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TW201726173A - 化學鎖固之雙特異性抗體 - Google Patents

化學鎖固之雙特異性抗體 Download PDF

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TW201726173A
TW201726173A TW105137932A TW105137932A TW201726173A TW 201726173 A TW201726173 A TW 201726173A TW 105137932 A TW105137932 A TW 105137932A TW 105137932 A TW105137932 A TW 105137932A TW 201726173 A TW201726173 A TW 201726173A
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antibody
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燕文 傅
古納 F 考夫曼
詹姆士 派特森
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Abstract

本發明提供具有式I之雙特異性抗體化合物：□其中，FAB1、FAB2及-X-係如本文中所定義。所提供的雙特異性抗體化合物可用作靶分子(包括CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet或Axl)之調節劑，且可用於治療一或多種病症。

Description

化學鎖固之雙特異性抗體
雙特異性抗體為具有兩種不同結合特異性之抗體或抗體樣分子。因為這個獨特的特徵，雙特異性抗體不僅可將治療劑(例如T細胞及藥物)與標靶(例如腫瘤)連接，它們還可以阻斷個別病原介質。已顯示抗癌症、自體免疫疾病及發炎性疾病之臨床成就及令人印象深刻的治療概況。參見，例如，MAbs.2009 Nov-Dec；1(6)：539-547。鑒於其擴大之治療潛力，仍需要識別新的雙特異性抗體。
現已發現具有通式I之雙特異性抗體化合物： 或其醫藥上可接受之鹽，及含該等雙特異性抗體化合物之組合物(其中，FAB1、FAB2及-X-係如本文中所定義)為有效的治療劑(例如，在治療癌症中)。參見，例如，圖9-12。
此外，以商業上相關之產率及量製得本文中所述之雙特異性抗體化合物及組合物係經下列程序：利用對現成抗體或細胞(例如CHO細胞)進行消化分解、經過簡單結合製程，且引發排他性地形成雜二聚體(具有高雙特異性抗體組裝產率)。該等製程可降低針對各抗體之大規模蛋白質工 程、複雜遺傳技術及辛苦生物化學製程之傳統的要求。
圖1提供生產如本文中所述之雙特異性抗體化合物之示意圖。
圖2說明合成例示性雙特異性抗體中所涉及中間物之SDS-PAGE凝膠分析。
圖3說明雙特異性抗體化合物105之疏水性相互作用層析(HIC)分析。
圖4說明雙特異性抗體化合物105同時地與Octet Red上兩個抗原結合。
圖5說明從全長IgG1抗體消化且純化後之SDS-PAGE分析。
圖6說明PSMA F(ab)及CD3 F(ab)於從全長PSMA IgG1及全長CD3 IgG1消化且純化後之疏水性相互作用層析(HIC)分析。
圖7顯示用於形成PSMA/CD3雙特異性抗體化合物106、107、108及109之一般合成方案。
圖8顯示αPSMA F(ab)及中間物αPSMA F(ab)-PEG4-疊氮化物及αPSMA F(ab)-PEG8-疊氮化物於環化前之HIC分析。
圖9顯示αCD3 F(ab)及中間物αCD3 F(ab)-PEG4-DBCO及αCD3 F(ab)-PEG8-DBCO於環化前之HIC分析。
圖10顯示αPSMA/αCD3雙特異性抗體化合物106、107、108及109之SDS-PAGE分析。
圖11顯示雙特異性抗體化合物108於LnCaP及PC3細胞中之殺死%對濃度。
圖12顯示雙特異性抗體化合物109於LnCaP及PC3細胞中之殺死%對濃度。
相關申請案
本申請案主張2015年11月18日申請之美國臨時申請案第62/257,044號之優先權。
序列表
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式電子呈送且其全部內容以引用的方式併入本文中。創建於2016年11月16日之該ASCII副本名為126036-00420_SL.txt及係15,301個字組大小。
本文中提供具有式I之雙特異性抗體化合物： 其中，FAB1表示第一Fab片段；FAB2表示第二Fab片段；及-X-表示將FAB1與FAB2共價連接在一起之視需要經取代三唑基。
定義
如本文中所使用，術語「抗體」係指由四個多肽鏈(兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈)，或其任何功能性片段(例如Fab片段)、突變體、變體或衍生物(例如式I之雙特異性抗體化合物)組成之任何免疫球蛋白(Ig)分子。該突變體、變體或衍生之抗體形式為技藝已知。在全長抗體中，各重鏈係由重鏈可變區(本文中簡稱為HCVR或VH)及重鏈恒定區組成。重鏈恒定區係由三個結構域CH1、CH2及CH3組成。各輕鏈係由輕鏈可變區(本文中簡稱為LCVR或VL)及輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區係由一個結構域CL組成。該等VH及VL區可進一步再分為命名為互補決定區(CDR)之高變區，其內部分散更加保守之命名為框架區(FR)的區域。各VH及VL係由自胺基端至羧基端按以下順序配置之三個CDR及四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可係任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類別。在一些實施例中，抗體為全長抗體。在一些實施例中，抗體為鼠類抗體。在一些實施例中，抗體為人類抗體。在一些實施例中，抗體為人類化抗體。在其他實施例中，抗體為嵌合抗體。可由熟習此項技藝者熟知的方法來製備嵌合及人類化抗體，熟知的方法包括CDR接枝方法(參見，例如，美國專利第5,843,708號；第6,180,370號；第5,693,762號；第5,585,089號；及第5,530,101號)、鏈改組策略(參見，例如，美國專利第5,565,332號；Rader等人(1998)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA 95：8910-8915)、分子建模策略(美國專利第5,639,641號))。在一個實施例中，本文中所述之抗體(例如，FAB1及FAB2)不包含鉸鏈區。
術語「雙特異性抗體」係指由四個多肽鏈(兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈)，或其任何功能性片段(例如Fab片段)、突變體、變體、或衍生物(例如式I之雙特異性抗體化合物)組成之任何免疫球蛋白(Ig)分子(例如式I之雙特異性抗體化合物)，其可與兩個不同抗原決定基結合。在一個實施例中，雙特異性抗體係與相同抗原上之兩個不同抗原決定基結合。在一個實施例中，雙特異性抗體係與兩個不同抗原上之抗原決定基結合。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體係式I之雙特異性抗體，其中FAB1及FAB2不包含鉸鏈區。
如本文中所使用，術語抗體之「抗原結合部分」(或簡單而言「抗體部分」)係指保留特異性結合至抗原之能力之抗體的一或多個片段。已經顯示，抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體的片段執行。該等抗體實施例亦可係雙特異性、雙重特異性，或多特異性形式；具體而言係與兩個或更 多個不同抗原結合。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」之內的結合片段的實例包括(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包括藉由雙硫橋在鉸鏈區連接的兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂的VL及VH結構域組成之Fv片段，及(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341：544-546；及Winter等人，PCT公開案第WO 90/05144 A1號)。
技藝中已知各種用於生產抗體片段之技術。抗體片段可經由完整抗體之蛋白水解消化而得到(參見，例如，Morimoto等人，J Biochem Biophys.Method.24：107-117(1992)；及Brennan等人，Science 229：81(1985))。亦可直接藉由重組宿主細胞生產抗體片段。例如，Fab、Fv及scFv抗體片段皆可在大腸桿菌(E.coli)中表現並分泌出來，因此可輕易地生產出大量此等片段。抗體片段可分離自下述抗體噬菌體庫。此等片段可如本文中所述結合。
如本文中可互換使用，術語「Fab」或「FAB」或「Fab片段」係指為具有VL、VH、CL及CH1結構域之單價片段之抗體片段。除非另作指明，否則Fab不包含將重鏈之CH1及CH2結構域連接之Fc區或鉸鏈區。F(ab)2係指式I之雙特異性抗體化合物。在一個態樣中，術語「FAB1」或「FAB2」係指抗體之Fab片段。在一個態樣中，FAB1及FAB2不包含鉸鏈區。
如本文中所使用，術語「人類抗體」係指具有一或多個衍生自人類免疫球蛋白序列之可變及恒定區之重組抗體。在一個實施例中，所有該等可變及恒定結構域係衍生自人類免疫球蛋白序列(完全人類抗體)。可依多 種方法製備人類抗體，下文描述該等方法之實例，包括藉由以小鼠之經基因改造以表現衍生自人類重鏈及/或輕鏈編碼基因之抗體之所述抗原進行免疫。
術語「人類化抗體」係指包含至少一個含實質上源自人類抗體鏈(稱為受體免疫球蛋白或抗體)之可變區框架殘基之鏈及至少一個實質上源自非人類(例如小鼠)抗體(稱為供體免疫球蛋白或抗體)之CDR之抗體。參見，在Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029 10033(1989)、美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,761號、第WO 90/07861號，及美國專利第5,225,539號中所描述之製造方法，該等案件之各者係以引用的方式併入本文中。恒定區(若存在)亦可實質上或完全地源自人類免疫球蛋白。技藝中已知製造人類化抗體之方法。參見，例如，美國專利第7,256,273號，該案係以引用的方式併入本文中。在一個實施例中，非人類物種抗體之重鏈及/或輕鏈之框架及恒定結構域中的某些胺基酸係經突變以生產人類化抗體。如何製造人類化抗體之其他實例可參見美國專利第6,054,297號；第5,886,152號；及第5,877,293號，該等案件之各者係以引用的方式併入本文中。
如本文中所使用，「抗原決定基」為抗體所結合的分子之一部分。在一個實施例中，抗原決定基可包含分子之非連續部分(例如，在多肽中，為在多肽一級序列中非連續但在多肽三級及四級結構內文中彼此近到足夠被抗原結合蛋白質所結合之胺基酸殘基)。
術語「經分離之」係指自至少一種通常與分子之天然來源有關之污染分子加以鑑別並分離出來之分子。較佳地，該經分離之分子係與其天然相關之所有組分沒有結合關係。在一個態樣中，分離所述抗體。
如本文中所使用，「經取代三唑基」係指經一或多個不會實質上改變一或多種本文中所述雙特異性抗體化合物之生產、偵測且在某些實施例中回收、純化，及用途之條件的基團取代之三唑基。連接點可係在任何可取代位置且包括，例如，1,2,3-三唑基(例如，1,4；1,5；4,5；及1,4,5取代)及1,2,4-三唑基(例如，3,4；3,5；4,5；及3,4,5取代)。
側氧基係指官能基「=O」(氧原子經雙鍵與另一原子連接之取代基)。
術語「烷基」意指飽和直鏈或分支鏈單價烴基。如本文中所使用，「(C2-C20)烷基」意指在直鏈或分支鏈配置中具有2至20個碳原子之基團。在定義之處，烷基可間雜一或多個選自O、N及S之雜原子。
術語「炔」係指在兩個碳原子之間含有至少一個碳-碳三鍵之不飽和烴。末端炔意指兩個碳原子之間的碳-碳三鍵係在碳鏈的末端，例如，就像在該處有至少一個氫原子與經三鍵連接之碳原子連接(例如戊-1-炔)。
術語「芳基」係指除非另作指明否則具有總共6至14個環成員之芳族單環或雙環碳環系統。術語「芳基(aryl)」可與術語「芳環」、「芳基(aryl group)」、「芳基基團(aryl moiety)」或「芳基(aryl radical)」互換使用。芳族碳環與一或多個碳環基環稠合之基團(例如四氫萘基)亦包含於如本文中所使用之術語「芳基」之範圍內。在本發明之某些實施例中，「芳基」係指芳族環系統，其包括(但不限於)苯基(簡稱為「Ph」)、萘基及類似者。應明瞭，當在指明的情況下，芳基(例如，就視需要經取代芳基或視需要進行取代之芳基而言)上視需要選用之取代基可存於任何可取代位置(即，任何的經氫取代之環碳)上。
單獨地使用或用作「雜芳基烷基」、「雜芳基烷氧基」或「雜芳基 胺基烷基」中大基團的一部分之術語「雜芳基」係指含1-4個選自N、四級銨陽離子、O及S之雜原子之5-10員芳族基團，且包括(例如)噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、吡啶基、嗒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基及喋啶基。術語「雜芳基(heteroaryl)」可與術語「雜芳環」、「雜芳基(heteroaryl group)」或「雜芳族基(heteroaromatic)」互換使用。非限制性實例包括吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、吡咯并吡啶基、喹啉基、喹唑啉基及喹噁啉基。應明瞭，當在指明的情況下，雜芳基上視需要選用之取代基可存於任何可取代位置(碳及氮)上。
如本文中所使用，術語「碳環基」意指單環烴環系統、雙環(例如，橋接雙環或螺雙環)烴環系統、多環(例如，三環或更多環)烴環系統或完全飽和或包含一或多個單位之部分不飽和性但其中不存在芳環之稠合烴環系統。環烷基為完全飽和碳環。單環碳環基包括(但不限於)環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環庚基、環庚烯基及環辛基。橋接雙環碳環基包括(但不限於)雙環[3.2.1]辛烷、雙環[2.2.1]庚烷、雙環[3.1.0]己烷及類似者。螺雙環碳環基包括(例如)螺[3.6]癸烷、螺[4.5]癸烷及類似者。稠合碳環包括(例如)十氫萘、八氫并環戊二烯及類似者。多環碳環包括(例如)雙環[6.1.0]壬烷及1,4,5,5a,6,6a,7,8-八氫環丙[5,6]環辛烷并[1,2-d][1,2,3]三唑。應明瞭，當在指明的情況下，碳環基(例如，就視需要經取代碳環基或經取代碳環基)上視需要選用之取代基可存於任何可取代位置(且包括(例如)碳環基所連接的位置)上。
術語「雜環基」意指含1至4個獨立地選自N、O及S之雜原子之3-12 員(例如，4-、5-、6-、7-及8員)飽和或部分不飽和雜環。其可係單環、雙環(例如，橋接雙環、稠合雙環或螺雙環)或多環(例如，三環或更多環)。本文中，術語「雜環」、「雜環基(heterocyclyl)」、「雜環基環」、「雜環基(heterocyclic group)」、「雜環基團(heterocyclic moiety)」及「雜環基(heterocyclic radical)」可互換使用。雜環基環可在任何導致穩定結構之雜原子或碳原子處與其側基連接。該等飽和或部分不飽和雜環基之實例包括(但不限於)四氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫哌喃基、吡咯啶基、吡啶酮基、吡咯啶酮基、哌啶基、噁唑啶基、哌嗪基、二氧雜環己烷基、二氧雜環戊烷基、嗎啉基、二氫呋喃基、二氫哌喃基、二氫吡啶基、四氫吡啶基、二氫嘧啶基、3-氮雜雙環[3.1.0]己烷基、2-氧雜-6-氮雜螺[3.3]庚烷基、1-氮雜螺[4.5]癸烷及四氫嘧啶基。術語「雜環基」亦包括(例如)稠合至另一不飽和雜環基或芳基或雜芳基環(諸如(例如)四氫萘啶、吲哚啉酮、二氫吡咯并三唑、咪唑并嘧啶、喹啉酮及二氧雜螺癸烷)之不飽和雜環基。多環(例如三環或更多環)雜環基之實例包括(但不限於)5,6,11,12-四氫二苯并[b,f]氮環辛四烯(azocine)及8,9-二氫-1H-二苯并[b,f][1,2,3]三唑并[4,5-d]氮環辛四烯。應明瞭，當在指明的情況下，雜環基上視需要選用之取代基可存於任何可取代位置(且包括(例如)連接雜環基之位置(例如，就視需要經取代雜環基或視需要進行取代之雜環基而言))上。
術語「螺」係指共享一個環原子(例如碳)之兩個環。
術語「稠合」係指共享兩個相鄰環原子之兩個環。
術語「橋接」係指共享至少三個環原子之兩個環。
如本文中所述，存於經取代三唑基上之基團可經進一步取代或包含 「視需要經取代之」基團。例如，視需要經取代烷基、視需要經取代吡唑基、視需要經取代碳環、視需要經取代多環雜環系統等。除非另有指示，否則「視需要經取代之」基團可具有導致形成穩定或化學可用的化合物之適宜取代基。如本文中所使用，術語「穩定」係指當針對一或多個本文所述目的處在允許其製造、檢測，且在某些實施例中，其回收、純化，及用途之條件時實質上不改變之基團。
在一個態樣中，視需要經取代或經取代烷基、碳環基或雜環基之適宜取代基為彼等實質上不減少雙特異性抗體化合物產量者。實例包括鹵素、CN、-ORc、-NRdRe、-S(O)iRc、-NRcS(O)2Rc、-S(O)2NRdRe、-C(=O)ORc、-OC(=O)ORc、-OC(=O)Rc、-OC(=S)ORc、-C(=S)ORc、-O(C=S)Rc、-C(=O)NRdRe、-NRcC(=O)Rc、-C(=S)NRdRe、-NRcC(=S)Rc、-NRc(C=O)ORc、-O(C=O)NRdRe、-NRc(C=S)ORc、-O(C=S)NRdRe、-NRc(C=O)NRdRe、-NRc(C=S)NRdRe、-C(=S)Rc、-C(=O)Rc、(C1-C6)烷基、環烷基、-(CH2)1-4-環烷基、雜環基、-(CH2)1-4-雜環基、芳基、-NHC(=O)-雜環基、-NHC(=O)-環烷基、-(CH2)1-4-芳基、雜芳基或-(CH2)1-4-雜芳基，其中該(C1-C6)烷基、環烷基、-(CH2)1-4-環烷基、雜環基、-(CH2)1-4-雜環基、芳基、-(CH2)1-4-芳基、雜芳基及-(CH2)1-4-雜芳基中之各者係視需要經鹵素、ORc、-NO2、-CN、-NRcC(=O)Rc、-NRdRe、-S(O)kRc、-C(=O)ORc、-C(=O)NRdRe、-C(=O)Rc、(C1-C3)烷基、鹵基(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基及鹵基(C1-C3)烷氧基取代，其中Rc為氫或視需要經1至3個鹵素取代之(C1-C6)烷基；Rd與Re各自獨立地選自氫及(C1-C6)烷基；且k為0、1或2。視需要經取代烷基、碳環基及雜環基之適宜取代基亦包括側氧 基(=O)。
本文中所述之雙特異性抗體化合物可呈醫藥上可接受之鹽形式存在。就在藥物中之用途而言，醫藥上可接受之鹽係指非毒性醫藥上可接受之鹽。醫藥上可接受之鹽形式包括醫藥上可接受之酸性/陰離子或鹼性/陽離子鹽。本文中所述化合物之適宜醫藥上可接受之酸加成鹽包括(例如)無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸及硫酸)之鹽及有機酸(諸如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、甲磺酸及對甲苯磺酸)之鹽。適宜之醫藥上可接受之鹼性鹽包括(例如)銨鹽、鹼金屬鹽(諸如鈉鹽及鉀鹽)及鹼土金屬鹽(諸如鎂鹽及鈣鹽)。
如本文中所使用，術語「治療(treatment、treat以及treating)」係指逆轉、緩解、延遲如本文中所述之疾病或病症，或其一或多種症狀之發作，或抑制其發展。在一些實施例中，可在已發展出一或多種症狀後投與治療，即，治療性治療。在其他實施例中，可在無症狀下投與治療。例如，可在症狀發作(例如，根據歷史症狀且/或根據遺傳或其他易患病因素)前對易患病個體投與治療，即，預防性治療。亦可在症狀已消除後繼續治療，例如防止或延遲其復發。
術語「個體」及「患者」可互換使用，且意指需要治療之哺乳動物，例如，寵物(例如，狗、貓及類似者)、農場動物(例如，牛、豬、馬、羊、山羊及類似者)及實驗室動物(例如，大鼠、小鼠、天竺鼠及類似者)。通常，個體為需要治療的人類。
雙特異性抗體化合物及其製造方法
在第一例示性實施例中，式I之雙特異性抗體化合物係式II、IIa、III或IIIa之雙特異性抗體化合物： 其中R1與R2各自獨立地為經取代烷基；環A為經取代碳環基或經取代雜環基；且Ra與Rb各自獨立地選自 及；其中Q、T及V各自獨立地為N或CH；「」指示對FAB1或FAB2的連接點且「------」指示對R1或R2的連接點，且其中其餘的變數及值係如針對式I所述。
在第二例示性實施例中，式I、III或IIIa中之環A為經取代雙環或多環碳環基或經取代多環雜環基，其中其餘的變數及值係如針對式I或第一例示性實施例所述。
在第三例示性實施例中，環A為 或；其中虛線鍵指示對三唑基的連接點及波形鍵指示對R2的連接點，且其中其餘的變數及值係如針對式I或第一 或第二例示性實施例所述。
在第四例示性實施例中，式I、II、IIa、III或IIIa中之R1及R2各自獨立地為視需要經取代(C2-C30)烷基，該視需要經取代(C2-C30)烷基視需要間雜一或多個選自N、O及S之雜原子，其中其餘的變數及值係如針對式I或第一、第二或第三例示性實施例所述。
在第五例示性實施例中，式I、II、IIa、III或IIIa中之R1及R2各自獨立地為視需要間雜一或多個選自N及O之雜原子之經取代(C2-C30)烷基，其中其餘的變數及值係如針對式I或第一、第二、第三或第四例示性實施例所述。
在第六例示性實施例中，式I、II、IIa、III或IIIa中之R1及R2各自獨立地為間雜至少一個O及至少一個N且經至少一個側氧基取代之(C2-C30)烷基，其中其餘的變數及值係如針對式I或第一、第二、第三、第四或第五例示性實施例所述。
在第七例示性實施例中，式I、II、IIa、III或IIIa中之R1及R2各自獨立地選自 波形線指示對Ra或Rb的連接點；虛線指示對三唑基或環A的連接點；且p及w獨立地為1至8之整數，其中其餘的變數及值係如針對式I或第一、第二、第三、第四、第五或第六例示性實施例所述。
在第八例示性實施例中，式I、II、IIa、III或IIIa中之R1係選自 其中波形線指示對Ra的連接點；且虛線指示對三唑基的連接點，且其中其餘的變數及值係如針對式I或第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七例示性實施例所述。
在第九例示性實施例中，式I、II、IIa、III或IIIa中之R2係選自 ；波形線指示對Ra的連接點；且虛線指示對三唑基或環A的連接點，其中其餘的變數及值係如針對式I或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八例示性實施例所述。
在第十例示性實施例中，式I、II、IIa、III或IIIa中之Ra及Rb係經FAB1及FAB2之天然半胱胺酸與FAB1及FAB2連接，其中其餘的變數及值係如針對式I或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九例示性實施例所述。或者，式I、II、IIa、III或IIIa中之Ra及Rb係經負責形成FAB1及FAB2之鏈間雙硫鍵之天然半胱胺酸與FAB1及FAB2結合，其中其餘的變數及值係如針對式I或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九例示性實施例所述。
在第十一例示性實施例中，式I之雙特異性抗體化合物係下式之雙特異性抗體化合物： 或其醫藥上可接受之鹽，其中FAB1與FAB2係經天然半胱胺酸殘基與吡咯啶-二酮連接。
在第十三實施例中，式I之雙特異性抗體化合物係下式之雙特異性抗體化合物： 或其醫藥上可接受之鹽，其中FAB1與FAB2係經天然半胱胺酸殘基與吡咯啶-二酮連接。
在第十四實施例中，本文中所述之任一雙特異性抗體化合物中之FAB1及FAB2各自獨立地選自含CD3結合區之Fab片段及含PSMA結合區之Fab片段。
根據以下反應方案及實例，或其修改，使用可輕易取得的起始材料、試劑及習知的合成程序，可輕易地製備本文中所述之雙特異性抗體化合物。此外，可參考以下如March，Advanced Organic Chemistry，第3版，John Wiley & Sons，1985、Greene及Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第2版，John Wiley & Sons，1991，及Richard Larock，Comprehensive Organic Transformations，第4版，VCH publishers Inc.，1989中所述之適宜合成方法之參考文獻。
可根據圖1中所顯示之一般反應方案製備式I之雙特異性抗體化合物。在第一方法中，藉由如例如圖1中所述之消化(諸如木瓜酶消化)移除全長FAB之Fc片段及鉸鏈區。接著選擇性地還原FAB1及FAB2以形成Fab片段。官能基部分X或Y(其中X或Y中一者為疊氮化物(N3)及X或Y中另一者為炔)藉由基於半胱胺酸之結合引入至各Fab中，圖1中分別得到經化學修飾的Fab片段。官能基部分X及Y較佳藉由與各Fab片段之恒定區(即，輕鏈CL區及重鏈CH1恒定區)中之半胱胺酸殘基結合引入。
為達成化學鍵聯，將重鏈之CH1及輕鏈之CL中之半胱胺酸殘基還原。在一個實施例中，如本文中所述，將形成鏈間雙硫鍵之天然半胱胺酸還原並用於化學修飾Fab片段。在一個實施例中，起始抗體可包含引入額外半胱胺酸殘基的重鏈及輕鏈恒定區(分別為CH1及CL)中之修飾。
接著，藉由X部分與Y部分間化學接合將兩Fab片段鍵聯在一起，以形成X-Y，其在式I之雙特異性抗體化合物中與變數「-X-」相關。
例如，在雙特異性抗體化合物以式II表示之情況下，疊氮化物可連接至R1及末端炔可連接至R2，其中將發生接合以形成三唑基。參見以下方案1。
應明瞭，亦可相反使用，於該情況下，疊氮化物連接至R2及末端炔在R1上，以形成由式IIa表示之雙特異性抗體化合物。
在另一個實例中，在雙特異性抗體化合物以式III表示之情況下，疊氮化物可連接至R1及炔可連接至R2，於該情況下，將發生接合以形成三唑基。參見以下方案2。
應明瞭，亦可相反使用，於該情況下，疊氮化物連接至R2，而炔係在R1上，以形成由式IIIa表示之雙特異性抗體化合物。
在一個態樣中，FAB1及FAB2各自能夠結合相同或不同抗原上的兩個不同抗原決定基。在一個實施例中，FAB1及FAB2係與相同抗原上的兩個不同抗原決定基結合。在一個實施例中，FAB1及FAB2係與兩個不同抗原結合。
在一個實施例中，FAB1及FAB2各自獨立地為IgG1或IgG4同型。在一個實施例中，FAB1及FAB2各為IgG1同型。在一個實施例中，FAB1及FAB2各為IgG4同型。在一個實施例中，FAB1為IgG1同型及FAB2為IgG4 同型。在另一個實施例中，FAB2為IgG1同型及FAB1為IgG4同型。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與選自由CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet及Axl組成之群的靶分子結合。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與選自以下群的抗原對結合：CD3-PSMA、CD3-CD19、CD3-CXCR5、CD3-CD33、PDL1-VEGFR2、PDL1-cMet、PDL1-Axl。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與CD3上的兩個抗原決定基結合或與CD3及另一靶分子結合。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含BLINCYTO(Blinatumomab；Amgen)之與CD3結合部分對應之CD3結合區(例如，Fab片段)。在另一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與抗-CD3抗體(HuM291、UCHT1或OKT3)對應之Fab片段。在另一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與抗-CD3抗體對應之Fab片段，該抗-CD3抗體包含含胺基酸序列 (SEQ ID NO：5)之重鏈區；或含SEQ ID NO：5之重鏈；及含胺基酸序列 (SEQ ID NO：6)之輕鏈區；或含SEQ ID NO：6之輕鏈區。
在另一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與抗-CD3抗體對應之Fab片段，該抗-CD3抗體包含含胺基酸序列 (SEQ ID NO：9)之重鏈可變區(HCVR)；或含SEQ ID NO：9之重鏈；及含胺基酸序列 (SEQ ID NO：6)之輕鏈區；或含SEQ ID NO：6之輕鏈區。在另一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與抗-CD3抗體對應之Fab片段，該抗-CD3抗體包含含胺基酸序列 (SEQ ID NO：7)之重鏈區；或含SEQ ID NO：7之重鏈區；及含胺基酸序列 (SEQ ID NO：8)之輕鏈區。在另一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與抗-CD3抗體對應之Fab片段，該抗-CD3抗體包含含胺基酸序列 (SEQ ID NO：10)之重鏈可變區；或含SEQ ID NO：10之HCVR及含胺基酸序列 (SEQ ID NO：8)之輕鏈區。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與前列腺特異性膜抗原蛋白(PSMA)上的兩個抗原決定基結合或與PSMA及另一靶分子結合。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與抗體3D8、4D4及/或3E11對應之Fab片段，該等抗體述於US 2007/0031438中，該案之內容係以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與CD19上的兩個抗原決定基結合或與CD19及另一靶分子結合。在一個實施例中，本 文中所述之雙特異性抗體化合物包含BLINCYTO(Blinatumomab；Amgen)之與CD3結合部分(例如，Fab片段)對應之CD19結合區。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與CXCR5上的兩個抗原決定基結合或與CXCR5及另一靶分子結合。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與2015年8月12日申請之美國專利申請案第14/825,144號中所述的抗-CXCR5抗體對應之Fab片段，該案之內容係以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與CD33上的兩個抗原決定基結合或與CD33及另一靶分子結合。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與PDL1上的兩個抗原決定基結合或與PDL1及另一靶分子結合。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與US 2013/0323249及WO 2013/181634中所述的抗-PDL-1抗體對應之Fab片段，該等案之內容係以引用的方式併入本文中。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與如US 2013/0323249中所述之抗-PDL-1抗體H6B1L之Fab片段對應之胺基酸序列，該案之內容係以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與抗-PDL-1抗體對應之Fab片段，該抗-PDL-1抗體包含含胺基酸序列 (SEQ ID NO：1)之重鏈可變區，或含SEQ ID NO：1中描述的CDR序列之HCVR；及含胺基酸序列 (SEQ ID NO：2)之輕鏈可變區，或含SEQ ID NO：2中描述的CDR序列之LCVR。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與VEGFR2上的兩個抗原決定基結合或與VEGFR2及另一靶分子結合。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與US 2014/0294827及WO 2013/149249中所述的抗-VEGFR2抗體對應之Fab片段，該等案之內容分別係以引用的方式併入本文中。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與如US 2014/0294827中所述的抗-VEGFR2抗體VK-B8之Fab片段對應之胺基酸序列，該案之內容係以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物包含與抗-VEGFR2抗體對應之Fab片段，該抗-VEGFR2抗體包含含胺基酸序列 (SEQ ID NO：3)之重鏈可變區，或含SEQ ID NO：3中描述的CDR序列之HCVR；及含胺基酸序列 (SEQ ID NO：4)之輕鏈可變區，或含SEQ ID NO：4中描述的CDR序列之LCVR。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與cMet上的兩個抗原決定基結合或與cMet及另一靶分子結合。在一個實施例中，本 文中所述之雙特異性抗體化合物包含與美國專利申請案第13/924492號及PCT WO 2013/192594中所述的抗-cMet抗體對應之Fab片段，該等案之內容係以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與Axl上的兩個抗原決定基結合或與Axl及另一靶分子結合。
可使用技藝中已知的標準重組方法來製造用於本文中所述之雙特異性抗體化合物中之Fab片段。在一個實施例中，生產全長抗體(即，包含Fab區、鉸鏈區及Fc區之抗體)且隨後消化以提供用於本文中所述之雙特異性抗體化合物中之Fab片段。或者，在宿主細胞中生產Fab片段，此不需要消化全長抗體。
本文中所述之生產方法可應用於全長抗體及其片段(包括Fab片段)。
技藝中已知重組抗體之生產。例如，為重組生產抗體，分離出可編碼該抗體之核酸，並將該核酸插入至複製型載體中，以供進一步選殖(DNA擴增)或表現。編碼該單株抗體之DNA可利用習知步驟輕易地分離並加以定序(例如，藉由利用能夠特異性結合編碼抗體重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)。許多載體是可以使用的。載體之選擇部分取決於欲使用的宿主細胞。一般而言，較佳的宿主細胞係源自原核細胞或真核細胞(一般而言哺乳動物)。
在一個實施例中，使用原核細胞來生產抗體。將編碼多肽之序列插入至能夠複製並表現原核宿主中之異源多核苷酸之重組載體中。可使用許多可用且為技藝已知之載體。適宜載體之選擇將主要取決於欲插入至載體(且特定言之欲藉由載體轉形之宿主細胞)中之核酸的大小。各載體包含多種組分，根據其功能(異源多核苷酸之擴增或表現，或二者)及其與其存在 的特定宿主細胞之相容性改變。該等載體組分一般包括(但不限於)：複製起點、篩選標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入及轉錄終止序列。
適用於表現抗體之原核宿主細胞包括古細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏-陰性或革蘭氏-陽性生物。有用細菌之實例包括埃希氏菌(Escherichia)(例如，大腸桿菌(E.coli))、桿菌(例如，枯草桿菌(B.subtilis))、腸內菌、假單胞菌物種(例如，綠膿假單胞菌(P.aeruginosa))、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、志賀氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)或副球菌(Paracoccus)。在一個實施例中，使用革蘭氏-陰性細胞。在一個實施例中，大腸桿菌細胞用作宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington,D.C.：American Society for Microbiology，1987)，第1190-1219頁；ATCC寄存編號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 fhuA(tonA)ptr3 lac Iq lacL8 ompT(nmpc-fepE)degP41 kan.sup.R之菌株33D3(美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308(ATCC 31,608)亦適宜。此等實例係說明性而非限制。技藝中已知用於建構任何上述具有所定義的基因型之細菌之衍生物的方法且在例如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)中描述。一般必需考慮細菌細胞中複製單元(replicon)之可複製性來選擇適宜的細菌。例如，當熟知的質體(諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)用 於供給複製時，大腸桿菌、沙雷氏菌(Serratia)或沙門氏菌(Salmonella)物種可適宜地用作宿主。
原核宿主細胞係經上述表現載體轉形，並培養在經修飾成針對誘導啟動子、挑選轉形體或擴增編碼所需序列之基因之習知營養培養基中。轉形意指將DNA作為額外染色體要素或染色體組成部分引入至原核宿主中使得DNA可複製。根據所使用的宿主細胞，使用適合此等細胞之標準技術進行轉形。使用氯化鈣之鈣處理一般而言係用於包含實質細胞壁障壁之細菌細胞。轉形之另一種方法係使用聚乙二醇/DMSO。所使用的又另一技術係電穿孔。
用於生產本文中所述之雙特異性抗體化合物之原核細胞生長於技藝中已知且係適於培養所選宿主細胞的培養基中。適宜培養基之實例包括溶菌肉湯(luria broth，LB)加上必要營養補充劑。在一些實施例中，培養基亦包含基於表現載體之建構所選擇的篩選劑，以選擇性地使含表現載體之原核細胞生長。例如，將安比西林(ampicillin)添加至培養基以使表現安比西林抗性基因之細胞生長。
本文中所述之經表現的抗體蛋白質係分泌進入宿主細胞之胞外質中且從胞外質回收。蛋白質回收通常涉及破壞微生物，一般藉由諸如滲透壓劇烈改變(osmotic shock)、超音波處理或溶解之此等方法。一旦細胞破壞後，可立刻藉由離心或過濾移除細胞碎屑或完整細胞。可(例如)藉由親和力樹脂層析進一步純化蛋白質。或者，蛋白質可以被運輸至培養基中並在其中分離。可從培養物移走細胞且過濾並濃縮培養物上清液以用於進一步純化所生產的蛋白質。可使用一般已知的方法(諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點分析)來進一步分離且識別經表現的多肽。
或者，藉由發酵製程大量地進行抗體生產。各種大規模饋料批次發酵程序可用於生產重組蛋白質。大規模發酵具有至少1000公升的容量，較佳約1,000至100,000公升的容量。該等發酵器使用攪拌葉輪以分散氧及營養素，尤其係葡萄糖(較佳的碳/能量來源)。小規模發酵一般而言係指在體積容量不大於約100公升且可自約1公升至約100公升變化的發酵器中發酵。
亦可在真核宿主細胞中生產抗體。就真核細胞表現而言，載體組分為技藝中已知且通常包括(但不限於)以下一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因及增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。
真核宿主細胞係經用於生產抗體之表現或選殖載體轉形，並培養在經修飾成針對誘導啟動子、挑選轉形體或擴增編碼所需序列之基因之習知營養培養基中。用於在載體中選殖或表現DNA(即，編碼抗體之DNA)之適宜宿主細胞包括本文中所述之高等真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。在培養物中繁殖脊椎動物細胞(組織培養)已經成為例行程序。可用的哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉形之猴子腎臟CV1細胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎臟細胞株(293細胞或經次選殖以供在懸浮培養物中生長用的293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼年倉鼠腎臟細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴子腎臟細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎臟細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬科腎臟細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠(buffalo rat)肝細胞 (BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌細胞株(Hep G2)。
可將用於生產本文中所述之抗體之宿主細胞培養在各種培養基中。市售培養基(諸如Ham's F10(Sigma)、最低要求培養基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)，Sigma))適於培養宿主細胞。此外，Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)、Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)、美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號；或美國專利第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利第Re.30,985號中所述之任何培養基可用作宿主細胞之培養基。任何此等培養基可在必要時補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN.TM.藥物)、痕量元素(定義為通常以微莫耳範圍之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可包括熟習此項技藝者所知之適宜濃度之任何其他必要補充劑。培養條件(諸如溫度、pH及類似條件)就是經選擇用於表現之宿主細胞先前所採用之條件，且一般技術者會明瞭的。
一旦生產得到，進一步純化本文生產之抗體以得到實質上均質以用於進一步的分析及使用之製劑。可使用技藝中已知的標準蛋白質純化方法。以下程序為適宜純化程序的示例：免疫親和力或離子交換管柱上之分 餾、乙醇沉澱、逆相HPLC、二氧化矽或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)上的層析、聚焦層析、SDS-PAGE、硫酸銨沉澱，及凝膠過濾(使用(例如)Sephadex G-75)。
在一個實施例中，蛋白質A可在消化得到用於式I之雙特異性抗體化合物中之Fab片段前用於純化全長抗體。蛋白質A作為親和力配體之適合性取決於物種及存在於抗體中任何免疫球蛋白Fc結構域之同型。可使用蛋白質A純化以含1個、2個或4個重鏈之人類免疫球蛋白為主之抗體(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。建議將蛋白質G用於所有小鼠同型及人類3(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。
在一個態樣中，固定於固相上的蛋白質A係用於免疫親和力純化全長抗體產物。蛋白質A為源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)之以高親和力與抗體Fc區結合之41kD細胞壁蛋白質。Lindmark等人(1983)J.Immunol.Meth.62：1-13。蛋白質A所固定的固相較佳為含玻璃或二氧化矽表面之管柱，更佳係可控孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱已經塗覆試劑，諸如甘油，試圖防止污染物非特異性地黏附。接著洗滌固相以移除與固相非特異性結合之污染物。最後，藉由洗脫從固相回收所述抗體。
當利用重組技術時，抗體在細胞內、在胞外質間隙內生產，或直接分泌至培養基中。若抗體係在細胞內生產，第一步驟是藉由(例如)離心法或超過濾法移除宿主細胞或溶解片段的顆粒碎屑。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述一種用於分離經分泌至大腸桿菌胞外質間隙之抗體之步驟。簡而言之，細胞糊狀物在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲磺醯氟(PMSF)存在下解凍超過約30分鐘。細胞碎片藉由離 心法移除。若抗體係分泌至培養基中，此等表現系統之上清液通常先係利用市售蛋白濃縮過濾器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超過濾裝置)進行濃縮。任何上述步驟中皆可包括蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)以抑制蛋白水解，及可包括抗生素以防止外來污染物之生長。
可使用技藝中已知的任何數目之技術來識別抗體。較佳地，該抗體為單株抗體。單株抗體係從實質上均質抗體之群體中所得到，也就是說，除了可能少量存在之潛在天然生成的突變及/或轉譯後修飾(例如，異構化作用、醯胺化作用)之外，組成該群體之個別抗體係相同的。例如，單株抗體可利用首次由Kohler等人，Nature,256：495(1975)所描述之融合瘤方法進行製造，或者可藉由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)進行製造。
單株抗體亦可藉由重組DNA方法進行製造，諸如彼等美國專利第4,816,567號中所述及如上所述之方法。編碼單株抗體之DNA可利用習知步驟輕易地分離並加以定序(例如，藉由利用能夠特異性結合編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)。該等融合瘤細胞可充當此種DNA之較佳來源。一旦經分離，可將該DNA置於表現載體中，接著將該表現載體轉染至另一不會以其他方式產生免疫球蛋白蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌(E.coli)細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以便在此等重組宿主細胞中合成單株抗體。關於編碼抗體之DNA之細菌中重組表現的評論文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)及Pluckthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一實施例中，該等抗體可自利用McCafferty等人，Nature, 348：552-554(1990)中所述技術所生產之抗體噬菌體庫分離出來。Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分別描述利用噬菌體庫分離鼠類及人類抗體。後續出版物描述藉由鏈改組技術(chain shuffling)(Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992))，及利用組合感染及活體內重組作為建構極大型噬菌體庫之策略(Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993))來生產高親和力(nM範圍)之人類抗體。因此，此等技術係替代以傳統單株抗體融合瘤技術分離單株抗體之可行方案。
在某些實施例中，本文中所述之抗體可係人類化或人類抗體。非人類(例如，鼠類)抗體之人類化形式為嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈或片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)，其包含源自非人類免疫球蛋白之最小序列。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之互補決定區(CDR)之殘基(如本文中所用之HVR)被來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(供者抗體)(諸如小鼠、大鼠或兔子)之CDR之殘基替換。在一些實例中，人類免疫球蛋白之Fv框架殘基被對應的非人類殘基替換。人類化抗體亦可包含未見於接受者抗體或輸入性CDR或框架序列之殘基。一般而言，人類化抗體包含實質上所有至少一個，及通常兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區相當於彼等非人類免疫球蛋白之CDR區，而所有或實質上所有FR區為彼等人類免疫球蛋白一致序列之FR區。人類化抗體最佳亦包含通常來自人類免疫球蛋白之免疫球蛋白恒定區(Fc)之至少一部分。Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)及Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
可使用技藝中已知的方法來生產重組人類抗體。例如，可產生轉殖基因動物(例如小鼠)，當該等動物免疫後能夠在沒有產生內源性免疫球蛋白情況下產生出人類抗體之完整譜系。例如，已經描述將嵌合及生殖系突變小鼠中同型合子抗體重鏈鏈接區(JH)基因刪除會導致內源性抗體生產完全受到抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移在此種生殖系突變小鼠中會導致當抗原攻毒後人類抗體之生產。參見，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；美國專利第5,591,669號及WO 97/17852。
或者，可使用噬菌體展示技術在活體外從未經免疫供者之免疫球蛋白可變結構域(V)基因譜系生產人類抗體及抗體片段。McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)；Hoogenboom與Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)。根據此技術，將抗體V結構域基因以順讀一致(in-frame)方式選殖至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要外殼蛋白基因中，並以功能抗體片段展現在噬菌體顆粒表面上。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組之單股DNA複本，故基於抗體功能性質篩選亦可篩選編碼展現彼等性質之抗體之基因。因此，噬菌體模擬B細胞的部分性質。可以多種形式進行噬菌體展示，在例如，Johnson、Kevin S.及Chiswell，DavidJ.，Curr.Opin Struct.Biol.3：564-571(1993)中作出綜述。數種來源的V-基因片段可用於噬菌體展示。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)係由源自經免疫小鼠脾臟之V基因之小型隨機組合庫分離出各種抗-噁唑酮抗體。可建構未經免疫的人類供者之V基因譜系，並大體上按照Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12：725- 734(1993)所描述之技術分離出針對各種抗原(包括自體抗原)之抗體。亦可參見，美國專利第5,565,332號及第5,573,905號。
亦可用Cole等人及Boerner等人之技術製備人類單株抗體(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77頁(1985)及Boerner等人，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)。同樣地，可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入至其中內源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活之轉殖基因動物(例如小鼠)製備人類抗體。當攻毒時，就會觀察到人類抗體的生產，此在所有方面都極類似人類中所見，包括基因重組、裝配及抗體譜系。例如，在美國專利第5,545,807號；第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號中及在以下科學出版物：Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)、Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)、Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)及Lonberg與Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)中描述該方法。最後，人類抗體亦可於活體外藉由活化B細胞產生(參見美國專利第5,567,610號及第5,229,275號)。
雙特異性抗體化合物之具體實例在示例中提供。本文中包括醫藥上可接受之鹽以及該等雙特異性抗體化合物之中性形式。
在某些實施例中，本發明提供一種治療罹患由治療性標靶(例如，CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet及Axl)介導的疾病之患者(例如人類)之方法，其包括對患者投與有效量之如本文中所述之雙特異性抗體化合物或其組合物的步驟。
調配物及投藥
在某些實施例中，本發明提供一種使用包含本文中所述之雙特異性抗體化合物及醫藥上可接受之載劑之組合物來治療罹患由治療性標靶(標靶分子)(例如，CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet及Axl)介導的疾病之個體(例如人類)之方法。在某些實施例中，所提供組合物中本文中所述雙特異性抗體化合物的量為在生物樣品或個體中有效作為抑制劑或促效劑的量。在某些實施例中，調配所提供的組合物以用於投與需要該組合物的個體。在一些實施例中，調配所提供的組合物以用於非經腸或靜脈內投與個體。
術語「醫藥上可接受之載劑」係指不破壞與其一起調配的抗體之藥理學活性之非毒性載劑、佐劑或媒劑。可用於本發明組合物中之醫藥上可接受之載劑、佐劑或媒劑包括(但不限於)離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白質(諸如人類血清白蛋白)、緩衝物質(諸如磷酸鹽)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸之部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、基於纖維素之物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇)及羊毛脂。
可經口、非經腸、經吸入噴霧、經局部、經直腸、經鼻、經頰、經陰道或經由植入型容器投與本文中所述之組合物。如本文中所使用，術語「非經腸」包括皮下、靜脈內、肌內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、肝內、病灶內及顱內注射或輸注技術。
可依已知技藝使用適宜的分散劑或潤濕劑及懸浮劑來調配可注射製 劑，例如，無菌可注射水性或油性懸浮液。無菌可注射製劑亦可為非毒性的非經腸可接受之稀釋劑或溶劑之無菌可注射溶液、懸浮液或乳液。可接受之媒劑及溶劑當中可使用的是水、林格氏溶液(Ringer's solution)、U.S.P.及等滲氯化鈉溶液。此外，無菌、不揮發油通常用作溶劑或懸浮介質。基於此目的，可使用任何無刺激性不揮發油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，製備可注射劑中使用脂肪酸(諸如油酸)。
例如，藉由透過細菌截留過濾器過濾，或藉由以可在使用前溶解或分散在無菌水或其他無菌可注射介質中之無菌固體組合物形式將殺菌劑併入，可對可注射調配物進行滅菌。
亦應明瞭，針對任一特定患者之具體劑量及治療方案將取決於多種因素，包括年齡、體重、一般健康、性別、飲食、投藥時間、排泄率、藥物併用、主治醫師之判斷，及所治療特定疾病之嚴重度。組合物中所提供雙特異性抗體化合物的量亦將取決於組合物中之特定化合物。
雙特異性抗體化合物之用途
本文中所述之雙特異性抗體化合物及組合物一般而言可用於調節抗體對其具特異性之分子。可為本文中所述之雙特異性抗體化合物所結合之分子的實例包括(但不限於)CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet及Axl(包括其組合)。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與選自以下組合之抗原對結合：CD3-PSMA、CD3-CD19、CD3-CXCR5、CD3-CD33、PDL1-VEGFR2、PDL1-cMet及PDL1-Axl。
因此，在一些實施例中，本發明提供一種治療與CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet或Axl之有害活性有關 之疾病的方法，其包括投與所提供之化合物或組合物。
在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物係與選自以下之抗原或抗原組合結合：CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet及Axl，可用於治療罹患選自非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)(NHL)、前列腺癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、結腸癌、乳癌之疾病之個體。本文中所述雙特異性抗體化合物之調節標靶分子(例如，CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet及/或Axl)意指已藉由投與一或多種本文中所述雙特異性抗體化合物改變或改動標靶分子(例如，CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet及/或Axl)之活性。調節可係上調(增加)或下調(減小)標靶分子(例如，CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet及Axl)之活性或功能量值。例示性活性及功能包括(例如)結合特性、酵素活性、細胞受體活化、轉錄活性及信號轉導。
可依使用本文中所述雙特異性抗體化合物之方法治療之疾病及病症包括(但不限於)藉由對哺乳動物(例如，需要該治療之人類)投與有效量之本文所述雙特異性抗體化合物來治療或改善癌症或另一增生性疾病。在一些態樣中，欲由本文方法所治療的疾病與病症為癌症。使用本文中所述之化合物及方法治療之癌症的實例包括(但不限於)腎上腺癌、腺泡細胞癌、聽神經瘤、肢端小痣性黑色素瘤、汗腺頂端汗腺瘤、急性嗜酸性細胞白血病、急性紅血球白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性巨核胚細胞白血病、急性單核細胞白血病、急性前骨髓細胞白血病、腺癌、腺樣囊狀癌、腺瘤、牙源性腺樣瘤、腺鱗狀癌、脂肪組織腫瘤、腎上腺皮質癌、成人T 細胞白血病/淋巴瘤、侵襲性NK細胞白血病、AIDS相關淋巴瘤、肺泡型橫紋肌肉瘤、肺泡樣軟組織肉瘤、成釉細胞纖維瘤、退行性大細胞淋巴瘤、退行性甲狀腺癌、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、血管肌肉脂肪瘤、血管肉瘤、星形細胞瘤、非典型畸胎類橫紋肌樣瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病、B細胞前淋巴球性白血病、B細胞淋巴瘤、基底細胞癌、膽道癌、膀胱癌、胚細胞瘤、骨癌、睪丸小管卵巢腺瘤(Brenner tumor)、棕色瘤(Brown tumor)、伯奇氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、乳癌、腦癌、癌、原位癌、癌肉瘤、軟骨腫瘤、堊質瘤、骨髓性肉瘤、軟骨瘤、脊索瘤、絨毛膜癌、脈絡叢乳突狀瘤、腎透明細胞肉瘤、顱咽管瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、子宮頸癌、結腸直腸癌、德高斯氏病(Degos disease)、促結締組織增生性小圓細胞瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、胚胎發育不良性神經上皮瘤、惡性胚細胞瘤、胚胎癌、內分泌腺腫瘤、內胚層竇瘤、腸病相關T細胞淋巴瘤、食管癌、胎內胎(fetus in fetu)、纖維瘤、纖維肉瘤、濾泡性淋巴瘤、濾泡性甲狀腺癌、神經節細胞瘤、胃腸癌、生殖細胞瘤、妊娠性絨毛膜癌、巨細胞纖維母細胞瘤、骨巨細胞瘤、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、膠質瘤、大腦膠質瘤病、胰高血糖素瘤、性腺母細胞瘤、顆粒細胞瘤、半陰陽胚細胞瘤、膽囊癌、胃癌(gastric cancer)、毛細胞白血病、血管母細胞瘤、頭部及頸部癌症、血管外皮細胞瘤、惡性血液病、肝母細胞瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、侵犯性小葉癌、腸癌、腎癌、喉癌(laryngeal cancer)、惡性痣、致死性中線癌、白血病、雷迪格細胞瘤(leydig cell tumor)、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴瘤、急性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、 MALT淋巴瘤、惡性纖維組織細胞瘤、惡性周邊神經鞘腫瘤、惡性蠑螈瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、肥大細胞白血病、縱隔生殖細胞瘤、乳髓質癌、甲狀腺髓質癌、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、梅克爾細胞癌(merkel cell cancer)、間皮瘤、轉移性泌尿上皮癌、混合米勒氏腫瘤(mixed Mullerian tumor)、黏液性腫瘤、多發性骨髓瘤、肌肉組織腫瘤、蕈狀肉芽腫、黏液性脂肪肉瘤、黏液瘤、黏液肉瘤、鼻咽癌、神經鞘瘤、神經母細胞瘤、神經纖維瘤、神經瘤、結節性黑色素瘤、眼癌、寡樹突細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、嗜酸性細胞瘤、視神經鞘腦膜瘤、視神經瘤、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、潘克斯特瘤(Pancoast tumor)、乳突性甲狀腺癌、副神經節瘤、松果體母細胞瘤、松果體細胞瘤、垂體細胞瘤、垂體腺瘤、垂體瘤、漿細胞瘤、多胚胎瘤、T前驅淋巴母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、原發性腹膜癌、前列腺癌、胰癌、咽癌、腹膜假黏液瘤、腎細胞癌、腎髓質癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、李希特氏(Richter's)轉形、直腸癌、肉瘤、許旺氏細胞瘤(Schwannomatosis)、精細胞瘤、足細胞瘤(Sertoli cell tumor)、性索-性腺基質瘤、印戒細胞癌、皮膚癌、小圓藍色細胞腫瘤、小細胞癌、軟組織肉瘤、體抑素瘤、炱癌(soot wart)、脊椎瘤、脾邊緣區淋巴瘤、鱗狀細胞癌、滑膜肉瘤、塞扎里病(Sezary's disease)、小腸癌、鱗狀癌、胃癌(stomach cancer)、T細胞淋巴瘤、睪丸癌、卵泡膜細胞瘤(thecoma)、甲狀腺癌、移行細胞癌、喉癌(throat cancer)、臍尿管癌、泌尿生殖器癌、泌尿上皮癌、葡萄膜黑色素瘤、子宮癌、疣狀癌、視通路神經膠質瘤、外陰癌、陰道癌、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、華生氏瘤(Warthin's tumor)及威爾 姆氏腫瘤(Wilms' tumor)。
在一個態樣中，可藉由依使用本文中所述雙特異性抗體化合物之方法治療之疾病及病症係選自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前列腺癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、結腸癌及乳癌。在一個實施例中，本文中所述之雙特異性抗體化合物用作雙特異性T細胞結合子，且能夠選擇性地對其抗原起作用並將人類免疫系統導向作用於腫瘤細胞。
在一個實施例中，用本文中所述之雙特異性抗體化合物及醫藥上可接受之載劑、佐劑或媒劑治療人類患者，其中該雙特異性抗體化合物係以可治療或改善一或多種上文所列舉的疾病及病症之量存在。在另一個實施例中，由本文中所述雙特異性抗體化合物治療或改善的疾病及病症包括彼等上述者中之任何一者。在一個態樣中，患者的該等疾病及病症係選自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前列腺癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、結腸癌、乳癌。
示例
如下文實例中所描繪，在某些例示性實施例中，依以下一般程序製備雙特異性抗體化合物。應瞭解，雖然一般方法描繪本文某些化合物之合成，但以下一般方法及其他的為熟習此項技藝者已知之方法可應用於如本文中所述之所有雙特異性抗體化合物及該等雙特異性抗體化合物各者之亞類及種類。
製備式I之雙特異性抗體化合物 移除抗體之Fc及鉸鏈區
抗體經緩衝交換至20mM磷酸鈉(JT Baker 3827-01)及10mM EDTA(Aldrich E26290)中且將(1.0mg)添加至80μL具有20mM半胱胺酸 (Sigma C7352)之木瓜酶漿液(Thermo Scientific Pierce 20341)並在37℃於頭對頭旋轉器(head to head spinner)中培養6.5小時。接著利用蛋白質A純化經由ÄKTA純化層析系統自Fab移除Fc片段及未消化之IgG。
在一個替代例中，蛋白質水解消化IgG1可產生F(ab)蛋白質。SpeB半胱胺酸蛋白酶FabULOUS(Genovis)用於消化IgG1之鉸鏈區以產生F(ab)及Fc片段。採用一種消化程序，在37℃於具有1mM二硫蘇糖醇(DTT)之杜貝卡氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)中利用0.1至0.2U/μg過夜(~16h)。接著，於F(ab)純化前，樣品經緩衝交換以移除DTT或稀釋以減小DTT濃度。藉由Ni-NTA重力管柱移除蛋白酶，接著依標準方法使流過部分(flow-through)(FT)進行蛋白質A純化。蛋白質A FT包含F(ab)片段，而Fc及任何未消化之IgG1留在管柱中。就大規模製備F(ab)而言，在含20mM咪唑、0.5M NaCl及20mM具有0.1mM DTT之磷酸鈉(pH 7.4)之緩衝液中利用0.1至0.2U/μg在37℃進行消化過夜(~16h)，在ÄKTA純化層析系統上實現串接HisTrap FF(GE)及HiTrap MabSelect SuRe(GE)純化。藉由SDS-PAGE分析及HIC HPLC評估F(ab)純度。參見圖5及圖6。
SDS-PAGE分析
利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，使用與NuPAGE MOPS SDS操作緩衝液含在XCell SureLock小型電泳系統中之NuPAGE Novex 4-12%Bis-Tris蛋白質凝膠。所有樣品(2.5μg)包含NuPAGE LDS樣品緩衝液且在加載前加熱至95℃5分鐘。經還原之樣品亦包含NuPAGE樣品還原劑。Mark12未染色標準品(10μL)用於估算分子量。在125V凝膠電泳1.5小時後，將凝膠固定5分鐘且用SYPRO Ruby蛋白凝膠染色劑依所推薦的程序染色。用Bio-Rad ChemiDoc MP系統進行 成像並藉由Image Lab軟體分析。
SDS-PAGE分析疏水性相互作用層析(HIC)HPLC
使用TOSOH TSKgel丁基-NPR(4.6mm ID x 10cm，2.5μm)管柱，在40℃於Agilent 1260 Infinity系統上，藉由HIC HPLC分析。使用50μg樣品以歷時30分鐘從0%B變為60%B的線性梯度進行分析性操作：A=50mM磷酸鈉+1M硫酸銨(pH 7)，B=50mM磷酸鈉+25%異丙醇(pH 7)。使用OpenLAB軟體分析所有數據。
環化之一般程序
透過還原鏈間雙硫鍵，接著與含疊氮化物或二苄基環辛炔(DBCO)之2,3-二溴馬來醯亞胺(DBM)中間物反應，達成FAB1與FAB2結合。接著經由無銅點擊化學(click chemistry)開始環化。關於作為一實例之使用αPSMA及αCD3之方法之一般概述，亦可參見圖7。在原位藉由在室溫(RT)使適宜DBM-PEG-DBCO連接子(例如，對於下文所述之αPSMA/αCD3雙特異性抗體化合物，使用DBM-PEG4-DBCO及DBM-PEG8-DBCO)與10至15當量的適宜疊氮基-PEG-疊氮化物(例如，對於下文所述之αPSMA/αCD3雙特異性抗體化合物，使用疊氮基-PEG2-疊氮化物)反應1小時，來製備含疊氮化物之2,3-二溴馬來醯亞胺(DBM)中間物。通常，在RT使用5或10當量的DTT還原5mg/mL之F(ab)蛋白質(例如，αPSMA、αCD3)1小時，接著，分別在RT與10或15當量DBM連接子及7.5%DMSO共溶劑結合過夜。藉由離心過濾移除過量的連接子。藉由SDS-PAGE及HIC HPLC分析確定重鏈-輕鏈雙硫橋為~85%有效。在室溫或37℃藉由將FAB1-X中間物及FAB2-Y中間物以5mg/mL混合24至48小時來開始環化。藉由SDS-PAGE分析及HIC HPLC評估環化前抗體及中間物 之純度。關於αCD3 F(ab)及αPSMA F(ab)產物之數據可參見圖6、圖8及圖9。通常以~65-95%產率形成環化產物，隨著培養溫度及時間改變。
抗-PDL1/抗-VEGFR2雙特異性抗體化合物
可如下製備式I之雙特異性抗體化合物，其中FAB1為抗-PDL1及FAB2為抗-VEGFR2。FAB1(抗-PDL1抗體)包含具有與SEQ ID No：1及2對應之胺基酸序列之可變區。FAB2(抗-VEGFR2抗體)包含具有與SEQ ID No：3及4對應之胺基酸序列之可變區。
在移除抗-PDL1及抗-VEGFR2之Fc後，添加各抗體(1-10mg)至個別15mL過濾離心管(Millipore，UFC903024)且添加適宜體積之50mM磷酸鈉、150mM NaCl、5mM EDTA(pH 7.7)緩衝液至管的50mL刻線。在22℃以3,000RPM離心該等管20分鐘。接著將抗體轉移至個別1.5mL塑膠小瓶中且使用Nanodrop(Fisher，ND-2000 UV-Vis Spectrophotometer)確定濃度。最終抗體濃度至多5mg/mL。在該實例中，抗-PDL1用作FAB1及抗-VEGFR2用作FAB2。
製備1mg/mL TCEP((三(2-羧乙基)膦)，Sigma-Aldrich，C4706)含在pH 8.0 PBS(1mM EDTA)緩衝液中之原液。將五當量的TCEP添加至FAB1且震盪該混合物並在室溫培養1小時。使用NAP-5(GE17-0853-02)脫鹽管柱從經還原之FAB1分離得TCEP。
製備二溴-DBCO(2,3-二溴馬來酸酐；Click Chemistry Tools，A108-100)含在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中之原液且添加1當量的含在DMSO中之二溴-DBCO至FAB1樣品。樣品中DMSO的最終體積為約5-9%(v/v)。在RT藉由旋轉架混合進行二溴-DBCO與FAB1間結合1小時。再重複該步驟兩次。二溴-DBCO之最終濃度為3當量FAB1。
將含在DMSO中之二溴-疊氮化物(1當量)添加至FAB1樣品。抗體樣品中DMSO的最終體積為約5-9%(v/v)。在RT藉由旋轉架混合進行結合反應1小時，以二溴-DBCO為3當量之最終濃度再重複該步驟兩次。
將各樣品放入個別15mL過濾離心管(Millipore，UFC903024)且添加適宜體積之1X DPBS加上10%DMSO(Corning，21-031-CM，不含鈣或鎂)緩衝液至管的50mL刻線。在22℃以3,000RPM離心該等樣品20分鐘。再次重複洗滌步驟。接著，添加適宜體積之1X DPBS(Corning，21-031-CM，不含鈣或鎂)緩衝液至管的50mL刻線。在22℃以3,000RPM離心該等樣品20分鐘。洗滌後，將該等樣品轉移至個別1.5mL塑膠小管中且放入冰箱(5℃)或用於點擊步驟。
對於待分析的各樣品，需要20μL濃度為0.6mg/mL者。依已確立的方案來操作SDS-PAGE凝膠(RTP AD001-01及AD002-01)，參見圖2，其中1)表示FAB1-DBCO；2)表示FAB2-疊氮化物；及3)表示式I之雙特異性抗體化合物(FAB1-DBCO及FAB2-疊氮化物之點擊產物)。
下文提供具體實例。
1-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙基)-3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮
將MeOCOCl(10mmol，940mg含在10ml DCM中)逐滴添加至含在60mL THF中之2.5g 3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮(10mmol)及1g NMM，攪拌20分鐘，接著用60mL DCM稀釋反應溶液，用水洗滌3次，藉由無水硫酸鈉攪拌有機相，濃縮，得到2.65g 3,4-二溴-2,5-二側氧基-2H-吡咯-1(5H)-羧酸甲酯。將2-(2-疊氮基乙氧基)乙胺(130mg，1mmol) 及5mL DCM添加至311mg，1mmol該化合物，TLC顯示反應在20分鐘內完成，接著藉由DCM及鹽水萃取，藉由NH4Cl溶液洗滌，於無水硫酸鈉上乾燥，且接著濃縮以用於管柱純化，藉由2：1己烷及乙酸乙酯沖洗，得到230mg 1-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙基)-3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮。1HNMR：3.32ppm(t,J=5.0Hz,1H),3.40ppm(t,J=5.0Hz,1H),3.50ppm(q,J=5.0Hz,1H),3.62ppm(t,J=5.0Hz,1H),3.63-3.69ppm(m,3H),3.84ppm(t,J=5hz,1H)。Fw：365.9,C8H8Br2N4O3；質量峰(1：2：1)：366.9,368.9,370.9。
N-(3-(1-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙基)-1,9-二氫-8H-二苯并 [b,f][1,2,3]三唑并[4,5-d]氮環辛四烯(azocin)-8-基)-3-側氧基丙基)-1-(3,4-二溴-2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺(102)
將含在DMSO(0.7mL)中之疊氮基-PEG2-疊氮化物(1.4mg，5.0當量，101)添加至二溴-馬來醯亞胺-PEG2-二苯并環辛炔(1.0mg，1.0當量，100)含在DMSO(0.13mL)中之溶液。在室溫攪拌該混合物1小時。由 LC/MS指示反應完成。所得二溴-馬來醯亞胺-疊氮化物102之分子量為961.1g/mol。
二苯并環辛烷-PEG4-馬來醯亞胺-FAB 1
製備二溴-DBCO(2,3-二溴馬來酸酐；Click Chemistry Tools，A108-100)含在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中之原液且添加1當量的含在DMSO中之二溴-DBCO至FAB1樣品。抗體樣品中DMSO的最終體積為約5-9%(v/v)。在室溫藉由旋轉架混合進行結合反應1小時。再重複該步驟兩次。二溴-DBCO的最終濃度為3當量FAB1。
將樣品放入個別15mL過濾離心管(Millipore，UFC903024)中且添加適宜體積之1X DPBS加上10%DMSO(Corning，21-031-CM，不含鈣或鎂)緩衝液至管的50mL刻線。在22℃以3,000RPM離心該樣品20分鐘。再次重複該步驟。接著，添加適宜體積之1X DPBS(Corning，21-031-CM，不含鈣或鎂)緩衝液至管的50mL刻線。在22℃以3,000RPM離心該樣品20分鐘。洗滌後，將該樣品轉移至個別1.5mL塑膠小瓶中並放入冰箱(5℃)以得到103。
疊氮基-PEG2-二苯并[b,f][1,2,3]三唑并[4,5-d]氮環辛四烯-8-基)-3-側氧基丙基)-PEG4-馬來醯亞胺-FAB 2
添加含在DMSO中之二溴-疊氮化物102(1當量)至FAB2樣品。抗體樣品中DMSO的最終體積為約5-9%(v/v)。在室溫藉由旋轉架混合進行結合反應1小時。再重複該步驟兩次。二溴-DBCO之最終濃度為3當量FAB2。
將樣品放入個別15mL過濾離心管(Millipore，UFC903024)中且添加適宜體積之1X DPBS加上10%DMSO(Corning，21-031-CM，不含鈣或鎂)緩衝液至管的50mL刻線。在22℃以3,000RPM離心該樣品20分鐘。再次重複該洗滌步驟。接著，添加適宜體積之1X DPBS(Corning，21-031-CM，不含鈣或鎂)緩衝液至管的50mL刻線。在22℃以3,000RPM離心該樣品20分鐘。洗滌後，將該樣品轉移至個別1.5mL塑膠小瓶中並放入冰箱(5℃)以得到104。
PEG4抗-PDL1/PEG 4抗-VEGFR2雙特異性抗體化合物
將含在PBS(5.0mg/mL)中之104片段(500μg)添加至含在PBS(5.0mg/mL)中之103(500μg)。在室溫於藉由旋轉架混合進行反應過夜。對該混合物進行SEC分析。
使用Tskgel丁基-NPR 4.6mm x 10cm 2.5um之Agilent 1200 HPLC用於分析FAB1-DBCO、FAB2-疊氮化物及式I之雙特異性抗體化合物產物。緩衝液A：50mM NaH2PO4、1.5M(NH4)2 SO4 pH 7.0及緩衝液B：50mM NaH2PO4 pH 7.0+25%IPA。
參見圖3。105之MS分子量計算值為95954.00，理論值為95955.00。
藉由尺寸排除層析(SEC)，利用Agilent 1200 HPLC，使用TSK凝膠SuperSW3000管柱(4.6mm ID x 30cm，4μm)，來純化式I之雙特異性抗體化合物。緩衝液為0.2M磷酸鉀、0.25M KCl，pH 6.2。
αPSMA/αCD3雙特異性抗體化合物 αPSMA-PEG4/αCD3-PEG4(106)、αPSMA-PEG4/αCD3-PEG8(107)、αPSMA-PEG8/αCD3-PEG4(108)及αPSMA-PEG8/αCD3-PEG8(109)之一般程序
依上述方法，且使用適宜的起始材料，來合成αPSMA-PEG4/αCD3-PEG4(106)、αPSMA-PEG4/αCD3-PEG8(107)、αPSMA-PEG8/αCD3-PEG4(108)及αPSMA-PEG8/αCD3-PEG8(109)。關於該方法之一般概述，亦可參見圖7。例如，在原位藉由使DBM-PEG4-DBCO及DBM-PEG8-DBCO連接子與10至15當量疊氮基-PEG2-疊氮化物在室溫(RT)反應1小時，來製備疊氮化物連接子。通常，在RT使用5或10當量的DTT還原F(ab)蛋白質(5mg/mL)1小時，接著，在RT分別與10或15當量DBM連接子及7.5%DMSO共溶劑結合過夜。藉由離心過濾移除過量的連接子。藉由SDS-PAGE及HIC HPLC分析確定重鏈-輕鏈雙硫橋為~85%有效。藉由在室溫或37℃將αPSMA F(ab)中間物與αCD3 F(ab)中間物以5mg/mL混合24至48小時開始環化。藉由SDS-PAGE分析及HIC HPLC評估環化前抗體及中間物之純度。參見圖6、圖8及圖9。最終產物的產率為~65-95%產率，隨著培養溫度及時間改變。藉由SDS-PAGE評估雙特異性產物106、107、108及109之純度並顯示於圖10中。
在活體外使用Octet Red的親和力測定
感測器AR2G用於測定抗原與105在Octet Red(ForteBio,Inc.)上的相互作用。簡單而言，測定方案如下：300秒基線；300秒加載10μg/ml抗原A，120秒基線；300秒105；300秒解離；300秒抗原B及300秒解離(圖4)。在PBS中進行感測器水合及基線測定及解離測定。如圖4中所描述，各Fab片段能夠維持抗原結合。
雙特異性抗體化合物108及109之發光細胞毒性分析
經螢火蟲螢光素酶轉導的前列腺癌靶細胞系用於細胞毒性分析，LNCaP(ATCC® CRL-1740TM)、PSMA+(在RPMI-1640+10%非熱不活化FBS+0.5μg/mL嘌呤黴素中培養)及PC-3(ATCC® CRL-1435TM)、PSMA-(在RPMI-1640+10%熱不活化FBS+1.0μg/mL嘌呤黴素中培養)。用TrypLE(ThermoFisher Scientific)收取細胞，接著，再懸浮於新鮮RPMI-1640+10%熱不活化FBS中並以依4,000個細胞/孔以100μL接種。在37℃於潮濕5%CO2培養箱中培養過夜後，將FAB及式I之雙特異性抗體化合物在RPMI-1640+10%熱不活化介質(50μL)中之連續稀釋液以指定 濃度添加至分析板。用培養基洗滌剛解凍的周邊血液單核細胞(PBMC)並以40,000個細胞含於50μL中添加至分析板，得到10：1之效應子：標靶比。培養4天後，從分析板取出90μL且將90μL ONE Glo螢光素酶分析試劑(Promega #E6120)與樣品混合並在室溫培養10分鐘。將樣品轉移至白色96孔平底板以使用PerkinElmer EnSpire多模式板式讀取器進行發光測定。使用GraphPad Prism軟體分析數據。利用化合物108及109在PSMA+LNCaP細胞的觀測到細胞殺滅的效力為~1nM。非經腸F(ab)蛋白質未顯示細胞毒性活性。PSMA-PC-3細胞未觀測到由式I之雙特異性抗體化合物介導的細胞殺滅。數據顯示使用效應子：標靶10：1之PBMC達成式I之雙特異性抗體化合物之與PSMA相關之細胞毒性。
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<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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Claims (16)

  1. 一種具有式I之雙特異性抗體化合物： 其中，FAB1表示第一Fab片段；FAB2表示第二Fab片段；及-X-表示將FAB1與FAB2共價連接在一起之經取代三唑基。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體化合物，其中該式I之雙特異性抗體係式II、IIa、III或IIIa之雙特異性抗體： 其中：R1與R2各自獨立地為經取代烷基；環A為經取代碳環基或經取代雜環基；Ra與Rb各自獨立地選自 Q、T及V各自獨立地為N或CH；「」指示對FAB1或FAB2的連接點；及「------」指示對R1或R2的連接點。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗體化合物，其中環A為經取代雙環或多環碳環基或經取代多環雜環基。
  4. 如請求項1至3中任一項之雙特異性抗體化合物，其中：環A為或；虛線鍵係指對三唑基的連接點；及波形鍵係指對R2的連接。
  5. 如請求項1至4中任一項之雙特異性抗體化合物，其中R1與R2各自獨立地為視需要經取代(C2-C30)烷基，該視需要經取代(C2-C30)烷基視需要間雜一或多個選自N、O及S之雜原子。
  6. 如請求項1至5中任一項之雙特異性抗體化合物，其中R1與R2各自獨立地為視需要間雜一或多個選自N及O之雜原子之經取代(C2-C30)烷基。
  7. 如請求項1至6中任一項之雙特異性抗體化合物，其中R1與R2各自獨立地為(C2-C30)烷基，該(C2-C30)烷基間雜至少一個O及至少一個N且經至少一個側氧基取代。
  8. 如請求項1至7中任一項之雙特異性抗體化合物，其中R1與R2各自獨立地選自 波形線係指對Ra或Rb的連接點；虛線係指對三唑基或環A的連接點；及p與w獨立地為1至8之整數。
  9. 如請求項1至8中任一項之雙特異性抗體化合物，其中R1係選自 波形線係指對Ra的連接點；及虛線係指對三唑基的連接點。
  10. 如請求項1至9中任一項之雙特異性抗體化合物，其中R2係選自 波形線係指對Ra的連接點；及虛線係指對三唑基或環A的連接點。
  11. 如請求項1至10中任一項之雙特異性抗體化合物，其中Ra與Rb係經FAB1及FAB2之天然半胱胺酸與FAB1及FAB2結合。
  12. 如請求項1之雙特異性抗體化合物，其中該式I之雙特異性抗體係下式之特異性抗體： 或其醫藥上可接受之鹽，其中FAB1與FAB2係經天然半胱胺酸殘基與吡咯啶-二酮連接。
  13. 如請求項1至12中任一項之雙特異性抗體化合物，其中FAB1與FAB2 不包含鉸鏈區。
  14. 如請求項1至13中任一項之雙特異性抗體化合物，其中FAB1與FAB2各自獨立地選自含CD3結合區之Fab片段及含PSMA結合區之Fab片段。
  15. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之雙特異性抗體化合物；及醫藥上可接受之載劑。
  16. 一種治療經受CD3、PSMA、CD19、CXCR5、CD33、PDL1、VEGFR2、cMet或Axl調節影響之疾病或病症之方法，其包括對有此需要的個體投與如請求項1至14中任一項之雙特異性抗體化合物、或其醫藥上可接受之鹽，或如請求項15之組合物。
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