TW201345922A - 人類抗－ｃｄ２７抗體、方法及用途 - Google Patents

Abstract

對人類CD27具免疫特異性之人類抗體能夠阻斷CD27與其配體CD70之結合並中和CD27的生物活性，包括但不限於CD27細胞內的訊號傳遞、T細胞的增生和活化、B細胞的增生和分化、漿母細胞的形成和抗體反應的減輕、藉由CD70刺激腫瘤細胞以及T細胞和B細胞的可溶性介質生產。該抗體可用於診斷或治療與CD27活性相關之疾病和病症。

Description

人類抗-CD27抗體、方法及用途

本發明係關於人類抗CD27蛋白之抗體及其用途，更具體而言係關於人類抗人類CD27蛋白之抗體及其在治療炎症疾病上之用途。

CD27係一種I型跨膜蛋白及腫瘤壞死因子受體超家族(TNFSF27)的成員，在大多數的T細胞、自然殺手細胞和抗體分泌漿細胞和記憶B細胞上表現為表面抗原。CD70係一種細胞介素，也稱為腫瘤壞死因子配體超家族成員7(TNFSF7)，為CD27的同源配體。TNFSF配體-受體的交互作用能夠調節T依賴性的B細胞分化(Jacquot S.2000 Immunol Res.21(1)：23-30)並在不同的胞中誘導細胞凋亡。

CD27：CD70接合造成典型及非典型的NF-kβ訊息傳遞路徑的活化，繼而刺激B細胞及T細胞的增殖、漿細胞的分化以及隨後的抗體分泌(Yamamoto,H.1998 J Immunol.161(9)：4753-9)。CD27與OX40、4-1BB的協同刺激也促進了活化T細胞的存活(Croft,M.2003 Cytokine Growth Factor Rev.14(3-4)：265-73)，從而調節一些作用性及記憶性T細胞並藉由促進細胞介素(如IL-4及IFN-γ)產生或調節T細胞對其他細胞介素(如IL2及IL-12)作用的反應來直接控制T細胞的功能。

在人類以及動物的研究中，可推測出CD27：CD70路徑在各種不同的免疫相關疾病中扮演著重要的角色，包括全身性紅斑狼瘡(SLE)(Doemer T Lupus 2004 13(5)：283-9)、類風溼性關節炎(Tak,PP et al.1996 clin Immunol Immunopathol 80(2)：129-38)及多發性硬化症 (Hintzen RQ et al.1991 J Neuroimmunol 35(1-3)：211-7)。另一方面，已有報導指出CD70在惡性B細胞上有不同程度的表現，且CD70：CD27複合物可以藉由活化抗腫瘤免疫力與減少腫瘤生長來調介抗腫瘤反應(Borst J,Hendriks J and Xiao Y.2005.Curr Opin Immunol.17(3)：275-81)。CD27也可控制CD4+和CD8+ T細胞在感染部位的累積(Hendricks et al.2000 Nature Immunol 1,433-440)。

CD70在正常的非造血細胞上不會表現。CD70的表現似乎會短暫地被限制在抗原活化的T細胞和B細胞，並且當抗原的刺激停止時，其表現量會下調。來自動物模型的證據暗示CD70可能有助於免疫疾病，例如類風溼性關節炎(Brugnoni et al.,1997 Immunol.Lett.55：99-104)、乾癬性關節炎(Brugnoni et al.,1997,Immunol.Lett.55：99-104)以及狼瘡(Oelke et al.,2004,Arthritis Rheum.50：1850-60)。除了在炎症反應中的潛在作用，CD70也在各種轉形細胞上表現，包括淋巴瘤B細胞、霍奇金氏症及李特‧斯頓伯格細胞(Hodgkin's and Reed-Sternberg cells)、神經來源的惡性細胞以及一些癌細胞。

W02008/051424(南漢普頓大學(Univ.South Hampton))中所描述的促效劑CD27結合抗體被注意到可用來促進T細胞的免疫性，且該些抗體具有一結合表位使其不受CD70的影響(不被抑制)。

雖然在囓齒類動物中有關CD27及/或CD70改變的研究已證實這種受體配體交互作用的潛在重要性，仍需要提供對人類CD27具有特異性的人類抗體及其他對表現CD27的細胞可產生臨床上有用的細胞毒性、抑制細胞生長或免疫調節作用的CD27：CD70交互作用阻斷劑，尤其是在缺乏CD70的存在下對CD27表現細胞不會有不良促效劑的影響。這類化合物可以是有用的治療劑，用來調節CD27表現細胞所調介之癌細胞的發育或免疫疾病。

本發明提供與人類CD27結合的單株抗體，其可以在一宿主對象中的細胞、組織或器官上阻斷與CD27-CD70交互作用相關的活動。本發明提供例示性CD27結合單株抗體之胺基酸序列，其係由核酸編碼以在一宿主細胞中表現。此外，本發明之CD27單株抗體在CD27的胞外區域(extracellular domain)界定有至少三個非覆蓋型表位(epitope)，當與本發明之抗體結合時，CD27無法與CD70型配體接合來驅動訊號傳遞以及下游的生物活性。

本發明的另一個態樣係一分離的抗-CD27抗體，其會與CD27蛋白質表位(定義為CD27蛋白質位置在21-191之間的殘基)反應。

本發明的另一個態樣係一分離的抗體，其具有一選自SEQ ID NOs：76、78、80、102-126、128-136及145-147所示序列之重鏈變異區序列，以及一選自SEQ ID NOs：77、79、81-101、127、137-144及148所示序列之輕鏈變異區序列，其包括該些序列的變異體，例如保守性取代(conservative substitution)。

本發明的再一個態樣係一分離的抗體，其具有選自SEQ ID NOs：1-75及151-158所示序列之重鏈CDR序列及輕鏈CDR序列，其包括該些序列的變異體，例如保守性取代(conservative substitution)。

本發明的另一個態樣係一分離的多核苷酸，其編碼一本發明之抗體。

在另一個態樣中，本發明係關於一種抗體，其結合至一共同表位(定義為蛋白質上抗體C2177及/或C2186或表30-39中所述之由此產生的人類抗體所結合的區域)或與抗體C2177及/或C2186或表30-39中所述之由此產生的人類抗體競爭結合至CD27蛋白。在另一個實施例中，本發明係關於一種抗體，其結合至一CD27胞外區域的表位(定義為蛋白質上抗體C2191結合的區域或由此產生表30-39中所述之人類抗體)並與抗體C2191或表30-39中所述之由此產生的人類抗體競爭結合至CD27蛋白。在另一個實施例中，本發明係關於一種抗體，其結合至一CD27 胞外區域的表位(定義為蛋白質上抗體C2192結合的區域或由此產生表30-39中所述之人類抗體)並與抗體C2192或表30-39中所述之由此產生的人類抗體競爭結合至CD27蛋白。在另一個態樣中，本發明包含一種衍生自一或多個抗體C2177、C2186、C2191及C2192或表30-39中所述之由此產生的人類抗體之抗體或其片段，其具有一或多個抗體C2177、C2186、C2191及C2192或表30-39中所述之由此產生的人類抗體所展示出的其他功能性結合特性，像是抑制CD27結合至CD70陽性細胞。

因此，本發明的一個態樣係關於一種基因工程抗體，其包含一基因工程(例如人源化或適應人的)重鏈及輕鏈，其中：(1)該基因工程重鏈變異區包含(或衍生自)一或多個來自小鼠抗體C2177、C2191、C2192及C2186重鏈之互補決定區(CDR)以及一來自人類接受者抗體重鏈之框架，其視情況具有一或多個人類框架殘基取代，及(2)該基因工程輕鏈變異區包含一或多個來自小鼠抗體C2177、C2191、C2192及C2186輕鏈之互補決定區以及一來自人類接受者抗體輕鏈之框架，其視情況具有一或多個人類框架殘基取代；以及(3)該基因工程抗體特異性地結合至人類CD27並干擾其與CD70的交互作用。

在一進一步的實施例中，該基因工程抗體可由一或多個CDR組成且該CDR進一步基因改造有一或多個取代或缺失，例如，那些與抗體C2177、C2191、C2192及/或C2186之一或多個CDR有90%、95%、98%或99.5%相同的CDR。

另一個實施例係關於治療或預防與CD27生物活性相關的病理症狀，藉由投予治療或預防有效量的一本發明抗體、其部份或本發明抗體之混合物或其部份至一需要該治療之對象。

在一進一步的實施例中，本發明包含作為一疫苗成分之抗原表位。包含一些或全部SEQ ID NO：1殘基21-191之亞片段或三維類 似物，或其保守性改變之多肽或編碼上述多肽表位之多核苷酸會被本發明之抗體辨識。該多肽和多核苷酸可用來自動免疫一宿主以引起抗CD27抗體的產生，其能對抗或預防與CD27生物活性相關的病理症狀。

本發明亦關於產生、純化、配製及包裝一本發明抗體之方法，以用來治療或預防與CD27生物活性相關的病理症狀，藉由投予治療或預防有效量的一抗體或其部份。

圖1顯示C2177抗體對T細胞增殖之效果。

圖2顯示CD27：C2177：C2191三元複合物的晶體結構。CD27片段的N端末端及C端末端被標記。Fabs上的重鏈顏色較輕鏈深。

圖3為CD27蛋白-C2177抗體接觸的示意圖，圓圈裡的是CD27蛋白殘基(表位)，方塊裡的是C2177抗體殘基(補位(paratope))。

圖4為CD27蛋白-C2191抗體接觸的示意圖，圓圈裡的是CD27蛋白殘基(表位)，方塊裡的是C2191抗體殘基(補位)。

縮寫字

CDR-互補決定區；CFSE-羧基螢光素乙醯乙酸(carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester)；ECD-胞外區域；FR-框架；H-重鏈；GvHD-移植物對抗宿主疾病(graft-versus-host disease)；L-輕鏈；IFN-干擾素(g，γ)；Ig-免疫球蛋白；Mab-單株抗體；MMP-基質金屬蛋白酶；PBMC-週邊血液單核細胞；VL-輕鏈變異區；VH-重鏈變異區

定義

如本文所述，「抗體」包括整個抗體及其任何抗原結合片段或其單鏈。因此，該抗體包括任何含有包含至少一部分免疫球蛋白分子的分子之蛋白質或胜肽，例如但不限於至少一重鏈或輕鏈的互補決定區(CDR)或其配體結合部分，一重鏈或輕鏈變異區，一重鏈或輕鏈恆定區，一框架(FR)區，或其任何部分，或至少一結合蛋白的一部分，其可被併至本發明之抗體。「抗體」一詞係進一步欲含括抗體、其截切片段、特定部分及變異體，包括抗體模擬物，或包含模擬抗體或其特定片段或部分之結構及/或功能的抗體部分，包括單鏈及單鏈域抗體及片段。功能性片段包括對一預選標靶之抗原結合片段。以術語一抗體的「抗原結合部分」涵蓋的結合片段的實例包括(i)一Fab片段，即一由VL、VH、CL及CH域所組成之單價片段；(ii)一F(ab')2片段，即一二價片段，包含兩個在絞鏈區(hinge region)透過二硫橋連接的Fab片段；(iii)一Fd片段，由該VH及CH域所組成；(iv)一Fv片段，由一抗體單臂之VL及VH域所組成，(v)一dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341：544-546)，其係由一VH域所組成；及(vi)一分離的互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩域：VL和VH係透過不同基因進行編碼，但可使用重組方法，透過一種合成鏈接物來將它們連接，該合成鏈接物能夠將它們製成一個單一蛋白質鏈，其中該VL和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見如Bird et al.(I 988)Science 242：423-426，以及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85：5879-5883)。此種單鏈抗體亦欲含括於抗體之「抗原結合部分」一詞內。這些抗體片段係使用具該領域中技術者所知悉的習知技術而獲得，且該些片段係經篩選具有如完整抗體相同方式之效用。反之，可使用scFv構造基因庫來篩選抗原結合能力，並接著使用習知技術將其剪接為編碼人類生殖系基因序列的其他DNA。該基因庫的一個實例係「HuCAL：人類組合抗體庫」(Knappik,A.et al.J Mol Biol(2000)296(1)：57-86)。

術語「CDR」係指抗體的互補決定區或高變區之胺基酸殘基，其參與或負責抗原結合。人類IgG抗體亞型的高變區或CDR包含如Kabat等人所述(1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)之來自輕鏈變異區中殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及重鏈變異區中殘基31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)的胺基酸殘基，及/或那些來自高變區環(hypervariable loop)的殘基(即輕鏈變異區中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈變異區中的殘基26-32(H1)、53-55(H2)或現今H2 Chothia定義的52-57及96-101(H3)，如Chothia et al.,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)所述。)

框架或FR1-4殘基係那些非高變區且框住高變區的變異區殘基。最近，一個通用的編號系統已經被開發和廣泛採用，即國際免疫遺傳學信息系統(international ImMunoGeneTics information system®(IMGT))(LaFranc,et al.2005.Nucl Acids Res.33：D593-D597)。

在此，CDR依據在輕鏈或重鏈內之胺基酸序列及位置兩者、藉由依序編號指稱。由於免疫球蛋白變異區結構內的CDR「位置」在物種間為保留且存於稱為環的結構中，根據結構特徵，藉由比對(align)變異區序列使用編號系統，因此即容易辨識CDR及框架殘基。此資訊係用於將來自一物種免疫球蛋白之CDR殘基移植(grafting)及置換至典型上來自人類抗體之受體框架。

術語「CD27」意指人類TNF受體超家族(TNFSF27)，即人類基因939(CD27基因)的產物，亦稱為人類CD27L受體、MGC20393、S152、T14、T細胞活化抗原CD27並包括所有CD27的變異體、異構物和物種同源物(species homologs)。該表達的人類CD27(NCBI登錄號為NP_001233)係一個長度為260胺基酸的多肽，其在N端末端具有20胺基酸的分泌訊號。因此，本發明之抗體在某些情況中可能與來自人類以外物種的CD27交叉反應。在其他情況中，該抗體可能對人類CD27具有完全特異性且沒有表現出物種或其他類型的交叉反應性。CD27生物活性的 意思係指由於一或多個配體(尤其是CD70多肽(TNFSF7，NP_001243)或其他配體，例如SIVA)活化CD27所造成之CD27受體結合及/或活化而產生之任何下游的活性。CD27轉換訊號而導致NF-κ--β及MAPK8/JNK的活化。轉接蛋白TRAF2及TRAF5已顯示出會調介這種受體的訊息傳遞過程。CD27的生物活性也可能來自某些截短形式的CD27或CD27片段與本身展現出生物活性的配體的結合，例如，一包含約全長蛋白的殘基21-191的多肽可結合至CD70。該CD27抗原胞質尾(殘基213-260)結合至SIVA蛋白(亦稱為凋亡誘導因子：CD27BP；SIVA1，Siva-1，NP_006418(175 aa))的N端末端；以及Siva-2，SIVA2，NP_068355(110 aa)。

術語「表位(epitope)」是指能特異性結合至一抗體的蛋白質決定區。表位通常由分子的化學活性表面分類，例如胺基酸或糖側鏈所構成，且通常具有特定三維結構特徵以及比電荷特徵。構形及非構形表位差別為與前者的結合在變性溶劑存在下即失去，但後者並不會。

「人源化(Humanization)」(亦稱為重塑或CDR移植)或「基因工程」包括建立減少來自異種源(通常為囓齒動物)的單株抗體(mAb)的免疫原性以及改善親和性或效應物功能的技術(ADCC，補體活化，結合C1q)。基因工程的單株抗體可以使用分子生物學技術來產生，利用噬菌體呈現的隨機序列或重新合成。例如，為了建構一併入有來自非人物種之CDR區的人源化抗體，該設計可包括變異體，像是在CDR殘基上的保守胺基酸取代，以及將來自非人物種單株抗體的殘基倒回取代至人類框架區(backmutations)。該位置可透過序列比對法、共有序列分析或變異區3D結構的結構分析來分辨或辨識。可利用電腦程式來描繪或顯示所選的候選免疫球蛋白序列可能的三維構象結構。審視這些影像可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能上可能扮演的角色，亦即分析會影響該候選免疫球蛋白與其抗原結合能力的殘基。用這種方法，或通過簡單的序列比對演算法(例如Clustal W)，可以從已知的抗體序列(在可公開進入的資料庫尋找，如VBASE或Kabat)選擇FR(框架)殘基，並最佳化共有序列以取得想要的抗體特性，像是對目標抗原的親和性。隨著抗體結構已 知參數的資料組增加，也使得這些技術更加成熟和完善。另一種人類化的方法係以人類單株抗體上最常見的殘基僅修飾囓齒類動物序列的表面殘基，該方法被稱為「重修表面(resurfacing)」或「面飾法(veneering)」。大量的人類和非人類的Ig序列現在已知道並可被該領域中熟諳此技藝者自由取得和使用，例如在IMGT下可找到的LeFranc等人發展的資料庫和工具；美國國家生物中心(NCBI)策劃的網站；Kabat等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)(現在也大大地擴充並可在網路上取得)，各皆全文併入本文中作為參考。可用任何已知方法或利用人類免疫球蛋白序列資訊發展的方法來進行本發明抗體的人類化或基因工程。例如，在Winter的美國專利第6982361號及Bowdish等人的WO03/025019中有教導該方法，其內容被併入本文中作為參考。

如本文所述，K_D係指解離常數，特定言之，為該抗體對一預定抗原之K_D，且為該抗體對一特定標靶之親和性的量值。高親和性抗體對一預定抗原之K_D係10^-8M或更少，更佳的是10^-9M或更少，且再佳者為10^-10M或更少。K_D的倒數為K_A，即結合常數。如本文所述之術語「k_dis」或「k₂」或「k_d」，係意指特定抗體-抗原交互作用的解離速率。「K_D」是解離速率(k₂)(亦稱為「離開速率(k_off)與結合速率(k₁)或「連接速率(k_on)」之比率。因此，K_D等同k₂/k₁或k_off/k_on，且以莫耳濃度(M)表示。K_D越小，則結合越強。因此，K_D為10^-6M(或1μM)表示較10^-9M(或1nM)結合力弱。這些數值可利用表面電漿子共振(surface plasmon resonance)及/或Kinexa法計算，如該領域中所習知。

如本文所述之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指由單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組合物對於一特定表位呈現單一的結合特異性及親和性。當所有抗體係藉由重組方法製備、表現、產生或分離時，該術語亦包括「重組抗體」及「重組單株抗體」，如(a)分離自一動物或融合瘤之抗體，該融合瘤係藉由融合抗體分泌動物細胞及融合夥伴(fusion partner)而製備；(b)自經轉形以表現抗體之宿主細胞(例如來自轉染瘤(transfectoma))所分離之抗體；(c)自重組的組合人類或其 他物種之抗體庫分離之抗體；以及(d)藉由任何其他涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列方式所製備、表現、產生或單離之抗體。如本文所述之「經分離之抗體」，係意指一抗體為實質上不含具有不同抗原特異性的其他抗體。然而，與人類CD27之表位、異構型或變異體特異性結合之分離抗體可能具有與其他有關抗原(例如來自其他物種的抗原，如CD27物種同源物)之交叉反應性。此外，經分離之抗體可實質上不含其他細胞材料和/或化學物。在本發明之一實施例中，具有不同特異性之「經分離之」單株抗體的組合係經組合至一明確界定之組成物。

如本文所述，「特異性結合」、「免疫特異性結合」及「免疫特異性地結合」意指抗體結合至一預定抗原。典型上，該抗體結合之解離常數(K_D)為10^-7M或更少，且結合至預定抗原之K_D至少小於其結合非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)之K_D二倍。慣用語「會識別抗原的抗體」和「對抗原具特異性之抗體」係與本文的術語「會特異性地結合抗原的抗體」交替使用。如本文所述，「高度特異性」結合意指特異性標靶表位的抗體之相對K_D至少比抗體結合其他配體K_D的小10倍。

如本文所述的「同型」意指由重鏈恆定區基因所編碼的抗體分類(例如IgM或IgG)。一些抗體分類更包含子類，該子類亦由重鏈恆定區所編碼，且在恆定區域內之特定殘基處(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)進一步經寡醣裝飾，藉此進一步給予該抗體生物功能。例如，在人類抗體同型中，IgG1、IgG3和範圍較小的IgG2顯示有如鼠類IgG2a抗體般的效應物功能。

「效應物」功能或「效應物陽性」係指抗體包含不同於抗原特異性結合域之區域，其能與受體或其他血液成分(例如補體)交互作用，導致如巨噬細胞的誘集(recruitment)，以及導致被抗體之抗原結合域結合之細胞破壞之事件。抗體具有數種藉由結合效應物分子所調介之效應物功能。舉例而言，補體C1成分與抗體結合會活化補體系統。補體活化在調理作用(opsonisation)及細胞病原體的裂解上是重要的。補體活化刺 激炎症反應，且亦涉及自體免疫過敏反應。再者，抗體經由Fc區結合至細胞，以抗體Fc區之Fc受體位置結合至細胞上的Fc受體(FcR)。有許多的Fc受體係對不同種類抗體有特異性，包括IgG抗體(γ受體)、IgE(η受體)、IgA(α受體)和IgM(μ受體)。抗體結合至細胞表面之Fc受體引發許多重要及多樣之生物反應，包括吞噬及破壞抗體包覆粒子、廓清免疫複體、藉由殺手細胞溶裂抗體包覆之標靶細胞(稱為抗體依賴性細胞調介之細胞毒殺作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，或ADCC)、釋出炎症調介物、胎盤轉移作用及控制免疫球蛋白產生。

1. 本發明之抗體組成

本發明之CD27中和抗體為體外、原位及/或體內抑制、阻斷或干擾至少一種CD27活性或CD70結合的抗體，且不促進、刺激、誘發或促效(agonize)CD27活性或配體結合，且抗體結合亦不會模擬CD27配體接合之下游作用的抗體，特別是CD70與CD27之交互作用，例如宿主細胞中的訊號傳遞。合適的CD27中和抗體、特定部分或變異體亦可視情況影響至少一個CD27活性或功能，例如但不限於：RNA、DNA或蛋白質合成；蛋白質釋放；T細胞活化；B細胞增生或分化；抗體分泌；CD27受體訊號傳遞；CD27截切；CD27配體結合；CD27或CD70的誘發、合成或分泌。

關於阻斷本發明之CD27中和抗體活性的CD27：CD70共刺激路徑，以提升的T細胞或B細胞效應物功能治療自體免疫疾病可能是有益的。

本發明係基於發現抗人類CD27單株抗體能夠抑制CD70造成的CD27活化，且在缺乏CD70的刺激下不會使CD27自活化。能夠分泌這樣的抗體的融合瘤和轉染瘤(transfectoma)被產生。利用NF-kβ報導基因分析來鑑定幾個在表現CD27的宿主細胞中能夠抑制CD70調介的NF-kβ報導子活化的候選抗體。第二，確認該抗體的特徵為當在缺乏CD70的刺激下與CD27偶聯的螢光素酶報導子轉染細胞一起培養時無法 誘導劑量依賴性的催動活性。第三，證實該抗體劑量依賴性地抑制CD70依賴性人類初始(naïve)CD4 T細胞的增殖。第四，生成的該CD27中和抗體能夠以劑量依賴的方式減少CD70調介的來自人類原發性B細胞對生成漿細胞的刺激。第五，在有測試的抗-CD27抗體的原發性T細胞或B細胞中沒有觀察到顯著的劑量依賴性催動活性。

本發明之抗體可干擾CD27：CD70的接合，在細胞培養中既可抑制T細胞效應物功能也可抑制B細胞分化成漿細胞，因此可用來治療免疫調介的疾病，包括但不限於類風溼性關節炎、全身性紅斑狼瘡、多發性硬化症、發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease)、克隆氏病、慢性阻塞性肺臟疾病或其他併發症狀、與功能異常相關的病狀、疾病或失調、或是CD27表現細胞群的活化。本文所述之CD27結合抗體會辨識人類CD27胞外區域上的至少三個不同區域，表示CD27上額外發現有多處位點適於作為抗體或其他具有類似功能阻斷能力的化合物之標靶。因此，表現及純化此處提供之抗體結合域為胺基酸序列進一步提供了一種工具，其可作為篩選展現CD27中和活性之新穎分子之裝置。

在一實施例中，該抗人類CD27抗體具有一包含一輕鏈變異區(VL)或重鏈變異區(VH)的結合區，其具有如SEQ ID NO：76-144所示之胺基酸序列，且該抗體或其上之結合部份會免疫特異性地結合至CD27。在本發明之另一個實施例中，該抗體或其抗原結合部份會結合至CD27蛋白，並且除此之外，該抗體還擁有本發明抗體之特定功能特性，像是：結合至固定化的人類CD27；抑制人類可溶性CD27結合至表現CD70的細胞；抑制人類CD70調介的CD27訊號傳遞，由NF-κB報導基因分析測量且IC50小於0.5ug/ml；抑制CD70調介的初始(naïve)T細胞增生；抑制CD70調介的來自原發性人類B細胞的漿細胞爆炸性形成； 抑制人類CD70調介的來自原發性T細胞及原發性B細胞或細胞株的可溶性調節分子(soluble mediator)釋放；結合至人類CD27且K_d小於100nM(10^-7M)；在缺乏CD70的刺激下最小活化CD27訊號傳遞；以及結合至人類CD27胞外區域上的一表位，其中該單株抗體以一或多個SEQ ID NOS：76-144的變異區序列與該表位結合並與被辨識具有一或多個SEQ ID NOS：76-144的變異區序列的單株抗體競爭結合。

因為在該領域中抗體重鏈和輕鏈CDR區在抗體對抗原的結合特異性/親和性上扮演著特別重要的角色係屬習知，因此本文揭露之本發明之重組抗體較佳地包含一或多個SEQ ID NOS：1-75的重鏈和輕鏈CDR。這樣的抗體可以利用習知技術以化學的方式將抗體的各種不同部分(例如CDR、框架)結合在一起來製備，利用重組DNA技術的習知技術藉由製備或表現一(亦即一或多個)編碼該抗體之核酸分子來製備，或利用任何其他合適的方法來製備。

在一實施例中，本發明之人類抗體具有一或多個SEQ ID NOS：1-75的重鏈和輕鏈CDR序列。除了這些CDR序列，熟諳此技藝者將知道該確切CDR序列可能(或被希望)有一些誤差，但仍然維持該抗體結合至CD27的能力(例如保守性取代)。因此，在另一實施例中，該人類抗體可由一或多個CDR組成，例如，該CDR與SEQ ID NOs：1-75列出的CDR具有90%、95%、98%或99.5%相似度。

在另一實施例中，本發明抗體所結合之表位(包含少至五個多至全部的CD27蛋白殘基21至191或編碼其序列之核酸)可用以免疫化一對象，以直接於宿主中產生本發明之抗體，以達治療、預防或改善與CD27產生有關之疾病或疾病症狀之目的。

2. CD27中和抗體的產生

一展現如本文揭露及描述之抗體所例示之所需生物活性譜的CD27中和抗體可藉由各種不同的技術來產生，包括標準的體細胞雜 交技術(融合瘤方法)(Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495)。在融合瘤方法中，將小鼠或其他適當的宿主動物(例如倉鼠或獼猴)如此文所述免疫，以引起會產生或能夠產生特異性結合至用於免疫之蛋白質的抗體的淋巴球。或者，淋巴細胞可為體外免疫。然後使用一個合適的融合劑，如聚乙二醇，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成一融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。

如本文所述及/或如該領域中所習知，也可藉由免疫化一能夠產生全套人類抗體之基因轉殖動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、非人類靈長類動物等等)來視情況產生CD27中和抗體。產生人類抗CD27抗體的細胞可以從這些動物中分離出且使用合適的方法不死化(immortalized)，如本文所述的方法。或者，編碼序列的抗體可為經選殖的，引入到一個合適的載體，且藉由本文所教示及此項技術領域已知的方法轉染用於表現和分離抗體的宿主細胞。

利用生殖系組態中攜帶人類免疫球蛋白(Ig)基因位點的基因轉殖小鼠可提供單離的針對各種標靶的高親和性完全人類單株抗體，該標靶包括正常人類免疫系統可耐受的人類自體抗原(Lonberg,N.等人，US5569825，US6300129及1994,Nature 368：856-9；Green, L.等人，1994,Nature Genet.7：13-21；Green, L.& Jakobovits,1998,Exp.Med.188：483-95；Lonberg,N and Huszar,D.,1995,Int.Rev.Immunol.13：65-93；Kucherlapati等人，US6713610；Bruggemann,M.等人，1991,Eur.J.Immunol.21：1323-1326；Fishwild, D.等人，1996,Nat.Biotechnol.14：845-851；Mendez, M.等人，1997,Nat.Genet.15：146-156；Green,L.,1999,J.Immunol.Methods 231：11-23；Yang, X.等人，1999,Cancer Res.59：1236-1243；Brüggemann,M.and Taussig,MJ.,Curr.Opin.Biotechnol.8：455-458,1997；Tomizuka等人，WO02043478)。在這種小鼠的內源性免疫球蛋白基因位點可以被破壞或刪除，以消除動物產生內源性基因編碼的抗體的能力。此外，可委託如 Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(San Jose,Calif.)公司，使用如上所述的技術來提供針對一選定抗原的人類抗體。

在另一實施例中，該人類抗體係選自一噬菌體庫，其中該噬菌體包含人類免疫球蛋白基因，且該庫表現人類抗體結合域，例如單鏈抗體(scFv)，如Fab，或一些展現成對或不成對抗體變異區的其他構造(Vaughan et lo al.Nature Biotechnology 14：309-314(1996)：Sheets et al.PITAS(USA)95：6157-6162(1998))；Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks et al.J.Mol.Biol.,222：581(1991))。本發明之人類單株抗體亦可使用噬菌體呈現法(phage display method)製備，以供篩選人類免疫球蛋白基因庫。此種用於分離人類抗體之噬菌體呈現法已於本領域中建立。例如見：美國專利第5,223,409、5,403,484、及5,571,698號(Ladner等人)、美國專利第5,427,908及5,580,717號(Dower等人)、美國專利第5,969,108及6,172,197號(McCafferty等人)、以及美國專利第第5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915及6,593,081號(Griffiths等人)。

免疫原性抗原的製備以及單株抗體的生產可利用任何合適的技術(如重組蛋白生產)來進行。可將該免疫原性抗原以純化蛋白或包括整個細胞或細胞或組織萃取物之蛋白質混合物的形式投予至一動物中，或者該抗原可由編碼該抗原或其部份之核酸於該動物體內重新(de novo)形成。

本發明之經分離的核酸可使用(a)重組方法、(b)合成技術、(c)純化技術、或其組合而製得，如該領域中所習知。利用該領域中習知方法(例如藉由使用能特異性地結合至編碼鼠源性抗體的重鏈與輕鏈的基因的寡核苷酸探針)，可輕易地單離與定序出編碼該單株抗體的DNA。當生產融合瘤時，該等細胞可做為該等DNA的來源。或者使用其中編碼序列與轉譯產物相連結的呈現技術，如噬菌體或核糖體呈現庫，該結合劑(binder)與該核酸的選擇則簡化。噬菌體選擇後，可從噬菌體分離出抗體編碼區且用於產生全抗體，包括人類抗體，或任何所欲抗原結合片段， 且表現於任何所欲宿主，包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母菌與細菌。

人源化抗體

本發明進一步提供與人類CD27結合之人源化(基因工程改造或適應人類)免疫球蛋白(或抗體)。該人源化形式之免疫球蛋白具有實質上來自人類免疫球蛋白的各種不同框架區(稱為受體免疫球蛋白)以及實質上來自非人類單株抗體之特異性結合CD27的CDR。恆定區若存在時，亦可實質上為來自人類免疫球蛋白。該人源化抗體對CD27所展現之K_D至少約10^-6M(1μM)、約10^-7M(100nM)或更少。該人源化抗體之結合親和力可能大於或小於產出該人源化抗體之小鼠抗體之結合親和力。為了影響改變該人源化抗體對CD27的親和力(例如提高親和力)，可在該CDR殘基或該人類殘基進行取代。

如果人類變異區框架採用與該CDR起源之小鼠變異區框架相同或類似的構形，將小鼠CDR取代進人類變異區框架最有可能導致其保留正確的空間定位。此係藉由從框架序列展現與衍生該CDR之鼠類變異框架區具高度序列相似度的人類抗體獲得該人類變異區來達成。該重鏈與輕鏈變異框架區可衍生自相同或不同的人類抗體序列。該人類抗體序列可為天然發生的人類抗體的序列，可為衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的序列，或可為數種人類抗體及/或生殖系序列的共有序列。

合適的人類抗體序列係經由電腦比較小鼠變異區的胺基酸序列與已知人類抗體的序列而加以鑑定。該比較係分別對重鏈與輕鏈進行，但原則都是類似的。

在一實例中，使用該CD27中和單株抗體之胺基酸序列於編制在公共抗體序列資料庫中的人類抗體資料庫中查詢。本文中所揭露或描述之重鏈變異區可用來找尋具有最高序列相似度的該人類變異區。同樣地，本文中所揭露或描述之輕鏈變異區可用來找尋具有最高序列相似度的該人類變異區。為各個鼠類變異區製備一DNA構造，其中該編碼來自鼠 類單株抗體供體的其中一個重鏈變異區的區域被轉移至所選的人類重鏈變異序列，取代該人類變異區的CDR。

將鼠類CDR區與人類變異框架區不自然的並置可造成不自然的構形限制，除非以某些胺基酸殘基取代來修正，否則該限制會導致結合親和力的喪失。如上所述，本發明之人源化抗體包含實質上來自人類免疫球蛋白的各種不同的框架區以及實質上來自小鼠免疫球蛋白(例如C2177、C2186、C2191或C2192小鼠抗體)的CDR。在確認小鼠抗體的CDR及合適的人類受體免疫球蛋白序列後，下一個步驟係決定來自這些成份的哪些殘基(如果有的話)應被取代以優化所得的人源化抗體的特性。在一般情況下，應儘量減少以鼠類胺基酸殘基取代人類胺基酸殘基，因為引進鼠類殘基會增加該抗體在人類中引發HAMA反應的風險。用來取代的胺基酸係基於其對CDR構形及/或抗原結合的可能影響來選擇。對於這些可能影響的研究可藉由建造模型、檢驗該胺基酸在特定位置的特性或經驗上觀察特定胺基酸取代或突變的影響來完成。關於經驗法，已發現要創建一可用於篩選所欲活性、結合親和力或特異性的變異體序列庫是特別便利的。一種用於創造該等變異體基因庫的形式為噬菌體呈現載體。或者，可使用用來多樣化變異域內編碼有標靶殘基的核酸序列的其他方法來產生變異體。

決定是否需要進一步取代的另一方法，以及用於取代的胺基酸殘基的選擇，可使用電腦模型完成。用於製造免疫球蛋白分子的三維影像的電腦硬體與軟體已可廣為取得。一般而言，分子模型係由經解析的免疫球蛋白鏈或其域的結構開始產生。將欲模型化的鏈與經解析的三維結構的鏈或域比較胺基酸序列相似性，並選擇顯示最大序列相似性的鏈或域作為構築該分子模型的起點。修改經解析的起始結構以使介於免疫球蛋白鏈或域與該起始結構之真實胺基酸之間的差異被模型化。然後經修正的結構被組裝為組合免疫球蛋白。最終地，該模型藉由能量模擬以及藉由確認所有原子皆彼此於適當距離內且結合長度與角度皆於化學可接受限制內而被精細化。

通常人源化抗體中的CDR區與其來源的小鼠抗體中對應的CDR區大體上相同，更通常的是完全相同。雖然不是通常想要，有時候可以在CDR殘基製造一或多個保守的胺基酸取代而不會明顯影響所得的人源化免疫球蛋白之結合親和力。偶爾，CDR區的取代可以提高結合親和力。

除了上述討論的特定胺基酸取代以外，人源化免疫球蛋白的框架區通常與其來源的人類抗體中的框架區大體上相同，更通常的是完全相同。當然，很多框架區中的胺基酸對抗體的特異性或親和力貢獻很少或沒有直接貢獻。因此，框架殘基的許多個別保守性取代不會明顯改變所得的人源化免疫球蛋白的特異性或親和力而可以被容忍。

由於編碼的簡併，每個免疫球蛋白胺基酸序列都有各種不同的核酸序列來編碼。所欲核酸序列可藉由重新合成固相DNA或藉由將該所欲多肽之較早製備的變異體以PCR突變來製造。編碼本發明所揭示的抗體的所有核酸皆涵括於本發明。

如上述製造的人類抗體的變異區段典型地係連結至人類免疫球蛋白恆定區的至少一部份。該抗體將含有輕鏈與重鏈恆定區兩者。重鏈恆定區通常包括CH1域、鉸鏈域、CH2域、CH3域，有時還會包括CH4域。

該人源化抗體可包含來自任何抗體種類的任何類型的恆定域，抗體種類包括IgM、IgG、IgD、IgA與IgE，以及任何亞種類(同型)，包括IgGI、IgG2、IgG3以及IgG4。當期望該人源化抗體顯現細胞毒性活性時，恆定域通常為補體固定恆定域且該種類典型為IgG₁。當不期望該等細胞毒性活性時，該恆定域可為IgG₂種類。該人源化抗體可包含來自一種以上的種類或同型的序列。

將編碼人源化輕鏈與重鏈變異區的核酸(視情況連結至恆定區)插入至表現載體。該輕鏈與重鏈可選殖於相同或不同的表現載體。可將編碼免疫球蛋白鏈的DNA區段操作連接至表現載體的控制序列以確保免疫球蛋白多肽的表現。該等控制序列包括一訊號序列、一啟動子、一 增強子以及一轉錄終止序列(參照Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029(1989)；WO 90/07861；Co et al.,J.Immunol.148,1149(1992)，其全文皆併入本文中作為用於所有目的之參考)。

治療性蛋白質的功效係可能因不需要的免疫反應而受到限制。非人類單株抗體可具有可引起人類免疫反應之線性胺基酸序列的實質延伸與局部結構構象。減少非人類抗體的免疫原性的第一次嘗試係建造人鼠抗體的嵌合體，接著在1980年代晚期出現人源化那些嵌合體的方法(可在Almagro and Fransson,Front Biosci 13：1619-1633,2008中複習)。

最常使用的人源化方法之一係所謂的「互補決定區(CDR)移植」，其中鼠類CDR係被移植到人類抗體框架區(FR)。然而，應用這種方法往往會導致大量損失對抗原的結合性，從而減少以該抗體為基礎的藥物的效力。因此，使用良好的設計原理來創造當注射到人體內時引起最小的免疫原性反應但保留母代非人類分子的結合性和生物物理外貌的抗體分子是非常有價值的。

本文敘述2177及2191(對CD27具有結合特異性的兩種小鼠單株抗體(mAb))的人源化。利用Janssen專有的人源化技術(稱為人類框架改編(Human Framework Adaption(HFA))，揭露於Raghunathan,G.的專利申請案US20090118127 A1並進一步經Fransson等人說明(J Mol Biol 398：214-231,2010))的第一個步驟，將這些抗體的框架(FR)以人類生殖系基因FRs取代。該技術使一組對CD27具特異性的單株抗體比起親代小鼠抗體2177及2191具有較好的結合和抑制特性。

3. 使用抗-CD27抗體之方法

如下面所詳述，本發明證實四種分離的單株抗體(C2177、C2186、C2191及C2192)會結合至CD27上的三個非覆蓋型表位並展現體外及/或體內的CD27抑制活性。值得注意的是，該單株抗體的反應性包括劑量依賴性阻斷CD27與CD70相互作用的能力；在有CD70的存在下減少CD27訊號傳遞的能力；減少T細胞產生IL-4及IFNg的能力以及抑 制CD70依賴性人類初始CD4+ T細胞增殖、抑制CD70依賴性B細胞增殖及抑制漿細胞生成的能力。此外，分離的抗體在缺少CD70刺激的情況下不會顯著誘導CD27活化。

鑑於在本發明中所述的單株抗體的性質，該抗體或其抗原結合片段皆適合作為在人類和動物中治療或預防CD27相關症狀的治療劑和預防劑。

一般而言，用途將包含將治療或預防有效量的本發明的一或多種單株抗體或抗原結合片段，或選自具有相同結合與生物活性範圍的一抗體或分子，投予至一易感對象或一顯示症狀者，其中已知CD27活性具有病理後遺症，如免疫失調或腫瘤的生長與轉移。可投予該抗體之任何活性形式，包括Fab與F(ab')2片段。

較佳地，所使用的抗體與接受者種型相容以使該個體對單株抗體的免疫反應不會造成不可接受的短循環半衰期或誘發對單株抗體的免疫反應。所投予的單株抗體可顯示某些二級功能，例如結合至該對象的Fc受體以及活化ADCC機制，以使用細胞溶解或細胞毒殺機制來去除標靶細胞族群，或可將彼等以基因工程限制或拿掉該些二級效應物功能以保存標靶細胞族群。

個體的治療可包含投予一治療有效量的本發明抗體。該抗體可如下文所述提供於一套組中。該抗體可呈混合物使用或投予，例如等量投予，或個別地依序提供或全部於一次投予。在提供給患者能結合至CD27的抗體或其片段，或能保護接受的患者對抗CD27的抗體時，投予劑的劑量會依據某些因子而變動，例如患者的年齡、體重、身高、性別、身體病況、既往病史等等。

在一類似的方法中，本發明單株抗體的另一治療用途係利用因抗本發明單株抗體之一而產生之抗獨特型抗體(anti-idiotypic antibody)來自動免疫(active immunization)一患者。以模擬該表位結構之抗獨特型來免疫可引起活躍的抗-CD27反應(Linthicum,D.S.and Farid, N.R.,Anti-idiotypes,Receptors,and Molecular Mimicry(1988),pp1-5 and 285-300)。

同樣地，可藉由投予一或多種抗原性及/或免疫原性表位作為疫苗組分而誘發自動免疫。疫苗接種可以足以使接受者產生對抗此生物性功能區的抗體的量，預防性或治療性，經口或腸道外地進行。可用抗原性/免疫原性肽之純的形式、該肽的片段或該汰的修改形式，來自動免疫該宿主。可將不相應於原始蛋白質序列的一或多種胺基酸添加至原始胜肽或截斷形式胜肽的的胺基或羧基終端。該等額外的胺基酸有用於耦合該胜肽至另一胜肽、至一大的攜帶蛋白質或至一支撐體。可用於這些目的的胺基酸包括：酪胺酸、離胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸及其衍生物。可使用其他的蛋白質修飾技術，例如NH2-乙醯化或COOH-終端醯胺化，以提供用於耦合或融合該胜肽至另一蛋白質或胜肽分子或支撐體的額外手段。

能防止不想要的CD27生物活性的抗體係打算被用來以足以有效減少、解決或改善CD27相關症狀或病狀的量提供給接受對象。若藥劑的劑量、投予路徑等足以影響該等反應，則量係稱為充足的或「治療有效量」以「有效於」症狀的減少。對於抗體投予的反應可藉由例如成像技術或藉由組織樣本的活體外分析而分析對象受到影響的組織、器官或細胞予以量測。若一藥劑的存在造成接受患者生理上有可偵測的變化，則該藥劑為生理顯著的。

治療性應用

本發明之CD27中和抗體、抗原結合片段或其特定變異體可用於量測或在細胞、組織、器官或動物(包括哺乳動物與人類)中引起反應，以診斷、監測、調控、治療、緩和、幫助預防CD27或表現CD27的細胞所調介、影響或調控的病況的發生或減輕其症狀。因此，本發明提供一種在細胞、組織、器官、動物或病患中調節或治療至少一種如該領域 中所習知或如本文中所描述之CD27相關疾病的方法，其係使用至少一種本發明之CD27抗體。特別的適應症係於下文討論。

免疫相關疾病

本發明亦提供一種在細胞、組織、器官、動物或病患中調節或治療免疫相關發炎性疾病的方法，該疾病包括但不限於類風溼性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、全身性幼年型類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反應陰性關節炎、骨關節炎、發炎性腸道疾病、潰瘍性大腸炎、全身性紅斑性狼瘡、抗磷脂症候群、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)、全身性血管炎/韋格納肉芽腫(wegener's granulomatosis)、類肉瘤病、睾丸炎/輸精管結紮逆轉手術(vasectomy reversal procedures)、過敏性/異位性疾病(atopic disease)、氣喘、過敏性鼻炎、濕疹、過敏性接觸皮膚炎、過敏性結膜炎、過敏性肺炎、移植、器官移植排斥反應、移植物對抗宿主疾病、全身性炎症反應症候群、敗血症候群、革蘭氏陽性敗血症、革蘭氏陰性敗血症、培養陰性敗血症(culture negative sepsis)、真菌性敗血症、嗜中性白血球低下發燒(neutropenic fever)、尿膿毒症(urosepsis)、腦膜炎球菌血症(meningococcemia)、創傷/出血、燒傷、游離輻射暴露、急性胰臟炎、成人呼吸窘迫症候群(adult respiratory distress syndrome)、酒精性肝炎、慢性炎性病症(chronic inflammatory pathologies)、類肉瘤病、克羅恩病(Crohn's pathology)、鐮狀細胞貧血症、糖尿病、腎病、遺傳性過敏疾病、過敏反應、花粉熱、常年性鼻炎、結膜炎、子宮內膜異位、蕁麻疹、全身過敏性反應(systemic anaphalaxis)、皮膚炎、惡性貧血、溶血性疾病、血小板減少症、任何器官或組織的移植排斥反應、腎臟移植排斥反應、心臟移植排斥反應、肝移植排斥反應、胰臟移植排斥反應、肺移植排斥反應、骨髓移植(BMT)排斥反應、皮膚移植排斥反應、軟骨移植排斥反應、硬骨移植排斥反應、小腸移植排斥反應、胎兒胸腺植入物排斥反應、副甲狀腺移植排斥反應、任何器官或組織的異種移植排斥反應 (xenograft rejection)、同種異體移植排斥反應(allograft rejection)、抗受體過敏性反應、葛瑞夫茲氏病(Graves disease)、雷諾氏症(Raynoud’s disease)、B型胰島素阻抗性糖尿病、重症肌無力、抗體調介的細胞毒性、III型過敏性反應、POEMS症候群(多發性神經病變、器官腫大、內分泌異常、單株球蛋白症(monoclonal gammopathy)和皮膚變化症候群)、天疱瘡、硬皮病、混合性結締組織疾病、特發性愛迪生氏病(idiopathic Addison’s disease)、糖尿病、慢性活動性肝炎(chronic active hepatitis)、原發性膽汁性肝硬化(primary billiary cirrhosis)、白斑病(vitiligo)、血管炎、心肌梗塞後心切開術症候群、IV型過敏、接觸性皮膚炎、由於細胞內有機體而產生之肉芽腫、藥物敏感性、代謝性/特發性、威爾森氏症、血色病(hemachromatosis)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病視網膜病變、橋本氏甲狀腺炎、骨質疏鬆症、下丘腦-腦下垂體-腎上腺軸的評估、甲狀腺炎、腦脊髓炎、惡病質、囊腫纖維化、新生兒慢性肺部疾病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、家族性噬血症候群(familial hematophagocytic lymphohistiocytosis)、皮膚病、牛皮癬、禿髮、腎病症候群、腎炎、腎絲球腎炎、急性腎功能衰竭、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、OKT3治療、抗CD3治療、細胞介素治療、化學治療、放射治療(包括但不限於例如無力、貧血、惡病質等等)、慢性水楊酸中毒等等。

肺部疾病

本發明亦提供一種在細胞、組織、器官、動物或病患中調節或治療肺部或胸膜疾病的方法，其包括但不限於調節對相關細胞或輔助細胞的免疫反應或在例如以下列舉中涉及CD27之細胞進程：肺炎；肺膿瘍；由粉塵、氣體或煙霧形式之媒介所引起之職業性肺部疾病；氣喘、纖維閉塞性細支氣管炎(bronchiolitis fibrosa obliterans)、呼吸衰竭、肺部過敏性疾病(包括過敏性肺炎(外源性過敏性肺泡炎)、過敏性支氣管肺麴菌症(allergic bronchopulmonary aspergillosis)與藥物反應)；成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、肺出血腎炎症候群(Goodpasture’s Syndrome)、慢性 阻塞性氣道疾病(COPD)、特發性間質性肺病(如特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)、類肉瘤病、脫屑性間質性肺炎(desquamative interstitial pneumonia)、急性間質性肺炎、呼吸性細支氣管炎相關的間質性肺病、特發性阻塞性細支氣管炎合併器質化肺炎(idiopathic bronchiolitis obliterans with organizing pneumonia)、淋巴細胞性間質性肺炎、蘭格罕細胞組織球增生症(Langerhans' cell granulomatosis)、特發性肺鐵質沉著症(idiopathic pulmonary hemosiderosis)；急性支氣管炎、肺泡蛋白質沉著症(pulmonary alveolar proteinosis)、支氣管擴張、胸膜異常、肺不張、囊腫纖維化及肺部腫瘤，以及肺栓塞。

惡性疾病

本發明亦提供一種在細胞、組織、器官、動物或病患中調節或治療惡性疾病的方法，其包括但不限於調節對相關細胞或輔助細胞的免疫反應或在以下列舉之至少其中一種中涉及CD27之細胞進程：白血病、急性白血病、急性淋巴性白血病(ALL)、B細胞、T細胞或FAB ALL、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病、骨髓發育不良症候群(MDS)、淋巴瘤、霍奇金氏病、惡性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、多發性骨髓瘤、原發病或轉移性疾病之固態腫瘤、卡波西氏肉瘤、大腸直腸癌、胰臟癌、腎細胞癌、包括間皮瘤之肺癌、乳癌、鼻咽癌、惡性組織球病、腫瘤相關症候群(paraneoplastic syndrome)/惡性高鈣血症、腺癌、鱗狀細胞癌、肉瘤、惡性黑色素瘤(尤其是轉移性黑色素瘤)、血管瘤、轉移性疾病、癌症相關的骨吸收、癌症相關的骨痛等等。

心血管疾病

本發明亦提供一種在細胞、組織、器官、動物或病患中調節或治療心血管疾病的方法，其包括但不限於調節對相關細胞或輔助細胞 的免疫反應或在以下列舉之至少其中一種中涉及CD27之細胞進程：心肌梗塞、鬱血性心衰竭、中風、缺血性中風、出血、動脈硬化、動脈粥狀硬化、再狹窄(restenosis)、糖尿病性動脈硬化疾病(diabetic atheriosclerotic disease)、高血壓、動脈性高血壓、腎血管性高血壓、暈厥、休克、心血管系統梅毒(syphilis of the cardiovascular system)、心臟衰竭、肺原性心臟病、原發性肺動脈高血壓、心律不整、心房異位搏動(atrial ectopic beats)、心房撲動、心房震顫(持續性或陣發性)、後灌注症候群(post perfusion syndrome)、心肺循環炎症反應(cardiopulmonary bypass inflammation response)、紊亂性或多源性前房心搏過速、一般窄的QRS心搏過速(regular narrow QRS tachycardia)、特異性節律不整(specific arrythmias)、心室纖維性顫動、希氏束節律不整(His bundle arrythmias)、房室傳導阻滯、束支傳導阻滯、心肌缺血性疾病、冠狀動脈疾病、心絞痛、心肌病、擴張性充血性心肌病(dilated congestive cardiomyopathy)、限制性心肌病(restrictive cardiomyopathy)、心臟瓣膜疾病、心內膜炎、心包膜疾病、心臟腫瘤、主動脈和週邊動脈瘤(aordic and peripheral aneuryisms)、主動脈剝離、主動脈炎、腹主動脈及其分支的閉塞、周圍血管疾病、動脈阻塞疾病、週邊動脈粥狀硬化疾病(peripheral atherlosclerotic disease)、阻塞血栓性血管炎(thromboangitis obliterans)、功能性週邊動脈疾病(functional peripheral arterial disorders)、雷諾氏現象和疾病、手足發紺、肢端紅痛症、靜脈疾病、靜脈栓塞、靜脈曲張、動靜脈瘻管、淋巴水腫(lymphederma)、脂性水腫(lipedema)、不穩定型心絞痛、再灌流傷害(reperfusion injury)、後幫浦症候群(post pump syndrome)、缺血再灌流傷害等等。

神經性疾病

本發明亦提供一種在細胞、組織、器官、動物或病患中調節或治療神經性疾病的方法，其包括但不限於調節對相關細胞或輔助細胞的免疫反應或在以下列舉中涉及CD27之細胞進程：神經退化性疾病、多 發性硬化症、偏頭痛(migraine headache)、愛滋病癡呆複合症狀(AIDS dementia complex)、髓鞘脫失病(如多發性硬化症及急性橫貫性脊髓炎)；錐體外和小腦疾病(如皮質系統病變)；基底神經節的疾病或小腦疾病；過動症(hyperkinetic movement disorders)(如亨汀頓氏舞蹈症及老年性舞蹈病(senile chorea))；藥物引起的運動障礙(如因阻斷CNS多巴胺受體之藥物所引起之異常)；運動功能減退的運動障礙(帕金森氏症)；進行性核上麻痺(Progressive supranucleo Palsy)；小腦的結構性病變；脊髓小腦變性症(如脊髓共濟失調(spinal ataxia)、弗裏德賴希共濟失調(Friedreich's ataxia)、小腦皮質變性、多系統變性(Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager及Machado-Joseph))；全身性疾病(雷夫蘇姆氏病症(Refsum's disease)、無β脂蛋白血症(abetalipoprotemia)、共濟失調、毛細血管擴張及粒線體多系統疾病)；脫髓鞘核心障礙(demyelinating core disorders)(如多發性硬化症、急性橫貫性脊髓炎)；及運動單位失調(如神經性肌肉萎縮(前角細胞變性(anterior horn cell degeneration)如肌萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、嬰兒型脊髓性肌萎縮症(infantile spinal muscular atrophy)及少年型脊髓性肌萎縮症(juvenile spinal muscular atrophy)))；阿茲海默症；唐氏症；擴散性路易體症(diffuse Lewy body disease)；與路易體發育相關之老年癡呆症；高沙可夫症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome)；慢性酒精中毒；庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakob disease)；亞急性硬化泛腦炎、哈雷若登-斯帕茨病(Hallerrorden-Spatz disease)；以及拳擊手型失智症等等。這樣的方法可視情況包含投予一有效量的包含至少一TNF抗體或其特定部份或變異體之組合物或醫藥組合物至需要該調節、治療或療法的細胞、組織、器官、動物或病患。

CD27中和抗體的其它治療用途

除了上述的病況和疾病，本發明亦提供一種調節或治療各種病因引起的纖維化狀況的方法，其係藉由調節對相關細胞或輔助細胞的 免疫反應或在例如以下列舉中涉及CD27之細胞進程：肝纖維化(包括但不限於酒精引起的肝硬化、病毒引起的肝硬化、自體免疫引起的肝炎)；肺纖維化(包括但不限於硬皮病、特發性肺纖維化)；腎纖維化(包括但不限於硬皮病、糖尿病腎炎、腎絲球腎炎、狼瘡性腎炎)；真皮纖維化(包括但不限於硬皮病、肥厚型及蟹足腫型疤痕、燒傷)；骨髓纖維化；神經纖維瘤病；纖維瘤；腸纖維化；及手術過程中造成的纖維化沾黏。

本發明亦提供一種在細胞、組織、器官、動物或病患中調節或治療或改善傳染病的症狀的方法，其係藉由調節對相關細胞或輔助細胞的免疫反應或在例如以下列舉中涉及CD27之細胞進程：急性或慢性細菌感染、急性和慢性的寄生或感染過程(包括細菌、病毒和真菌感染)、HIV感染/HIV神經病變、腦膜炎、肝炎(A、B或C等等)、敗血性關節炎、腹膜炎、肺炎、會厭炎、大腸桿菌(E.coli)、溶血性尿毒症候群、瘧疾、出血性登革熱、利什曼體病、麻瘋、中毒性休克症候群、鏈球菌肌炎(streptococcal myositis)、氣性壞疽、結核分枝桿菌、鳥型細胞內的分枝桿菌(mycobacterium avium intracellulare)、卡氏肺囊蟲肺炎、盆腔炎、睾丸炎或副睪炎、退伍軍人菌(legionella)、萊姆病(lyme disease)、流行性感冒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、病毒相關之噬血症候群、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎等等。

在本申請案全文中所有引用之參考文獻的內容(包括參考文獻、核准的專利、公開的專利申請案、同時申請中的專利申請案)均明確地納入本文中以供參考。

在下面一系列用於說明本發明而非意圖對其進行限制之例示性實施例的描述中，本發明之其他特徵將變得顯著。

4. 醫藥配方

本發明提供CD27中和抗體的穩定配方，其較佳為磷酸鹽緩衝水溶液或混合鹽溶液，以及保存溶液及調配物以及適合用於醫藥或獸醫用途之多用途保存配方，並包含至少一種CD27中和抗體在醫藥上可接 受之配方。合適的媒液及其配方(包括其他的人類蛋白，例如人血清白蛋白)在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21^st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5中有描述。

為了形成適合用於有效給藥之醫藥上可接受之組合物，該組合物將包含一有效量的上述化合物以及一合適量的媒液載體。可採用其他的醫藥方法來控制作用期間。可透過使用聚合物來複合或吸收化合物以完成控制釋放製劑。利用控制釋放製劑控制作用期間的另一種可能方法係將本發明化合物併入聚合材料(如聚酯、聚胺基酸，水凝膠、聚(乳酸)或乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(ethylene vinylacetate copolymer))之顆粒中。或者，可能可以將這些材料包入製備的微膠囊中(例如分別將如羥甲基纖維素或明膠微膠囊與聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊界面聚合)，或膠體藥物傳遞系統中(例如微脂體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)，或巨乳液中，來取代將這些試劑併入聚合物顆粒中。該些技術係揭露於Remington supra(2006)。

5. CD27中和抗體之投予

根據本發明，至少一種在穩定或保存配方或本文所述溶液中之CD27中和抗體可透過各種不同傳遞方法被投予至一病患，該傳遞方法包括靜脈注射(I.V.)、肌肉注射(I.M.)；皮下注射(S.C.)；經皮傳遞、肺部傳遞、黏膜傳遞、使用植入物中的配方、滲透泵、匣(cartridge)、微型泵或熟諳此技藝者所理解的其他裝置，如該領域中所習知。

在一種投予CD27中和抗體的方法中，係經由預先安裝的配備有輸液袋的導管來靜脈注射給予藥物物質。該CD27中和抗體係被提供於20毫升的單次使用小瓶中，如那些由ImmunoGen,Inc.(Cambridge,MA)所提供者。每個小瓶包含在緩衝溶液(pH 6.5±0.5)中濃度從0.05至約2.0mg/ml的蛋白，該緩衝溶液基本上包含磷酸二氫鉀(0.57mg/ml)、磷酸二氫鈉一水合物(monobasic sodium phosphate monohydrate)(0.20 mg/ml)、磷酸氫二鈉(dibasic sodium phosphate)(0.555mg/ml)及在純水(USP)中的氯化鈉(8.16mg/ml)。在滴注該劑量體積進輸液袋後，將該藥物產物通過一低蛋白結合5-μ過濾器預過濾兩次，並在8小時的準備時間內透過一內部的0.22μm過濾器投予至病患。輸液後，靜脈注射線應以液體沖洗，以確保全部的藥物劑量都有被傳送。

一般來說，如果是投予一種全身性劑量的抗體，提供給該接受者的抗體劑量範圍最好約1ng/kg至100ng/kg、100ng/kg至500ng/kg、500ng/kg至1ug/kg、1ug/kg至100ug/kg、100ug/kg至500ug/kg、500ug/kg至1mg/kg、1mg/kg至50mg/kg、50mg/kg至100mg/kg、100mg/kg至500mg/kg(接受者的體重)，雖然也可投予較低或較高的劑量。低至約1.0mg/kg的劑量也可預期會表現出一些療效。較佳地，約5mg/kg是一個可以接受的劑量，雖然高達50mg/kg的劑量水平也是優選的，尤其是在用於治療用途時。或者，也可能不基於病患體重來投予一特定量的抗體，如一用量範圍為1ug-100ug、1mg-100mg或1gm-100gm。舉例而言，位點特異性的給藥可能係投予至體隔室或體腔，如關節內、支氣管內、腹腔內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、側腦室、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、腹膜內、心包腔內、腹腔內、胸腔內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊椎內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、病灶內、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內、或經皮的方法。

治療可為單一劑量排程，或較佳為多劑量排程，其中治療的主要療程可為1至10的不同劑量，接著以需要維持或加強反應的隨後時間間隔給予其他劑量，例如第二劑量為1至4個月，以及如果需要的話，於數個月後給予後續劑量。合適的治療排程的實例包括：(i)0、1個月及6個月，(ii)0、7日及1個月，(iii)0及1個月，(iv)0及6個月，或其他足以引出所需反應並被期望以此來減少疾病症狀或降低疾病嚴重性的排程。

6. 包含CD27中和抗體的製品

本發明包括含有可用於治療上述疾病的材料的製品，其包含一CD27中和抗體、一容器及一與該容器結合或插在容器上之標籤或包裝。該製品較佳係含有至少一小瓶，其包含至少一CD27中和抗體與指定緩衝劑及/或防腐劑(視情況為一水性稀釋液)的溶液，其中該包裝材料包含一標籤以指出該溶液可保存一段時間。本發明可包含一製品，其包含包裝材料、一包含凍乾的CD27中和抗體的第一小瓶以及一包含指定緩衝劑或防腐劑的水性稀釋液的第二小瓶，其中該包裝材料包含一標籤以指示醫生或病患如何在該水性稀釋液中重新構成該CD27中和抗體以形成一溶液。

合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等等。該容器可由各種不同的材料形成，如玻璃或塑膠。該容器可具有一無菌出入口(例如該容器可為一靜脈輸液袋或一具有塞子的小瓶，視情況能夠被皮下注射針刺穿)。

在該組合物中至少有一活性成分為CD27中和抗體。該標籤或包裝插入物指出該組合物係用於治療選擇的適應症，如全身性紅斑狼瘡(SLE)。本文中之包裝插入物可指出該抗體或組合物係用來治療在標準護理下對治療無反應或反應不佳之病況，如本文對特定疾病和診斷之概述。在其他實施例中，該包裝插入物可指出該抗體、抗體共軛物或組合物也可用來治療特徵為需要調節涉及CD27之細胞進程之免疫反應之疾病。

本發明之又一個態樣係一種用於在生物樣品中檢測CD27之套組。該套組包括一裝有一或多個抗體之容器(該抗體與CD27之表位結合)以及使用該抗體來結合CD27以形成一免疫複合物並檢測該免疫複合物之形成使得該免疫複合物的存在或不存在與該樣品中CD27的存在或不存在相關聯之說明。容器的實例包括多孔板，其可同時檢測多個樣品中的CD27。

雖然已經籠統描述過本發明，本發明實施例將於以下實例中進一步地被揭露。

實例1：CD27試劑和方法

為了產生和測試CD27結合單株抗體，產生代表人類CD70及人類CD27及人類CD27胞外區域(ECD)全長的蛋白質結構。

人類CD27(SEQ ID NO：149)係一種1型跨膜蛋白，包含一單一胜肽(殘基1至20)、胞外區域(ECD，殘基21至191)、跨膜區域(TM，殘基191至212)及胞內區域(ICD，殘基213至260)。人類CD70(SEQ ID NO：2)係一種長度為193個胺基酸的2型跨膜多肽，從N端末端開始包含一胞內區域(ICD，殘基1至17)、跨膜區域(TM，殘基18至38)及胞外區域(ECD，殘基39至193)。完整的CD70編碼序列係以選殖地方式(clonally)表現在HEK 293細胞的表面。

用於單株抗體ELISA及以Proteon為基礎的直接結合分析的該CD27 ECD之胺基酸1-121係短暫表現於HEK293細胞中並在C端末端帶有His6-標籤胜肽，並藉由金屬離子層析法純化。用於噬菌體淘選法(phage panning)及ELISA分析的該ECD之胺基酸1-173(C端末端帶有His6-標籤)係由HEK表現，並在金屬離子層析法之後接著用使用Superdex 75的大小排阻層析法(size exclusion chromatography)純化。以上兩種CD27蛋白皆使用化學標靶至蛋白上胺殘基之NHS-酯來生物素化。用於結晶的胺基酸1-101(C端末端帶有His6-標籤)係於一桿狀病毒系統中表現並藉由金屬離子層析法(Proteose,Inc)純化。用於免疫小鼠的CD27-Fc蛋白係購自R&D Systems。用於在某些研究中的完整CD27編碼序列係以選殖地方式表現在HEK 293細胞的表面。

人類CD27和人類CD70 cDNA殖株(clone)係購自Open Biosystems。使用標準的分子生物學技術來產生表現構造。簡言之，將該CD27及CD70基因的開放讀碼區(open reading frames)以PCR擴增並透過限制性核酸內切酶的消化及連接，或是透過不依賴連接酶的選殖法(ligase independent cloning(LIC))來選殖進哺乳動物表現載體。將全長的CD27及CD70基因選殖進表現載體並以選殖地方式表現在哺乳動物細 胞的表面。將CD27的胞外區域選殖進哺乳動物表現載體並以尾端帶有六個His的形式短暫地表現於HEK293細胞中。

實例2：CD27中和抗體的產生

鼠類抗人類CD27抗體係以融合瘤方法(Kohler and Milstein(1975))生成。十隻12-14週大的C3H/HeJ小鼠係取得自Charles River Laboratories。在第1天，將該小鼠在尾巴基部(BOT)以50微克的Hu CD27 Fc(R&D Systems)各結合使用0.33×10⁵單位的鼠類干擾素-α及干擾素-β(Biosource)(最終量為100微升)進行皮下(SQ)免疫。在第2天及第3天，將該小鼠在尾巴基部皮下注射干擾素(與第1天的劑量相同)。在第14天(即取脾臟融合的四天前)，將小鼠在尾巴基部皮下給予在PBS中50微克的Hu CD27-Fc結合使用50微克的抗鼠類CD40促效劑單株抗體(R&D Systems,MAB440)來增強免疫。

為了效價評估，進行捕獲階段(capture phase)的環境影響評估(EIA)。簡言之，在培養盤(Nunc-Maxisorp)上於4℃塗布於碳酸氫鹽緩衝液中的0.1微克山羊抗ms Fc(Jackson Immunotech)並過夜。在阻斷和清洗步驟後，加入稀釋的血清並在室溫下培養該盤30分鐘。在清洗步驟後，於室溫下以在阻斷緩衝液中0.25微克/mL生物素化的Hu CD27-ECD培養該培養盤30分鐘並以HRP標記的鏈黴親和素(Jackson Immunotech)(以1：40,000稀釋於0.4% BSA/PBS)作為探針於室溫下探測30分鐘。如上述所言清洗培養盤；接著加入OPD(Sigma fast tabs)受質溶液(substrate solution)，在室溫下培養10分鐘，每孔加入25微升的4N硫酸以終止呈色受質發展，在490nm測量吸光度。

非分泌型BALB/c小鼠骨髓瘤融合對象FO的細胞庫係購自ATCC(# CRL-1646)。將一FO細胞的冷凍小瓶解凍並以添加有10%(v/v)FBS(Hyclone)的Glutamax^TM(配方經過修改)培養基(Invitrogen)重新懸浮於DMEM中。由Charles River實驗室將該細胞擴張、凍存並視作無菌且沒有黴漿菌。此融合中亦使用C1833A(Centocor)細胞株。該細 胞株係藉由在FO細胞株中抑制CHOP基因的表現來自行產生，因此其需要在遺傳黴素的選擇下生長。如上述FO細胞處理方式處理細胞，除了細胞是生長在具有添加10%(v/v)FBS(Hyclone)及500ug/mL遺傳黴素(Gibco)的Glutamax^TM(配方經過修改)培養基的DMEM中。在融合前將FO及C1833A細胞株都進行細胞同步化。簡言之，將1.5-2×108個細胞種進180mL的DMEM(含有添加0.25%(v/v)FBS(Hyclone)的Glutamax^TM(配方經過修改)培養基)中並在37℃培養13小時。加入額外20mL的FBS使最終FBS濃度為10%，並在使用前於37℃再額外培養13小時。在整個細胞同步過程，C1833A細胞係不斷地經遺傳黴素選擇。在融合前將骨髓瘤細胞以PBS清洗、計數並透過Guava Viacount軟體測定活力(>78%)。

在融合當天，將動物以CO₂窒息來安樂死。在無菌條件下取出脾臟並浸泡在10mL的含有抗生素(PSA)(Sigma)的冰冷磷酸鹽緩衝液(PBS)中。

製備脾細胞的單一細胞懸浮液並利用紅血球裂解緩衝液(RBC lysis buffer(Sigma))將其中的紅血球裂解。按照製造商的說明，將清洗過的細胞使用抗鼠類Thy1.2、抗鼠類/人類CD11b及抗鼠類IgM磁珠(Miltenyi Biotec編號分別為130-049-101、130-149-601及130-047-301)標記以用於磁珠分選(magnetic sorting)，並接著使用AutoMacs Pro儀器運行Deplete程式進行分選。收集未標記的(富含漿母細胞階段的B細胞)及標記的細胞分層並接著用Guava PCA計數。丟棄明確具有標記的細胞。將未標記的細胞分成兩半以用於分別融合至融合對象FO與C1833A。根據De St.Groth(J Immunological Methods.35：1-21.1980)的方法，將鼠類骨髓瘤細胞與活的脾細胞以1：1的比率進行融合。簡言之，將脾細胞與骨髓瘤細胞混合在一起，使其沈澱成小丸(pellet)並以50mL的PBS清洗一次。於37℃將該小丸重新懸浮於1mL的聚乙二醇(PEG)溶液(2g分子量為4000的PEG、2mL DMEM以及0.4mL DMSO)中30秒。接著將該細胞融合混合物浸泡於37℃的水浴中並輕輕搖動約60秒。在1分鐘 的時間內緩慢加入37℃ DMEM以終止該融合反應。將該融合細胞在室溫下靜置5分鐘，接著以150×g離心5分鐘。接著將細胞重新懸浮於HAT培養基【DMEM中含Glutamax^TM(配方經過修改)，添加有20% FBS、5% Origen、25μg/mL建它黴素(gentamicin)(Sigma)以及HAT(100μM次黃嘌呤、0.4μM胺蝶呤及16μM胸苷(thymidine)(Sigma)】並種進96孔的平底聚苯乙烯組織培養盤(Corning # 3997)或含有約2.25μg/mL的AF488人類CD27(Janssen Research & Development,LLC)的甲基纖維素培養基(StemCell Technologies,MediumD cat# 03804)。在加濕的37℃培養箱以7% CO₂培養培養盤7至10天。從甲基纖維素培養盤中選出單一群落並利用ClonepixFL或在白光顯微鏡下篩選。

實例3：重組單株抗體之生物活性

如下所述，利用各種不同的體外分析試驗來分析源自鼠類抗體的結合區域結合至CD27以及阻斷某些CD27生物活性的能力。

使用一固相EIA以在融合瘤上清液中篩選能夠與人類CD27結合之抗體。於4℃，將培養盤(Nunc-Maxisorp #446612)以碳酸氫鹽緩衝液O/N中的4μg/mL Fab山羊抗huFc(Jackson #109-006-098)塗佈並過夜。之後不經過清洗，在室溫下將培養孔以200微升在PBS中的0.4%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)阻斷1小時。以含0.02%(w/v)Tween 20的0.15M鹽水清洗過後，在室溫下加入50微升於0.4% BSA/PBS中的huCD27-Fc至培養盤1小時。再次清洗過後，於室溫下將50微升未稀釋的融合瘤上清液培養在塗佈過的培養盤上30分鐘。清洗培養盤三次並接著於室溫下以50微升經1：10,000稀釋的山羊抗鼠類Fc HRP(Jackson # 115-036-071)培養30分鐘。再次清洗培養盤並使其如上述生長以進行效價評估。為了評估融合瘤單株抗體的相對結合能力，使用Maxisorp 384孔培養盤(NUNC 464718)與連續稀釋的融合瘤上清液(標準化到5microg/mL的起始濃度)進行相似的分析試驗。該分析試驗確定了386個陽性反應的融合瘤。

利用生化結合分析試驗，使用IM-9細胞(一種被發現會內源性表現人類CD70的B淋巴母細胞株(B-lymphoblastoid cell line))將所有386個CD27特異性融合瘤篩選出具備抑制huCD27與huCD70結合能力者。將Maxisorp培養盤(VWR # 62409-314)塗佈250毫微克(ng)/mL的重組人類CD27/Fc(R&D Systems,Cat# 382-CD)並於4℃培養過夜。隔天將培養盤以阻斷緩衝液(Pierce,Cat#37543)阻斷並接著以清洗緩衝液I(含有無Ca++或無Mg++的PBS、0.01% Tween-20)清洗。每個培養盤中也包括有對照組(小鼠對hCD27之單株抗體，R&D Systems，Cat# MAB382；小鼠IgG1同型對照，R&D Systems，Cat# MAB002；小鼠IgG2a同型對照，R&D Systems，Cat# MAB003)。將每孔50uL的融合瘤樣品或對照組與每孔50μL的捕獲IM-9細胞(人類B淋巴母細胞株(ATCC,CCL-159))混合並在室溫下不搖動培養1小時。培養結束時，將培養盤以清洗緩衝液II清洗以移除所有未結合的細胞，並接著以每孔50uL的Cell Titer Glo試劑(Promega,Cat# G7571)溶解細胞。在10分鐘的搖動培養後，將培養盤以Envision(PerkinElmer，2102多標記讀取機(Multilabel reader))讀取。產生的冷光訊號與ATP存在的量成比例並與培養孔中被CD27結合抓住的活細胞存在的數量直接相關。根據該生化結合分析試驗的結果，約50%的CD27特異性殖株被中和。

為了消除多餘的中和殖株，進行競爭結合分析以將該抗體分至競爭組。在該分析試驗中，個別評估融合瘤上清液是否能與面板上每個陽性反應融合瘤作為捕獲和檢測試劑。互相之間形成有效捕獲/檢測試劑的抗體很可能會辨識CD27蛋白上空間分隔的表位，因此可以使兩個抗體同時結合至標的蛋白。在整個面板上展現類似活動模式的殖株群很可能會結合至相似的表位。因此，從不同群組選擇殖株會提供辨識不同表位的抗體。簡言之，於4℃以塗佈緩衝液中的山羊抗小鼠Fc(JIR115-005-071)塗佈384孔的Nunc Maxisorp盤(464718)並過夜。接著在室溫下以PBS中的0.4% BSA阻斷培養盤30分鐘。在此步驟以及所有接下來的步驟中，以PBS、0.02% Tween-20清洗培養盤。一列的各孔中(每個上清液一列) 均給予20uL的上清液(初步篩選時使用純上清液，但是當再篩選時該亞殖株(supes)係標準化至2ug/ml單株抗體)並伴隨有對照組(小鼠抗huCD27，R&D Systems，Cat# MAB382；小鼠同型對照Cat#555439，Becton-Dickenson)，接著在室溫下培養30分鐘。清洗後，製備25uL在PBS中的未標記Hu CD27-ECD-His標籤並且在所有培養孔中加入0.3(或在濃度標準化時為0.8)ug/ml的10%小鼠血清(Bioreclamation小鼠血清CD-1 lot#MSEBREC.18565)，接著在室溫下培養30分鐘並隨後清洗。將每個上清液加入單欄中並與25uL如下製備之混合液在室溫下培養30分鐘：將上清液與山羊抗小鼠Fc HRP(Jackson 115-036-008)預先培養，方法為將150uL的1：1000山羊抗小鼠Fc HRP與各個1000uL上清液混合(初步篩選時)或將90uL的1：2000山羊抗小鼠Fc HRP與各個600uL上清液混合再調整至2ug/mL(再篩選亞殖株時)。在室溫下培養30分鐘後，每毫升加入200uL的100%正常小鼠血清並在室溫下額外培養30分鐘。清洗培養盤，接著每孔以100uL的檸檬酸鹽-磷酸鹽受質溶液(0.1M檸檬酸及0.2M磷酸鈉、0.01% H2O2以及1mg/mL OPD)在室溫下培養15分鐘。加入25uL的4N硫酸以終止受質生長，並使用自動培養盤讀取機在490nm測量吸光度。此分級分析試驗確認有三個群組會辨識huCD27抗原上的非重疊結合位點。將來自所有三組的選擇抗體按比例增加以用於抗體生產、純化及進一步在功能分析中的試驗。

細胞訊號傳遞的抑制

CD70與CD27的結合會誘導訊號傳遞而導致下游轉錄因子NF-kβ的活化。建立NF-kβ報導子分析試驗已用於進一步的抗體特性分析。該分析試驗係以兩種模式進行：(1)藉由中和CD70誘導的CD27活化來評估抗體的拮抗作用，及(2)藉由在沒有CD70接合的情況下活化CD27訊號傳遞來評估抗體的拮抗作用。將全部36ng含有人類CD27及螢光素酶構造的DNA在NF-kβ啟動子的控制下轉染進HEK-293F細胞。將HEK-293F轉染細胞以每孔5×10⁴個細胞(於40uL Freestyle培養 基(Gibco)中)塗在96孔培養盤上。在該分析培養盤中加入CD27中和融合瘤單株抗體的稀釋液(於Freestyle培養基(Gibco)中，用1：3稀釋，最終濃度為50ug/mL)並將培養盤於37℃(95% O₂/5% CO₂)培養一小時。為了測試融合瘤單株抗體中和CD70：CD27訊號傳遞的能力，在該分析培養盤中加入數量為CD27轉染細胞數20%的經定期照射(4000rads)的HEK-293E CD70游離細胞。為了測試融合瘤單株抗體的促效活性，省去CD70游離細胞的添加。將分析培養盤於37℃(95% O₂/5% CO₂)培養過夜並根據廠商說明使用Steady-Glo®螢光素酶分析系統(Promega)使其生長。選擇四種CD27中和融合瘤單株抗體C2177、C2186、C2191及C2192(其會劑量依賴性阻斷CD70調介的CD27訊號傳遞且在缺乏CD70刺激的情況下不會造成CD27受體顯著的劑量依賴性促效活化)用於進一步的特性分析。這四種抗體阻斷IM-9細胞與CD27結合以及在NF-kβ報導基因分析試驗中阻斷CD70調介的訊號傳遞的IC₅₀係總結於表1中。在缺少CD70的刺激下，NF-kβ報導基因分析試驗中的促效活性在抗體的最高測試濃度相對於一個不相干的同型對照抗體(小鼠IgG1對大鼠EMP蛋白)，於CD27的訊號傳遞顯示出成倍增加。

對CD27的親和力

藉由Biacore測量抗體C2177、C2186、C2191及C2192對單體可溶性CD27於25℃的K_D並報導於表1。在BIACORE 3000(BIAcore,Inc.)表面電漿子共振(SPR)儀器上進行分析。該樣品係製備於含0.005%界面活性劑(聚山梨醇酯20)的Dulbecco’s磷酸鹽緩衝液中(pH 7.4)。將山羊抗小鼠Fc特異性抗體(Jackson Immunoresearch laboratories Prod # 115-005-071)共價連接到塗佈有羧甲基葡聚糖的黃金表面(CM-5 Chip,Biacore)。在固定化之前，將該晶片以50mM NaOH、100mM HCl及0.1%十二基硫酸鈉預處理並在每次預處理之間注射去離子水。使用廠商對胺耦合化學之說明，將該抗體以10mM醋酸鈉緩衝液(pH 4.5)稀釋並耦合至該晶片之羧甲基葡聚糖表面。利用鹽酸乙醇胺 (ethanolamine-HCl)將該表面上剩餘的反應性基團去活化。在感測器表面透過Fc結構域捕捉單株抗體。監測以遞增濃度(0.6-150nM，連續4倍稀釋)注射進的人類CD27 ECD的結合三分鐘且監測解離十分鐘。使用兩種100mM磷酸的3秒脈衝(pulse)將捕捉表面再生至基線最佳化。使用Scrubber軟體(版本1.1g(BioLogic Software))處理數據。進行數據的雙重參考減法(Double reference subtraction)以校正緩衝液對訊號之貢獻以及儀器雜訊。使用Biaevaluation 4.0.1軟體(GE Healthcare Bio-Sciences,Uppsala,Sweden)進行處理數據之動力學分析。表示CD27單價結合的結合外型以1：1的結合模型來描述。

細胞增殖的抑制

在培養中以抗CD3加上抗CD28抗體次佳活化的T細胞增殖係經由CD70接合表現在T細胞上的CD27來增強。評估該四種鼠類中和抗體在CD70的存在下抑制T細胞增殖的能力以及在缺乏CD70的情況下誘導增殖的能力。冷凍的CD4+ T細胞係購自AllCells,LLC。將細胞解凍並放進含10% FBS、1%左旋麩醯胺酸及1%青黴素-鏈黴素的IMDM 培養基中。在將細胞放進培養盤之前，於4℃將1ug/78mL於PBS中的抗CD3(OKT3)抗體塗佈在一U型底培養盤上過夜。計數細胞，將濃度調為每毫升1×10⁶個細胞並每孔放進1×10⁵個細胞。每孔加入1ug/mL的可溶性抗CD28作為第二活化訊號。將轉染有人類CD70或空載體(mock)的經照射的(6000rads)HEK細胞以每孔2×10⁴個細胞(20%)加入至適當的培養孔中。刺激細胞3天，加入0.9uCi胸苷[甲基-3H]至所有樣品孔中並將該細胞培養18-24小時。刺激後的第四天，使用PE Filtermate Harvester將細胞捕獲至一過濾培養盤(filter plate)上。使該培養盤乾燥並加入30uL的MicroScintTM-20至所有樣品孔中。在PE TopCount NXT上讀取該培養盤，收集的數據為CPM。在缺乏CD70的情況下，抗體C2177顯示出會劑量依賴性抑制CD70調介的T細胞增殖以及非常微弱的內在促效活性(圖1)。在C2186、C2191及C2192抗體也觀察到相似的結果。這些抗體的IC₅₀及最大抑制%係報導於表2。在缺乏CD70接合的情況下，所有這些抗體均未顯示出對增殖有一致的刺激，表示缺少內在促效活性。

此外，該C2177、C2186、C2191及C2192抗體顯示出會劑量依賴性抑制CD70調介的T細胞增殖，如在CSFE分析試驗中所測量，且在缺乏CD70刺激的情況下對增殖沒有影響。冷凍的CD3+ T細胞係購自AllCells,LLC。將細胞解凍並放進含10% FBS、1%左旋麩醯胺酸及1%青黴素-鏈黴素的IMDM培養基中。將細胞預先以2.5mM CFSE(Invitrogen)標記，以FBS中止反應並以T細胞培養基清洗。CFSE係一種染料，其會被動擴散進入細胞並且在與細胞內的胺結合後變成帶有高度螢光。細胞分裂後每個子細胞將包含母細胞一半的CFSE標記，因此藉由追踪具不同CFSE強度的細胞數量可以監測細胞的增殖。將細胞濃度調整為每毫升具有1×10⁶個細胞，並每孔放進1×10⁵個細胞。在將細胞放進培養盤之前，於4℃將0.5ug/mL於PBS中的抗CD3(OKT3)抗體塗佈在一U型底培養盤上過夜。每孔加入0.1ug/mL的可溶性抗CD28作為第二活化訊號。將轉染有人類CD70或空載體(mock)的經照射的(6000rads) HEK細胞以每孔2×10⁴個細胞(20%)加入至適當的培養孔中。刺激細胞4天並藉由FACS分析以計數含有不同強度級別的CFSE標記的分裂細胞。

血漿芽細胞(plasma blast)分化的抑制

在血漿芽細胞分化分析試驗中，以原發性人類B細胞測試該CD27中和融合瘤單株抗體。將自正常供體的週邊血液(取得自AllCells)負選擇之CD19+人類B淋巴球在1ug/mL抗CD40抗體(殖株MAB89，Abcam)及100ng/mL介白素21(Invitrogen)或是1ug/mL可溶性人類重組CD40配體及2ug/mL「配體增強子」(均來自Alexis Biochemicals)及100ng/ml介白素21的存在下，於96孔培養盤中培養6天，每孔10⁵個B細胞。在2×10⁴經照射的(6000rads)CD70表現HEK 293細胞或MOCK轉染HEK 293細胞的存在(或不存在)下，加入CD27中和融合瘤或同型對照抗體。CD27中和融合瘤單株抗體以及匹配的同型對照使用量為25，2.5及0.25ug/mL。在第6天，以流式細胞儀分析細胞樣品且血漿芽細胞的部份係被鑑定為前向散射/高、無IgD、CD38明亮、低CD20。CD27中和單株抗體的效力係以在含CD70表現細胞和融合瘤單株抗體之B細胞培養液中的血漿芽細胞頻率來計算，其係標準化至含mock轉染細胞之對應B細胞培養液中的血漿芽細胞頻率。C2177、C2186、C2191或C2192單株抗體在2.5ug/mL的抑制百分比係顯示於表2中。在缺乏CD70的刺激下並未觀察到任何這些單株抗體有促效活性。

實例4：表位分佈製圖(MAPPING)及分類(GROUPING)

為了更小心地評估一開始的分級(binning)，以一些純化的中和單株抗體以及該CD27中和抗體(MAB 382(R&D Systems))進行競爭分析試驗。簡言之，在室溫下將5μl(10μg/mL)的CD27-Fc嵌合蛋白(R&D Sysytems,Cat# 382-CD)塗佈在一MSD HighBind培養盤(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)上的每個培養孔2小時。加入5% MSD Blocker A緩衝液(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)至每個培養孔中並在室溫下培養2小時。將培養盤以0.1M HEPES緩衝液(pH 7.4)清洗三次，接著加入10nM經標記的CD27抗體與不同濃度競爭者抗體(1nM至2uM)之混合物。將抗體以MSD Sulfo-Tag^TM NHS-酯(一種胺反應的N-羥基丁二醯亞胺酯(amine-reactive N-hydroxysuccinimide ester)，其會耦合至蛋白上的一級胺基以形成一穩定的醯胺鍵)標記。在室溫下輕輕搖動培養2小時後，以0.1M HEPES緩衝液(pH 7.4)清洗培養盤3次。將MSD Read Buffer T以蒸餾水稀釋(4倍)並以每孔150μL的量分配。使用SECTOR Imager 6000分析培養盤，其係透過Sulfo-Tag標記偵測電化學發光，該標記會在MSD微量盤的電極表面起始的電化學刺激後發光。

該競爭性研究將表3中概括的抗體界定為三個競爭群組，證實了一開始的分級分析試驗。C2179、C2192及MAB382構成一組；C2177、C2182、C2186及C2193係第二組；以及C2191單獨構成另外一組。

實例5：以X射線晶體學鑑定表位和補位

抗體C2177及C2191詳細的表位和補位係藉由將彼等對應的Fabs與CD27 ECD片段(殘基1-101)共結晶成三聚體複合物並以X射線晶體學確認結構來鑑定。帶His標籤的C2177 Fab及C2191 Fab嵌合形式(小鼠變異區，人類恆定區)係表現於HEK293細胞中並使用親和性及大小排阻層析法來純化。人類CD27之帶His標籤的ECD片段(殘基1-101)係進一步以陰離子交換層析純化。該三元複合物CD27：C2177 Fab：C2191 Fab係藉由將CD27與過量的Fabs混合來製備，莫耳比為1：1.25：1.25。將該複合物於4℃培養2小時，使用大小排阻層析法將其與未複合的種類分離，並於20mM Tris(pH 8.5)、250mM NaCl中濃縮至12mg/mL。以坐式液滴(sitting drop)之蒸氣擴散法於20℃進行該複合物之結晶。從24% PEG 3350、0.2M氯化銨、0.1M Tris緩衝液(pH 8.5)中取得該複合物之結晶。關於X射線數據的收集，將一晶體於抗凍劑溶液(含添加20%甘油的結晶溶液)中浸泡幾秒鐘，並在100K的氮氣流中快速冷凍。以裝有Saturn 944 CCD偵測器及X-stream 2000低溫冷凍系統(Rigaku)的Rigaku MicroMaxTM-007HF X射線產生器收集繞射數據，晶體旋轉超過240°，每0.25°影像暴露2分鐘，並以XDS程式處理該數據 (Kabsch W.2010.Acta Crystallogr.D66：125-132)。該晶體屬於單斜晶系空間群P21，晶胞參數為：a=141.1Å，b=53.0Å，c=143.4Å，α=90°，β=112.2°，γ=90°。

該三元複合物之晶體結構係以3.5Å分辨率確認並細化至晶體學R因子為26%。C2177及C2191的Fabs結合至CD27空間上不同的非重疊表位(圖2)。C2177Fab結合至CD27的N端末端(細胞表面的遠側)部份。該表位佔位700Å2並包括9個殘基：K5、S6、P8、H11、W13、G16、K17、H36、R37(圖3)。該補位係界定為與該抗原接觸(4Å內)之抗體殘基。該C2177補位包括來自VL的5個殘基(Y31、Y36、Y53、N57、N96)及來自VH的9個殘基(S31、W33、Y52、D55、D57、Y101、Y102、D104、Y105)(圖3)。所有6個CDR均涉及抗原辨識。H36及R37為該表位之中心殘基。他們堆疊對上VL的Y31及VH的Y102；H36亦形成一鹽橋至VH的D104。

C2191 Fab結合至CD27的「側」表面(圖2)並佔該表面的800Å2。該表位包括10個殘基：F28、D43、P44、I46、P47、G48、V49、H60、S63、H66。該C2191補位包括7個來自VL的殘基(Y34、F36、Y53、L54、R96、L98、W100)以及8個來自VH的殘基(S31、Y32、Y50、N57、Y59、R100、G101、N102)(圖4)。該抗體-抗原交互作用主要來自CD27的殘基44-49與VL CDR上的一小塊疏水性表面之間的疏水性交互作用。

C2177及C2191表位的位置不同暗示著這些抗體有不同的作用機制。C2191可能直接與CD70 ECD競爭CD27「側」表面上的重疊表位。相反地，C2177抗體並不競爭相同的表位而是防止帶有CD27及帶有CD70的細胞互相接近。事實是，C2191會防止可溶性CD70 ECD結合至CD27，但C2177不會，這支持了該觀察結果。

實例6：抗體調節人類淋巴球反應

培育一種免疫缺陷的小鼠模型：無NOD/SCID-IL2Rγ(NSG)小鼠以研究T細胞反應對人體免疫系統的控制方面(Markus G Manz & James P Di Santo Renaissance for mouse models of human hematopoiesis and immunobiology Nature Immunology 10,1039-1042(2009))。將人類PBMC授受性轉移(adoptive transfer)進免疫受損的(NSG)小鼠以評估抗-CD27抗體對人類細胞植入及/或增殖的效用。該模型可用來評估抗體製造時標靶人類CD27的影響以及T細胞調介的反應。

在細胞轉移的時間投予抗體C2177及C2191，接著一星期投予兩次，共3星期。在第21天犧牲小鼠，從血液和脾臟中純化細胞並接著以流式細胞儀確認細胞特性。CTLA4-Ig(Orencia,BMS)係納入作為免疫抑制的陽性對照組。藉由評估血液和脾臟樣品中人類CD45⁺細胞的存在來測量人類細胞植入/擴張。

密切監測該小鼠並依據動物福利指導準則(animal welfare guidelines)基於XGVH症狀決定犧牲時間。用來評估抗-CD27處理效果的實驗讀數包括：體重(每週兩次)；XGVH可觀察到的徵狀(每週兩次)，如姿勢、活動水平、儀容打扮、皮膚損傷(尤其是眼睛及耳朵周圍)，使用1-5的評分系統；人體細胞亞群的絕對計數和活化狀態，其係使用流式細胞儀分析(1)注射的人類PBMC、(2)小鼠PB(每週一次)及(3)脾臟和骨髓；利用ELISA測定血清、脾臟及BM中所有的人類Ig、IgM及IgG，並在犧牲後利用組織學或免疫組織化學法測定標靶器官中(如肝、腎、肺及脾臟)的人類滲透水平。

處理組別係如下：

1. PBMC(每隻小鼠2000萬至4000萬個細胞，i.p.)

2. PBMC+CTLA4-Ig(10mg/kg)

3. PBMC+同型對照抗體，每週2次，共3週

4. PBMC+抗-CD27抗體，每週2次，共3週

以10mg/kg抗-CD27單株抗體、C2177及C2191(嵌合在人類IgG₄(ala/ala,ser->pro)支架上的融合瘤單株抗體)給藥的小鼠，與從該血液或脾臟樣品中分離的單獨PMBC或PMBC中的同型對照相比，有統計學上明顯較少的人類CD45⁺細胞。

實例7：C2177及C2191單株抗體的人類框架改編(HUMAN FRAMEWORK ADAPTATION)

將用來從C2177及C2191抗體轉移抗原特異性至人類框架的抗原結合位點以及區域重新分類，如Raghunathan G.在2009年的US20090118127 A1中所概述。簡言之，該抗原結合區域已被用各種不同的術語來定義(可在Almagro and Fransson,Front Biosci 13：1619-1633,2008中複習)。術語「互補決定區(CDR)」係基於序列變異度(Wu and Kabat,J.Exp.Med.132：211-250,1970)。有六個互補決定區；三個在V_H(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)且三個在V_L(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。「高變區」、「HVR’s」或「HVL’s」意指一抗體變異區，其在結構上為可變的，如Chothia and Lesk所定義(Chothia and Lesk,Mol.Biol.196：901-917,1987)。有六個高變區，三個在VH(H1、H2及H3)且三個在VL(L1、L2及L3)。

在HFA法中，轉移非人類抗體之特異性至人類框架(HFR)的目標區域係如Kabat所定義之互補決定區(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)，除了對應至V_H之CDR-1的區域。對於這個區域，CDR和HVL的組合(延長的V_H之CDR-1)係從非人類抗體轉移至人類框架(如表30、31、34、35所提供)。此外，產生並測試具有較短轉移的CDR-H2之變異體(稱為Kabat-7[Raghunathan G.US20090118127 A1,2009])。

人類框架選擇

人類框架(定義為V區內不含抗原結合位置之區域)係選自功能性人類生殖系IGHV、IGKV、IGKJ及IGHJ基因之基因譜。藉由搜尋IMGT資料庫(Kaas,et al.,Nucl.Acids.Res.32,D208-D210,2004；Lefranc M.-P et al.,Nucl.Acids Res.,33,D593-D597,2005)並將所有的「01」對偶基因如Oct 01,2007中編譯，取得人類生殖系基因序列之基因譜。從這個編譯，將冗餘基因(胺基酸100%相同)和那些具有未成對半胱氨酸殘基的基因從編譯中移除掉。

HFR中人類序列的初步選擇係根據人類IGHV生殖系基因對小鼠V_H區域(包括FR-1至FR-3以及H-CDR-1和H-CDR-2)總長度的序列相似性。在下一階段，考慮CDR的長度及小鼠CDR與人類序列之間的序列相似性，用分數將該選擇的人類序列排序等級。使用一個標準的突變矩陣(如BLOSUM 62替代矩陣(Henikoff and Henikoff,Proc Natl Acad Sci U S A.89,10915-9,1992))來給分小鼠CDR與人類序列的序列比對，如果在CDR環中有插入及/或缺失，則給予一巨大懲罰。基於IGHJ生殖系基因(Kaas,et al.,Nucl.Acids.Res.32,D208-D210,2004；Lefranc M.-P et al.,Nucl.Acids Res.,33,D593-D597,2005)與小鼠抗體C2177及C2191序列的序列相似性來選擇FR-4。使用一類似的步驟來為V_L選出人類框架。生殖系基因IGVK係用於選擇FR 1至FR 3及L-CDR 1至L-CDR 3。生殖系基因IGJK係用於選擇FR-4。

除了序列準則(sequence criteria)，使用Accelrys,Inc程序套件中的Modeler(Sali and Blundell.J.Mol.Biol.234：779,1993)來建構該Fv片段之3D同源模型。利用該模型來分析該HFR變異體，包括確認CDR特性以及評估可發展性傾向(developability liabilities)。選擇HFR變異體的其他考慮因素包括最小化暴露的甲硫胺酸和色胺酸殘基數量，消除潛在的N-糖基化位點以及偏向在電腦模擬中(in silico)具有最高基因表現圖譜的人類生殖系基因(de Wildt,J.Mol.Biol.185：895,1999)。

關於C2177的路徑1框架改編及最佳化，在基因庫中包括六種V_H以及四種V_L HFR變異體。將該V_H及V_L HFR變異體以組合的方式配對以產生24個HFR變異體對再加上10個對照組(將所有HFR變異體與對應的C2177的V區配對)，再加上母體C2177本身，一共有35種組合。同樣地，對於C2191，將五種V_H及四種V_L HFR變異體以組合的方式配對以產生20個HFR再加上9個對照組(將所有HFR V變異體與對應的C2191的V區配對)，再加上母體C2191本身，一共有30種組合。利用標準方法重組編碼該選擇變異體區域之DNA，以組裝成具有人類IgG1及κ恆定區的完整單株抗體。所生成的C2177參考嵌合抗體(命名為M40)包含變異區H7及L18。對應的C2191嵌合抗體(命名為M41)包含變異區H10及L20。於48孔培養盤內的HEK 293E細胞中短暫表現該單株抗體。轉染後96小時，以培養盤中的上清液測試表現及結合活性。利用Octet技術評估所分泌的單株抗體之表現水平以測量抗體與蛋白A(Protein A)生物感測器之結合比率。藉由與已知抗體濃度的標準樣品比較，將該表現水平量化。作成由1：2同型對照抗體的連續稀釋所組成之一8點標準曲線，起始點為100ug/ml。在用過的培養基中水合(hydrate)生物感測器10分鐘，並測量標準樣品與未知樣品的結合比率2分鐘。使用5參數加權的劑量反應方程式以及初始斜率結合率演算法(initial slope binding rate algorithm)分析數據。將表現量>1ug/ml的樣品以用過的培養基稀釋至1ug/ml並利用單點ELISA篩選。在此ELISA中，將96孔黑色Maxisorp培養盤以50uL稀釋於碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.4)中的3ug/ml山羊抗人類IgG FC於4℃塗佈過夜並接著以清洗緩衝液(含0.05% Tween-20的PBS)清洗三次，以300μl StartingBlock(Thermo Scientific)溶液阻斷1小時，接著像之前一樣清洗。將樣品或標準品以100ng/ml用過的培養基稀釋，並在室溫下一邊搖動一邊將50ul加入至該分析培養盤中歷經1小時。將培養盤清洗三次，每孔加入50ul帶His標籤的人類CD27 ECD，濃度為60ng/ml(稀釋於分析緩衝液(含1% FBS及0.05% Tween-20的PBS)中)，並在室溫下培養1小時。清洗後，每孔加入50ul與五個 His共軛的Qiagen過氧化酶(以1：2000稀釋於分析緩衝液中)並在室溫下搖動培養1小時。依照廠商說明混合BM ChemiLum Substrate(BM Chemilum,POD,Roche)並在最終清洗後將50ul加入至該培養盤中。10分鐘後，以Perkin Elmer Envision讀取機讀取該培養盤。

該C2177組合庫的篩選結果顯示所有的V區以各種不同的強度結合至CD27。幾種HFR變異體比起母體C2177有較高的結合訊號，而其他變異體的結合則顯示與母體相當或比母體更低。所有的VL均在可檢出的水平結合抗原，並且不影響HFR變異體的結合，其表現量水平可以接受但與母體相比較低。二十四種該C2177 HFR抗體(VH與VL的組合)顯示會與CD27結合且表現量>1ug/ml。

該C2191組合庫的篩選結果顯示所有的VH(只有一個例外)以各種不同的訊號結合至CD27。除了與該VH配對的VL，所有的VL均顯示會結合至CD27。幾種HFR變異體比起母體C2177有較高的結合訊號，而其他變異體的結合則顯示與母體相當或比母體更低。十七種C2191 HFR抗體(VH與VL的組合)證實會與CD27結合且表現量>1ug/ml。

根據ELISA測得的對CD27的相對親和力，選擇十五種C2177變異體與十一種C2191變異體用於先導性規模(pilot-scale)的表現及純化。於CHO-S細胞中完成先導性規模的短暫表現，表現量為750ml。讓收穫之上清液透過蛋白質A層析法進行純化，接著評估純化後蛋白質的親和力和功能活性。

藉由表面電漿子共振(SPR)，利用ProteOn XPR36蛋白質交互作用陣列系統(BioRad)測量該HFR C2177人類單株抗體變異體的親和力。測量每個變異體之CD27結合比率和解離比率。使用廠商對胺耦合化學之說明，將山羊抗人類IgG(Fc)抗體共價耦合至GLC晶片(BioRad)的表面以製備該生物感測器表面。約5,000RU(反應單位)的抗體被固定化。於25℃在電泳緩衝液(PBS，0.01% P20，0.01% BSA)中進行動力學實驗。從起始濃度300nM在電泳緩衝液中以1：3連續稀釋製備人類CD27 ECD的連續稀釋液。在感測器晶片的每個通道上捕捉到約350RU的單株抗體。在通道6中固定化一同型匹配的抗體對照組並用作為一參考表面。捕捉單株抗體後，以每分鐘30uL注射(結合階段)抗原三分鐘，接著進行10分鐘的緩衝液流動(解離階段)。藉由每分鐘注射100uL的0.85%磷酸來再生該晶片表面。以該儀器的軟體處理數據。進行數據的雙重參考減法，將來自分析物注射的參考減法曲線(reference-subtracted curve)減掉由緩衝液注射產生的曲線。使用1：1的Langmuir結合模型，以整體擬合進行數據的動力學分析。將每個單株抗體的結果以K_a(離開速率)、K_d(連接速率)、K_D(解離平衡常數)以及百分比活性的型式報導。該C2177 HFR變異體的親和力與母體M40單株抗體相似，所有變異體的K_D均顯示不到三倍改變。同樣地，該HFR C2191人類單株抗體變異體的親和力與母體M41單株抗體相差不到兩倍。

在螢光素酶報導子分析試驗中，以HFR變異體對CD70調介的NFkB誘發的抑制來測量該HFR變異體的生物活性。將HEK細胞以可被NFkB誘導的螢光素酶表現載體pGL4-32-NFkB-Luc2(Promega)以及CD27表現質體或空載體轉染，在Freestyle表現培養基(Gibco,#12338)中培養過夜。隔天將40uL的細胞放進96孔培養盤中，每孔有50,000個細胞。接著將40uL的抗體或對照組，以起始濃度30ug/ml連續以1：3稀釋後加入至細胞中使最終濃度為孔中濃度，並培養1至2小時。於該培養期間，準備用於刺激的CD70游離細胞。簡言之，使用標準細胞培養技術將附著型細胞再懸浮並以25ug/mL的絲裂霉素C(Mitomycin C)培養1小時以停止細胞增生。培養後，將CD70+細胞在培養基中清洗，稀釋，並加入40uL至每孔中使每孔有10,000個細胞。將該培養盤培養過夜。隔天，依照廠商說明準備Steady Glo試劑(Promega)並在每孔中加入120uL。將培養盤在室溫下搖動培養20分鐘。在Perkin Elmer Envision讀取機上測量發光度。該C2177 HFR變異體的IC₅₀與母體單株抗體M40及彼此相似，範圍在0.11nM至0.21nM。該C2191 HFR變異體的IC₅₀亦與母體M41及彼此相似，範圍在0.13nM至1.39nM。

考量到親和力、生物活性和生物物理特性，選擇該C2177變異體M69(其包含變異區H28(SEQ ID NO：111)及L35(SEQ ID NO：82))以及該C2191變異體M91(其包含變異區H31(SEQ ID NO：131)及L42(SEQ ID NO：140))用於親和力成熟化(affinity maturation)。K_D、純化產量、細胞培養上清液與CD27 ECD的結合(「ELISA」)以及母體M40及其M69 HFR變異體及母體M41及其M91變異體藉由CD70對CD27調介的NFκβ反應的抑制(IC₅₀)的總結係顯示於表4中。

實例8：C2177 HFR MAB M69的最佳化

M69對人類CD27 ECD的親和力約1nM並含有與C2177及HFA母體CD27M40同樣的互補決定區。M69的最佳化涉及多個資料庫以增加親和力並在過程中移除引入或確定的PTM位點。

如實例9所述，一用於HFR及C2177最佳化的相似噬菌體呈現庫(phage display library)方法確認了在CDR-H2之52a位置的脯胺酸多樣性。在基因庫設計中該位置並非隨機。該C2177及C2191 Fabs與CD27的共同結構(實例5)顯示P52a不直接參與抗原結合。然而，該位置的突變可改變CDR-H2環的構形並使周圍的殘基D27能與CD27有更優化的交互作用。因此，使用NNK突變誘發設計一基因庫以隨機多樣化P52a及其鄰近殘基Y52、G53及D54(基因庫C27H28L2)。同樣地，在路徑2最佳化中，CDR-L1中Y32到F的突變顯示出結合增強。因此， 設計一在Y32具有隨機多樣性以及在殘基Y30a、D30d、A50(其座落在與Y32相同的結構平面)具有多樣性的第二基因庫(基因庫C27L35L2)。

此外，使用多樣性有限的基因庫評估完整的CDR-H3及CDR-L1環。表5及表6顯示這些基因庫的設計。

在一pIX噬菌體Fab呈現系統中建構Fab基因庫，如在WO2009/085462、Shi et al,J Mol Biol 397：385-396(2010)及Tornetta et al.J Immunol Methods 360：39-46(2010)中所述，並在限制酶位點稍作修改。根據該領域中習知之淘選方針(panning scheme)，針對生物素化的CD27-ECD淘選該些基因庫，如在WO2009/085462及Shi et al,J Mol Biol 397：385-396(2010)中所述，其係關於藉由選擇較慢的離開速率(off-rate)或較快的連接速率(on-rate)來增加親和力。噬菌體係藉由輔助噬菌體感染而產生。添加珠珠以形成一珠珠/抗原/噬菌體複合體，藉以回收結合劑(binder)。最後一次清洗後，噬菌體係因倍增生長之TG-1大腸桿菌細胞的感染而救出。噬菌體係再次產生，然後進行額外的淘選回合。

在接下來的篩選中，從噬菌體淘選回合的甘油儲存液中準備DNA並以NheI/SpeI消化切割該pIX基因。接合後，將該DNA轉染進TG-1細胞並生長在LB/瓊脂培養盤上過夜。第二天，撿出菌落、過夜生長，然後將培養基用在(i)菌落PCR和V-區域定序，及(ii)Fab的生產誘發。為了Fab的生產，在新的培養基中將過夜的培養液稀釋成10至100倍，然後在攝氏37度下生長5至6小時。添加含有IPTG的新鮮培養基以誘導Fab的生產，然後讓培養液在攝氏30度下過夜進行生長。第二天，讓培養液短暫離心，接著將含可溶性Fab蛋白質的上清液用在Fab ELISA。關於該ELISA，該可溶性Fab蛋白係被多株抗Fd(CH1)抗體補捉到培養盤上。在清洗及阻斷後，加入濃度為0.2nM的生物素化的人類CD27 ECD。這種濃度能夠將界定為母體的結合百分比之Fab變異體排序，其中出現在所有培養盤中當作對照組的母體Fab係定義成100%結合。該生物素化的CD27 ECD係藉由HRP共軛的鏈黴親和素偵測，並在一培養盤讀取機讀取化學發光。在該濃度的CD27，可以做Fab變異體的排序(標準化至母 體Fab)。藉由這個準則，選擇與人類CD27結合為100%或更高(相對於M69 Fab)的10個重鏈和6個輕鏈。

該母體的Y主要在位置52從CDR-H2基因庫(C27H28L2)選擇，表示該殘基為偏好的選擇。在位置52a，將P以Fabs中具有最佳結合活性的殘基A、S、V及G取代。在位置53，該母體的G與R及N一起選擇。在位置54，只有該母體的D被復原。將來自該基因庫的九個殖株(表7)次選殖進IgG載體以表現並確認作為單株抗體的特性。

對於CDR-H3基因庫(C27H28L3)，僅有S95A及A101G的多樣性被復原。來自該基因庫的一個含有兩種突變的殖株(表8)被次選殖進IgG載體中以表現並確認作為單株抗體的特性。

關於四個位置的L-CDR1基因庫(C27L35L2)，位置30a顯示富含有母體的Y及W。在位置30d，富含有殘基S、H及E與母體的D。在位置32，該母體的Y係以F及W取代。在位置50，比起母體的A較為偏好T。一般而言，最佳的殖株與母體相比有更多的疏水性側鏈。將來自該基因庫的五個殖株(表9)次選殖進IgG載體以表現並確認作為單株抗體的特性。

對於多樣性有限的完整CDR-L1基因庫(C27L35L3)，僅有一個序列被復原，其與母體僅有一處不同，即Y32改變為F，相似於上述四個位置的VL基因庫。該完整的CDR-L1基因庫在位置32不包括F，因此該復原的殖株可能為來自該四個位置的VL基因庫的污染物。將該殖株(L255)次選殖進IgG載體以表現並確認作為單株抗體的特性(表9)。

將該6個變異體輕鏈與該10個變異體重鏈配對以得出60個組合，並以HEK293E細胞表現。篩選上清液的表現水平，與人類CD27 ECD的結合如ELISA所測量，且親和力如在ProteOn儀器上所測量。所有變異體的表現水平均足以用於篩選。一些變異體的親和力增加高達40倍。兩個單株抗體M596及M600被選擇來進一步突變誘發以移除轉譯後修飾的潛在位點。這些單株抗體之VH鏈及VL鏈的組合係提供於表10中。該些抗體只有在輕鏈上有兩個殘基不同。

M596在三個位置與母體分子M69不同：在CDR-H2中的P52aA、在CDR-L1中的Y32W以及在CDR-L2的A50T。M600在兩個位置與M69不同：在CDR-H2的P52aA突變與在CDR-L1的Y32F。

在M596及M600中確認三個共享的潛在轉譯後修飾位點。在CDR-H2中的位置N58有一個潛在的N-連接糖基化位點且在CDR-H2及CDR-L1(分別由「DG」及「DS」編碼)有兩個潛在的異構化位點。此外，M596在CDR-L1含有一非生殖系的色胺酸殘基，其可能容易被氧化。

為了移除該糖基化風險，在N58創建三個個別的單一取代以及在S60創建一個取代(表11)。該建構係表現於HEK293E細胞中，並使用ProteOn儀器評估上清液對CD27的親和力。所有的變異體均具有與母體相近的親和力，分別為25pM(M596)及49pM(M600)。選擇變異體M680及M678(兩者均源自M600)評估進一步的取代以消除該異構化位點。變異體M680及M678分別在位置60及58具有A，並在CDR-L1缺乏色胺酸(其在M596母體中則存在)，因此有額外的優勢。

為了評估在M678及M680中突變潛在異構化位點的影響，設計一小的基因庫以同時移除兩個位點。在該重鏈的CDR-H2或該共同輕鏈的CDR-L1中每個突變均單獨地被取代，並接著在一組合基因庫中配對。該基因庫的多樣性係顯示於表12中。

表現這些單株抗體並像糖基化位點變異體一樣地評估親和力。在CDR-L1潛在異構化位點的D34E突變會導致親和力一致增加兩倍，因此該位點被成功移除。在CDR-H2潛在異構化位點的D54E突變會降低親和力十倍以上。然而，該G55A突變並不會顯著影響親和力。變異體M703及M706保留了M600母體的親和力，且PTM對功能影響的風險降低。表13顯示PTM風險評估中各階段的選擇變異體，其重鏈和輕鏈配對、親和力以及互補決定區中的序列修飾。選擇用來移除該潛在糖基化位點的突變係加上底線表示。用來移除該兩個潛在異構化位點的突變係以粗體加上雙底線表示。

實例9：結合的HFR以及C2177單株抗體之最佳化

在本方法中，評估一組有限HFR變異體之用於表現的Fab形式、pIX的展現與結合，接著將最佳候選者進行最佳化。C2177的互補決定區係在兩個重鏈VH5-51(SEQ ID NO：102 H24)及VH1-46(SEQ ID NO：106 H25)與兩個輕鏈Vk4-1及Vk012(SEQ ID NO：90 L36)經過人類框架改編。將這些HFA變異體區域在一2×2矩陣中互相配對，如在Fab pIX噬菌體呈現載體中具有人類CH1及Ck恆定區的Fabs。該VH1-46/Vk012變異體(M55，H25/L36)顯示會與CD27結合且有良好的展現特性，其被選擇用來建構親和力成熟化基因庫。

如上面實例8中所述，建構用於pIX噬菌體呈現的Fab基因庫。根據CD27與C2191及C2177在實驗上的共同結構(實例5)，在該抗體補位中及周圍的CDR殘基設計多樣性基因庫。變異的重點在於互補決定區L1、L3及H2。將在一個別CDR中的全部4-6個殘基以一NNK密碼子進行多樣化，該密碼子可用於編碼全部20種胺基酸。每個基因庫的大小估計為6×10⁷個變異體，其可藉由使用標準基因庫限制性核酸內 切酶選殖技術來涵蓋。表14顯示在不同CDR基因庫中經過全面多樣化之殘基。

將在噬菌體外殼蛋白IX上呈現之Fab基因庫針對生物素化的hCD27ECD/Fc淘選。噬菌體係藉由輔助噬菌體感染一變異體質體庫而產生。添加塗佈有鏈黴親和素的磁珠以形成一珠珠/抗原/噬菌體複合體，藉以回收結合劑(binder)。最後一次清洗後，藉由感染倍增生長之MC1061F’大腸桿菌細胞而救出噬菌體。噬菌體係再次產生，然後進行額外的淘選回合。生產來自選擇殖株的可溶性Fab並評估其結合親和力，如 關於路徑1中所述。只在CDR-L1及CDR-L2基因庫中有得到目標。來自該兩個基因庫的二十一個殖株證實比起母體HFR Fab結合更強。捨棄在多樣性序列中含有C或M的殖株。轉換十個Fabs到IgG4SPAAa/κ背景中表現以進一步確認特性。該IgG4PAA重鏈係人類IgG4，其在絞鏈區中含有絲胺酸到脯胺酸的取代(Angal et al.,Mol Immunol 30：105(1993))且在CH2中的兩個位置含有丙胺酸的取代(ML Alegre et al,Transplantation；57：1537-43(1994))。於HEK293E細胞中產生該單株抗體作為該Fabs的複製物並作為重鏈和輕鏈組合之基體。使用培養上清液在ProteOn儀器上測量親和力(表15)。CDR-H2中P52a到Q(M158)或到S(M157)的突變與母體單株抗體(M159)相比，K_D減少了6倍。在CDR-L1(M149)中的Y36F突變會減少K_D 4倍且加入G33H及D34E突變(M155)後會導致K_D減少6倍。P52S突變與Y36F(M160)或Y36F加上G33H及D34E的組合會使K_D減少20倍至100pM。選擇在M158、M160及M166的取代組合進一步做特性確認。

在750mL的HEK293細胞培養液中生產M158、M160及M166蛋白，將其純化並在Biacore上分析對CD27-His之結合動力學。該K_D值比那些由ProteOn測量的純上清液高約1 log，但彼此之間則具有相同數值(表16)。

當再評估原始的HFA組合時，該經VH5-51改編的VH與該VH1-46支架的K_D相比低了2倍。將H-CDR2中的P52aS突變引入VH5-51 VH中創建出H221。分別以來自HFA母代單株抗體(M159)的L220、L219及L217輕鏈與親和力提昇的變異體M160及M166來表現H221以產生單株抗體M171、M169及M170。該純化的單株抗體的BIAcore動力學測量顯示，與對應的VH1-46變異體相比K_D增加兩倍(比較表16及17)。

M160、M169及M170的序列分析在D54-G55確認有一個潛在的異構化位點，以及在H196及H221的CDR-H2中的N61-G62確認有一個潛在的脫醯胺位點。此外，在L219的CDR-L1中的D34被確認有一個潛在的異構化位點。引入突變以移除這些位點並評估突變對活性的影響(表18)。在ProteOn上分析純化的單株抗體對CD27-His的親和力。該些突變對K_D沒有影響或有正面影響。例如，M668及M671與彼等之母體單株抗體(分別為M160及CM169)相比，K_D降低了幾乎2倍。

實例10：C2191 HFR MAB M91的最佳化

用來最佳化M91(H31/L42)的方法如實例8中所述，除非另有說明。在一種Fab形式中進行C2191互補決定區的丙胺酸/生殖系掃描以評估與CD27交互作用重要的位置，使用C2191母體的VH及VL區(為具有人類Ch1及Ck恆定區的Fab形式)。該基因庫將互補決定區中的殘基以丙胺酸或存在於對應生殖系序列中的殘基取代。根據模型以及後續的被測定的結構(實例5)，互補決定區中的一些位置因為較少或不會曝露於溶劑中而被排除。將推定的體細胞突變突變回小鼠生殖系胺基酸以評估其對抗體親和力之貢獻。簡言之，將小鼠V區選殖進Fab pIX呈現載體並以ELISA驗證母體與生物素化的人類CD27-ECD蛋白之結合。利用定點突變(site-directed mutagenesis)引入單一突變(根據該基因庫設計)，基本上如Stratagene(La Jolla,CA,USA)所述進行。從序列確定的 突變中選擇最佳者到新的培養盤中並與母代Fab及負對照組Fabs一同生長。於E.coli中產生最終的單一胺基酸取代變異體，並接著以ELISA篩選表現量以及與CD27的結合。平均該母體殖株之表現及結合訊號並將其設為1.0，將突變體的訊號相對於該母體做標準化。ELISA中使用兩種形式的抗原：CD27 ECD(殘基1-173)及CD27 ECD-Fc嵌合體(R&D Systems)。

該掃描之結果結合共晶體結構提供了設計親和力成熟化基因庫之基礎。對於該重鏈；選擇變異的位置係在H-CDR1中的T33以及在CDR-H2中的Y50、S52、S52a、N56及Y58(表23)。T33並非接觸的殘基但T33A的突變卻增強了結合。位置S52及S52a並非接觸的殘基，但在掃描中該取代顯示會增加些微的結合。在位置50及58的酪胺酸均為接觸位點，在實例11中所述之並行的最佳化路徑中選擇在這些位點做取代。在該丙胺酸/生殖系掃描中並未評估位置N56，但其係一接觸位點並在晶體結構中與T33、S52及S52a相鄰。對於該輕鏈，選擇變異的位置係在CDR-L1中的T30a、S30b、G30c及Y30d以及在CDR-L2中的L50及N53(表23)。這些殘基均不與抗原直接接觸而是與接觸的殘基相鄰，而該掃描顯示該接觸的殘基對結合具有重大負面影響。L50A突變對結合的影響中等，並且在晶體結構中為CDR-L2中唯一可能與抗原接觸的殘基。此外，選擇N53用於有限的多樣化。建構兩個平行的基因庫，一個將Y30d突變為W，且另一個將Y30d保持為Y，因為W可提高補位疏水性並因此較難發育。下面的表19及20顯示M91之VH及VL親和力成熟化基因庫的設計。

將在噬菌體外殼蛋白IX上呈現之Fab基因庫針對生物素化的CD27-ECD淘選。選擇總共12個重鏈變異體和12個輕鏈變異體，其與CD27的結合相等於C2191母代嵌合的Fab或比其更好。將該變異體轉換為IgG1/κ抗體，以144種組合生產於HEK293E細胞中，並以ProteOn評估培養上清液的結合能力。在一些變異體可觀察到親和力有顯著增加(>100倍)。在144個VH與VL的配對中，選擇8個作進一步的特性確認(表21)。將這些單株抗體分類成三個次群組：群組1變異體係相同重鏈(H227、SEQ ID NO：133)與四個不同輕鏈的配對，而群組2及群組3則各為一輕鏈與兩個不同重鏈的配對。該四個選擇的輕鏈在CDR-L1(RASKSVSX₁X₂X₃X₄SFMH(SEQ ID NO：158)；其中X₁係A、E、H或 L；X₂係D、G、V或W；X₃係G或R；及X₄係W或Y)中多樣化的所有四個位置均有所改變。彼等在CDR-L2(X₁ASX₂LES(SEQ ID NO：171)；其中X₁係L或V；且其中X₂係K、N或R)中多樣化的兩個位置亦有所改變。CDR-L3來自未改變的L42序列(SEQ ID NO：140)，其為QHSRELPWT。

這八個變異體係藉由於HEK293E細胞中短暫表現而生產，體積為750ml。將收穫的上清液透過蛋白A層析法純化，並藉由SDS-PAGE及SE-HPLC分析每個變異體以測定樣品純度以及純化樣品中的單體百分比。所有的變異體均大於90%的純度且大於90%為單體。為評估該些抗體之結合特性，將每個純化的變異體進行交互作用層析(cross-interaction chromatography)以測定滯留因子(k’)(Jacobs SA,Wu SJ,Feng Y,Bethea D & O'Neil KT(2010)Cross-interaction chromatography： a rapid method to identify highly soluble monoclonal antibody candidates.Pharm Res 27,65-71)。在該方法中，將樣品抗體通過一耦合有人類IgG的管柱，並評估相對於對照抗體之滯留度。簡言之，依據廠商說明將50mg的人類IgG(Sigma Aldrich)耦合至1 mL的NHS-Sepharose管柱(GE Healthcare)。以0.1M Tris(pH 8)、0.5M NaCl清洗以移除未耦合的IgG，並用相同緩衝液來阻斷未反應的NHS基團。使用Pierce的Coomassie Plus Assay Kit(Thermo Pierce)來測量未反應的耦合緩衝液和清洗液中殘留的蛋白質濃度並從固定前的蛋白質數量中減去以測定耦合效率。使用相同流程製備一對照管柱，但沒有將IgG共軛到樹脂上。將該對照管柱以每分鐘流速0.1毫升的PBS(pH7)平衡後，在Dionex UltiMate 3000 HPLC上第一次運行。首先注射20μL的儲備蛋白質溶液，以確保阻斷非特定異性結合位置，接著以20μL的10%丙酮來檢查該管柱的完整性。將欲分析的樣品於PBS(pH 7)中稀釋成0.1 mg/mL。將每個樣品各20uL注射到每根管柱上，然後讓它在流速每分鐘0.1 mL下運行30分鐘。記錄滯留時間，然後計算出各變異體的滯留因子(K')。k’值係計算為在IgG管柱與空白(blank)管柱上滯留時間的差異。根據SDS-PAGE及SE-HPLC，將所有變異體純化至純度大於90%。所有的k’值均被計算出小於0.3，表示具有良好的溶解特性(表22)。

藉由BIAcore評估該八種變異體單株抗體及該HFR母體對CD27 ECD的親和力，並在κβ報導子分析試驗中評估彼等之IC₅₀。藉由BIAcore測量動力學常數和親和力。收集這些變異體的數據並總結於表23中。從最初小量培養上清液測量到的表現量及與CD27結合之ELISA訊號亦包括於此表中。

實例11：結合的HFR以及C2191單株抗體之最佳化

在本方法中，評估一組有限HFR變異體之用於表現的Fab形式、pIX的展現與結合，接著將最佳候選者進行最佳化。C2191的互補決定區係在兩個重鏈(VH3-23及VH3-11)及兩個輕鏈(Vk4-1及Vk012)經過人類框架改編。將這些HFA變異體區域在一2×2矩陣中一起配對，如在Fab pIX噬菌體呈現載體中具有人類CH1及Ck恆定區的Fabs。該VH3-23/Vk012變異體(H39(SEQ ID NO：145))及L40(SEQ ID NO：137)顯示會與CD27結合且有良好的展現特性，其被選擇用來建構親和力成熟化基因庫。此Fab被稱為「母體」。

為了選擇親和力增強之抗體，使用NNK退化性密碼子(degenerate codon)在所有互補決定區(除了H39的CDR-H3)進行多個 殘基的完整多樣化(表24)。每個CDR基因庫均單獨建構並以噬菌體淘選來選擇親和力成熟的變異體。

該C2191基因庫(在CDR-H2、CDR-L1或CDR-L2具有多樣性)產生50個獨特的Fabs，在單點ELISA測量中，其與人類CD27的結合比起母代HFR Fab更強。將該些殖株進一步在多點ELISA中排序，並選出十七個殖株用來轉換成人類IgG4alaala/κ以用於進一步的特性確認(表25)。

將IgG1/k單株抗體建構為該Fabs的複製物以及重鏈和輕鏈變異區之基體(表26)，並測試親和力及溶解特性。該母體Fab之單株抗體形式係表示為M131。選擇M141及M408進一步確認特性。

實例12：親和力成熟的單株抗體之特性確認

選擇源自母代C2177和C2191融合瘤抗體的親和力成熟單株抗體進行密碼子最佳化，將其引入至一不同的載體中以雙重表現重鏈和輕鏈，表現於CHO-GS細胞培養中，並純化以用於進一步的特性確認。與上面實例中所述之成熟變異體相關的這些抗體的識別碼(ID)係顯示於表27中。

這些單株抗體之彙整數據係顯示如下，包含Biacore的K_D分析以及在NF-κβ報導基因分析試驗中測得之IC₅₀(表28及29)。關於該NF-κβ報導基因分析試驗，將HEK-293F細胞以總共36ng的DNA(含人類CD27及螢光素酶構造)在NF-κβ啟動子的控制下轉染。將HEK-293F轉染細胞以每孔5×10⁴個細胞(於40μL的Freestyle培養基(Gibco)中)置於96孔培養盤中。將抗-CD27融合瘤單株抗體於Freestyle培養基中的稀釋液(用1：3稀釋，使最終濃度為50μg/mL)加入該分析培養盤中並將培養盤於37℃(5% CO₂)培養一小時。為了測試單株抗體中和CD70：CD27訊號傳遞的能力，在該分析培養盤中加入數量為CD27轉染細胞數20%的 經定期照射(4000rads)的HEK-293E CD70游離細胞。為了測試融合瘤單株抗體的促效活性，省去CD70游離細胞的添加。將分析培養盤於37℃(5% CO₂)培養過夜並根據廠商說明使用Steady-Glo^®螢光素酶分析系統(Promega)使其生長。

CDR及V區序列

蛋白質及抗體變異區序列

<110> 健生生物科技公司

<120> 人類抗-CD27抗體、方法及用途

<130> JBI5001USNP

<140> 102109158

<141> 2013-03-15

<150> US 61/611332

<151> 2012-03-15

<160> 176

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

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<223> CDR重鏈可變序列

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<223> CDR輕鏈可變序列

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<220>

<223> CDR輕鏈可變序列

<400> 75

<210> 76

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 76

<210> 77

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 77

<210> 78

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 78

<210> 79

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 79

<210> 80

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 80

<210> 81

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 81

<210> 82

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 82

<210> 83

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 83

<210> 84

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 84

<210> 85

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 85

<210> 86

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 86

<210> 87

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 87

<210> 88

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 88

<210> 89

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 89

<210> 90

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 90

<210> 91

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 91

<210> 92

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 92

<210> 93

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 93

<210> 94

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 94

<210> 95

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 95

<210> 96

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 96

<210> 97

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 97

<210> 98

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 98

<210> 99

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 99

<210> 100

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 100

<210> 101

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 101

<210> 102

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 102

<210> 103

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 103

<210> 104

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 104

<210> 105

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 105

<210> 106

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 106

<210> 107

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 107

<210> 108

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 108

<210> 109

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 109

<210> 110

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 110

<210> 111

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 111

<210> 112

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 112

<210> 113

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 113

<210> 114

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 114

<210> 115

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 115

<210> 116

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 116

<210> 117

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 117

<210> 118

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 118

<210> 119

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 119

<210> 120

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 120

<210> 121

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 121

<210> 122

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 122

<210> 123

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 123

<210> 124

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 124

<210> 125

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 125

<210> 126

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 126

<210> 127

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 127

<210> 128

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 128

<210> 129

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 129

<210> 130

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 130

<210> 131

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 131

<210> 132

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 132

<210> 133

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 133

<210> 134

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 134

<210> 135

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 135

<210> 136

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 136

<210> 137

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 137

<210> 138

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 138

<210> 139

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 139

<210> 140

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 140

<210> 141

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 141

<210> 142

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 142

<210> 143

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 143

<210> 144

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 144

<210> 145

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 145

<210> 146

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 146

<210> 147

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變序列

<400> 147

<210> 148

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變序列

<400> 148

<210> 149

<211> 240

<212> PRT

<213> 智人

<400> 149

<210> 150

<211> 193

<212> PRT

<213> 智人

<400> 150

<210> 151

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (3)..(3)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (4)..(4)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (5)..(5)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (7)..(7)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (10)..(10)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (12)..(12)

<400> 151

<210> 152

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (4)..(4)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (7)..(7)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (12)..(12)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (13)..(13)

<400> 152

<210> 153

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR輕鏈可變序列

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (8)..(8)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (11)..(11)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (13)..(13)

<400> 153

<210> 154

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR輕鏈可變序列

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (1)..(1)

<400> 154

<210> 155

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR輕鏈可變序列

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (9)..(9)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (10)..(10)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (11)..(11)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (14)..(14)

<400> 155

<210> 156

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (1)..(1)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (3)..(3)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (4)..(4)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (8)..(8)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (10)..(10)

<400> 156

<210> 157

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (1)..(1)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (3)..(3)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (4)..(4)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (8)..(8)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (10)..(10)

<400> 157

<210> 158

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR輕鏈可變序列

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (8)..(8)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (9)..(9)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (10)..(10)

<220>

<221> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<222> (11)..(11)

<400> 158

<210> 159

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈恆定區

<400> 159

<210> 160

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈恆定區

<400> 160

<210> 161

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<400> 161

<210> 162

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<400> 162

<210> 163

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體輕鏈序列

<400> 163

<210> 164

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體重鏈序列

<400> 164

<210> 165

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<400> 165

<210> 166

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<400> 166

<210> 167

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<400> 167

<210> 168

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<400> 168

<210> 169

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR重鏈可變序列

<400> 169

<210> 170

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR輕鏈可變序列

<400> 170

<210> 171

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR輕鏈可變序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 171

<210> 172

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR輕鏈可變序列

<400> 172

<210> 173

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR輕鏈可變序列

<400> 173

<210> 174

<211> 179

<212> PRT

<213> 智人

<400> 174

<210> 175

<211> 135

<212> PRT

<213> 智人

<400> 175

<210> 176

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 176

Claims (37)

1. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一輕鏈變異區，該輕鏈變異區包含：一輕鏈互補決定區1(CDRL1)胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：59-66及158所組成之群組；一CDRL2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：67-74所組成之群組；以及一CDRL3胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：75。
2. 如申請專利範圍第1項之單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，其進一步包含一重鏈變異區，該重鏈變異區包含：一CDRH1胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：42-45及161所組成之群組；一CDRH2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：46-57、156及157所組成之群組；以及一CDRH3胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：58。
3. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一重鏈變異區，該重鏈變異區包含：一重鏈互補決定區1(CDRH1)胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：42-45及161所組成之群組；一CDRH2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：46-57、156及157所組成之群組；以及一CDRH3胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：58。
4. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一輕鏈變異區以及一重鏈變異區，該輕鏈變異區包含：一CDRL1胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：59-66及158所組成之群組；一CDRL2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：67-74所組成之群組；以及 一CDRL3胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：75，且該重鏈變異區包含：一CDRH1胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：42-45所組成之群組；一CDRH2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：46-57、156及157所組成之群組；以及一CDRH3胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：58。
5. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一輕鏈變異區以及一重鏈變異區，該輕鏈變異區包含：一CDRL1胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：62；一CDRL2胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：68；以及一CDRL3胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：75，且該重鏈變異區包含：一CDRH1胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：44及161所組成之群組；一CDRH2胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：47；以及一CDRH3胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：58。
6. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一輕鏈變異胺基酸序列以及一重鏈變異胺基酸序列，其中該輕鏈變異胺基酸序列包含SEQ ID NO：143且該重鏈變異胺基酸序列包含SEQ ID NO：133。
7. 如申請專利範圍第6項之單離的抗體，其進一步包含一IgG4重鏈恆定區及一IgG4輕鏈恆定區。
8. 如申請專利範圍第7項之單離的抗體，其中該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：159之胺基酸序列且該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：160之胺基酸序列。
9. 一種單離的人類CD27中和抗體或其抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段結合至一申請專利範圍第6項之抗體結合之表位，其係藉由結合至固定化的CD27胞外區域所測定。
10. 如申請專利範圍第6項之單離的抗體，其中該抗體結合至人類CD27的KD以表面電漿子共振所測定為1×10-7M或更少。
11. 一種單離的核酸分子，選自由以下所組成之群組：(i)一編碼申請專利範圍第6項之抗體或抗原結合部份之核苷酸序列，(ii)序列為SEQ ID NO：163的輕鏈核苷酸序列及/或序列為SEQ ID NO：164的重鏈核苷酸序列或(iii)一編碼輕鏈變異區胺基酸序列SEQ ID NO：143之核苷酸序列及/或一編碼重鏈變異區胺基酸序列SEQ ID NO：133之核苷酸序列。
12. 一種單離的核酸載體，包含申請專利範圍第11項之單離的核酸分子。
13. 一種原核或真核宿主細胞，包含申請專利範圍第12項之單離的核酸載體。
14. 如申請專利範圍第13項之宿主細胞，其中該宿主細胞係至少一種選自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、多發性骨髓瘤或淋巴瘤細胞之細胞，或任何彼等之衍生、永生化或轉染之細胞。
15. 一種製造CD27抗體之方法，包含將申請專利範圍第11項之核酸分子併入至一載體中，轉染一宿主細胞、轉殖動物或轉殖植物以表現一抗體並回收該表現的抗體。
16. 一種抑制經T細胞調介之B細胞抗體產生的方法，包含將一對象之T細胞的一部分與一有效量的申請專利範圍第6項之抗體或抗原結合部份接觸；且該抗體或其抗原結合部份在存在有人類CD70蛋白或人類CD70蛋白之一部分的情況下會抑制該人類T細胞上CD27之活化。
17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該對象係患有炎症疾病。
18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該炎症疾病係全身性紅斑狼瘡。
19. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該對象顯示有一抗原特異性的體液免疫反應，其與選自由一種肺部或胸膜系統的疾病、一種中樞或周邊神經系統的疾病、一種眼睛或視覺系統的疾病、一種胃腸道和消化系統的疾病、一種心血管系統的疾病、一種傳染病及一種寄生蟲感染所組成群組之疾病相關。
20. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該抗體或其抗原結合部份係全身性投予至該對象。
21. 一種抑制初始(naïve)T細胞增生的方法，包含將一組織與有效量的申請專利範圍第6項之抗體或抗原結合部份接觸；且該抗體或抗原結合部份在存在有人類CD70蛋白或人類CD70蛋白之一部分的情況下會抑制該人類T細胞上CD27之活化。
22. 一種製品，包含一種醫藥上可接受的配方，其包含申請專利範圍第6項之抗體。
23. 一種單離的人類抗體或其抗原結合片段，包含結合至人類CD27蛋白上一表位的一抗體變異區，該CD27蛋白會被選自由抗體C2177、CD2186、CD2191及CD2192所組成群組之抗體結合。
24. 一種單離的人類抗體或其抗原結合片段，包含會與選自由抗體C2177、CD2186、CD2191及CD2192所組成群組之抗體競爭結合人類CD27蛋白的一抗體變異區。
25. 一種單離的CD27抗體或其抗原結合片段，包含一輕鏈變異區，該輕鏈變異區包含：一輕鏈互補決定區1(CDRL1)胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：24-36、153及155所組成之群組；一CDRL2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：37-40及154所組成之群組；以及一CDRL3胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：41。
26. 一種單離的CD27抗體或其抗原結合片段，包含一重鏈變異區，該重鏈變異區包含：一重鏈互補決定區1(CDRH1)胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：1及2所組成之群組；一CDRH2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：3-22、151及152所組成之群組；以及 一CDRH3胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：23及162所組成之群組。
27. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一輕鏈變異區以及一重鏈變異區，該輕鏈變異區包含：一輕鏈互補決定區1(CDRL1)胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：24-36、153及155所組成之群組；一CDRL2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：37-40及154所組成之群組；以及一CDRL3胺基酸序列，其序列為SEQ ID NO：41，且該重鏈變異區包含：一CDRH1胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：1及2所組成之群組；一CDRH2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：3-22、151及152所組成之群組；以及一CDRH3胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：23及162所組成之群組。
28. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一輕鏈變異胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：137-144及148所組成之群組。
29. 如申請專利範圍第28項之單離的抗體或其抗原結合片段，其進一步包含一重鏈變異胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：128-136及145-147所組成之群組。
30. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一重鏈變異胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：128-136及145-147所組成之群組。
31. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一輕鏈變異胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：82-101所組成之群組。
32. 如申請專利範圍第31項之單離的抗體或其抗原結合片段，其進一步包含一重鏈變異胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：102-125所組成之群組。
33. 一種單離的人類CD27抗體或其抗原結合片段，包含一重鏈變異胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：102-125所組成之群組。
34. 一種單離的CD27抗體或其抗原結合片段，包含一輕鏈變異胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：77、79、81及127所組成之群組。
35. 如申請專利範圍第34項之單離的抗體或其抗原結合片段，其進一步包含一重鏈變異胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：76、78、80及126所組成之群組。
36. 一種單離的CD27抗體或其抗原結合片段，包含一重鏈變異胺基酸序列，其選自由SEQ ID NOs：76、78、80及126所組成之群組。
37. 一種本說明書中所述之任一發明。