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TW202027795A - 依喜替康類似物的配體－藥物偶聯物、其製備方法及其應用 - Google Patents

依喜替康類似物的配體－藥物偶聯物、其製備方法及其應用 Download PDF

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TW202027795A
TW202027795A TW108135663A TW108135663A TW202027795A TW 202027795 A TW202027795 A TW 202027795A TW 108135663 A TW108135663 A TW 108135663A TW 108135663 A TW108135663 A TW 108135663A TW 202027795 A TW202027795 A TW 202027795A
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許建煙
章瑛
蔡曉峰
屈博磊
梁金棟
張連山
賀峰
陶維康
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大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
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Abstract

本公開涉及依喜替康類似物的配體-藥物偶聯物及其製備方法和應用。具體而言，本公開提供了一種具有式(-D)所示結構的配體-藥物偶聯物，其製備方法，含有其的醫藥組成物，以及其藉由受體調節在製備治療癌症的藥物中的用途。其中通式(-D)中的各取代基與說明書中的定義相同。

Description

依喜替康類似物的配體-藥物偶聯物、其製備方法及其應用
本公開涉及一類全新結構依喜替康(或依沙替康)類似物的配體-藥物偶聯物。具體地說，本公開涉及一種含有結構單員Y的依喜替康類似物的抗體-藥物偶聯物，及其製備方法，和包含該偶聯物的醫藥組成物以及該偶聯物或醫藥組成物的用途。
化療依然是包括手術、放療、以及靶向治療法在內的最重要的抗癌手段之一。盡管高效細胞毒素的種類很多，但是腫瘤細胞和正常細胞之間差別很小，限制了這些抗腫瘤化合物由於毒副作用在臨床上的廣泛應用。而抗腫瘤單株抗體對於腫瘤細胞表面抗原的特異性，抗體藥物已成為抗腫瘤治療的前線藥物，但單獨使用抗體作為抗腫瘤藥物時，療效經常不盡人意。
抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)將單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連，充分利用了抗體對正常細胞和腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和細 胞毒素的高效性，同時又避免了前者療效偏低和後者毒副作用過大等缺陷。這也就意味着，與以往傳統的化療藥物相比，抗體藥物偶聯物能精準地結合腫瘤細胞並降低對正常細胞的影響(Mullard A,(2013)Nature Reviews Drug Discovery,12：329-332；DiJoseph JF,Armellino DC,(2004)Blood,103：1807-1814)。
2000年第一個抗體藥物偶聯物Mylotarg(吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，惠氏製藥有限公司)被美國FDA批准上市，用於治療急性髓細胞白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；US4970198；US 5079233；US 5585089；US 5606040；US 5693762；US 5739116；US 5767285；US 5773001)。
2011年8月，Adcetris(brentuximab vedotin，西雅圖基因遺傳公司)藉由美國FDA快速審評通道，用於治療霍奇金淋巴瘤以及復發性間變性大細胞淋巴瘤(Nat.Biotechnol(2003)21(7)：778-784；WO2004010957；WO2005001038；US7090843A；US7659241；WO2008025020)。Adcetris®是一種新型靶向ADC藥物，能使藥物直接作用於淋巴瘤細胞上的靶點CD30後發生內吞作用從而誘導腫瘤細胞的凋亡。
Mylotarg和Adcetris都是針對血液腫瘤進行靶向治療，血液腫瘤和實體腫瘤相比組織結構相對簡單。2013年2月，Kadcyla(ado-trastuzumab emtansine，T-DM1)獲得美國FDA批准，用於治療HER2陽性同時對曲妥珠單抗(Tratuzumab，商品名：Herceptin)和紫杉醇有抗藥性的晚期或轉移性乳腺癌患者(WO2005037992；US8088387)。Kadcyla是美國FDA批准的治療實體腫瘤的第一個ADC藥物。
用於抗體藥物偶聯物的具有細胞毒性的小分子有幾類，其中有一類是喜樹鹼衍生物，它們藉由抑制拓撲異構酶I而具有抗腫瘤作用。報導喜樹鹼衍生物依沙替康(化學名：(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3’,4’：6,7]咪唑並[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)應用於抗體偶聯藥物(ADC)的文獻有WO2014057687；Clinical Cancer Research(2016)22(20)：5097-5108；Cancer Sci(2016)107：1039-1046。但仍需進一步開發療效更好的ADC藥物。
為了改進配體，特別是抗體和藥物的偶聯效果，本公開提供一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中所述配體-藥物偶聯物包含式(-D)所示的結構：
Figure 108135663-A0101-12-0003-4
其中：Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基； R1選自鹵素、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；其中，或-D中的波浪線表示氫原子，或與接頭單員或與結合靶細胞所表達抗原的抗體共價連接；m為0至4的整數。
本公開的一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為具有通式(-D1)所示的化合物或其配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 108135663-A0101-12-0004-5
其中：R1為環烷基烷基或環烷基；較佳C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；式-D1中的波浪線表示氫原子，或與接頭單員或與結合靶細胞所表達抗原的抗體共價連接；m為0或1。
本公開的一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 108135663-A0101-12-0005-6
其中：Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；m為0至4的整數；n為1至10，可以為整數，也可以為小數；Pc為配體；L為接頭單員。
本公開的一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中-Y-為-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素或烷基；R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0或1。
本公開的一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中結構單員-Y-為-O-(CH2)m-CR1R2-C(O)-；R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0或1。
本公開的一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中結構單員-Y-為-O-(CH2)m-CR1R2-C(O)-；R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2為氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0或1。
本公開的一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中結構單員-Y-為-O-(CH2)m-CR1R2-C(O)-；R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2為氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0。
本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中結構單員-Y-選自：
Figure 108135663-A0101-12-0007-7
本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中-Y-的O端與接頭單員L相連。
本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(Pc-L-D1)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
Figure 108135663-A0101-12-0007-8
其中： R1為環烷基烷基或環烷基；較佳C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0或1；n為1至10，可以為整數，也可以為小數；Pc為配體；L為接頭單員。
在本發明的另一個較佳的實施方案中，根據本發明所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中n為2至8，可以為整數，也可以為小數；較佳為3至8，可以為整數，也可以為小數。
在本發明的另一個較佳的實施方案中，根據本發明所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中接頭單員-L-為-L1-L2-L3-L4-，L1選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH2-C(O)-NR3-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化學鍵，其中p1為1至20的整數；較佳為化學鍵；L3為由2至7個胺基酸構成的肽殘基，其中胺基酸視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代； L4選自-NR5(CR6R7)t-、-C(O)NR5、-C(O)NR5(CH2)t-或化學鍵，其中t為1至6的整數；較佳為-NR5(CR6R7)t-；R3、R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。
本公開的另一些實施方案中，配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中接頭單員L1選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2)s1-C(O)-、-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2-環己基-C(O)-、-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2CH2O)s2-CH2CH2-C(O)-、-CH2-C(O)-NR3-(CH2)s3-C(O)-或-C(O)-(CH2)s4C(O)-，其中s1為2至8的整數，s2為1至3的整數，s3為1至8的整數，s4為1至8的整數；s1較佳為5。
本公開的另一些實施方案中，配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中接頭單員L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-或化學鍵，p1為6至12的整數。
本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中L4選自-NR5(CR6R7)t-，R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2，較佳為2；L4較佳為自-NR5CR6R7-；L4更佳-NHCH2-。
本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中接頭單員-L-為-L1-L2-L3-L4-， L1為
Figure 108135663-A0101-12-0009-10
，s1為2至8的整數；L2為化學鍵； L3為四肽殘基；L4為-NR5(CR6R7)t-，R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2。
本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中接頭單員-L-為-L1-L2-L3-L4-，L1為-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2-環己基-C(O)-；L2為-NR4(CH2CH2O)9CH2C(O)-；L3為四肽殘基；L4為-NR5(CR6R7)t-，R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2。
本公開本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該L3的肽殘基為由一個、兩個或多個選自苯丙胺酸(E)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、賴胺酸(K)、瓜胺酸、絲胺酸(S)、谷胺酸(E)、天冬胺酸(N)中的胺基酸形成的胺基酸殘基；較佳為由一個、兩個或多個選自苯丙胺酸和甘胺酸的胺基酸形成的胺基酸殘基；更佳為四肽殘基；最佳為GGFG(甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸)的四肽殘基。
本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該接頭單員-L-，其L1端與配體相連，L4端與Y相連。
本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑合物，其中該-L-Y-為
Figure 108135663-A0101-12-0011-11
L1選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2)s1-C(O)-或-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2-環己基-C(O)-；L2為-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-或化學鍵，p1為6至12的整數；L3為GGFG的四肽殘基；R1為環烷基烷基或環烷基；較佳C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；s1為2至8的整數；較佳5；m為0至4的整數。
本公開的另一些實施方案中，提供的配體-藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑合物，其中該-L-Y-為
Figure 108135663-A0101-12-0011-12
較佳為
Figure 108135663-A0101-12-0011-13
L2為-NR4(CH2CH2O)9CH2C(O)-； L3為GGFG的四肽殘基；R1為環烷基烷基或環烷基；較佳C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；m為0至4的整數。
本公開的另一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的提供的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其中該-L-Y-為
Figure 108135663-A0101-12-0012-14
L2為化學鍵；L3為GGFG的四肽殘基；R1為環烷基烷基或環烷基；較佳C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；s1為2至8的整數；較佳5；m為0至4的整數。
本公開的另一方面，提供一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該配體-藥物偶聯物包含式(-L-Y-)所示的結構：
Figure 108135663-A0101-12-0013-15
其可用於得到經由連接片段將藥物與配體連接而成配體-藥物偶聯物；其中：L1選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2)s1-C(O)-或-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2-環己基-C(O)-；L2為-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-或化學鍵，p1為1至20的整數；L3為GGFG的四肽殘基；R1為環烷基烷基或環烷基；較佳C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R5、R6或R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；s1為2至8的整數；m為0至4的整數。
本公開的另一方面，提供一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該配體-藥物偶聯物包含式(-L-Y-)所示的結構：
Figure 108135663-A0101-12-0013-16
其中：L2為化學鍵；L3為GGFG的四肽殘基；R1為環烷基烷基或環烷基；較佳C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基； R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；s1為2至8的整數；m為0至4的整數。
本公開的另一些實施方案中，提供的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 108135663-A0101-12-0014-17
其中：W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化學鍵，p1為1至20的整數；L3為由2至7個胺基酸構成的肽殘基，胺基酸可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基 為一個或多個獨立地選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基；R1選自鹵素、環烷基烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；；較佳環烷基烷基或環烷基；更佳C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；m為0至4的整數；n為0至10的非零整數或小數，較佳為1-10之間的整數或小數；Pc為配體。
本公開的另一些實施方案中，提供的通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物，其為通式(Pc-Lb-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
Figure 108135663-A0101-12-0015-18
其中：s1為2至8的整數；較佳5； Pc、R1、R2、R5~R7、m和n如通式(Pc-La-Y-Dr)中所定義。
本公開的配體-藥物偶聯物的連接單員-L-Y-包括，但不限於：
Figure 108135663-A0101-12-0016-19
Figure 108135663-A0101-12-0017-20
本公開通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物包括，但不限於：
Figure 108135663-A0101-12-0017-21
Figure 108135663-A0101-12-0018-22
Figure 108135663-A0101-12-0019-23
Figure 108135663-A0101-12-0020-24
其中Pc和n如通式(Pc-La-Y-Dr)中所定義。
在本公開的另一些实施方案中，該配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其中該Pc為抗體或其抗原結合片段，該抗體選自嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體；較佳為單株抗體。
在本公開的另一些實施方案中，該配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其中該抗體或其抗原結合片段選自抗HER2(ErbB2)抗體、抗EGFR抗體、抗B7-H3抗體、抗c-Met抗體、抗HER3(ErbB3)抗體、抗HER4(ErbB4)抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD44抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD73抗體、抗CD105抗體、抗CEA抗體、抗A33抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗Lewis Y抗體、抗VEGFR抗體、抗GPNMB抗體、抗Integrin抗體、抗PSMA抗體、抗Tenascin-C抗體、抗SLC44A4抗體或抗Mesothelin抗體或其抗原結合片段。
在本公開的另一些實施方案中，該配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其中該抗體或其抗原結合片段選自曲妥珠單 抗(Trastuzumab)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)、諾利珠單抗(Enoblituzumab)、艾貝珠單抗(Emibetuzumab)、依託珠單抗(Inotuzumab)、品納珠單抗(Pinatuzumab)、本妥昔單抗(Brentuximab)、吉妥珠單抗(Gemtuzumab)、必伐珠單抗(Bivatuzumab)、洛沃珠單抗(Lorvotuzumab)、cBR96和格馬圖單抗(Glematumama)，或其抗原結合片段。
本公開通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物包括，但不限於以下結構式：
Figure 108135663-A0101-12-0021-25
Figure 108135663-A0101-12-0022-26
Figure 108135663-A0101-12-0023-27
Figure 108135663-A0101-12-0024-28
其中，n為0至10的非零整數或小數，較佳為1-10之間的整數或小數；更佳為2至8，可以為整數，也可以為小數；最佳為3至8，可以為整數，也可以為小數。
本公開的另一方面，提供了一種通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，
Figure 108135663-A0101-12-0025-29
其中：Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R1選自鹵素、環烷基烷基、氘代烷基、環烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；m為0至4的整數。
本公開另一方面的一個較佳方案，提供的通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、 或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其為通式(D1)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，
Figure 108135663-A0101-12-0026-30
其中：R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0或1。
本公開所述的通式(D)所示的化合物包括，但不限於：
Figure 108135663-A0101-12-0026-31
Figure 108135663-A0101-12-0027-32
Figure 108135663-A0101-12-0028-35
Figure 108135663-A0101-12-0029-36
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽。
本公開另一方面的一個較佳方案，提供了一種通式(La-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽：
Figure 108135663-A0101-12-0029-37
其中W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化學鍵，p1為1至20整數；L3為由2至7個胺基酸構成的肽殘基，其中胺基酸視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基為一個或多個獨立地選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基；R1選自鹵素、環烷基烷基、氘代烷基、環烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；m為0至4的整數。
本公開另一方面的一個較佳方案，提供了的通式(La-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其為通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽：
Figure 108135663-A0101-12-0031-38
其中R1、R2、R5~R7、s1和m如通式(La-Y-Dr)中所定義。
本公開該的通式(La-Y-Dr)所示的化合物包括，但不限於：
Figure 108135663-A0101-12-0031-39
Figure 108135663-A0101-12-0032-40
Figure 108135663-A0101-12-0033-41
Figure 108135663-A0101-12-0034-42
Figure 108135663-A0101-12-0035-43
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽。
本公開的另一方面，提供了一種製備通式(D1)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽的方法，其包括以下步骤：
Figure 108135663-A0101-12-0035-44
通式(Y1)和通式(Dr)缩合反應，得到通式(D1)所示的化合物，其中：R1、R2和m如通式(D1)中所定義。
本公開的另一方面，提供了一種製備通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽的方法，其包括以下步骤：
Figure 108135663-A0101-12-0036-45
通式(IA)和通式(IB)缩合反應，得到通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物，其中：R1、R2、R5~R7、s1和m如通式(Lb-Y-Dr)中所定義。
本公開的另一方面，提供了一種製備通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽的方法，其包括以下步驟：
Figure 108135663-A0101-12-0036-46
通式(IA)和通式(IB)進行縮合反應，得到通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物，其中：R1、R2、R5~R7、s1和m如通式(Lb-Y-Dr)中所定義。
本公開的另一方面，提供了一種製備如通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物的方法，其包括如下步驟：
Figure 108135663-A0101-12-0037-47
還原Pc後，與通式(La-Y-Dr)偶聯反應，得到通式(Pc-La-Y-Dr)；還原劑較佳TCEP；其中：Pc為配體；W、L2、L3、R1、R2、R5~R7、m和n如通式(Pc-La-Y-Dr)中所定義。
本公開的另一方面，進一步涉及一種藥物組合物，其含有治療有效量的如本公開所述的配體-藥物偶聯物或化合物、或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本公開的另一方面，進一步涉及一種藥物組合物，其含有根據本公開所述的通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本公開的另一方面，進一步涉及一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其包含配體和連接至配體的藥物，其中該藥物選自本公開所述的通式(D)所示的化合物、通式(La-Y-Dr)所示的化合物、或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，較佳藥物藉由接頭連接至配體，較佳配體為單株抗體。
本公開的另一方面，進一步涉及一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的製備方法，包含將本公開所述的通式(D)所示的化合物、通式(La-Y-Dr)所示的化合物、或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽與配體連接的步驟，較佳藉由接頭連接，較佳配體為單株抗體。
本公開的另一方面，進一步涉及本公開所述的配體-藥物偶聯物或化合物、或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，或其藥物組合物，其用作藥物。
本公開的另一方面，進一步涉及本公開所述的配體-藥物偶聯物或化合物、或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，或其醫藥組成物在製備用於治療或預防腫瘤的藥物中的用途；較佳其中該腫瘤為與HER2、HER3或EGFR表達相關的癌症。
本公開的另一方面，進一步涉及本公開所述的配體-藥物偶聯物或化合物、或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，或醫藥組成物在製備 治療和/或預防癌症的藥物的用途，該癌症較佳選自乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤、肺癌(例如，小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、白血病(例如，急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、慢性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病)、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或復發性間變性大細胞淋巴瘤)。
本公開的另一方面，進一步涉及一種用於治療和/或預防腫瘤的方法，該方法包括向需要其的患者施用治療有效劑量的本公開所述的配體-藥物偶聯物或化合物、或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物或包含其的醫藥組成物；較佳其中該腫瘤為與HER2、HER3或EGFR表達相關的癌症。
本公開的另一方面，進一步涉及一種用於治療或預防癌症的方法，該方法包括向需要其的患者施用治療有效劑量的本公開該的配體-藥物偶聯物或化合物、或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物或包含其的醫藥組成物；該癌症較佳選自乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤、肺癌(例如小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、白血病(例如，急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、慢性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病)、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌或淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或復發性間變性大細胞淋巴瘤)。
可將活性化合物製成適合於藉由任何適當途徑給藥的形式，活性化合物較佳是以單位劑量的方式，或者是以患者可以以單劑自我給藥的方式。本發明化合物或組合物的單位劑量的表達方式可以是片劑、膠囊、扁囊劑、瓶裝藥水、藥粉、顆粒劑、錠劑、栓劑、再生藥粉或液體製劑。
本發明治療方法中所用化合物或組合物的劑量通常將隨疾病的嚴重性、患者的體重和化合物的相對功效而改變。不過，作為一般性指導，合適的單位劑量可以是0.1~1000mg。
本發明的醫藥組成物除活性化合物外，可含有一種或多種輔料，該輔料選自以下成分：填充劑(稀釋劑)、黏合劑、潤濕劑、崩解劑或賦形劑等。根據給藥方法的不同，組合物可含有0.1至99重量%的活性化合物。
含活性成分的醫藥組成物可以是適用於口服的形式，例如片劑、糖錠劑、錠劑、水或油混懸液、可分散粉末或顆粒、乳液、硬或軟膠囊，或糖漿劑或酏劑。可按照本領域任何已知製備藥用組合物的方法製備口服組合物，此類組合物可含有黏合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑或藥學上可接受的潤濕劑等，此類組合物還可以含有一種或多種選自以下的成分：甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑，以提供悅目和可口的藥用製劑。
水懸浮液含有活性物質和用於混合的適宜製備水懸浮液的賦形劑。水混懸液也可以含有一種或多種防腐劑例、一種或多種著色劑、一種或多種矯味劑和一種或多種甜味劑。
油混懸液可藉由使活性成分懸浮於植物油中配製而成。油懸浮液可含有增稠劑。可加入上述的甜味劑和矯味劑，以提供可口的製劑。
醫藥組成物還可以是用於製備水混懸液的可分散粉末和顆粒提供活性成分，藉由加入水混合分散劑、濕潤劑、懸浮劑或防腐劑中的一種或多種。也可加入其他賦形劑例如甜味劑、矯味劑和著色劑。藉由加入抗氧化劑例如抗壞血酸保存這些組合物。
本公開的醫藥組成物也可以是水包油乳劑的形式。
醫藥組成物可以是無菌注射水溶液形式。可以使用的可接受的溶媒或溶劑有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性成分溶於油相的無菌注射水包油微乳。例如將活性成分溶於大豆油和卵磷脂的混合物中。然後將油溶液加入水和甘油的混合物中處理形成微乳。可藉由局部大量注射，將注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本公開化合物恆定循環濃度的方式給予溶液和微乳。為保持這種恆定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的實例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型靜脈注射泵。
醫藥組成物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油混懸液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該混懸液。無菌注射製劑也可以是在腸胃外可接受的無毒稀釋劑或溶劑中製備的無菌注射溶液或混懸液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。
可按用於直腸給藥的栓劑形式給予本公開化合物。可藉由將藥物與在普通溫度下為固體但在直腸中為液體，因而在直腸中會溶化而釋放藥物的適宜的無刺激性賦形劑混合來製備這些醫藥組成物。此類物質包括可可脂、甘油明膠、氫化植物油、各種分子量的聚乙二醇和聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物。
如本領域技術人員所熟知的，藥物的給藥劑量依賴於多種因素，包括但並非限定於以下因素：所用具體化合物的活性、患者的年齡、患者的體重、患者的健康狀況、患者的行為、患者的飲食、給藥時間、給藥方式、排泄的速率、藥物的組合等；另外，最佳的治療方式如治療的模式、通式化合物(I)的日用量或可藥用的鹽的種類可以根據傳統的治療方案來驗證。
第1A圖為本公開ADC-19的血漿穩定性實驗結果；第1B圖為本公開ADC-18的血漿穩定性實驗結果；第1C圖為本公開ADC-20的血漿穩定性實驗結果；第2圖為本公開ADC-21、ADC-24對JIMT-1荷瘤小鼠藥效評價；第3圖為本公開ADC對人乳腺癌細胞SK-BR-3移植瘤裸小鼠的療效評價；第4圖為本公開ADC-25的血漿穩定性實驗結果；第5圖為本公開ADC對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的的療效；第6圖為本公開ADC對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效；第7圖為本公開ADC對人膠質細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的的療效。
發明的詳細說明
除非另有限定，本文所用的所有技術和科學術語均與本公開所屬領域普通技術人員的通常理解一致。雖然也可採用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本公開，但本文描述了較佳的方法和材料。描述和要求保護本公開時，依據以下定義使用下列術語。
當本公開中使用商品名時，申請人旨在包括該商品名產品的製劑、該商品名產品的非專利藥和活性藥物部分。
除非有相反陳述，在說明書和權利要求書中使用的術語具有下述含義。
術語“配體”是能識別和結合目標細胞相關的抗原或受體的大分子化合物。配體的作用是將藥物呈遞給與配體結合的目標細胞群，這些配體包括但不限於蛋白類激素、凝集素、生長因子、抗體或其他能與細胞結合的分子。在本公開實施方式中，配體表示為Pc，配體可藉由配體上的雜原子與連接單員形成連接鍵，較佳為抗體或其抗原結合片段，該抗體選自嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或鼠源抗體；較佳為單株抗體。
術語“藥物”是指細胞毒性藥物，藥物表示為Dr，能在腫瘤細胞內具有較強破壞其正常生長的化學分子。細胞毒性藥物原則上在足夠高的濃度下都可以殺死腫瘤細胞，但是由於缺乏特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會導致正常細胞的凋亡，導致嚴重的副作用。該術語包括毒素，如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，毒性藥物，化療藥物，抗生素和核溶酶，較佳為毒性藥物。
術語“接頭單員”或“連接片段”或“連接單員”是指一端與配體連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與藥物相連。本公開的較佳方案表示為L和L1至L4，其中L1端與配體相連，L4端與結構單員Y相連後與藥物(Dr)相連。
接頭，包括延伸物、間隔物和胺基酸單員，可以藉由本領域已知方法合成，諸如US2005-0238649A1中所記載的。接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。
術語“配體-藥物偶聯物”，指配體藉由穩定的連接單員與具有生物活性的藥物相連。在本公開中“配體-藥物偶聯物”較佳為抗體-藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)，指把單株抗體或者抗體片段藉由穩定的連接單員與具有生物活性的毒性藥物相連。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。本公開所述的抗體較 佳為針對靶細胞上細胞表面抗原的特異性抗體，非限制性實施例為以下抗體：抗HER2(ErbB2)抗體、抗EGFR抗體、抗B7-H3抗體、抗c-Met抗體、抗HER3(ErbB3)抗體、抗HER4(ErbB4)抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD44抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD73抗體、抗CD105抗體、抗CEA抗體、抗A33抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗Lewis Y抗體、抗VEGFR抗體、抗GPNMB抗體、抗Integrin抗體、抗PSMA抗體、抗Tenascin-C抗體、抗SLC44A4抗體或抗Mesothelin抗體中一個或多個；較佳為曲妥珠單抗(Trastuzumab，商品名Herceptin)、帕妥珠單抗(Pertuzumab，也被稱作2C4，商品名Perjeta)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab，商品名泰欣生)、諾利珠單抗(Enoblituzumab)、艾貝珠單抗(Emibetuzumab)、依託珠單抗(Inotuzumab)、品納珠單抗(Pinatuzumab)、本妥昔單抗(Brentuximab)、吉妥珠單抗(Gemtuzumab)、必伐珠單抗(Bivatuzumab)、洛沃珠單抗(Lorvotuzumab)、cBR96和格馬圖單抗(Glematumamab)。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體，較佳人源化抗體和全人源抗體。
術語“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能用鼠製備抗體。製備時用特定抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體發誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系统或原核系统中表達嵌合抗體分子。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於携带大量鼠蛋白成分，從而诱导的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。進一步描述參與人源化可使用小鼠抗體的方法的文獻包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同 事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。
術語“全人源抗體”、“全人抗體”或“完全人源抗體”，也稱“全人源單株抗體”，其抗體的可變區和恆定區都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。單株抗體的發展經歷了四個階段，分別為：鼠源性單株抗體、嵌合性單株抗體、人源化單株抗體和全人源單株抗體。本公開為全人源單株抗體。全人抗體製備的相關技術主要有：人融合瘤技術、EBV轉化B淋巴細胞技術、噬菌體顯示技術(phage display)、轉基因小鼠抗體製備技術(transgenic mouse)和單個B細胞抗體製備技術等。
術語“抗原結合片段”是指抗體的保持特異性結合抗原的能力的一個或多個片段。已显示可利用全長抗體的片段来進行抗體的抗原結合功能。“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由铰鏈區上的二硫桥連接的两個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互补决定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的两個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的两個結構域VL和VH由分開的基因编馬，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它们，從而使得其能够產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與 對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學断裂完整免疫球蛋白来產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。
Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。
F(ab')2是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。
Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。
此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重復的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061， Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。該6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication 91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。
術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。
術語“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大约小於10-7M，例如大约小於10-8M、10-9M或10-10M或更小的親和力(KD)結合。
術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於 功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增强子影響編碼序列的轉錄，那麼動啟動子或增强子有效地連接至該編碼序列。
術語“載體”是指能够運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“质粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能够在已引入它们的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明該的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN01244135I上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
術語“肽”是指介於胺基酸和蛋白質之間的化合物片段，由2個或2個以上胺基酸分子藉由肽鍵相互連接而成，是蛋白質的結構與功能片段，如激素、酶類等本質上都是肽。
術語“糖”是指由C、H、O三種元素組成的生物大分子，可分為單糖、二糖和多糖等。
術語“螢光探針”是指在紫外-可見-近紅外區有特徵螢光，並且其螢光性質(激發和發射波長、強度、壽命和偏振等)可隨所處環境的性質，如極性、折射率、黏度等改變而靈敏地改變的一類螢光性分子，其與核酸(DNA或RNA)、蛋白質或其他大分子結構非共價相互作用而使一種或幾種螢光性質發生改變，可用於研究大分子物質的性質和行為。
術語“毒性藥物”是指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。包括毒素和其他能用於腫瘤治療的化合物。
術語“毒素”是指能夠對細胞的生長或增殖產生有害效果的任何物質，可以是來自細菌、真菌、植物或動物的小分子毒素及其衍生物，包括喜樹鹼類衍生物如伊沙替康，美登木素生物鹼及其衍生物(CN101573384)如DM1、DM3、DM4，auristatin F(AF)及其衍生物，如MMAF、MMAE、3024(WO 2016/127790 A1，化合物7)，白喉毒素、外毒素、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、modeccin、α-帚麯黴素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)局限麯黴素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。
術語“化療藥物”是可用於治療腫瘤的化學化合物。該定義還包括起調節、降低、阻斷或抑制可促進癌生長的激素效果作用的抗激素劑，且常常是系統或全身治療的形式。它們自身可以是激素。化療藥物實例包括烷化劑，如噻替呱(thiotepa)；環磷醯胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸脂如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和呱泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯並多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替呱(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞胺嗪(triethylenemelamine)，三亞乙基磷醯胺，三亞乙基硫代磷醯胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷醯胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環磷醯胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋苯丙胺酸氮芥 (melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉黴素，放線菌素，authramycin，重氮絲胺酸，博來黴素，放線菌素C(cactinomycin)，加利車黴素(calicheamicin)，carabicin，洋紅黴素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色黴素，放線菌素D，柔紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮胺酸，阿黴素(doxorubicin)，表阿黴素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發波黴素(marcellomycin)，絲裂黴素，黴酚酸，諾加黴素(nogalamycin)，橄欖黴素(olivomycin)，培洛黴素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤黴素，三鐵阿黴素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲黴素(streptozocin)，殺結核菌素，烏苯美司(ubenimex)，淨司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如胺甲蝶吟，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，胺甲蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙(trimetrexate)；喋吟類似物氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基蝶呤，硫咪蝶呤，硫鳥蝶呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿紮胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，去氟氧尿苷(doxitluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二甲睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環硫雄醇(epitiostanol)，美雄胺(mepitiostane)，睾內酯(testolactone)；抗腎上腺類如胺魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑如frolinic acid；醋葡內脂；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；噴司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2'，2"-三氯二乙胺(trichlorrotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春鹼醯胺；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇；呱溴烷坑(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；環磷醯胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷，如紫杉醇(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)和docetaxel(TAXOTERE®,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花鹼；鉑；依託泊甙(etoposide)(VP-16)；異環磷航膠；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞賓(vinorelbine)；新黴醯胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔紅黴素；胺基蝶呤；xeloda；伊拜磷酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；維甲酸esperamicins；capecitabine；以及上述任何物質的藥學上可接受的鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素製劑，如抗雌激素製劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018,onapristone，和托瑞 米芬(Fareston)；和抗雄激素製劑如氟他胺(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質的藥學上可接受的鹽，酸或衍生物。
術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子的烷基，更佳含有1至10個碳原子的烷基，最佳含有1至6個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更佳的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時， 取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基。
術語“雜烷基”指含有一個或多個選自N、O或S的雜原子的烷基，其中烷基如上所定義。
術語“亞烷基”指飽和的直鏈或支鏈脂肪族烴基，其具有2個從母體烷的相同碳原子或兩個不同的碳原子上除去兩個氫原子所衍生的殘基，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子，更佳含有1至6個碳原子的亞烷基。亞烷基的非限制性實例包括但不限於亞甲基(-CH2-)、1,1-亞乙基(-CH(CH3)-)、1,2-亞乙基(-CH2CH2)-、1,1-亞丙基(-CH(CH2CH3)-)、1,2-亞丙基(-CH2CH(CH3)-)、1,3-亞丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-亞丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和1,5-亞丁基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)等。亞烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳獨立地視需要選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基中的一個或多個取代基所取代。
術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基或環烷基的定義如上該。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵 素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳包含3至12個碳原子，更佳包含3至10個碳原子，最佳包含3至8個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。
術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；更佳環烷基環包含3至10個環原子。單環雜環基的非限制性實例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高哌嗪基等。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。
術語“螺雜環基”指5至20員的單環之間共用一個原子(稱螺原子)的多環雜環基團，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺雜環基分為單螺雜環基、雙螺雜環基或多螺雜環基，較佳為單螺雜環基和雙螺雜環基。更較佳為4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺雜環基。螺雜環基的非限制性實例包括：
Figure 108135663-A0101-12-0058-48
術語“稠雜環基”指5至20員，系統中的每個環與體系中的其他環共享毗鄰的一對原子的多環雜環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠雜環基，較佳為雙環或三環，更佳為5員/5員或5員/6員雙環稠雜環基。稠雜環基的非限制性實例包括：
Figure 108135663-A0101-12-0058-49
術語“橋雜環基”指5至14員，任意兩個環共用兩個不直接連接的原子的多環雜環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更較佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋雜環基，較佳為雙環、三環或四環，更佳為雙環或三環。橋雜環基的非限制性實例包括：
Figure 108135663-A0101-12-0059-50
該雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性實例包括：
Figure 108135663-A0101-12-0059-51
和
Figure 108135663-A0101-12-0059-52
等。
雜環基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基基。
術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共享毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至10員，例如苯基和萘基，較佳苯基。該芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性實例包括：
Figure 108135663-A0101-12-0059-53
芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、 烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳為5至10員，更較佳為5員或6員，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。該雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性實例包括：
Figure 108135663-A0101-12-0060-54
雜芳基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“胺基保護基”是為了使分子其它部位進行反應時胺基保持不變，用易於脫去的基團對胺基進行保護。非限制性實施例包含9-芴甲氧羰基、第三丁氧羰基、乙醯基、苄基、烯丙基和對甲氧苄基等。這些基團可視需要地被選自鹵素、烷氧基或硝基中的1-3個取代基所取代。該胺基保護基較佳為9-芴甲氧羰基。
術語“環烷基烷基”指烷基被一個或多個環烷基取代，較佳被一個環烷基取代，其中烷基如上所定義，其中環烷基如上所定義。
術語“鹵烷基”指烷基被一個或多個鹵素取代，其中烷基如上所定義。
術語“氘代烷基”指烷基被一個或多個氘原子取代，其中烷基如上所定義。
術語“羥基”指-OH基團。
術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
術語“胺基”指-NH2。
術語“硝基”指-NO2。
術語“醯胺基”指-C(O)N(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。
術語“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。
本公開還包括各種氘化形式的式(I)化合物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。本領域技術人員能夠參考相關文獻合成氘化形式的式(I)化合物。在製備氘代形式的式(I)化合物時可使用市售的氘代起始物質，或它們可使用常規技術採用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限於氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要被烷基取代的雜環基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團被烷基取代的情形和雜環基團不被烷基取代的情形。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更較佳為1~3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻， 取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有遊離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文該化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語“藥學上可接受的鹽”或“可藥用鹽”是指本公開配體-藥物偶聯物的鹽，或本公開中該的化合物的鹽，這類鹽用於哺乳動物體內時具有安全性和有效性，且具有應有的生物活性，本公開抗體-抗體藥物偶聯化合物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，藥學上可接受的鹽的非限制性實例包括：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。
術語“溶劑化物”或“溶劑化合物”指本公開的配體-藥物偶聯化合物與一種或多種溶劑分子形成可藥用的溶劑化物，溶劑分子的非限制性實例包括水、乙醇、乙腈、異丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
術語“載藥量”是指式(I)分子中每個配體上加載的細胞毒性藥物平均數量，也可以表示為藥物量和抗體量的比值，藥物載量的範圍可以是每個配體(Pc)連接0-12個，較佳1-10個細胞毒性藥物(D)。在本發明的實施方式中，載藥量表示為n，示例性的可以為1，2，3，4，5，6， 7，8，9，10的均值。可用常規方法如UV/可見光光譜法，質譜，ELISA試驗和HPLC特徵鑒定偶聯反應後每個ADC分子的藥物品均數量。
本公開的一個實施方式中，細胞毒性藥物藉由連接單員偶聯在配體的N端胺基和/或賴胺酸殘基的ε-胺基上，一般地，偶聯反應中能與抗體偶聯的藥物分子數將小於理論上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制配體細胞毒性藥物偶聯物的載量，包括：(1)控制連接試劑和單抗的摩爾比，(2)控制反應時間和溫度，(3)選擇不同的反應試劑。
常規的醫藥組成物的製備見中國藥典。
術語“載體”用於本公開的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。
術語“賦形劑”是在藥物製劑中除主藥以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。
術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量 偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。如澱粉、乳糖、鈣的無機鹽、微晶纖維素等。
醫藥組成物可以是無菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶劑中有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性成分溶於油相的無菌注射水包油微乳。例如將活性成分溶於大豆油和卵磷脂的混合物中。然後將油溶液加入水和甘油的混合物中處理形成微乳。可藉由局部大量注射，將注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本公開化合物恆定循環濃度的方式給予溶液和微乳。為保持這種恆定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的實例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型靜脈注射泵。
醫藥組成物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油混懸液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該混懸液。無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中製備的無菌注射溶液或混懸液，例如1,3-丁二醇中製備的溶液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用包括合成甘油單或二酯在內的任何調和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以製備注射劑。
本公開涉及一類可裂解的特定結構的連接臂和特定結構的活性物，及由連接臂、活性物與抗體組成的抗體藥物偶聯物(ADC)。此類ADC是經由間隔物將一種毒性物質連於抗體而形成的複合物。該抗體偶聯藥物(ADC)在體內經降解而釋放出活性分子，從而起到抗腫瘤的作用。
本公開的合成方法
為了完成本公開的合成目的，本公開採用如下的合成技術方案：
方案一：
本公開通式(D1)所示的化合物或其可藥用鹽或溶劑合物的製備方法，該方法包括：
Figure 108135663-A0101-12-0065-55
通式(Y1)化合物和通式(Dr)化合物在縮合劑存在下，視需要在鹼性條件下反應，得到通式(D1)，其中：R1、R2和m如通式(D1)中所定義。
提供鹼性條件的試劑包括有機鹼和無機鹼類，該有機鹼類包括但不限於三乙胺、二乙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、六氫吡啶、N,N-二異丙基乙胺、正丁基鋰、二異丙基胺基鋰、醋酸鉀、第三丁醇鈉或第三丁醇鉀，該無機鹼類包括但不限於氫化鈉、磷酸鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、氫氧化鈉和氫氧化鋰。
縮合劑可以選自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽、1-羥基苯并三唑和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N,N'-二環己基碳化二亞胺、N,N'-二異丙基碳二亞胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羥基苯并三唑、1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基胺基)磷 磷鎓六氟磷酸鹽或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，較佳4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽或1-羥基苯并三唑和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
方案二：
本公開通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物或其可藥用鹽或溶劑合物的製備方法，该方法包括：
Figure 108135663-A0101-12-0066-56
第一步，通式(IB-1)化合物和依喜替康甲磺酸鹽(1b)在縮合劑存在下，視需要在鹼性條件下反應得到通式(IB-2)化合物；第二步，通式(IB-2)化合物脫去保護基得到通式(IB)化合物；第三步，通式(IA)化合物和通式(IB)化合物在縮合劑存在下，視需要在鹼性條件下反應，得到通式(Lb-Y-Dr)， 其中：Rc為胺基保護基；較佳為9-芴甲氧羰基(Fmoc)；R1、R2、R5~R7、s1和m如通式(Lb-Y-Dr)所定義。
提供鹼性條件的試劑包括有機鹼和無機鹼類，該有機鹼類包括但不限於三乙胺、二乙胺、N-甲基嗎啉、吡啶、六氫吡啶、N,N-二異丙基乙胺、正丁基鋰、二異丙基胺基鋰、醋酸鉀、第三丁醇鈉或第三丁醇鉀，該無機鹼類包括但不限於氫化鈉、磷酸鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸铯、氫氧化鈉和氫氧化鋰。
縮合劑選自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽、1-羥基苯并三唑和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N,N'-二環己基碳化二亞胺、N,N'-二異丙基碳二亞胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羥基苯并三唑、1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基胺基)磷鎓六氟磷酸鹽或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，較佳4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽或1-羥基苯并三唑和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
方案三：
本公開通式(Pc-La-Y-Dr)所示的化合物的方法，其包括如下步骤：
Figure 108135663-A0101-12-0068-57
還原Pc後，與通式(La-Y-Dr)反應，得到通式(Pc-La-Y-Dr)；還原劑較佳TCEP，特別地，較佳還原抗體上的二硫鍵；其中：Pc為配體；W、L2、L3、R1、R2、R5~R7、m和n如通式(Pc-La-Y-Dr)中所定義。
以下結合實施例進一步描述本公開，但這些實施例並非限制本公開的範圍。
本公開實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例
化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或質譜(MS)來確定的。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)，化學位移是以10-6(ppm)作為單位給出。
MS的測定用FINNIGAN LCQAd(ESI)質譜儀(生產商：Thermo，型號：Finnigan LCQ advantage MAX)。
UPLC的測定用Waters Acquity UPLC SQD液質聯用儀。
HPLC的測定使用安捷倫1200DAD高壓液相色譜儀(Sunfire C18 150×4.6mm色譜柱)和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀(Gimini C18 150×4.6mm色譜柱)。
UV-HPLC的測定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度計。
增殖抑制率及IC50值的測定用PHERA starFS酶標儀(德國BMG公司)。
薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm矽膠板。
柱層析一般使用煙臺黃海200~300目矽膠為載體。
本公開的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。
實施例中如無特殊說明，反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。
氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。
氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。
加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。
氫化反應通常抽真空，充入氫氣，重複操作3次。
微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。
實施例中如無特殊說明，反應中的溶液是指水溶液。
實施例中如無特殊說明，反應的溫度為室溫。
室溫為最適宜的反應溫度，溫度範圍是20℃~30℃。
實施例中pH=6.5的PBS緩衝液的配製：取KH2PO4 8.5g，K2HPO4.3H2O 8.56g，NaCl 5.85g，EDTA 1.5g置於瓶中，定容至2L，超聲波使其全部溶解，搖勻即得。
純化化合物採用的柱層析的洗脫劑的體系和薄層色譜法的展開劑的體系包括：A：二氯甲烷和異丙醇體系，B：二氯甲烷和甲醇體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和酸性或鹼性試劑等進行調節。
本公開部分化合物是藉由Q-TOF LC/MS來表徵的。Q-TOF LC/MS使用安捷倫6530精確質量數四級杆-飛行時間質譜儀和安捷倫1290-Infinity超高效液相色譜儀(安捷倫Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色譜柱)。
實施例1
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環丙烷-1-甲醯胺1
Figure 108135663-A0101-12-0071-286
Figure 108135663-A0101-12-0071-287
向依喜替康甲磺酸鹽1b(2.0mg，3.76μmol，採用專利申請“EP0737686A1”公開的方法製備而得)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基環丙基甲酸1a(1.4mg，3.7μmol，採用公知的方法“Tetrahedron Letters,25(12),1269-72；1984”製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(3.8mg，13.7μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應2小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物1(1.6mg，產率：82.1%)。
MS m/z(ESI)：520.2[M+1]
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.90-7.84(m,1H),7.80-7.68(m,1H),5.80-5.70(m,1H),5.62-5.54(m,2H),5.44-5.32(m,2H),5.28-5.10(m, 2H),3.40-3.15(m,3H),2.44(s,3H),2.23(t,1H),2.06-1.75(m,2H),1.68-1.56(m,1H),1.22-1.18(m,2H),1.04-0.98(m,2H),0.89(t,3H).
實施例2
(S)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-A
(R)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-B
Figure 108135663-A0101-12-0072-288
Figure 108135663-A0101-12-0072-289
向1b(4mg，7.53μmol)中加入2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入2-環丙基-2-羥基乙酸2a(2.3mg，19.8μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)、1-羥基苯並三唑(3mg，22.4μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(4.3mg，22.4μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌2小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物2用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)，B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(2-A：1.5mg，2-B：1.5mg)。
MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。
單一構型化合物2-B(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.06分鐘，純度：88%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.37(d,1H),7.76(d,1H),7.30(s,1H),6.51(s,1H),5.58-5.56(m,1H),5.48(d,1H),5.41(s,2H),5.32-5.29(m,2H),3.60(t,1H),3.19-3.13(m,1H),2.38(s,3H),2.20-2.14(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.83(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.34-1.28(m,1H),0.86(t,3H),0.50-0.39(m,4H)。
單一構型化合物2-A(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.10分鐘，純度：86%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.35(d,1H),7.78(d,1H),7.31(s,1H),6.52(s,1H),5.58-5.53(m,1H),5.42(s,2H),5.37(d,1H),5.32(t,1H),3.62(t,1H),3.20-3.15(m,2H),2.40(s,3H),2.25-2.16(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.21-1.14(m,1H),0.87(t,3H),0.47-0.35(m,4H)。
實施例3
(S)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-A
(R)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-B
Figure 108135663-A0101-12-0074-290
Figure 108135663-A0101-12-0074-291
向1b(5.0mg，9.41μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啡啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入3,3,3-三氟-2-羥基丙酸3a(4.1mg，28.4μmol，供應商Alfa)、1-羥基苯並三唑(3.8mg，28.1μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(5.4mg，28.2μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應10分鐘。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌8小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物3用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(1.5mg，1.5mg)。
MS m/z(ESI)：561.9[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.11分鐘，純度：88%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.94(d,1H),7.80(d,1H),7.32(s,1H),7.20(d,1H),6.53(s,1H),5.61-5.55(m,1H),5.45-5.23(m,3H),5.15-5.06(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.26-2.20(m,1H),2.16-2.08(m,1H),2.02-1.94(m,1H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
單一構型化合物(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.19分鐘，純度：90%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.97(d,1H),7.80(d,1H),7.31(s,1H),7.16(d,1H),6.53(s,1H),5.63-5.55(m,1H),5.45-5.20(m,3H),5.16-5.07(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.22-2.14(m,1H),2.04-1.95(m,2H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
實施例4
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環戊烷-1-甲醯胺4
Figure 108135663-A0101-12-0075-61
Figure 108135663-A0101-12-0076-62
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基-環戊烷甲酸4a(2.2mg，16.9μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.7mg，16.9μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4(2.5mg，產率：80.9%)。
MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.73-7.62(m,2H),5.75-5.62(m,1H),5.46-5.32(m,2H),5.26-5.10(m,1H),3.30-3.10(m,1H),2.43(s,3H),2.28-2.20(m,2H),2.08-1.84(m,8H),1.69-1.58(m,2H),1.04-1.00(m,2H),0.89(t,3H)。
實施例5
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羥甲基)環丙烷-1-甲醯胺5
Figure 108135663-A0101-12-0077-292
Figure 108135663-A0101-12-0077-293
向1b(2.0mg，3.76μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-(羥甲基)-環戊烷甲酸5a(0.87mg，7.5μmol，採用專利申請“WO201396771”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2mg，7.24μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應2小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物5(1.0mg，產率：50%)。
MS m/z(ESI)：533.9[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 8.07(s,1H),7.23-7.18(m,2H),6.71-6.64(m,1H),6.55-6.51(m,1H),5.36-5.27(m,2H),4.67-4.61(m,2H),3.53-3.48(m,1H),3.30-3.22(m,2H),3.18-3.13(m,1H),2.71-2.61(m,2H),2.35-2.28(m,1H),2.04-1.91(m,4H),1.53-1.40(m,3H),0.91-0.75(m,4H)。
實施例6
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羥基甲基)環丁烷-1-甲醯胺6
Figure 108135663-A0101-12-0078-294
Figure 108135663-A0101-12-0078-295
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-(羥基甲基)環丁烷-1-甲酸6a(2.2mg，16.9μmol；採用文獻“Journal of the American Chemical Society,2014,vol.136,#22,p.8138-8142”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.7mg，16.9μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物6(2.1mg，產率：67.9%)。
MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 7.85-7.62(m,1H),6.88(br，1H),5.87-5.48(m,2H),5.47-5.33(m,1H),5.31-5.06(m,1H),4.25-3.91(m,2H),3.25(br,1H),2.60-2.32(m,3H),2.23(t,1H),2.15-1.95(m,3H),1.70-1.56(m,2H),1.41-1.17(m,9H),1.03(s,1H),0.95-0.80(m,2H)。
實施例7
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環丁烷-1-甲醯胺7
Figure 108135663-A0101-12-0079-296
Figure 108135663-A0101-12-0079-297
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啡啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基環丁烷甲酸7a(2.0mg，17.22μmol，供應商藥石)，1-羥基苯並三唑(2.3mg，17.0μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(3.2mg，16.7μmol)，加畢，在0-5℃攪拌 反應10分鐘。撤去冰水浴，常溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物7(2.5mg，產率：83.1%)。
MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.28(d,1H),7.75(d,1H),7.29(s,1H),6.51(s,1H),6.12(s,1H),5.59-5.51(m,1H),5.41(s,2H),5.20-5.01(m,2H),3.27-3.17(m,1H),3.15-3.05(m,1H),2.71-2.63(m,1H),2.37(s,3H),2.12-2.05(m,1H),2.03-1.94(m,2H),1.92-1.78(m,4H),1.50-1.42(m,1H),0.90-0.83(m,4H)。
實施例8
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8
Figure 108135663-A0101-12-0080-66
Figure 108135663-A0101-12-0081-67
第一步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸苄酯8c
將1-羥基環丙烷-1-羧酸苄酯8a(104mg，0.54mmol；採用專利申請“US2005/20645”公開的方法製備而得)和2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲基乙酸酯8b(100mg，0.27mmol；採用專利申請“CN105829346A”公開的方法製備而得)加入反應瓶，加入5mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(61mg，0.54mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌10分鐘，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於3mL 1,4-二氧六環中，加入0.6mL水，加入碳酸氫鈉(27mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(70mg，0.27mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物8c(100mg，產率：73.6%)。
MS m/z(ESI)：501.0[M+1]。
第二步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸8d
將8c(50mg，0.10mmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(25mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到標題產物8d(41mg，產率：100%)。
MS m/z(ESI)：411.0[M+1]。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸酯8e
將1b(7mg，0.013mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入8d(7mg，0.017mmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(7mg，0.026mmol)，冰浴攪拌反應35分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物8e(8.5mg，產率78.0%)。
MS m/z(ESI)：828.0[M+1]。
第四步
1-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8f
將8e(4mg，4.84μmol)溶於0.2mL二氯甲烷中，加入0.1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物8f(2.9mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：606.0[M+1]。
第五步
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8
將粗品8f(2.9mg，4.84μmol)溶於0.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入(S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-二側氧基-1H-吡咯-1-基)已醯胺基)乙醯胺基)乙醯胺基)-3-苯基丙酸8g(2.7mg，5.80μmol，採用專利申請“EP2907824”公開的方法製備而得)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2.7mg，9.67μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌15分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮得到標題產物8(2mg，產率：39.0%)。
MS m/z(ESI)：1060.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 9.01(d,1H),8.77(t,1H),8.21(t,1H),8.08-7.92(m,2H),7.73(d,1H),7.28(s,1H),7.24-7.07(m,4H),6.98(s,1H),6.50(s,1H),5.61(q,1H),5.40(s,2H),5.32(t,1H),5.12(q,2H),4.62(t,1H),4.52(t,1H),4.40-4.32(m,1H),3.73-3.47(m,8H),3.16-3.04(m,2H),2.89(dd,1H),2.69-2.55(m,2H),2.37-2.23(m,4H),2.12-1.93(m,4H),1.90-1.74(m,2H),1.52-1.38(m,4H),1.33-1.11(m,5H),0.91-0.81(m,4H)。
實施例9
N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-B
Figure 108135663-A0101-12-0084-68
Figure 108135663-A0101-12-0085-69
第一步
2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯9a
將2a(1.3g，11.2mmol；採用專利申請“WO2013/106717”公開的方法製備而得)溶於50mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(6.18g，44.8mmol)，溴化苄(1.33mL，11.2mmol)和四丁基碘化銨(413mg，1.1mmol)。將反應液室溫攪拌48小時，藉由矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物9a(2g，產率：86.9%)。
第二步
10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯9b
將9a(120.9mg,0.586mmol)和8b(180mg，0.489mmol)加入反應瓶，加入4mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(109mg，0.98mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌40分鐘， 加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於4mL二氧六環中，加入2mL水，加入碳酸氫鈉(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(126mg，0.49mmol)，室溫攪拌2小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物9b(48mg，產率：19%)。
MS m/z(ESI)：515.0[M+1]。
第三步
10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸9c
將9b(20mg，0.038mmol)溶於4.5mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(12mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物9c(13mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-環丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧基乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸酯9d
將1b(10mg，18.8μmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入 粗品9c(13mg，30.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(16.9mg，61.2μmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物9d(19mg，產率：73.6%)。
MS m/z(ESI)：842.1[M+1]。
第五步
2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺9e
將9d(19mg，22.6μmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入1mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。往殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，保留固體。將固體殘餘物減壓濃縮，油泵拉乾得到粗品標題產物9e(17mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：638.0[M+18]。
第六步
N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲 哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-B
將粗品9e(13.9mg，22.4μmol)溶於0.6mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(21.2mg，44.8μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(18.5mg，67.3μmol)，冰浴攪拌反應10分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物9。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(9-A：2.4mg，9-B：1.7mg)。
MS m/z(ESI)：1074.4[M+1]。
單一構型化合物9-A(較短保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.14分鐘，純度：85%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.60(t,1H),8.51-8.49(d,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.96(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.15(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.74-4.62(m,1H),4.54-4.40(m,2H),3.76-3.64(m,4H),3.62-3.48(m,2H),3.20-3.07(m,2H),3.04-2.94(m,1H),2.80-2.62(m,1H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.15(m,2H),2.15-2.04(m,2H),1.93-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.87(t,3H),0.64-0.38(m,4H)。
單一構型化合物9-B(較長保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.16分鐘，純度：89%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.68-8.60(m,1H),8.58-8.50(m,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.94(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.13(m,3H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.60-5.50(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,2H),4.78-4.68(m,1H),4.60-4.40(m,2H),3.76-3.58(m,4H),3.58-3.48(m,1H),3.20-3.10(m,2H),3.08-2.97(m,2H),2.80-2.72(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.13(m,2H),2.13-2.04(m,2H),2.03-1.94(m,2H),1.91-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,4H),0.91-0.79(m,3H),0.53-0.34(m,4H)。
實施例10
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺10-A
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺10-B
Figure 108135663-A0101-12-0090-298
Figure 108135663-A0101-12-0090-299
第一步
3,3,3-三氟-2-羥基丙酸苄酯10a
將3a(1.80g，12.5mmol)溶於100mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(5.17g，37.5mmol)，溴化苄(4.48mL，37.5mmol)和四丁基碘化銨(231mg，0.63mmol)。將反應液加熱至60℃攪拌5小時。將反應液冷卻至室溫，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物10a(980mg，產率：33.5%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.43-7.36(m,5H),5.34(s,2H),4.53(s,1H),3.44(s,1H)。
第二步
1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-10-(三氟甲基)-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯10b
將8b(63mg,0.17mmol)和10a(80mg，0.34mmol)加入反應瓶，加入3mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(38mg，0.34mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌20分鐘，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合併有機相並濃縮，所得殘餘物溶於2mL二氧六環中，加入0.4mL水，加入碳酸氫鈉(19mg，0.23mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(49mg，0.19mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物10b(51mg，產率：55.3%)。
MS m/z(ESI)：559.9[M+18]。
第三步
1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-10-(三氟甲基)-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸10c
將10b(15mg，0.28mmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(15mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物10c(13mg)。
MS m/z(ESI)：452.9[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((3-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並 [1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,1,1-三氟-3-側氧基丙-2-基)氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸酯10d
將1b(10mg，18.8μmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入10c(13mg，28.7μmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(11mg，39.7μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物10d(16mg，產率97.8%)。
MS m/z(ESI)：870.0[M+1]。
第五步
2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟丙醯胺10e
將10d(16mg，18.4μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。往殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，保留固體；重複三次。將固體殘餘物減壓濃縮，油泵拉乾得到粗品標題產物10e(12mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：647.9[M+1]。
第六步
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並 [1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺10-A
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺10-B
將粗品10e(12mg，18.5μmol)溶於1.0mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(14mg，29.6μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(15mg，54.2μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物10。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(2.7mg，2.6mg)。
MS m/z(ESI)：1102.0[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.18分鐘，純度：91%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.97(d,1H),8.85-8.76(m,1H),8.37-8.27(m,1H),8.12-8.02(m,1H),8.02-7.95(m,1H),7.80(d,1H),7.31(s,1H),7.26-7.10(m,4H),6.99(s,1H),6.66(br,1H),6.52(s,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,1H),5.37-5.25(m,3H),5.23-5.13(m,1H), 4.81-4.68(m,2H),4.51-4.41(m,1H),3.78-3.45(m,6H),3.21-3.13(m,1H),3.02-2.93(m,1H),2.77-2.63(m,2H),2.45-2.29(m,3H),2.24-2.05(m,3H),2.04-1.93(m,5H),1.90-1.75(m,2H),1.52-1.38(m,4H),0.90-0.78(m,5H)。
單一構型化合物(較長保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.23分鐘，純度：90%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 9.05(d,1H),8.97-8.88(m,1H),8.35-8.27(m,1H),8.11-8.03(m,1H),8.02-7.95(m,1H),7.80(d,1H),7.34(s,1H),7.29-7.13(m,4H),6.99(s,1H),6.66(br,1H),6.54(s,1H),5.64-5.55(m,1H),5.43(s,1H),5.36-5.20(m,3H),4.92-4.85(m,1H),4.82-4.72(m,2H),4.52-4.42(m,1H),3.77-3.48(m,6H),3.21-3.14(m,1H),3.03-2.95(m,1H),2.79-2.65(m,2H),2.47-2.28(m,3H),2.25-2.05(m,3H),2.05-1.94(m,5H),1.91-1.76(m,2H),1.52-1.37(m,4H),0.92-0.77(m,5H)。
實施例11
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺11
Figure 108135663-A0101-12-0094-71
Figure 108135663-A0101-12-0095-72
第一步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丁烷-1-羧酸苄酯11b
將1-羥基環丁烷-羧酸苄酯11a(167mg，0.81mmol，採用文獻“Journal of Medicinal Chemistry,2013,vol.56,# 13,p.5541-5552”公開的方法製備而得)和8b(150mg，0.41mmol)加入反應瓶，加入5mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(92mg，0.82mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌10分鐘，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相並濃縮，所得殘餘物溶於3mL二氧六環中，加入0.6mL水，加入碳酸氫鈉(41mg，0.48mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(105mg，0.41mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物11b(37mg，產率：17.6%)。
MS m/z(ESI)：514.6[M+1]。
第二步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丁烷-1-羧酸11c
將11b(37mg，71.9μmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(15mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應2小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到標題產物11c(35mg，產率：82%)，直接進行下一步。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丁氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸酯11d
將1b(10mg，0.018mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入11c(13mg，0.031mmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(25mg，0.091mmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入8mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(8mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系A純化所得殘餘物，得到標題產物11d(19mg，產率73.9%)。
MS m/z(ESI)：842.3[M+1]。
第四步
1-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺11e
將11d(19mg，22.6μmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液減壓濃縮，加入1mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入4mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物11e(15mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第五步
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺11
將粗品11e(2mg，3.22μmol)溶於0.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(1.5mg，3.17μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2.7mg，9.67μmol)，室溫攪拌30分鐘。反應液用油泵旋乾，除掉DMF，殘餘物用DCM溶解後直接用薄層層析法純化2次(展開劑極性：DCM/MeOH=10/1)，得到標題產物11(1mg，產率：28.8%)。
MS m/z(ESI)：1073.6[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 8.70-8.60(m,1H),8.28-8.19(m,1H),8.13-7.91(m,3H),7.79-7.71(d,1H),7.29(s,1H),7.25-7.09(m,4H),6.98(s,1H),6.71-6.62(m,1H),6.55-6.47(m,1H),5.64-5.54(m,2H),5.40(s,1H),5.35-5.27(t,2H),5.17-5.10(m,2H),4.60-4.51(m,1H),4.51-4.35(m,2H),3.93-3.78(m,3H),3.71-3.59(m,3H),3.01-2.88(m,3H),2.70-2.64(m,2H),2.44-2.30(m,3H),2.28-2.14(m,3H),2.11-1.92(m,6H),1.90-1.76(m,3H),1.51-1.39(m,4H),0.92-0.75(m,6H)。
實施例12
(S)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基丙醯胺12-A
(R)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基丙醯胺12-B
Figure 108135663-A0101-12-0098-300
Figure 108135663-A0101-12-0098-301
第一步
3-環丙基-2-羥基丙酸12b
將12a(0.5g，3.87mmol，供應商Adamas)溶於35mL水和乙酸(V：V=4：1)的混合溶劑中，冰水浴降溫至0-5℃，滴加亞硝酸鈉(0.53g，7.74mmol)的2M水溶液，升至室溫攪拌反應3小時。向反應液中加入固體氯化鈉，使水相飽和，用乙酸乙酯(8mL×8)萃取，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮，得到標題產物12b(0.45g，產率：89.3%)。
第二步
(S)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基丙醯胺12-A
(R)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基丙醯胺12-B
向1b(45mg，0.085mmol)中加入1.5mL乙醇和1.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，滴加0.1mL N-甲基嗎啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入12b(90mg，0.691mmol)，1-羥基苯並三唑(34mg，0.251mmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(49mg，0.256mmol)，加畢，室溫攪拌反應3小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物12用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：Sharpsil-T C18 5um 21.2*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)，B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，得到標題產物(7mg，15mg)。
MS m/z(ESI)：547.9[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.345分鐘，純度：72%(色譜柱：ZORBAX Ecliphase Plus C18 1.8um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.42(d,1H),7.78(d,1H),7.30(s,1H),6.51(s,1H),5.60-5.50(m,2H),5.42(s,1H),5.19(q,2H),4.02-4.00(m,1H),3.21-3.11(m,2H),2.39(s,3H),2.21-2.07(m,2H),2.05-1.95(m,1H),1.92-1.68(m,4H),1.53-1.41(m,1H),0.87(t,3H),0.48-0.34(m,2H),0.14-0.01(m,2H)。
單一構型化合物(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.399分鐘，純度：88%(色譜柱：ZORBAX Ecliphase Plus C18 1.8um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.36(d,1H),7.77(d,1H),7.31(s,1H),6.51(s,1H),5.58-5.51(m,1H),5.48(d,1H),5.42(s,1H),5.20(q,2H),4.09-4.02(m,1H),3.22-3.11(m,2H),2.39(s,3H),2.27-2.06(m,2H),2.05-1.95(m,1H),1.93-1.81(m,2H),1.65-1.43(m,2H),1.32-1.21(m,1H),0.87(t,3H),0.48-0.33(m,2H),0.14-0.01(m,2H)。
實施例13(參照例)
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥乙 醯胺
Figure 108135663-A0101-12-0100-75
標題化合物13參照專利“EP2907824A1中說明書第147頁的Example 76”公開的方法製備而得。
實施例14
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(環丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺14-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(環丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺14-B
Figure 108135663-A0101-12-0101-302
Figure 108135663-A0101-12-0101-303
第一步
3-環丙基-2-羥基丙酸苄酯14a
將12b(200mg，1.54mmol)溶於20mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(1.06g，7.68mmol)，溴化苄(0.16mL，1.34mmol)和四丁基碘化銨(28mg，0.07mmol)。將反應液室溫攪拌48小時，藉由矽藻土過濾，濾 餅用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物14a(140mg，產率：41.3%)。
第二步
10-(環丙基甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯14b
將14a(94mg,0.427mmol)和8b(130mg，0.353mmol)加入反應瓶，加入10mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(79mg，0.704mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌10分鐘，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(10mL×4)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物14b(50mg，產率：26.8%)。
MS m/z(ESI)：529.2[M+1]。
第三步
10-(環丙基甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸14c
將14b(27mg，0.051mmol)溶於3mL乙酸乙酯，加入鈀碳(7mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物14c(23mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：439.1[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((3-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7] 吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸酯14d
將1b(22mg，42.38μmol)加入反應瓶，加入3mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加三乙胺(4.3mg，42.49μmol)，加入粗品14c(23mg，51.1μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(17.6mg，63.6μmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入15mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(15mL)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物14d(29mg，產率：79.9%)。
MS m/z(ESI)：856.1[M+1]。
第五步
2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)丙醯胺14e
將14d(29mg，33.9μmol)溶於0.8mL二氯甲烷中，加入0.4mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液減壓濃縮，加入1mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。往殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，重複三次。將殘餘物減壓濃縮，油泵拉乾得到粗品標題產物14e(22mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：634.1[M+1]。
第六步
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(環丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並 [3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺14-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(環丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺14-B
將粗品14e(22mg，33.9μmol)溶於2.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，依次加入8g(24mg，50.8μmol)，和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(14mg，50.6μmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物14。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，得到標題產物(2mg，2mg)。
MS m/z(ESI)：1088.4[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.18分鐘，純度：88%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
單一構型化合物(較長保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.23分鐘，純度：96%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
實施例15
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五側氧基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3,4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺15
Figure 108135663-A0101-12-0105-304
Figure 108135663-A0101-12-0105-305
第一步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜癸基)環丙烷-1-羧酸苄酯15b
將8b(500mg，1.35mmol)加入反應瓶，加入6mL四氫呋喃，將1-羥基甲基環丙烷-1-甲酸苄酯15a(233mg，1.13mmol；採用專利申請“EP2862856A1中說明書第262頁的Example 22-2”公開的方法製備而得)加入瓶中，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入氫化鈉(54mg，1.35mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌40分鐘；降至零度加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物15b(15mg，產率：2.5%)。
MS m/z(ESI)：515.2[M+1]。
第二步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜癸基)環丙烷-1-羧酸15c
1-(10-(9H-fluoren-9-yl)-5,8-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazadecyl)cyclopropanecarboxylic acid
將15b(15mg，0.029mmol)溶於2mL乙酸乙酯中，加入鈀碳(3mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應4.5小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到標題產物15c(11mg，產率：89%)。
MS m/z(ESI)：425.2[M+1]。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並 [1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙基)甲氧基)甲基)胺基)2-側氧基乙基)胺基甲酸酯15d
將1b(10mg，0.021mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入15c(11mg，0.026mmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(10.7mg，0.039mmol)，加完後室溫攪拌反應60分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物15d(19mg，產率87.0%)。
MS m/z(ESI)：842.2[M+1]。
第四步
1-(((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)甲基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺15e
將15d(19mg，22.56μmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液在0℃下減壓濃縮，加入1mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次；減壓濃縮得到粗品標題產物15e(13.9mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：620.1[M+1]。
第五步
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五側氧基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫 -1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺15
將粗品15e(13.9mg，22.4μmol)溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(15.8mg，33.4μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(9.3mg，33.6μmol)，升至室溫攪拌反應60分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮得到標題產物15(2.5mg，產率：10.3%)。
MS m/z(ESI)：1074.2[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.51-8.37(m,1H),8.22(t,1H),8.14-8.02(m,2H),8.011-7.94(m,1H),7.82-7.73(m,1H),7.29(s,1H),7.26-7.10(m,3H),6.98(s,1H),6.53-6.47(m,1H),5.62-5.50(m,1H),5.45-5.36(m,1H),5.35-5.23(m,2H),5.13-5.02(m,2H),4.61-4.50(m,2H),4.42-4.28(m,2H),3.76-3.61(m,3H),3.60-3.45(m,3H),3.27-3.23(m,1H),3.20-2.81(m,7H),2.75-2.61(m,3H),241-2.28(m,3H),2.23-2.13(m,2H),2.11-2.01(m,1H),2.03-1.94(m,1H),1.90(s,1H),1.87-1.74(m,2H),1.53-1.36(m,3H),1.29-1.08(m,4H),0.90-0.68(m,4H)。
實施例16
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五側氧基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺16
Figure 108135663-A0101-12-0109-306
Figure 108135663-A0101-12-0109-307
第一步
1-(羥基甲基)環丁烷-1-羧酸16b
將1-(羥甲基)環丁烷羧酸乙酯16a(250mg，1.58mmol，供應商Alfa)溶於甲醇(2mL)和水(1mL)，加入氫氧化鈉(126mg，3.15mmol)，升溫至40℃，攪拌反應3小時。冷卻至常溫，減壓濃縮除去有機溶劑，用乙醚(10mL)反萃，收集水相。水相用6N鹽酸水溶液調至pH 3-4，減壓濃縮得到固體。加入3mL甲苯，減壓濃縮旋乾，重複三次。油泵 拉乾，得到粗品標題產物16b(206mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI，NEG)：129.2[M-1]。
第二步
1-(羥基甲基)環丁烷-1-羧酸苄酯16c
將粗品16b(206mg，1.58mmol)溶於乙腈(15mL)，加入無水碳酸鉀(1.09g，7.90mmol)和四丁基碘化銨(29mg，78.51umol)，加入溴化苄(216mg，1.26mmol)，室溫攪拌過夜。過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物16c(112mg，產率：32.1%)。
MS m/z(ESI)：221.1[M+1]。
第三步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜癸基)環丁烷-1-羧酸苄酯16d
將16c(77mg，0.35mmol)和8b(100mg，0.27mmol)加入反應瓶，加入3mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(61mg，0.54mmol)，冰浴攪拌10分鐘。加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於3mL 1,4-二氧六環中，加入0.5mL水，加入碳酸氫鈉(27mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(71mg，0.27mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物16d(24mg，產率：16.7%)。
MS m/z(ESI)：551.3[M+23]。
第四步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜癸基)環丁烷-1-羧酸16e
將16d(12mg，22.7μmol)溶於1.5mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(5mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應2小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液減壓濃縮，得到粗品標題產物16e(10mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第五步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丁基)甲氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸酯16f
將1b(7.5mg，0.014mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品16e(10mg)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(6mg，0.026mmol)，冰浴攪拌反應30分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物16f(10.6mg，產率87.8%)。
MS m/z(ESI)：856.2[M+1]。
第六步
1-(((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)甲基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺16g
將16f(10.6mg，12.4μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次。減壓濃縮得到粗品標題產物16g(8mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：634.1[M+1]。
第七步
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五側氧基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺16
將粗品16g(8mg)溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，加入8g(8.8mg，18.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(5.2mg，18.8μmol)，室溫攪拌反應30分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，得到標題產物16(1.0mg，產率：7.2%)。
MS m/z(ESI)：1088.0[M+1]。
實施例17
(1r,4r)-N-((S)-7-苄基-1-(1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)-3,6,9,12,15-五側氧基-17,20,23,26,29,32,35,38,41-九氧雜-2,5,8,11,14-五氮雜四十三-43-基)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺17
Figure 108135663-A0101-12-0113-308
Figure 108135663-A0101-12-0113-309
第一步
1-苯基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十氧雜三十一-31-酸第三丁酯17b
將1-苯基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧雜二十八-28-醇17a(0.34g，0.67mmol，供應商畢得)溶於10mL二氯甲烷中，依次加入 氧化銀(0.24g，1.01mmol)、溴乙酸第三丁酯(0.16g，0.81mmol)和碘化鉀(0.07g，0.40mmol)，室溫攪拌反應3小時。過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物17b(0.42g，產率：100%)。
MS m/z(ESI)：636.3[M+18]。
第二步
29-羥基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九-1-酸第三丁酯17c
將17b(417mg，0.67mmol)溶於15mL四氫呋喃，加入鈀碳(110mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，升至60℃攪拌反應3小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物17c(357mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：546.2[M+18]。
第三步
29-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九-1-酸第三丁酯17d
將17c(357mg,0.675mmol)溶於10mL甲苯，加入疊氮磷酸二苯酯(279mg，1.014mmol)和1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯(206mg，1.353mmol)，氬氣置換三次，室溫攪拌反應2小時，然後升至105℃反應19小時。反應液冷卻至室溫，濃縮，加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×4)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到粗品標題產物17d(412mg)。
MS m/z(ESI)：571.3[M+18]。
第四步
29-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九-1-酸第三丁酯17e
將17d(230mg，0.415mmol)溶於8mL四氫呋喃，加入鈀碳(58mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應2小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物17e(220mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：528.2[M+1]。
第五步
1-((1r,4r)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己基)-1-側氧基-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜三十一-31-酸第三丁酯17f
將(1r,4r)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-羧酸(98.5mg，0.415mmol)溶於10mL二氯甲烷，加入2-(7-氧化苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(190mg，0.500mmol)和N,N-二異丙基乙胺(162mg，1.253mmol)，氬氣置換三次，加入粗品17e(220mg，0.417mmol)，室溫攪拌反應1小時。加入15mL水，用二氯甲烷(8mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(15mL)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物17f(122mg，產率：39.2%)。
MS m/z(ESI)：747.2[M+1]。
第六步
1-((1r,4r)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己基)-1-側氧基-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜三十一-31-酸17g
將17f(122mg，0.163mmol)溶於0.8mL二氯甲烷中，加入0.4mL三氟乙酸，室溫攪拌反應1小時。加入15mL二氯甲烷稀釋，減壓濃縮；加入10mL正己烷，減壓濃縮，重複兩次；再加入10mL甲苯 減壓濃縮；用10mL正己烷：乙醚=5：1的混合溶劑打漿三次，至pH接近7，濃縮，油泵抽乾，得到標題產物17g(98mg，產率：86.8%)。
MS m/z(ESI)：691.2[M+1]。
第七步
2,4-二甲氧基苄基1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙基-1-羧酸酯17h
將8d(164mg，0.40mmol)溶於二氯甲烷(5mL)，依次加入2,4-二甲氧基苄醇(81mg，0.48mmol)，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽(115mg，0.60mmol)和4-二甲胺基吡啶(5mg，0.041mmol)，加畢，室溫攪拌反應1小時。加入20mL水，震盪後分層，水相用二氯甲烷(8mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物17h(124mg，產率：55.4%)。
MS m/z(ESI)：583.1[M+23]。
第八步
2,4-二甲氧基苄基(S)-1-((11-苄基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜十七-17-基)氧基)環丙基-1-羧酸酯17j
將17h(39mg，69.6umol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌1小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮。將所得到的粗品溶於2mL N,N-二甲基甲醯胺，加入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘胺醯-L-苯丙胺酸17i(35mg，69.8μmol，採用專利申請“CN108853514A中說明書第13頁的實施例7-12”公開的方法製備而 得)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(23mg，83.1μmol)，室溫攪拌1小時。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物17j(48mg，產率：83.9%)。
MS m/z(ESI)：822.0[M+1]。
第九步
(S)-1-((11-苄基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜十七-17-基)氧基)環丙烷-1-羧酸17k
將17j(48mg，58.4μmol)溶於1.4mL 3%(v/v)的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降溫至0-5℃，加入三乙基矽烷(21mg，180.6μmol)，冰浴攪拌反應3小時。冰浴下減壓濃縮除去一半有機溶劑，加入5mL乙醚，自然升至室溫打漿，析出白色固體，過濾，收集濾餅，油泵抽乾，得到標題產物17k(33mg，產率：84.1%)。
第十步
(9H-芴-9-基)甲基((S)-7-苄基-1-(1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)-3,6,9,12-四側氧基-2,5,8,11-四氮雜十三-13-基)胺基甲酸酯17l
將1b(20mg，42.4μmol)加入反應瓶，加入1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，氬氣置換三次，冰水浴冷卻至0~5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至1b溶解。將17k(33mg，49.1μmol)溶於1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，然後滴加入上述反應液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(17.6mg，63.6μmol)。升至室溫， 攪拌反應1小時。加入10mL二氯甲烷和5mL水，攪拌5分鐘，靜置分層，收集有機相；水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物17l(37mg，產率：80.2%)。
MS m/z(ESI)：1090.1[M+1]。
第十一步
(1r,4r)-N-((S)-7-苄基-1-(1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)-3,6,9,12,15-五側氧基-17,20,23,26,29,32,35,38,41-九氧雜-2,5,8,11,14-五氮雜四十三-43-基)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺17
將17l(15.5mg，14.23μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次。減壓濃縮，然後用油泵抽乾。將所得粗品溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17g(11mg，15.92μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(6.0mg，21.68μmol)，氬氣置換三次，室溫攪拌反應30分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮得到標題產物17(6mg，產率：27.4%)。
MS m/z(ESI)：1556.4[M+18]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.98(d,1H),8.76(s,1H),8.20(br,1H),8.12-7.95(m,3H),7.93-7.76(m,2H),7.75-7.66(m,2H),7.24(s,1H),7.20-7.05(m,6H),6.97(s,1H),6.64(br,1H),6.55(d,1H),6.47(s,1H),5.61-5.52(m,2H),5.37(s,1H),5.33-5.23(m,2H),5.18(s,1H),5.13(s,1H),5.05(s,1H),5.00(s,1H),4.65-4.55(m,2H),4.53-4.45(m,1H),4.38-4.28(m,2H),3.84(s,2H),3.67(d,3H),3.60-3.40(m,33H),3.18(d,1H),3.15-3.08(m,3H),2.28(s,3H),2.00-1.92(m,3H),1.85(s,2H),1.82-1.73(m,2H),1.68-1.52(m,4H),1.29-1.15(m,3H),0.86-0.76(m,5H)。
實施例18
(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六側氧基-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十六-46-基)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺18
Figure 108135663-A0101-12-0119-185
Figure 108135663-A0101-12-0120-186
第一步
(R)-2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯18a
(S)-2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯18b
將2a(7.4g，63.7mmol)溶於200mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(35g，253.6mmol)，溴化苄(9.3g，54.4mmol)和四丁基碘化銨(500mg，1.36mmol)。將反應液室溫攪拌16小時，藉由矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物4.1g，進一步手性拆分純化，得到標題產物18a(1.1g)和18b(1.2g)。
第二步
(R)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯18c
將8b(3.1g，8.41mmol)溶於四氫呋喃(55mL)中，加入18a(2.0g，9.70mmol)，冰水浴冷卻至0~5℃，加入第三丁醇鉀(1.89g，16.84mmol)，冰水浴下攪拌10分鐘。加入乙酸乙酯(30mL)和水(20mL)，靜置分層，水相用氯仿(30mL×5)萃取，合併有機相。有機相減壓濃縮，所得殘餘物溶於1,4-二氧六環(32mL)和水(8mL)，加入碳酸鈉(1.78g，16.79mmol)和氯甲酸-9-芴基甲酯(2.18g，8.42mmol)，室溫攪拌2小時。反應液中加入水(30mL)，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(30mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用柱層析以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物18c(1.3g，產率：30.0%)。
MS m/z(ESI)：515.2[M+1]。
第三步
(R)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸18d
將18c(1.29g，2.51mmol)溶於乙酸乙酯(15mL)中，加入鈀碳(260mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應5小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(20mL)和甲醇(20mL)淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物18d(980mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：425.1[M+1]。
第四步
2,4-二甲氧基苄基(R)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酯18e
將粗品18d(980mg，2.31mmol)溶於二氯甲烷(15mL)中，加入2,4-二甲氧基苄醇(777mg，4.62mmol)，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽(664mg，3.46mmol)和4-二甲胺基吡啶(28mg，0.23mmol)，室溫攪拌一小時。減壓濃縮除去有機溶劑，加入20mL水，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(30mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用柱層析以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物18e(810mg，產率：61.1%)。
m/z(ESI)：575.0[M+1]。
第五步
2,4-二甲氧基苄基(R)-2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基乙酸酯18f
將18e(33mg，57.4μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌1小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物18f(21mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第六步
2,4-二甲氧基苄基(11S,19R)-11-苄基-19-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,18-二氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十-20-酸酯18g
將粗品18f(21mg，57.4μmol)溶於3mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17i(29mg，57.8μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(19mg，68.7μmol)，室溫攪拌1小時。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10 mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物18g(37mg，產率：77.1%)。
MS m/z(ESI)：853.0[M+18]。
第七步
(11S,19R)-11-苄基-19-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,18-二氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十-20-酸18h
將18g(37mg，44.3μmol)溶於1.4mL 3%(v/v)的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降溫至0-5℃，加入三乙基矽烷(15.4mg，132.4μmol)，冰浴攪拌反應3小時。冰浴下減壓濃縮除去一半有機溶劑，加入5mL乙醚，自然升至室溫打漿，析出白色固體，過濾，收集濾餅，油泵抽乾，得到標題產物18h(24mg，產率：79.1%)。
MS m/z(ESI)：708.2[M+23]。
第八步
(9H-芴-9-基)甲基((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)胺基甲酸酯18i
將1b(30mg，63.6μmol)加入反應瓶，加入1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至1b溶解。將18h(65mg，94.8μmol)溶於1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，然後滴加入上述反應液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(27mg，97.6μmol)。升至室溫，攪拌反應1小時。加入10mL二氯甲烷和5mL水，攪拌5分鐘，靜置分層，收集有機相；水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和 氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物18i(25mg，產率：35.6%)。
MS m/z(ESI)：1104.4[M+1]。
第九步
(S)-2-(2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基)-N-(2-((((R)-1-環丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧基乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙氧基)-3-苯基丙醯胺18j
將18i(12mg，10.9μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物18j(10mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：881.0[M+1]。
第十步
(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六側氧基-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十六-46-基)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺18
將粗品18j(10mg)溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17g(8.5mg，12.3μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.6mg，16.6μmol)，室溫攪拌30分鐘。反應液過濾，進行高 效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物18(9.5mg，產率：56.2%)。
MS m/z(ESI)：1570.2[M+18]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.77(d,1H),8.59-8.55(m,1H),8.42(d,1H),8.37-8.28(m,1H),8.25-8.06(m,2H),7.96-7.86(m,1H),7.86-7.70(m,2H),7.32-7.28(m,1H),7.25-7.14(m,3H),6.67(m,1H),5.96(s,1H),5.80-5.72(m,1H),5.62-5.52(m,2H),5.43-5.30(m,3H),5.28-5.17(m,2H),5.12-5.08(m,1H),4.72-4.35(m,8H),3.95-3.70(m,13H),3.35-3.22(m,14H),2.42-2.32(m,3H),2.05-1.98(m,4H),1.88-1.82(m,12H),1.47-1.39(m,3H),1.32-1.18(m,11H),0.90-0.80(m,4H),0.52-0.37(m,3H),0.32-0.18(m,2H)。
實施例19
(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六側氧基-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十六-46-基)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺19
Figure 108135663-A0101-12-0125-187
Figure 108135663-A0101-12-0126-188
第一步
(S)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯19a
將18b(252mg,1.22mmol)加入反應瓶，加入4mL二氯甲烷，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鋰(98mg,1.22mmol)，冰水浴下攪拌反應15分鐘，變澄清，加入8b(300mg,814.3μmol)，冰水浴下攪拌2.5小時。加水(10mL)，分液，水相用二氯甲烷(8mL×2)萃取，合併有機相後用水(10mL×1)洗，飽和食鹽水(10mL×2)洗，無水硫酸鈉乾燥，過濾濃縮得粗品。用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物19a(282mg，產率：67.2%)。
第二步
(S)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸19b
將19a(280mg，0.554mmol)溶於8mL乙酸乙酯中，加入鈀碳(84mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應3小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物19b(230mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
第三步
2,4-二甲氧基苄基(S)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸酯19c
將粗品19b(230mg，541.8μmol)溶於7mL二氯甲烷中，依次加入2,4-二甲氧基苯甲醇(136.7mg,812.7μmol)，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽(155mg,808.5umol)和4-二甲胺基吡啶(6.6mg,53.5umol)，室溫攪拌16小時。反應液用10mL二氯甲烷稀釋後，用水(10mL×1)洗，飽和食鹽水(10mL×2)洗，無水硫酸鈉乾燥，過濾濃縮得粗品。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物19c(159mg，產率：51.0%)
第四步
2,4-二甲氧基苄基(S)-2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基乙酸酯19d
將19c(60mg，104.4μmol)溶於1mL二氯甲烷中，加入0.5mL二乙胺，室溫攪拌1小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物19d(21mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第五步
2,4-二甲氧基苄基(11S,19S)-11-苄基-19-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,18-二氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十-20-酸酯19e
將粗品19d(36mg，102.2μmol)溶於4mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17i(52mg，103.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(34.6mg，125.0μmol)，室溫攪拌1小時。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物19e(70mg，產率：80.2%)。
第六步
(11S,19S)-11-苄基-19-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,18-二氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十-20-酸19f
將19e(70mg，83.7μmol)溶於2.5mL 3%(v/v)的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降溫至0-5℃，加入三乙基矽烷(29mg，249.4μmol)，冰浴攪拌反應3小時。冰浴下減壓濃縮除去一半有機溶劑，加入5mL乙醚，自然升至室溫打漿，析出白色固體，過濾，收集濾餅，油泵抽乾，得到標題產物19f(57mg，產率：99.2%)。
第七步
(9H-芴-9-基)甲基((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)胺基甲酸酯19g
將1b(30mg，63.6μmol)加入反應瓶，加入1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三 乙胺，攪拌至1b溶解。將19f(57mg，83.1μmol)溶於1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，然後滴加入上述反應液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(26mg，93.9μmol)。升至室溫，攪拌反應1小時。加入10mL二氯甲烷和5mL水，攪拌5分鐘，靜置分層，收集有機相；水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物19g(56mg，產率：79.8%)。
MS m/z(ESI)：1103.1[M+1]。
第八步
(S)-2-(2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基)-N-(2-((((S)-1-環丙基-2-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧基乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)-3-苯基丙醯胺19h
將19g(4.6mg，4.16μmol)溶於1.5mL二氯甲烷中，加入0.75mL二乙胺，室溫攪拌1.6小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物19h(4.0mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第九步
(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六側氧基- 3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十六-46-基)-4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺19
將粗品19h(4.0mg)溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17g(2.9mg，4.2μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(1.5mg，5.4μmol)，室溫攪拌40分鐘。反應液過濾，進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物19(2.1mg，產率：32.4%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.71-8.62(m,1H),8.59-8.51(m,1H),8.34-8.26(m,1H),8.14-8.02(m,2H),7.95-7.86(m,1H),7.83-7.69(m,2H),7.35-7.31(m,1H),7.29-7.11(m,3H),7.01(s,1H),6.72-6.50(m,3H),5.59-5.50(m,2H),5.42(s,2H),5.38-5.18(m,3H),4.79-4.69(m,2H),4.61-4.42(m,3H),3.91(s,2H),3.79-3.65(m,4H),3.63-3.44(m,13H),3.41-3.30(m,2H),3.26-3.09(m,5H),3.08-2.84(m,4H),2.81-2.64(m,3H),2.42-2.28(m,3H),2.24-2.12(m,2H),2.05-1.93(m,4H),1.89-1.77(m,2H),1.72-1.56(m,3H),1.53-1.38(m,3H),1.34-1.10(m,11H),0.94-0.78(m,5H),0.52-0.35(m,3H)。
實施例20(參照例)
Figure 108135663-A0101-12-0130-189
標題化合物20參照專利“CN104755494A中說明書第163頁的實施例58”提供的方法合成。
以下抗體按抗體常規方法進行製備，例如可進行載體構建後，轉染真核細胞如HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，純化表達。
以下為Trastuzumab的序列
輕鏈
Figure 108135663-A0101-12-0131-190
SEQ ID NO.1
重鏈
Figure 108135663-A0101-12-0131-191
SEQ ID NO.2
以下為Pertuzumab的序列：
輕鏈
Figure 108135663-A0101-12-0132-192
SEQ ID NO.3
重鏈
Figure 108135663-A0101-12-0132-193
SEQ ID NO.4
以下為B7H3抗體1F9DS的序列：
輕鏈
Figure 108135663-A0101-12-0133-194
SEQ ID NO.5
重鏈
Figure 108135663-A0101-12-0133-195
SEQ ID NO.6
實施例21 ADC-1
Figure 108135663-A0101-12-0133-196
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；2.5ml，9.96mg/ml，0.168μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.082mL，0.82μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/ml，並取出2.0ml溶液往下反應。
將化合物10-較短保留時間化合物(2.1mg，2.02μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述2.0ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性產物ADC-1的PBS緩衝液(5.0mg/mL，1.1mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=5.09。
實施例22 ADC-2
Figure 108135663-A0101-12-0134-197
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；2.5ml，9.96mg/ml，0.168μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.082mL，0.82μmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/ml，並取出2.0ml溶液往下反應。
將化合物10-較長保留時間化合物(2.1mg，2.02μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述2.0ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性產物ADC-2的PBS緩衝液(4.95mg/mL，1.1mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=7.39。
實施例23 ADC-3
Figure 108135663-A0101-12-0135-198
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；2.5ml，9.96mg/ml，0.168μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.082mL，0.82μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/ml，並取出2.0ml溶液往下反應。
將化合物8(2.1mg，2.02μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述2.0ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-3通式的示例性產物ADC-3的PBS緩衝液(5.24mg/mL，1.1mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=7.36。
實施例24 ADC-4
Figure 108135663-A0101-12-0136-199
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；3.74ml，13.38mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至6.7mg/ml，並取出1.3ml溶液往下反應。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(1.0mg，0.93μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述1.3ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-4的PBS緩衝液(1.72mg/mL，2.36mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=7.39。
實施例25 ADC-5
Figure 108135663-A0101-12-0136-285
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；3.0ml，6.70mg/ml，0.136μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.067mL，0.67μmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，並取出0.614ml溶液往下反應。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(0.5mg，0.42μmol)溶解於0.031mL DMSO中，加入到上述0.614ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-5的PBS緩衝液(3.08mg/mL，0.82mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=3.16。
實施例26 ADC-6
Figure 108135663-A0101-12-0137-201
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；3.74ml，13.38mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至6.7mg/ml，並取出0.75ml溶液往下反應。
將化合物9-較長保留時間化合物9-B(0.68mg，0.63μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述0.75ml溶液中，置於水浴振盪器， 於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4B通式的示例性產物ADC-6的PBS緩衝液(1.78mg/mL，1.78mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=3.94。
實施例27 ADC-7
Figure 108135663-A0101-12-0138-202
在37℃條件下，向抗體Pertuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；5.0ml，10mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/ml，並取出1.0ml溶液往下反應。
將化合物8(0.65mg，0.6μmol)溶解於0.1mL DMSO中，加入到上述1.0ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-7通式的示例性產物ADC-7的PBS緩衝液(1.42mg/mL，2.15mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=6.91。
實施例28 ADC-8
Figure 108135663-A0101-12-0139-203
在37℃條件下，向抗體Pertuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；5.0ml，10mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/ml，並取出1.6ml溶液往下反應。
將化合物10-較短保留時間化合物(1.04mg，1.0μmol)溶解於0.1mL DMSO中，加入到上述1.6ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-8通式的示例性產物ADC-8的PBS緩衝液(2.14mg/mL，2.31mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=6.58。
實施例29 ADC-9
Figure 108135663-A0101-12-0139-204
在37℃條件下，向抗體Pertuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；5.0ml，10mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)， 置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/ml，並取出0.8ml溶液往下反應。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(0.55mg，0.5μmol)溶解於0.1mL DMSO中，加入到上述0.8ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-9A通式的示例性產物ADC-9的PBS緩衝液(2.27mg/mL，1.11mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=3.16。
實施例30 ADC-10
Figure 108135663-A0101-12-0140-205
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.574mL，38.78nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，19.76uL，197.6nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物14-較短保留時間化合物(0.64mg，588nmol)溶解於40ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得 到FADC-10通式的示例性產物ADC-10的PBS緩衝液(5.48mg/mL，1.03mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.25。
實施例31 ADC-11
Figure 108135663-A0101-12-0141-206
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.646mL，43.64nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，22.24uL，222.4nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物14-較長保留時間化合物(0.72mg，662nmol)溶解於40ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-10通式的示例性產物ADC-11的PBS緩衝液(2.13mg/mL，1.87mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.03。
實施例32 ADC-12
Figure 108135663-A0101-12-0142-207
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.726mL，49.05nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，25.0uL，250.0nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物15(0.81mg，754nmol)溶解於40ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-12通式的示例性產物ADC-12的PBS緩衝液(3.34mg/mL，1.45mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.93。
實施例33 ADC-13
Figure 108135663-A0101-12-0142-208
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.287mL，19.39nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，9.88uL， 98.8nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物16(0.32mg，294nmol)溶解於20ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-13通式的示例性產物ADC-13的PBS緩衝液(2.37mg/mL，0.88mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.53。
實施例34 ADC-14
Figure 108135663-A0101-12-0143-209
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.592mL，40.0nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，20.38uL，203.8nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物17(0.92mg，598nmol)溶解於40ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-14通式的示例性產物ADC-14的PBS緩衝液(0.30mg/mL，12.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.61。
實施例35 ADC-15
Figure 108135663-A0101-12-0144-210
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.592mL，40.0nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，20.38uL，203.8nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物18(0.93mg，599nmol)溶解於40ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-15通式的示例性產物ADC-15的PBS緩衝液(0.32mg/mL，11.8mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.89。
實施例36 ADC-16
Figure 108135663-A0101-12-0144-211
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.53mL，35.8nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，18.25uL，182.5 nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物19(0.83mg，534nmol)溶解於35ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-16通式的示例性產物ADC-16的PBS緩衝液(0.32mg/mL，12.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.43。
實施例37 ADC-17
Figure 108135663-A0101-12-0145-212
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，2.0mL，135.12nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，43.2uL，432nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(2.22mg，2067nmol)溶解於175ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)， 得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-17的PBS緩衝液(1.32mg/mL，12.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=5.42。
實施例38 ADC-18(參照例)
Figure 108135663-A0101-12-0146-213
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，1.5mL，101.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，51.7uL，517nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(2.0mg，1934nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-18通式的示例性產物ADC-18的PBS緩衝液(0.79mg/mL，13.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.23。
實施例39 ADC-19
Figure 108135663-A0101-12-0147-214
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，1.36mL，91.9nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，46.9uL，469nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(2.0mg，1862nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-19的PBS緩衝液(0.73mg/mL，13.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.26。
實施例40 ADC-20
Figure 108135663-A0101-12-0147-215
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，1.5mL，101.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，51.7uL，517nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物10-較長保留時間化合物(2.0mg，1815nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性產物ADC-20的PBS緩衝液(0.73mg/mL，13.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.43。
實施例41 ADC-21(參照例)
Figure 108135663-A0101-12-0148-216
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，1.86mL，125.4nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，63.9uL，639nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(2.07mg，2001nmol)溶解於150ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-18通式的示例性產物ADC-21的PBS緩衝液(2.91mg/mL，4.44mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.23。
實施例42 ADC-22
Figure 108135663-A0101-12-0149-217
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，1.88mL，127.2nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，64.9uL，649nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(2.1mg，1955nmol)溶解於150ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-22的PBS緩衝液(3.56mg/mL，3.98mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.79。
實施例43 ADC-23(參照例)
Figure 108135663-A0101-12-0150-218
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，345mL，23.31umol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，11.89mL，118.9umol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3.5小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(362mg，350umol)溶解於7.12ml MeCN和3.56mL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液藉由超濾膜包先後用含有2%(v/v)MeCN和1%(v/v)DMSO的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)、琥珀酸緩衝水溶液(pH=5.3的0.01M的琥珀酸緩衝水溶液)脫鹽純化，之後加入蔗糖至60mg/mL、吐溫20至0.2mg/mL，裝瓶凍乾後得到FADC-18通式的示例性產物ADC-23的凍乾粉樣品，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.05。
實施例44 ADC-24
Figure 108135663-A0101-12-0151-219
在37℃條件下，向抗體Trastuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，332mL，22.43umol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，11.44mL，114.4umol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3.5小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(241mg，224umol)溶解於13.76ml MeCN和6.88mL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液藉由超濾膜包先後用含有4%(v/v)MeCN和2%(v/v)DMSO的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)、琥珀酸緩衝水溶液(pH=5.3的0.01M的琥珀酸緩衝水溶液)脫鹽純化，之後加入蔗糖至60mg/mL、吐溫20至0.2mg/mL，裝瓶凍乾後得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-24的凍乾粉樣品，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.07。
實施例45 ADC-25
Figure 108135663-A0101-12-0151-220
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，2.14mL，144.60nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，73.7uL，740nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(3.0mg，2793nmol)溶解於150ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-25通式的示例性產物ADC-25的PBS緩衝液(1.28mg/mL，13.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.87。
實施例46 ADC-26(參照例)
Figure 108135663-A0101-12-0152-221
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1uL，300nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(1.0mg，967nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-26通式的示例性產物ADC-26的PBS緩衝液(1.61mg/mL，4.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.15。
實施例47 ADC-27
Figure 108135663-A0101-12-0153-222
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1uL，300nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(1.02mg，950nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-25通式的示例性產物ADC-27的PBS緩衝液(1.94mg/mL，3.5mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.11。
實施例48 ADC-28(參照例)
Figure 108135663-A0101-12-0154-223
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，2.36mL，159.47nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，81.3uL，810nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(3.0mg，2901nmol)溶解於150ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-26通式的示例性產物ADC-28的PBS緩衝液(1.29mg/mL，13.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.46。
實施例49 ADC-29
Figure 108135663-A0101-12-0154-224
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.80mL，50.06nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，28.6uL， 290nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(1.29mg，1201nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-25通式的示例性產物ADC-29的PBS緩衝液(2.63mg/mL，2.4mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.24。
實施例50 ADC-30(參照例)
Figure 108135663-A0101-12-0155-225
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.86mL，58.4nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，29.1uL，290nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(1.0mg，967nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-26通式的示例性產物ADC-30的PBS緩衝液(1.61mg/mL，4.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.15。
實施例51 ADC-31
Figure 108135663-A0101-12-0156-226
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1uL，300nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物8(1.0mg，943nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-31通式的示例性產物ADC-31的PBS緩衝液(1.47mg/mL，4.5mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.33。
ADC原液藥物載量分析
實驗目的及原理
ADC原液是一種抗體交聯物類藥物，其治療疾病的機理是依賴抗體的靶向性將毒素分子運送到細胞中，進而將細胞殺死。藥物的載量對藥效起著決定性的作用。使用紫外法對ADC原液的藥物載量進行了測定。
實驗方法
將裝有琥珀酸鈉緩衝液的比色皿分別置於參比吸收池和樣品測定吸收池中後，扣除溶劑空白後，再將裝有供試品溶液的比色皿置於樣品測定吸收池中，測定280nm和370nm處吸光度。
結果計算：採用紫外分光光度法(使用儀器：Thermo nanodrop2000紫外分光光度計)測定ADC原液載量，其原理是在某波長下ADC原液的總吸光值等於胞毒藥物與單克隆抗體在該波長下吸光值的加和，即：(1)A280nm=εmab-280bCmab+εDrug-280bCDrug
εDrug-280：藥物在280nm平均摩爾消光係數5100；CDrug：藥物的濃度；εmab-280：曲妥珠單抗原液或帕妥珠單抗原液在280nm平均摩爾消光係數214600；Cmab：曲妥珠單抗原液或帕妥珠單抗原液的濃度；b：光程長度為1cm。
同理可以得到樣品在370nm下的總吸光值方程：(2)A370nm=εmab-370bCmab+εDrug-370bCDrug
εDrug-370：藥物在370nm平均摩爾消光係數19000；CDrug：藥物的濃度；εmab-370：曲妥珠單抗原液或帕妥珠單抗原液在370nm消光係數為0；Cmab：曲妥珠單抗原液的濃度；b：光程長度為1cm。
由(1)和(2)兩種方程結合單克隆抗體和藥物在兩個檢測波長下的消光係數和濃度數據可以計算出藥物的載量。
藥物載量=CDrug/Cmab
生物學評價
測試例1：通式(D)化合物對腫瘤細胞體外增殖抑制測試
一、測試目的
本實驗的目的是為了檢測本發明通式(D)藥物化合物，對U87MG細胞(中科院細胞庫，Catalog # TCHu138)和SK-BR-3腫瘤細胞(人乳腺癌細胞，ATCC，貨號HTB-30)體外增殖的抑制活性。以不同濃度的化合物體外處理細胞，經6天培養後，採用CTG(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay，Promega，貨號：G7573)試劑對細胞的增值進行檢測，根據IC50值評價該化合物的體外活性。
二、實驗方法
下面以對U87MG細胞體外增殖抑制測試方法為例，用於舉例說明本發明中測試本發明化合物對腫瘤細胞進行體外增殖抑制活性測試的方法。本方法同樣適用於，但不限於對其它腫瘤細胞進行體外增殖抑制活性測試。
1、細胞培養：U87MG和SK-BR-3細胞分別用10%FBS的EMEM培養基(GE，貨號SH30024.01)和含10%FBS的McCoy's 5A培養基(Gibco，貨號16600-108)培養。
2、細胞準備：取對數生長期的U87MG和SK-BR-3細胞，用PBS(磷酸鹽緩衝液，上海源培生物科技股份有限公司)洗滌1次之後，加入2-3ml胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA(1x)，Gibico,Life Technologies公司)消化2-3min，待細胞消化完全後，加入10-15ml細胞培養液，將經過消化的細胞洗脫下來，1000rpm離心5min，棄上清，接著加入10-20ml細胞培養液將細胞重懸，製成單細胞懸液。
3、細胞鋪板：將U87MG和SK-BR-3單細胞懸液混勻，用細胞培養液分別調整活細胞密度至2.75×103cells/ml和8.25×103cells/ml，將密度調整過後的細胞懸液混勻，以180μl/孔加入96孔細胞培養板。96孔板外周孔只加入200ul培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5% CO2)。
4、化合物準備：用DMSO(二甲基亞碸，上海泰坦科技股份有限公司)溶解化合物，配製成初始濃度為10mM的存儲液。
小分子化合物的起始濃度為500nM，配藥方法如下。
在96孔U型底配藥板第一列中分別加入30μl不同待測樣品，樣品濃度為100uM；第2列至第11列每孔中加入20ul DMSO。取第一列樣品10ul至第二列20ul DMSO中，混勻，取10ul至第三列中，以此類推至第10列。將配藥板中的藥每孔取5ul至95ul EMEM培養基中，混勻，待用。
ADC的起始濃度為10nM或500nM，配藥方法如下。
在96孔板第一列中分別加入100μl不同待測樣品，樣品濃度為100nM或5uM；第2列至第11列每孔中加入100ul PBS。取第一列樣品50ul至第二列100ul PBS中，混勻，取50ul至第三列中，以此類推3倍稀釋至第10列。
5、加樣操作：向培養板中加入20μl配置的不同濃度的待測樣品，每個樣品兩複孔。將培養板在培養箱孵育6天(37℃，5% CO2)。
6、顯色操作：取出96孔細胞培養板，向每孔加入90μl CTG溶液，室溫孵育10分鐘
7、讀板操作：取出96孔細胞培養板，置於酶標儀(BMG labtech，PHERAstar FS)中，用酶標儀測定化學發光。
三、數據分析
用Microsoft Excel，Graphpad Prism 5對數據進行處理分析。實驗結果參見下表。
Figure 108135663-A0101-12-0160-227
結論：本公開中的小分子片段對SK-BR-3細胞和U87細胞具有明顯的增殖抑制活性，手性中心對化合物的抑制活性有一定影響。
測試例2：本公開抗體藥物偶聯物對HER2靶標的腫瘤細胞的體外增殖抑制測試
本實驗的目的是為了檢測本公開針對HER2靶標的抗體藥物偶聯物，對SK-BR-3(人乳腺癌細胞，ATCC，貨號HTB-30)和MDA-MB-468(人乳腺癌細胞，ATCC，貨號HTB-132)體外增殖的抑制活性。以不同濃度的化合物體外處理細胞，經6天培養後，採用CTG試劑對細胞的增值進行檢測，根據IC50值評價該化合物的體外活性。
按照測試例1的測試方法，測試細胞為SK-BR-3和MDA-MB-468，細胞培養液分別為含10% FBS的McCoy's 5A培養基(Gibco，貨號16600-108)，含10% FBS的EMEM培養基(GE，貨號SH30024.01)，和含10% FBS的L-15培養基(ThermoFisher，貨號11415-114)。用細胞培養液將三株細胞分別調整活細胞密度至8.33×103個細胞/ml、8.33×103個細胞/ml和1.39×104個細胞/ml，將密度調整過後的細胞懸液混勻，以180μl/孔加入96孔細胞培養板。對相關化合物進行測試，得到結果見下表。
Figure 108135663-A0101-12-0161-228
Figure 108135663-A0101-12-0162-229
結論：本公開針對HER2靶標的抗體藥物偶聯物對HER2陽性細胞SK-BR-3具有明顯的增殖抑制活性；同時，它們對HER2陰性細胞MDA-MB-468增殖抑制活性弱；具有良好的選擇性。
測試例3：Her2-ADC血漿穩定性實驗
將ADC-19樣品、ADC-18樣品、ADC-20樣品、人血漿、猴血漿(上海美迪西生物醫藥股份有限公司)、和1%BSA(Sigma)PBS溶液(上海生工)分別用0.22μm的過濾器過濾除菌。將ADC-19、ADC-18、ADC-20分別以終濃度200ug/ml加入上述無菌血漿或1%BSA PBS溶液中，置於37℃細胞培養箱中孵育，將孵育當天記為第0天，隨後分別在第7天、14天和21天取出樣品，進行遊離毒素的檢測。
取25μl樣品至96孔板中；加入50μL內標工作液(100ng/mL喜樹堿乙腈溶液)及150μl乙腈；渦旋混合5分鐘，離心10分鐘(4000rpm)，5ul進行LC/MS/MS(美國應用生物系統公司)分析。
結果顯示：ADC-19在人和猴血漿，以及1%BSA PBS溶液中都相當穩定，遊離毒素的釋放率最高不超過2.1%，且在第14天趨於穩定，見第1A圖。
ADC-18在人和猴血漿中穩定性差，遊離毒素的釋放率最高分別為14.5%和8.10%。在1%BSA PBS溶液中比較穩定，見第1B圖。
ADC-20在人血漿、猴血漿和1%BSA PBS溶液中穩定性均比較差，遊離毒素的釋放率最高分別為21.7%、29.7%和21.7%。，且在1%BSAPBS溶液中一直處於降解狀態，見第1C圖。
測試例4：JIMT-1荷瘤小鼠藥效評價
一、試驗目的
以nunu裸鼠為受試動物，評價Her2-ADC抗體T-DM1、ADC-21、ADC-24腹腔注射給藥後，對人乳腺癌細胞曲妥珠單抗耐藥株(赫賽汀)JIMT-1移植瘤裸小鼠的療效。
二、受試藥物及材料
1、受試藥物
T-DM1(參考US20050169933製備)
ADC-21：3mg/kg
ADC-21：10mg/kg
ADC-24：3mg/kg
ADC-24：10mg/kg
空白對照(Blank)：PBS
2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
3、試驗動物
nunu裸鼠，購自北京維通利華。
三、試驗方法
在小鼠右肋部皮下接種JIMT-1細胞(南京科佰)(5×106/隻，具有50%人工基底膜)，腫瘤生長8天，長至203.09±11.94mm3後將動物隨機分組(d1)，8隻/組，共6組。
採用腹腔注射給藥，共給藥2次。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據。
數據統計使用Excel 2003統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的空白對照組(Vehicle，PBS)及實驗組的相對腫瘤體積。
四、試驗結果
實驗結果如第2圖顯示，腹腔注射給藥2次，觀察至第34天時結束實驗。T-DM1(10mg/kg)對腫瘤無抑制作用；ADC-21，3mg/kg的抑瘤率46.22%(P<0.01)；ADC-21，10mg/kg的抑瘤率56.77%(P<0.001)；ADC-24，3mg/kg的抑瘤率62.77%(P<0.001)；ADC-24，10mg/kg的抑瘤率76.32%(P<0.001)。在同等劑量情況下，ADC-24的抑瘤效果明顯好於ADC-21。
測試例5：SK-BR-3荷瘤小鼠藥效評價
一、試驗目的
以nunu裸鼠為受試動物，評價Her2-ADC抗體ADC-21、ADC-22腹腔注射給藥後對人乳腺癌細胞SK-BR-3移植瘤裸小鼠的療效。
二、受試藥物及材料
1、受試藥物
ADC-21：1mg/kg
ADC-21：6mg/kg
ADC-22：1mg/kg
ADC-22：6mg/kg
空白對照(Blank)：PBS
2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
3、試驗動物
nunu裸鼠，購自北京維通利華。
三、試驗方法
在小鼠右肋部皮下接種SK-BR-3細胞(ATCC)(5×106/隻，具有50%人工基底膜)，腫瘤生長20天，長至153.34±11.73mm3後將動物隨機分組(d0)，8隻/組，共5組。
採用腹腔注射給藥1次。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據。
數據統計使用Excel 2003統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的空白對照及實驗組的相對腫瘤體積。
四、試驗結果
實驗結果如第3圖顯示，腹腔注射給藥1次，觀察至第28天時結束實驗，ADC-21 1mg/kg的抑瘤率15.01%；ADC-21 6mg/kg的抑瘤率77.4%，且和空白對照相比有非常顯著差異(P<0.001)。ADC-22 1mg/kg的抑瘤率19.82%；ADC-22 6mg/kg的抑瘤率98.38%(P<0.001)。同為6mg/kg劑量情況下，ADC-22的抑瘤效果也明顯好於ADC-21。
測試例6：血漿穩定性
將樣品ADC-25，以100μg/ml的終濃度，分別與人血漿、猴血漿、和1%BSA PBS溶液混合均勻後，過濾除菌後置於37℃水浴鍋內孵育，將孵育當天記為第0天，隨後分別在第7天、14天和21天取出樣品，進行遊離毒素的檢測。
不同時間點的樣品取出後放至室溫，渦旋混勻；取25μl樣品至96孔板中；加入50μL內標工作液(100ng/mL喜樹堿乙腈溶液)及150μl乙腈；渦旋混合5分鐘，離心10分鐘(4000rpm)，取上清液5μl進行LC/MS/MS分析。
結果如第4圖顯示，ADC-25在人和猴血漿，以及1%BSA PBS溶液中都相當穩定，遊離毒素的釋放率最高不超過2%，且在第14天趨於穩定。
測試例7：ADC對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的療效評價
一、試驗目的
本實驗以BALB/cA-nude裸小鼠為受試動物，評價本公開ADC化合物對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的的療效。
二、受試藥物及材料
1、受試藥物
ADC-27(3mg/kg)
ADC-26(3mg/kg)
空白對照(Blank)：PH7.4的PBS緩衝液
2、配制方法：PH7.4的PBS缓冲液。
3、試驗動物
BALB/cA-nude裸小鼠：購自上海傑思捷實驗動物有限責任公司。
三、試驗方法
實驗用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7週，皮下接種人腦星形膠質母細胞瘤U87MG細胞(人腦星形膠質母細胞瘤，中科院細胞庫，Catalog # TCHu138)。接種細胞後第十天，將動物隨機分組(D0)，每組8隻，開始腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b2
其中a、b分別表示長、寬。
相對體积(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的對照組(空白)及實驗組的相對腫瘤體積。
四、試驗結果
腹腔注射(i.p.)給藥每週1次，共給藥3次，觀察至第22天時，ADC-27 3mg/kg的抑瘤率達到63.3%(P<0.0001)；ADC-26 3mg/kg的抑制率達到49.1%。ADC-27顯示出比ADC-26更強的抗腫瘤療效。
給藥過程中各組動物體重正常，提示ADC無明顯毒副作用。檢測結果如表3和第5圖所示。所檢測抗體能夠有效抑制荷瘤裸鼠中U87MG移植瘤的生長，並且呈現出劑量依賴性。
Figure 108135663-A0101-12-0168-230
測試例8：ADC對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效評價
一、試驗目的
本實驗以BALB/cA-nude裸小鼠為受試動物，評價本公開ADC化合物對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效。
二、受試藥物及材料
1、受試藥物
ADC-29(3mg/kg)
ADC-28(3mg/kg)
陰性對照ADC(3mg/kg)：非B7H3靶點與化合物20偶聯形成的配體毒素偶聯物
2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
3、試驗動物
BALB/cA-nude裸小鼠：購自常州卡文斯實驗動物有限責任公司。
三、試驗方法
實驗用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7週，皮下接種人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562細胞(ATCC，Catalog #ATCC® CCL-138TM)。接種細胞後第十天，將動物隨機分組(D0)，每組8隻，開始腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b2
其中a、b分別表示長、寬。
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的對照組(陰性對照)及實驗組的相對腫瘤體積。
四、試驗結果
腹腔注射給藥每週1次，共給藥3次，觀察至第28天時，受試ADC抑瘤率分別是：ADC-29 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到72.27%(P<0.001)；ADC-28 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到56.2%(P<0.001)。ADC-29均顯示出比ADC-28更強的抗腫瘤療效。
給藥過程中各組動物體重正常，提示ADC無明顯毒副作用。檢測結果如表4和第6圖所示。所檢測抗體能夠有效抑制荷瘤裸鼠中Detroit 562移植瘤的生長，並且呈現出劑量依賴性。
Figure 108135663-A0101-12-0170-231
測試例9：U87-MG荷瘤小鼠藥效評價
一、試驗目的
以Balb/c裸鼠為受試動物，在其人膠質瘤細胞U87MG移植瘤模型上評價B7H3-抗體藥物偶連物腹腔注射後的療效。
二、受試藥物及材料
1、受試藥物
ADC-30 1mg/kg
ADC-30 3mg/kg
ADC-31 1mg/kg
ADC-31 3mg/kg
空白對照(Blank)：PBS
2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
3、試驗動物
BALB/cA-nude裸小鼠：購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。
三、試驗方法
在小鼠右肋部皮下接種U87MG細胞(人腦星形膠質母細胞瘤，中科院細胞庫，Catalog # TCHu138)(2.5×106/隻)，腫瘤生長14天，長至167.49mm3後將動物隨機分組(d1)，8隻/組，共5組。
採用腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據。
數據統計使用Excel 2003統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的空白對照組(Vehicle)及實驗組的相對腫瘤體積。
四、試驗結果
實驗結果如第7圖顯示，腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，觀察至第18天時，受試ADC抑瘤率分別為：ADC-30 1mg/kg的抑瘤率為0.31%；ADC-30 3mg/kg的抑瘤率達到45.23%(P<0.0001)； ADC-31 1mg/kg的抑瘤率達到39.22%(P<0.01)；ADC-31 3mg/kg的抑瘤率達到80.24%(P<0.0001)。在同等劑量情況下，ADC-31的抑瘤效果明顯好於ADC-30。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司
<120> 依喜替康類似物的配體-藥物偶聯物、其製備方法及其應用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> 曲妥珠單抗(Trastuzumab)輕鏈
<400> 1
Figure 108135663-A0101-12-0173-232
Figure 108135663-A0101-12-0174-233
<210> 2
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> 曲妥珠單抗(Trastuzumab)重鏈
<400> 2
Figure 108135663-A0101-12-0174-234
Figure 108135663-A0101-12-0175-235
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> 帕妥珠單抗(Pertuzumab)輕鏈
<400> 3
Figure 108135663-A0101-12-0176-236
<210> 4
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> 帕妥珠單抗(Pertuzumab)重鏈
<400> 4
Figure 108135663-A0101-12-0176-237
Figure 108135663-A0101-12-0177-238
Figure 108135663-A0101-12-0178-239
<210> 5
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> B7H3抗體1F9DS輕鏈
<400> 5
Figure 108135663-A0101-12-0178-240
Figure 108135663-A0101-12-0179-241
<210> 6
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> B7H3抗體1F9DS重鏈
<400> 6
Figure 108135663-A0101-12-0179-242
Figure 108135663-A0101-12-0180-243
Figure 108135663-A0101-11-0002-3

Claims (46)

  1. 一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該配體-藥物偶聯物包含式(-D)所示的結構：
    Figure 108135663-A0101-13-0001-244
     其中：Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R1選自鹵素、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；其中，式-D中的波浪線表示氫原子，或與接頭單元或與結合靶細胞所表達抗原的抗體共價連接；m為0至4的整數。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該配體-藥物偶聯物包含式(-D1)所示的結構：
    Figure 108135663-A0101-13-0002-245
     其中：R1為環烷基烷基或環烷基；較佳C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；波浪線表示氫原子，或與接頭單元或與結合靶細胞所表達抗原的抗體共價連接；m為0或1。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其為通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 108135663-A0101-13-0002-246
     其中： Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；m為0至4的整數；n為1至10，可以為整數，也可以為小數；Pc為配體；L為接頭單元。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中：Y為-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素或烷基；R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基； m為0或1。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中Y選自：
    Figure 108135663-A0101-13-0004-247
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其中Y的O端與接頭單元L相連。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其為通式(Pc-L-D1)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 108135663-A0101-13-0004-248
     其中：R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；較佳氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0或1；n為1至10，可以為整數，也可以為小數；Pc為配體；L為接頭單元。
  8. 如申請專利範圍第3至7項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中n為2至8，可以為整數，也可以為小數；較佳為3至8，可以為整數，也可以為小數。
  9. 如申請專利範圍第3至8項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中接頭單元-L-為-L1-L2-L3-L4-，L1選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH2-C(O)-NR3-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化學鍵，其中p1為1至20的整數；較佳為化學鍵；L3為由2至7個胺基酸構成的肽殘基，其中胺基酸視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；L4選自-NR5(CR6R7)t-、-C(O)NR5、-C(O)NR5(CH2)t-或化學鍵，其中t為1至6的整數；較佳為-NR5(CR6R7)t-；R3、R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中L1選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2)s1-C(O)-、-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2-環己基-C(O)-、-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2CH2O)s2-CH2CH2-C(O)-、-CH2-C(O)-NR3-(CH2)s3-C(O)-或-C(O)-(CH2)s4C(O)-，其中s1為2至8的整數，s2為1至3的整數，s3為1至8的整數，s4為1至8的整數。
  11. 如申請專利範圍第9或10項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-或化學鍵，p1為6至12的整數。
  12. 如申請專利範圍第9至11項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中L4選自-NR5(CR6R7)t-，R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2，較佳為2。
  13. 如申請專利範圍第9至12項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中L3為由2至7個選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸、天冬胺酸的胺基酸構成的肽殘基；較佳為四肽殘基；更佳為甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸的四肽殘基。
  14. 如申請專利範圍第3至13中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中接頭單員-L-為-L1-L2-L3-L4-， L1為
    Figure 108135663-A0101-13-0006-249
    ，s1為2至8的整數；L2為化學鍵；L3為四肽殘基； L4為-NR5(CR6R7)t-，R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2。
  15. 如申請專利範圍第3至13項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中接頭單元-L-為-L1-L2-L3-L4-，L1為-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2-環己基-C(O)-；L2為-NR4(CH2CH2O)9CH2C(O)-；L3為四肽殘基；L4為-NR5(CR6R7)t-，R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2。
  16. 如申請專利範圍第9至15項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該接頭單元-L-，其L1端與配體相連，L4端與Y相連。
  17. 如申請專利範圍第3至16項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中-L-Y-為：
    Figure 108135663-A0101-13-0007-250
     其中L1選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2)s1-C(O)-或-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2-環己基-C(O)-；L2為-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-或化學鍵，p1為6至12的整數；L3為GGFG的四肽殘基；R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基； R5、R6或R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；s1為2至8的整數；m為0至4的整數。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的配體-藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑合物，其中該-L-Y-為：
    Figure 108135663-A0101-13-0008-251
     L2為-NR4(CH2CH2O)9CH2C(O)-；L3為GGFG的四肽殘基；R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R5、R6或R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；m為0至4的整數。
  19. 如申請專利範圍第17項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中所述-L-Y-為
    Figure 108135663-A0101-13-0008-252
    L2為化學鍵；L3為GGFG的四肽殘基；R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基； R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；s1為2至8的整數；較佳5。m為0至4的整數。
  20. 一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該配體-藥物偶聯物包含式(-L-Y-)所示的結構：
    Figure 108135663-A0101-13-0009-253
     其中：L2為化學鍵；L3為GGFG的四肽殘基；R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R5選自氫原子或烷基，R6和R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；s1為2至8的整數；m為0至4的整數。
  21. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其為通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 108135663-A0101-13-0010-254
     其中：W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，所述雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中所述的C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化學鍵，p1為1至20的整數；L3為由2至7個胺基酸構成的肽殘基，其中胺基酸視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；R1選自鹵素、環烷基烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基； m為0至4的整數；n為1至10，可以為整數，也可以為小數；Pc為配體。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其為通式(Pc-Lb-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 108135663-A0101-13-0011-255
     其中：s1為2至8的整數；較佳5；Pc、R1、R2、R5~R7、m和n如申請專利範圍第21項所定義。
  23. 如申請專利範圍第3至20項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中-L-Y-選自：
    Figure 108135663-A0101-13-0011-256
    Figure 108135663-A0101-13-0012-257
  24. 如申請專利範圍第1至23項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其選自以下結構式：
    Figure 108135663-A0101-13-0013-258
    Figure 108135663-A0101-13-0014-259
    Figure 108135663-A0101-13-0015-260
     其中：n為1至10，可以為整數，也可以為小數；Pc為配體。
  25. 如申請專利範圍第3至24項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該Pc為抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體選自嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
  26. 如申請專利範圍第25項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗體或其抗原結合片段選自抗HER2(ErbB2)抗體、抗EGFR抗體、抗B7-H3抗體、抗c-Met抗體、抗HER3(ErbB3)抗體、抗HER4(ErbB4)抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、 抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD44抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD73抗體、抗CD105抗體、抗CEA抗體、抗A33抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗Lewis Y抗體、抗VEGFR抗體、抗GPNMB抗體、抗Integrin抗體、抗PSMA抗體、抗Tenascin-C抗體、抗SLC44A4抗體、抗Mesothelin抗體或其抗原結合片段。
  27. 如申請專利範圍第25項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中所述的抗體或其抗原結合片段選自曲妥珠單抗(Trastuzumab)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)、諾利珠單抗(Enoblituzumab)、艾貝珠單抗(Emibetuzumab)、依託珠單抗(Inotuzumab)、品納珠單抗(Pinatuzumab)、本妥昔單抗(Brentuximab)、吉妥珠單抗(Gemtuzumab)、必伐珠單抗(Bivatuzumab)、洛沃珠單抗(Lorvotuzumab)、cBR96和格馬圖單抗(Glematumamab)，或其抗原結合片段。
  28. 如申請專利範圍第3至27項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其選自以下結構式：
    Figure 108135663-A0101-13-0016-261
    Figure 108135663-A0101-13-0017-262
    Figure 108135663-A0101-13-0018-263
    Figure 108135663-A0101-13-0019-264
     其中n如申請專利範圍第3項所定義。
  29. 一種通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，
    Figure 108135663-A0101-13-0019-265
     其中：Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-； Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R1選自鹵素、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；m為0至4的整數。
  30. 如申請專利範圍第29項所述的通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，其為通式(D1)所示的化合物：
    Figure 108135663-A0101-13-0020-266
     或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中：R1為C3-6環烷基烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基； m為0或1。
  31. 如申請專利範圍第29或30項所述的通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，其選自：
    Figure 108135663-A0101-13-0021-267
  32. 一種通式(La-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，
    Figure 108135663-A0101-13-0022-268
     其中：W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化學鍵，p1為1至20整數；L3為由2至7個胺基酸構成的肽殘基，其中胺基酸視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；R1選自鹵素、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基； R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；m為0至4的整數。
  33. 如申請專利範圍第32項所述的通式(La-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，其為通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物：
    Figure 108135663-A0101-13-0023-269
     或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中R1、R2、R5~R7、s1和m如申請專利範圍第32項中所定義。
  34. 如申請專利範圍第32或3項3所述的通式(La-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式或其可藥用的鹽，其選自：
    Figure 108135663-A0101-13-0023-270
    Figure 108135663-A0101-13-0024-271
  35. 一種製備如通式(D1)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽的方法，其包括以下步驟：
    Figure 108135663-A0101-13-0024-272
     通式(Y1)和通式(Dr)進行縮合反應，得到通式(D1)所示的化合物，其中：R1、R2和m如申請專利範圍第30項中所定義。
  36. 一種製備如通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽的方法，其包括以下步驟：
    Figure 108135663-A0101-13-0025-273
     通式(IA)和通式(IB)進行縮合反應，得到通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物，其中：R1、R2、R5~R7、s1和m如申請專利範圍第32項中所定義。
  37. 一種製備如通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽的方法，其包括以下步驟：
    Figure 108135663-A0101-13-0026-274
     通式(IA)和通式(IB)進行縮合反應，得到通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物，其中：R1、R2、R5~R7、s1和m如申請專利範圍第32項中所定義。
  38. 一種製備如通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的方法，其包括以下步驟：
    Figure 108135663-A0101-13-0026-275
     還原Pc後，與通式(La-Y-Dr)偶聯反應，得到通式(Pc-La-Y-Dr)所示的化合物；其中：Pc為配體； W、L2、L3、R1、R2、R5~R7、m和n如申請專利範圍第21項中所定義。
  39. 一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其包含配體和連接至配體的藥物，其中該藥物選自如申請專利範圍第29至34項中任一項所述的化合物，較佳藥物藉由接頭連接至配體。
  40. 如申請專利範圍第39項所述的配體-藥物偶聯物，其中該配體為單株抗體。
  41. 一種申請專利範圍第39或40項所述的配體-藥物偶聯物的製備方法，其包含將選自申請專利範圍第29至34項中任一項所述的化合物與配體連接的步驟，較佳藉由接頭連接。
  42. 如申請專利範圍第41項所述的製備方法，其中該配體為單克隆抗體。
  43. 一種醫藥組成物，其含有治療有效量的如申請專利範圍第1至28項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，或如申請專利範圍第29至31項中任一項通式(D)所示所述的化合物、其可藥用鹽或溶劑合物，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
  44. 一種申請專利範圍第1至28項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，或如申請專利範圍第29至31項中任一項所述的通式(D)所示的化合物或其可藥用鹽或溶劑合物，或如申請專利範圍第43項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於治療或預防腫瘤的藥物。
  45. 如申請專利範圍第44項所述的用途，其中該腫瘤為與HER2、HER3、B7H3或EGFR表達相關的癌症。
  46. 一種申請專利範圍第1至28項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，或如申請專利範圍第29至31項中任一項所述的通式(D)所示的化合物或其可藥用鹽或溶劑合物，或如申請專利範圍第43項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備治療和/或預防癌症的藥物，其中該癌症較佳選自乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤、肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、白血病、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。
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