CN108473979B - 肽标签及包含它的带有标签的蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本发明以具有下述序列的肽作为肽标签附加于有用蛋白质上而使之表达。Xm(PYn)qPZr。此处，X、Y及Z分别是独立地选自R、G、S、K、T、L、N、Q、H中的氨基酸残基，Y中的至少1个包含K、L、N、Q、H或R。m为0～5的整数，n为1、2或3，q为1～10的整数，r为0～10的整数。
Description
技术领域
本发明涉及肽标签及包含它的带有标签的蛋白质、编码该蛋白质的DNA、以及包含该DNA的转化体。
背景技术
随着基因重组技术的发展，目前通常进行基于异种表达的有用蛋白质的生产。在基于异种表达的有用蛋白质的生产中，作为提高蛋白质的表达、蓄积量的对策，研究了启动子及终止子的选择、翻译增强子、导入基因的密码子改变、蛋白质的细胞内运输及局域化等。例如，专利文献1中公开了在植物等中表达细菌毒素蛋白质的技术，公开了用以一定间隔配置有脯氨酸的肽接头连结细菌毒素蛋白质来实施表达(专利文献1)。
另外，除此以外还开发了多个通过使肽标签连结于目标蛋白上而提高其表达的技术(专利文献2、非专利文献1～4)。这些肽标签连结技术大部分是提高目标蛋白的溶解性、抑制细胞内的包涵体的形成、促进目标蛋白的正常表达的技术，并非是以提高蛋白质的表达量为目的的技术。另外，其多数适用于主要使用了大肠杆菌的表达系统。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利5360727号说明书
专利文献2：日本专利5273438号说明书
非专利文献
非专利文献1：Smith，D.B.and Johnson，K.S.，：Gene，67，31，1988
非专利文献2：Marblestone，J.g.et al.：Protein Sci.，15，182，2006
非专利文献3：diguan，C.et al.：Gene，67，21，1988
非专利文献4：Maria.C.V.et al.：Gene，74，365-373，1988
发明内容
发明所要解决的问题
通过使用专利文献1中公开的将脯氨酸以一定间隔配置的肽接头来连结毒素蛋白质，能够实现毒素融合蛋白质在植物内的高蓄积化。然而，该肽接头虽然作为连结多个蛋白质的接头的有用性高，然而作为以单一的目标蛋白的高表达为目的的肽标签的能力没有得到充分地研究，存在有研究的余地。因而，本发明的课题在于，提供一种肽标签，在宿主细胞中表达目标蛋白的情况下，可以通过使之与该目标蛋白结合而增加目标蛋白的表达量。
用于解决问题的方法
本发明人等为了实现专利文献1中公开的连接肽的作为蛋白质高表达用肽标签的性能提高，首先着眼于该肽(PG12及PG17)中的脯氨酸的存在，预测通过将存在于脯氨酸(P)与脯氨酸(P)之间的丝氨酸(S)和甘氨酸(G)利用物理化学性质与它们不同的氨基酸置换，或许能进一步提高这些肽所具有的有益的性质。具体而言，准备将肽中的丝氨酸(S)、甘氨酸(G)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)等碱性氨基酸、或天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等酸性氨基酸、以及丙氨酸(A)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)等立体性或极性不同的在侧链中不具有电荷的氨基酸的肽标签，使它们与目标蛋白融合，由此尝试了目标蛋白的表达提高。其结果是发现，通过在PG12、PG17中将存在于P与P之间的S和G置换为K、L、N、Q或R，将所得的肽附加到目标蛋白上，会提高目标蛋白的表达量。本发明是基于此种见解而完成的。
即，本发明如下所示。
[1]一种肽，其具有下述的序列。
Xm(PYn)qPZr
此处，X、Y及Z分别是独立地选自精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、赖氨酸(K)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)中的氨基酸残基，Y中的至少1个包含K、L、N、Q、H或R。
m为0～5的整数，n为1、2或3(n优选为2或3)，q为1～10的整数，r为0～10的整数。
[2]根据[1]中记载的肽，其中，G和S的含有率小于60％。
[3]根据[1]或[2]中记载的肽，其长度为6～50个氨基酸。
[4]根据[1]～[3]任一项中记载的肽，其具有序列号25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、64、66、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、140、142、143、145、147、149、151、153、155、或157的氨基酸列。
[5]一种带有标签的蛋白质，其包含[1]～[4]任一项中记载的肽和有用蛋白质。
[6]根据[5]中记载的带有标签的蛋白质，其中，有用蛋白质为人生长激素、干扰素β、木聚糖酶、酯酶、或绿色荧光蛋白(GFP)。
[7]根据[5]或[6]中记载的带有标签的蛋白质，其中，所述肽与所述有用蛋白质经由蛋白酶识别序列被连结。
[8]根据[5]～[7]任一项中记载的带有标签的蛋白质，其包含分泌信号。
[9]一种DNA，其编码[5]～[8]任一项中记载的带有标签的蛋白质。
[10]一种重组载体，其包含[9]中记载的DNA。
[11]一种转化体，其由[9]中记载的DNA或[10]中记载的重组载体进行了转化。
[12]根据[11]中记载的转化体，其中，转化体为酵母、大肠杆菌、短小芽胞杆菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞(包括人培养细胞然而不包括人个体)。
[13]一种带有标签的蛋白质的制造方法，其特征在于，培养[11]或[12]中记载的转化体而使带有标签的蛋白质蓄积，回收带有标签的蛋白质。
发明效果
通过使用本发明的肽标签，可以提高目标蛋白的表达量。因而，对于使用了酵母、大肠杆菌、短小芽胞杆菌等细胞的蛋白质的生产有用。特别是，大肠杆菌、短小芽胞杆菌在此前对于表达量的标签的效果并不明确，因此在它们中可以实现经由标签的表达提高在产业上非常有用。本发明的肽标签是氨基酸为10～30个左右的小的肽，对附加有该肽标签的目标蛋白的结构、功能造成影响的可能性低。因而，可以省略表达后的切割处理的可能性高，在需要肽标签的除去的情况下也可以插入蛋白酶识别序列。
附图说明
图1是表示导入酵母菌属酵母中的基因构建(hGH或IFNβ表达用)的步骤的图。
图2是表示导入大肠杆菌中的基因构建(hGH或IFNβ表达用)的步骤的图。
图3是表示导入短小芽胞杆菌中的基因构建(hGH表达用)的步骤的图。
图4是表示各附加有标签的IFNβ在酵母菌属酵母中的表达量的图。表示将无标签IFNβ的表达量设为1时的相对值。
图5是表示各附加有标签的hGH在酵母菌属酵母中的表达量的图。表示将无标签hGH的表达量设为1时的相对值。
图6是表示各附加有标签的IFNβ在大肠杆菌中的表达量的图。表示将无标签IFNβ的表达量设为1时的相对值。
图7是表示各附加有标签的hGH在大肠杆菌中的表达量的图。表示将无标签hGH的表达量设为1时的相对值。
图8是表示各附加有标签的hGH在短小芽胞杆菌中的表达量的图。表示将无标签hGH的表达量设为1时的相对值。
图9是表示导入短小芽胞杆菌中的基因构建(木聚糖酶表达用)的步骤的图。
图10是表示导入短小芽胞杆菌中的基因构建(酯酶表达用)的步骤的图。
图11是表示导入毕赤酵母中的基因构建(hGH表达用)的步骤的图。
图12是表示各附加有标签的木聚糖酶在短小芽胞杆菌中的表达量的图。表示将无标签木聚糖酶的表达量设为1时的相对值。
图13是表示各附加有标签的酯酶在短小芽胞杆菌中的表达量的图。表示将无标签酯酶的表达量设为1时的相对值。
图14是表示各附加有标签的hGH在毕赤酵母中的表达量的图。表示将无标签hGH的表达量设为1时的相对值。
图15是表示各附加有标签的GFP在昆虫细胞中的表达量的图。表示将无标签GFP的表达量设为1时的相对值。
图16是表示各附加有标签的GFP在哺乳动物细胞中的表达量的图。表示将无标签GFP的表达量设为1时的相对值。
具体实施方式
本发明的肽(也称作肽标签)具有下述的序列。
Xm(PYn)qPZr
所谓Xm是指连续m个X，该情况下的m个X可以是选自R、G、S、K、T、L、N、Q、H中的相同的氨基酸残基，也可以是不同的氨基酸残基。m为0～5的整数，优选为1～5的整数，更优选为1～3的整数。
所谓(PYn)q，是指将PYn连续q次，即，由于n为1、2或3，因此是指将PY、PYY或PYYY连续q次(P表示脯氨酸)。PY、PYY和PYYY只要合计连续q次即可。
此处，各个Y可以是选自R、G、S、K、T、L、N、Q中的相同的氨基酸残基，也可以是不同的氨基酸残基，然而连续q次的PYn中所含的Y中的至少1个为K、L、N、Q、H或R。更优选连续q次的PYn中所含的Y中的2个以上为K、L、N、Q、H或R。q为1～10的整数，优选为2～10的整数，更优选为2～5的整数，进一步优选为2～3的整数。
所谓PZr，是指在P后连续r个Z，该情况下的r个Z可以是选自R、G、S、K、T、L、N、Q中的相同的氨基酸残基，也可以是不同的氨基酸残基。r为0～10的整数，优选为1～10的整数，更优选为1～5的整数。
本发明的肽优选长度为6～50个氨基酸，更优选为6～40个氨基酸，进一步优选为8～40个氨基酸，更进一步优选为10～30个氨基酸，更进一步优选为12～25个氨基酸，特别优选为12～20个氨基酸。
本发明的肽中，相对于全部氨基酸而言的将甘氨酸与丝氨酸相加的含有率优选小于60％，更优选小于57％。
作为本发明的肽的一个方式，可以举出如下的肽，即，在PG12或PG17中，具有将P以外的氨基酸中的1～数个(例如1～6个、优选为2～6个)氨基酸置换为K、L、N或Q的氨基酸序列。另外，可以举出如下的肽，即，在PG12或PG17中，具有将P、R以外的氨基酸中的1～数个(例如1～5个、优选为2～5个)氨基酸置换为R的氨基酸序列。此处，在PG12或PG17中被置换的氨基酸更优选为P与P之间的氨基酸。
本发明的肽优选为包含以序列号25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、64、66、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、140、142、143、145、147、149、151、153、155、或157表示的氨基酸序列的肽。
本发明的带有标签的蛋白质是在目标蛋白上结合有本发明的肽标签的蛋白质(也称作标签与目标蛋白的融合蛋白质)。可以在目标蛋白的N末端结合肽标签，也可以在目标蛋白的C末端结合肽标签，还可以在目标蛋白的N末端和C末端双方结合肽标签。可以在目标蛋白的N末端和/或C末端直接结合肽标签，也可以夹隔着1～数个氨基酸(例如1～5个氨基酸)的序列结合。1～数个氨基酸的序列只要是不会对带有标签的蛋白质的功能、表达量造成不良影响的序列，则可以为任意的序列，然而通过设为蛋白酶识别序列，可以在表达、纯化后从有用蛋白质中切掉肽标签。作为蛋白酶识别序列，可以例示出Xa因子识别序列(IEGR：序列号10)。另外，本发明的带有标签的蛋白质也可以包含His标签、HN标签(例如序列号6)、FLAG标签等检测、纯化等所必需的其他标签序列。
作为本发明的带有标签的蛋白质中所含的有用蛋白质，没有特别限制，可以举出生长因子、激素、细胞因子、血液蛋白质、酶、抗原、抗体、转录因子、受体、荧光蛋白或它们的部分肽等。
作为酶，例如可以举出脂酶、蛋白酶、类固醇合成酶、激酶、磷酸酶、木聚糖酶、酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、氧化酶、还原酶、纤维素酶、芳香化酶、胶原蛋白酶、转谷氨酰胺酶、糖苷酶及几丁质酶。
作为生长因子，例如可以举出上皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、颗粒球菌落刺激因子(G-CSF)、粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板来源性生长因子(PDGF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)。
作为激素，例如可以举出胰岛素、胰高血糖素、生长激素释放抑制因子、生长激素(例如序列号1)、副甲状腺素、催乳素、瘦蛋白、降钙素。
作为细胞因子，例如可以举出白介素、干扰素(IFNα、IFNβ(例如序列号2)、IFNγ)、肿瘤坏死因子(TNF)。
作为血液蛋白质，例如可以举出凝血酶、血清白蛋白、VII因子、VIII因子、IX因子、X因子、组织纤溶酶原激活因子。
作为抗体，例如可以举出完全抗体、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fc、Fc融合蛋白、重链(H链)、轻链(L链)、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、二硫键Fv(sdFv)、双特异抗体。
作为疫苗使用的抗原蛋白只要是可以引起免疫响应的蛋白，就没有特别限制，根据设想的免疫响应的对象适当地选择即可，例如可以举出来自于病原性细菌的蛋白质、来自于病原性病毒的蛋白质。
本发明的带有标签的蛋白质也可以附加有以分泌生产用途在宿主细胞中发挥作用的分泌信号肽。在以酵母作为宿主的情况下，分泌信号肽可以举出转化酶分泌信号(例如序列号5)、P3分泌信号、α因子分泌信号(序列号168)等，在以大肠杆菌作为宿主的情况下，可以举出PelB分泌信号，在以短小芽胞杆菌作为宿主的情况下，可以举出P22分泌信号。另外，在以植物作为宿主的情况下，可以举出来自属于茄科(Solanaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物、优选来自属于烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、荷兰草莓属(Fragaria)、莴苣属(Lactuca)等的植物、更优选来自烟草(Nicotianatabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、荷兰草莓(Fragaria×ananassa)、莴苣(Lactuca sativa)等的分泌信号。
此外，为了在特定的细胞分区中表达本发明的带有标签的蛋白质，也可以附加内质网滞留信号肽、液泡运输信号肽等运输信号肽。
本发明的带有标签的蛋白质可以化学地合成，也可以利用基因工程来生产。对于利用基因工程来生产的方法将在后面叙述。
本发明的DNA的特征在于，包含编码本发明的带有标签的蛋白质的DNA。即，本发明的DNA包含编码有用蛋白质的DNA、以及编码肽标签的DNA。编码有用蛋白质的DNA、以及编码肽标签的DNA以将阅读框合并方式被连结。
编码有用蛋白质的DNA例如可以基于公知的碱基序列利用一般的基因工程的手法获得。
另外，编码本发明的带有标签的蛋白质的DNA也优选根据生产该蛋白质的宿主细胞以使杂交蛋白的翻译量增大的方式适当地改变表示构成带有标签的蛋白质的氨基酸的密码子。作为密码子改变的方法，例如可以以Kang et al.(2004)的方法为参考。另外，可以举出选择宿主细胞中使用频率高的密码子、选择GC含量高的密码子、或选择宿主细胞的管家基因中使用频率高的密码子的方法。
为了提高宿主细胞中的表达，本发明的DNA也可以包含在宿主细胞中发挥作用的增强子序列等。作为增强子，可以举出Kozak序列、来自于植物的乙醇脱氢酶基因的5’－非翻译区域。
本发明的DNA可以利用一般的基因工程的手法制作，例如可以通过将编码本发明的肽标签的DNA、以及编码有用蛋白质的DNA等使用PCR或DNA连接酶等连结来构建。
本发明的重组载体只要是将编码所述带有标签的蛋白质的DNA以能够在将载体导入的宿主细胞中表达的方式插入载体内的载体即可。载体只要能够在宿主细胞中复制，就没有特别限制，例如可以举出质粒DNA、病毒DNA等。另外，载体优选包含耐药性基因等选择标记。作为具体的质粒载体，例如可以例示出pTrcHis2载体、pUC119、pBR322、pBluescriptII KS+、pYES2、pAUR123、pQE-Tri、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL、pRI909、pRI910、pBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm、pTrc99A、pKK223、pA1－11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等。
载体内所用的启动子可以根据将载体导入的宿主细胞适当地选择。例如，在酵母中表达的情况下，可以使用GAL1启动子、PGK1启动子、TEF1启动子、ADH1启动子、TPI1启动子、PYK1启动子等。在植物中表达的情况下，可以使用花椰菜花叶病毒35S启动子、水稻的肌动蛋白启动子、玉米的泛素启动子、莴苣的泛素启动子等。在大肠杆菌中表达的情况下，可以举出T7启动子等，在短小芽胞杆菌中表达的情况下，可以举出P2启动子、P22启动子等。也可以是能够诱导的启动子，例如可以使用作为能够利用IPTG诱导的启动子的lac、tac、trc，此外还可以使用能够利用IAA诱导的trp、能够利用L-阿拉伯糖诱导的ara、能够使用四环素诱导的Pzt-1、能够在高温(42℃)下诱导的PL启动子、作为冷休克基因的一种的cspA基因的启动子等。
另外，根据需要，也可以根据宿主细胞包含终止子序列。
本发明的重组载体例如可以通过将DNA构建物用适当的限制性内切酶切割或利用PCR附加限制性内切酶位点、插入载体的限制性内切酶位点或多克隆位点而制作。
本发明的转化体的特征在于，由所述DNA或包含它的重组载体进行了转化。转化中所用的宿主细胞可以是真核细胞及原核细胞的任意一种，然而优选真核细胞。
作为真核细胞，优选使用酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。作为酵母，可以举出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或产朊假丝酵母(Candida utilis)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等。此外，也可以使用曲霉属菌(Aspergillus)等微生物。作为原核细胞，可以举出大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸菌(Lactobacillus)、枯草菌(Bacillus)、短小芽胞杆菌(Brevibacillus)、土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放线菌等。作为植物细胞，可以举出属于莴苣属(Lactuca)等菊科(Astaraceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、藜科(Chenopodiaceae)的植物的细胞等。
本发明中所用的转化体可以通过使用一般的基因工程的手法将本发明的重组载体导入宿主细胞而制作。例如，可以使用电穿孔法(Tada，et al.，1990，Theor.Appl.Genet，80：475)、原生质体法(Gene，39，281-286(1985))、聚乙二醇法(Lazzeri，et al.，1991，Theor.Appl.genet.81：437)、利用了土壤杆菌的导入方法(Hood，et al.，1993，Transgenic，Res.2：218，Hiei，et al.，1994Plant J.6：271)、基因枪法(Sanford，et al.，1987，J.Part.Sci.tech.5：27)、聚阳离子法(Ohtsuki，et al.，FEBS Lett.1998May 29；428(3)：235-40.)等方法。需要说明的是，基因表达可以是一过性的表达，也可以是编入染色体中的稳定的表达。
将本发明的重组载体导入宿主细胞中后，可以根据选择标记的表现型来选择转化体。另外，通过培养所选择的转化体，可以生产所述带有标签的蛋白质。培养中所用的培养基及条件可以根据转化体的种类适当地选择。
另外，在宿主细胞为植物细胞的情况下，通过依照常法培养所选择的植物细胞，可以将植物体再生，可以使植物细胞内或植物细胞的细胞膜外蓄积所述带有标签的蛋白质。
蓄积于培养基或细胞内的本发明的附加有肽标签的蛋白质可以依照本领域技术人员熟知的方法进行分离纯化。例如，可以利用盐析、乙醇沉淀、超滤、凝胶过滤色谱、离子交换柱层析、亲和色谱、中高压液相色谱、反相色谱、疏水色谱等已知的合适的方法、或将这些方法组合而进行分离纯化。
以下，对本发明的实施例进行说明，然而本发明并不限定于该实施例。
实施例
(1)编码带有酵母用肽标签的蛋白质的基因表达用质粒的构建
作为附加肽标签的蛋白质，使用了1)人生长激素(hGH、序列号1)、2)人干扰素β-1b(IFNβ、序列号2)。将编码hGH的人工合成DNA(序列号3)插入pUC19改变质粒pTRU5(FASMAC)的EcoRV识别部位，得到质粒1。将编码IFNβ的人工合成DNA(序列号4)插入pUC19改变质粒pTRU5的EcoRV识别部位，得到质粒2。
以在表达蛋白的N末端附加酵母转化酶SUC2信号肽(SUC2SP、序列号5、Hashimoto等，Protein Engineering，1998 2；75-77)和检测/纯化用的6×HN标签(序列号6)的方式，将在包含NotI、SalI、SfiI、XhoI、AscI识别序列的多克隆位点的5’末端附加有编码SUC2SP及6×HN标签的DNA序列的人工合成DNA(序列号7)插入pYES2(Invitrogen)的HindIII-XbaI位点，制成酵母表达用质粒3。
利用下述步骤构建出用于在酵母中表达在N或C末端或者N、C两末端附加有各种标签(表1)的hGH或IFNβ的质粒(图1)。
首先，为了在hGH或IFNβ的N或C末端或N、C两末端附近各种标签，实施了利用表2所示的模板质粒、正向引物、反向引物的组合的PCR。在各引物的5’末端附加了与质粒3相同的序列。PCR使用KOD-PLUS-Ver.2(东洋纺)，以达到2pg/μL模板质粒、0.3μM正向引物、0.3μM反向引物、0.2mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5mMMgSO4、0.02U/μLKOD-PLUS-Ver.2的方式制备50μl反应液，在94℃加热5分钟后，进行25个循环的在98℃加热10秒、在60℃加热30秒、在68℃加热40秒的加热处理，最后在68℃加热5分钟。将所得的扩增片段用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行了纯化。将质粒3用NotI、AscI消化后，利用使用了0.8％SeaKem GTG Agarose(Lonza)的电泳进行分离，使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)从凝胶中提取。将约50ng的所提取的质粒3与纯化PCR产物2μl混合，将液量调整为5μl后，与Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit(Applied Biosystem)附带的2×EnzymeMix 5μl混合，在室温下静置30分钟，其后在冰上静置5分钟。将反应液5μl与上述试剂盒附带的感受态细胞DH10B T1SA混合并在冰上静置30分钟后，在37℃加热10分钟，在冰上静置2分钟后，添加250μl的SOC，在37℃以200rpm振荡1小时。其后，将振荡物的50μl涂布于包含100mg/l氨苄西林的2×YT琼脂培养基(16g/LBacto胰蛋白胨、10g/LBacto酵母提取物、5g/LNaCl、15g/L细菌培养用琼脂)上后，在37℃静置培养一夜，得到转化菌落。将菌落移植到包含100mg/l氨苄西林的2×YT液体培养基(16g/LBacto胰蛋白胨、10g/LBacto酵母提取物、5g/LNaCl)中，在37℃以200rpm振荡培养一夜后，提取质粒，确认碱基序列后，用于酵母的转化。
(2)酵母的转化
将酵母(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1、Invitrogen)在YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％右旋糖(D-葡萄糖))中在30℃以200rpm振荡培养一夜。在10ml的YPD中以使波长600nm下的浊度(OD600)为0.2-0.4的方式稀释后，在30℃以200rpm振荡培养至OD600为0.6-1.0。以500×g在室温进行5分钟离心，使细胞变为颗粒，抛弃上清液。然后将颗粒悬浮于10mL的Solution I(S.c.EasyComp Transformation Kit、Invitrogen)中。继而，以500×g在室温进行5分钟离心，使细胞变为颗粒，抛弃上清液。然后将颗粒悬浮于1ml的SolutionII(S.c.EasyComp Transformation Kit、Invitrogen)中，每次50μl地分注，作为感受态细胞。在-80℃的深冻冰箱中保管至使用前。
将所得的感受态细胞融解而恢复到室温，添加1μg的利用上述操作制作出的带有肽标签的蛋白质表达用质粒后，添加500μl的SolutionIII(室温)并进行涡旋后，在30℃静置1小时(每15分钟进行涡旋)。继而将上述静置物50μl涂布于包含2％葡萄糖及2％细菌培养用琼脂的SC-Ura培养基(6.7g/L酵母氮源基础，0.1g/L腺嘌呤，0.1g/L精氨酸，0.1g/L半胱氨酸，0.1g/L亮氨酸，0.1g/L赖氨酸，0.1g/L苏氨酸，0.1g/L色氨酸，0.05g/L天冬氨酸，0.05g/L组氨酸，0.05g/L异亮氨酸，0.05g/L蛋氨酸，0.05g/L苯基丙氨酸，0.05g/L脯氨酸，0.05g/L丝氨酸，0.05g/L酪氨酸，0.05g/L缬氨酸)上后，在30℃静置培养2-3天，得到转化菌落。
(3)酵母的蛋白质诱导培养
将转化后的单菌落涂布于平板培养基(SC-Ura，2％右旋糖)上，在30℃以24小时在培养箱中静置而进行了培养。然后，从培养后的平板培养基中用1μl灭菌一次性接种环刮取菌体，植入分注有3ml预培养培养基(SC-Ura，2％半乳糖)的灭菌聚苯乙烯制14ml管中，在30℃以200rpm进行了16小时振荡培养。培养结束后，利用分光光度计600nm测定浊度，在已灭菌的1.5ml埃彭道夫管中分取在3ml培养基中再悬浮时使浊度为0.4的必需量的培养物后，以3000×g在4℃进行5分钟离心分离，除去上清液后，将沉淀悬浮于1ml诱导培养基(SC-Ura，1％半乳糖，1％棉籽糖)中，与预先分注有2ml的诱导培养基的灭菌聚苯乙烯制14ml管合并，在30℃以200rpm进行24小时振荡培养。培养结束后，在1.5mL埃彭道夫管中分取培养液400μl，以3000×g在4℃进行5分钟离心后，除去上清液，然后在液氮中冷冻，然后在深冻冰箱中以-80℃保存。
(4)从酵母中提取蛋白质
蛋白质提取是依照Akira Hosomi等人的方法(Akira Hosomi，et al，：JBioLChem，285，(32)，24324-24334，2010)，使用在液氮冷冻后以-80℃保存的基因导入酵母菌体进行。向保存样品中加入720μl的蒸馏水，利用旋涡混合器搅拌后，加入80μl的1.0NNaOH，再次利用旋涡混合器搅拌后，在冰浴中静置10分钟。然后，在4℃以15000g进行5分钟离心分离，抛弃上清液后，回收沉淀。向沉淀中加入100μl的样品缓冲液(EZ Apply、ATTO制)，利用旋涡混合器搅拌后，在沸水中加热10分钟，进行了样品的SDS化。
(5)编码带有大肠杆菌用肽标签的蛋白质的基因表达用质粒的构建
制备人工合成DNA(序列号78)，插入pET-15b(Novagen)的XbaI-BlpI位点，制成大肠杆菌表达用质粒4。人工合成DNA(序列号78)是将pET-22b(+)(Novagen)的XbaI-BlpI间的基因表达组件中的从大肠杆菌PelB信号肽(PelBSP)紧后方到终止密码子的区域置换为接在检测/纯化用的6×HN标签(序列号6)之后的包含NotI、SalI、SfiI、XhoI、AscI识别序列的多克隆位点的DNA。
利用下述步骤构建出用于在大肠杆菌中表达在N或C末端或者N、C两末端附加了各种标签的hGH或IFNβ的质粒(图2)。
首先，为了向hGH或IFNβ的N或C末端或N、C两末端附加各种标签，实施了利用表3所示的模板质粒、正向引物、反向引物的组合的PCR。在各引物的5’末端附加了与质粒4相同的序列。PCR使用KOD-PLUS-Ver.2(东洋纺)，以达到2pg/μL模板质粒、0.3μM正向引物、0.3μM反向引物、0.2mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5mMMgSO4、0.02U/μLKOD-PLUS-Ver.2的方式制备50μl反应液，在94℃进行5分钟加热后，进行25个循环的在98℃加热10秒、在60℃加热30秒、在68℃加热40秒的加热处理，最后在68℃加热5分钟。用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化所得的扩增片段。将质粒4用NotI、AscI消化后，利用使用了0.8％SeaKem GTG琼脂糖(Lonza)的电泳进行分离，使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN)从凝胶中提取。将约50ng的所提取的质粒4与纯化PCR产物2μl混合，将液量调整为5μl后，与GeneArt Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit(Applied Biosystem)附带的2×EnzymeMix 5μl混合，在室温下静置30分钟，其后在冰上静置5分钟。将反应液5μl与上述试剂盒附带的感受态细胞大肠杆菌DH10B T1SA混合，在冰上静置30分钟后，在37℃加热10分钟，在冰上静置2分钟后，添加250μl SOC，在37℃以200rpm振荡1小时。其后，将振荡物的50μl涂布于包含100mg/l氨苄西林的2×YT琼脂培养基(16g/LBacto胰蛋白胨、10g/LBacto酵母提取物、5g/LNaCl、15g/L细菌培养用琼脂)上后，在37℃静置培养一夜，得到转化菌落。将菌落移植到包含100mg/l氨苄西林的2×YT液体培养基(16g/LBacto胰蛋白胨、10g/LBacto酵母提取物、5g/LNaCl)中，在37℃以200rpm振荡培养一夜后，提取质粒，确认碱基序列后，用于蛋白质表达用大肠杆菌的转化中。
(6)蛋白质表达用大肠杆菌的转化
将大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)的甘油菌植入加入了3mLSOB培养基(20g/LBacto胰蛋白胨、5g/LBacto酵母提取物、10mMNaCl、2.5mM KCl、10mMMgSO4、10mMMgCl2)的灭菌聚苯乙烯制14ml管中，在37℃以200rpm振荡培养一夜。向加入了100mLSOB培养基的灭菌三角烧瓶中植入上述预培养液0.2ml后，在30℃以200rpm进行振荡培养。如果波长600nm下的浊度(OD600)达到0.4-0.6则进行10-30分钟冰浴而停止培养。将培养液移入50mL锥形管中以2500×g在4℃进行10分钟离心分离(×2根)。抛弃上清液，将颗粒加入冰浴过的15mLTB(10mM PIPES-KOH、pH6.7、15mM CaCl2、0.25M KCl、55mMMnCl2)中而平稳地悬浮(×2根)。将2根的悬浮液集中于1根中，以2500×g在4℃进行10分钟离心分离。抛弃上清液，将颗粒加入冰浴过的10mLTB中而平稳地悬浮。加入700μl的DMSO，一边冰浴一边悬浮。向1.5ml微型管中每次50μl地分注，作为感受态细胞。用液氮冷冻后，以-80℃保存至使用前。
将所得的感受态细胞在冰上融解，添加利用上述操作制作出的带有大肠杆菌用肽标签的蛋白质表达质粒1ng后，平稳地混合，在冰上静置30分钟。在42℃进行30-45秒处理(热休克)后，在冰上静置2min。添加250μl的SOC后，使管水平，在37℃以200rpm振荡1小时。将振荡物50μl涂布于包含100mg/l氨苄西林的2×YT琼脂培养基上后，在37℃静置培养一夜，得到转化菌落。
(7)大肠杆菌的蛋白质诱导培养
将转化后的单菌落涂布于平板培养基(2×YT、100ppm氨苄西林)中，在37℃在培养箱中静置一夜而进行了培养。然后，从培养后的平板培养基中用灭菌一次性接种环刮取菌体，植入分注有2ml预培养培养基(LB，100ppm氨苄西林)的灭菌聚苯乙烯制14ml管中，在37℃以200rpm进行振荡培养，直至OD600值达到0.6～1.0。向这些培养物的除去了离心上清液的沉淀物中添加1.0mLLB培养基(100ppm氨苄西林)时，在1.5mL埃彭道夫管中分取OD600值达到0.3所必需的量的培养物，在4℃(冰箱内)静置保管一夜。第二天，将所述样品以2000rpm在4℃进行30min离心后，除去上清液，加入新的LB培养基(100ppm氨苄西林)1ml，使沉淀悬浮。继而，以使OD600值为0.03的方式，向2.7ml的LB培养基(100ppm氨苄西林)中植入上述样品1ml中的300μl，在37℃以200rpm振荡培养，直至OD600值达到0.4～1.0。然后，加入1M IPTG(诱导剂)3μl(最终浓度为1mM)，在37℃以200rpm进行3小时振荡培养。培养结束后，将加入了样品的试管在冰上冷却5分钟，使大肠杆菌的增殖停止后，在新的1.5ml的埃彭道夫管中分取培养液200μl，以5000rpm在4℃进行5min离心分离。然后，除去上清液，将菌体用液氮冷冻后，以-80℃冷冻保存。
(8)从大肠杆菌中提取蛋白质
向冷冻保存样品中加入100μl的样品缓冲液(EZ Apply、ATTO制)，利用旋涡混合器搅拌后，在沸水中加热10分钟，进行了样品的SDS化。
(9)编码带有短小芽胞杆菌用的肽标签的hGH的基因表达用质粒的构建及转化
使用短芽孢杆菌表达系统-BIC System-(Takara-Bio)进行质粒构建及短小芽胞杆菌的转化(图3)。
首先，为了向hGH的N或C末端或N、C两末端附加各种标签，实施了利用表3所示的模板质粒、正向引物、反向引物的组合的PCR。向各引物的5’末端附加了与pBIC3的插入部位相同的序列。PCR使用KOD-PLUS-Ver.2(东洋纺)，以达到2pg/μL模板质粒、0.3μM正向引物、0.3μM反向引物、0.2mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5mMMgSO4、0.02U/μLKOD-PLUS-Ver.2的方式制备50μl反应液，在94℃进行5分钟加热后，进行25个循环的在98℃加热10秒、在60℃加热30秒、在68℃加热40秒的加热处理，最后在68℃加热5分钟。用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化所得的扩增片段。
如下所示地进行利用相同重组的质粒的构建及转化。将100ng的短小芽胞杆菌表达用质粒pBIC3(试剂盒中附带)与纯化过的PCR产物以摩尔比计约为1：2的方式混合，用灭菌水调整为5μl。将桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)SP3感受态细胞(Takara-Bio)在37℃Heat Block中静置30秒而急速解冻，离心分离(12000rpm、室温、1分钟)后除去上清液，然后添加将上述5μl的DNA溶液与50μl的Solution A(试剂盒中附带)混合而得的全部溶液，利用涡旋使感受态细胞的颗粒完全地悬浮，静置5分钟。加入150μl的Solution B(PEG溶液)，利用涡旋混和10秒，离心分离(5000rpm、室温、5分钟)后除去上清液，再次进行离心分离(5000rpm、室温、30秒)，完全地除去上清液。向其中加入1mLMT培养基，使用微量移液器完全地悬浮后，在37℃以200rpm进行1小时振荡培养。将培养液铺板于MTNm平板(10g/L葡萄糖、10g/L植物蛋白胨、5g/L Erlich鲣提取物、2g/L粉末酵母提取物S、10mg/LFeSO4·7H2O、10mg/LMnSO4·4H2O、1mg/LZnSO4·7H2O、20mMMgCl2、1.5％细菌培养用琼脂、50μg/mL新霉素、pH 7.0)上，在37℃静置培养一夜。对所得的克隆体利用菌落的Western分析确认目标蛋白的表达，对于可以确认表达的克隆体，将菌落植入TMNm培养基(10g/L葡萄糖、10g/L植物蛋白胨、5g/LErlich鲣提取物、2g/L粉末酵母提取物S、10mg/LFeSO4·7H2O、10mg/LMnSO4·4H2O、1mg/LZnSO4·7H2O、50μg/mL新霉素、pH 7.0)中，在30℃以200rpm培养一夜，提取质粒，确认了碱基序列。
(10)编码带有短小芽胞杆菌用的肽标签的木聚糖酶及酯酶的基因表达用质粒的构建及转化
将编码来自于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的木聚糖酶(XynA、序列号159)的人工合成DNA(序列号160)插入pUC19改变质粒pUCFa(FASMAC)的EcoRV识别部位，得到质粒5。另外，将编码来自于枯草芽孢杆菌的酯酶(EstA、序列号185)的人工合成DNA(序列号186)插入pUC19改变质粒pUCFa(FASMAC)的EcoRV识别部位，得到质粒6。
以将检测/纯化用的HA标签(序列号161)及6×His标签(序列号162)附加于表达蛋白的C末端的方式，将编码HA标签、6×His标签及终止密码子的人工合成DNA(序列号163)插入pNCMO2(Takara-Bio)的NcoI-HindIII位点，制作出短小芽胞杆菌表达用质粒7。
利用下述步骤构建出用于在短小芽胞杆菌中表达在N或C末端或者N、C两末端附加有PX12-20标签的木聚糖酶或酯酶的质粒(图9、10)。
首先，为了向木聚糖酶或酯酶的N或C末端或者N、C两末端附加各种标签，实施了利用表3所示的模板质粒、正向引物、反向引物的组合的PCR。向各引物的5’末端附加了与质粒7相同的序列。另外，以接在信号肽后附加2个氨基酸残基AD的方式设计了正向引物。PCR使用KOD-PLUS-Ver.2(东洋纺)，以达到2pg/μL模板质粒、0.3μM正向引物、0.3μM反向引物、0.2mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5mMMgSO4、0.02U/μLKOD-PLUS-Ver.2的方式制备出50μl反应液，在94℃进行5分钟加热后，进行25个循环的在98℃加热10秒、在60℃加热30秒、在68℃加热40秒的加热处理，最后在68℃加热5分钟。将所得的扩增片段用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。将质粒7用NcoI、NdeI消化后，利用使用了0.8％SeaKem GTG琼脂糖的电泳进行分离，使用QIAquick凝胶回收试剂盒从凝胶中提取。将约50ng的所提取的质粒7与纯化PCR产物2μl混合并将液量调整为5μl后，与Gene Art Seamless PLUSCloning and Assembly Kit附带的2×EnzymeMix 5μl混合，在室温下静置30分钟，其后在冰上静置5分钟。将反应液5μl与感受态细胞DH10B T1 SA混合，在冰上静置30分钟后，在37℃加热10分钟，在冰上静置2分钟后，添加250μl的SOC，在37℃以200rpm振荡1小时。其后，将振荡物的50μl涂布于包含100mg/l氨苄西林的2×YT琼脂培养基上后，在37℃静置培养一夜，得到转化菌落。将菌落移植到包含100mg/l氨苄西林的2×YT液体培养基中，在37℃以200rpm振荡培养一夜后，提取质粒，确认碱基序列后，用于短小芽胞杆菌的转化中。
将桥石短芽孢杆菌SP3感受态细胞在37℃在Heat Block中静置30秒而急速解冻，离心分离(12000rpm、室温、1分钟)后除去上清液，然后添加将上述质粒溶液1μl与50μl的Solution A混合而得的全部溶液，利用涡旋使感受态细胞的颗粒完全地悬浮，静置5分钟。加入150μl的Solution B，利用涡旋混合10秒，离心分离(5000rpm、室温、5分钟)后除去上清液，再次离心分离(5000rpm、室温、30秒)，完全地除去上清液。向其中加入1mLMT培养基，使用微量移液器完全地悬浮后，在37℃以200rpm振荡培养1小时。将培养液铺板于MTNm平板中，在37℃静置培养一夜，得到转化短小芽胞杆菌。
(11)短小芽胞杆菌的蛋白质表达培养
将转化短小芽胞杆菌的单菌落涂布于MTNm平板上，在30℃静置一夜而进行了培养。从培养后的平板培养基中用1μl灭菌一次性接种环刮取菌体，植入加入到灭菌聚苯乙烯制14ml管中的3mLTMNm培养基中，在30℃以200rpm进行一夜预培养。在hGH表达的情况下，将预培养液200μl植入3mLTMNm培养基中，在30℃以200rpm振荡培养，48小时后对包含菌体的培养液进行取样。在木聚糖酶及酯酶的表达的情况下，将预培养液200μl植入3mLTMNm培养基中，在30℃以120rpm振荡培养，48小时后对包含菌体的培养液进行取样。将培养液每份100μl地细分，利用离心分离(20000×g、4℃、10分钟)分为培养上清液和菌体，将培养上清液50μl和菌体全量以-80℃保存。
(12)从短小芽胞杆菌中提取蛋白质
相对于冷冻保存过的培养上清液50μl，加入2×样品缓冲液(EZ Apply、ATTO制)50μl，利用旋涡混合器搅拌后，在沸水中加热10分钟而进行了SDS化。对于菌体，加入1×样品缓冲液(将EZ Apply稀释2倍的溶液)100μl，利用相同的工序进行了SDS化。
(13)编码带有毕赤酵母用的肽标签的hGH的基因表达用质粒的构建及转化
将在Kozak序列的下游配置有来自于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae的α因子的细胞外分泌信号肽(AFSP、序列号168)编码序列及终止密码子序列的人工合成DNA(序列号169)插入pJ902-15(Invivogen)的BsaI-BsaI位点，制成毕赤酵母表达用质粒8。
利用下述步骤构建出用于在毕赤酵母中表达在N或C末端或者N、C两末端附加了各种标签的hGH的质粒(图11)。
首先，为了向hGH的N或C末端或者N、C两末端附加标签，实施了利用表3所示的模板质粒、正向引物、反向引物的组合的PCR。向各引物的5’末端附加了与质粒8相同的序列。PCR使用KOD-PLUS-Ver.2(东洋纺)，以达到2pg/μL模板质粒、0.3μM正向引物、0.3μM反向引物、0.2mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5mMMgSO4、0.02U/μLKOD-PLUS-Ver.2的方式制备出50μl反应液，在94℃进行5分钟加热后，进行25个循环的在98℃加热10秒、在60℃加热30秒、在68℃加热40秒的加热处理，最后在68℃加热5分钟。将所得的扩增片段用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。将质粒8用XhoI、NotI消化后，利用使用了0.8％SeaKem GTG琼脂糖的电泳进行分离，使用QIAquick凝胶回收试剂盒，从凝胶中提取。将约50ng的所提取的质粒8与纯化PCR产物2μl混合，将液量调整为5μl后，与Gene Art Seamless PLUSCloning and Assembly Kit附带的2×EnzymeMix 5μl混合，在室温下静置30分钟，其后在冰上静置5分钟。将反应液5μl与感受态细胞DH10B T1SA混合，在冰上静置30分钟后，在37℃加热10分钟，在冰上静置2分钟后，添加250μl的SOC，在37℃以200rpm振荡1小时。其后，将振荡物的50μl涂布于包含100mg/l氨苄西林的2×YT琼脂培养基上后，在37℃静置培养一夜，得到转化菌落。将菌落移植到包含100mg/l氨苄西林的2×YT液体培养基中，在37℃以200rpm振荡培养一夜后，提取质粒，确认了碱基序列。利用SacI切割将质粒直链化，利用苯酚·氯仿萃取除去蛋白质，进行乙醇沉淀后，干燥，溶解于TE缓冲液中，用于毕赤酵母的转化中。
将毕赤酵母(Pichia pastoris PPS-9010)在YPD培养基中在30℃以200rpm振荡培养一夜。向加入了100ml的YPD培养基的三角烧瓶中以使OD600为0.2-0.4的方式添加上述培养液，在30℃以200rpm进行振荡培养，直至OD600为0.8-1.0。以500×g在室温离心5分钟，抛弃上清液而得到细胞颗粒。向颗粒中添加冰浴过的18ml的BEDS溶液(10mM二(羟乙基)甘氨酸、3％(v/v)乙二醇、5％(v/v)二甲亚砜、1M山梨醇)和冰浴过的2ml的1M二硫苏糖醇，悬浮后，在30℃以100rpm进行5分钟温育。继而，以500×g在室温进行5分钟离心，抛弃上清液而得到细胞颗粒。向颗粒中添加2ml的BEDS溶液，悬浮后，每次40μl地分注，作为感受态细胞。在-80℃的深冻冰箱中保管至使用前。
将直链化了的约100ng的上述质粒溶液与在冰上融解了的感受态细胞混合，添加到电穿孔用小杯(电极间距离0.2cm、BIO-RAD)中而在冰上静置2分钟。将小杯安放于电穿孔用装置(MicroPulser、BIO-RAD)中，在经过编程的条件(Pic、10μF、600Ω、2.0kV、1pulse)下实施电穿孔。之后立即添加包含1M山梨醇的YPD培养基1ml，将全部量转移到微型管中，在30℃以200rpm振荡1小时。振荡后，将500μl涂布于包含1M山梨醇、2％细菌培养用琼脂及100mg/L盐酸博来霉素(invivogen)的YPD平板培养基上后，在30℃静置培养2-3天，得到转化菌落。
(14)毕赤酵母的蛋白质表达培养
将转化后的单菌落涂布于包含1M山梨醇、2％细菌培养用琼脂及100mg/L盐酸博来霉素的YPD平板培养基上，在30℃进行24小时的静置培养。然后，从培养后的平板培养基中用1μl灭菌一次性接种环刮取菌体，植入添加到灭菌14ml管中的3mLBMGY培养基(1％Bacto酵母提取物、2％Bacto蛋白胨、0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)、1.34％酵母氮源基础无氨基酸无硫酸铵、0.4mg/L生物素、1％甘油)中，在30℃以200rpm进行振荡培养，直至OD600为2-6。在已灭菌的1.5ml埃彭道夫管中分取在再悬浮于3ml培养基中时使OD600为1的必需量的培养物后，以3000×g在20℃进行5分钟离心分离，除去上清液后，将沉淀悬浮于1mL BMMY培养基(1％Bacto酵母提取物、2％Bacto蛋白胨、0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)、1.34％酵母氮源基础无氨基酸无硫酸铵、0.4mg/生物素、0.5％甲醇)中，将全部量与预先在灭菌14ml管中准备好的2ml的BMMY培养基混合，在30℃以200rpm进行72小时振荡培养。培养结束后，在微型管中分取培养液100μl，以15000×g在4℃进行10分钟离心后，在新的微型管中分取上清50μl，得到培养上清液，除去剩余的上清液，得到菌体颗粒。将培养上清液、菌体颗粒在液氮中冷冻后，在深冻冰箱中以-80℃保存。
(15)毕赤酵母的蛋白质提取
相对于冷冻保存了的培养上清液50μl，加入2×样品缓冲液(EZ Apply、ATTO制)50μl，利用旋涡混合器搅拌后，在沸水中加热10分钟而进行了SDS化。
将菌体颗粒悬浮于冰浴过的悬浮缓冲液(1X PBS(BIO-RAD)、1×Complete-EDTAfree(罗氏))100μl中，将全部量添加到加入了80μl玻璃珠(直径0.5mm、已进行酸处理、Sigma)的微型管中，使用TissueLyzerII(QIAGEN)，以30Hz振荡4分钟而进行了破碎。分取30μl的破碎液，加入2×样品缓冲液(EZ Apply、ATTO制)30μl，利用旋涡混合器搅拌后，在沸水中加热10分钟而进行了SDS化。
(16)Western分析
作为蛋白质定量时的标准物质使用了hGH及IFNβ的标品。另外，在木聚糖酶的定量时，使用附加有HA序列的Stx2eB作为标品。通过将其用样品缓冲液(EZ Apply、ATTO制)反复进行2倍稀释而制成稀释系列，使用它们作为标样。
蛋白质的电泳(SDS-PAGE)使用了电泳槽(Criterion cell、BIO RAD)及CriterionTGX-凝胶(BIO RAD)。向电泳槽中加入泳动缓冲液(Tris/Glycine/SDS Buffer、BIO RAD)，向孔中点入SDS化了的样品4μl，以200V定电压进行40分钟泳动。
电泳后的凝胶使用Trans-Blot转印系统(BIO RAD)，利用Trans-BlotTurbo(BIORAD)进行了印迹。
将印迹后的膜浸渍于封闭溶液(TBS系，pH7.2、Nacalai Tesque)中，在室温下振荡1小时或在4℃静置16小时后，在TBS-T(137mM氯化钠、2.68mM氯化钾、1％聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯、25mM Tris-HCl、pH 7.4)中在室温下进行3次5分钟的振荡而清洗。在hGH的检测时，将抗血清兔单克隆抗人生长激素抗体[EPR11047(B)](abcam)用TBS-T稀释3000倍后使用。在IFNβ的检测时，将抗血清小鼠单克隆抗人IFNβ抗体(R&D系统)用TBS-T稀释1000倍后使用。另外，在木聚糖酶及酯酶的检测时，将抗血清大鼠单克隆抗HA抗体(Roche)用TBS-T稀释6000倍后使用。将膜浸渍于抗体稀释液中，在室温下振荡1小时，由此进行抗原抗体反应，在TBS-T中在室温下进行3次5分钟的振荡而清洗。作为二次抗体，在hGH检测的情况下，使用用TBS-T稀释2000倍的Anti-Rabbit IgG，AP-linked Antibody(CelLSignalingTECHNOLOGY)，在IFNβ的检测的情况下，使用Anti-Mouse IgG，AP-linked Antibody(CelLSignaling TECHNOLOGY)。另外，在木聚糖酶及酯酶的检测的情况下，使用用TBS-T稀释了6000倍的Anti-Rat IgG，AP-linked Antibody(EDMMillipore Corp.)。
将膜浸渍于二次抗体稀释液中，在室温下振荡1小时，由此进行抗原抗体反应，在TBS-T中在室温下进行3次5分钟的振荡而清洗。利用碱性磷酸酶的显色反应是通过将膜浸渍于显色液(0.1M氯化钠、5mM氯化镁、0.33mg/ml硝基四氮唑蓝、0.33mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸、0.1M Tris-HCl、pH9.5)中，在室温下振荡15分钟而进行，将膜用蒸馏水清洗后，在常温下干燥。
将显色了的膜利用扫描仪(PM-A900、EPSON)以析像度600dpi进行图像化，使用图像分析软件(CS Analyzer ver.3.0、ATTO)，进行hGH或IFNβ蛋白质的定量。
(17)昆虫细胞中的蛋白质表达量的提高效果确认
作为附加肽标签的蛋白质使用了来自于维多利亚多管发光水母Aequoreavictoria的绿色荧光蛋白(GFP、氨基酸序列：序列号175、DNA碱基序列：序列号176)。利用在GFP蛋白质的N末端侧配置各种肽标签、在C末端侧配置Flag标签的正向引物(pENTR1A-1(序列号177)···无标签用、pENTR1A-2(序列号178)···PG12标签用、pENTR1A-3(序列号179)···PX12-20标签用、pENTR1A-4(序列号180)···PX12-20v7标签用)与反向引物(pENTR1A-Flag-GFP(序列号181))的引物对进行PCR反应，制备出克隆用DNA片段。将制备出的DNA片段向pENTR 1A(ThermoFisher Scientific)克隆而构建出具有编码各种肽标签-GFP-Flag标签的DNA片段的质粒。以该质粒为基础使用LR反应向作为施主载体的pFastbac(ThermoFisher Scientific)插入编码各种肽标签-GFP-Flag标签的DNA。将这些的各种施主载体导入大肠杆菌DH10bac(ThermoFisher Scientific)并使之转座于Bacmid载体的lacZ区域而制成重组Bacmid。将包含编码各种肽标签-GFP-Flag标签的DNA的重组BacmidDNA导入来自于蚕的BmN细胞而制成各种杆状病毒。将所得的各种杆状病毒溶液添加到BmN细胞用培养基中而再次得到杆状病毒溶液，将该操作反复进行3次，制备出杆状病毒浓度充分地提高了的各种杆状病毒溶液。将该杆状病毒溶液200μl添加到包含5.0×105的BmN细胞的1.8ml的IPL41-10％FCS培养基中，36小时后进行移液而剥离细胞，回收培养液并计测细胞数后，利用离心操作分离为培养上清液和细胞部分。将回收到的细胞部分悬浮于200μl的20mM Tris-HCl(pH7.4)、20mMNaCl、3mMMgCl2溶液中并进行超声波处理后，利用离心操作回收上清液。将回收到的细胞破碎上清液加入培养上清液中而作为分析用样品。对包含各种肽标签-GFP-Flag标签的分析用样品9μl实施SDS-PAGE，作为1次抗体使用anti-Flag抗体(Sigma Aldrich)，作为2次抗体使用anti-mouse IgG HRP标记抗体(GEhealthcare)，使用ImmunoStar Zeta(和光纯药)检测各种肽标签-GFP-Flag标签蛋白。将各种肽标签-GFP-Flag标签蛋白的条带强度用细胞数除，比较所得的数值而作为各种肽标签的蛋白质表达量提高效果。
(18)哺乳类细胞中的蛋白质表达量的提高效果确认
作为附加肽标签的蛋白质使用了来自于维多利亚多管发光水母Aequoreavictoria的绿色荧光蛋白(GFP、氨基酸序列：序列号175、DNA碱基序列：序列号176)。利用在GFP蛋白质的N末端侧配置有各种肽标签、在C末端侧配置有Flag标签的正向引物(pENTR1A-1(序列号177)···无标签用、pENTR1A-2(序列号178)···PG12标签用、pENTR1A-3(序列号179)···PX12-20标签用)与反向引物(pENTR1A-Flag-GFP(序列号181))的引物对进行PCR反应，制备出克隆用DNA片段。将制备出的DNA片段向pENTR 1A(ThermoFisherScientific)克隆而构建出具有编码各种肽标签-GFP-Flag标签的DNA片段的质粒。以该质粒为基础使用LR反应向pAd/CMV/v5-DEST腺病毒载体(ThermoFisher Scientific)插入编码各种肽标签-GFP-Flag标签的DNA。将这些的各种载体导入HEK293A细胞而制成各种腺病毒溶液。将所得的各种腺病毒溶液接种到HEK293A细胞中而再次获得腺病毒溶液，反复进行4次该操作，制备出腺病毒浓度充分地提高了的各种腺病毒溶液。将该腺病毒溶液200μl添加到包含2.5×105的A549细胞的1.2ml的DMEM high葡萄糖-10％FCS培养基中，84小时后进行胰蛋白酶处理(37℃、10分钟)而剥离细胞，回收培养液并计测细胞数后，利用离心操作分离为培养上清液和细胞部分。将回收到的细胞部分悬浮于200μl的20mM Tris-HCl(pH7.4)、20mMNaCl、3mMMgCl2溶液中并进行超声波处理后，利用离心操作回收上清液，加入培养上清液中。在激发波长395nm、测定波长509nm下测定出荧光强度。将各种肽标签-GFP-Flag标签蛋白的荧光强度用细胞数除，比较所得的数值而作为各种肽标签的蛋白质表达量提高效果。
＜结果＞
(1)由各种肽标签附加带来的酵母中的蛋白质的表达量提高
将所制成的基因重组酵母在给定的条件下培养，在给定的条件下提取hGH或IFNβ，利用Western分析测定出这些目标蛋白的表达量。其结果是，根据图4，在PG12的序列(序列号22)中，在向IFNβ附加了将3个S变为K的PX12-20(序列号25)时，与附加了PG12的IFNβ相比蛋白质的表达量增加。另外，对于PX12-20标签的效果，与附加于N末端相比，附加于C末端时更大，附加于N末端和C末端双方时进一步变大。
另外，图5中，对PG12及PG17的序列进行各种改变而制作肽标签，研究了对hGH的表达的影响，其结果是发现，置换PG12的S或G的氨基酸在K以外，即使是L、N、Q或R，也有高表达效果。另外，在向改变了氨基酸序列的标签上附加了蛋白酶识别序列的情况下，也维持了高表达效果。
(2)由各种肽标签附加带来的大肠杆菌中的蛋白质的表达量提高
将所制成的基因重组大肠杆菌在给定的条件下培养，在给定的条件下提取hGH或IFNβ，利用Western分析测定出这些目标蛋白的表达量。其结果是，根据图6，在将PX12-20(序列号25)及PX12-20v7(序列号38)分别附加于IFNβ上时，与附加有PG12的IFNβ相比，蛋白质的表达量增加。另外，对于PX12-20及PX12-20v7的效果，与仅附加于N末端相比，附加于N末端和C末端双方时进一步变大。另外，根据图7，对于hGH也发挥了PX12-20的效果。
(3)由各种肽标签附加带来的短小芽胞杆菌中的蛋白质的表达量提高
将所制成的基因重组短小芽胞杆菌在给定的条件下培养，在给定的条件下提取hGH，利用Western分析测定出这些目标蛋白的表达量。其结果是，根据图8，在将PX12-20(序列号25)、PX12-38(序列号52)及PX12-20v7(序列号38)分别附加于hGH上时，hGH的表达量增加。
另外，将所制成的基因重组短小芽胞杆菌在给定的条件下培养，在给定的条件下提取木聚糖酶，利用Western分析测定出这些目标蛋白的表达量。其结果是，根据图12，在将PX12-20(序列号25)附加于C末端或N末端和C末端双方时，木聚糖酶的表达量增加。
此外，将所制成的基因重组短小芽胞杆菌在给定的条件下培养，在给定的条件下提取酯酶を，利用Western分析测定出这些目标蛋白的表达量。其结果是，根据图13，在将PX12-20(序列号25)附加于N末端时，酯酶的表达量增加。
(4)由各种肽标签附加带来的毕赤酵母中的蛋白质的表达提高
将所制成的基因重组毕赤酵母在给定的条件下培养，在给定的条件下提取hGH，利用Western分析测定出这些目标蛋白的表达量。其结果是，根据图14，将PX12-20(序列号25)及PX12-20v7(序列号38)分别附加于hGH上时，hGH的表达量增加。
[表1－1]
表1.各肽标签的氨基酸序列
| Tag | 标签氨基酸序列 |
| GH(-) | - |
| RS-N | RS |
| ECM29SC-N | RSPESGAGSPRS(序列号12) |
| ECM290N-N | LGSESDDSEGSIKQ(序列号14) |
| Anjam-N | GPGPSRGSDIKLTS(序列号16) |
| PG12v5-N | RWPGSGPGWPRS(序列号18) |
| PG12v7-N | PSGPSGPGSPTS(序列号20) |
| P612-N | RSPGSGPGSPRS(序列号22) |
| PG12-C | RSPGSGPGSPRS(序列号22) |
| PG12-NC | RSPGSGPGSPRS(序列号22)-IFNβ-RSPGSGPGSPRS(序列号22) |
| PX12-20-N | RKPGKGPGKPRS(序列号25) |
| PX12-20-C | RKPGKGPGKPRS(序列号25) |
| PX12-20-NC | RKPGKGPGKPRS(序列号25)-hGH/IFNβ-RKPGKGPGKPRS(序列号25) |
| PX12-20v2-N | RKPGKGPGKPRK(序列号28) |
| PX12-20v3-N | RKPGKGPGKPTS(序列号30) |
| PX12-20v4-N | RKPGKGPGKPLS(序列号32) |
| PX12-20v5-N | TKPGKGPGKPTS(序列号34) |
| PX12-20v6-N | KKPGKGPGKPKK(序列号36) |
| PX12-20v7-N | RKPKKKPKKPRS(序列号38) |
| PX12-20v8-N | RKPGKGPGSPRS(序列号40) |
| PX12-20v9-N | RKPGSGPGKPRS(序列号42) |
| PX12-29-N | RKPGKPKGKPTS(序列号44) |
| PX12-32N | RQPGQGPGQPRS(序列号46) |
| PX12-33-N | RNPGNGPGNPRS(序列号48) |
| PX12-36-N | RLPGLGPGLPRS(序列号50) |
| PX12-38-N | RRPGRGPGRPRS(序列号52) |
| PX12-28-N | RSPKSKPKSPRS(序列号54) |
| PX12-39-N | RSPGSGPGSPTS(序列号56) |
| PX17-20-N | RKPGKGPGKPRKPGKRS(序列号58) |
| PX17-20v2-N | RKPGKGPGKPRSPGSRS(序列号60) |
| PX12-20Xa-N | RKPGKGPGKPRSIEGR(序列号62) |
| PK11v1-N | RKPGKGPGKPR(序列号64) |
| PK11v2-N | KPGKGPGKPRS(序列号66) |
| PX12-20v7-NC | RKPKKKPKKPRS(序列号38)-hGH/IFNβ-RKPKKKPKKPRS(序列号38) |
| PX12-40-N | RRPRRRPRRPRS(序列号92) |
| PX12-41-N | RRPKRKPKRPRS(序列号94) |
| PX12-43-N | RKPRKRPRKPRS(序列号96) |
| PX12-44-N | KKPKKKPKKPKK(序列号98) |
| PX17-20v7-N | RKPKKKPKKPRKPKKRS(序列号100) |
| PX17-20v8-N | RKPKKKPKKPKKPKKRS(序列号102) |
| PX13-01-N | RKPKKKPKKKPRS(序列号104) |
| PX12-45-N | RKPKKPKKPKRS(序列号106) |
| PX22-20v7-N | RKPKKKPKKPRKPKKKPKKPRS(序列号108) |
| PX32-20v7-N | RKPKKKPKKPRKPKKKPKKPRKPKKKPKKPRS(序列号110) |
[表1-2]
| PX12-20v9-N | RKPKSKPKKPRS(序列号112) |
| PX12-20v10-N | RKPKGKPKKPRS(序列号114) |
| PX12-20v12-N | RKPGKKPGKPRS(序列号116) |
| PX12-20v13-N | RKPGGKPGKPRS(序列号118) |
| PK10v2-N | RKPKKKPRKP(序列号120) |
| PK09v2-N | RKPKKKPRK(序列号122) |
| PK10v3-N | RPKKKPKKPR(序列号124) |
| PK08v3-N | RPKRKPRK(序列号126) |
| PK09v3-N | PRKPRKPRK(序列号128) |
| PK09v4-N | PKRPKRPKR(序列号130) |
| PX12-49-N | RKPKLKPKKPRS(序列号132) |
| PX12-51-N | RRPLRLPLRPRS(序列号134) |
| PX12-52-N | RQPKQKPKQPRS(序列号136) |
| PX1254N | RQPKKKPKQPRS(序列号138) |
| PX12-61-N | RHPKHKPKHPRS(序列号140) |
| PX12-62-N | RNPKNKPKNPRS(序列号142) |
| PX12-40v2-N | RRPRRPRRPRRS(序列号143) |
| PX12-41v2-N | RRPKRPKRPKRS(序列号145) |
| PX12-45v2-N | RKPKKPKKPRS(序列号147) |
| PX12-45v3-N | RKPKKPKKPKKRS(序列号149) |
| PX12-75-N | RKPGSKPGKPRS(序列号151) |
| PX12-76-N | RKPQQKPQKPRS(序列号153) |
| PX12-77-N | RRPGSRPGRPRS(序列号155) |
| PX12-78-N | RKPKPKPKPRS(序列号157) |
[表2-1]
[表2－2]
[表2－3]
[表3]
(5)由各种肽标签附加带来的昆虫细胞及哺乳动物细胞中的蛋白质的表达提高
将所制成的基因重组昆虫细胞及哺乳动物细胞在给定的条件下培养，在给定的条件下测定出GFP的荧光。
其结果是，如图15所示，在昆虫细胞中表达附加有各种肽标签的GFP的情况下，附加有PX12-20标签或PX12-20v7标签的蛋白质与没有附加标签的情况相比，表达量得到增强。
其结果是，如图16所示，在哺乳类细胞中表达附加有各种肽标签的GFP的情况下，附加有PX12-20标签的蛋白质与没有附加标签的情况相比，表达量得到增强。
产业上的可利用性
本发明的肽标签在基因工程、蛋白质工程等领域中有用，本发明的附加有肽标签的蛋白质在医疗、研究、食品、畜产等领域中有用。
Claims (13)
1.一种肽，其由序列号25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、64、66、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、140、142、143、145、147、149、151、153、155、或157的氨基酸序列组成。
2.一种带有标签的蛋白质，其包含权利要求1所述的肽和有用蛋白质。
3.根据权利要求2所述的带有标签的蛋白质，其中，有用蛋白质为人生长激素、干扰素β、木聚糖酶、酯酶或绿色荧光蛋白GFP。
4.根据权利要求2所述的带有标签的蛋白质，其中，所述肽与所述有用蛋白质经由蛋白酶识别序列被连结。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的带有标签的蛋白质，其包含分泌信号。
6.一种DNA，其编码权利要求2～5中任一项所述的带有标签的蛋白质。
7.一种重组载体，其包含权利要求6所述的DNA。
8.一种转化体，其由权利要求6所述的DNA或权利要求7所述的重组载体进行了转化，其中，转化体为原核细胞、酵母或昆虫细胞。
9.根据权利要求8所述的转化体，其中，转化体为大肠杆菌或短小芽胞杆菌。
10.一种制作转化体的方法，所述方法包括通过权利要求6所述的DNA或权利要求7所述的重组载体转化宿主细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞为植物细胞或哺乳动物细胞，然而不包括人个体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包括人培养细胞。
13.一种带有标签的蛋白质的制造方法，其特征在于，培养权利要求8或9所述的转化体或培养通过权利要求10～12中任一项所述的方法制作的转化体而蓄积带有标签的蛋白质，并回收带有标签的蛋白质。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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