TW201938787A

TW201938787A - 鏈黴菌khy26菌株及其增量培養方法與防治植物病原微生物之用途

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Publication number: TW201938787A
Application number: TW107108324A
Authority: TW
Inventors: 陳泰元
Original assignee: 行政院農業委員會高雄區農業改良場
Priority date: 2018-03-12
Filing date: 2018-03-12
Publication date: 2019-10-01
Also published as: TWI638046B

Abstract

本發明係關於一種鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株及其增量培養方法與防治植物病原微生物之用途；鏈黴菌KHY26菌株之培養方法包含以特定成分之培養基，於一特定培養條件下培養一特定時間，以獲得高菌量濃度之鏈黴菌發酵產物；鏈黴菌KHY26菌株對蓮霧黑腐病菌(Lasiodiplodia theobromae )、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )及瓜類、茄科或其他作物之根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)等植物病原微生物具抗生活性，能抑制包含植物寄生性線蟲在內之多種植物病原微生物的生長，並可實際應用做為防治瓜類、茄科或其他作物之根瘤線蟲等植物病原微生物之生物農藥。

Description

鏈黴菌KHY26菌株及其增量培養方法與防治植物病原微生物之用途

本發明係關於一種具有防治多種植物病原微生物(含植物寄生性線蟲)功效之鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株及其增量培養方法與用途。

作物的種植過程中常常會遭遇植物病原菌或害蟲的侵害，目前常見防治害蟲的方法包含，化學防治、物理防治、生物防治等等。化學防治法雖然使用上較為方便，但若使用不當時很容易造成使用者中毒、藥劑殘留以及環境污染等等缺失，反觀，生物防治法，例如使用生物農藥，則對於環境較為友善。生物農藥包含具有植物保護功效的天然物質，例如源自植物的除蟲菊精或魚藤精，或是應用於微生物防治的蘇力菌，又或是用於防治害蟲的昆蟲性費洛蒙等等。

由於微生物具有能大量複製且對環境較為友善之優點，因此不少研究係將微生物應用於生物農藥的製備；例如中華明國專利第TW 201439035(A)號專利公開案係一種農用微生物製劑粉劑配方及其製作方法，係將微生物菌粉、賦形劑與增量劑混合，以製備微生物製劑；其中的微生物為菌粉可為芽孢桿菌、假單孢桿菌、固氮菌、酵母菌、枯草桿菌、木霉菌、真菌、溶磷菌或藻類。又，中華明國專利第TW 201438582(A)號專利公開案係為使用細黃鏈黴菌(Streptomyces microflavus)株及使用彼等來控制植物疾病和害蟲之方法，係將細黃鏈黴菌突變株應用於防治植食性害蟲與對植物有害之真菌。

今，發明人乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，據此研創出本發明之具有防治多種植物病原微生物(含植物寄生性線蟲)功效之鏈黴菌KHY26菌株(以下簡稱KHY26)以及大量生產KHY26之培養方法，並將KHY26用於防治包含植物寄生性線蟲在內之多種植物病原微生物。

本發明係一種鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株(以下簡稱KHY26)，以及含有KHY26之生物農藥。鏈黴菌KHY26菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910799，其中KHY26係具有防治多種植物病原微生物(含植物寄生性線蟲)之功效。

本發明亦提供培養鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株(以下簡稱KHY26)的方法，包含：將KHY26培養於一特定培養基，並於25~35℃培養一特定時間，以獲得含有大量KHY26活菌體之發酵產物。

本發明進一步提供一種鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株(以下簡稱KHY26)用於製備生物農藥之用途，係以一有效劑量之KHY26，製作成液劑或粉劑，施予一植物以防治包含植物寄生性線蟲在內之多種植物病原微生物。

於本發明之一實施例中，植物病原微生物可為木瓜疫病菌(Phytophthora palmimora )、木瓜根腐病菌(Pythium aphanidermatum )、蓮霧黑腐病菌(Lasiodiplodia theobromae )、蓮霧果腐病菌(Pestalotiopsis euginae )、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )、芒果畸形病菌(Fusarium mangiferae )、番石柳黑星病菌(Phyllosticta psidiicola )、番石榴瘡痂病菌(Pestalotiopsis psidii )、稻熱病菌(Magnaporthe grisea )以及瓜類根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)與茄科根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)。

於本發明之一實施例中，其一培養基為液態培養基，包含1~10 wt%黃豆漿、0.1~1 wt%酵母抽出物、0.05~0.5 wt%磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )、0.05~0.5 wt%磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )、0.01~0.1 wt%硫酸鎂(MgSO₄ ·7H₂ O))、0.05~0.5 wt%幾丁聚醣(Chitoson)與剩餘百分比之水，且培養之特定時間為3~5天。

於本發明之一實施例中，另一培養基為固態培養基包含一固體部分與一液體部分，固體部分以重量比100%計算包含5~35 wt%燕麥粒、5~35 wt%大麥片、10~20 wt%玉米粉、5~30 wt%稻殼、5~15 wt%蚵殼粉，液體部分為該固體部分總重量之40~60 wt%的水，且培養之特定時間為10~18天。

於本發明之一實施例中，生物農藥為液劑或粉劑。

於本發明之一實施例中，生物農藥係為液態發酵產物所製成之液劑或粉劑，且液劑之有效劑量為濃度1 x 10⁵ ~1 x 10¹⁰ cfu/mL之KHY26菌株，粉劑之有效劑量為濃度1 x 10⁷ ~1 x 10¹⁰ cfu/g之KHY26菌株，且粉劑包含鏈黴菌KHY26菌粉與麥芽糊精。

於本發明之一實施例中，生物農藥為固態發酵產物所製成之粉劑，且粉劑之有效劑量係為濃度1 x 10⁸ ~1 x 10¹¹ cfu/g之KHY26菌株。

藉此，本發明鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株對根瘤線蟲及多種植物病原菌具抗生活性，因此可用於作為生物農藥或是果實保護組成物。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明為一種鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株(以下簡稱KHY26)，寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910799。鏈黴菌KHY26可用於製備生物農藥，並可抑制多種植物病原微生物如：木瓜疫病菌(Phytophthora palmimora )、木瓜根腐病菌(Pythium aphanidermatum )、蓮霧黑腐病菌(Lasiodiplodia theobromae )、蓮霧果腐病菌(Pestalotiopsis euginae )、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )、芒果畸形病菌(Fusarium mangiferae )、番石柳黑星病菌(Phyllosticta psidiicola )、番石榴瘡痂病菌(Pestalotiopsis psidii )、稻熱病菌(Magnaporthe grisea )以及瓜類根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)與茄科根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)。以鏈黴菌KHY26所製備之生物農藥可為液劑或粉劑，粉劑可包含鏈黴菌KHY26與其固態發酵培養基質，並可以一有效劑量，抑制根瘤線蟲等植物寄生性線蟲之生長與繁殖。

本發明亦提供增量培養鏈黴菌KHY26菌株之方法，包含將鏈黴菌KHY26菌株培養於一培養基中，並於25~35℃培養一特定時間。其中該培養基可為液態培養基，包含1~10 wt%黃豆漿、0.1~1 wt%酵母抽出物、0.05~0.5 wt%磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )、0.05~0.5 wt%磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )、0.01~0.1 wt%硫酸鎂(MgSO₄ ·7H₂ O)、0.05~0.5 wt%幾丁聚醣(Chitoson)與水，且培養之特定時間為3~5天。此外，培養基亦可為固態培養基，固態培養基包含一固體部分與一液體部分，固體部分以重量比100%計算，包含5~35 wt%燕麥粒、5~35 wt%大麥片、10~20 wt%玉米粉、5~30 wt%稻殼與5~15 wt%蚵殼粉，以及液體部分為該固體部分總重量之40~60 wt%的水，且固態發酵培養之特定時間為10~18天。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實驗一、鏈黴菌KHY26菌株及其培養方法

( 一 ) 鏈黴菌KHY26菌株之分離與鑑定

自臺灣各地農田及惡地地形取得15處土壤樣本，經分離篩選後純培養，再以菌落外觀型態分類，共得到219株菌株；以菌株對於蓮霧黑腐病菌(Lasiodiplodia theobromae )及木瓜根腐病菌(Pythium aphanidermatum )的抗生活性作為菌株功效篩選指標，於馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板(potato dextrose agar，PDA)上，將分離之菌株分別與蓮霧黑腐病菌及木瓜根腐病菌進行對峙培養，試驗結果獲得對蓮霧黑腐病菌及木瓜根腐病菌皆具抗生活性之微生物，共16株菌株，且其中編號KHY26之菌株對前述兩種病原菌皆具有最佳之抗生活性。請參見第一圖(A)，為KHY26菌株於PDA培養基平板上生長之型態圖，係為邊緣呈現平滑狀之圓形菌落；另請見第一圖(B)，將KHY26培養於羊血培養基平板，並沒有產生溶血反應，表示KHY26具有生物安全性。

將KHY26菌株進行16s rDNA定序，並委託財團法人食品工業研究所進行菌種鑑定，確認KHY26菌株為鏈黴菌(Streptomyces misionesis )(請參見附件1)；其16s rDNA之序列請參見序列表之SEQ ID NO:1，另，SEQ ID NO:2為KHY26菌株上，帶有的鏈黴菌特殊專一性片段。

( 二) 液態發酵之培養基成分對KHY26菌株生長的影響

下列實驗以搖瓶培養系統進行培養，以觀察培養基之不同穀物基質、酸鹼值及其他添加物對於本發明KHY26菌株生長之影響，其中下列所提及之基本培養液為黃豆漿培養基，成分包含3 wt%黃豆漿、0.3 wt%酵母抽出物、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )與剩餘百分比的水。

以下所有實驗中之菌量計算方法如下：於無菌環境中取1 mL待測菌液與9 mL 無菌水混合均勻，此即為10倍稀釋菌液，並以此方法繼續進行菌液的10倍序列稀釋；取0.1 mL之稀釋菌液滴至PDA平板，並以消毒過之三角玻璃棒將稀釋菌液均勻塗佈於PDA平板表面後，置於27℃下培養，待菌落生長至肉眼可見之大小時，計算各稀釋倍率之菌落數；每組實驗皆進行三重複，計算時係將三重複之菌落數加總後除以3以獲得一平均菌落數；平均菌落數再以下列計算公式推算原始菌數：

原始菌數(單位：cfu/mL)=平均菌落數 × 稀釋倍率之倒數 × 10

菌量計算結果將以顯著性測試進行統計分析，若未達顯著水準則以費雪最小差異測試法(Fisher’s Least Significance Test, LSD)檢定，測定5%之顯著差異，若各組間具有顯著差異則會標記不同的字母，若各組間不具有顯著差異則會標記相同的字母。

(1) 不同穀物基質對KHY26菌株生長的影響

將菌量濃度為10⁹ cfu/mL之KHY26菌體懸浮液，取1 mL菌體懸浮液作為接種源，加入400 mL之3種培養液中，於27℃，轉速150 rpm下，搖瓶培養5天，並於第5天測量菌量；3種培養液係分別為3 wt%黃豆漿培養液、3 wt%燕麥漿培養液以及3 wt%粉頭培養液，；其成分包含3 wt%之黃豆漿(或3 wt%燕麥漿、或3 wt%粉頭培養液)、0.3 wt%酵母抽出物、0.1 wt%磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )、0.1 wt%磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )與剩餘百分比的水；黃豆漿之製備方法為將市售黃豆以果汁機打成漿，燕麥漿之製備方法為將市售燕麥以果汁機打成漿；粉頭之製備方法為將市售粉頭以果汁機打成漿；實驗結果請參見表一，以3 wt%黃豆漿培養液培養所得到的菌量最多。

表一

(2) 不同酸鹼值對KHY26菌株生長的影響

以含有3 wt%黃豆漿之培養液為基底，調整其酸鹼值以測試酸鹼值對於KHY26菌株生長之影響，培養條件為27℃、轉速150 rpm、搖瓶培養5天；結果請參見表二：試驗中，以pH=7.5培養液所得到的菌量最高為3.5 x 107 cfu/mL。

表二

(3) 硫酸鎂(MgSO4)對於KHY26菌株生長的影響

以含有3 wt%黃豆漿、pH=7.5之培養液為基底，調整硫酸鎂(MgSO₄ ·7H₂ O)濃度以測試硫酸鎂與KHY26生長之關係，培養條件為27℃、轉速150 rpm、搖瓶培養5天；結果請見表三，以0.05 wt%硫酸鎂之培養液所得到的菌量最高，為3.1 x 10⁷ cfu/mL。

表三

(4) 幾丁聚醣 (Chitosan) 對於KHY26菌株生長的影響

以含有3 wt%黃豆漿、pH=7.5之培養液為基底，添加1~5 wt%幾丁聚醣(Chitosan)並測試對KHY26菌株生長之影響，培養條件為27℃、轉速150 rpm、搖瓶培養5天；結果請見表四，以1 wt%幾丁聚醣之培養液所得到的菌量最高，為6.0 x 10⁷ cfu/mL。

表四

( 三) KHY26菌株之固態發酵培養方式

此固態發酵所使用之固態培養基成分包含燕麥粒、大麥片、玉米粉、稻殼、蚵殼粉與甲殼素，將原料磨成細粉後充分混合均勻，再加入一定比例範圍之純水，以獲得使用之固態發酵培養基。本發明之固態發酵培養基包含一固體部分與一液體部分，固體部分若以重量比100%計算，包含5~35 wt%燕麥粒、5~35 wt%大麥片、10~20 wt%玉米粉、5~30 wt%稻殼與5~15 wt%蚵殼粉；液體部分為上述固態部分總重量40~60 wt%的水。其中固體部分的較佳比例為30 wt%燕麥粒、30 wt%大麥片、15%玉米粉、20%稻殼與5%蚵殼粉，液體部分的較佳添加量為固態部分總重量60 wt%之水。

固態發酵培養步驟如下：將菌量濃度為10⁹ cfu/mL之KHY26菌體懸浮液，取1 mL菌體懸浮液作為接種源，以稻殼、燕麥粒、大麥片、玉米粉及蚵殼混合之固態培養基於27℃培養14天，以獲得固態發酵增量培養菌體及培養基之混合固型物。將混合固型物以粉碎機充分混拌及粉碎，以獲得固態發酵菌粉，作為KHY26粉劑；在菌粉原始菌量為1.4 x 10¹⁰ cfu/g之狀況下，若粉碎後以80目之濾網過濾，製備得的KHY26粉劑菌量較高，為1.2 x 10¹⁰ cfu/g，而以100目濾網過濾者所得之粉劑菌量較低，為9.4 x 10⁹ cfu/g。

( 四) KHY26液劑及粉劑之儲存安定性測試

(1) KHY26 液劑儲存安定性測試

將依前述液態發酵配方及條件，搖瓶培養5天之KHY26菌液液劑儲存於4℃、16℃與27℃，並定期觀察其菌量之變化；實驗結果請參見表五，儲存時間為2個月時，三種儲存溫度之KHY26的菌量並無顯著變化；儲存至3個月時，KHY26菌量開始下降，並以儲存溫度為27℃者最為明顯，菌量僅剩下9.5 x 10⁵ cfu/mL，且於儲存6個月後菌量即低於10³ cfu/mL；而儲存於4℃與16℃者，至儲存6個月後，菌量仍可維持在10⁷ cfu/mL以上。

表五

此外，KHY26菌液液劑亦可進一步以乾燥機進行乾燥，以製備成粉劑使用。其製備方式有兩種，第一種製備方式為：將前述液態發酵小型量產之KHY26菌液，以低溫噴霧乾燥機於噴霧出口溫度50℃下進行噴霧乾燥處理，再將乾燥後之粉末，加入不同載體(玉米粉、小麥粉、乳糖及麥芽糊精)混合攪拌，以製成粉劑。第二種製備方式為：將前述液態發酵小型量產之KHY26菌液，以冷凍乾燥機進行乾燥處理，其步驟依序為(1)冷凍樣品階段，目的為將樣品冷凍，進行時令樣品溫度在1小時內下降至-40℃；(2)第一階段乾燥，目的為將冷凍後之樣品內的冰晶階段性昇華，進行方式為抽真空至真空度為100 mT，並設定溫度於90分鐘內上升至-30℃，再於下一個90分鐘內上升至-20℃，接著於360分鐘內上升至-10℃，最後於360分鐘內上升至0℃；(3)第二階段乾燥，目的為使樣品升溫至常溫以使樣品更加乾燥，進行方式為破真空至真空度為1 mT，並設定溫度於240分鐘內上升至10℃，再於240分鐘內上升至20℃，最後於360分鐘內上升至25℃；(4)乾燥結束，維持上述的溫度及真空度至冷凍乾燥機關閉為止，以獲得冷凍乾燥後的粉末。接著再將冷凍乾燥後之粉末，加入不同載體(玉米粉、小麥粉、乳糖及麥芽糊精)混合攪拌，以製成粉劑。

(2) 粉劑製作與儲存安定性測試

將前述固態發酵物粉碎並以80目篩網過篩後，所製備之KHY26粉劑儲存於27℃以量測其儲存安定性，結果請見表六，於儲存4個月之後KHY26之菌量雖略有下降，但仍可維持在10¹⁰ cfu/g，其儲存安定性頗佳。

表六

( 五) 鏈黴菌KHY26菌株之生理生化測試

將KHY26菌株(以下簡稱KHY26)培養於特定之篩選培養基上，如SMA培養基(skim milk agar)、YSA培養基(yeast extract-soluble starch agar)、Tween-80 agar與MRA培養基(Mandel-Reese agar)、EYA培養基(egg-yolk agar)與PCA培養基(powdered chitin agar)，等菌落長出後觀察培養基之狀態，以判定KHY26所具備的酵素活性；請參見第二圖，於Tween-80 agar上，KHY26菌株周圍會產生白色沉澱環，即KHY26具有脂肪分解酶(lipase)活性；EYA培養基上，KHY26菌株周圍產生一透明環，表示其具有磷脂質分解酵素(phospholipase)的活性；YSA培養基上，KHY26菌株周圍具有大透明圓環，表示KHY26亦具有澱粉分解酵素(amylase)活性；生長於SMA培養基之KHY26菌落周圍會產生透明圓環，表示KHY26具有蛋白分解酵素(protease)活性；MRA培養基上，KHY26菌株周圍產生橘黃色環，表示KHY26具有纖維素分解酵素(cellulase)活性；PCA培養基上，KHY26菌落周圍生成一透明環，表示KHY26具有幾丁質分解酵素(chitinase)活性

( 六) 鏈黴菌KHY26菌株對農藥之耐受性

利用農藥平板法以及農藥液混合法，檢測鏈黴菌KHY26菌株(以下簡稱KHY26)對農藥之耐受性。農藥平板法是將菌液塗佈於含有不同農藥之PDA培養基平板，培養後觀測細菌的生長情形；農藥液混合法是將菌液與農藥液均勻混合30分鐘後，再塗佈於PDA培養基平板上，並觀察細菌生長。請參見表七，為KHY26對於各種農藥耐受性測試結果，「O」代表具有耐受性(菌株生長良好)、「X」代表無耐受性(菌株無法生長)、「△」代表低耐受性(菌株可生長但生長狀態不佳)；在兩種測試方法中，KHY26對於甲基多保淨、亞托敏、免賴得、達特安、第滅達安、納乃得、益達胺、芬殺松與第滅寧皆具有耐受性。

表七

實驗二、鏈黴菌KHY26之抗生活性範圍評估

為了大範圍評估KHY26菌量(以下簡稱KHY26)的抗生活性，係將KHY26於PDA培養基平板之一側劃線培養1日之後，再於KHY26對側接種欲觀測之植物病原真菌，並於27℃進行對峙培養，以觀察該病原菌之生長情形。請參見第三圖，於對峙培養的試驗中，KHY26能有效抑制木瓜疫病菌、木瓜根腐病菌、蓮霧黑腐病菌、蓮霧果腐病菌、芒果炭疽病菌、芒果畸形病菌、番石榴黑星病菌以及番石榴瘡痂病菌的生長；第四圖係使用分離自臺灣各地的稻熱病菌(Magnaporthe grisea )分離株與KHY26菌株進行對峙培養，結果顯示KHY26亦能有效抑制不同地區分離之稻熱病菌菌株的生長。

實驗三、鏈黴菌KHY26菌株對於果實之保護功效

本部分之實驗結果皆使用費雪最小差異測試法(Fisher’s Least Significance Test, LSD)檢定，標記不同英文字者代表該二組別之間具有5%顯著差異，標記相同英文字者代表不具有顯著差異。

( 一 ) 防治芒果炭疽病

採收露天種植的芒果，並浸泡水(對照組)或KHY26菌液，再以農友貫行之方式裝箱並於室溫下放置7天，以觀察芒果炭疽病之發病情形；結果顯示對照組的罹病率為88.9%，罹病度為59.3%；而KHY26菌液組的罹病率為22.2%，罹病度為11.1%，顯著低於對照組。

芒果炭疽病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~4級，0級代表無任何病徵，1級為果實炭疽病斑面積占1~5%，2級為果實炭疽病斑面積占6~10%，3級為果實炭疽病斑面積占11~25%，4級為果實炭疽病斑面積26%以上；罹病度之公式如下：

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(4 x 總果實數)] x 100%

罹病率(%)＝(罹病果實數 /總果實數) x 100%

( 二) 防治棗炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides )

於印度棗(Zizyphus mauritiana )果實上製造20個傷口後，先噴霧處理水、濃度為2 x 10⁷ cfu/mL之KHY26菌液或是44.2%克收欣溶液(2000倍稀釋)；24小時之後接種濃度為1 x 10⁶ spore/mL炭疽病孢子懸浮液，並於室溫下培養7天觀察罹病度。參見表八，對照組的罹病度為63.35%，克收欣之罹病度為50.0%，而KHY26菌液組的罹病度為13.3%，顯著低於對照組。再參見第五圖，對照組與克收欣組的印度棗的果實比面上明顯可見白色菌絲的生長，但是KHY26菌液組的印度棗果實表面無明顯的白色菌絲，果實外觀亦相對完整美觀。

棗炭疽病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~5級，0級代表無任何病徵，1級為果實炭疽病斑面積占1~5%，2級為果實炭疽病斑面積占6~10%，3級為果實炭疽病斑面積占11~25%，4級為果實炭疽病斑面積26~50%，5級為果實炭疽病斑面積51%以上；罹病度之公式如下：

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(5 x 總果實數)] x 100%

表八

( 三 ) 防治蓮霧黑腐病菌 (Lasiodiplodia theobromae )

於蓮霧果實上製造20處傷口後，立即噴灑濃度約1 x 10⁶ spore/mL之蓮霧黑腐病菌，5分鐘後再噴灑水(對照組)、濃度約2 x 10⁷ cfu/mL之KHY26菌液、KHY26培養濾液或10%保粒黴素甲(1000倍稀釋)，將蓮霧果實於室溫下培養7天後觀察。請參見第六圖，對照組的每顆蓮霧果實上皆生長大量白色菌絲，噴灑保粒黴素甲的蓮霧果實上亦觀察到菌絲生長；噴灑KHY26培養濾液之果實則有少量菌絲，噴灑KHY26菌液之蓮霧果實觀察到白色菌絲量又少於噴灑KHY26濾液者。

進一步測試施予防治物時機與蓮霧黑腐病菌的防治功效：同時處理組係於病原菌接種後5分鐘噴灑KHY26菌液或保粒黴素甲；預處理組則是先施予蓮霧果實KHY26菌液或保粒黴素甲，24小時後再於蓮霧上製造傷口並接種病原菌；接種病原菌後於室溫培養7天，並觀察菌絲的生長且記錄；參見第七圖，KHY26菌液組的罹病度皆低於保粒黴素甲組，且菌絲生長之情形也較輕微；另，不論是給予KHY26菌液或是保粒黴素甲，預處理組的菌絲生長情形皆低於同時處理組。

蓮霧黑腐病菌罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~5級，0級代表無任何病徵，1級為果實黑腐病斑面積占1~5%，2級為果實黑腐病斑面積占6~10%，3級為果實黑腐病斑面積占11~20%，4級為果實炭疽斑面積21~35%，5級為果實黑腐病斑面積36~50%以上，6級為果實黑腐病斑面積51%以上；罹病度之公式如下：

罹病度(%)＝[(Σ罹病指數 x 該指數果實數) /(6 x 總果實數)] x 100%

( 四) 防治木瓜疫病

將採收後之木瓜浸泡於水(對照組)、它牌枯草桿菌、2000倍稀釋的62.5%賽普護汰寧藥劑，或是菌量濃度為2 x 10⁵ cfu/mL之KHY26稀釋菌液，浸泡1分鐘後陰乾，放於27℃下放置於封口袋內，8天後觀察木瓜病害的發生情形。請參見表九與第八圖，浸泡賽普護汰寧藥劑與KHY26菌液之木瓜的罹病率與罹病度皆顯著低於對照組以及處理它牌枯草桿菌處理組，且KHY26菌液組的罹病率與罹病度又低於賽普護汰寧藥劑組；參見第八圖，處理KHY26菌液的木瓜果皮較完完整美觀，並無觀察到病斑或是菌絲。

木瓜疫病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~4級，0級代表無任何病徵，1級為果實疫病病斑面積占1~5%，2級為果實疫病病斑面積占6~10%，3級為果實疫病病斑面積占11~20%，4級為果實疫病病斑面積21%以上；罹病度之公式如下：

罹病率(%)＝(罹病果實數 /總果實數) x 100%

表九

另，將木瓜浸泡於水、2 x 10⁷ cfu/mL之KHY26菌液，與2000倍稀釋的62.5%賽普護汰寧藥劑1分鐘後，取出陰乾並放置於紙箱，以電石催熟1天，再於室溫下放置5天，並觀察木瓜病害之發生情形。請參見表十，於木瓜疫病的防護上，KHY26菌液與賽普護汰寧的罹病率與罹病度皆為0%，明顯低於對照組；而於木瓜蒂腐病的防護上，KHY26菌液與賽普護汰寧的罹病率與罹病度皆亦低於對照組。

木瓜疫病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~4級，0級代表無任何病徵，1級為果實疫病病斑面積占1~5%，2級為果實疫病病斑面積占6~10%，3級為果實疫病病斑面積占11~20%，4級為果實疫病病斑面積21%以上。

木瓜蒂腐病罹病度係藉由罹病指數求得，罹病指數分為0~4級，0級代表無任何病徵，1級為果實蒂腐病病斑面積占1~5%，2級為果實蒂腐病病斑面積占6~10%，3級為果實蒂腐病病斑面積占11~20%，4級為果實蒂腐病病斑面積21%以上。上述二種疾病罹病度之公式如下：

罹病率(%)＝(罹病果實數 /總果實數) x 100%

表十

( 五) 防治木瓜根腐病(Pythium aphanidermatum )

將生長45天大的木瓜移植含有木瓜根腐病菌(Pythium aphanidermatum )的土壤中，土染的病菌量為10² spore/g-土壤後，每株分別澆灌總體積為10 mL之水(對照組)及稀釋5~500倍、原始濃度為6 x 10⁷ cfu/mL)之KHY26菌液菌液，並於室溫培養7天以觀察病害的發生。請參見表十一，澆灌KHY26菌液各稀釋倍數皆能明顯抑制罹病之植株，其罹病率亦顯著低於對照組。

罹病率(%)＝(罹病株數 /總株數) x 100%

表十一

另，將生長60天大之木瓜穴盤苗，連同栽培介質分別以100~1000倍稀釋、原始濃度為6 x 10⁷ cfu/mL之KHY26種子菌液進行浸根處理，再移植到含有菌量為10² spore/g-土壤之木瓜根腐病病菌之培養土內，於室溫培養12天。請參見表十二，以浸根方式處理之木瓜植株，其罹病率可降低至10%，所能達到的防治效果優於以澆灌方式給予KHY26菌液之植株；且以浸根方式處理木瓜植株，僅需要使用1000倍稀釋的菌液就可以達到極佳的防護效果。

罹病率(%)＝(罹病株數 /總株數) x 100%

表十二

另，於美濃的木瓜園進行田間試驗，自木瓜穴盤苗移植至田間起，每2周澆灌一次KHY26菌液，連續澆灌6次後；無澆灌KHY26菌液之對照組於颱風後發生根腐病的機率為44.4%，而KHY26菌液澆灌組別發生根腐病的機率僅為22.2%。

罹病率(%)＝(罹病株數 /總株數) x 100%

( 六) 防治瓜類根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)

將欲種植甜瓜之植穴，於種植前一日分別處理500 mL水(對照組)、500 mL之100倍稀釋無菌培養液、500 mL之100倍稀釋、原始濃度為2x10⁷ cfu/ml之KHY26菌液及於植穴旁開溝條並施以 7.2g的歐殺滅，毆殺滅之施予比例約為 60 kg/公頃；其中種植於處理KHY26菌液植穴之組別，其植株會再以100倍稀釋之KHY26菌液進行浸根處理，再定植；定植後每週再分別以水、100倍稀釋之KHY26菌液(原始濃度為2x10⁷ cfu/ml)或100倍稀釋之無菌培養液進行澆灌處理，本實驗共進行5次澆灌處理。請參見表十三，為各組別之植株根瘤數目及土壤線蟲數，KHY26組別能有效減少植株的根瘤數目，以及土壤中的線蟲數；再請參閱第九圖，處理KHY26菌液處理組別的根瘤數明顯低於對照組以及無菌培養液組。

表十三

( 七) 以KHY26液劑防治茄科根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)

將番茄穴盤苗於移植至田間前，連同穴盤栽培介質以50倍稀釋、原始濃度為2x10⁷ cfu/ml之KHY26液劑進行浸根處理，再移植至田間植穴中，於移植後，每14天，每株分別澆灌處理500 mL水(對照組)、500 mL之100倍、200倍、400倍稀釋KHY26液劑(原始濃度為2x10⁷ cfu/ml)，本實驗共進行7次澆灌處理。請參見表十四，為各組別之土壤線蟲數，KHY26液劑各濃度處理組皆能有效減少土壤中的線蟲總數，以及減少根瘤線蟲及其他植食性線蟲數目。

表十四

( 八) 以KHY26粉劑防治茄科根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)

將番茄穴盤苗於移植至田間前，將不同處理量(1 g、2 g或4g)、原始菌量為1x10⁹ cfu/g之KHY26粉劑施灑於植穴中土壤1次，再將番茄苗移植至田間植穴中，於移植後，每14天，每株分別施灑1 g、2 g或4 g之KHY26粉劑於植株莖基處，無任何施灑者為對照組，每14天施灑於植株莖基部周遭土壤1次，並於每次施用後澆水，本實驗共進行7次施灑處理。請參見表十五，為各組別之土壤線蟲數，KHY26粉劑各施用量處理組皆能有效減少土壤中的線蟲總數，以及減少根瘤線蟲及其他植食性線蟲數目。

表十五

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1. 本發明之鏈黴菌KHY26菌株對於多種植物病原菌具有抗生活性，並對根瘤線蟲等線蟲具有抑制效果，且因不具溶血特性故其安全性亦高；KHY26菌液噴灑生長中之植物、將植株進行浸根處理、或噴灑於採收後之果實皆能有效降低蓮霧黑腐病、炭疽病、木瓜疫病、木瓜根腐病、甜瓜根瘤線蟲之感染，可應用於製備廣效性生物農藥。

2. 本發明之鏈黴菌KHY26菌株能有效避免蓮霧、木瓜、印度棗或芒果果皮產生黑斑或腐壞，除了可延長水果的保存以外亦能持水果外觀的美觀程度，提高其經濟價值。此外且KHY26能有效防治瓜類及茄科作物之根瘤線蟲，使瓜類及茄科作物植株生長良好。

3. 本發明提供鏈黴菌KHY26菌株之製備方法包含液態發酵法與固態發酵法，皆能獲得較高濃度之菌量，且製備成的粉劑亦具有優秀的儲存安定性。

綜上所述，本發明鏈黴菌KHY26及其培養方法與用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

無

第一圖：鏈黴菌KHY26菌株於PDA培養基上之菌落型態圖。

第二圖：鏈黴菌KHY26菌株之脂質分解酵素(lipase)、磷脂酶分解酵素(phosphplipase)、澱粉分解酵素(amylase)、蛋白質分解酵素(protease)、纖維分解酵素(cellulase)及幾丁質分解酵素(chitinase)活性分析圖。

第三圖：鏈黴菌KHY26菌株對不同植物病原真菌之抗生活性分析圖。

第四圖：鏈黴菌KHY26菌株對不同地區稻熱病菌之抗生活性分析圖。

第五圖：鏈黴菌KHY26菌液防治印度棗炭疽病分析圖。

第六圖：鏈黴菌KHY26菌液及濾液防治蓮霧黑腐病菌分析圖。

第七圖：鏈黴菌KHY26菌液之施用時機對防治蓮霧黑腐病影響分析圖。

第八圖：鏈黴菌KHY26菌液防治木瓜疫病分析圖。

第九圖：鏈黴菌KHY26菌液防治甜瓜根瘤線蟲分析圖。

附件1：鏈黴菌KHY26學名鑑定鑑定報告。

國內寄存資訊

財團法人食品工業發展研究所

民國106年10月19號

寄存編號：BCRC 910799

＜110＞行政院農業委員會高雄農業改良場＜120＞鏈黴菌KHY26及其培養方法與用途＜160＞ 2 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 1287 ＜212＞ DNA ＜213＞ Streptomyces misionesis ＜400＞ 1 cgtgacgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag caatgctgat 60 ctgcgattac tagcgactcc gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa tccgaactga 120 gaccggcttt ttgagattcg ctccacctca cggtatcgca gctcattgta ccggccattg 180 tagcacgtgt gcagcccaag acataagggg catgatgact tgacgtcgtc cccaccttcc 240 tccgagttga ccccggcggt ctcccgtgag tccccagcac cacaagggcc tgctggcaac 300 acgggacaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 360 gacagccatg caccacctgt acaccgacca caaggggggc actatctcta atgctttccg 420 gtgtatgtca agccttggta aggttcttcg cgttgcgtcg aattaagcca catgctccgc 480 cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agttttagcc ttgcggccgt actccccagg 540 cggggcactt aatgcgttag ctgcggcacg gacaacgtgg aatgttgccc acacctagtg 600 cccaccgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg 660 ctcctcagcg tcagtatcgg cccagagatc cgccttcgcc accggtgttc ctcctgatat 720 ctgcgcattt caccgctaca ccaggaattc cgatctcccc taccgaactc tagcctgccc 780 gtatcgagct gcagacccgg ggttaagccc cgggctttca caaccgacgc gacaagccgc 840 tacgagctct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc gccctacgta ttaccgcggc 900 tgctggcacg tagttagccg gcgcttcttc tgcaggtacc gtcactctcg cttcttccct 960 gctgaaagag gtttacaacc cgaaggccgt catccctcac gcggcgtcgc tgcatcaggc 1020 tttcgcccat tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc 1080 agtcccagtg tggccggtcg ccctctcagg ccggctaccc gtcgtcgcct tggtgagccg 1140 ttacctcacc aacaagctga taggccgcgg gctcatcctg caccgccgga gctttacacc 1200 atcaaggatg cccaagatgg tcatatccgg tattagaccc cgtttccagg gcttgtccca 1260 gagtgcaggg cagattgccc acgtgtt 1287 ＜210＞ 2 ＜211＞ 889 ＜212＞ DNA ＜213＞ Streptomyces misionesis ＜400＞ 2 tgcaggacac ttcgtatcgc ccggccttta tggctagtcc tacggccaag accaggttgg 60 agcgctccgc ctcaagccat ccgagggcat cgctctgcct cctgaagtaa cgagaaggcg 120 tggggctagg cggcaggtgg gaggatgcgg catgtgcacc gtggacgtaa taatccagga 180 gccgacccaa tgcaaggtcg cgctgatcct cgacacgaaa ctctccgcct agattatcgg 240 catataggcg aatcaagtcg tggagccgcc acctgcccca ggtttctccc ggttcgacga 300 ggtgcatcct cgccagatct tcaagcaatc gatcagcagc cgactcttcg attgcggcca 360 gttgcgccgc agccctgctc gatatatctg cccctggatt gattgggatt aggcgaaaga 420 ggcgggcctg atcttcggtg agcctccgat aggaaacatc aaatgcggcc gtgaccgttc 480 ttgtgccgcg ctcaagatgt ccaagtcgcg tgtgtgcctg agagagggct tgtttcattg 540 aagtcagtgg gcgaccgggg aaatctgcca ggagagcgcc gcagatctgc aaggctattg 600 ggaggtttcc gcagagccga gcgatttctt tcgcggcatc gaggtcctcc tccacccgga 660 tgtcgtcgac accgttagta ttcttcaata cgcttcgcaa gaggttgacc gatgctgctg 720 atggcaagac ctcaaggctg tggcggcggg cattgatgtc caagctgtcg cgcgaggtaa 780 tcagaaccgc gttagccgtg tcactcggca gcagtggctg tacctgatca atcgacgaca 840 cattgtcgat aattagaagt attcgacgct tatgctttgc gtacgctgc 889

Claims

一種鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株，係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910799，其中KHY26菌株係對植物病原微生物具抗生活性，該植物病原菌係包含木瓜疫病菌(Phytophthora palmimora )、木瓜根腐病菌(Pythium aphanidermatum )、蓮霧黑腐病菌(Lasiodiplodia theobromae )、蓮霧果腐病菌(Pestalotiopsis euginae )、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )、芒果畸形病菌(Fusarium mangiferae )、番石柳黑星病菌(Phyllosticta psidiicola )、番石榴瘡痂病菌(Pestalotiopsis psidii )、稻熱病菌(Magnaporthe grisea )以及瓜類根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)其中至少之一。
一種培養高濃度鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株之培養方法，包含：將鏈黴菌KHY26菌株接種於一培養基，並於25~35℃培養一特定時間，以獲得含有鏈黴菌KHY26之發酵產物。
如申請專利範圍第2項所述之培養方法，其中該培養基係為液態培養基，包含1~10 wt%黃豆漿、0.1~1 wt%酵母抽出物、0.05~0.5 wt%磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )、0.05~0.5 wt%磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )、0.01~0.1 wt%硫酸鎂(MgSO₄ ·7H₂ O))、0.05~0.5 wt%幾丁聚醣(Chitoson)與剩餘百分比之水，且該特定時間為3~5天，並將該鏈黴菌KHY26菌株以轉速100~300 rpm、溶氧量0.5~10 ppm之條件培養3~8日。
如申請專利範圍第2項所述之培養方法，其中該培養基係為固態培養基，包含一固體部分與一液體部分，該固體部分以重量比100%計算包含5~35 wt%燕麥粒、5~35 wt%大麥片、10~20 wt%玉米粉、5~30 wt%稻殼與5~15 wt%蚵殼粉，以及該液體部分為該固體部分總重量之40~60 wt%的水，且該特定時間為10~18天。
一種包含鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株之生物農藥，係以一有效劑量之KHY26菌株施予一所需植物，以抑制植物病原微生物之入侵、生長及病徵表現，其中該植物病原菌係包含木瓜疫病菌(Phytophthora palmimora )、木瓜根腐病菌(Pythium aphanidermatum )、蓮霧黑腐病菌(Lasiodiplodia theobromae )、蓮霧果腐病菌(Pestalotiopsis euginae )、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )、芒果畸形病菌(Fusarium mangiferae )、番石柳黑星病菌(Phyllosticta psidiicola )、番石榴瘡痂病菌(Pestalotiopsis psidii )、稻熱病菌(Magnaporthe grisea )以及根瘤線蟲(Meloidogyne spp.)其中至少之一。
如申請專利範圍第5項所述之生物農藥，該生物農藥係為液態發酵所製成之液劑或粉劑，該液劑之有效劑量係為濃度1 x 10⁵ ~1 x 10¹⁰ cfu/mL之KHY26菌株，該粉劑之有效劑量係為濃度1 x 10⁷ ~1 x 10¹⁰ cfu/g之KHY26菌株，且該粉劑係包含鏈黴菌KHY26菌粉與麥芽糊精。
如申請專利範圍第5項所述之生物農藥，其中該生物農藥係為固態發酵所製成之粉劑，該粉劑之有效劑量係為濃度1 x 10⁸ ~1 x 10¹¹ cfu/g之KHY26菌株。
一種鏈黴菌(Streptomyces misionesis )KHY26菌株用於製備生物農藥之用途，係以一有效劑量之鏈黴菌KHY26菌株施予一所需植物以防治植物病原微生物。
如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該生物農藥為KHY26菌株液態發酵所製成之液劑或粉劑，該液劑之有效劑量係為濃度1 x 10⁶ ~1 x 10¹⁰ cfu/mL之KHY26菌株，該粉劑之有效劑量係為濃度1 x 10⁷ ~1 x 10¹⁰ cfu/g之KHY26菌株，且該粉劑係包含鏈黴菌KHY26菌粉與麥芽糊精。
如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該生物農藥為KHY26菌株固態發酵所製成之粉劑，該粉劑之有效劑量係為濃度1 x 10⁸ ~1 x 10¹¹ cfu/g之KHY26菌株。