TW201726706A

TW201726706A - 胜肽標記及含有其之附加標記的蛋白質

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Publication number: TW201726706A
Application number: TW105143577A
Authority: TW
Inventors: 小池和好; 瀧田英司; 金田晃一
Original assignee: 出光興產股份有限公司
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2017-08-01
Also published as: JPWO2017115853A1; CA3009880A1; WO2017115853A1; AU2016382134A1; AU2016382134B2; CN108473979A; CN108473979B; US20190024094A1; BR112018013246A2; JP7027168B2; EP3399033A4; US10808253B2; EP3399033B1; JP2022044600A; KR20180091098A; US20210130404A1; MX2018008019A; EP3399033A1

Abstract

把具有下述序列的胜肽作為胜肽標記並附加至有用蛋白質且使之表現。 Xm(PYn)qPZr於此處，X、Y及Z是分別獨立地選自下述胺基酸殘基：R、G、S、K、T、L、N、Q、H；且Y之中至少1個包含K、L、N、Q、H或R。m為0~5的整數，n為1、2或者3，q為1~10的整數，r=0~10的整數。

Description

胜肽標記及含有其之附加標記的蛋白質

發明領域本發明關於胜肽標記及含有其之附加標記的蛋白質，編碼其的DNA，還有包含該DNA的轉形體。

發明背景因基因重組技術的發展，在今日來說普遍進行藉由異源表現(heterologous expression)來生產有用蛋白質。在藉由異源表現來生產有用蛋白質時，啟動子及終止子的選定、轉譯增強子、導入基因的密碼子改變、蛋白質在細胞內輸送及局部存在化等是正在探討作為使蛋白質的表現、累積量提升的對策。例如，在專利文獻1來說，揭示使細菌毒素蛋白質藉由植物等表現的技術，並揭示將細菌毒素蛋白質藉著胜肽連接子(peptide linker)來連結並使之表現，該胜肽連接子是脯胺酸以一定間隔配置而成(專利文獻1)。

又，在其以外亦正開發幾個藉著使胜肽標記連結至目標蛋白質，而使其之表現提升的技術(專利文獻2、非專利文獻1~4)。該等胜肽標記連結技術幾乎都是使目標蛋白質的溶解性提升、抑制在細胞內之包涵體(inclusion body)的形成、促進目標蛋白質的正常表現，而非以提升蛋白質表現量為目的。又，其大多是應用於主要使用有大腸菌的表現系統。先行技術文獻專利文獻

專利文獻1：日本專利5360727號說明書專利文獻2：日本專利5273438號說明書非專利文獻

非專利文獻1：Smith, D. B. and Johnson, K. S.,: Gene, 67, 31, 1988 非專利文獻2：Marblestone, J. G. et al.: Protein Sci., 15, 182, 2006 非專利文獻3：di Guan, C. et al.: Gene, 67, 21, 1988, 非專利文獻4：Maria. C. V. et al.: Gene, 74, 365-373, 1988

發明概要發明欲解決之課題於專利文獻1所揭示之使用胜肽連接子來連結毒素蛋白質，藉此毒素融合蛋白質在植物內的高累積化變得可能；其中，該胜肽連接子是脯胺酸已以一定間隔配置而成。惟，該胜肽連接子作為連結多個蛋白質的連接子的有用性雖高，但作為以單一目標蛋白質的高表現為目的的胜肽標記的能力尚未被充分探討，而有探討的餘地。因此，本發明課題在於提供一種胜肽標記，在使目標蛋白質在宿主細胞表現時，該胜肽標記能夠藉由結合至該目標蛋白質來使目標蛋白質的表現量增加。用以解決課題之手段

本發明人等為了圖謀於專利文獻1所揭示之連接子胜肽作為蛋白質高表現用胜肽標記性能的提升，首先著眼於該胜肽(PG12及PG17)中脯胺酸的存在，藉著把存在於脯胺酸(P)與脯胺酸(P)之間的絲胺酸(S)與甘胺酸(G)，以與該等物理化學性質不同的胺基酸取代，設想是否能夠使該等胜肽具有的有益性質進一步提升。具體地說，準備已將胜肽中的絲胺酸(S)、甘胺酸(G)取代為離胺酸(K)、精胺酸(R)等鹼性胺基酸，或天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)等酸性胺基酸，還有丙胺酸(A)、蘇胺酸(T)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)等立體性或極性不同且在側鏈不帶電荷的胺基酸而成的胜肽標記，藉由使該等融合至目標蛋白質，嘗試提升目標蛋白質的表現。其結果發現，藉著把在PG12及PG17中存在於P與P之間的S與G取代為K、L、N、Q或R而成的胜肽附加至目標蛋白質，目標蛋白質的表現量會提升。本發明是基於這樣的知識而成者。

即，本發明如下。 [1]一種具有下述序列的胜肽： X_m (PY_n )_q PZ_r ，於此處，X、Y及Z是分別獨立地選自下述之胺基酸殘基：精胺酸(R)、甘胺酸(G)、絲胺酸(S)、離胺酸(K)、蘇胺酸(T)、白胺酸(L)、天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)、組胺酸(H)，且Y之中至少1個包含K、L、N、Q、H或R；m為0~5的整數，n為1、2或3(較佳是n為2或3)，q為1~10的整數，r=0~10的整數。 [2]如[1]記載之胜肽，G與S的含有率小於60%。 [3]如[1]或者[2]記載之胜肽，長度為6~50個胺基酸。 [4]如[1]~[3]中任一項記載之胜肽，其具有序列編號25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、64、66、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、140、142、143、145、147、149、151、153、155或157的胺基酸列。 [5]一種附加標記的蛋白質，包含如[1]~[4]中任一項記載之胜肽，與有用蛋白質。 [6]如[5]記載之附加標記的蛋白質，其中有用蛋白質為人類生長激素、干擾素β、木聚糖酶、酯酶或綠色螢光蛋白(GFP)。 [7]如[5]或[6]記載之附加標記的蛋白質，其中前述胜肽與前述有用蛋白質是透過蛋白酶辨識序列所連結。 [8]如[5]~[7]中任一項記載之附加標記的蛋白質，其包含分泌信號。 [9]一種DNA，其編碼如[5]~[8]中任一項記載之附加標記的蛋白質。 [10]一種重組載體，包含如[9]記載之DNA。 [11]一種轉形體，其經以如[9]記載之DNA或者如[10]記載之重組載體所轉形而成。 [12]如[11]記載之轉形體，其中轉形體為酵母、大腸菌、嗜熱短桿菌(Brevibacillus)、昆蟲細胞或者哺乳動物細胞(含人類培養細胞但不含人類個體)。 [13]一種附加標記的蛋白質的製造方法，特徵在於培養如[11]或[12]記載之轉形體使附加標記的蛋白質累積，並回收附加標記的蛋白質。發明效果

藉由使用本發明胜肽標記，能夠使目標蛋白質的表現量提升。因此，對於使用了酵母、大腸菌、嗜熱短桿菌等細胞的蛋白質的生產是有用的。尤其，因為迄今在大腸菌或嗜熱短桿菌，標記對於表現量的效果並不明確，在該等中能夠達成藉由標記所致之表現提升在產業上非常有用。本發明之胜肽標記是胺基酸10~30左右的小胜肽標記，對被附加有該胜肽標記之目標蛋白質的結構及機能造成影響的可能性低。因此，表現後之切斷處理能夠省略的可能性高，但當需要除去胜肽標記時，亦能夠插入蛋白酶辨識序列。

較佳實施例之詳細說明用以實施發明之形態本發明之胜肽(亦稱胜肽標記)具有下述序列。 X_m (PY_n )_q PZ_r

所謂X_m 是意味X連續m個，此狀況時的m個X可為選自R、G、S、K、T、L、N、Q、H的相同胺基酸殘基，亦可為不同的胺基酸殘基。m為0~5的整數，但較佳為1~5的整數，更佳為1~3的整數。

所謂(PY_n )_q 意味PY_n ，即，因為n為1，2或者3，意味PY、PYY或者PYYY連續q次(P表示脯胺酸)。PY、PYY與PYYY合計連續q次即可。於此處，分別的Y可為選自R、G、S、K、T、L、N、Q的相同胺基酸殘基，亦可為不同的胺基酸殘基，但在連續q次之PY_n 所含的Y之中，至少1個為K、L、N、Q、H或者R。更佳為在連續q次之PY_n 所含的Y之中，2個以上為K、L、N、Q、H或者R。q為1~10的整數，較佳為2~10的整數，更佳為2~5的整數，進一步較佳為2~3的整數。

所謂PZ_r 意味在P之後Z連續r個，此狀況時之r個Z可為選自R、G、S、K、T、L、N、Q的相同胺基酸殘基，亦可為不同的胺基酸殘基。r為0~10的整數，但較佳為1~10的整數，更佳為1~5的整數。

本發明之胜肽，較佳為長度6~50個胺基酸，更佳為6~40個胺基酸，進一步較佳為8~40個胺基酸，越發佳為10~30個胺基酸，甚至更佳為12~25個胺基酸，特佳為12~20個胺基酸。

在本發明之胜肽中，相對於全部胺基酸之甘胺酸與絲胺酸加以合計的含有率為較佳為小於60%，更佳為小於57%。

就本發明之胜肽的一態様而言，可舉具有下述胺基酸序列的胜肽：在PG12或者PG17中，P以外的胺基酸之中， 1~數個(例如，1~6個，較佳為2~6個)胺基酸已被取代為K、L、N或者Q而成的胺基酸序列。又，可舉具有下述胺基酸序列的胜肽：在PG12或者PG17中，P、R以外的胺基酸之中，1~數個(例如，1~5個，較佳為2~5個)胺基酸已被取代為R而成的胺基酸序列。於此處，更佳為在PG12或者PG17中被取代的胺基酸是P與P之間的胺基酸。

本發明之胜肽較佳為以序列編號25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、64、66、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、140、142、143、145、147、149、151、153、155，或者157所表示的胺基酸序列構成的胜肽。

本發明之附加標記的蛋白質，是本發明之胜肽標記已結合至目標蛋白質而成者(亦稱為標記與目標蛋白質的融合蛋白質)。胜肽標記可結合至目標蛋白質的N末端，胜肽標記亦可結合至目標蛋白質的C末端，胜肽標記亦可結合至目標蛋白質的N末端與C末端雙方。胜肽標記可直接結合至目標蛋白質的N末端及/或C末端，亦可透過1~數個胺基酸(例如，1~5個胺基酸)的序列來結合。1~數個胺基酸的序列是不會對附加標記的蛋白質的機能及表現量造成不良影響的序列的話可為任意的序列，但藉著作成蛋白酶辨識序列，在表現、純化之後能夠從有用蛋白質將胜肽標記切開。可例示因子Xa辨識序列(IEGR：序列編號10) 作為蛋白酶辨識序列。又，本發明附加標記的蛋白質，亦可為包含His標記、HN標記(例如，序列編號6)、FLAG標記等在檢測及純化等需要的其他標記序列。

就本發明附加標記的蛋白質所含之有用蛋白質而言，未被特別限制，可舉：成長因子、激素、細胞介素、原血紅素蛋白、酵素、抗原、抗體、轉錄因子、受體、螢光蛋白或者該等的部分胜肽等。

就酵素而言，例如，可舉：脂酶、蛋白酶、類固醇合成酶、激酶、磷酸酶、木聚糖酶、酯酶、甲基酶(methylase)、去甲基酶、氧化酶、還原酶、纖維素酶、芳香酶、膠原酶、轉麩醯胺酸酶、醣苷酶及甲殼素酶。

就成長因子而言，例如，可舉：表皮生長因子(EGF)、似胰島素生長因子(IGF)、轉變生長因子(TGF)、神經生長因子(NGF)、大腦衍生神經滋養因子(BDNF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、顆粒球群落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor)(G-CSF)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)(GM-CSF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、紅血球生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、纖維母細胞生長因子(FGF)、肝細胞生長因子(HGF)。

就激素而言，例如，胰島素、升糖素、生長抑制素、生長激素(例如，序列編號1)、副甲狀腺素、泌乳素、瘦素、抑鈣素。

就細胞介素而言，例如，可舉：介白素、干擾素(IFNα、IFNβ(例如，序列編號2)、IFNγ)、腫瘤壞死因子(TNF)。

就原血紅素蛋白而言，例如，可舉：凝血酶、血清白蛋白、VII因子、VIII因子、IX因子、X因子、組織血纖維蛋白溶酶原活化因子(tissue plasminogen activator)。

就抗體而言，例如，可舉：完全抗體、Fab、F(ab’)、F(ab’)₂ 、Fc、Fc融合蛋白質、重鏈(H鎖)、輕鏈(L鎖)、單鏈Fv(scFv)、sc(Fv)₂ 、雙硫鍵Fv(sdFv)、雙功能抗體(Diabody)。

作為疫苗所使用的抗原蛋白，是能夠引起免疫反應者的話未被特別限制，因應想定之免疫反應的對象來適宜選擇即可，例如，可舉：源於致病性細菌的蛋白質及源於致病性病毒的蛋白質。

在分泌生產用，本發明之附加標記的蛋白質亦可附加有在宿主細胞中發揮作用的分泌信號胜肽。分泌信號胜肽，當以酵母為宿主時，可舉：轉化酶分泌信號(例如，序列編號5)、P3分泌信號、α因子分泌信號(序列編號168)等；當以大腸菌為宿主時，可舉：PelB分泌信號；當以嗜熱短桿菌為宿主時，可舉：P22分泌信號。又，當以植物為宿主時，可舉源於：屬於茄科(Solanaceae)、薔薇科(Rosaceae)、蕓薹科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，進一步較佳為屬於菸草屬(Nicotiana)、阿拉伯芥屬(Arabidopsis)、莓屬(Fragaria)、萵苣屬(Lactuca)等的植物，較佳為菸草(Nicotiana tabacum)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、草莓(Fragaria×ananassa)、萵苣(Lactuca sativa)等的分泌信號。

進而，本發明之附加標記的蛋白質，為了使在特定的細胞劃分區表現，亦可附加有內質網殘留信號胜肽、液胞轉移信號胜肽等輸送信號胜肽。

本發明之附加標記的蛋白質，能化學合成，亦能夠基因工程生產。就基因工程生產的方法來說，於後敘述。

本發明之DNA特徵係在於包含編碼本發明附加標記的蛋白質的DNA。即，本發明之DNA，包含編碼有用蛋白質的DNA，及編碼胜肽標記的DNA。編碼有用蛋白質的DNA，及編碼胜肽標記的DNA是配合讀框被連結。

編碼有用蛋白質的DNA，例如，可基於公知的鹼基序列，藉由一般基因工程的手法而獲得。又，編碼本發明附加標記的蛋白質的DNA，是因應使該蛋白質生產的宿主細胞，適宜改變表示構成附加標記的蛋白質之胺基酸的密碼子，使得雜交體蛋白質的轉譯量增大亦為較佳為。就就改變密碼子的方法而言，例如能以Kang et al. (2004)的方法為參考。又，可舉下述方法：或選擇在宿主細胞中使用頻率高的密碼子，或選擇GC含量高的密碼子，或選擇在宿主細胞的持家基因(housekeeping gene)中使用頻率高的密碼子的方法。

本發明DNA，為了使在宿主細胞的表現提升，亦可為包含在宿主細胞中發揮作用的增強子序列等。就增強子而言，可舉Kozak序列及源於植物之乙醇去氫酶基因的5’-非轉譯區。

本發明DNA能夠藉由一般基因工程的手法而製作，例如，能夠使用PCR及DNA連接酶等，把編碼本發明胜肽標記的DNA，及編碼有用蛋白質的DNA等予以連結而構建。

本發明之重組載體，是編碼前述附加標記的蛋白質的DNA，以使得在被導入有載體的宿主細胞中能夠表現的方式，被插入至載體內者即可。載體是能夠在宿主細胞中複製者即可未被特別限制，例如，可舉：質體DNA、病毒DNA等。又，載體較佳包含抗藥性基因等篩選標誌。就具體的質體載體而言，例如，可例示：pTrcHis2載體、pUC119、pBR322、pBluescript II KS+、pYES2、pAUR123、pQE-Tri、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL、pRI909、pRI910、pBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm、pTrc99A、 pKK223、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等。

可在載體內使用的啟動子，能夠因應被導入有載體的宿主細胞來適宜選擇。例如，使在酵母表現時，能夠使用GAL1啟動子、PGK1啟動子、TEF1啟動子、ADH1啟動子、TPI1啟動子、PYK1啟動子等。使在植物表現時，能夠使用花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)35S啟動子、稻的肌動蛋白啟動子、玉米的泛素啟動子、萵苣的泛素啟動子等。使在大腸菌表現時，可舉：T7啟動子等；使在嗜熱短桿菌表現時，可舉：P2啟動子及P22啟動子等。亦可為可誘導的的啟動子，例如可使用：在可藉由IPTG誘導的啟動子，即lac、tac、trc之外，還可使用：可利用IAA誘導的trp、可利用L-阿拉伯糖誘導的ara、可使用四環素誘導的Pzt-1、可利用高温(42℃)誘導的P_L 啟動子、為冷休克基因之一個的cspA基因的啟動子等。又，因應需要，終止子序列亦可因應宿主細胞來包含。

本發明之重組載體，例如藉由下述來製作：能夠將DNA構建物以恰當的限制酶來切斷或者藉由PCR來附加限制酶部位，插入至載體的限制酶部位或多重選殖位(multiple cloning site)來製作。

本發明之轉形體，特徵在於是被前述DNA或者包含其之重組載體所轉形。可使用於轉形之宿主細胞可為真核細胞及原核細胞之任一者，但較佳為真核細胞。就真核細胞而言，可較佳使用酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞等。就酵母而言，可舉：啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae)、高蛋白假絲酵母(Candida utilis)及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、畢赤氏酵母(Pichia pastoris)等。進一步，亦可使用麴菌(Aspergillus)等微生物。就原核細胞而言，可舉：大腸菌(Escherichia coli)、乳酸菌(Lactobacillus)、枯草菌(Bacillus)、嗜熱短桿菌(Brevibacillus)、農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、放線菌等。就植物細胞而言，可舉：萵苣屬(Lactuca)等屬於菊科(Astaraceae)、茄科(Solanaceae)、蕓薹科(Brassicaceae)、薔薇科(Rosaceae)、藜科(Chenopodiaceae)之植物的細胞等。

於本發明使用的轉形體，能夠藉由使用一般基因工程的手法，來將本發明重組載體導入至宿主細胞而製作。例如，能夠使用電穿孔法(Tada, et al., 1990, Theor.Appl.Genet, 80：475)、原生質體法(Gene, 39, 281-286(1985))、聚乙二醇法(Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437)、利用了農桿菌的導入方法(Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271)、粒子槍(particle gun)法(Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5：27)、聚陽離子(polycation)法(Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):235-40.)等方法。再者，基因表現可為─暫時性表現，亦可為組入至染色體的穩定表現。

將本發明重組載體導入至宿主細胞之後，能夠藉由篩選標誌的表現型來挑選轉形體。又，藉著將挑選出的轉形體予以培養，能夠生產前述附加標記的蛋白質。於培養使用的培養基及條件，能夠因應轉形體的種類來適宜選擇。又，當宿主細胞為植物細胞時來說，藉由將挑選出的植物細胞按照一般方法來培養，能夠使植物體再生，並能夠使前述附加標記的蛋白質累積在植物細胞內或植物細胞的細胞膜外。

已累積在培養基或細胞內之附加有本發明胜肽標記的蛋白質，能夠按照該技術領域之人士熟知的方法來進行分離純化。例如，可藉由：鹽析、乙醇沈澱、超過濾、凝膠過濾層析術、離子交換管柱層析術、親和力層析術、中高壓液相層析術、逆相層析術、疏水層析術等已知的適切方法，或者藉由組合該等來分離純化。

以下，說明本發明的實施例，但本發明並非被限定於這般的實施例。實施例

(1) 編碼酵母用附加胜肽標記的蛋白質之基因表現用質體的構建使用1)人類生長激素(hGH，序列編號1)、2)人類干擾素β-1b(IFNβ，序列編號2)作為要附加胜肽標記的蛋白質。把編碼hGH之人工合成DNA(序列編號3)插入到pUC19修飾質體pTRU5(FASMAC)的EcoRV辨識部位，獲得了質體1。把編碼IFNβ之人工合成DNA(序列編號4)插入到pUC19修飾質體pTRU5的EcoRV辨識部位，獲得了質體2。

以使得酵母轉化酶SUC2信號胜肽(SUC2SP，序列編號5，Hashimoto等，Protein Engineering, 1998 2; 75-77)與檢測/純化用之6×HN標記(序列編號6)附加到表現蛋白質之N末端的方式，把在NotI、SalI、SfiI、XhoI、AscI辨識序列所構成的多重選殖位的5’末端附加有編碼SUC2SP及6×HN標記的DNA序列而成的人工合成DNA(序列編號7)，插入至pYES2(Invitrogen)的HindIII-XbaI位來作成了酵母表現用質體3。

以下述程序來構建質體，該質體是用以使在N或C末端，或者在N、C兩末端附加有各種標記(表1)而成的hGH或者IFNβ在酵母中表現 (圖1)。首先，為了在hGH或者IFNβ的N或C末端，或者N、C兩末端附加各種標記，實施依據表2顯示的模板質體、正向引子、反向引子的組合的PCR。在各引子的5’末端附加有與質體3相同的序列。PCR使用KOD-PLUS-Ver.2(東洋紡)，調製50 μl反應液使之成為2 pg/μl 模板質體、0.3 μM 正向引子、0.3 μM 反向引子、0.2 mM dNTPs、1×KOD-Plus-Ver.2用緩衝液(1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2)、1.5 mM MgSO₄ 、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2，在94℃、加熱5分鐘之後，進行98℃、10秒鐘，60℃、 30秒鐘，68℃、40秒鐘的加熱處理25循環，最後在68℃下加熱5分鐘。所獲得之擴增片段是利用QIAquick PCR 純化套組(QIAquick PCR Purification Kit)(QIAGEN)進行純化。質體3是以NotI、AscI消化後，藉由使用了0.8% SeaKem GTG 瓊脂糖(Lonza)的電泳進行分離，使用QIAquick 凝膠萃取套組(QIAquick Gel Extraction Kit)(QIAGEN)從凝膠進行萃取。把約50 ng份之萃取出的質體3與純化PCR產物2 μl予以混合，並將液量調整為5 μl後，與Gene Art 無縫PLUS 選殖及組裝套組(Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit)(Applied Biosystem)隨附的2×酶混合物(Enzyme Mix) 5 μl混合，在室溫下靜置30分鐘，其後於冰上靜置5分鐘。將反應液5 μl與上述套組隨附的勝任細胞DH10B T1 SA混合並在冰上靜置30分鐘後，在37℃下加溫10分鐘，在冰上靜置2分鐘後，把SOC添加250 μl，以37℃、200 rpm振盪1小時。其後，將50μl振盪物塗布至包含100 mg/l安比西林的2×YT瓊脂培養基(16 g/l 細菌用胰腖(Bacto tryptone)、10 g/l 細菌用酵母萃(Bacto Yeast Extract)、5 g/l NaCl、15 g/l 細菌用瓊脂(Bacto Agar))後，在37℃下靜置培養一晩，獲得了轉形群落。將群落移植至包含100 mg/l安比西林的2×YT液體培養基(16 g/l 細菌用胰腖、10 g/l 細菌用酵母萃、5 g/l NaCl)，以37℃、200 rpm振盪培養一晩後，萃取質體，確認鹼基序列後，使用於酵母的轉形。

(2)酵母的轉形將酵母(Saccharomyces cerevisiae INVSc1，Invitrogen)在YPD培養基(1% 酵母萃、2% 蛋白腖(peptone)、2% 右旋糖(dextrose)(D-葡萄糖))以30℃、200rpm振盪培養一晩。進行稀釋使得在10 ml的YPD 中在波長600 nm下的濁度(OD₆₀₀ )成為0.2-0.4之後，以30℃、200 rpm進行了振盪培養直至OD₆₀₀ 成為0.6-1.0。以500 x g、室溫來離心5 分鐘，將細胞作成片狀沉澱物(pellet)，捨去上清液。其次將片狀沉澱物懸浮於10 ml的溶液 I(Solution I) (S. c. EasyComp Transformation Kit，Invitrogen)。進一步，以500 x g、室溫來離心5 分鐘，將細胞作成片狀沉澱物，捨去上清液。其次，將片狀沉澱物懸浮在1 ml的溶液II(S. c. EasyComp Transformation Kit，Invitrogen)，各分注50 μl，作成勝任細胞。保管在-80℃的超低溫冷凍器直至使用。將所獲得之勝任細胞融解並返回至室溫，將在上述製作出之附加胜肽標記的蛋白質表現用質體添加1 μg之後，添加500 μl的溶液III(室溫)並進行了渦漩震盪(vortex)之後，在30℃下靜置1小時(每15分鐘進行了渦漩震盪)。進一步將上述靜置物50μl塗布至包含2% 葡萄糖及2% 細菌用瓊脂的SC-Ura培養基 (6.7 g/L酵母氮源(yeast nitrogen base)、0.1 g/L 腺嘌呤、0.1 g/L 精胺酸、0.1 g/L 半胱胺酸、0.1 g/L 白胺酸、0.1 g/L 離胺酸、0.1 g/L 蘇胺酸、0.1 g/L 色胺酸、0.05 g/L 天冬胺酸、0.05 g/L 組胺酸、0.05 g/L 異白胺酸、0.05 g/L 甲硫胺酸、0.05 g/L 苯丙胺酸、0.05 g/L 脯胺酸、0.05 g/L 絲胺酸、0.05 g/L 酪胺酸、0.05 g/L 纈胺酸)之後，在30℃下靜置培養2-3日，獲得了轉形群落。

(3) 酵母的蛋白質誘導培養將轉形後的單一群落塗抹至平板培養基(SC-Ura、2%右旋糖)，靜置在30℃、24小時在培育箱中進行了培養。其次，由培養後的平板培養基以1μl滅菌一次性接種環(disposable loop)刮取菌體，接種到分注有3ml前培養培養基(SC-Ura、2% 半乳糖)的滅菌聚苯乙烯製14ml管，進行30℃、200rpm、16小時振盪培養。培養結束後，以分光光度計600nm來測定濁度，當在再懸浮於3ml培養基時，把濁度成為0.4所需量的培養物分別取至已滅菌的1.5ml微量離心管後，進行3,000×g、4℃、5分鐘離心，除去上清液後，使沉澱懸浮於1ml誘導培養基(SC-Ura、1% 半乳糖、1% 棉子糖)，與預先分注有2ml誘導培養基的滅菌聚苯乙烯製14ml管一起進行30℃、200rpm、24小時振盪培養。培養結束後，將培養液400μl分別取至1.5ml 微量離心管，3,000×g、4℃、5分鐘離心後，除去上清液之後，在液態氮中凍結後，在超低溫冷凍器中-80℃下保存。

(4)自酵母萃取蛋白質蛋白質萃取是按照Akira Hosomi等人的方法(Akira Hosomi, et al,: J Biol Chem, 285,(32), 24324-24334, 2010)，使用液態氮凍結後，保存在-80℃之導入基因的酵母菌體來進行。將720μl的蒸餾水添加至保存樣本並以渦漩震盪混合器(vortex mixer)攪拌後，添加80μl之1.0N NaOH，再度利用渦漩震盪混合器來攪拌後，在冰冷卻下靜置10分鐘。接著，進行4℃、15,000g、5分鐘離心，捨棄上清液之後，回收沉澱。將100μl的樣本緩衝液(EZ Apply，ATTO製)添加至沉澱，利用渦漩震盪混合器攪拌後，在沸水中加溫10分鐘，進行了樣本的SDS化。

(5)編碼大腸菌用附加胜肽標記的蛋白質之基因表現用質體的構建調製人工合成DNA(序列編號78)，插入到pET-15b(Novagen)的XbaI-BlpI位來作成大腸菌表現用質體4。人工合成DNA(序列編號78)是如下者：pET-22b(+)(Novagen)之XbaI-BlpI間的基因表現匣之中，把緊接著大腸菌PelB信號胜肽(PelBSP)後到終止密碼子為止的區域，替換為由檢測/純化用的6×HN標記(序列編號6)並接著NotI、SalI、SfiI、XhoI、AscI辨識序列構成的多重選殖位而成。以下述程序來構建質體(圖2)，該質體是用以使在N或C末端或者N、C兩末端附加有各種標記而成的hGH或者IFNβ在大腸菌中表現。首先，為了將各種標記附加至hGH或者IFNβ的N或C末端或者N、C兩末端，實施依據表3所示的模板質體、正向引子、反向引子的組合的PCR。在各引子的5’末端附加有與質體4相同的序列。PCR是使用KOD-PLUS-Ver.2(東洋紡)，調製50 μl反應液使之成為2 pg/μl 模板質體、0.3 μM 正向引子、0.3 μM 反向引子、0.2 mM dNTPs、1×KOD-Plus-Ver.2用緩衝液、1.5 mM MgSO₄ 、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2，在94℃、5分鐘加熱之後，將98℃、10秒鐘，60℃、30秒鐘，68℃、40秒鐘的加熱處理進行25循環，最後在68℃下加熱5分鐘。所獲得之擴增片段是利用QIAquick PCR 純化套組(QIAGEN)進行純化。質體4是以NotI、AscI消化後，藉由使用了0.8% SeaKem GTG 瓊脂糖(Lonza)的電泳而分離，並使用QIAquick 凝膠萃取套組(QIAGEN)從凝膠進行了萃取。將約50 ng份之萃取出的質體4與純化PCR產物2 μl予以混合並將液量調整為5 μl後，與Gene Art 無縫PLUS 選殖及組裝套組(Applied Biosystem)隨附的2×酶混合物 5 μl混合，在室溫下靜置30分鐘，其後在冰上靜置5分鐘。將反應液5 μl與上述套組隨附的勝任細胞大腸菌DH10B T1 SA予以混合並在冰上靜置30分鐘後，在37℃下加溫10分鐘，在冰上靜置2分鐘後，將SOC添加250 μl，以37℃、200 rpm振盪了1小時。其後，將50μl振盪物塗布於包含100 mg/l安比西林的2×YT瓊脂培養基(16 g/l細菌用胰腖、10 g/l 細菌用酵母萃、5 g/l NaCl、15 g/l 細菌用瓊脂)後，在37℃下靜置培養一晩，獲得了轉形群落。將群落移植至包含100 mg/l安比西林的2×YT液體培養基(16 g/l細菌用胰腖、10 g/l 細菌用酵母萃、5 g/l NaCl)，以37℃、200 rpm振盪培養一晩後，萃取質體，確認鹼基序列後，使用於蛋白質表現用大腸菌的轉形。

(6)蛋白質表現用大腸菌的轉形將大腸菌BL21 (DE3)(Novagen)的甘油儲藏液接種到裝入有3 ml SOB培養基(20 g/l 細菌用胰腖、5 g/l 細菌用酵母萃、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgSO₄ 、10 mM MgCl₂ )的滅菌聚苯乙烯製14ml管，以37℃、200rpm振盪培養一晩。將上述前培養液接種0.2 ml至裝入有100 ml SOB培養基的滅菌錐形瓶(Erlenmeyer flask)後，以30℃、200rpm進行振盪培養。當在波長600 nm下的濁度(OD600)成為0.4-0.6後則冰冷卻10-30分鐘停止培養。將培養液移至50 ml 錐形管，進行了2,500×g、4℃、10 分鐘離心(×2支)。捨去上清液，添加已冰冷卻的15 ml TB(10 mM PIPES-KOH、pH6.7、15 mM CaCl₂ 、0.25 M KCl、55 mM MnCl₂ )並溫和地懸浮片狀沉澱物(×2支)。將2支份的懸浮液匯集為1支，進行2,500×g、4℃、10 分鐘離心。捨去上清液，添加已冰冷卻的10ml TB溫和地懸浮片狀沉澱物。將DMSO添加700 μl，一邊冰冷卻一邊進行懸浮。在1.5 ml微量管各分注50μl來作成勝任細胞。利用液態氮凍結後，在‐80℃保存直至使用。在冰上融解所獲得之勝任細胞，添加1 ng在上述製作出的大腸菌用附加胜肽標記的蛋白質表現質體後，溫和地混合並在冰上靜置30 分鐘。42℃、30-45秒處理(熱震)之後，在冰上靜置2 min。添加250 μl的SOC後，使管呈水平，以37℃、200 rpm振盪1 小時。將振盪物50μl塗布於包含100 mg/l安比西林的2×YT瓊脂培養基後，在37℃下靜置培養一晩，獲得了轉形群落。

(7) 大腸菌的蛋白質誘導培養將轉形後的單一群落塗抹於平板培養基(2×YT、100ppm 安比西林)，靜置在培育箱中在37℃下進行培養一晩。其次，藉著滅菌一次性接種環，由培養後的平板培養基刮取菌體，接種到分注有2 ml前培養培養基(LB、100ppm 安比西林)的滅菌聚苯乙烯製14 ml管，37℃、200 rpm進行振盪培養直至OD₆₀₀ 値到達0.6~1.0。在將1.0ml LB培養基(100ppm 安比西林)添加至已去除了該等培養物的離心上清液而得的沉澱物之際，把OD₆₀₀ 値成為0.3所需要量的培養物分別取至1.5ml 微量離心管，在4℃(冷蔵庫內)下靜置保管一晩。翌日，將前述樣本以2,000 rpm、4℃、30 min離心後，除去上清液，添加新的LB培養基(100ppm 安比西林)1 ml，將沉澱予以懸浮。進一步，把上述樣本1 ml中的300μl接種至2.7 ml的LB培養基(100 ppm 安比西林)使得OD₆₀₀ 値成為0.03，以37℃、200 rpm進行振盪培養直至OD₆₀₀ 値到達0.4~1.0。其次，將1M IPTG(誘導劑)添加3μl(終濃度1mM)，以37℃、200 rpm進行3小時振盪培養。培養結束後，把裝入有樣本的試管在冰上冷卻5分鐘，使大腸菌的增殖停止後，將培養液200μl分別取至新的1.5 ml微量離心管，以5,000rpm、4℃5min進行離心。接著，去除上清液，以液態氮凍結菌體後，在‐80℃下予以凍結保存。

(8)自大腸菌萃取蛋白質將100μl的樣本緩衝液(EZ Apply，ATTO製)添加至凍結保存樣本，利用渦漩震盪混合器攪拌後，在沸水中加熱10分鐘，進行樣本的SDS化。

(9)編碼嗜熱短桿菌用之附加胜肽標記的hGH之基因表現用質體的構建及轉形質體構建及嗜熱短桿菌的轉形是使用Brevibacillus表現系統(BrevibacillusExpression System) –BIC系統-(Takara bio) 而進行 (圖3)。首先，為了在hGH的N或C末端或者N、C兩末端附加各種標記，實施依據表3所示之模板質體、正向引子、反向引子的組合的PCR。在各引子的5’末端附加了與pBIC3的插入處相同的序列。PCR是使用KOD-PLUS-Ver.2(東洋紡)，調製50 μl反應液使之成為2 pg/μl 模板質體、0.3 μM 正向引子、0.3 μM 反向引子、0.2 mM dNTPs、1×KOD-Plus-Ver.2用緩衝液、1.5 mM MgSO₄ 、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2，在94℃、5分鐘加熱之後，進行98℃、10秒鐘，60℃、30秒鐘，68℃、40秒鐘的加熱處理25循環，最後在68℃下加熱5分鐘。所獲得之擴增片段是利用QIAquick PCR 純化套組(QIAGEN)純化。由同源重組進行的質體的構建及轉形是如以下般進行。把100 ng的嗜熱短桿菌表現用質體pBIC3(於套組隨附)與已純化的PCR產物以莫耳比成為約1:2的方式進行混合，利用滅菌水調整成為5 μl。將橋石短芽孢桿菌(Brevibacillus choshinensis) SP3 勝任細胞(Takara bio)在37℃加熱塊(heat block)靜置30秒鐘來急速解凍，並離心(12,000 rpm、室溫、1分鐘)後除去上清液後，把混合了上述5 μl DNA溶液與50 μl 溶液 A(於套組隨附)而成者全量添加並藉由渦漩震盪來將勝任細胞的片狀沉澱物完全地懸浮，靜置5分鐘。添加150 μl的溶液 B(PEG溶液)，利用渦漩震盪混和10秒鐘，並離心(5,000 rpm、室溫、5分鐘)後除去上清液，再度離心(5,000 rpm、室溫、30秒鐘)並完全地除去上清液。對其添加1 ml MT培養基，使用微量吸管來完全地懸浮後，以37 ℃、200 rpm進行了1小時振盪培養。培養液是平板接種(plating)於MTNm平板(10 g/L葡萄糖、10 g/L植物蛋白腖(phytone peptone)、5 g/L埃里克鰹魚萃取物(Ehrlich’s bonito extract)、2 g/L粉末酵母萃S、10 mg/L FeSO₄ ・7H₂ O、10 mg/L MnSO₄ ・4H₂ O、1 mg/L ZnSO₄ ・7H₂ O、20 mM MgCl₂ 、1.5% 細菌用瓊脂、50 μg/mL新黴素、pH 7.0)，在37 ℃下靜置培養1晩。所獲得之殖株(clone)是藉由群落的西方墨點分析而確認目標蛋白質的表現，針對可確認到表現的殖株，將群落接種於TMNm培養基(10 g/L葡萄糖、10 g/L植物蛋白腖、5 g/L埃里克鰹魚萃取物、2 g/L粉末酵母萃S、10 mg/L FeSO₄ ・7H₂ O、10 mg/L MnSO₄ ・4H₂ O、1 mg/L ZnSO₄ ・7H₂ O、50 μg/mL新黴素、pH 7.0)，以30℃、200 rpm培養一晩，萃取質體，並確認了鹼基序列。

(10)編碼嗜熱短桿菌用之附加的胜肽標記的木聚糖酶及酯酶的基因表現用質體的構建及轉形把編碼源於枯草桿菌(Bacillus subtilis)之木聚糖酶(XynA、序列編號159)的人工合成DNA(序列編號160)插入至於pUC19修飾質體pUCFa(FASMAC)的EcoRV辨識部位，並獲得質體5。又，把編碼源於枯草桿菌的酯酶(EstA、序列編號185)的人工合成DNA(序列編號186)插入至pUC19修飾質體pUCFa(FASMAC)的EcoRV辨識部位並獲得質體6。以使得檢測/純化用的HA標記(序列編號161)及6×His標記(序列編號162)被附加至表現蛋白質的C末端的方式，把編碼HA標記、6×His標記及終止密碼子的人工合成DNA(序列編號163)，插入至pNCMO2(Takara bio)的NcoI-HindIII位，製作嗜熱短桿菌表現用質體7。以下述程序構建質體(圖9、10)，該質體是用以使在N或C末端或者N、C兩末端附加有PX12-20標記而成的木聚糖酶或者酯酶在嗜熱短桿菌中表現。首先，為了在木聚糖酶或者酯酶的N或C末端或者N、C兩末端附加各種標記，實施依據表3所示之模板質體、正向引子、反向引子的組合的PCR。在各引子的5’末端附加有與質體7相同的序列。又，正向引子是設計成接著信號胜肽附加2個胺基酸殘基AD。PCR是使用KOD-PLUS-Ver.2(東洋紡)，調製50 μl反應液使之成為2 pg/μl 模板質體、0.3 μM 正向引子、0.3 μM 反向引子、0.2 mM dNTPs、1×KOD-Plus-Ver.2用緩衝液、1.5 mM MgSO₄ 、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2，在94℃、5分鐘加熱之後，把98℃、10秒鐘，60℃、 30秒鐘，68℃、40秒鐘的加熱處理進行25循環，最後在68℃下加熱5分鐘。所獲得之擴增片段是利用QIAquick PCR 純化套組予以純化。質體7是以NcoI、NdeI消化後，藉由使用了0.8% SeaKem GTG 瓊脂糖的電泳進行分離，並使用QIAquick 凝膠萃取套組自凝膠萃取。把約50 ng份的萃取出的質體7與純化PCR產物2 μl混合並將液量調整為5 μl後，與Gene Art 無縫PLUS 選殖及組裝套組隨附的2×酶混合物5 μl混合，在室溫下靜置30分鐘，其後在冰上靜置5分鐘。將反應液5 μl與勝任細胞DH10B T1 SA混合並在冰上靜置30分鐘後，在37℃下加溫10分鐘，在冰上靜置2分鐘後，將SOC添加250 μl，以37℃、200 rpm振盪1小時。其後，把振盪物50μl塗布於包含100 mg/l安比西林的2×YT瓊脂培養基後，在37℃下靜置培養一晩，獲得了轉形群落。將群落移植至包含100 mg/l安比西林的2×YT液體培養基，以37℃、200 rpm振盪培養一晩後，萃取質體，確認鹼基序列後，使用於嗜熱短桿菌的轉形。將橋石短芽孢桿菌SP3 勝任細胞靜置在37℃加熱塊30秒鐘來急速解凍，離心(12,000 rpm、室溫、1分鐘)後除去上清液後，將上述質體溶液1 μl與50 μl 溶液 A混合而得者全量添加並藉由渦漩震盪將勝任細胞的片狀沉澱物完全地懸浮，靜置5分鐘。添加150 μl的溶液 B，利用渦漩震盪混和10秒鐘，離心(5,000 rpm、室溫、5分鐘)後除去上清液，再度離心(5,000 rpm、室溫、30秒鐘)並完全地除去上清液。對其添加1 ml MT培養基，使用微量吸管來完全地懸浮後，以37 ℃、200 rpm振盪培養1小時。培養液是平板接種於MTNm平板，在37 ℃下靜置培養1晩，獲得了轉形嗜熱短桿菌。

(11) 嗜熱短桿菌的蛋白質表現培養將轉形嗜熱短桿菌的單一群落塗抹至MTNm平板，30℃靜置一晩進行培養。利用1μl滅菌一次性接種環由培養後的平板培養基刮取菌體，接種至裝入在滅菌聚苯乙烯製14 ml管中的3 ml TMNm培養基，以30℃、200rpm進行了一晩前培養。當表現hGH時，將前培養液200μl接種於3 ml TMNm培養基並以30℃、200rpm進行振盪培養，在48小時後取樣包含菌體的培養液。當表現木聚糖酶及酯酶時，將前培養液200μl接種於3 ml TMNm培養基並以30℃、120rpm進行振盪培養，48小時後取樣包含菌體的培養液。培養液每100 μl分為小份，藉由離心(20,000×g、4℃、10分鐘)分為培養上清液與菌體，將培養上清液50μl與菌體全量保存在-80 ℃。

(12)自嗜熱短桿菌萃取蛋白質對經凍結保存之培養上清液50μl，添加2×樣本緩衝液(EZ Apply，ATTO製)50μl，以渦漩震盪混合器來攪拌後，在沸水中加熱10分鐘進行了SDS化。關於菌體，是添加1×樣本緩衝液(將EZ Apply稀釋2倍而得者)100μl，以同樣的步驟進行了SDS化。

(13)編碼畢赤氏酵母用之附加胜肽標記的hGH的基因表現用質體的構建及轉形將人工合成DNA(序列編號169)插入至pJ902-15(Invivogen)的BsaI-BsaI位，作成畢赤氏酵母表現用質體8；其中，該人工合成DNA(序列編號169)是在Kozak序列的下游配置有源於啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae)之因子α的細胞外分泌信號胜肽(AFSP，序列編號168)編碼序列及終止密碼子序列。以下述程序來構建質體(圖11)，該質體是用以使在N或C末端或者N、C兩末端附加有各種標記的hGH在畢赤氏酵母表現。首先，為了在hGH的N或C末端或者N、C兩末端附加標記，實施依據表3所示之模板質體、正向引子、反向引子的組合的PCR。在各引子的5’末端附加有與質體8相同的序列。PCR是使用KOD-PLUS-Ver.2(東洋紡)，調製50 μl反應液使之成為2 pg/μl 模板質體、0.3 μM 正向引子、0.3 μM 反向引子、0.2 mM dNTPs、1×KOD-Plus-Ver.2用緩衝液、1.5 mM MgSO₄ 、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2，在94℃、5分鐘加熱之後，進行98℃、10秒鐘，60℃、 30秒鐘，68℃、40秒鐘的加熱處理25循環，最後在68℃下加熱5分鐘。所獲得之擴增片段是以QIAquick PCR 純化套組進行純化。質體8是以XhoI、NotI消化後，藉由使用了0.8% SeaKem GTG 瓊脂糖的電泳進行分離，並使用QIAquick 凝膠萃取套組從凝膠進行了萃取。將約50 ng份之萃取出的質體8與純化PCR產物2 μl予以混合並將液量調整為5 μl後，與Gene Art 無縫PLUS 選殖及組裝套組隨附的2×酶混合物 5 μl混合，在室溫下靜置30分鐘，其後於冰上靜置5分鐘。將反應液5 μl與勝任細胞DH10B T1 SA混合並在冰上靜置30分鐘後，在37℃下加溫10分鐘，在冰上靜置2分鐘後，將SOC添加250 μl，並以37℃、200 rpm進行了振盪1小時。其後，將振盪物的50μl塗布至包含100 mg/l安比西林的2×YT瓊脂培養基後，在37℃下靜置培養一晩，獲得了轉形群落。將群落移植至包含100 mg/l安比西林的2×YT液體培養基，以37℃、200 rpm振盪培養一晩後，萃取質體，確認了鹼基序列。質體是藉由SacI切斷而直鏈化，藉由酚/氯仿萃取萃取來去除蛋白質，乙醇沈澱後，進行乾燥並溶解於TE緩衝液，使用於畢赤氏酵母的轉形。將畢赤氏酵母(Pichia pastoris PPS-9010)以YPD培養基，以30℃、200rpm振盪培養一晩。添加上述培養液至裝入有100 ml之YPD 培養基的錐形瓶使得OD₆₀₀ 成為0.2-0.4，以30℃、200 rpm振盪培養直至OD₆₀₀ 成為0.8-1.0。以500 x g、室溫離心5 分鐘，捨去上清液獲得了細胞片狀沉澱物。將經冰冷卻之18 ml的BEDS溶液(10 mM 二羥乙甘胺酸、3% (v/v)乙二醇、5% (v/v)二甲亞碸、1 M山梨醇)與經冰冷卻之2 ml的1 M二硫蘇糖醇添加至片狀沉澱物，懸浮後，以30℃、100 rpm培育5分鐘。進一步，以500 x g、室溫離心5 分鐘，捨去上清液獲得了細胞片狀沉澱物。將2 ml的BEDS溶液添加至片狀沉澱物，懸浮後，各分注40 μl，作成了勝任細胞。以-80℃的超低溫冷凍器保管直至使用。把經直鏈化之約100 ng份的上述質體溶液，在冰上與經融解的勝任細胞混合，並添加至電穿孔用光析管(cuvette)(電極間距離0.2 cm，BIO-RAD)並在冰上靜置2分鐘。將光析管設置在電穿孔用裝置(MicroPulser，BIO-RAD)，以已編程好的條件(Pic、10μF、600Ω、2.0 kV、1脈衝(pulse))來實施了電穿孔。之後立刻添加包含1 M 山梨醇的YPD培養基1 ml，並將全量移至微量管，以30℃、200 rpm振盪了1小時。振盪後，將500μl塗布至包含1 M 山梨醇、2% 細菌用瓊脂及100 mg/L 博來黴素(Zeocine)(invivogen)的YPD平板培養基後，以30℃靜置培養2-3日，獲得了轉形群落。

(14)畢赤氏酵母的蛋白質表現培養把轉形後的單一群落塗布至包含1 M 山梨醇、2% 細菌用瓊脂及100 mg/L 博來黴素的YPD平板培養基，進行了30℃、24小時靜置培養。其次，利用1μl滅菌一次性接種環由培養後的平板培養基刮取菌體，並接種至已添加於滅菌14ml管之3 ml BMGY培養基(1% 細菌用酵母萃、2% 細菌用蛋白腖(Bacto peptone)、0.1 M 磷酸鉀緩衝液 (pH6.0)、1.34%有硫酸銨無胺基酸之酵母氮源(Yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids)、0.4 mg/L 生物素、1%甘油)，以30℃、200rpm進行振盪培養直至OD₆₀₀ 成為2-6。當再懸浮於3ml培養基時，把OD₆₀₀ 成為1所需量的培養物分別取至已滅菌之1.5ml微量離心管後，進行3,000×g、20℃、5分鐘離心，除去上清液後，把沉澱懸浮於1ml BMMY培養基(1% 細菌用酵母萃、2% 細菌用蛋白腖、0.1 M 磷酸鉀緩衝液 (pH6.0)、1.34% 有硫酸銨無胺基酸之酵母氮源、0.4 mg/L 生物素、0.5% 甲醇)，並將全量與已經準備好在預先滅菌14 ml管中的2 ml的BMMY培養基混合，進行30℃、200rpm、72小時振盪培養。培養結束後，把培養液100 μl分別取至微量管，15,000×g、4℃、10分鐘離心後，把上清液50 μl分別取至新的微量管並獲得培養上清液，除去殘留的上清液，獲得了菌體片狀沉澱物。培養上清液、菌體片狀沉澱物是在液態氮中凍結後，在超低溫冷凍器中以-80℃進行了保存。

(15)畢赤氏酵母的蛋白質萃取相對於經凍結保存的培養上清液50μl，添加2×樣本緩衝液(EZ Apply、ATTO製)50μl並以渦漩震盪混合器攪拌後，在沸水中加熱10分鐘進行SDS化。菌體片狀沉澱物是懸浮於經冰冷卻之懸浮緩衝液(1X PBS (BIO-RAD)、1XcOmplete-無EDTA(EDTA free)(Roche)、-EDTA(Roche))100μl，把全量添加至裝入有80 μl 玻璃珠(直徑0.5 mm、經酸處理後、Sigma)的微量管，使用TissueLyzerII(QIAGEN)，進行了30 Hz、4分鐘振盪而破碎。把破碎液分別取30μl，添加2×樣本緩衝液(EZ Apply，ATTO製)30μl，以渦漩震盪混合器來攪拌後，在沸水中加熱10分鐘進行了SDS化。

(16) 西方墨點分析在蛋白質定量時的標準物質來說使用了hGH及IFNβ的標準品。又，定量木聚糖酶之際，是使用附加有HA序列的Stx2eB作為標準品。將其以樣本緩衝液(EZ Apply，ATTO製)重複稀釋2倍藉此作成稀釋系列，使用該等來作為標準。蛋白質的電泳(SDS-PAGE)是使用了電泳槽(Criterion cell，BIO RAD)及Criterion TGX-凝膠(BIO RAD)。將電泳緩衝液(Tris/甘胺酸/SDS 緩衝液，BIO RAD)裝入電泳槽，將經SDS化之樣本上樣4 μl至孔(well)，以200 V恒電壓電泳40分鐘。電泳後的凝膠是使用Trans Blot 轉錄包(BIO RAD)，利用Trans Blot Turbo(BIO RAD)進行了印漬。印漬後的膜是浸於阻斷液(blocking solution)(TBS系，pH7.2，Nacalai Tesque)，在室溫下振盪1小時或者在4℃下靜置16小時後，在TBS-T(137 mM 氯化鈉、2.68 mM 氯化鉀、1% 聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯(polyoxyethylene sorbitan monolaurate)、25 mM Tris-HCl、pH 7.4)中進行室溫、5分鐘的振盪3次進行了洗淨。在hGH的檢測來說，以TBS-T把抗血清兔-單株抗生長激素抗體(Rabbit-monoclonal Anti-Growth Hormone antibody)[EPR11047(B)](abcam)稀釋3,000倍來使用。在IFNβ的檢測來說，以TBS-T把抗血清小鼠-單株抗人類IFNβ抗體(Mouse-monoclonal Anti-HumanIFNβantibody)(R&D Systems)稀釋1,000倍來使用。又，在木聚糖酶及酯酶的檢測來說，以TBS-T把抗血清大鼠-單株抗HA抗體(Rat-monoclonal Anti-HA antibody)(Roche)稀釋6,000倍來使用。把膜浸於抗體稀釋液中，藉由在室溫下振盪1小時而進行抗原抗體反應，在TBS-T中進行室溫、5分鐘的振盪3次而洗淨。在二次抗体來說，hGH的檢測的情況是使用了經以TBS-T稀釋2,000倍而得的抗兔 IgG、AP-連結的抗體(AP-linked Antibody)(Cell Signaling TECHNOLOGY)，IFNβ的檢測的情況是使用了抗小鼠IgG、AP-連結的抗體(Cell Signaling TECHNOLOGY)。又，木聚糖酶及酯酶的檢測的情況是使用了經以TBS-T稀釋6,000倍而得的抗大鼠IgG、AP-連結的抗體(EDM Millipore Corp.)。將膜浸在在二次抗體稀釋液中，藉由在室溫下振盪1小時而進行抗原抗體反應，並在TBS-T中進行室溫、5分鐘的振盪3次而洗淨。由鹼性磷酸酶進行的顯色反應，是藉由下述進行：將膜浸在顯色液(0.1 M 氯化鈉、5 mM 氯化鎂、0.33 mg/ml硝基藍四唑(nitro blue tetrazolium)、0.33 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸、0.1 M Tris-HCl，pH9.5)中，在室溫下進行15分鐘振盪，並將膜以蒸餾水洗淨之後，在常溫下乾燥。已顯色的膜是藉由掃描儀(PM-A900，Epson)以解像度600 dpi來進行圖像化，並使用圖像分析軟體(CS Analyzer ver. 3.0，ATTO)，進行了hGH或者IFNβ蛋白質的定量。

(17)確認在昆蟲細胞中之蛋白質表現量的提升效果使用了源於維多利亞多管發光水母(Aequorea victoria)的綠色螢光蛋白(GFP、胺基酸序列：序列編號175、DNA鹼基序列：序列編號176)作為附加胜肽標記的蛋白質。以在GFP蛋白質的N末端側配置各種胜肽標記，且在C末端側配置Flag標記般的正向引子(pENTR1A-1(序列編號177)・・・無標記用、pENTR1A-2(序列編號178)・・・PG12標記用、pENTR1A-3(序列編號179)・・・PX12-20標記用、pENTR1A-4(序列編號180)・・・PX12-20v7標記用)，與反向引子(pENTR1A-Flag-GFP(序列編號181))的組件來進行PCR反應，調整了選殖用DNA片段。把經調整之DNA片段選殖到pENTR 1A(ThermoFisher Scientific)來構建了質體，該質體帶有編碼各種胜肽標記-GFP-Flag標記的DNA片段。以該質體為基礎並使用LR反應來將編碼各種胜肽標記-GFP-Flag標記的DNA往供予者載體(donor vector)，即，pFastbac(ThermoFisher Scientific)插入。把該等各種供予者載體導入大腸菌DH10bac(ThermoFisher Scientific)來使之轉位至穿梭質體載體(bacmid vector)的lac Z區域而作成了重組穿梭質體(recombinant bacmid)。把包含編碼各種胜肽標記-GFP-Flag標記之DNA的重組穿梭質體DNA導入源於家蠶的BmN細胞來作成了各種桿狀病毒。獲得之各種桿狀病毒溶液添加至BmN細胞用培養基並再度獲得桿狀病毒溶液，將前述作業重複3次，調整出桿狀病毒濃度充分地升高的各種桿狀病毒溶液。把該桿狀病毒溶液200 μl添加至包含5.0×10⁵ 之BmN細胞之1.8 ml的IPL41-10%FCS培養基，在36小時後進行移液混合(pipetting)來剝下細胞，回收培養液並計量了細胞數之後，利用離心操作來分離為培養上清液與細胞組分(cellular fraction)。回收的細胞組分是懸浮於200 μl的20 mM Tris-HCl(pH7.4)、20 mM NaCl、3 mM MgCl₂ 溶液並在超音波處理後利用離心操作來回收了上清液。經回收的細胞破碎上清液液是添加至培養上清液來作為分析用樣本。把包含各種胜肽標記-GFP-Flag標記之分析用樣本9 μl份注入SDS-PAGE，在1次抗體使用抗Flag抗體(Sigma Aldrich)，在2次抗體使用抗小鼠 IgG HRP標識的抗體(GE healthcare)，並使用ImmunoStar Zeta(和光純藥)而檢測出各種胜肽標記-GFP-Flag標記蛋白質。把各種胜肽標記-GFP-Flag標記蛋白質的條帶強度除以細胞數而得的數値予以比較，並令為了各種胜肽標記之蛋白質表現量提升效果。

(18)確認在哺乳類細胞中之蛋白質表現量的提升效果使用了源於維多利亞多管發光水母的綠色螢光蛋白(GFP、胺基酸序列：序列編號175、DNA鹼基序列：序列編號176)作為附加胜肽標記的蛋白質。以在GFP蛋白質的N末端側配置各種胜肽標記，且在C末端側配置Flag標記般的正向引子(pENTR1A-1(序列編號177)・・・無標記用、pENTR1A-2(序列編號178)・・・PG12標記用、pENTR1A-3(序列編號179)・・・PX12-20標記用)，與反向引子(pENTR1A-Flag-GFP(序列編號181))的組件來進行PCR反應，調整選殖用DNA片段。把經調整之DNA片段選殖到pENTR 1A(ThermoFisher Scientific)來構建質體，該質體帶有編碼各種胜肽標記-GFP-Flag標記的DNA片段。以該質體為基礎並使用LR反應來將編碼各種胜肽標記-GFP-Flag標記的DNA往pAd/CMV/v5-DEST腺病毒載體(ThermoFisher Scientific)插入。把該等各種載體導入HEK293A細胞來作成各種腺病毒溶液。將所獲得之各種腺病毒溶液接種到HEK293A細胞來再度獲得腺病毒溶液，將前述作業重複4次，調整出腺病毒濃度充分地升高的各種腺病毒溶液。把該腺病毒溶液200 μl對2.5×10⁵ 的A549細胞添加至1.2 ml的DMEM高葡萄糖(high glucose)-10%FCS培養基中，在84小時後進行胰蛋白酶處理(37℃、10分鐘)來剝下細胞，回收培養液並計量了細胞數之後，利用離心操作來分離為培養上清液與細胞組分。回收的細胞組分是懸浮在200 μl的20 mM Tris-HCl(pH7.4)、20 mM NaCl、3 mM MgCl₂ 溶液並在超音波處理之後利用離心操作來回收上清液，並添加至培養上清液。以激發波長395 nm、測定波長509 nm來測定螢光強度。把各種胜肽標記-GFP-Flag標記蛋白質的螢光強度除以細胞數而得的數値予以比較並令為了各種胜肽標記的蛋白質表現量提升效果。

＜結果＞ (1)由附加各種胜肽標記所致之在酵母中之蛋白質的表現量提升在規定的條件下培養作出的基因重組酵母，利用規定的條件來萃取hGH或IFNβ，藉由西方墨點分析來測定了該等目標蛋白質的表現量。其結果，由圖4，在PG12的序列(序列編號22)中，把3個S變更為K而成的PX12-20(序列編號25)附加在IFNβ之後時，蛋白質的表現量較附加有PG12的IFNβ增加。又，PX12-20標記的效果，是附加在C末尾時者大於附加在N末尾者，且附加在N末尾與C末尾雙方時者是更大。又，在圖5來說，對於PG12及PG17的序列進行各種各樣的改變來製作胜肽標記，調查對於hGH之表現的影響時，了解到：取代PG12的S或G的胺基酸在K以外，L、N、Q或者R亦有高表現效果。又，在改變了胺基酸序列的標記，附加了蛋白酶辨識序列時亦是維持著高表現效果。

(2)由附加各種胜肽標記所致之在大腸菌中蛋白質的表現量提升以規定的條件來培養作出的基因重組大腸菌，利用規定的條件萃取hGH或者IFNβ，並藉由西方墨點分析測定了該等目標蛋白質的表現量。其結果，由圖6，分別把PX12-20(序列編號25)及PX12-20v7(序列編號38)附加至IFNβ時，蛋白質的表現量較附加有PG12的IFNβ增加。又，PX12-20及PX12-20v7的效果，是附加在N末尾與C末尾雙方時者比起僅附加在N末尾來得更大。又，由圖7，PX12-20的效果對於hGH亦會發揮。

(3)由附加各種胜肽標記所致之在嗜熱短桿菌中之蛋白質的表現量提升以規定的條件來培養作出的基因重組嗜熱短桿菌，並利用規定的條件來萃取hGH，藉由西方墨點分析來測定了該等目標蛋白質的表現量。其結果，由圖8，將PX12-20(序列編號25)、PX12-38(序列編號52)及PX12-20v7(序列編號38)分別附加到hGH時，hGH的表現量增加。又，利用規定的條件來培養作出的基因重組嗜熱短桿菌，以規定的來萃取木聚糖酶，並藉由西方墨點分析來測定了該等目標蛋白質的表現量。其結果，由圖12，把PX12-20(序列編號25)附加到C末尾或者N末尾與C末尾雙方時，木聚糖酶的表現量增加。進一步，利用規定的條件來培養作出的基因重組嗜熱短桿菌，以規定的條件來萃取酯酶，並藉由西方墨點分析測定了該等目標蛋白質的表現量。其結果，由圖13，在把PX12-20(序列編號25)附加到N末尾時，酯酶的表現量增加。

(4)由附加各種胜肽標記所致之在畢赤氏酵母中蛋白質的表現提升利用規定的條件來培養作出的基因重組畢赤氏酵母，以規定的條件來萃取hGH，並藉由西方墨點分析來測定了該等目標蛋白質的表現量。其結果，由圖14，將PX12-20(序列編號25)及PX12-20v7(序列編號38)分別附加在hGH時，hGH的表現量增加。

(5)由附加各種胜肽標記所致之在昆蟲細胞及哺乳動物細胞中蛋白質的表現提升利用規定的條件來培養作出的基因重組昆蟲細胞及哺乳動物細胞，並以規定的條件來測定了GFP的螢光。其結果，如圖15所示，在昆蟲細胞使附加有各種胜肽標記的GFP表現時，附加有PX12-20標記及PX12-20v7標記的蛋白質比起無附標記時，表現量被增強。其結果，如圖16所示，在哺乳類細胞使附加有各種胜肽標記的GFP表現時，附加有PX12-20標記的蛋白質比起無附標記時，表現量被增強。產業上之可利用性

本發明胜肽標記在基因工程及蛋白質工程等領域是有用的，附加有本發明胜肽標記的蛋白質在醫療、研究、食品、畜產等領域是有用的。

圖1顯示已導入至酵母菌屬(Saccharomyces)酵母之基因構建(hGH 或者IFNβ表現用)之程序圖。圖2顯示已導入至大腸菌之基因構建(hGH 或者IFNβ表現用)之程序圖。圖3顯示已導入至顯示嗜熱短桿菌之基因構建(hGH表現用)之程序圖。圖4顯示已附加各標記之IFNβ在酵母菌屬酵母中之表現量的圖。顯示把無標記之IFNβ的表現量令為1時的相對值。圖5顯示已附加各標記之hGH在酵母菌屬酵母中之表現量的圖。顯示把無標記之hGH的表現量令為1時的相對值。圖6顯示已附加各標記之IFNβ在大腸菌中之表現量的圖。顯示把無標記之IFNβ的表現量令為1時的相對值。圖7顯示已附加各標記之hGH在大腸菌中之表現量的圖。顯示把無標記之hGH的表現量令為1時的相對值。圖8顯示已附加各標記之hGH在嗜熱短桿菌中之表現量的圖。顯示把無標記之hGH的表現量令為1時的相對值。圖9顯示已導入至嗜熱短桿菌之基因構建(木聚糖酶表現用)之程序圖。圖10顯示已導入至嗜熱短桿菌之基因構建(酯酶表現用)之程序圖。圖11顯示已導入至畢赤氏(Pichia)酵母之基因構建(hGH表現用)之程序圖。圖12顯示已附加各標記之木聚糖酶在嗜熱短桿菌中之表現量的圖。顯示把無標記之木聚糖酶的表現量令為1時的相對值。圖13顯示已附加各標記之酯酶在嗜熱短桿菌中之表現量的圖。顯示把無標記之酯酶的表現量令為1時的相對值。圖14顯示已附加各標記之hGH在畢赤氏酵母中之表現量的圖。顯示把無標記之hGH的表現量令為1時的相對值。圖15顯示已附加各標記之GFP在昆蟲細胞中之表現量的圖。顯示把無標記之GFP的表現量令為1時的相對值。圖16顯示已附加各標記之GFP在哺乳動物細胞中之表現量的圖。顯示把無標記之GFP之表現量令為1時的相對值。

SEQUENCE LISTING ＜110＞出光興產股份有限公司＜120＞胜肽標記及含有其之附加標記的蛋白質＜130＞ OP-16467 ＜150＞ JP2015-256396 ＜151＞ 2015-12-28 ＜150＞ JP2016-153265 ＜151＞ 2016-08-03 ＜160＞ 186 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 191 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 1 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Ile Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 ＜210＞ 2 ＜211＞ 165 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 2 Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln 35 40 45 Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Arg Asn 165 ＜210＞ 3 ＜211＞ 573 ＜212＞ DNA ＜213＞智人＜400＞ 3 ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60 caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120 aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180 ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240 ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300 ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360 atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggatcgggca gatcttcaag 420 cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480 gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540 cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttc 573 ＜210＞ 4 ＜211＞ 495 ＜212＞ DNA ＜213＞智人＜400＞ 4 agctacaact tgcttggatt cctacaaaga agcagcaatt ttcagtctca gaagctcctg 60 tggcaattga atgggaggct tgaatactgc ctcaaggaca ggatgaactt tgacatccct 120 gaggagatta agcagctgca gcagttccag aaggaggacg ccgcattgac catctatgag 180 atgctccaga acatctttgc tattttcaga caagattcat ctagcactgg ctggaatgag 240 actattgttg agaacctcct ggctaatgtc tatcatcaga taaaccatct gaagacagtc 300 ctggaagaaa aactggagaa agaagatttc accaggggaa aactcatgag cagtctgcac 360 ctgaaaagat attatgggag gattctgcat tacctgaagg ccaaggagta cagtcactgt 420 gcctggacca tagtcagagt ggaaatccta aggaactttt acttcattaa cagacttaca 480 ggttacctcc gaaac 495 ＜210＞ 5 ＜211＞ 19 ＜212＞ PRT ＜213＞啤酒釀母菌＜400＞ 5 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ile Ser Ala ＜210＞ 6 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ HN tag ＜400＞ 6 His Asn His Asn His Asn His Asn His Asn His Asn 1 5 10 ＜210＞ 7 ＜211＞ 137 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ SUC2SP-6xHN-選殖位＜400＞ 7 atgcttttgc aagccttcct tttcctcttg gctggtttcg ccgccaagat ttctgcccat 60 aatcataatc ataatcataa tcataatcat aatggcggcc gcgtcgacgg ccagggtggc 120 cctcgagggc gcgccaa 137 ＜210＞ 8 ＜211＞ 41 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-hGHF ＜400＞ 8 ataatcataa tggcggccgc ttcccaacca ttcccttatc c 41 ＜210＞ 9 ＜211＞ 47 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ hGHR-stopCYCt ＜400＞ 9 gatgcggccc tctagattgg cgcgcctcag aagccacagc 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ggtttttttt taggttttct 60 gtttcggagg taacctgtaa 80 ＜210＞ 83 ＜211＞ 43 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ P22SP-hGHF ＜400＞ 83 agtaccaagt tccgcattcg ctttcccaac cattccctta tcc 43 ＜210＞ 84 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ hGHR-stopBrevit ＜400＞ 84 catcctgtta agctttcaga agccacagct gccctc 36 ＜210＞ 85 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ P22SP-PX12-20-hGHF ＜400＞ 85 agttccgcat tcgctagaaa acctggtaaa ggtcctggta aacctagatc cttcccaacc 60 attcccttat cc 72 ＜210＞ 86 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ hGHR-PX12-20-stopBrevit ＜400＞ 86 catcctgtta agctttcagg atctaggttt accaggacct ttaccaggtt ttctgaagcc 60 acagctgccc tc 72 ＜210＞ 87 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ P22SP-PX12-38-hGHF ＜400＞ 87 agttccgcat tcgctagaag acctggtaga ggtcctggta gacctagatc cttcccaacc 60 attcccttat cc 72 ＜210＞ 88 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ hGHR-PX12-38-stopBrevit ＜400＞ 88 catcctgtta agctttcagg atctaggtct accaggacct ctaccaggtc ttctgaagcc 60 acagctgccc tc 72 ＜210＞ 89 ＜211＞ 72 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 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agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 96 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-43 ＜400＞ 96 Arg Lys Pro Arg Lys Arg Pro Arg Lys Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 97 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-43-hGHF ＜400＞ 97 ataatcataa tggcggccgc agaaaaccta gaaaaagacc tagaaaacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 98 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-44 ＜400＞ 98 Lys Lys Pro Lys Lys Lys Pro Lys Lys Pro Lys Lys 1 5 10 ＜210＞ 99 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-44-hGHF ＜400＞ 99 ataatcataa tggcggccgc aaaaaaccta aaaaaaaacc taaaaaacct aaaaaattcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 100 ＜211＞ 17 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX17-20v7 ＜400＞ 100 Arg Lys Pro Lys Lys Lys Pro Lys Lys Pro Arg Lys Pro Lys Lys Arg 1 5 10 15 Ser ＜210＞ 101 ＜211＞ 92 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX17-20v7-hGHF ＜400＞ 101 ataatcataa tggcggccgc agaaaaccta aaaaaaaacc taaaaaacct agaaaaccta 60 aaaaaagatc cttcccaacc attcccttat cc 92 ＜210＞ 102 ＜211＞ 17 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX17-20v8 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＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-20v10 ＜400＞ 114 Arg Lys Pro Lys Gly Lys Pro Lys Lys Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 115 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-20v10-hGHF ＜400＞ 115 ataatcataa tggcggccgc agaaaaccta aaggtaaacc taaaaaacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 116 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-20v12 ＜400＞ 116 Arg Lys Pro Gly Lys Lys Pro Gly Lys Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 117 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-20v12-hGHF ＜400＞ 117 ataatcataa tggcggccgc agaaaacctg gtaaaaaacc tggtaaacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 118 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-20v13 ＜400＞ 118 Arg Lys Pro Gly Gly Lys Pro Gly Lys Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 119 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-20v13-hGHF ＜400＞ 119 ataatcataa tggcggccgc agaaaacctg gtggtaaacc tggtaaacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 120 ＜211＞ 10 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PK10v2 ＜400＞ 120 Arg Lys Pro Lys Lys Lys Pro Arg Lys Pro 1 5 10 ＜210＞ 121 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＜400＞ 128 Pro Arg Lys Pro Arg Lys Pro Arg Lys 1 5 ＜210＞ 129 ＜211＞ 68 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PK09v3-hGHF ＜400＞ 129 ataatcataa tggcggccgc cctagaaaac ctagaaaacc tagaaaattc ccaaccattc 60 ccttatcc 68 ＜210＞ 130 ＜211＞ 9 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PK09v4 ＜400＞ 130 Pro Lys Arg Pro Lys Arg Pro Lys Arg 1 5 ＜210＞ 131 ＜211＞ 68 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PK09v4-hGHF ＜400＞ 131 ataatcataa tggcggccgc cctaaaagac ctaaaagacc taaaagattc ccaaccattc 60 ccttatcc 68 ＜210＞ 132 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-49 ＜400＞ 132 Arg Lys Pro Lys Leu Lys Pro Lys Lys Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 133 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-49-hGHF ＜400＞ 133 ataatcataa tggcggccgc agaaaaccta aattgaaacc taaaaaacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 134 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-51 ＜400＞ 134 Arg Arg Pro Leu Arg Leu Pro Leu Arg Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 135 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-51-hGHF ＜400＞ 135 ataatcataa tggcggccgc agaagacctt tgagattgcc tttgagacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 136 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-52 ＜400＞ 136 Arg Gln Pro Lys Gln Lys Pro Lys Gln Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 137 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-52-hGHF ＜400＞ 137 ataatcataa tggcggccgc agacaaccta aacaaaaacc taaacaacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 138 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-54 ＜400＞ 138 Arg Gln Pro Lys Lys Lys Pro Lys Gln Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 139 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-54-hGHF ＜400＞ 139 ataatcataa tggcggccgc agacaaccta aaaaaaaacc taaacaacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 140 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-61 ＜400＞ 140 Arg His Pro Lys His Lys Pro Lys His Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 141 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHN-PX12-61-hGHF ＜400＞ 141 ataatcataa tggcggccgc agacatccta aacataaacc taaacatcct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 142 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-62 ＜400＞ 142 Arg Asn Pro Lys Asn Lys Pro Lys Asn Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 143 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-40v2 ＜400＞ 143 Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 144 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 6XHN-PX12-40v2-hGHF ＜400＞ 144 ataatcataa tggcggccgc agaagaccta gaagacctag aagacctaga agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 145 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-41v2 ＜400＞ 145 Arg Arg Pro Lys Arg Pro Lys Arg Pro Lys Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 146 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 6XHN-PX12-41v2-hGHF ＜400＞ 146 ataatcataa tggcggccgc agaagaccta aaagacctaa aagacctaaa agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 147 ＜211＞ 11 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-45v2 ＜400＞ 147 Arg Lys Pro Lys Lys Pro Lys Lys Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 148 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 6XHN-PX12-45v2-hGHF ＜400＞ 148 ataatcataa tggcggccgc agaaaaccta aaaaacctaa aaaacctaga tccttcccaa 60 ccattccctt atcc 74 ＜210＞ 149 ＜211＞ 13 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-45v3 ＜400＞ 149 Arg Lys Pro Lys Lys Pro Lys Lys Pro Lys Lys Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 150 ＜211＞ 80 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 6XHN-PX12-45v3-hGHF ＜400＞ 150 ataatcataa tggcggccgc agaaaaccta aaaaacctaa aaaacctaaa aaaagatcct 60 tcccaaccat tcccttatcc 80 ＜210＞ 151 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-75 ＜400＞ 151 Arg Lys Pro Gly Ser Lys Pro Gly Lys Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 152 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 6XHN-PX12-75-hGHF ＜400＞ 152 ataatcataa tggcggccgc agaaaacctg gttctaaacc tggtaaacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 153 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-76 ＜400＞ 153 Arg Lys Pro Gln Gln Lys Pro Gln Lys Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 154 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 6XHN-PX12-76-hGHF ＜400＞ 154 ataatcataa tggcggccgc agaaaacctc aacaaaaacc tcaaaaacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 155 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-77 ＜400＞ 155 Arg Arg Pro Gly Ser Arg Pro Gly Arg Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 156 ＜211＞ 77 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 6XHN-PX12-77-hGHF ＜400＞ 156 ataatcataa tggcggccgc agaagacctg gttctagacc tggtagacct agatccttcc 60 caaccattcc cttatcc 77 ＜210＞ 157 ＜211＞ 11 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ PX12-78 ＜400＞ 157 Arg Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Arg Ser 1 5 10 ＜210＞ 158 ＜211＞ 74 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 6XHN-PX12-78-hGHF ＜400＞ 158 ataatcataa tggcggccgc agaaaaccta aacctaaacc taaacctaga tccttcccaa 60 ccattccctt atcc 74 ＜210＞ 159 ＜211＞ 185 ＜212＞ PRT ＜213＞枯草桿菌＜400＞ 159 Ala Ser Pro Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val 1 5 10 15 Asn Ala Val Asn Gly Pro Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn 20 25 30 Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Ser 35 40 45 Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly 50 55 60 Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr 65 70 75 80 Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly 85 90 95 Thr Val Lys Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg 100 105 110 Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Glu Lys Thr Thr Phe Thr Gln Tyr 115 120 125 Trp Ser Val Arg Gln Thr Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Lys Ile 130 135 140 Thr Phe Ser Asn His Val Arg Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu 145 150 155 160 Gly Ser Ile Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Val Trp 180 185 ＜210＞ 160 ＜211＞ 555 ＜212＞ DNA ＜213＞枯草桿菌＜400＞ 160 gctagcccag actactggca aaattggact gatggcggcg gaacagtaaa cgctgtcaat 60 gggcctggag ggaattacag tgttaattgg tctaataccg gaaatttcgt tgttggtaaa 120 ggttggacta caggttcgcc atctaggaca ataaactata atgccggagt ttgggcgccg 180 aatggcaatg gatatttggc tttatatggt tggacgagat cacctctcat agaatattat 240 gtagtggatt catggggtac ttatagacct actggaacgt ataaaggtac tgtaaaaagt 300 gatggcggca catatgacat atatacaact acacgttata atgcaccttc cattgatggc 360 gaaaaaacta ctttcacgca gtactggagt gttcgccaga cgaagagacc aactggaagc 420 aacgctaaaa tcactttcag caatcatgtt agagcatgga agagtcatgg aatgaatctg 480 ggtagtattt ggtcttatca agtcttagcg acagagggat atcaaagtag tggaagttct 540 aacgtaacag tgtgg 555 ＜210＞ 161 ＜211＞ 9 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ HA ＜400＞ 161 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 ＜210＞ 162 ＜211＞ 6 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 6XHis ＜400＞ 162 His His His His His His 1 5 ＜210＞ 163 ＜211＞ 56 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 HA-6XHis ＜400＞ 163 ctttcgctta cccatatgat gtaccagatt acgctcatca tcatcatcat cattga 56 ＜210＞ 164 ＜211＞ 54 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 mCWSP-AD-BsxynAF ＜400＞ 164 acttactgtt gctcccatgg ctttcgctgc agatgctagc ccagactact ggca 54 ＜210＞ 165 ＜211＞ 44 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 BsxynAR-HA ＜400＞ 165 gtaatctggt acatcatatg ggtaccacac tgttacgtta gaac 44 ＜210＞ 166 ＜211＞ 90 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 mCWSP-AD-PX12-20-BsxynAF ＜400＞ 166 acttactgtt gctcccatgg ctttcgctgc agatagaaaa cctggtaaag gtcctggtaa 60 acctagatcc gctagcccag actactggca 90 ＜210＞ 167 ＜211＞ 80 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 BsxynAR-PX12-20-HA ＜400＞ 167 gtaatctggt acatcatatg ggtaggatct aggtttacca ggacctttac caggttttct 60 ccacactgtt acgttagaac 80 ＜210＞ 168 ＜211＞ 89 ＜212＞ PRT ＜213＞啤酒釀母菌＜400＞ 168 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 ＜210＞ 169 ＜211＞ 280 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ kozak-AFSP-stop ＜400＞ 169 gatccaaacg atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc 60 attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc 120 tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa 180 cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga 240 agaaggggta tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttga 280 ＜210＞ 170 ＜211＞ 61 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ AFSP-hGH ＜400＞ 170 agaagaaggg gtatctctcg agaaaagaga ggctgaagct ttcccaacca ttcccttatc 60 c 61 ＜210＞ 171 ＜211＞ 52 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ hGHR-stopAOXt ＜400＞ 171 attctgacat cctcttgagc ggccgcccct cagaagccac agctgccctc ca 52 ＜210＞ 172 ＜211＞ 97 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ AFSP-PX12-20-hGH ＜400＞ 172 agaagaaggg gtatctctcg agaaaagaga ggctgaagct agaaaacctg gtaaaggtcc 60 tggtaaacct agatccttcc caaccattcc cttatcc 97 ＜210＞ 173 ＜211＞ 88 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ hGHextR-PX12-20-stopAOXt ＜400＞ 173 attctgacat cctcttgagc ggccgcccct caggatctag gtttaccagg acctttacca 60 ggttttctga agccacagct gccctcca 88 ＜210＞ 174 ＜211＞ 97 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ AFSP-PX12-20v7-hGH ＜400＞ 174 agaagaaggg gtatctctcg agaaaagaga ggctgaagct agaaaaccta aaaaaaaacc 60 taaaaaacct agatccttcc caaccattcc cttatcc 97 ＜210＞ 175 ＜211＞ 238 ＜212＞ PRT ＜213＞維多利亞多管發光水母＜400＞ 175 Met Ser Gly Gly Glu Glu Leu Phe Ala Gly Ile Val Pro Val Leu Ile 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val His Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Ile Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 50 55 60 Cys Tyr Gly Ile Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Glu His Met Lys Met 65 70 75 80 Asn Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Gln Phe Gln Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Gly Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Lys 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Ser 130 135 140 Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Arg Pro Asp Lys Ala Asn Asn Gly 145 150 155 160 Leu Glu Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Thr Asn Val Pro Leu Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Ile Pro Ile Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Lys Ile Ser 195 200 205 Lys Asp Arg Asn Glu Ala Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Ser Phe 210 215 220 Ser Ala Cys Cys His Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Arg 225 230 235 ＜210＞ 176 ＜211＞ 717 ＜212＞ DNA ＜213＞維多利亞多管發光水母＜400＞ 176 atgagcgggg gcgaggagct gttcgccggc atcgtgcccg tgctgatcga gctggacggc 60 gacgtgcacg gccacaagtt cagcgtgcgc ggcgagggcg agggcgacgc cgactacggc 120 aagctggaga tcaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctg 180 gtgaccaccc tctgctacgg catccagtgc ttcgcccgct accccgagca catgaagatg 240 aacgacttct tcaagagcgc catgcccgag ggctacatcc aggagcgcac catccagttc 300 caggacgacg gcaagtacaa gacccgcggc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360 aaccgcatcg agctgaaggg caaggacttc aaggaggacg gcaacatcct gggccacaag 420 ctggagtaca gcttcaacag ccacaacgtg tacatccgcc ccgacaaggc caacaacggc 480 ctggaggcta acttcaagac ccgccacaac atcgagggcg gcggcgtgca gctggccgac 540 cactaccaga ccaacgtgcc cctgggcgac ggccccgtgc tgatccccat caaccactac 600 ctgagcactc agaccaagat cagcaaggac cgcaacgagg cccgcgacca catggtgctc 660 ctggagtcct tcagcgcctg ctgccacacc cacggcatgg acgagctgta caggtaa 717 ＜210＞ 177 ＜211＞ 37 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 pENTR1A-1 ＜400＞ 177 agtcgactgg atccggtacc gccaccatga gcggggg 37 ＜210＞ 178 ＜211＞ 80 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 pENTR1A-2 ＜400＞ 178 agtcgactgg atccggtacc gccaccatga ggtcccccgg ctccggcccc ggctccccca 60 ggtccagcgg gggcgaggag 80 ＜210＞ 179 ＜211＞ 80 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 pENTR1A-3 ＜400＞ 179 agtcgactgg atccggtacc gccaccatga ggaagcccgg caagggcccc ggcaagccca 60 ggtccagcgg gggcgaggag 80 ＜210＞ 180 ＜211＞ 80 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 pENTR1A-4 ＜400＞ 180 agtcgactgg atccggtacc gccaccatga ggaagcccaa gaagaagccc aagaagccca 60 ggtccagcgg gggcgaggag 80 ＜210＞ 181 ＜211＞ 61 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子 pENTR1A-Flag-GFP ＜400＞ 181 gtctagatat ctcgagttac ttgtcgtcgt cgtccttgta gtccctgtac agctcgtcca 60 t 61 ＜210＞ 182 ＜211＞ 54 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ mCWSP-AD-BsestAF ＜400＞ 182 acttactgtt gctcccatgg ctttcgctgc agatgctgaa cacaatccag tcgt 54 ＜210＞ 183 ＜211＞ 43 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ BsestAR-HA ＜400＞ 183 gtaatctggt acatcatatg ggtattaatt cgtattctgg ccc 43 ＜210＞ 184 ＜211＞ 90 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ mCWSP-AD-PX12-20-BsestAF ＜400＞ 184 acttactgtt gctcccatgg ctttcgctgc agatagaaaa cctggtaaag gtcctggtaa 60 acctagatcc gctgaacaca atccagtcgt 90 ＜210＞ 185 ＜211＞ 181 ＜212＞ PRT ＜213＞枯草桿菌＜400＞ 185 Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala Ser 1 5 10 15 Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp Ser 20 25 30 Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr Asn 35 40 45 Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu Asp 50 55 60 Glu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly Gly 65 70 75 80 Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val 85 90 95 Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser Ile 115 120 125 Tyr Ser Ser Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu Asp 130 135 140 Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Val Gly His Ile Gly Leu Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly 165 170 175 Gly Gln Asn Thr Asn 180 ＜210＞ 186 ＜211＞ 543 ＜212＞ DNA ＜213＞枯草桿菌＜400＞ 186 gctgaacaca atccagtcgt tatggttcac ggtattggag gggcatcatt caattttgcg 60 ggaattaaga gctatctcgt atctcagggc tggtcgcggg acaagctgta tgcagttgat 120 ttttgggaca agacaggcac aaattataac aatggaccgg tattatcacg atttgtgcaa 180 aaggttttag atgaaacggg tgcgaaaaaa gtggatattg tcgctcacag catggggggc 240 gcgaacacac tttactacat aaaaaatctg gacggcggaa ataaagttgc aaacgtcgtg 300 acgcttggcg gcgcgaaccg tttgacgaca ggcaaggcgc ttccgggaac agatccaaat 360 caaaagattt tatacacatc catttacagc agtgccgata tgattgtcat gaattactta 420 tcaagattag atggtgctag aaacgttcaa atccatggcg ttggacacat cggccttctg 480 tacagcagcc aagtcaacag cctgattaaa gaagggctga acggcggggg ccagaatacg 540 aat 543

Claims

一種具有下述序列的胜肽： X_m (PY_n )_q PZ_r ，於此處，X、Y及Z是分別獨立地選自下述之胺基酸殘基：精胺酸(R)、甘胺酸(G)、絲胺酸(S)、離胺酸(K)、蘇胺酸(T)、白胺酸(L)、天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)、組胺酸(H)，且Y之中至少1個包含K、L、N、Q、H或R； m為0至5的整數，n為1、2或者3，q為1至10的整數，r=0至10的整數。
如請求項1之胜肽，其中G與S的含有率小於60%。
如請求項1或2之胜肽，其為長度為6至50個胺基酸。
如請求項1至3中任一項之胜肽，其具有序列編號25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、64、66、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、140、142、143、145、147、149、151、153、155或157的胺基酸序列。
一種附加標記的蛋白質，包含如請求項1至4中任一項之胜肽，與有用蛋白質。
如請求項5之附加標記的蛋白質，其中有用蛋白質為人類生長激素、干擾素β、木聚糖酶、酯酶或綠色螢光蛋白(GFP)。
如請求項5或6之附加標記的蛋白質，其中前述胜肽與前述有用蛋白質是透過蛋白酶辨識序列所連結。
如請求項5至7中任一項之附加標記的蛋白質，其包含分泌信號。
一種DNA，編碼如請求項5至8中任一項之附加標記的蛋白質。
一種重組載體，包含如請求項9之DNA。
一種轉形體，其經以如請求項9之DNA或者如請求項10之重組載體所轉形而成。
如請求項11之轉形體，其中轉形體為酵母、大腸菌、嗜熱短桿菌(Brevibacillus)、昆蟲細胞或者哺乳動物細胞(含人類培養細胞但不含人類個體)。
一種附加標記的蛋白質的製造方法，特徵在於培養如請求項11或12之轉形體使附加標記的蛋白質累積，並回收附加標記的蛋白質。