硫代胺甲醯基胺基]丙基]-8-[3-[3-[(二甲基胺基)甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺BzL-42f (0.18 g，252 umol，產率69.8%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ8.12-8.06 (m, 2H), 7.92-7.02(m, 10H), 4.01 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.76-3.40 (m, 8H), 3.40-3.36 (m, 2H), 3.34-3.32 (m, 2H), 3.03-2.91 (m, 1H), 2.82 (s, 6H), 2.04 (s, 2H), 1.77-1.67 (m, 2H), 0.97 (s, 3H)。
製備BzL-42g：在25℃下向BzL-42f (0.14 g，196 umol，1.0當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯(138 mg，236 umol，1.2當量)於DMF(0.5 mL)中之混合物中添加Et3 N (40.0 mg，393 umol，2.0當量)及HgCl2 (64.0 mg，236 umol，1.2當量)，接著在此溫度下攪拌18小時。過濾混合物且藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100*30mm 8um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-45%，10分鐘)純化濾液，得到呈黃色油狀之3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(Z)-N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-[(二甲基胺基)甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]-N'-(3-氰基苯基)甲脒基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯BzL-42g (0.14 g，111 umol，產率56.4%)。
製備BzL-42h：在25℃下向BzL-42g (0.12 g，94.9 umol，1.0當量)於H2 O (2 mL)及CH3 CN (0.5 mL)中之溶液中添加TFA (325 mg，2.85 mmol，211 uL，30.0當量)，接著在80℃下攪拌1小時。真空濃縮混合物，得到殘餘物，藉由製備型HPLC (管柱：Xtimate C18 100*30mm*3um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：5%-35%，10分鐘)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(Z)-N-[3-[[2-胺基-8-[3-[3-[(二甲基胺基)甲基]氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]-N'-(3-氰基苯基)甲脒基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸BzL-42h (32 mg，26.5 umol，產率27.9%)。1 H NMR (MeOD, 400MHz) δ8.16-8.09 (m, 2H), 7.93 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.87-7.81 (m, 1H), 7.81-7.74 (m, 3H), 7.66-7.62 (m, 4H), 7.12 (s, 1H), 4.01 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 3.80-3.66 (m, 10H), 3.66-3.45 (m, 40H), 3.40 (s, 3H), 2.82 (s, 6H), 2.53 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 2.07-2.01 (m, 1H), 1.77-1.67 (m, 2H), 0.98-0.90 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 1208.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1208.6 (觀測值)。
製備BzL-42：將BzL-42h (0.032 g，0.026 mmol，1當量)及TFP (0.009 g，0.05 mmol，2當量)溶解於DMF中。添加柯林鹼(0.017 ml，0.13 mmol，5當量)，繼而添加EDC-HCl (0.015 g，0.079 mmol，3當量)。在室溫下攪拌反應物且藉由LCMS監測，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到40-(2-胺基-8-(3-((3-((二甲基胺基)甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-35-((3-氰基苯基)亞胺基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜-34,36,40-三氮雜四十三烷酸2,3,5,6-四氟苯酯(0.018 g，0.013 mmol，49%)。LC/MS [M+H] 1356.62 (計算值)；LC/MS [M+H] 1357.10 (觀測值)。 實例63 合成BzL-43
Figure 02_image380
Figure 02_image382
製備BzL-43a：在25℃下向2-胺基-N-(4-胺基丁-2-炔基)-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺BzL-40a (0.1 g，187 umol，1.0當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-側氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸甲酯(101.3 mg，187 umol，1.0當量)於MeOH (10 mL)中之混合物中一次性添加AcOH (11.2 mg，187 umol，11 uL，1.0當量)及NaBH3 CN (35.2 mg，560 umol，3.0當量)，接著攪拌2小時。接著添加甲醛(29.5 mg，373 umol，27 uL，2.0當量)且在相同溫度下攪拌1小時。向混合物中添加數滴水且濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Xtimate C18 100*30mm*3um；移動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-35%，10分鐘)純化殘餘物，得到呈無色油狀之3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丁-2-炔基-甲基-胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸甲酯BzL-43a (0.05 g，46.46 umol，產率24.88%)。
製備BzL-43b：在25℃下向BzL-43a (50 mg，46.5 umol，1.0當量)於MeOH (3.0 mL)及H2 O (0.3 mL)中之溶液中一次性添加LiOH • H2 O (19.5 mg，465 umol，10.0當量)且在相同溫度下攪拌16小時。將混合物冷卻至0℃，用HCl水溶液(1M)調節至pH = 7且在40℃下減壓濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100*30mm 8um；移動相：[水(0.1% TFA)-ACN]；B%：10%-40%，10分鐘)純化殘餘物，得到呈淺黃色油狀之3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[[2-胺基-8-[3-[3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基]磺醯基苯基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丁-2-炔基-甲基-胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸BzL-43b (30 mg，28.24 umol，產率60.79%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.15-8.07 (m, 2H), 7.93 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.86-7.76 (m, 3H), 7.74-7.69 (m, 1H), 7.24 (s, 1H), 4.29 (s, 2H), 3.91-3.84 (m, 4H), 3.74-3.55 (m, 43H), 3.52-3.38 (m, 7H), 3.34-3.32 (m, 2H), 3.02 (s, 3H), 2.64-2.56 (m, 1H), 2.53 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 1.85-1.72 (m, 2H), 0.98 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1062.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1062.6 (觀測值)。
製備BzL-43：將Bz-43b (0.03 g，0.028 mmol，1當量)及TFP (0.009 g，0.06 mmol，2當量)溶解於DMF中。添加柯林鹼(0.019 ml，0.14 mmol，5當量)，繼而添加EDC-HCl (0.016 g，0.085 mmol，3當量)。在室溫下攪拌反應物且藉由LCMS監測，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到38-(2-胺基-8-(3-((3-((二甲基胺基)甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-33-甲基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜-33,38-二氮雜四十一-35-炔酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-43 (0.016 g，0.013 mmol，46%)。LC/MS [M+H] 1210.53 (計算值)；LC/MS [M+H] 1210.95 (觀測值)。 實例64 合成BzL-44
Figure 02_image384
製備BzL44a：將2-胺基-N-(4-(胺基甲基)苯甲基)-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺Bz-27 (0.119 g，0.203 mmol，1當量)及32-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷酸(0.107 g，0.203 mmol，1當量)溶解於1:1 ACN:DCM中。添加三乙胺(0.17 ml，1.2 mmol，6當量)，繼而添加三乙醯氧基硼氫化鈉(0.13 g，0.61 mmol，3當量)。在室溫下攪拌反應物40分鐘，接著添加甲醛(0.02 ml，0.27 mmol，1.3當量，37 wt.%，於H2 O中)。10分鐘後，濃縮反應物且藉由HPLC純化，得到1-(4-((2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺基)甲基)苯基)-2-甲基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十四烷-34-酸BzL44a (0.067 g，0.060 mmol，30%)。LC/MS [M+H] 1114.56 (計算值)；LC/MS [M+H] 1114.89 (觀測值)。
製備BzL-44：將BzL-44a (0.067 g，0.06 mmol，1當量)及TFP (0.020 g，0.12 mmol，2當量)溶解於DMF中。添加柯林鹼(0.040 ml，0.30 mmol，5當量)，繼而添加EDC-HCl (0.035 g，0.18 mmol，3當量)。在室溫下攪拌反應物且藉由LCMS監測，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到1-(4-((2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N -丙基-3H -苯并[b ]氮呯-4-甲醯胺基)甲基)苯基)-2-甲基-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十氧雜-2-氮雜三十四烷-34-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-44 (0.026 g，0.021 mmol，34%)。LC/MS [M+H] 1262.56 (計算值)；LC/MS [M+H] 1262.86 (觀測值)。 實例65 合成BzL-45
Figure 02_image386
Figure 02_image388
Figure 02_image390
製備BzL-45b：在25℃下向3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯BzL-45a (2.7 g，4.61 mmol，1.0當量)於THF (20 mL)中之混合物中添加Et3 N (700 mg，6.91 mmol，960 uL，1.5當量)及3-異硫氰基苯甲腈(1.48 g，9.22 mmol，2.0當量)且在此溫度下攪拌1小時。接著用水(30 mL)稀釋混合物且用EtOAc (50 mL x 3)萃取。用鹽水洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(MeOH/乙酸乙酯=0/1、1/10)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(3-氰基苯基)硫代胺甲醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯BzL-45b (0.5 g，670 umol，產率14.54%)。1 H NMR (CDCl3 , 400MHz) δ7.99 (s, 1H), 7.89 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.44-7.39 (m, 2H), 3.76-3.58 (m, 42H), 2.55-2.46 (m, 2H), 1.45 (s, 9H)。
製備BzL-45c：在25℃下於N2 下向BzL-45b (0.4 g，536 umol，1.0當量)及Et3 N (163 mg，1.61 mmol，223 uL，3.0當量)於DCM (10 mL)及DMF (0.4 mL)中之混合物中添加碘化2-氯-1-甲基吡啶-1-鎓(164 mg，643 umol，1.2當量)。在25℃下攪拌混合物1小時，接著在減壓下濃縮。藉由矽膠層析(CH3 CN/乙酸乙酯 = 0/1至1/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(3-氰基苯基)亞胺基亞甲基胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯BzL-45c (0.29 g，407 umol，產率75.9%)。1 H NMR (CDCl3 , 400MHz) δ7.43-7.33 (m, 4H), 3.70-3.62 (m, 42H), 2.51 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H)。
Figure 02_image392
Figure 02_image394
Figure 02_image396
Figure 02_image398
Figure 02_image400
製備BzL-45e：在N2 下向2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯BzL-45d (10 g，32.4 mmol，1.0當量)於DMF (100 mL)中之溶液添加Et3 SiH (72.8 g，626.09 mmol，100 mL，19.36當量)、Et3 N (6.5 g，64.69 mmol，9.00 mL，2.0當量)及Pd(dppf)Cl2 (1.18 g，1.62 mmol，0.05當量)。將懸浮液在真空下脫氣且用CO吹掃數次，且在80℃下於CO (50 psi)下攪拌12小時。用水(300 mL)稀釋混合物且用EtOAc (80 mL x 3)萃取。用鹽水(50 mL)洗滌有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮，且藉由急驟矽膠層析(ISCO®；15 g SepaFlash®二氧化矽急驟管柱，溶離劑0至100%乙酸乙酯/石油醚醚梯度，在65 mL/min下)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之2-胺基-8-甲醯基-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯BzL-45e (3 g，11.6 mmol，產率35.9%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ10.00 (s, 1H) 7.79 (s, 1H) 7.61 (d,J = 8.4 Hz, 1H) 7.55 (d,J = 1.2 Hz, 1H) 7.40 (dd,J = 8.0, 1.2 Hz, 1H) 7.07 (s, 2 H) 4.25 (q,J = 6.8 Hz, 2H) 2.91 (s, 2H) 1.31 (t,J = 6.8 Hz, 3H)。
製備BzL-45f：在0℃下向BzL-45e (2.6 g，10.1 mmol，1.0當量)於CH3 CN (15 mL)中之溶液中添加NaH2 PO4 (362 mg，3.02 mmol，0.3當量)、H2 O2 (5.71 g，50.33 mmol，4.84 mL，純度30%，5.0當量)及NaClO2 (1.46 g，16.1 mmol，1.6當量)且在25℃下攪拌5小時。用Na2 SO3 (水溶液)淬滅反應混合物且用H2 O (30 mL)及EtOAc (30 ml)稀釋，用HCl水溶液(1 M)將混合物之pH值調節至4，接著過濾，得到所需固體。在真空下乾燥固體，得到呈白色固體狀之2-胺基-4-乙氧基羰基-3H-1-苯并氮呯-8-甲酸BzL-45f (2.1 g，7.66 mmol，產率76.1%)。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ7.87 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.72-7.67 (m, 2H), 4.27 (q,J = 7.2 Hz, 2H), 3.28 (s, 2 H), 1.31 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。
製備BzL-45g：在25℃下向BzL-45f (1.0 g，3.65 mmol，1.0當量)於DMF (20 mL)中之混合物中添加PYAOP (2.28 g，4.38 mmol，1.2當量)及DIEA (2.36 g，18.2 mmol，3.18 mL，5.0當量)且攪拌10分鐘，接著添加苯胺(373 mg，4.01 mmol，366 uL，1.1當量)且在25℃下攪拌1小時。將混合物傾倒至冰水(50 mL)中且攪拌2分鐘。用乙酸乙酯(20 mL x 3)萃取水相。用鹽水(20 mL)洗滌經合併之有機相，用無水Na2 SO4 乾燥，過濾且真空濃縮，藉由矽膠層析(EtOAc/MeOH = 1:0至2:1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之2-胺基-8-(苯基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸乙酯BzL-45g (0.5 g，1.43 mmol，產率39.25%)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 7.89 (s, 1H), 7.76-7.65 (m, 3H), 7.62-7.56 (m, 1H), 7.37 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 7.16 (t,J = 8.0 Hz, 1H), 4.35 (q,J = 7.2 Hz, 2H), 3.32 (s, 2H), 1.38 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。
製備BzL-45h：在25℃下向BzL-45g (0.36 g，1.03 mmol，1.0當量)於EtOH (10 mL)中之混合物中添加LiOH • H2 O (216 mg，5.15 mmol，5.0當量)於H2 O (1 mL)中之溶液且在此溫度下攪拌16小時。用HCl (4M)淬滅混合物直至pH值達到5且在40℃下減壓濃縮以移除EtOH。添加水(10 mL)，接著過濾，得到呈黃色固體狀之2-胺基-8-(苯基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲酸BzL-45h (0.2 g，622 umol，產率60.41%)，其未經進一步純化即用於下一步驟中。1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ7.84-7.74 (m, 3H), 7.66 (s, 1H), 7.56-7.47 (m, 2H), 7.34 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 7.09 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.92 (s, 2H)。
製備BzL-45i：在25℃下向BzL-45h (0.2 g，622 umol，1.0當量)於DMF (5 mL)中之溶液中添加HATU (284 mg，746 umol，1.2當量)及DIEA (241 mg，1.87 mmol，325 uL，3.0當量)且在此溫度下攪拌10分鐘，接著將N-[3-(丙基胺基)丙基]胺基甲酸三級丁酯Bz-1b (161 mg，746 umol，1.2當量)添加至混合物中且在25℃下攪拌3小時。將反應物傾倒至冰水(30 mL)中且攪拌10分鐘。用EtOAc (10 mL x 3)萃取水相且用H2 O (10 mL x 2)及鹽水(10 mL)洗滌經合併之有機相，由Na2 SO4 乾燥且濃縮，得到呈黃色油狀之N-[3-[[2-胺基-8-(苯基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺基甲酸三級丁酯BzL-45i (0.3 g，577 umol，產率92.76%)。
製備BzL-45j：在25℃下向BzL-45i (0.4 g，769 umol，1.0當量)於MeOH (10 mL)中之溶液中添加HCl/MeOH (4 M，9.62 mL，50當量)。在25℃下攪拌混合物1小時，接著在40℃下減壓濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100*30mm 8um；移動相：[水(0.1%TFA) - ACN]；B%：5% - 30%，10分鐘)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之2-胺基-N4-(3-胺基丙基)-N8-苯基-N4-丙基-3H-1-苯并氮呯-4,8-二甲醯胺BzL-45j (0.23 g，431 umol，產率56.0%，TFA鹽)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.01-7.94 (m, 2H), 7.76-7.70 (m, 3H), 7.41 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 7.21 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 3.63 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 3.58-3.49 (m, 2H), 3.41 (s, 2H), 3.10-2.95 (m, 2H), 2.12-1.99 (m, 2H), 1.82-1.68 (m, 2H), 0.95 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 420.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 420.2 (觀測值)。
製備BzL-45k：在25℃下向Bz-45j (0.06 g，112 umol，1.0當量，TFA鹽)於DMF (1 mL)中之混合物中添加Et3 N (28 mg，281 umol，2.5當量)及BzL-45c (88 mg，123 umol，1.1當量)。在25℃下攪拌混合物1小時，接著過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Nano-micro Kromasil C18 100*30mm 8um；移動相：[水(0.1%TFA) - ACN]；B%：20% - 50%，10分鐘)純化，得到呈無色油狀之3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(Z)-N'-[3-[[2-胺基-8-(苯基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]-N-(3-氰基苯基)甲脒基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯BzL-45k (0.08 g，70.7 umol，產率62.9%)。
製備BzL-45l：在25℃下向BzL-45k (0.07 g，61 umol，1.0當量)於H2 O (5 mL)及CH3 CN (1 mL)中之溶液中添加TFA (211 mg，1.86 mmol，30當量)。在80℃下攪拌混合物2小時，接著在減壓下濃縮。將殘餘物冷凍乾燥，得到呈淺黃色油狀之3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(Z)-N'-[3-[[2-胺基-8-(苯基胺甲醯基)-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]-N-(3-氰基苯基)甲脒基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸BzL-45l (51 mg，42.9 umol，產率69.3%，TFA鹽)。1 H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.01-7.94 (m, 2H), 7.79-7.75 (m, 1H), 7.72 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.66-7.64 (m, 4H), 7.39 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 7.19 (t,J = 7.6 Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 3.76-3.52 (m, 46H), 3.42-3.40 (m, 4H), 2.53 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 2.04 (m, 2H), 1.79-1.65 (m, 2H), 0.93 (t,J = 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1075.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1075.6 (觀測值)。
製備BzL-45：將BzL-45l (0.051 g，0.047 mmol，1當量)及TFP (0.016 g，0.095 mmol，2當量)溶解於DMF中。添加柯林鹼(0.031 ml，0.24 mmol，5當量)，繼而添加EDC-HCl (0.027 g，0.14 mmol，3當量)。在室溫下攪拌反應物且藉由LCMS監測，接著濃縮且藉由HPLC純化，得到40-(2-胺基-8-(苯基胺甲醯基)-3H -苯并[b ]氮呯-4-羰基)-35-((3-氰基苯基)亞胺基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十氧雜-34,36,40-三氮雜四十三烷酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-45 (0.043 g，0.035 mmol，74%)。LC/MS [M+H] 1223.56 (計算值)；LC/MS [M+H] 1223.87 (觀測值)。 實例66 合成BzL-46
Figure 02_image402
製備BzL-46a：藉由針對BzL-42所述之程序進行Bz-27與BzL-45c之反應，得到(Z)-1-(4-((2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)甲基)苯基)-3-((3-氰基苯基)胺基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十氧雜-2,4-二氮雜三十七-2-烯-37-酸三級丁酯BzL-46a。LC/MS [M+H] 1299.7 (計算值)；LC/MS [M+H] 1299.7 (觀測值)。
製備BzL-46b：藉由合成BzL-42中所述之程序，BzL-46a與三氟乙酸TFA反應得到(Z)-1-(4-((2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)甲基)苯基)-3-((3-氰基苯基)胺基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十氧雜-2,4-二氮雜三十七-2-烯-37-酸BzL-46b。LC/MS [M+H] 1243.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1243.6 (觀測值)。
製備BzL-46：如針對合成BzL-42之程序中所述，BzL-46b與2,3,5,6-四氟苯酚TFP及EDC-HCl反應得到(Z)-1-(4-((2-胺基-8-(3-((3-(羥甲基)氮雜環丁-1-基)磺醯基)苯基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)甲基)苯基)-3-((3-氰基苯基)胺基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十氧雜-2,4-二氮雜三十七-2-烯-37-酸2,3,5,6-四氟苯酯BzL-46。LC/MS [M+H] 1391.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1391.6 (觀測值)。 實例67 製備免疫接合物(IC)
在例示性程序中，使用G-25 SEPHADEXTM 脫鹽管柱(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)將抗體進行緩衝液交換成含有100 mM硼酸、50 mM氯化鈉、1 mM乙二胺四乙酸之接合緩衝液(pH 8.3)。接著使用緩衝液將溶離液各自調節至6 mg/ml，接著進行無菌過濾。將6 mg/ml抗體預熱至30℃且與2-20 (例如7-10)莫耳當量之式II胺基苯并氮呯-連接子化合物快速混合。使反應在30℃下進行16小時，且藉由在pH 7.2磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中平衡之兩個連續G-25脫鹽管柱上過柱而使免疫接合物A與反應物分離，以提供表3a及3b之免疫接合物(IC)。藉由在連接至XEVOTM G2-XS TOF質譜儀(Waters Corporation)之ACQUITYTM UPLC H級(Waters Corporation, Milford, Massachusetts)上使用C4逆相管柱進行液相層析質譜分析來確定佐劑-抗體比率(DAR)。
對於接合而言，可將抗體溶解於此項技術中已知之生理緩衝系統中，該生理緩衝系統不會不利地影響抗體之穩定性或抗原結合特異性。可使用磷酸鹽緩衝鹽水。將胺基苯并氮呯-連接子中間體化合物溶解於包含如本文別處所述之至少一種極性非質子性溶劑的溶劑系統中。在一些此類態樣中，將胺基苯并氮呯-連接子中間體以約5 mM、10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM或約50 mM及其範圍，諸如約50 mM至約50 mM或約10 mM至約30 mM之濃度溶解於pH 8 Tris緩衝液(例如50 mM Tris)中。在一些態樣中，將胺基苯并氮呯-連接子中間體溶解於DMSO或乙腈中或DMSO中。在接合反應中，稀釋當量過量之胺基苯并氮呯-連接子中間體溶液且與經冷卻之抗體溶液(例如約1℃至約10℃)合併。可用至少一種極性非質子性溶劑及至少一種極性質子性溶劑(其實例包括水、甲醇、乙醇、正丙醇及乙酸)適當稀釋胺基苯并氮呯-連接子中間體溶液。在一些特定態樣中，在與抗體溶液混合之前，將胺基苯并氮呯-連接子中間體溶解於DMSO中且用乙腈及水稀釋。胺基苯并氮呯-連接子中間體與抗體之莫耳當量可為約1.5:1、約3:1、約5:1、約10:1、約15:1或約20:1及其範圍，諸如約1.5:1至約20:1、約1.5:1至約15:1、約1.5:1至約10:1、約3:1至約15:1、約3:1至約10:1、約5:1至約15:1或約5:1至約10:1。可藉由此項技術中已知之方法，諸如LC-MS適當監測反應之完成，且反應典型地在約1小時至約24小時內完成。反應完成後，可將試劑添加至反應混合物中以淬滅反應物及/或將未反應之抗體硫醇基封端。適合封端試劑之實例為乙基順丁烯二醯亞胺。
根據實例5接合後，可藉由此項技術中已知之純化方法純化免疫接合物且與未接合之反應物及/或接合物聚集體分離，該等純化方法諸如且不限於尺寸排阻層析、疏水相互作用層析、離子交換層析、層析聚焦、超濾、離心超濾及其組合。舉例而言，在純化之前可稀釋免疫接合物，諸如在20 mM丁二酸鈉(pH 5)中。將經稀釋之溶液施加至陽離子交換管柱，繼而用例如至少10管柱體積之20 mM丁二酸鈉(pH 5)洗滌。可用諸如PBS之緩衝液適當溶離接合物。 實例68 HEK報導體檢定
表現人類TLR7或人類TLR8之HEK293報導體細胞係購自Invivogen，且對於細胞繁殖及實驗遵循供應商方案。簡言之，在5% CO2 下於補充有10% FBS、吉歐黴素(Zeocin)及殺稻瘟菌素(Blasticidin)之DMEM中使細胞生長至80-85%匯合。接著將細胞以4x104 個細胞/孔與含有HEK偵測介質及免疫刺激分子之基質一起接種於96孔平盤中。在620-655 nm波長下使用盤讀取器量測活性。 實例69 試管內免疫接合物活性之評估
此實例顯示本發明之免疫接合物有效引發髓樣活化，且因此可用於治療癌症。
人類抗原呈現細胞之分離：藉由使用含有針對CD14、CD16、CD40、CD86、CD123及HLA-DR之單株抗體的ROSETTESEPTM 人類單核細胞富集混合液(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)進行密度梯度離心，自獲自健康供血者(Stanford Blood Center, Palo Alto, California)之人類周邊血液中陰性選擇人類髓樣抗原呈現細胞(APC)。隨後經由使用含有針對CD14、CD16、CD40、CD86、CD123及HLA-DR之單株抗體而CD16未耗竭之EASYSEPTM 人類單核細胞富集套組(Stem Cell Technologies)進行陰性選擇將未成熟APC純化至＞90%純度。
髓樣APC活化檢定：在含有伊斯科夫改良達爾伯克培養基(iscove’s modified dulbecco’s medium，IMDM) (Lonza)之96孔盤(Corning, Corning, NY)中培育2 x 105 個APC，該培養基補充有10% FBS、100 U/mL青黴素、100 µg/mL (微克/毫升)鏈黴素、2 mM L-麩醯胺酸、丙酮酸鈉、非必需胺基酸及如有指示，各種濃度之未接合(裸) PD-L1或HER2抗體及本發明之免疫接合物P (如根據上述實例製備)。曲妥珠單抗及阿維魯單抗用作抗體構築體。18小時後，藉由ELISA分析無細胞上清液之TNFα分泌。
可使用各種篩選檢定來量測髓樣細胞類型之活化，其中利用不同髓樣群體。此等群體可包括以下：自健康供體血液中分離之單核細胞、M-CSF分化巨噬細胞、GM-CSF分化巨噬細胞、GM-CSF+IL-4單核細胞源性樹突狀細胞、自健康供體血液中分離之經典樹突狀細胞及極化為免疫抑制狀態之髓樣細胞(亦稱作髓樣源性抑制細胞或MDSC)。MDSC極化細胞之實例包括向免疫抑制狀態分化之單核細胞，諸如M2a MΦ (IL4/IL13)、M2c MΦ (IL10/TGFb)、GM-CSF/IL6 MDSC及腫瘤馴化單核細胞(TEM)。可使用腫瘤條件培養基(例如786.O、MDA-MB-231、HCC1954)進行TEM分化。初生腫瘤相關髓樣細胞亦可包括在解離之腫瘤細胞懸浮液中存在之初生細胞(Discovery Life Sciences)。
可作為單培養物或作為與表現ISAC可經由抗體之CDR區結合之所關注抗原之細胞的共培養物進行所述髓樣細胞群體之活化評估。培育18-48小時後，可藉由使用流動式細胞量測術上調細胞表面共刺激分子或藉由量測分泌之促炎細胞激素來評估活化。對於細胞激素量測，收集無細胞上清液且使用流動式細胞量測術由細胞激素珠粒陣列(例如來自Biolegend之LegendPlex)進行分析。
本文引用之所有參考文獻，包括公開案、專利申請案及專利，藉此以引用之方式併入，其程度如同各參考文獻個別地及特定地指示以引用之方式併入且在本文中以全文闡述一般。
圖1A-D展示PD-L1 A型結合劑1-42之重鏈及輕鏈CDR。 圖2A-D展示PD-L1 A型結合劑1-42之第一(HFW1)、第二(HFW2)、第三(HFW3)及第四(HFW4)重鏈構架區多肽。 圖3A-D展示PD-L1 A型結合劑1-42之第一(LFW1)、第二(LFW2)、第三(LFW3)及第四(LFW4)輕鏈構架區多肽。 圖4 A-D展示PD-L1 A型結合劑1-42之重鏈可變區(VH)。 圖4 E-G展示PD-L1 A型結合劑1-42之輕鏈可變區(VL)。 圖5A-B展示PD-L1 B型結合劑1-21之重鏈及輕鏈CDR。 圖6A-B展示PD-L1 B型結合劑1-21之第一(HFW1)、第二(HFW2)、第三(HFW3)及第四(HFW4)重鏈構架區多肽。 圖7A-B展示PD-L1 B型結合劑1-21之第一(LFW1)、第二(LFW2)、第三(LFW3)及第四(LFW4)輕鏈構架區多肽。 圖8A-B展示PD-L1 B型結合劑1-21之重鏈可變區(VH)。 圖8C-D展示PD-L1 B型結合劑1-21之輕鏈可變區(VL)。
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Claims (68)

  1. 一種免疫接合物，其包含藉由連接子共價附接至一或多個胺基苯并氮呯部分之抗體，且具有式I： Ab-[L-Bza]p I 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： Ab為該抗體； p為1至8之整數； Bza為具有下式之胺基苯并氮呯部分：
    Figure 03_image167
    R1 、R2 、R3 及R4 係獨立地選自由H、C1 -C12 烷基、C2 -C6 烯基、C2 -C6 炔基、C3 -C12 碳環基、C6 -C20 芳基、C2 -C9 雜環基及C1 -C20 雜芳基組成之群，其中烷基、烯基、炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基獨立地且視情況經一或多個選自以下之基團取代： -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C3 -C12 碳環基)； -(C3 -C12 碳環基)-*； -(C3 -C12 碳環基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -(C3 -C12 碳環基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C3 -C12 碳環基)-NR5 -C(=NR5 )NR5 -*； -(C6 -C20 芳基)； -(C6 -C20 芳基)-*； -(C6 -C20 芳二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -C(=NR5a )N(R5 )-*； -(C2 -C20 雜環基)； -(C2 -C20 雜環基)-*； -(C2 -C9 雜環基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -(C2 -C9 雜環基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C2 -C9 雜環基)-NR5 -C(=NR5a )NR5 -*； -(C1 -C20 雜芳基)； -(C1 -C20 雜芳基)-*； -(C1 -C20 雜芳基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C20 雜芳基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C1 -C20 雜芳基)-NR5 -C(=NR5a )N(R5 )-*； -C(=O)-*； -C(=O)-(C2 -C20 雜環二基)-*； -C(=O)N(R5 )2 ； -C(=O)N(R5 )-*； -C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)R5 ； -C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )CO2 R5 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=NR5a )N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 C(=NR5a )R5 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C8 烷二基)-NR5 (C2 -C5 雜芳基)； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-N(R5 )-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -N(R5 )2 ； -N(R5 )-*； -N(R5 )C(=O)R5 ； -N(R5 )C(=O)-*； -N(R5 )C(=O)N(R5 )2 ； -N(R5 )C(=O)N(R5 )-*； -N(R5 )CO2 R5 ； -NR5 C(=NR5a )N(R5 )2 ； -NR5 C(=NR5a )N(R5 )-*； -NR5 C(=NR5a )R5 ； -N(R5 )-(C2 -C5 雜芳基)； -O-(C1 -C12 烷基)； -O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-*； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*；及 -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-OH； 或R2 與R3 一起形成5員或6員雜環基環； X1 、X2 、X3 及X4 係獨立地選自由一鍵、C(=O)、C(=O)N(R5 )、O、N(R5 )、S、S(O)2 及S(O)2 N(R5 )組成之群； R5 係選自由H、C6 -C20 芳基、C6 -C20 芳二基、C1 -C12 烷基及C1 -C12 烷二基組成之群，或兩個R5 基團一起形成5員或6員雜環基環； R5a 係選自由C6 -C20 芳基及C1 -C20 雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之附接位點，且其中R1 、R2 、R3 及R4 中之一者附接至L； L為選自由以下組成之群的連接子： -C(=O)-(PEG)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-； -C(=O)-(PEG)-O-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-(MCgluc)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； -C(=O)-(PEG)-N(R5 )-； -C(=O)-(PEG)-N(R5 )-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(PEG)-N+ (R5 )2 -(PEG)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-N(R5 )CH(AA1 )C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(PEG)-C(=O)-N(R5 )CH(AA1 )C(=O)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； -C(=O)-(PEG)-SS-(C1 -C12 烷二基)-OC(=O)-； -C(=O)-(PEG)-SS-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-； -C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-； -C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； -C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-C(=O)； -C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； -C(=O)-CH2 CH2 OCH2 CH2 -(C1 -C20 雜芳二基)-CH2 O-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-； -C(=O)-CH2 CH2 OCH2 CH2 -(C1 -C20 雜芳二基)-CH2 O-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-；及 -(丁二醯亞胺基)-(CH2 )m -C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； PEG具有下式：-(CH2 CH2 O)n -(CH2 )m -；m為1至5之整數，且n為2至50之整數； PEP具有下式：
    Figure 03_image087
    其中AA1 及AA2 係獨立地選自胺基酸側鏈，或AA1 或AA2 及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波形線指示附接點； R6 係選自由C6 -C20 芳二基及C1 -C20 雜芳二基組成之群，經-CH2 O-C(=O)-且視情況經以下基團取代：
    Figure 03_image089
    ；且 MCgluc係選自下群：
    Figure 03_image091
    ；
    Figure 03_image093
    ；及
    Figure 03_image095
    其中q為1至8，且AA為胺基酸側鏈；且 烷基、烷二基、烯基、烯二基、炔基、炔二基、芳基、芳二基、碳環基、碳環二基、雜環基、雜環二基、雜芳基及雜芳二基獨立地且視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3 、-CH2 CH3 、-CH=CH2 、-C≡CH、-C≡CCH3 、-CH2 CH2 CH3 、-CH(CH3 )2 、-CH2 CH(CH3 )2 、-CH2 OH、-CH2 OCH3 、-CH2 CH2 OH、-C(CH3 )2 OH、-CH(OH)CH(CH3 )2 、-C(CH3 )2 CH2 OH、-CH2 CH2 SO2 CH3 、-CH2 OP(O)(OH)2 、-CH2 F、-CHF2 、-CF3 、-CH2 CF3 、-CH2 CHF2 、-CH(CH3 )CN、-C(CH3 )2 CN、-CH2 CN、-CH2 NH2 、-CH2 NHSO2 CH3 、-CH2 NHCH3 、-CH2 N(CH3 )2 、-CO2 H、-COCH3 、-CO2 CH3 、-CO2 C(CH3 )3 、-COCH(OH)CH3 、-CONH2 、-CONHCH3 、-CON(CH3 )2 、-C(CH3 )2 CONH2 、-NH2 、-NHCH3 、-N(CH3 )2 、-NHCOCH3 、-N(CH3 )COCH3 、-NHS(O)2 CH3 、-N(CH3 )C(CH3 )2 CONH2 、-N(CH3 )CH2 CH2 S(O)2 CH3 、-NHC(=NH)H、-NHC(=NH)CH3 、-NHC(=NH)NH2 、-NHC(=O)NH2 、-NO2 、=O、-OH、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-OCH2 CH2 OCH3 、-OCH2 CH2 OH、-OCH2 CH2 N(CH3 )2 、-O(CH2 CH2 O)n -(CH2 )m CO2 H、-O(CH2 CH2 O)n H、-OP(O)(OH)2 、-S(O)2 N(CH3 )2 、-SCH3 、-S(O)2 CH3 及-S(O)3 H。
  2. 如請求項1之免疫接合物，其中該抗體為具有結合PD-L1之抗原結合結構域之抗體構築體。
  3. 如請求項2之免疫接合物，其中該抗體係選自由阿特珠單抗(atezolizumab)、得瓦魯單抗(durvalumab)及阿維魯單抗(avelumab)或其生物類似藥(biosimilar)或生物改良藥(biobetter)組成之群。
  4. 如請求項1之免疫接合物，其中該抗體為具有結合HER2之抗原結合結構域之抗體構築體。
  5. 如請求項4之免疫接合物，其中該抗體係選自由曲妥珠單抗(trastuzumab)及帕妥珠單抗(pertuzumab)或其生物類似藥或生物改良藥組成之群。
  6. 如請求項1之免疫接合物，其中該抗體為具有結合CEA之抗原結合結構域之抗體構築體。
  7. 如請求項6之免疫接合物，其中該抗體為拉貝妥單抗(labetuzumab)或其生物類似藥或生物改良藥。
  8. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中PEP具有下式：
    Figure 03_image097
    。
  9. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中PEP係選自下群：
    Figure 03_image091
    ；
    Figure 03_image093
    ；及
    Figure 03_image099
    其中n為1或大於1，且AA為胺基酸側鏈。
  10. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中AA1 及AA2 係獨立地選自天然存在之胺基酸之側鏈。
  11. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中AA1 及AA2 係獨立地選自H、-CH3 、-CH(CH3 )2 、-CH2 (C6 H5 )、-CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 、-CH2 CH2 CH2 NHC(NH)NH2 、-CH2 CH(CH3 )2 、-CH2 SO3 H及-CH2 CH2 CH2 NHC(O)NH2 。
  12. 如請求項11之免疫接合物，其中AA1 為-CH(CH3 )2 ，且AA2 為-CH2 CH2 CH2 NHC(O)NH2 。
  13. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中AA1 及AA2 係獨立地選自GlcNAc天冬胺酸、-CH2 SO3 H及-CH2 OPO3 H。
  14. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中Bza係選自式Ia-d：
    Figure 03_image169
    。
  15. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中Bza係選自式Ie及If：
    Figure 03_image171
    其中式If之R5a 係選自由苯基及吡啶基組成之群，視情況經一或多個選自F、Cl、Br、I、-CN、-NO2 及-OCH3 之基團取代。
  16. 如請求項15之免疫接合物，其中L為-C(=O)-(PEG)-。
  17. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中Bza係選自式Ig及Ih：
    Figure 03_image173
    。
  18. 如請求項17之免疫接合物，其中L為-C(=O)-(PEG)-或-C(=O)-(PEG)-C(=O)-。
  19. 如請求項18之免疫接合物，其中R2 及R3 各自為C1 -C8 烷基。
  20. 如請求項19之免疫接合物，其中R2 及R3 各自為-CH2 CH2 CH3 。
  21. 如請求項1之免疫接合物，其中X2 及X3 各自為一鍵，且R2 或R3 為-O-(C1 -C12 烷基)。
  22. 如請求項21之免疫接合物，其中R2 或R3 為-OCH2 CH3 。
  23. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中R1 及R4 中之一者係選自： -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=NR5 )N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-*； -(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-C(=O)-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-C(=O)-(C2 -C20 雜環二基)-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-*；及 -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； X1 及X4 為一鍵，且其中星號*指示L之附接位點。
  24. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中R2 及R3 中之一者係選自： -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=NR5 )-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-C(=NR5 )N(R5 )-*； -(C2 -C6 炔二基)-N(R5 )-*；及 -(C2 -C6 炔二基)-N(R5 )C(=NR5 )N(R5 )-*； X2 及X3 為一鍵，且其中星號*指示L之附接位點。
  25. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中R1 及R4 中之一者係選自-(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 及-(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-OH。
  26. 如請求項25之免疫接合物，其中C6 -C20 芳二基為苯二基且C2 -C20 雜環二基為氮雜環丁二基。
  27. 如請求項26之免疫接合物，其中R1 及R4 中之一者係選自下式：
    Figure 03_image107
    。
  28. 如請求項1至7中任一項之免疫接合物，其中R1 及R4 中之一者為-C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -L。
  29. 如請求項28之免疫接合物，其中C1 -C20 雜芳二基為吡啶二基且C2 -C20 雜環二基為哌啶二基。
  30. 一種式II之胺基苯并氮呯-連接子化合物：
    Figure 03_image085
    II 其中 Z係選自H、-O(C1 -C8 烷基)及N(X2 R2 )(X3 R3 )； R1 、R2 、R3 及R4 係獨立地選自由H、C1 -C12 烷基、C2 -C6 烯基、C2 -C6 炔基、C3 -C12 碳環基、C6 -C20 芳基、C2 -C9 雜環基及C1 -C20 雜芳基組成之群，其中烷基、烯基、炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基獨立地且視情況經一或多個選自以下之基團取代： -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C3 -C12 碳環基)； -(C3 -C12 碳環基)-*； -(C3 -C12 碳環基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -(C3 -C12 碳環基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C3 -C12 碳環基)-NR5 -C(=NR5 )NR5 -*； -(C6 -C20 芳基)； -(C6 -C20 芳基)-*； -(C6 -C20 芳二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C6 -C20 芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -C(=NR5a )N(R5 )-*； -(C2 -C20 雜環基)； -(C2 -C20 雜環基)-*； -(C2 -C9 雜環基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -(C2 -C9 雜環基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C2 -C9 雜環基)-NR5 -C(=NR5a )NR5 -*； -(C1 -C20 雜芳基)； -(C1 -C20 雜芳基)-*； -(C1 -C20 雜芳基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -(C1 -C20 雜芳基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -(C1 -C20 雜芳基)-NR5 -C(=NR5a )N(R5 )-*； -C(=O)-*； -C(=O)-(C2 -C20 雜環二基)-*； -C(=O)N(R5 )2 ； -C(=O)N(R5 )-*； -C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)R5 ； -C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )CO2 R5 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=NR5a )N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 C(=NR5a )R5 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C8 烷二基)-NR5 (C2 -C5 雜芳基)； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-N(R5 )-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-*； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*； -N(R5 )2 ； -N(R5 )-*； -N(R5 )C(=O)R5 ； -N(R5 )C(=O)-*； -N(R5 )C(=O)N(R5 )2 ； -N(R5 )C(=O)N(R5 )-*； -N(R5 )CO2 R5 ； -NR5 C(=NR5a )N(R5 )2 ； -NR5 C(=NR5a )N(R5 )-*； -NR5 C(=NR5a )R5 ； -N(R5 )-(C2 -C5 雜芳基)； -O-(C1 -C12 烷基)； -O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -O-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-*； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-*； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 ； -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-NR5 -*；及 -S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-OH； 或R2 與R3 一起形成5員或6員雜環基環； X1 、X2 、X3 及X4 係獨立地選自由一鍵、C(=O)、C(=O)N(R5 )、O、N(R5 )、S、S(O)2 及S(O)2 N(R5 )組成之群； R5 係選自由H、C6 -C20 芳基、C6 -C20 芳二基、C1 -C12 烷基及C1 -C12 烷二基組成之群，或兩個R5 基團一起形成5員或6員雜環基環； R5a 係選自由C6 -C20 芳基及C1 -C20 雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之附接位點，且其中R1 、R2 、R3 及R4 中之一者附接至L； L為選自由以下組成之群的連接子： Q-C(=O)-(PEG)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-； Q-C(=O)-(PEG)-O-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-(MCgluc)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-N(R5 )-； Q-C(=O)-(PEG)-N(R5 )-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(PEG)-N+ (R5 )2 -(PEG)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-N(R5 )CH(AA1 )C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-N(R5 )CH(AA1 )C(=O)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； Q-C(=O)-(PEG)-SS-(C1 -C12 烷二基)-OC(=O)-； Q-C(=O)-(PEG)-SS-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-； Q-C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-； Q-C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-； Q-C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )-C(=O)； Q-C(=O)-(C1 -C12 烷二基)-C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； Q-C(=O)-CH2 CH2 OCH2 CH2 -(C1 -C20 雜芳二基)-CH2 O-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-； Q-C(=O)-CH2 CH2 OCH2 CH2 -(C1 -C20 雜芳二基)-CH2 O-(PEG)-C(=O)-(MCgluc)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-；及 Q-(CH2 )m -C(=O)-(PEP)-N(R5 )-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )C(=O)-(C2 -C5 單雜環二基)-； 其中PEG具有下式：-(CH2 CH2 O)n -(CH2 )m -；m為1至5之整數，且n為2至50之整數； PEP具有下式：
    Figure 03_image087
    其中AA1 及AA2 係獨立地選自胺基酸側鏈，或AA1 或AA2 及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波形線指示附接點；且 R6 係選自由C6 -C20 芳二基及C1 -C20 雜芳二基組成之群，經-CH2 O-C(=O)-且視情況經以下基團取代：
    Figure 03_image089
    ；且 MCgluc係選自下群：
    Figure 03_image091
    ；
    Figure 03_image093
    ；及
    Figure 03_image095
    其中q為1至8，且AA為胺基酸側鏈；且 Q係選自由N-羥基丁二醯亞胺基、N-羥基磺基丁二醯亞胺基、順丁烯二醯亞胺及苯氧基組成之群，經一或多個獨立地選自F、Cl、NO2 及SO3 - 之基團取代； 其中烷基、烷二基、烯基、烯二基、炔基、炔二基、芳基、芳二基 碳環基、碳環二基、雜環基、雜環二基、雜芳基及雜芳二基視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3 、-CH2 CH3 、-CH=CH2 、-C≡CH、-C≡CCH3 、-CH2 CH2 CH3 、-CH(CH3 )2 、-CH2 CH(CH3 )2 、-CH2 OH、-CH2 OCH3 、-CH2 CH2 OH、-C(CH3 )2 OH、-CH(OH)CH(CH3 )2 、-C(CH3 )2 CH2 OH、-CH2 CH2 SO2 CH3 、-CH2 OP(O)(OH)2 、-CH2 F、-CHF2 、-CF3 、-CH2 CF3 、-CH2 CHF2 、-CH(CH3 )CN、-C(CH3 )2 CN、-CH2 CN、-CH2 NH2 、-CH2 NHSO2 CH3 、-CH2 NHCH3 、-CH2 N(CH3 )2 、-CO2 H、-COCH3 、-CO2 CH3 、-CO2 C(CH3 )3 、-COCH(OH)CH3 、-CONH2 、-CONHCH3 、-CON(CH3 )2 、-C(CH3 )2 CONH2 、-NH2 、-NHCH3 、-N(CH3 )2 、-NHCOCH3 、-N(CH3 )COCH3 、-NHS(O)2 CH3 、-N(CH3 )C(CH3 )2 CONH2 、-N(CH3 )CH2 CH2 S(O)2 CH3 、-NHC(=NH)H、-NHC(=NH)CH3 、-NHC(=NH)NH2 、-NHC(=O)NH2 、-NO2 、=O、-OH、-OCH3 、-OCH2 CH3 、-OCH2 CH2 OCH3 、-OCH2 CH2 OH、-OCH2 CH2 N(CH3 )2 、-O(CH2 CH2 O)n -(CH2 )m CO2 H、-O(CH2 CH2 O)n H、-OP(O)(OH)2 、-S(O)2 N(CH3 )2 、-SCH3 、-S(O)2 CH3 及-S(O)3 H。
  31. 如請求項30之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中PEP具有下式：
    Figure 03_image097
    。
  32. 如請求項30之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中PEP係選自下群：
    Figure 03_image091
    ；
    Figure 03_image093
    ；及
    Figure 03_image099
    其中n為1或大於1，且AA為胺基酸側鏈。
  33. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中AA1 及AA2 係獨立地選自天然存在之胺基酸之側鏈。
  34. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中AA1 及AA2 係獨立地選自H、-CH3 、-CH(CH3 )2 、-CH2 (C6 H5 )、-CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 、-CH2 CH2 CH2 NHC(NH)NH2 、-CH2 CH(CH3 )2 、-CH2 SO3 H及-CH2 CH2 CH2 NHC(O)NH2 。
  35. 如請求項34之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中AA1 為-CH(CH3 )2 ，且AA2 為-CH2 CH2 CH2 NHC(O)NH2 。
  36. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中AA1 及AA2 係獨立地選自GlcNAc天冬胺酸、-CH2 SO3 H及-CH2 OPO3 H。
  37. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其係選自式IIa-d：
    Figure 03_image101
    。
  38. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其係選自式IIe及IIf：
    Figure 03_image103
    其中式If之R5a 係選自由苯基及吡啶基組成之群，視情況經一或多個選自F、Cl、Br、I、-CN、-NO2 及-OCH3 之基團取代。
  39. 如請求項38之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中L為Q-C(=O)-(PEG)-或Q-C(=O)-(PEG)-C(=O)-。
  40. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其係選自式IIg及IIh：
    Figure 03_image105
    。
  41. 如請求項40之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中L為-C(=O)-(PEG)-C(=O)-(PEP)-。
  42. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中R2 及R3 各自為C1 -C8 烷基。
  43. 如請求項42之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中R2 及R3 各自為-CH2 CH2 CH3 。
  44. 如請求項43之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中X2 及X3 各自為一鍵，且R2 或R3 為-O-(C1 -C12 烷基)。
  45. 如請求項44之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中R2 或R3 為-OCH2 CH3 。
  46. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中R1 及R4 中之一者係選自-(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-N(R5 )2 及-(C6 -C20 芳二基)-S(=O)2 -(C2 -C20 雜環二基)-(C1 -C12 烷二基)-OH。
  47. 如請求項46之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中C6 -C20 芳二基為苯二基且C2 -C20 雜環二基為氮雜環丁二基。
  48. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中R1 及R4 中之一者係選自下式：
    Figure 03_image107
    。
  49. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中R1 及R4 中之一者為-C(=O)NR5 -(C1 -C20 雜芳二基)-(C2 -C20 雜環二基)-C(=O)NR5 -(C1 -C12 烷二基)-NR5 -L。
  50. 如請求項49之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中C1 -C20 雜芳二基為吡啶二基且C2 -C20 雜環二基為哌啶二基。
  51. 如請求項30至32中任一項之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其中Q係選自：
    Figure 03_image413
    。
  52. 如請求項30之胺基苯并氮呯-連接子化合物，其係選自表2a、表2b或表2c。
  53. 一種免疫接合物，其係藉由使抗體與如請求項52之胺基苯并氮呯-連接子化合物接合來製備。
  54. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1-29中任一項之免疫接合物及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、媒劑、載劑或賦形劑。
  55. 一種如請求項54之醫藥組合物之用途，其係用於製造用以治療癌症之藥劑。
  56. 如請求項55之用途，其中該癌症容易發生由TLR7及/或TLR8促效作用誘導之促炎反應。
  57. 如請求項55之用途，其中該癌症係選自表現PD-L1之癌症、表現HER2之癌症及表現CEA之癌症。
  58. 如請求項55-57中任一項之用途，其中該癌症係選自膀胱癌、尿道癌、尿道上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌及乳癌。
  59. 如請求項58之用途，其中該乳癌為三陰性乳癌，該梅克爾細胞癌為轉移性梅克爾細胞癌，該胃癌為過表現HER2之胃癌，或該癌症為胃食管連接部腺癌。
  60. 一種製備如請求項1之式I免疫接合物之方法，其中使如請求項30之式II胺基苯并氮呯-連接子化合物與抗體接合。
  61. 如請求項2之免疫接合物，其中該抗體構築體為A型PD-L1抗體且包含免疫球蛋白重鏈可變區多肽及免疫球蛋白輕鏈可變區多肽，其中： 該免疫球蛋白重鏈可變區多肽包含：包含A型SEQ ID NO: 1-23中之任一者的互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 24-57中之任一者的互補決定區2 (HCDR2)，及包含SEQ ID NO: 58-95中之任一者的互補決定區3 (HCDR3)；或 該免疫球蛋白輕鏈可變區多肽包含：包含SEQ ID NO: 96-128中之任一者的互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 129-151中之任一者的互補決定區2 (LCDR2)，及包含SEQ ID NO: 152-155中之任一者的互補決定區3 (LCDR3)； 其中該等序列係來自圖1-4。
  62. 如請求項2之免疫接合物，其中該抗體構築體為A型PD-L1抗體且包含SEQ ID NO: 223-264中之任一者的免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR；及SEQ ID NO: 265-306中之任一者的免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； 其中該等序列係來自圖1-4。
  63. 如請求項2之免疫接合物，其中該抗體構築體為A型PD-L1抗體且包含具有與SEQ ID NO: 223-264中之任一者至少90%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區多肽，及具有與SEQ ID NO: 265-306中之任一者至少90%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區多肽； 其中該等序列係來自圖1-4。
  64. 如請求項2之免疫接合物，其中該抗體構築體為A型PD-L1抗體且包含圖1A-D之PD-L1結合劑之重鏈及輕鏈免疫球蛋白多肽或至少其CDR。
  65. 如請求項2之免疫接合物，其中該抗體構築體為B型PD-L1抗體且包含免疫球蛋白重鏈可變區多肽及免疫球蛋白輕鏈可變區多肽，其中： 該免疫球蛋白重鏈可變區多肽包含：包含SEQ ID NO: 308-321中之任一者的互補決定區1 (HCDR1)、包含SEQ ID NO: 322-338中之任一者的互補決定區2 (HCDR2)，及包含SEQ ID NO: 339-359中之任一者的互補決定區3 (HCDR3)；或 該免疫球蛋白輕鏈可變區多肽包含：包含SEQ ID NO: 360-374中之任一者的互補決定區1 (LCDR1)、包含SEQ ID NO: 375-386中之任一者的互補決定區2 (LCDR2)，及包含SEQ ID NO: 387-398中之任一者的互補決定區3 (LCDR3)； 其中該等序列係來自圖5-8。
  66. 如請求項2之免疫接合物，其中該抗體構築體為B型PD-L1抗體且包含SEQ ID NO: 430-450中之任一者的免疫球蛋白重鏈可變區或至少其CDR；及SEQ ID NO: 451-471中之任一者的免疫球蛋白輕鏈可變區或至少其CDR； 其中該等序列係來自圖5-8。
  67. 如請求項2之免疫接合物，其中該抗體構築體為B型PD-L1抗體且包含具有與SEQ ID NO: 430-450中之任一者至少90%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區多肽，及具有與SEQ ID NO: 451-471中之任一者至少90%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區多肽； 其中該等序列係來自圖5-8。
  68. 如請求項2之免疫接合物，其中該抗體構築體為B型PD-L1抗體且包含圖5A-B之PD-L1結合劑之重鏈及輕鏈免疫球蛋白多肽或至少其CDR。
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