[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN104284678B - 人抗cd27抗体、方法和用途 - Google Patents

人抗cd27抗体、方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN104284678B
CN104284678B CN201380025446.3A CN201380025446A CN104284678B CN 104284678 B CN104284678 B CN 104284678B CN 201380025446 A CN201380025446 A CN 201380025446A CN 104284678 B CN104284678 B CN 104284678B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
people
cell
antigen
separated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380025446.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104284678A (zh
Inventor
J.陈
J.弗兰斯森
N.富索夫
D.哈梅
T.马里亚
G.奧布莫洛瓦
T.奧尔特
M.赖兹伊恩
M.斯库里
R.斯维特
A.特普亚科夫
J.惠勒
J.C.阿马格罗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Biotech Inc
Original Assignee
Centocor Ortho Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centocor Ortho Biotech Inc filed Critical Centocor Ortho Biotech Inc
Publication of CN104284678A publication Critical patent/CN104284678A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104284678B publication Critical patent/CN104284678B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

对于人CD27免疫特异性的人抗体能够阻断CD27与其配体CD70的结合并中和CD27的生物活性，包括但不限于CD27胞内信号传导、T细胞增殖和活化、B细胞增殖和分化、成浆细胞形成和抗体应答的减轻、通过CD70的肿瘤细胞刺激、以及来自T细胞和B细胞的可溶性介质产生。该抗体可以用于诊断或治疗CD27活性相关疾病和状况。

Description

人抗CD27抗体、方法和用途
技术领域
本发明涉及针对CD27蛋白质的人抗体及其用途，并且更具体地，涉及针对人CD27蛋白质的人抗体及其在治疗炎性病症中的用途。
背景技术
CD27是I型跨膜蛋白质和TNF受体超家族(TNFSF27)成员，在大多数T细胞、自然杀伤细胞以及抗体分泌浆细胞和记忆B细胞上作为表面抗原表达。CD70是细胞因子，也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员7(TNFSF7)，以及CD27的同源配体。TNFSF配体受体相互作用能够调节T细胞依赖性B细胞分化(Jacquot S.2000Immunol Res.21(1):23-30)，并且在不同细胞中诱导细胞凋亡性细胞死亡。
CD27:CD70连接导致经典和非经典NF-kβ信号传导途径的活化，所述活化依次又刺激B细胞和T细胞增殖、浆细胞分化和后续抗体分泌(Yamamoto,H.1998J Immunol.161(9):4753-9)。CD27与OX40、4-1BB的共刺激还促进活化T细胞的存活(Croft,M.2003CytokineGrowth Factor Rev.14(3-4):265-73)，从而调节许多效应和记忆T细胞，并且通过促进细胞因子例如IL-4和IFNγ产生或调节对其他细胞因子例如IL2和IL-12的作用的T细胞应答而控制T细胞功能。
在人和动物两者中的研究均提示CD27:CD70途径在多种免疫相关疾病中的重要作用，所述免疫相关疾病包括系统性红斑狼疮(SLE)(Doerner T Lupus200413(5):283-9)、类风湿性关节炎(Tak,PP等人，1996clin Immunol Immunopathol80(2):129-38)和多发性硬化症(Hintzen RQ等人，1991JNeuroimmunol35(1-3):211-7)。另一方面，CD70已报道在恶性B细胞上表达至不同程度，并且CD70:CD27复合物能够通过活化抗肿瘤免疫并减少肿瘤生长来介导抗肿瘤应答(Borst J,Hendriks J和Xiao Y.2005.Curr Opin Immunol.17(3):275-81)。CD27还可控制在感染部位处的CD4+和CD8+T细胞积聚(Hendricks等人，2000NatureImmunol1,433-440)。
CD70在正常非造血细胞上不表达。CD70表达看起来暂时局限于抗原活化T细胞和B细胞，并且当抗原刺激停止时，它的表达下调。来自动物模型的证据提示CD70可促成免疫病症例如类风湿性关节炎(Brugnoni等人，1997Immunol.Lett.55:99-104)、牛皮癣关节炎(Brugnoni等人，1997,Immunol.Lett.55:99-104)、以及狼疮(Oelke等人，2004,ArthritisRheum.50:1850-60)。除其在炎症应答中的潜在作用之外，CD70还在各种经转化的细胞上表达，所述经转化的细胞包括淋巴瘤B细胞、何杰金氏细胞和里德-斯特恩伯格细胞(Reed-Sternberg cell)、神经和许多癌起源的恶性细胞。
在W02008/051424(Univ.South Hampton)中描述的激动剂CD27结合抗体注明为可用于促进T细胞免疫，并且此类抗体具有促使它们不受CD70影响(未被抑制)的结合表位。
虽然啮齿类中涉及CD27和/或CD70改变的研究已证实该受体配体相互作用的潜在重要作用，但需要提供对于人CD27及其他CD27:CD70相互作用阻断剂特异性的人抗体，所述人抗体可对CD27表达细胞发挥临床上有用的细胞毒性、细胞生长抑制或免疫调节作用，特别是在不存在CD70的情况下不对CD27表达细胞发挥不希望的激动剂作用。此类化合物可以是调节由CD27表达细胞介导的赘生性细胞或免疫病症发展中有用的治疗剂。
发明内容
本发明提供了能够阻断在宿主受试者中的细胞、组织或器官上与CD27-CD70相互作用相关的活性的人CD27结合单克隆抗体。本发明提供了示例性CD27结合单克隆抗体的氨基酸序列，所述氨基酸序列通过用于在宿主细胞中表达的核酸编码。此外，本发明的CD27单克隆抗体限定在CD27的胞外域上的至少三个非重叠表位，当由本发明的抗体接合时，所述至少三个非重叠表位阻止CD70型配体连接驱动的信号传导和下游生物活性。
本发明的另一个方面是与CD27蛋白质表位反应的分离的抗CD27抗体，所述CD27蛋白质表位由在CD27蛋白质的位置21-191之间的残基限定。
本发明的另一个方面是具有重链可变区序列和轻链可变区序列的分离的抗体，所述重链可变区序列选自SEQ ID NO:76、78、80、102-126、128-136和145-147中所示的序列，所述轻链可变区序列选自SEQ ID NO:77、79、81-101、127、137-144和148中所示的序列，包括这些序列的变体例如保守置换。
本发明的进一步方面是分离的抗体，所述分离的抗体具有选自SEQ ID NO:1-75和151-158中所示的序列的重链和轻链CDR序列，包括这些序列的变体例如保守置换。
本发明的另一个方面是编码本发明的抗体的分离的多核苷酸。
在另一方面，本发明涉及这样的抗体，所述抗体结合抗体C2177和/或C2186或表30-39中所述的由其生成的人抗体与之结合的由蛋白质上的区域限定的共同表位，或所述抗体与抗体C2177和/或C2186或表30-39中所述的由其生成的人抗体竞争结合CD27蛋白质。在另一个实施例中，本发明涉及这样的抗体，所述抗体结合抗体C2191或表30-39中所述的由其生成的人抗体与之结合的由蛋白质上的区域限定的CD27的胞外域表位，并且与抗体C2191或表30-39中所述的由其生成的人抗体竞争结合CD27蛋白质。在另一个实施例中，本发明涉及这样的抗体，所述抗体结合抗体C2192或表30-39中所述的由其生成的人抗体与之结合的由蛋白质上的区域限定的CD27的胞外域表位，并且与抗体C2192或表30-39中所述的由其生成的人抗体竞争结合CD27蛋白质。在另一个方面，本发明包含衍生自抗体C2177、C2186、C2191和C2192或表30-39中所述的由其生成的人抗体中的一种或多种的抗体或其片段，所述抗体或其片段具有由C2177、C2186、C2191和C2192或表30-39中所述的由其生成的人抗体中的一种或多种表现出的其他功能结合特征，例如抑制CD27与CD70阳性细胞的结合。
因此，本发明的一个方面涉及包含经改造的(例如人源化或人适应的)重链和轻链的经改造的抗体，其中：
(1)经改造的重链可变区包含或衍生自来自小鼠抗体C2177、C2191、C2192和C2186重链的一个或多个互补决定区(CDR)，和来自人受体抗体重链的框架，任选具有一个或多个人框架残基置换，以及
(2)经改造的轻链可变区包含来自小鼠抗体C2177、C2191、C2192和C2186轻链的一个或多个互补决定区，和来自人受体抗体轻链的框架，任选具有一个或多个人框架残基置换；以及
(3)经改造的抗体与人CD27特异性结合并干扰其与CD70的相互作用。
在进一步的实施例中，经改造的抗体可由一个或多个CDR组成，所述CDR由一个或多个置换或缺失进一步改造，例如与抗体C2177、C2191、C2192和/或C2186的一个或多个CDR90％、95％、98％或99.5％相同的CDR。
另一个实施例涉及通过给需要此类治疗的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的抗体、其部分或本发明的抗体或其部分的混合物，来治疗或预防与CD27生物活性相关的病理状况。
在进一步的实施例中，本发明包含抗原表位作为疫苗的组分。本发明的抗体识别上文描述的多肽或编码多肽表位的多核苷酸，所述多肽表位包含SEQ ID NO:1残基21-191中的一些或全部的亚片段或三维类似物。该多肽和多核苷酸可用于主动免疫宿主，以引发针对CD27的抗体的产生，所述抗体能够对抗或预防与CD27生物活性相关的病理状况。
本发明还涉及生成、纯化、配制并包装本发明的抗体的方法，通过施用治疗或预防有效量的抗体或其部分，所述本发明的抗体用于治疗或预防与CD27生物活性相关的病理状况。
附图说明
图1是显示C2177抗体对T细胞增殖的作用的图。
图2显示了CD27:C2177:C2191三元复合物的晶体结构。CD27片段的N末端和C末端是标记的。Fab的重链比其轻链更暗。
图3是CD27蛋白质–C2177抗体接触的简图，其中CD27蛋白质残基(表位)在圆圈中，而C2177抗体残基(配位)在方框中。
图4是CD27蛋白质–C2191抗体接触的简图，其中CD27蛋白质残基(表位)在圆圈中，而C2191抗体残基(配位)在方框中。
具体实施方式
缩写
CDR–互补决定区；CFSE–羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯；ECD–胞外域；FR–框架；H–重链；GvHD移植物抗宿主病；L–轻链；IFN–干扰素(g,γ)；Ig–免疫球蛋白；Mab–单克隆抗体；MMP–基质金属蛋白酶；PBMC–外周血单核细胞；VL–可变轻链；VH–可变重链。
定义
如本文所用，“抗体”包括全抗体和任何抗原结合片段或其单链。因此，抗体包括任何包含这样的分子的蛋白或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，诸如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区(FR)、或其任何部分，或可整合进本发明的抗体中的结合蛋白的至少一部分。术语“抗体”还旨在涵盖抗体、其消化片段、指定部分或变体，包括抗体模拟物或包含模拟抗体或其指定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括单链抗体和单域抗体及其片段。功能片段包括针对预选靶标的抗原结合片段。涵盖于抗体的“抗原结合部分”术语中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH域组成的一价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含通过铰链区二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个支臂的VL和VH域组成的Fv片段，(v)由VH域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域VL和VH由单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成的连接肽连接，从而将它们制成单个蛋白质链，所述连接肽使得它们可制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成一价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人，(1988)Science242:423-426以及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖于抗体的“抗原结合部分”术语中。使用本领域的技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选出效用方式与完整抗体相同的片段。相反地，可用scFv构造文库筛选抗原结合力，之后使用常规技术将其与编码人种系基因序列的其他DNA拼接在一起。这种文库的一个例子是“HuCAL:Human Combinatorial Antibody Library”(Knappik，A.等人，JMol Biol(2000)296(1):57-86)。
术语“CDR”是指抗体的互补决定区或高变区氨基酸残基，这些氨基酸残基参与或负责抗原结合。人IgG抗体亚型的高变区或CDR包含来自轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)的氨基酸残基(如由Kabat等人，(1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)所述)和/或来自高变环的那些残基(即轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)或目前H2Chothia定义的52-57和96-101(H3)(如由(Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))描述的))。
框架或FR1-4残基是除高变区外并支撑高变区的那些可变域残基。最近，通用编号系统已得到开发并广泛采用，international ImMunoGeneTics information(IMGT)(LaFranc等人，2005.Nucl Acids Res.33:D593-D597)。
本文中，CDR以氨基酸序列以及重链或轻链中的位置通过顺序编号来表示。由于CDR在免疫球蛋白可变域的结构中的“位置”在物种间是保守的且存在于称为环的结构中，因此通过使用根据结构特征对齐可变域序列的编号体系，容易鉴定CDR和框架残基。这种信息用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移接和置换到来自通常是人抗体的受体框架中。
术语“CD27”指人TNF受体超家族(TNFSF27)，人基因939(CD27基因)的产物，也称为人CD27L受体、MGC20393、S152、T14、T细胞活化抗原CD27，并且包括CD27的所有变体、同种型和物种同系物。所表达的人CD27(NCBI登录号NP_001233)是长度260个氨基酸的多肽，具有在N末端处的20氨基酸分泌信号。因此，在某些情况下，本发明的抗体可与来自除人外的物种的CD27交叉反应。在其他情况下，抗体可对于人CD27是完全特异性的，并且不表现出物种或其他类型的交叉反应性。CD27生物活性意指由于通过一种或多种配体尤其是CD70多肽(TNFSF7,NP_001243)或其他配体例如SIVA的CD27活化，起因于CD27受体结合和/或活化的任何下游活性。CD27转导导致NF-κ--β和MAPK8/JNK活化的信号。衔接蛋白质TRAF2和TRAF5已显示介导该受体的信号传导过程。CD27生物活性还可起因于某些截短形式的CD27或CD27片段与配体的结合，所述配体自身表现出生物活性，例如包含来自可与CD70结合的全长蛋白质的约残基21-191的多肽。CD27抗原胞质尾，残基213-260，结合SIVA蛋白质(也称为细胞凋亡诱导因子：CD27BP；SIVA1、Siva-1、NP_006418(175aa))；和Siva-2、SIVA2、NP_068355(110aa)的N末端。
术语“表位”是指能与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征，以及比电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于与前者而不是后者的结合在变性溶剂的存在下丧失。
“人源化”(也称为再成形或CDR移植)或“改造”包括建立的减少来自异种来源(通常为啮齿类)的单克隆抗体(mAb)的免疫原性，并改善亲和力或效应子功能(ADCC、补体活化、C1q结合)的技术。经改造的mAb可使用分子生物学技术、使用噬菌体展示的随机化序列产生或从头合成。例如，为了构建具有来自非人物种的掺入CDR区的人源化抗体，设计可包括变化，例如CDR残基中的保守氨基酸置换，和残基从非人mAb回复置换成人框架区(回复突变)。位置可通过序列比较方法、共有序列分析或可变区的3D结构的结构分析进行辨别或鉴定。有能说明并显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序可供使用。对这些显示结果进行检查，可以分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式或通过简单序列比对算法(例如Clustal W)，FR(框架)残基可从在此类可公开访问的数据库例如VBASE或Kabat中发现的已知抗体序列中选择，并且将共有序列优化，使得实现所需抗体特征，例如对于一种或多种靶抗原的亲和力。随着抗体结构的已知参数的数据集增加，这些技术的成熟和完善也增加。另一种人源化方法是仅用在人mAb中发现的最常见的残基修饰啮齿类序列的表面残基，并且已被称为“表面再建”或“镶饰(veneering)”。大量人和非人Ig序列均是目前已知的，并且可由本领域技术人员免费获得并使用的，例如在名称IMGT下发现的由LeFranc等人开发的数据库和工具；由美国国家生物制品中心(U.S.National Center forBiologics)(NCBI)策划的网站；Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，U.S.Dept.Health(1983)目前也极大扩展并可在线获得，各自以引用的方式全文并入本文。本发明的抗体的人源化或改造可使用任何已知方法或使用人免疫球蛋白序列信息开发的方法进行。此类方法在例如Winter美国专利6982361和Bowdish等人，WO03/025019中教导，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
如本文所用，KD是指解离常数，具体地讲，是指抗体对预定抗原的KD，并且是抗体对特定靶标的亲和力的测量。高亲和力抗体对预定抗原的KD为10-8M或更低，更优选10-9M或更低，并且更优选10-10M或更低。KD的倒数是KA，为缔合常数。如本文所用，术语“kdis”或“k2”或“kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。“KD”是解离速率(k2，也称为“解离率(off-rate)(koff)”)与缔合速率(k1)或“结合率(on-rate)(kon)”的比率。因此，KD等于k2/k1或koff/kon，且以摩尔浓度(M)表示。它遵循下列原则，即KD越小，结合越强。因此与10-9M(或1nM)相比较，10-6M(或1微摩尔)的KD表明为弱结合。这些值可使用如本领域已知的表面等离振子共振和/或Kinexa方法进行计算。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位呈现出单一的结合特异性和亲和力。该术语也包括“重组抗体”和“重组单克隆抗体”，因为所有抗体都是通过重组方法制备、表达、生产或分离的，例如(a)从动物或杂交瘤分离的抗体，所述抗体通过抗体分泌动物细胞和融合配偶体来制备的；(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离；(c)从重组的、组合的人或其他物种的抗体文库分离的抗体以及(d)用任何其他方法制备、表达、生产或分离的抗体，所述方法涉及将免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列拼接。如本文所用，“分离的抗体”意指这样的抗体：基本上不含其他具有不同抗原特异性的抗体。然而，与人CD27的表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可与例如来自其他物种的其他相关抗原(例如CD27物种同系物)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施例中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体组合被混合在成分明确的组合物中。
如本文所用，“特异性结合”、“免疫特异性结合”和“免疫特异性地结合”是指抗体与预定抗原的结合。通常，抗体以10-7M或更小的解离常数(KD)结合，并且与预定抗原结合的KD至少两倍低于其与除预定抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)结合的KD。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。如本文所用，“高度特异性”结合是指抗体对特定靶表位的相对KD为该抗体与其他配体结合的KD的至少1/10。
如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG)。一些抗体种类还包括亚类，所述亚类也是由重链恒定区编码的，并且还在恒定区域(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)内的特定残基处用低聚糖修饰，所述恒定区域还将生物功能赋予抗体。例如，在人抗体同种型中，IgG1、IgG3和现存较少的IgG2呈现出与鼠IgG2a抗体一样的效应子功能。
所谓“效应子”功能或“效应子阳性”是指抗体包含与抗原特异性结合域有所区别的域，该域能够与受体或其他血液组分(例如补体)相互作用，导致例如巨噬细胞募集，以及引起由抗体的抗原结合域所结合的细胞破坏的事件。抗体具有通过效应分子的结合而介导的几种效应子功能。例如，补体的C1组分结合抗体会激活补体系统。补体的激活对细胞病原体的调理和溶解是重要的。补体的激活会刺激炎症反应，并且还可涉及自身免疫性超敏反应。另外，抗体通过Fc区结合细胞，即抗体Fc区上的Fc受体位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有许多对不同种类的抗体有特异性的Fc受体，所述抗体包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)以及IgM(μ受体)。将抗体结合到细胞表面上的Fc受体会引发许多重要的和各式各样的生物反应，包括吞噬和破坏抗体包裹的颗粒，清除免疫复合物，杀伤细胞溶解抗体包裹的靶细胞(被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，或ADCC)，释放炎性介质，胎盘转移和调节免疫球蛋白产生。
1.本发明的抗体组合物
本发明的CD27中和抗体是这样的抗体，所述抗体在体外、原位和/或体内抑制、阻断或干扰至少一种CD27活性或CD70结合，并且不促进、刺激、诱导或激动CD27活性或配体结合，抗体结合也不模拟CD27配体连接(特别是CD70与CD27的相互作用)的下游效应，例如宿主细胞中的信号转导。合适的CD27中和抗体、特定部分或变体还可任选影响至少一种CD27活性或功能，例如但不限于RNA、DNA或蛋白质合成，蛋白质释放，T细胞活化，B细胞增殖或分化，抗体分泌，CD27受体信号传导，CD27切割，CD27配体结合，CD27或CD70诱导、合成或分泌。
与本发明的CD27中和抗体的CD27:CD70共刺激途径阻断活性有关，具有升高的T细胞或B细胞效应子功能的自身免疫病症的治疗可以是有益的。
本发明基于抗人CD27单克隆抗体的发现，所述抗人CD27单克隆抗体能够抑制通过CD70的CD27活化，并且在不存在CD70刺激的情况下不能CD27自活化。生成能够分泌此类抗体的杂交瘤和转染瘤。NF-kβ报道基因测定法用于鉴定能够抑制CD27表达宿主细胞的CD70介导的NF-kβ报道分子活化的几种候选抗体。其次，该抗体被表征为在不存在CD70刺激的情况下，当与CD27偶联的萤光素酶报道分子转染细胞一起温育时，不能诱导剂量依赖性激动活性。第三，证实该抗体剂量依赖性抑制CD70依赖性人幼稚CD4T细胞增殖。第四，生成的CD27中和抗体能够以剂量依赖性方式减少CD70介导的来自人原代B细胞的浆细胞生成的刺激。第五，使用测试的抗CD27抗体在原代T细胞或B细胞中未观察到显著的剂量依赖性激动活性。
本发明的抗体可干扰CD27:CD70连接，抑制细胞培养中的T细胞效应子功能和B细胞分化为浆细胞两者，并且因此对于免疫介导疾病的治疗可以是有益的，所述免疫介导疾病包括但不限于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、炎性肠病、克罗恩氏病、慢性阻塞性肺疾病或其他与CD27表达细胞群的异常功能或活化相关的综合征、病理状态、疾病或病症。本文所述的CD27结合抗体识别人CD27的胞外域上的至少三个不同区，指示另外发现的CD27上的多个位点适合于抗体或其他具有类似阻断能力的化合物的靶向。因此，本文作为氨基酸序列提供的抗体结合域的表达和纯化还提供了这样的工具，所述工具可以是用于选择表现出CD27中和活性的新分子的方法。
在一个实施例中，抗人CD27抗体具有结合区，所述结合区包含具有如SEQ ID NO:76-144所示的氨基酸序列的轻链可变(VL)或重链可变(VH)区，并且所述抗体或其结合部分免疫特异性地结合CD27。在本发明的另一个实施例中，抗体或其抗原结合部分与CD27蛋白质结合，并且另外，抗体具有本发明抗体的指定功能特性，例如：
与固定的人CD27结合；
抑制人可溶性CD27与表达CD70的细胞结合；
通过NF-κB报道基因测定法以小于0.5ug/ml的IC50测量的，抑制人CD70介导的CD27信号传导；
抑制CD70介导的幼稚T细胞增殖；
抑制CD70介导的来自原代人B细胞的成浆细胞形成；
抑制人CD70介导的来自T和B原代细胞或细胞系的可溶性介质释放；
以小于100nM(10–7M)的Kd与人CD27结合；
在不存在CD70刺激的情况下，最低限度活化CD27信号传导；以及
与人CD27胞外域上的表位结合，具有SEQ ID NO:76-144的可变区序列中的一个或多个的Mab与所述表位结合，并且与鉴定为具有SEQ ID NO:76-144的可变区序列中的一个或多个的Mab竞争结合。
因为本领域众所周知抗体重链和轻链CDR域在抗体对于抗原的结合特异性/亲和力中起特别重要的作用，所以本文公开的本发明的重组抗体包含SEQ ID NO:1-75的重链和轻链CDR中的一个或多个。此类抗体可通过下述进行制备：使用常规技术将抗体的多个部分(例如CDR、框架)化学连接在一起，使用重组DNA技术的常规技术来制备并表达编码抗体的(即一种或多种)核酸分子或使用任何其他合适的方法。
在一个实施例中，本发明的人抗体具有SEQ ID NO:1-75的重链和轻链CDR中的一个或多个的序列。除这些CDR序列之外，普通技术人员将会知道与确切CDR序列的一些偏差可以是可能的或期望的，同时仍保留抗体结合CD27的能力(例如保守置换)。因此，在另一个实施例中，人抗体可由一个或多个CDR组成，所述CDR例如与SEQ ID NO:1-75中列出的CDR90％、95％、98％或99.5％相同。
在另一个实施例中，由本发明的抗体结合的表位包含CD27蛋白质或其核酸编码序列的残基21-191中的少至五个至全部，可用于免疫受试者，以便直接在宿主中产生本发明的抗体，用于治疗、预防或改善与CD27产生相关的疾病或疾病症状的目的。
2.CD27中和抗体的生成
表现出通过公开和描述的抗体如本文例示的所需生物活性谱的CD27中和抗体可通过多种技术生成，包括Kohler和Milstein(1975)Nature256:495的标准体细胞杂交技术(杂交瘤方法)。在杂交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物，例如仓鼠或猕猴，以引起淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能产生将特异性地结合到用于免疫的蛋白的抗体。或，可将淋巴细胞在体外免疫。然后用适合的融合剂，例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles和Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。
如本文所述和/或如本领域已知的，还可任选通过使能够产生人抗体储库的转基因动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类等等)免疫来生成CD27中和抗体。可使用合适的方法，例如本文描述的方法，从此类动物中分离产生人抗CD27的抗体的细胞并使其永生化。作为另外一种选择，可将抗体编码序列克隆，导入合适的载体，并用来转染宿主细胞，从而通过本文教导的方法和本领域所知的那些方法表达和分离抗体。
在其种系配置中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因小鼠的使用提供了高亲和力的全人单克隆抗体的分离，所述全人单克隆抗体针对多种靶包括正常人免疫系统对其耐受的人自身抗原(Lonberg,N.等人，US5569825、US6300129和1994，Nature368:856-9；Green,L.等人，1994，Nature Genet.7:13-21；Green,L.&Jakobovits，1998，Exp.Med.188:483-95；Lonberg,N和Huszar,D.，1995，Int.Rev.Immunol.13:65-93；Kucherlapati等人，US6713610；Bruggemann，M.等人，1991，Eur.J.Immunol.21:1323-1326；Fishwild,D.等人，1996，Nat.Biotechnol.14:845-851；Mendez,M.等人，1997，Nat.Genet.15:146-156；Green,L.，1999，J.Immunol.Methods231:11-23；Yang,X.等人，1999，Cancer Res.59:1236-1243；Brüggemann，M.和Taussig,M J.，Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458,1997；Tomizuka等人，WO02043478)。此类小鼠中的内源免疫球蛋白基因座可以被破坏或缺失，以消除动物产生由内源基因编码的抗体的能力。此外，诸如Abgenix，Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(SanJose,Calif.)之类的公司可从事使用如上所述的技术提供针对所选抗原的人抗体。
在另一个实施例中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体包含人免疫球蛋白基因，并且该文库将人抗体结合域表达为例如单链抗体(scFv)、Fab、或一些其他的表现出配对或不配对的抗体可变区的构建体(Vaughan等人，Nature Biotechnology14:309-314(1996)；Sheets等人，PITAS(USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222:581(1991))。本发明的人单克隆抗体也可用噬菌体展示法制备，以用来筛选人免疫球蛋白基因的文库。此类用于分离人抗体的噬菌体展示法在本领域是成熟的。参见例如授予Ladner等人的美国专利5,223,409；5,403,484；和5,571,698；授予Dower等人的美国专利5,427,908和5,580,717；授予McCafferty等人的美国专利5,969,108和6,172,197；以及授予Griffiths等人的美国专利5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
免疫原性抗原的制备和单克隆抗体产生可使用任何合适技术例如重组蛋白质产生来执行。免疫原性抗原可以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或细胞提取物或组织提取物)的形式施用于动物，或抗原可在动物体内由编码所述抗原或其一部分的核酸从头形成。
本发明的分离的核酸可用本领域熟知的(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术或它们的组合进行制备。编码单克隆抗体的DNA易于使用本领域已知的方法(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)来分离并测序。在杂交瘤生成的情况下，此类细胞可用作此类DNA的来源。作为另外一种选择，使用其中编码序列和翻译产物相关联的展示技术，例如噬菌体或核糖体展示文库，简化了连接子和核酸的选择。噬菌体选择后，可分离来自噬菌体的抗体编码区，并用来产生完整抗体，包括人抗体或任何其他所需的抗原结合片段，并且表达在任何所需的宿主内，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。
人源化抗体
本发明还提供了结合人CD27的人源化(经改造的或人适应的)免疫球蛋白(或抗体)。人源化形式的免疫球蛋白具有基本上来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的一个或多个可变框架区和特异性结合CD27的基本上来自非人Mab的CDR。所述一个或多个恒定区(如果存在)也基本上来自人免疫球蛋白。人源化抗体表现出对CD27至少约10-6M(1μM)、约10-7M(100nM)或更小的KD。人源化抗体的结合亲和力可大于或小于它们衍生自其的小鼠抗体的结合亲和力。为了实现亲和力中的改变，例如改善人源化抗体对CD27的亲和力，可在CDR残基或人残基中作出置换。
如果人可变域框架采取与CDR源于其的小鼠可变框架相同或相似的构象，则小鼠CDR置换到人可变域框架内很可能导致保留其正确的空间取向。这通过获得来自人抗体的人可变域来实现，所述人抗体的框架序列表现出与CDR衍生自其的鼠可变框架域的高度序列同一性。重链和轻链可变框架区可衍生自相同或不同人抗体序列。人抗体序列可为天然存在的人抗体序列，衍生自人种系免疫球蛋白序列，或可为几个人抗体和/或种系序列的共有序列。
合适的人抗体序列可通过计算机比较小鼠可变区的氨基酸序列与已知人抗体的序列来进行识别。分别进行重链和轻链的比较，但是每种比较的原则是相同的。
在一个例子中，CD27中和mAb的氨基酸序列用于查询由公共抗体序列数据库汇集的人抗体数据库。本文公开或描述的重链可变区可用于发现具有最高序列同一性的人可变区。类似地，本文公开或描述的轻链可变区可用于发现具有最高序列同一性的人可变区。对于每个鼠可变区制备DNA构建体，其中将编码来自鼠Mab供体的重链可变区之一的CDR的区域转移到所选人重链可变序列内，替换人可变区的CDR。
鼠CDR区与人可变框架区的非天然并列可导致非天然构象限制，除非通过某些氨基酸残基的置换校正，所述非天然构象限制导致结合亲和力的丧失。如上所述，本发明的人源化抗体包含基本上来自人免疫球蛋白的一个或多个可变框架区和基本上来自小鼠免疫球蛋白(例如C2177、C2186、C2191或C2192小鼠抗体)的CDR。已鉴定小鼠抗体的CDR和适当的人受体免疫球蛋白序列，下一个步骤是测定应置换来自这些组分的哪些残基(如果存在的话)，以优化所得的人源化抗体的特性。一般而言，人氨基酸残基由鼠的置换应降到最低，因为鼠残基的引入增加抗体在人中引发HAMA应答的危险。基于其对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响，选择氨基酸用于置换。此类可能影响的研究可通过建模、在特定位置处的氨基酸特征的检查或特定氨基酸的置换或诱变效应的凭经验观察来完成。就实验方法而言，已发现它特别便于创建变体序列文库，可以根据所期望的活性、结合亲和力或特异性来对该变体序列文库进行筛选。用于创建此类变体文库的一种形式为噬菌体展示载体。作为另外一种选择，可使用编码可变域内的靶残基的核酸序列变异的其他方法生成变体。
确定是否需要进一步替换以及选择用于替换的氨基酸残基的另一种方法可使用计算机建模来完成。用来产生免疫球蛋白分子三维图像的计算机硬件和软件可广泛获得。通常，分子模型的产生起始于免疫球蛋白链或其域的已解算的结构。将要建模的链与已解算的三维结构的链或域进行氨基酸序列相似性的比较，并且选择显示出最高序列相似性的链或域作为分子模型构建的起始点。对已解算的起始结构进行修饰，以允许被建模的免疫球蛋白链或域中的实际氨基酸与起始结构中的那些实际氨基酸之间的不同。然后将修饰的结构组装进复合免疫球蛋白中。最后，通过能量最小化以及通过证实所有原子彼此处于合适的距离且键长和键角在化学可接受限度内来改良模型。
通常，人源化抗体中的CDR区是基本上相同的，并且更通常地，与它们衍生自其的小鼠抗体中的相应CDR区相同。尽管通常是不期望的，但有时能够制备CDR残基的一个或多个保守氨基酸置换，而不明显影响所得的人源化免疫球蛋白的结合亲和力。偶然地，CDR区的置换可增强结合亲和力。
除上文讨论的特定氨基酸置换外，人源化免疫球蛋白的框架区通常是基本上相同的，并且更通常地，与它们衍生自其的人抗体中的框架区相同。当然，框架区中的许多氨基酸对抗体的特异性或亲和力作出很少功效或无直接贡献。因此，框架残基的许多个别保守置换可以是耐受的，而不明显改变所得的人源化免疫球蛋白的特异性或亲和力。
由于密码的简并性，多种核酸序列将编码每个免疫球蛋白氨基酸序列。所需的核酸序列可通过固相DNA从头合成或通过早期制备的所需多核苷酸的变体的PCR诱变来生成。描述于本申请中的所有编码该抗体的核酸明确地包括在本发明中。
如上文所述产生的人源化抗体的可变区段通常连接至人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。所述抗体将包含轻链和重链恒定区二者。重链恒定区通常包含CH1、铰链、CH2、CH3域，并且有时还包含CH4域。
人源化抗体可包含来自任何抗体种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和来自任何亚类(同种型)，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的任何类型恒定区。当需要人源化抗体表现出细胞毒活性时，恒定域通常为补体结合性恒定域，并且种类通常为IgG1。当可不需要此类细胞毒活性时，恒定域可以为IgG2类。人源化抗体可包含来自不止一个种类或同种型的序列。
将任选地与恒定区连接的编码人源化轻链可变区和重链可变区的核酸插入表达载体中。轻链和重链可克隆在相同或不同的表达载体中。将编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接到确保免疫球蛋白多肽表达的一个或多个表达载体中的对照序列。此类对照序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列(参见Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，10029(1989)；WO90/07861；Co等人，J.Immunol.148，1149(1992)，所述文献全文以引用方式并入本文中用于所有目的)。
治疗蛋白的功效可限于不需要的免疫反应。非人单克隆抗体可具有直链氨基酸序列的基本延伸和引起人免疫应答的局部结构构象。减少非人抗体的免疫原性的第一尝试是框架人鼠抗体嵌合体，其随后为二十世纪八十年代晚期中用于使这些嵌合体人源化的方法(在Almagro和Fransson，FrontBiosci13:1619-1633,2008中综述)。
最常用的人源化方法之一是所谓的“互补决定区(CDR)移植”，其中将鼠CDR移植到人抗体框架区(FR)内。然而，该方法的应用更通常不导致与抗原结合的大量丧失，并且因此不导致基于抗体的药物效力中的减少。从而，这对于使用合理设计原理以创建抗体分子是高度有价值的，所述抗体分子引起最低限度的免疫原性反应，同时在注射到人内时保留亲本非人分子的结合和生物物理特征。
2177和2191的人源化得到描述，所述2177和2191是对CD27具有结合特异性的两种小鼠单克隆抗体(mAb)。使用杨森公司(Janssen)有专利权的称为人框架适应(HFA)的人源化技术的第一步骤，将这些抗体的框架(FR)替换为人种系基因FR，所述人源化技术在专利申请Raghunathan,G.,US20090118127A1中公开并在Fransson等人(J Mol Biol398:214-231,2010)中进一步例示。该技术使对于CD27特异性的一组mAb成为可能，所述mAb的结合和抑制特性优于对于亲本小鼠抗体2177和2191测量的结合和抑制特性。
3.使用抗CD27抗体的方法
如下文更详细地描述的，本发明证实四种分离的单克隆抗体(C2177、C2186、C2191和C2192)结合CD27上的三个非重叠表位，并且在体外和/或在体内展示CD27抑制活性。显著地，MAb的反应性包括下述能力：剂量依赖性阻断CD27与CD70的相互作用，减少在CD70的存在下的CD27信号传导，减少通过T细胞的IL-4和IFNg产生，并抑制CD70依赖性人幼稚CD4+T细胞增殖、CD70依赖性B细胞增殖和浆细胞生成。此外，分离的抗体在不存在CD70刺激的情况下不显著诱导CD27活化。
考虑到如本发明中所述的单克隆抗体的特性，抗体或其抗原结合片段适合作为治疗剂和预防剂来治疗或预防人和动物中的CD27相关状况。
一般而言，使用包括将治疗或预防有效量的一种或多种本发明的单克隆抗体或抗原结合片段，或选择为具有类似结合和生物活性谱的抗体或分子，施用于敏感受试者或表现出状况的受试者，在所述状况中已知CD27活性具有病理后遗症，例如免疫病症或肿瘤生长和转移。可以施用所述抗体的任何活性形式，包括Fab和F(ab')2片段。
优选地，所用抗体与受者物种相容，使得在受试者中对MAb的免疫反应不会造成不能接受的短循环半衰期或引起对MAb的免疫反应。施用的MAb可表现出一些辅助功能，例如与受试者的Fc受体结合和激活ADCC机制，以便使用细胞溶解或细胞毒机制排除靶细胞群，或可将它们进行工程化以限制或消除这些辅助功能，从而保留靶细胞群。
个体治疗可包括施用治疗有效量的本发明的抗体。抗体可以如下所述的试剂盒提供。抗体可以例如相等量的混合物形式使用或施用，或可以单独地按序提供或一起施用。在向患者提供在受体患者中能够结合CD27的抗体或其片段或能够保护不受CD27的抗体时，施用试剂的剂量根据诸如患者的年龄、重量、高度、性别、一般医学状况、既往病史等因素而改变。
在相似的方法中，本发明的单克隆抗体的另一个治疗用途为，使用针对本发明的一个单克隆抗体培育的抗独特型抗体来主动免疫患者。用模拟表位结构的抗独特型的免疫可引发主动抗CD27应答(Linthicum,D.S.和Farid,N.R.，Anti-idiotypes,Receptors,andMolecular Mimicry(1988)，第1-5和285-300页)。
同样，可通过施用作为疫苗组分的一个或多个抗原表位和/或致免疫表位来引起主动免疫。可口服或非肠道服用一定量的疫苗，该量足够在预防性或治疗上实现受试者产生对抗此生物功能区的保护性抗体。可用纯化形式的抗原肽/致免疫肽、肽的片段或肽的修饰形式主动免疫宿主。可将不对应初始蛋白序列的一个或多个氨基酸加入初始肽或截短形式的肽的氨基端或羧基端。此类额外的氨基酸可用于将该肽偶联到另一个肽、偶联到大载体蛋白或偶联到支撑物。可用于这些目的的氨基酸包括：酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸以及它们的衍生物。可使用替代的蛋白修饰技术，例如NH2端乙酰化或COOH端酰胺化，以提供另外的将该肽偶联或融合到另一个蛋白或肽分子或支撑物的方法。
能够保护不受不需要的CD27生物活性的抗体预期以足够实现CD27相关症状或病理状态的减少、消退或改善的量提供给受体受试者。如果试剂的剂量、给药途径等足以影响此类反应，则认为该量为“实现”症状减轻的足够量或“治疗有效量”。可通过分析受试者的受影响的组织、器官或细胞，如通过成像技术、或通过体外分析组织样品来测定对抗体施用的反应。如果试剂的存在导致受试患者的生理出现可检测的改变，那么该试剂为生理上显著的。
治疗应用
本发明的CD27中和抗体、其抗原结合片段或特定变体可在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人)中用于测量或引发效应，以诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防下述的发生或减少下述的症状：由CD27或表达CD27的细胞介导、影响或调节的状况。因此，本发明提供了使用至少一种本发明的CD27抗体调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种CD27相关疾病的方法。具体适应症在下文讨论。
免疫相关疾病
本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的免疫相关炎性疾病的方法，所述免疫相关炎性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、全身发作型幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊椎炎、胃溃疡、血清阴性关节病、骨关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺纤维化、系统性血管炎/韦格纳氏肉芽肿、肉样瘤病、睾丸炎/输精管复通术、变态反应/特应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、湿疹、变应性接触性皮炎、变应性结膜炎、超敏感性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身性炎症应答综合征、脓毒症综合征、革兰氏阳性脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、培养阴性脓毒症、真菌脓毒症、嗜中性粒细胞减少性发热、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、电离辐射暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、酒精诱发的肝炎、慢性炎性病理状态、肉样瘤病、克罗恩氏病的病理状态、镰状细胞性贫血、糖尿病、肾病变、特应性疾病、超敏反应、变应性鼻炎、花粉热、常年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位症、哮喘、荨麻疹、全身性过敏反应、皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、血小板减少症、任何器官或组织的移植物排斥、肾移植排斥、心脏移植排斥、肝移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、皮肤同种异体移植物排斥、软骨移植排斥、骨移植物排斥、小肠移植排斥、胎儿胸腺植入物排斥、甲状旁腺移植排斥、任何器官或组织的异种移植物排斥、同种异体移植物排斥、抗受体超敏反应、格雷夫斯病、雷诺氏病、B型胰岛素抗性糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、III型超敏反应、系统性红斑狼疮、POEMS综合征(多发性神经病变、脏器肿大、内分泌病变、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合征)、抗磷脂综合征、天疱疮、硬皮病、混合性结缔组织病、特发性阿狄森氏病、糖尿病、慢性活动型肝炎、原发性胆汁性肝硬化、白癜风、血管炎、心梗后MI心切开术综合征、IV型超敏反应、接触性皮炎、超敏感性肺炎、同种异体移植物排斥、由于胞内生物的肉芽肿、药物敏感性、代谢/特发性、威尔森氏病、血色素沉著病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病性视网膜病变、桥本氏甲状腺炎、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、囊性纤维化、新生儿慢性肺病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、皮肤状况、牛皮癣、脱发、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾功能衰竭、血液透析、尿毒症、毒性、先兆子痫、OKT3疗法、抗CD3疗法、细胞因子疗法、化学疗法、放射疗法(例如包括但不限于虚弱、贫血、恶病质等等)、慢性水杨酸盐中毒等等。
肺部疾病
本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的肺部或胸膜疾病的方法，所述方法包括但不限于在下述疾病中调节对涉及CD27的相关或辅助细胞或细胞过程的免疫应答：肺炎；肺脓肿；由以粉尘、气体或薄雾形式的试剂引起的职业性肺病；哮喘、闭塞性纤维性细支气管炎、呼吸衰竭、肺超敏感性疾病包括超敏感性肺炎(外源性变应性肺泡炎)、变应性支气管肺曲霉病和药物反应；成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、古德帕斯彻氏综合征、慢性阻塞性气道病症(COPD)、特发性间质性肺病例如特发性肺纤维化、肉瘤样病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎、呼吸性细支气管炎伴间质性肺病、特发性闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎、淋巴细胞性间质性肺炎、朗格汉斯细胞肉芽肿、特发性肺含铁血黄素沉着症；急性支气管炎、肺泡蛋白沉积症、支气管扩张症、胸膜病症、肺不张、囊性纤维化和肺肿瘤以及肺栓塞。
恶性疾病
本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的恶性疾病的方法，所述方法包括但不限于在下述疾病中的至少一种中调节对涉及CD27的相关或辅助细胞或细胞过程的免疫应答：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B细胞、T细胞或FAB ALL、急性髓样白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、作为原发性疾病或转移性疾病的实体瘤、卡波西氏肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、肾细胞癌、肺癌包括间皮瘤、乳腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多病、恶性肿瘤的副肿瘤综合征/高血钙症、腺癌、鳞状细胞癌、肉瘤、恶性黑素瘤特别是转移性黑素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌症相关的骨重吸收、癌症相关的骨痛等等。
心血管疾病
本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的心血管疾病的方法，所述方法包括但不限于在下述疾病中的至少一种中调节对涉及CD27的相关或辅助细胞或细胞过程的免疫应答：心肌梗死、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病性动脉粥样硬化病、高血压、动脉高血压、肾血管性高血压、昏厥、休克、心血管系统梅毒、心力衰竭、肺源性心脏病、原发性肺动脉高血压、心律失常、心房异位搏动、心房扑动、心房颤动(持续或阵发的)、灌注后综合征、心肺转流术炎症应答、紊乱性或多源性房性心动过速、规则狭窄性QRS心动过速、特殊心律失常、心室颤动、希氏束心律失常、房室传导阻滞、束支传导阻滞、心肌缺血性病症、冠状动脉病、心绞痛、心肌梗死、心肌病、扩张性充血性心肌病、限制性心肌病、心脏瓣膜病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉夹层、主动脉炎症、腹主动脉及其分支阻塞、外周血管病症、阻塞性动脉病症、外周动脉粥样硬化病、血栓闭塞性血管炎、功能性外周动脉病症、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性肢痛病、静脉病、静脉血栓形成、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定型心绞痛、再灌注损伤、泵后综合征、缺血再灌注损伤等等。
神经系统疾病
本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的神经系统疾病的方法，所述方法包括但不限于在下述疾病中调节对涉及CD27的相关或辅助细胞或细胞过程的免疫应答：神经变性疾病、多发性硬化症、偏头痛、AIDS痴呆复合征、脱髓鞘疾病例如多发性硬化症和急性横贯性脊髓炎；锥体束外和小脑失调，例如皮质脊髓系统病灶；基底神经节失调或小脑失调；多动性运动失调，诸如亨廷顿氏舞蹈症和老年性舞蹈症；药源性运动失调，诸如阻断CNS多巴胺受体的药物诱发的失调；运动减少性失调，诸如帕金森氏病；进行性核上性麻痹；小脑结构性病灶；脊髓小脑的退化，诸如脊髓性共济失调、弗里德赖希共济失调(Friedreich's ataxia)、小脑皮层退化、多发性系统退化(Mencel症、Dejerine-Thomas症、Shi-Drager症和Machado-Joseph症)；全身失调(雷弗素姆氏病、无β脂蛋白血症、共济失调、毛细管扩张和线粒体多系统失调)；脱髓鞘核失调，诸如多发性硬化症、急性横向脊髓炎；以及运动单元的失调，诸如神经源性肌萎缩(前角细胞退化，诸如肌萎缩侧索硬化症、婴儿型骨髓性肌萎缩症和幼年型骨髓性肌萎缩症)；阿尔茨海默病；唐氏综合症；弥漫性路易体病；与路易体发展相关的老年性痴呆；韦尼克-科尔萨科夫综合征；慢性酒精中毒；克雅二氏症；亚急性硬化性全脑炎、哈勒沃登-施帕茨病(Hallerrorden-Spatz disease)；以及拳击员痴呆等等。此类方法可任选包括给需要此类调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的组合物或药物组合物，所述组合物或药物组合物包含至少一种TNF抗体或指定部分或变体。
CD27中和抗体的其他治疗用途
除上述状况和疾病之外，本发明还提供了通过在例如下述疾病中调节对涉及CD27的相关或辅助细胞或细胞过程的免疫应答，用于调节或治疗各种病因的纤维化状况的方法：肝纤维化(包括但不限于酒精诱发的肝硬化、病毒诱发的肝硬化、自身免疫诱发的肝炎)；肺纤维化(包括但不限于硬皮病、特发性肺纤维化)；肾纤维化(包括但不限于硬皮病、糖尿病肾炎、肾小球肾炎、狼疮肾炎)；表皮纤维化(包括但不限于硬皮病、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩、烧伤)；骨髓纤维化；神经纤维瘤；纤维瘤；肠纤维化；以及外科手术导致的纤维性粘着。
本发明还提供了通过在例如下述疾病中调节对涉及CD27的相关或辅助细胞或细胞过程的免疫应答，用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的传染性疾病症状的方法：急性或慢性细菌感染、急性和慢性寄生或感染过程包括细菌、病毒和真菌感染、HIV感染/HIV神经病、脑膜炎、肝炎(甲型、乙型或丙型等等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌(E.coli)、溶血性尿毒性综合征、疟疾、登革出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌性肌炎、气性坏疽、结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌、卡氏肺囊虫性肺炎、盆腔炎性疾病、睾丸炎或附睾炎、军团菌、莱姆病、a型流行性感冒、EB病毒、病毒相关性噬血细胞综合征、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎等等。
本专利申请自始至终所有引用的参考文献(包括参考文献、授权专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)的内容在此明确地以引用方式并入。
本发明的其他特征在示例性实施例的下述描述过程中将变得显而易见，给出所述示例性实施例用于本发明的举例说明而不预期限制本发明。
4.药物制剂
本发明提供了优选为水性磷酸盐缓冲盐水或混合盐溶液的CD27中和抗体的稳定制剂，以及包含在药学上可接受的制剂中的至少一种CD27中和抗体，适合于药物或兽医学用途的保存溶液和制剂以及可重复使用的保存制剂。合适的媒介物及其制剂，包含其他人蛋白如人血清白蛋白在内，描述于例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy，第21版，Troy,D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA2006，第5部分。
为了形成适合于有效施用的药学上可接受的组合物，此类组合物将含有有效量的上述化合物连同合适量的载体媒介物。另外的药物方法可用于控制作用持续时间。控制释放制剂可通过使用聚合物复合或吸收化合物而实现。另一种控制通过控制释放制剂的作用持续时间的可能方法是将本发明的化合物掺入聚合物材料的颗粒内，所述聚合物材料例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。作为另外一种选择，代替将这些试剂掺入聚合物颗粒内，能够将这些材料夹带在制备例如界面聚合的微胶囊，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中，或胶态药物递送系统例如脂质体、白蛋白微球体、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶囊或粗乳状液中。此类技术公开于Remington同上(2006)中。
5.CD27中和抗体的施用
在本文所述的稳定或保存制剂或溶液中的至少一种CD27中和抗体可根据本发明经由多种递送方法施用于患者，所述递送方法包括静脉内(I.V.)，肌内(I.M.)；皮下(S.C.)；经皮，肺部，经粘膜，使用在植入物、渗透泵、药液筒、微型泵或其他技术人员知道的工具中的制剂，如本领域众所周知的。
在施用CD27中和抗体的一种方法中，药物物质从配备输液袋的先前安装的导管静脉内给予。CD27中和抗体在20-ml一次性使用的小瓶中供应，所述小瓶例如由ImmunoGen,Inc.(Cambridge,MA)供应的小瓶。每个小瓶含有在缓冲溶液(pH6.5±0.5)中浓度为0.05至约2.0mg/ml的蛋白质，所述缓冲溶液基本上由在纯净水，USP中的磷酸二氢钾(0.57mg/ml)、磷酸二氢钠一水合物(0.20mg/ml)、磷酸氢二钠(0.555mg/ml)和氯化钠(8.16mg/ml)组成。药物产品在将剂量体积灌输到输液袋内后，通过使其经过低蛋白质结合5-μ滤器而预过滤两次，并且通过线内0.22μm滤器在制备8小时内施用于患者。在输注后，i.v.线应使用流体冲洗，以确保完全药物剂量的递送。
通常，如果施用全身剂量的抗体，希望提供给受者剂量在约1ng/kg-100ng/kg、100ng/kg-500ng/kg、500ng/kg-1μg/kg、1μg/kg-100μg/kg、100μg/kg-500μg/kg、500μg/kg-1mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、50mg/kg-100mg/kg、100mg/kg-500mg/kg(受者的体重)范围内的剂量，但也可施用较低或较高的剂量。低至约1.0mg/kg的剂量可预期显示一些功效。优选地，约5mg/kg是可接受的剂量，尽管高达约50mg/kg的剂量水平对于治疗用途也是尤其优选的。作为另外一种选择，可给予特定量的抗体的施用，所述特定量不基于患者的重量，例如在1ug–100ug、1mg–100mg或1gm–100gm范围内的量。例如，可通过下列位点特异性施用到体室或体腔中：关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮方式。
治疗可以单剂量计划表给予，或优选以多剂量计划表给予，在所述多剂量计划表中，最初治疗过程可使用1-10次分开的剂量，随后为维持和或增强应答所需的以后续时间间隔给予的其他剂量，例如在1-4个月时的第二剂量，以及需要时，在几个月后的一个或多个后续剂量。合适的治疗疗程的例子包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或其他足以引起预期会减轻疾病症状或减轻疾病严重程度的所需反应的疗程。
6.包含CD27中和抗体的制造制品
本发明包括含有可用于治疗上述病症的材料的制造制品，所述制造制品包含CD27中和抗体、容器和在容器上或与容器相关的标签或药品说明书。制造制品优选含有至少一个小瓶，所述至少一个小瓶包含任选在水性稀释剂中的至少一种CD27中和抗体与指定缓冲液和/或防腐剂溶液，其中所述包装材料包含指示此类溶液可保持一段时间的标签。本发明可包含制造制品，所述制造制品包含包装材料，包含冻干的CD27中和抗体的第一小瓶，和包含指定缓冲液或防腐剂的水性稀释剂的第二小瓶，其中所述包装材料包含指导从业者或患者如何在水性稀释剂中重构CD27中和抗体以形成溶液的标签。
合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料例如玻璃或塑料形成。容器可具有无菌访问口(例如容器可以是具有任选能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
组合物中的至少一种活性剂是CD27中和抗体。标签或药品说明书指示组合物用于治疗选择的适应症例如SLE。药品说明书在本文中可指示抗体或组合物用于治疗这样的状况，所述状况不响应或弱响应使用如本文概述的用于特定疾病和诊断的标准护理的治疗。在其他实施例中，药品说明书可指示抗体、抗体缀合物或组合物也可用于治疗特征在于需要调节涉及CD27的细胞过程的免疫应答的疾病。
本发明的另外一个方面是用于检测生物样品中的CD27的试剂盒。该试剂盒包括容纳一种或多种结合CD27的表位的抗体的容器，和使用该抗体用于与CD27结合形成免疫复合物并检测免疫复合物形成的目的的说明书，使得免疫复合物的存在或不存在关联样品中CD27的存在或不存在。容器的例子包括允许同时检测多重样品中的CD27的多孔板。
虽然已用一般的术语描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中公开。
实例1：CD27试剂和方法
为了生成并测试CD27结合单克隆抗体，生成代表人CD70和人CD27的全长以及人CD27的胞外域(ECD)的蛋白质构建体。
人CD27(SEQ ID NO:149)是1型跨膜蛋白质，包含信号肽(从残基1到20)、胞外域(ECD，从残基21到191)、跨膜域(TM，从残基191到212)以及胞内(ICD，从残基213到260)域。人CD70(SEQ ID NO:2)是长度193个氨基酸的2型跨膜多肽，从N末端起包含胞内域(ICD，从残基1至17)、跨膜域(TM，从残基18至38)和胞外域(ECD，从残基39至193)。将完整的CD70编码序列在HEK293细胞表面上克隆表达。
对于mAb ELISA和基于蛋白质的直接结合测定法，CD27ECD的氨基酸1-121与C末端His6标签肽一起在HEK293细胞中瞬时表达，并且通过金属离子色谱法进行纯化。对于噬菌体淘选和ELISA测定法，具有C末端His6标签的ECD的氨基酸1-173进行HEK表达，并且通过金属离子色谱法随后为在Superdex75上的尺寸排阻色谱法进行纯化。这两种CD27蛋白质均使用NHS酯化学进行生物素酰化，靶向蛋白质上的胺残基。对于结晶，具有C末端His6标签的氨基酸1-101在杆状病毒系统中表达，并且通过Proteose,Inc.经由金属离子色谱法进行纯化。对于小鼠免疫，CD27-Fc蛋白质购自R&D systems。对于一些研究，将完整的CD27编码序列在HEK293细胞表面上克隆表达。
人CD27和人CD70cDNA克隆购自Open Biosystems。标准分子生物学技术用于生成表达构建体。简言之，经由限制性核酸内切酶消化和连接，或经由连接酶不依赖性克隆(LIC)，将CD27和CD70基因的开放读码框PCR扩增并克隆到哺乳动物表达载体内。将全长CD27和CD70基因克隆到表达载体内，并且在哺乳动物细胞表面上克隆表达。将CD27的胞外域克隆到哺乳动物表达载体内，并且与六组氨酸尾部一起在HEK293细胞中瞬时表达。
实例2：CD27中和抗体的生成
鼠抗人CD27抗体通过Kohler和Milstein(1975)的杂交瘤方法生成。十只12-14周龄C3H/HeJ小鼠得自Charles River Laboratories。在第1天时，小鼠在尾根(BOT)处用最终体积100μL，与各0.33×105单位的鼠干扰素-α和干扰素-β(Biosource)组合的50μg HuCD27Fc(R&D Systems)进行皮下(SQ)免疫。在第2和3天时，小鼠用干扰素(与第1天时相同的剂量)进行SQ BOT注射。在第14天时，小鼠用在PBS中SQ BOT给予的与50μg抗鼠CD40激动剂Mab(R&D Systems,MAB440)组合的50μgHu CD27-Fc进行加强；在脾收获用于融合前四天。
对于滴度评价，执行捕获期EIA。简言之，板(Nunc-Maxisorp)用在碳酸氢盐缓冲液中的0.1μg山羊抗ms Fc(Jackson Immunotech)在4℃下包被过夜。在封闭和洗涤步骤后，加入血清稀释物，并且使板在RT下温育30分钟。在洗涤步骤后，使板在RT下与0.25μg/mL生物素酰化的HuCD27-ECD一起在封闭缓冲液中温育30分钟，并且用在0.4％BSA/PBS中1:40,000稀释的HRP标记的链霉抗生物素蛋白(Jackson Immunotech)在RT下探测30分钟。板如上所述进行洗涤；随后加入OPD(Sigma快速标签)底物溶液，在室温下温育10分钟，通过添加以25μL/孔的4N硫酸停止底物显色，并且在490nm处测量吸光度。
非分泌性BALB/c小鼠骨髓瘤融合配偶体的细胞库FO购自ATCC(#CRL-1646)。将FO细胞的一个冻干小瓶解冻并重悬浮于补充有10％(v/v)FBS(Hyclone)的具有GlutamaxTM的DMEM(改良)培养基(Invitrogen)。将细胞扩增，冷冻保存并通过查尔斯河实验室认定无菌和不含支原体。C1833A(Centocor)细胞系也用于该融合中。该细胞系通过击倒FO细胞系中的CHOP基因表达而内部获得，因此它需要在使用遗传霉素的选择下生长。细胞如上文FO进行处理，除了在补充有10％(v/v)FBS(Hyclone)和500ug/mL遗传霉素(Gibco)的具有GlutamaxTMDMEM(改良)培养基中生长之外。在融合前对FO和C1833A细胞系两者实施细胞同步。简言之，将1.5-2×108细胞种植到补充有0.25％(v/v)FBS(Hyclone)的180mL具有GlutamaxTM的DMEM(改良)培养基内，并且在37℃下温育13小时。加入另外20mL FBS用于10％的最终FBS浓度，并且在使用前在37℃下温育另外13小时。C1833A细胞在细胞同步过程自始至终始终处于遗传霉素选择下。骨髓瘤细胞在PBS中洗涤，计数并在融合前经由GuavaViacount软件测定活力(>78％)。
在融合当天，细胞通过CO2窒息实施安乐死。将脾无菌取出并浸入含有抗生素(PSA)(Sigma)的10mL冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
制备脾细胞的单细胞悬浮液并实施使用RBC裂解缓冲液(Sigma)的RBC裂解。根据制造商的说明书将洗涤的细胞标记用于磁性分选，使用抗鼠Thy1.2、抗鼠/人CD11b和抗鼠IgM磁珠(Miltenyi Biotec#130-049-101、130-149-601和130-047-301)，并且随后通过运行耗尽程序使用AutoMacs Pro仪器进行分选。收集未标记的(富含成浆细胞B细胞)和标记的细胞馏分两者，随后经由Guava PCA进行计数。弃去阳性标记的细胞。将未标记的细胞对半分开用于与FO和C1833A融合配偶体两者融合。根据De St.Groth(J ImmunologicalMethods.35:1-21.1980)的方法，融合以1:1比的鼠骨髓瘤细胞与活脾细胞进行。简言之，将脾和骨髓瘤细胞混合在一起，形成团块并在50mLPBS中洗涤一次。将团块重悬浮于1mL聚乙二醇(PEG)溶液(2g PEG分子量4000、2mL DMEM和0.4mL DMSO)中在37℃下经过30秒。随后将细胞/融合混合物浸入37℃水浴中大约60秒，伴随轻轻搅动。通过经过1分钟缓慢加入37℃DMEM停止融合反应。允许融合的细胞在室温下静置5分钟，并且随后以150×g离心5分钟。随后将细胞重悬浮于HAT培养基[具有GlutamaxTM的DMEM(改良)，补充有20％FBS、5％Origen、25μg/mL庆大霉素(Sigma)和HAT(100μM次黄嘌呤、0.4μM氨甲蝶呤和16μM胸苷(Sigma)，并且种植到含有～2.25μg/mL AF488人CD27(Janssen Research&Development,LLC)的96孔平底聚苯乙烯组织培养板(Corning#3997)或甲基纤维素培养基(StemCell Technologies，MediumD目录#03804)中。板在具有7％CO2的加湿37℃培养箱中温育7-10天。从甲基纤维素板中选择单个集落，用于利用ClonepixFL或在白光显微镜下筛选。
实例3：重组Mab的生物活性
使用如下所述的多种体外测定法分析来自鼠抗体的结合域结合CD27并阻断CD27的某些生物活性的能力。
固相EIA用于在杂交瘤上清液中筛选能够结合人CD27的抗体。板(Nunc-Maxisorp#446612)用在碳酸氢盐缓冲液O/N中的4μg/mL Fab山羊抗huFc(Jackson#109-006-098)在4℃下包被过夜。无需洗涤，孔用在PBS中的200μL0.4％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)在RT下封闭1小时。在用含有0.02％(w/v)Tween20的0.15M盐水洗涤后，将在0.4％BSA/PBS中的50μlhuCD27-Fc加入板中在RT下1小时。再次洗涤后，使50μl未稀释的杂交瘤上清液在包被板上在RT下温育30分钟。将板洗涤三次，并且随后与1:10,000稀释的50μL山羊抗鼠Fc HRP(Jackson#115-036-071)一起在RT下温育30分钟。将板再次洗涤并如上所述显色用于滴度评价。对于杂交瘤Mab的相对结合能力评价，使用Maxisorp384孔板(NUNC464718)用系列稀释的杂交瘤上清液(对5μg/mL的起始浓度标准化)进行相似测定法。该测定法鉴定了386个阳性杂交瘤。
使用生物化学结合测定法与IM-9细胞(发现内源表达人CD70的B成淋巴细胞样细胞系)，在所有386个CD27特异性杂交瘤中筛选抑制huCD27与huCD70结合的能力。Maxisorp板(VWR#62409-314)用重组人CD27/Fc(R&D Systems，目录#382-CD)以250纳克(ng)/mL包被，并且在4℃下温育过夜。第二天，板用封闭缓冲液(Pierce，目录#37543)封闭，并且用含有无Ca++或Mg++的PBS、0.01％Tween-20的洗涤缓冲液I洗涤。在每块板上包括对照(针对hCD27的小鼠MAB，R&D Systems，目录#MAB382；小鼠IgG1同种型对照，R&D Systems，目录#MAB002；小鼠IgG2a同种型对照，R&D Systems，目录#MAB003)。将50uL/孔杂交瘤样品或对照与50μL/孔收获的IM-9细胞，人B成淋巴细胞样细胞系(ATCC,CCL-159)混合，并且在RT下无需振荡温育1小时。在温育结束时，板用洗涤缓冲液II进行洗涤，以去除所有未结合的细胞，并且随后用50uL/孔Cell Titer Glo试剂(Promega，目录#G7571)进行裂解。在伴随振荡的10分钟温育后，在Envision(PerkinElmer，2102多标记阅读器)上阅读板。生成的发光信号与存在的ATP量成比例，并且直接关联通过CD27结合捕获的在孔中存在的活细胞数目。基于生物化学结合测定法的结果，约50％的CD27特异性克隆是中和的。
为了消除中和克隆中的冗余，执行竞争结合测定法以将抗体框并(bin)成竞争组。在该测定法中，用实验对象组中的阳性杂交瘤各自作为捕获试剂和检测试剂个别评价杂交瘤上清液。彼此形成有效捕获/检测试剂的抗体很可能识别CD27蛋白质上空间分开的表位，因此允许两个抗体同时与靶蛋白质结合。跨越整个实验对象组表现出相似活性模式的克隆组合可能与相似表位结合。从不同组中选择克隆因此提供了识别不同部位的抗体。简言之，384孔Nunc Maxisorp板(464718)用在包被缓冲液中的山羊抗小鼠Fc(JIR115-005-071)在4℃下包被过夜。板随后用在PBS中的0.4％BSA在室温下封闭30分钟。在该步骤和所有后续步骤时，板用PBS、0.02％Tween-20进行洗涤。行(一行/上清液)的每个孔接受20uL上清液(纯上清液用于初始筛选，但对于亚克隆再筛选，上清液针对2ug/ml mAb进行标准化)连同对照(小鼠抗huCD27，R&D Systems，目录#MAB382；小鼠同种型对照目录#555439，Becton-Dickenson)，随后在RT下温育30分钟。在洗涤后，在PBS加上10％小鼠血清(Bioreclamation小鼠血清CD-1批次#MSEBREC.18565)中制备25uL未标记的Hu CD27–ECD-His标签，以0.3(或0.8用于浓度标准化)μg/ml加入所有孔，随后为在室温下的30分钟温育，随后洗涤。每种上清液沿单列向下加入，并且在RT下与25uL如下制备的混合物一起温育30分钟：(使上清液与山羊抗小鼠Fc HRP(Jackson115-036-008)预温育)，通过将150uL1:1000山羊抗小鼠Fc HRP与各1000uL上清液(对于初步筛选)或90uL1:2000/600uL调整至2ug/mL的上清液(对于亚克隆再筛选)混合。在室温下的30分钟温育后，加入200μL100％正常小鼠血清/mL，并且在RT下温育另外30分钟。将板洗涤，随后在RT下与100uL/孔柠檬酸盐磷酸盐底物溶液(0.1M柠檬酸和0.2M磷酸钠、0.01％H2O2和1mg/mL OPD)在RT下温育15分钟。通过添加25uL4N硫酸停止底物显色，并且使用自动化板阅读器在490nm处测量吸光度。该框并测定法鉴定了识别在huCD27抗原上的非重叠结合位点的三组。来自所有三组的所选抗体按比例扩大用于抗体产生、纯化和在功能测定法中的进一步测试。
细胞信号传导的抑制
CD70与CD27的结合诱导导致转录因子NF-kβ的下游活化的信号传导。建立NF-kβ报道分子测定法用于进一步的抗体表征。测定法以两种模式运行：(1)用于评价通过中和CD70诱导的CD27活化的抗体拮抗性，和(2)用于评价没有CD70连接通过活化CD27信号传导的抗体激动性。在NF-kβ启动子的控制下，HEK-293F细胞用含有人CD27和萤光素酶构建体的总共36ng DNA进行转染。将HEK-293F转染子以5×104细胞/孔在96孔板中的40uL Freestyle培养基(Gibco)中铺平板。以1:3稀释度将CD27中和杂交瘤mAb的稀释物加入测定板中的Freestyle培养基(Gibco)中用于50ug/mL的最终浓度，并且使板在37℃(95％O2/5％CO2)下温育一小时。为了测试杂交瘤mAb中和CD70:CD27信号传导的能力，将终末照射的(4000拉德)HEK-293E CD70游离细胞以20％的CD27转染子细胞数目加入测定板中。为了测试杂交瘤mAb的激动剂活性，省略CD70游离细胞的添加。测定板在37℃(95％O2/5％CO2)下温育过夜，并且根据制造商的说明书，使用萤光素酶测定系统(Promega)显色。选择四种CD27中和杂交瘤mAb，C2177、C2186、C2191和C2192，用于进一步表征，在不存在CD70刺激的情况下，所述四种CD27中和杂交瘤mAb剂量依赖性阻断CD70介导的CD27信号传导，而不引起显著的剂量依赖性CD27受体激动性活化。在表1中概括关于这四种抗体在NF-kβ报道基因测定法中用于阻断IM-9细胞与CD27和CD70介导的信号传导的IC50。在NF-kβ报道基因测定法中的激动活性显示为在测试的最大抗体浓度下，在不存在CD70刺激的情况下，在CD27信号传导中相对于无关同种型对照抗体(针对大鼠EMP蛋白质的小鼠IgG1)的倍数增加。
关于CD27的亲合力
通过Biacore测量抗体C2177、C2186、C2191和C2192在25℃下对于单体可溶性CD27的KD，并且在表1中报告。测定法在BIACORE3000(BIAcore,Inc.)表面等离振子共振(SPR)仪器上进行。样品在含有0.005％表面活性剂(聚山梨糖醇20)的达尔贝科磷酸盐缓冲盐水pH7.4中进行制备。山羊抗小鼠Fc特异性抗体(Jackson Immunoresearch laboratoriesProd#115-005-071)共价附着至羧甲基右旋糖酐包被的金表面(CM-5芯片，Biacore)。在固定前，芯片用50mM NaOH、100mM HCl和0.1％十二烷基硫酸钠预处理，伴随在预处理之间的去离子水注射。使用关于胺偶联化学的制造商说明书，将抗体用10mM乙酸钠缓冲液pH4.5稀释，并且偶联至芯片的羧甲基化的右旋糖酐表面。表面上的剩余反应基团使用乙醇胺-HCl失活。mAb经由Fc域捕获在传感器表面上。监测以渐增浓度(0.6-150nM，4倍稀释系列)注射的人CD27ECD的结合三分钟，并监测解离十分钟。捕获表面至基线的再生使用100mM磷酸的两次3秒脉冲进行优化。使用Scrubber软件，版本1.1g(BioLogic Software)处理数据。执行数据的双重参考扣除，以校准缓冲液对信号和仪器噪声的贡献。使用Biaevaluation4.0.1软件(GE Healthcare Bio-Sciences,Uppsala,Sweden)进行经处理的数据的动力学分析。结合特征图通过1:1结合模型进行描述，指示CD27的单价结合。
表1.
1关于IM-9细胞与固定的CD27结合的mAb抑制的IC50
2关于报道基因测定法中的mAb抑制的IC50
3作为相对于同种型对照抗体在报道基因信号中的倍数增加测量的，在不存在CD70的情况下，以50ug/ml的mAb的激动剂活性。
细胞增殖的抑制
在具有抗CD3加上抗CD28抗体的培养物中亚最佳活化的T细胞增殖通过在T细胞上表达的CD27的CD70连接得到增强。四种鼠中和抗体就其在CD70的存在下抑制T细胞增殖和在不存在CD70的情况下诱导T细胞增殖的能力进行评价。冷冻的CD4+T细胞购自AllCells,LLC。将细胞解冻并置于含有10％FBS、1％l-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的IMDM培养基内。在细胞铺平板之前，将抗CD3(OKT3)抗体以在PBS中的1ug/mL包被到U形底部板上在4℃下过夜。计数细胞，达到1×106细胞/mL的浓度，并且以1×105细胞/孔铺平板。可溶性抗CD28以每孔1ug/mL作为次级活化信号添加。由人CD70或单独的载体(模拟)转染的被照射的(6000拉德)HEK细胞以2×104细胞/孔(20％)加入适当孔中。将细胞刺激3天，将0.9uCi胸苷[甲基-3H]加入所有样品孔中，并且使细胞温育18-24小时。在刺激第四天时，使用PEFiltermate收获器将细胞收获到滤板上。允许板干燥，并且将30uL MicroScintTM-20加入所有样品孔中。板在PE TopCount NXT上阅读，并且数据作为CPM收集。抗体C2177显示CD70介导的T细胞增殖的剂量依赖性抑制，和在不存在CD70的情况下极弱的固有激动活性(图1)。对于C2186、C2191和C2192抗体观察到类似结果。关于这些抗体的IC50和最大％抑制在表2中报告。抗体无一显示在不存在CD70连接的情况下的一致增殖刺激，指示缺乏固有激动剂活性。
此外，如在CSFE测定法中测量的，C2177、C2186、C2191和C2192抗体显示CD70介导的T细胞增殖的剂量依赖性抑制，而在不存在CD70刺激的情况下对增殖没有作用。冷冻的CD3+T细胞购自AllCells有限责任公司。将细胞解冻并置于含有10％FBS、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的IMDM培养基内。细胞用2.5mM CFSE(Invitrogen)预标记，用FBS猝灭并用T细胞培养基洗涤。CFSE是被动扩散到细胞内并且在与胞内胺结合后变得高度荧光的染料。在细胞分裂后，每个子细胞将含有亲本细胞的一半CFSE标记，因此细胞增殖可通过跟踪具有不同CFSE强度的细胞数目进行监测。使细胞达到1×106细胞/mL的浓度，并且以1×105细胞/孔铺平板。在细胞铺平板之前，将抗CD3(OKT3)抗体在4℃下以在PBS中的0.5ug/mL包被到U形底部板上。可溶性抗CD28以每孔0.1ug/mL作为次级活化信号添加。由人CD70或单独的载体(模拟)转染的被照射的(6000拉德)HEK细胞以2×104细胞/孔(20％)加入适当孔中。将细胞刺激4天，并且通过FACS分析进行分析，以计数含有CFSE标记的不同强度水平的分裂细胞。
成浆细胞分化的抑制
CD27中和杂交瘤mAb也在使用原代人B细胞的成浆细胞分化测定法中进行测试。已从正常供体的外周血中负选择的CD19+人B淋巴细胞(得自AllCells)在1ug/mL抗CD40抗体(克隆MAB89，Abcam)和100ng/mL白细胞介素21(Invitrogen)或1ug/mL可溶性人重组CD40配体和2ug/mL“配体增强子”(两者Alexis Biochemicals)和100ng/ml白细胞介素21的存在下，在96孔板中以每孔105B细胞培养6天。在2×104被照射的(6000拉德)CD70表达HEK293细胞或模拟转染的HEK293细胞的存在或不存在下，加入CD27中和杂交瘤或同种型对照抗体。CD27中和杂交瘤mAb和匹配同种型对照以25、2.5和0.25ug/mL使用。在第6天时，细胞样品通过流式细胞术进行分析，并且成浆细胞馏分鉴定为向前散射/高、IgD负、CD38亮、CD20低的。CD27中和mab的效应计算为针对含有模拟转染细胞的相应B细胞培养物中的成浆细胞频率标准化的，含有CD70表达细胞和杂交瘤mabs的B细胞培养物中的成浆细胞频率。通过以2.5ug/mL的C2177、C2186、C2191或C2192mAb的抑制百分比显示于表2中。对于这些mAb中的任一种，未观察到在不存在CD70刺激的情况下的激动活性。
表2.
实例4：表位作图和分组
为了更仔细地评估初始框并，用一些纯化的中和mAb和CD27中和抗体MAB382(R&DSystems)进行竞争测定法。简言之，将每孔5μl(10μg/mL)CD27-Fc嵌合抗体(R&D Sysytems，目录#382-CD)在MSD HighBind板(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)上在RT下包被2小时。将5％MSD封闭剂A缓冲液(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)加入每个孔并在RT下温育2小时。板用0.1M HEPES缓冲液，pH7.4洗涤三次，随后添加10nM标记的CD27抗体与不同浓度的竞争物抗体(1nM至2uM)的混合物。抗体用MSD Sulfo-TagTMNHS酯进行标记，所述NHS酯是胺反应性N羟基琥珀酰亚胺酯，其与蛋白质的伯胺基团偶联，以形成稳定的酰胺键。在RT下伴随轻在伴随轻轻振荡的2小时温育后，板用0.1M HEPES缓冲液(pH7.4)洗涤3次。使用蒸馏水稀释MSD阅读缓冲液T(4倍)并以150μl/孔的体积分配。使用SECTOR显像仪6000来分析板，所述SECTOR显像仪6000检测通过磺基标签标记的电化学发光，所述磺基标签标记在MSD微板的电极表面上起始的电化学刺激后发光。
竞争研究限定关于在表3中概括的抗体的三个竞争组，证实初始框并测定法。C2179、C2192和MAB382构成一组；C2177、C2182、C2186和C2193为第二组；并且C2191构成分开的组。
表3.
实例5：通过X射线晶体学的表位和配位鉴定
抗体C2177和C2191的详细表位和配位通过其相应Fab与CD27ECD片段(残基1-101)作为三聚复合物的共结晶和通过X射线晶体学的结构测定进行测定。加上His标签的嵌合形式(小鼠可变域，人恒定域)的C2177Fab和C2191Fab在HEK293细胞中进行表达，并且使用亲和色谱法和尺寸排阻色谱法进行纯化。加上His标签的人CD27的ECD片段(残基1-101)通过阴离子交换色谱法进一步纯化。三元复合物CD27:C2177Fab:C2191Fab通过将CD27与过量Fab以1:1.25:1.25的摩尔比混合进行制备。使复合物在4℃下温育2小时，使用尺寸排阻色谱法与未复合的种类分开，并且在20mM Tris pH8.5、250mM NaCl中浓缩至12mg/mL。复合物的结晶通过在坐滴中的蒸汽扩散法在20℃下进行。复合物的晶体得自24％PEG3350、0.2M氯化铵、0.1M Tris缓冲液，pH8.5。对于X射线数据收集，将一个晶体在含有补充有20％甘油的结晶溶液的冷冻保护剂溶液中浸泡数秒，并且在氮流中以100K速冻。衍射数据在配备Saturn944CCD检测器和X流2000低温冷却系统(Rigaku)的Rigaku MicroMaxTM-007HF X射线发生器处经过240°晶体旋转收集，使用每0.25°图像2分钟暴露，并且用程序XDS(KabschW.2010.Acta Crystallogr.D66:125-132)进行处理。晶体属于单斜空间群P21，具有单体晶胞参数：α＝90°，β＝112.2°，γ＝90°。
三元复合物的晶体结构以分辨率进行测定，并且精炼至26％的结晶R因子。C2177和C2191的Fab在空间上不同的非重叠表位处结合CD27(图2)。C2177Fab结合CD27的N末端(远离细胞表面)部分。该表位覆盖并且包括9个残基：K5、S6、P8、H11、W13、G16、K17、H36、R37(图3)。配位定义为与抗原接触(在内)的抗体残基。C2177配位包括5个来自VL的残基(Y31、Y36、Y53、N57、N96)和9个来自VH的残基(S31、W33、Y52、D55、D57、Y101、Y102、D104、Y105)(图3)。所有6个CDR均涉及抗原识别。H36和R37是表位的中央残基。它们针对VL的Y31和VH的Y102叠堆；H36还与VH的D104形成盐桥。
C2191Fab在“侧”表面处结合CD27(图2)，并且覆盖表面的 该表位包括10个残基：F28、D43、P44、I46、P47、G48、V49、H60、S63、H66。C2191配位包括7个来自VL的残基(Y34、F36、Y53、L54、R96、L98、W100)和8个来自VH的残基(S31、Y32、Y50、N57、Y59、R100、G101、N102)(图4)。抗体抗原相互作用受CD27的残基44-49和在VL CDR处的疏水贴片之间的疏水作用控制。
C2177和C2191表位的不同位置提示这些抗体的不同作用机制。C2191可能直接与CD70ECD竞争在CD27的“侧”表面上的重叠表位。相反，C2177抗体不竞争相同表位，而是阻止具有CD27和CD70的细胞的接近。该观察通过下述事实得到支持：C2191阻止可溶性CD70ECD与CD27的结合，而C2177则不是。
实例6：人淋巴细胞应答的抗体调节
开发免疫缺陷的小鼠模型，NOD/SCID-IL2Rγ无效(NSG)小鼠，以研究通过T细胞应答的人免疫系统控制方面(Markus G Manz&James P Di Santo Renaissance for mousemodels of human hematopoiesis and immunobiologyNature Immunology10,1039-1042(2009))。人PBMC过继转移到免疫妥协的(NSG)小鼠内用于评估抗CD27抗体对人细胞移植物移入和/或增殖的作用。该模型允许评估靶向人CD27对抗体产生和T细胞介导的应答的作用。
抗体C2177和C2191在细胞转移时施用，并且随后每周两次，共3周。在第21天时，将细胞处死，并且从血液和脾中纯化细胞，并且随后通过流式细胞术进行表征。包括CTLA4-Ig(Orencia,BMS)作为用于免疫抑制的阳性对照。通过评估在血样和脾样品中的人CD45+细胞的存在，来测量人细胞移植物移入/扩增。
紧密监测小鼠，并且依照动物福利指南基于XGVH症状测定处死时间。用于评估抗CD27处理效应的实验读出包括：体重(每周两次)，可观察的XGVH体征(每周两次)，例如姿势、活动水平、理毛行为、使用1-5评分系统的皮肤病灶(特别是在眼和耳周围)，人细胞亚集的绝对计数和使用下述的流式细胞分析的活化状态：(1)注射的人PBMC、(2)小鼠PB(一次/周)和(3)脾和骨髓；使用ELISA测定血清、脾和BM中的总人Ig、IgM和IgG，并且在处死后，使用组织学或免疫组织化学测定靶器官例如肝、肾、肺和脾中的人浸润水平。
处理组如下：
1.PBMC(20至40百万细胞/小鼠，i.p.)
2.PBMC+CTLA4-Ig(10mg/kg)
3.PBMC+同种型对照抗体，2×/周共3周
4.PBMC+抗CD27抗体，2×/周共3周
当与单独的PMBC或从血样或脾样品中分离的PMBC中的同种型对照相比较时，用10mg/kg抗CD27mAb、C2177和C2191(在人IgG4(ala/ala,ser->pro)支架)上嵌合化的杂交瘤抗体)给药的小鼠具有统计上显著更少的人CD45+细胞。
实例7：C2177和C2191mAb的人框架适应
如Raghunathan G.US20090118127A1,2009中概述的，再分类用于将抗原特异性从抗体C2177和C2191转移到人FR内的抗原结合位点和区域。简言之，抗原结合区已使用多种术语进行定义(在Almagro和Fransson，Front Biosci13:1619-1633,2008中综述)。术语“互补决定区(CDR)”基于序列可变性(Wu和Kabat，J.Exp.Med.132:211-250,1970)。存在六个CDR；三个用于VH(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)和三个用于VL(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。“高变区”、“HVR”或“HVL”指抗体可变域的区域，如由Chothia和Lesk(Chothia和Lesk，Mol.Biol.196:901-917,1987)限定的，所述区域在结构中是可变的。存在六个HVR，三个用于VH(H1、H2和H3)和三个用于VL(L1、L2和L3)。
在HFA方法中，靶向用于将非人抗体的特异性转移到人FR(HFR)内的区域是如由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)限定的CDR，除了在对应于VH的CDR-1的区域中。对于该区域，将CDR和HVL(VH的延长CDR-1)的组合从非人抗体转移到人FR内(如表30、31、34、35中提供的)。此外，生成并测试具有更短的转移的CDR-H2(称为Kabat-7[Raghunathan G.US20090118127A1,2009])的变体。
人FR选择
人FR定义为在V区中不包含在抗原结合位点中的区域，选自功能人种系IGHV、IGKV、IGKJ和IGHJ基因的储库。人种系基因序列的储库通过下述获得：搜索IMGT数据库(Kaas等人，Nucl.Acids.Res.32,D208-D210,2004；Lefranc M.-P等人，Nucl.Acids.Res.，33,D593-D597,2005)并汇集到2007年10月1日时的所有“01”等位基因。由该汇集，从汇集中去除冗余基因(在氨基酸水平下100％相同)和具有未配对的半胱氨酸残基的基因。
人序列针对HFR的初始选择基于人IGHV种系基因与包括FR-1至3以及H-CDR-1和H-CDR-2的小鼠VH区的整个长度的序列相似性。在下一个阶段，所选人序列使用得分进行排序，所述得分考虑到CDR的长度以及小鼠和人序列的CDR之间的序列相似性两者。标准突变矩阵例如BLOSUM62置换矩阵(Henikoff和Henikoff，Proc Natl Acad Sci U S A.89,10915-9,1992)用于小鼠和人序列的CDR的评分比对，并且如果在CDR环中存在插入和/或缺失，则应用大罚分。FR-4基于IGHJ种系基因(Kaas等人，Nucl.Acids.Res.32,D208-D210,2004；Lefranc M.-P等人，Nucl.Acids Res.，33,D593-D597,2005)与小鼠抗体C2177和C2191序列的序列相似性进行选择。类似操作用于选择用于VL的人FR。IGVK种系基因用于选择FR1-3和L-CDR1-3。IGJK种系基因用于选择FR-4。
除序列标准之外，使用来自Accelrys,Inc的程序套件中的Modeler(Sali和Blundell.J.Mol.Biol.234:779,1993)构建用于Fv片段的3D同源性模型。该模型用于HFR变体的分析，包括CDR表征和可发展性倾向(developability liabilities)的评价。关于HFR变体选择的另外考虑是使暴露的甲硫氨酸和色氨酸残基数目降到最低，消除潜在的N糖基化位点并有利于在计算机芯片中具有最高表达谱的人种系(de Wildt,J.Mol.Biol.185:895,1999)。
对于C2177的路径1框架适应和优化，在文库中包括六种VH和四种VL HFR变体。VH和VL HFR变体以组合方式配对，以获得24个HFR变体对加上10个对照配对，所有HFR变体均具有C2177的配对V区加上亲本C2177自身，以获得总共35个组合。类似地，对于C2191，五种VH和四种VL HFR变体以组合方式配对，以获得20个HFR加上9个对照，组合配对的所有HFR V变体与C2191的配对V区加上亲本C2191亲本自身，总共30种变体。使用标准方法重组编码所选可变域的DNA，以装配具有人IgG1和κ恒定区的完整MAb。所得的C2177的参考嵌合抗体，指定为M40，由可变区H7和L18组成。相应的C2191的嵌合抗体，指定为M41，由可变区H10和L20组成。mAb在48孔板中的HEK293E细胞中瞬时表达。来自培养物的上清液流体在转染后96小时测试表达和结合活性。使用Octet技术评估分泌的mAb的表达水平，以测量抗体与蛋白A生物传感器的结合速率。表达水平通过与已知抗体浓度的标准样品比较进行定量。装配以100ug/ml开始，由相同同种型的抗体的1:2系列稀释组成的8点标准曲线。生物传感器在耗尽培养基中水合10分钟，并且标准和未知样品的结合速率测量2分钟。使用5参数加权剂量应答方程和初始斜率结合速率算法分析数据。具有表达>1ug/ml的样品用耗尽培养基稀释至1ug/ml，并且使用单点ELISA进行筛选。对于该ELISA，96孔黑色maxisorp板用在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH9.4中稀释的50uL3ug/ml山羊抗人IgG FC在4C下包被过夜，并且然后用洗涤缓冲液(具有0.05％Tween-20的PBS)洗涤三次，用300μl起始封闭(赛默飞科技公司(Thermo Scientific))溶液封闭1小时，随后如之前洗涤。将样品或标准在耗尽培养基中稀释至100ng/ml，并且将50ul加入测定板在室温下伴随振荡1小时。将板洗涤三次，并且50ul/孔具有His标签的人CD27ECD以在测定缓冲液(具有1％FBS和0.05％Tween-20的PBS)中稀释的60ng/ml加入，并且在室温下温育1小时。洗涤后，加入在测定缓冲液中以1:2000稀释的50ul/孔缀合五his的Qiagen过氧化物酶，并且室温下伴随振荡温育1小时。根据制造商的说明书混合BM ChemiLum底物(BM Chemilum,POD，Roche)，并且在最后一次洗涤后将50ul加入板中。10分钟后，在珀金埃尔默Envision阅读器上阅读板。
筛选C2177组合文库的结果显示所有V区均以不同强度与CD27结合。几种HFR变体给出比亲本C2177更高的结合信号，而其他变体显示与亲本可比较或更低的结合。所有VL均在可检测的水平上结合抗原，并且不影响结合以可接受但低于亲本水平表达的HFR变体。二十四种C2177HFR抗体(VH、VL组合)显示CD27结合和表达>1ug/ml。
筛选C2191组合文库的结果显示除一个VH外的全部均以不同信号与CD27结合。除具有该VH的配对之外，所有VL均显示与CD27的结合。几种HFR变体给出比亲本C2177更高的结合信号，而其他变体显示与亲本可比较或更低的结合。十七种C2191HFR抗体(VH、VL组合)证实CD27结合和表达>1ug/ml。
基于通过ELISA测量的对于CD27的相对结合亲和力，选择十五种C2177和十一种C2191变体用于实验性规模的表达和纯化。实验性规模的表达在CHO-S细胞中以750ml的体积完成。经由蛋白A色谱法纯化收获的上清液，并且针对它们的亲和力和功能活性评价经纯化的蛋白。
HFR C2177人MAb变体的亲和力通过表面等离振子共振(SPR)使用ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统(BioRad)进行测量。对于每种变体测量CD27结合速率和解离速率。使用用于胺偶联化学的制造商说明书，通过使山羊抗人IgG(Fc)抗体与GLC芯片(BioRad)的表面共价偶联来制备生物传感器表面。将大约5,000RU(应答单位)抗体固定。动力学实验在25℃下在运行缓冲液(PBS、0.01％P20、0.01％BSA)中执行。在运行缓冲液中制备从300nM开始的1:3系列稀释的人CD27ECD。在传感器芯片的每个通道上捕获约350RUmAb。将同种型匹配的抗体对照固定在通道6中，并且用作参考表面。mAb的捕获随后为以30uL/分钟的三分钟抗原注射(结合相)，随后为10分钟的缓冲液流动(解离相)。通过注射以100uL/分钟的0.85％磷酸再生芯片表面。数据在仪器软件上进行处理。通过从分析物注射的扣除参考的曲线中扣除通过缓冲液注射生成的曲线，来执行数据的双重参考扣除。使用具有整体拟合的1:1兰米尔结合模型执行数据的动力学分析。关于每种mAb的结果以Ka(结合速率)、Kd(离开速率)、KD(平衡解离常数)和活性百分比的形式报告。C2177HFR变体的亲和力类似于亲本M40mAb，显示对于所有变体在KD中小于三倍的变化。类似地，HFR C2191人mAb变体的亲和力显示与亲本M41mAb小于两倍的差异。
HFR变体的生物活性通过其在萤光素酶报道分子测定法中抑制CD70介导的NFkB诱导进行测量。HEK细胞用NFkB诱导型萤光素酶表达载体pGL4-32-NFkB-Luc2(Promega)和CD27表达质粒或空载体进行转染，并且在Freestyle表达培养基(Gibco,#12338)中温育过夜。第二天将细胞以40uL和50,000细胞/孔在96孔板中铺平板。随后，使用1:3的系列稀释，以30ug/ml最终孔内浓度开始，将40uL抗体或对照加入细胞中，并且温育1至2小时。在该温育过程中，制备CD70游离细胞用于刺激。简言之，使用标准细胞培养技术使贴壁细胞重悬浮，并且与以25ug/mL的丝裂霉素C一起温育1小时，以停止细胞扩增。在温育后，在培养基中洗涤CD70+细胞，稀释并以10,000细胞/孔加入40uL。使板温育过夜。第二天，根据制造商的说明书制备Steady Glo试剂(Promega)，并且加入120uL/孔。使板在室温下在振荡的同时温育20分钟。在珀金埃尔默Envision阅读器上测量发光。C2177HFR变体的IC50类似于彼此和M40亲本MAb，范围为0.11nM至0.21nM。C2191HFRIC变体的50也类似于彼此和M41亲本，从0.13nM到1.39nM不等。
亲和力、生物活性和生物物理特性的考虑导致选择由可变区H28(SEQ ID NO:111)和L35(SEQ ID NO:82)组成的C2177变体M69以及由可变区H31(SEQ ID NO:131)和L42(SEQID NO:140)组成的C2191变体M91，用于亲和力成熟。表4中显示了关于M40亲本及其M69HFR变体以及M41亲本及其M91变体的KD、纯化得率、细胞上清液与CD27ECD的结合(“ELISA”)和CD27介导的NFκβ应答被CD70的抑制(IC50)。
表4.
实例8：C2177HFRMAB M69的优化
M69对人CD27ECD具有约1nM的亲和力，并且含有与C2177和HFA亲本CD27M40相同的CDR。M69的优化涉及多重文库，以增加亲和力，并去除在过程中引入或鉴定的PTM位点。
如实例9中所述，用于HFR和C2177优化的平行噬菌体展示文库方法鉴定在CDR-H2的第52a位处的脯氨酸中的多样性。该位置在文库设计中不是随机化的。C2177和C2191Fab与CD27(实例5)的共同结构指示P52a不直接涉及抗原结合。然而，在该位置处的突变可改变CDR-H2环构象，并且通过周围残基D27允许与CD27的更优化相互作用。因此，使用NNK诱变设计文库，以使P52a及其邻近残基Y52、G53和D54随机多样性(文库C27H28L2)。另外在路径2优化中，在CDR-L1中的Y32至F突变显示改善的结合。因此，设计在Y32中具有随机多样性连同在残基Y30a、D30d、A50中的多样性的第二文库，所述残基Y30a、D30d、A50位于与Y32相同的结构平面中(文库C27L35L2)。
另外，使用多样性有限的文库评估完整的CDR-H3和CDR-L1环。表5和6显示了这些文库的设计。
表5.关于CDR-H3的多样性有限的亲和力成熟设计(C27H28L3)
VH亲本氨基酸和位置 多样性
Ser95 A,S
Asp96 A,D
Tyr97 A,D,S,Y
Tyr98 A,D,S,Y
Gly99 A,G
Asp100 A,D
Tyr100a A,D,S,Y
Gly100b A,G
Phe100c A,F,S,V
Ala101 A,G
Tyr102 A,D,S,Y
表6.关于CDR-L1的多样性有限的亲和力成熟设计(C27L35L3)
VH亲本氨基酸和位置 多样性
Lys24 A,K,E,T
Ala25 A,G
Ser26 A,S
Gln27 A,Q,E,P
Ser28 A,S
Val29 A,V
Asp30 A,D
Tyr30a A,D,S
Ala30b A,G
Gly30c A,G
Asp30d A,D
Ser31 A,S
Tyr32 A,D,S
Met33 A,M,T,V
Asn34 A,N,D,T
如WO2009/085462，Shi等人，J Mol Biol397:385-396(2010)和Tornetta等人，JImmunol Methods360:39-46(2010)中所述，伴随对限制性酶位点的微小修饰，在pIX噬菌体Fab展示系统中构建Fab文库。根据本领域已知的淘选方案，例如WO2009/085462和Shi等人，J Mol Biol397:385-396(2010)中所述，这些文库针对生物素酰化的CD27-ECD进行淘选，旨在通过选择更慢的离开速率或更快的结合速率来增加亲和力。噬菌体通过辅助噬菌体感染产生。通过添加珠形成珠/抗原/噬菌体复合物来回收结合子。在最终洗涤后，通过感染指数生长的TG-1大肠杆菌细胞拯救噬菌体。再次产生噬菌体并经受另外轮的淘选。
对于后续筛选，由噬菌体淘选循环的甘油原液制备DNA，并且通过NheI/SpeI消化切除pIX基因。在连接后，将所述DNA转化到TG-1细胞内，并且在LB/琼脂平板上生长过夜。第二天，挑取菌落，使其生长过夜，并且所述培养物用于(i)菌落PCR和V区测序；以及(ii)诱导Fab产生。对于Fab产生，将过夜培养物在新培养基中稀释10-100倍并使其在37摄氏度下生长5-6小时，由包含IPTG的新鲜培养基添加诱导Fab产生，并且使培养物在30摄氏度下生长过夜。次日，停止旋转培养物，并且上清液(包含可溶性Fab蛋白)用于Fab ELISA。对于ELISA，通过多克隆抗Fd(CH1)抗体，将所述可溶性Fab蛋白捕获到板上。在洗涤和封闭后，将生物素酰化的人CD27ECD以0.2nM浓度加入。这个浓度能分级Fab变体，其定义为亲本的百分比结合，其中以所有平板中对照存在的亲本Fab被定义为100％结合。通过HRP缀合的链霉抗生物素蛋白和在读板机中的化学发光读数来检测生物素酰化的CD27ECD。在该CD27浓度下，针对亲本Fab的Fab变体排序是可能的。通过该标准，选择相对于M69Fab以100％或更高结合人CD27的10条重链和6条轻链。
从CDR-H2文库(C27H28L2)中，在第52位处占优势地选择亲本Y，指示对于该残基的优先。在第52a位处，P替换为在Fab中具有最佳结合活性的A、S、V和G残基。在第53位处，选择亲本G连同R和N。在第54位处，仅回收亲本D。将来自该文库的九个克隆(表7)亚克隆到IgG载体内用于作为mAb表达和表征。
表7.选自完全多样性文库C27H28L2的九个VH克隆
肽ID Y52 P52a G53 D54
H237 F V R D
H238 Y V G D
H239 Y A G D
H240 Y A R D
H241 Y G R D
H242 Y A N D
H243 Y G G D
H244 Y S G D
H245 Y S R D
对于CDR-H3文库(C27H28L3)，回收的唯一多样性是S95A和A101G。将来自该文库的含有两种突变的一个克隆(表8)亚克隆到IgG载体内用于作为mAb表达和表征。
表8.选自C27H28L3的单个VH克隆
肽ID S95 D96 Y97 Y98 G99 D100 Y100a G100b F100c A101 Y102
H236 A D Y Y G D Y G F G Y
对于四位置L-CDR1文库(C27L35L2)，位置30a显示亲本Y和W的富集。在第30d位处，残基S、H和E连同亲本D一起富集。在第32位处，将亲本Y替换为F和W。在第50位处，T优选超过亲本A。一般而言，与亲本相比较，最佳克隆具有更疏水的侧链。将来自该文库的五个克隆(表9)亚克隆到IgG载体内用于作为mAb表达和表征。
对于多样性有限的完整CDR-L1文库(C27L35L3)，仅回收一个序列，与亲本的唯一差异是Y32变成F，类似于上文四位置VL文库。该完整CDR-L1文库不包括在第32位中的F，并且因此回收的克隆可能是来自四位置VL文库的污染。将该克隆(L255)亚克隆到IgG载体内用于作为mAb表达和表征(表9)。
表9.选自C27L35L1和C27L35L2的六个VL克隆
肽ID Y30a D30d Y32 A50
L255 Y D F A
L256 Y D W V
L257 Y D W T
L258 Y S F T
L260 W H W T
L261 Y S F E
6条变体轻链与10条变体重链配对，以获得在HEK293E细胞中表达的60个组合。就表达水平，如通过ELISA测量的与人CD27ECD的结合和如在ProteOn仪器上测量的亲和力筛选上清液。所有变体的表达水平对于筛选目的均是足够的。亲和力对于一些变体增加高达40倍。选择两种mAbM596和M600用于进一步诱变，以去除翻译后修饰的潜在位点。关于这些mAb的VH和VL链组合在表10中给出。抗体仅相差在其轻链中的两个残基。
表10.所选C2177亲和力成熟先导物的重链和轻链配对
M596在三个位置处不同于亲本分子M69：在CDR-H2中的P52aA、在CDR-L1中的Y32W和在CDR-L2中的A50T。M600在两个位置处不同于M69：在CDR-H2中的P52aA突变和在CDR-L1中的Y32F。
在M596和M600中鉴定了三个共享的潜在翻译后修饰位点。存在在CDR-H2中的第N58位处的潜在N联糖基化位点，并且在CDR-H2和CDR-L1中的两个潜在异构化位点分别由“DG”和“DS”编码。另外，M596含有在CDR-L1中的非种系色氨酸残基，其可能对氧化是敏感的。
为了去除糖基化危险，在N58位制备三个个别单一置换和在S60处的一个单一置换(表11)。构建体在HEK293E细胞中表达，并且使用ProteOn仪器评估上清液与CD27的亲和力。所有变体均具有接近于亲本的亲和力，所述亲和力对于M596和M600分别为25pM和49pM。选择均衍生自M600的M680和M678用于评估消除异构化位点的进一步置换。变体M680和M678分别具有在第60和58位处的A，并且具有缺乏在CDR-L1中的色氨酸的另外优点，所述色氨酸存在于M596亲本中。
表11.
VH亲本氨基酸和位置 多样性
Asn58 N、A、R、T
Ser60 S、A
为了评估使M678和M680中的潜在异构体位点突变的影响，设计小文库以平行去除两个位点。每个突变个别置换到重链的CDR-H2或共同轻链的CDR-L1内，并且随后在组合文库中配对。该文库的多样性显示于表12中。
表12.
VH亲本氨基酸和位置 多样性
Asp54 D、E
Gly55 G、A
VL亲本氨基酸和位置 多样性
Asp34 D、E
表达这些mAb并且关于糖基化位点变体评估亲和力。CDR-L1潜在异构化位点中的D34E突变导致亲和力中的一致两倍增加并且因此该位点被成功去除。CDR-H2潜在异构化位点中的D54E突变使亲和力降低超过十倍。然而，G55A突变不显著影响亲和力。变体M703和M706保留M600亲本的亲和力，并且具有减少的对来自PTM的功能影响的危险。表13显示了来自PTM危险评价的每个阶段的所选变体、它们的重链和轻链配对、亲和力和在CDR中的序列修饰。选择用于去除潜在糖基化位点的突变是有下划线的。去除两个潜在异构体位点的突变是粗体和加双重下划线的。
表13.
实例9：组合的HFR和C2177MAb优化
在该方法中，有限组的HFR变体以Fab形式评估表达、pIX展示和结合，并且最佳候选物随后进展至优化。来自C2177的CDR是适应到两条重链VH5-51(SEQ ID NO:102H24)和VH1-46(SEQ ID NO:106H25)以及两条轻链Vk4-1和Vk012(SEQ ID NO:90L36)内的人框架。这些HFA可变域在2×2矩阵中作为Fab与人CH1和Ck恒定区一起在Fab pIX噬菌体展示载体中配对。VH1-46/Vk012变体(M55,H25/L36)显示了与CD27的结合和良好的展示特征，并且选择用于构建亲和力成熟文库。
用于pIX噬菌体展示的Fab文库如上文对于实例8所述进行构建。基于CD27与C2191和C2177的实验共同结构(实例5)，在抗体配位中和周围的CDR残基中设计多样性文库。关于变化的重点在于CDR L1、L3和H2中。在个别CDR内的总共4-6个残基由编码所有20种氨基酸的NNK密码子多样化。每个文库的大小估计为≤6×107个变体，其可使用标准文库限制性核酸内切酶克隆技术覆盖。表14显示了在不同CDR文库中实施完全多样化的残基。
表14：关于C2177的亲和力成熟文库设计
在噬菌体外壳蛋白质IX上展示的Fab文库针对生物素酰化的hCD27ECD/Fc进行淘选。通过变体的质粒文库的辅助噬菌体感染产生噬菌体。通过添加链霉抗生物素蛋白包被的磁珠形成珠/抗原/噬菌体复合物来回收结合子。在最终洗涤后，通过感染指数生长的MC1061F大肠杆菌细胞拯救噬菌体。再次产生噬菌体并经受另外轮的淘选。如大约对于路径1所述的，由所选克隆产生可溶性Fab并评估结合活性。命中仅得自CDR-L1和CDR-L2文库。来自这两个文库的二十一个克隆证实比亲本HFR Fab更大的结合。弃去在多样化序列中含有C或M的克隆。将十个Fab转换用于在IgG4SPAAa/κ背景中表达用于进一步表征。IgG4PAA重链是含有铰链区中的丝氨酸至脯氨酸置换的人IgG4(Angal等人，Mol Immunol30:105(1993))和在CH2中的两个位置处的丙氨酸置换(ML Alegre等人，Transplantation；57:1537-43(1994))。在HEK293E细胞中产生mAb作为Fab的复制以及重链和轻链组合的矩阵。使用培养上清液在ProteOn仪器上测量亲和力(表15)。与亲本mAb(M159)相比较，在CDR-H2中的P52a至Q(M158)或S(M157)的突变使KD降低6倍。CDR-L1(M149)中的Y36F突变使KD降低4倍，并且G33H和D34E突变(M155)的添加导致KD中的6倍降低。P52S突变与Y36F(M160)或Y36F加上G33H和D34E的组合使KD降低20倍至100pM。选择M158、M160和M166中的置换的组合用于进一步表征。
表15：衍生自Fab突变文库的mAb的初始实验对象组
M158、M160和M166蛋白质在HEK293细胞的750mL培养物中产生，纯化并在Biacore上分析与CD27-His的结合动力学。KD值比使用粗制上清液通过ProteOn测量的高约1对数，但显示相对于彼此相同的值(表16)。
表16
mAb ID kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(pM)
M158 (1.5±0.03)E+06 (6.6±1.7)E-04 439±114
M160 (1.6±0.15)E+06 (1.8±0.01)E-04 117±11
M166 (1.62±0.04)E+06 (2.03±0.16)E-04 126±11
当再评估原始HFA组合时，VH5-51适应的VH显示比VH1-46支架低2倍的KD。将H-CDR2中的P52aS突变引入VH5-51VH内，产生H221。H221分别与来自HFA亲本mAb(M159)以及亲和力改善的变体M160和M166的L220、L219和L217轻链一起表达，以生成mAb M171、M169和M170。对纯化的mAb的BIAcore动力学测量显示与相应的VH1-46变体相比较在KD中的两倍改善(比较表16和17)。
表17
M160、M169和M170的序列分析鉴定在在H196和H221的CDR-H2中的D54-G55处的潜在异构化位点以及在N61-G62处的潜在脱酰胺位点。另外，在L219的CDR-L1内的D34处鉴定潜在异构体位点。引入突变以去除这些位点并评估其对活性的影响(表18)。纯化的mAb在ProteOn上就对CD27-His的亲和力进行分析。突变对KD没有作用或具有正面作用。例如，M668和M671两者均具有比其分别的亲本mAb，M160和CM169几乎低2倍的KD。
表18：具有PTM序列突变的mAb变体
实例10：C2191HFRMAb M91的优化
对于M91(H31/L42)优化应用的方法如实例8中所述，除注明的之外。C2191CDR的丙氨酸/种系扫描以Fab形式进行，以评估对于与CD27相互作用重要的位置，使用以Fab形式的具有人Ch1和Ck恒定区的C2191亲本VH和VL区。文库用丙氨酸或相应的种系序列中存在的残基替换CDR中的残基。排除CDR中的一些位置，因为基于建模和后续测定的结构(实例5)，它们具有低溶剂暴露或无溶剂暴露。使推定的体细胞突变回复突变为小鼠种系氨基酸，以评价其对抗体亲和力的贡献。简言之，将小鼠V区克隆到Fab pIX展示载体内，并且通过ELISA验证亲本与生物素酰化的人CD27-ECD蛋白质的结合。单一突变(根据文库设计)通过定点诱变引入，基本上如由Stratagene(La Jolla,CA,USA)所述执行。将序列证实的突变体最佳挑选到新板内，并且与亲本和阴性对照Fab一起生长。最终单一氨基酸置换变体在大肠杆菌中生成，并且随后通过ELISA筛选表达和CD27结合。将关于亲本克隆的表达和结合信号求平均值并设为1.0，并且突变体的信号相对于亲本标准化。在ELISA中使用两种形式的抗原：CD27ECD(1-173个残基)和CD27ECD-Fc嵌合体(R&D Systems)。
与共同晶体结构偶联的该扫描结果提供了用于设计亲和力成熟文库的基础。对于重链；选择用于变异的位置是H-CDR1中的T33以及CDR-H2中的Y50、S52、S52a、N56和Y58(表23)。T33不是接触残基，但T33A突变改善结合。第S52和S52a位不是接触残基，但扫描中的置换显示少许增加的结合。在第50和58位处的酪氨酸均为接触位点，并且在这些位点处的置换在实例11中所述的平行优化路径中选择。第N56位在丙氨酸/种系扫描中不评估，但它是接触位点，并且在晶体结构中与T33、S52和S52a邻近。对于轻链，选择用于变异的位置是CDR-L1中的T30a、S30b、G30c和Y30d以及CDR-L2中的L50和N53(表23)。这些残基无一直接接触抗原，但邻近接触扫描显示对结合具有基本上负面影响的残基。L50A突变对结合具有中等作用，并且在晶体结构中，是CDR-L2中可能与抗原接触的唯一残基。另外，选择N53用于有限多样化。构建两个平行文库，一个具有突变为W的Y30d，并且另一个具有作为Y保持的Y30d，因为W可使得配位更疏水性并且因此更无法发展。下表19和20显示了关于M91的VH和VL亲和力成熟文库设计。
表19.
表20.
*产生在该位置处含有Y或W的两个分开文库
在噬菌体外壳蛋白质IX上展示的Fab文库针对生物素酰化的CD27-ECD进行淘选。选择与CD27的结合等于或优于C2191的亲本嵌合Fab的总共12种重链和12种轻链变体。将变体转换成IgG1/κ抗体，作为144个组合在HEK293E细胞中产生，并且培养上清液通过ProteOn评估结合。对于一些变体观察到亲和力中的显著增加(>100倍)。在144个VH和VL配对中，选择8个进行进一步表征(表21)。将这些mAb分类成三个亚组：组1变体具有与四条不同轻链配对的相同重链(H227,SEQ ID NO:133)，而组2和组3各自具有与两条不同重链配对的一条轻链。四条选择的轻链在CDR-L1中多样化的所有四个位置处改变(RASKSVSX1X2X3X4SFMH)(SEQID NO:158)；其中X1是A、E、H或L；X2是D、G、V或W；X3是G或R；并且X4是W或Y)。它们还在CDR-L2中多样化的两个位置中改变(X1ASX2LES)(SEQ ID NO:171)；其中X1是L或V；并且其中X2是K、N或R)。CDR-L3与L42序列(SEQ ID NO:140)并无改变，并且是QHSRELPWT。
表21.所选2191亲和力成熟先导物的重链和轻链序列的配对
这八种变体通过在体积为750ml的HEK293E细胞中的瞬时表达产生。收获的上清液经由蛋白A色谱法进行纯化，并且通过SDS-PAGE和SE-HPLC进行分析，以测定样品的纯度和纯化样品中的单体百分比。所有变体均为大于90％纯的和大于90％单体的。为了评估抗体的结合特性，保留因子(k’)通过对于每种纯化的变体执行交叉相互作用色谱法进行测定(Jacobs SA,Wu SJ,Feng Y,Bethea D&O'Neil KT(2010)Cross-interactionchromatography:a rapid method to identify highly soluble monoclonal antibodycandidates.Pharm Res27,65-71)。在该方法中，使样品抗体经过与人IgG偶联的柱，并且相对于对照抗体评估保留。简言之，遵循制造商的说明书，使50mg人IgG(Sigma Aldrich)偶联至1mL NHS琼脂糖柱(GE Healthcare)。通过用0.1M Tris pH8、0.5M NaCl洗涤去除未偶联的IgG，并且用相同缓冲液封闭未反应的NHS基团。通过测量未反应偶联缓冲液中剩余的蛋白浓度并使用Pierce’s Coomassie Plus Assay Kit(Thermo Pierce)洗涤且从之前固定的蛋白的量中减去来确定偶联效率。还使用相同方案制备对照柱，但没有IgG与树脂的缀合。在用PBS pH7，以0.1ml/分钟的流速平衡后，对照柱首先在Dionex UltiMate3000HPLC上运行。首先注入20μL蛋白质原液以确保封闭非特异性结合位点，随后注入20μL10％丙酮以检查柱的完整性。将待分析的样品在PBS pH7中稀释至0.1mg/mL。将20μL每个样品注入到每个柱上并且允许以0.1mL/分钟运行30分钟。记录保留时间并且计算每个变体的保留因子(k’)。k’值计算为在IgG和空白对照柱上的保留时间中的差异。所有变体基于SDS-PAGE和SE-HPLC均纯化至大于90％纯度。所有k’值均计算为小于0.3，指示良好溶解特性(表22)。
表22.纯化的亲和力成熟变体的分批分析
八种变体mAb和HFR亲本通过BIAcore评估其对CD27ECD的亲和力，并且在κβ-报道分子测定法中评估其IC50。动力学常数和亲和力通过BIAcore进行测量。表23概括了对这些变体收集的数据。如由初始小型培养上清液测量的表达和与CD27结合的ELISA信号也包括在该表中。
表23：C2191AM文库子集数据概括
实例11：组合的HFR和C2191MAb优化
在该方法中，有限组的HFR变体以Fab形式评估表达、pIX展示和结合，并且最佳候选物随后进展至优化。来自C2191的CDR是适应到两条重链(VH3-23和VH3-11)和两条轻链(Vk4-1和Vk012)内的人框架。这些HFA可变域在2×2矩阵中作为Fab与人CH1和Ck恒定区一起在Fab pIX噬菌体展示载体中配对。VH3-23/Vk012变体(H39(SEQ ID NO:145))和L40(SEQID NO:137)显示了与CD27的结合和良好的展示特征，并且选择用于构建亲和力成熟文库。该Fab被称为“亲本”。
对于具有改善亲和力的抗体的选择，所有CDR中除H39的CDR-H3外的多重残基使用NNK简并密码子完全多样化(表24)。每个CDR文库分开构建，并且实施噬菌体淘选用于选择亲和力成熟的变体。
表24：关于C2191变体的亲和力成熟文库设计
在CDR-H2、CDR-L1或CDR-L2中具有多样性的C2191文库获得50种独特的Fab，如在单点ELISA中测量的，所述Fab相对于亲本HFR Fab对人CD27具有改善的结合。这些克隆还在多点ELISA中排序，并且选择十七个克隆用于转换成人IgG4alaala/κ用于进一步表征(表25)。
表25：选择用于转换成IgG的亲和力成熟的Fab
IgG1/k mAb构建为Fab的复制以及重链和轻链可变区的矩阵(表26)，并且测试亲和力和溶液特性。亲本Fab的mAb形式指定M131。选择M141和M408用于进一步表征。
表26：衍生自Fab亲和力成熟的mAb
实例12：亲和力成熟的mAb的表征
将衍生自亲本C2177和C2191杂交瘤抗体的所选亲和力成熟的mAb密码子优化，引入不同载体内用于重链和轻链的双重表达，在CHO-GS细胞培养中表达，并且纯化用于进一步表征。与上文实例中所述的成熟变体有关的这些抗体的ID显示于表27中。
表27.
关于这些mAb的概括数据在下文显示了关于通过Biacore的KD分析和在NF-κβ报道基因测定法中测量的IC50(表28和29)。对于该NF-κβ报道分子测定法，在NF-κβ启动子的控制下，用含有人CD27和萤光素酶构建体两者的总共36ng DNA转染HEK-293F细胞。将HEK-293F转染子以5×104细胞/孔铺平板在96孔板中的40μL Freestyle培养基(Gibco)中。以1:3稀释度将抗CD27杂交瘤mAb的稀释物加入测定板中的Freestyle培养基中，共50μg/mL的最终浓度，并且使板在37℃(5％CO2)下温育一小时。为了测试mAb中和CD70:CD27信号传导的能力，将终末照射的(4000拉德)HEK-293E CD70游离细胞以20％的CD27转染子细胞数目加入测定板中。为了测试杂交瘤mAb的激动剂活性，省略CD70游离细胞的添加。测定板在37℃(5％CO2)下温育过夜，并且根据制造商的说明书，使用萤光素酶测定系统(Promega)显色。
表28.衍生自C2191的成熟变体的表征
表29.衍生自C2177的成熟变体的表征
CDR和V区序列
表30.2177路径1
对于SEQ ID NO:151，X1是F或Y；X2是A、G、S或V；X3是G、N或R；X4是A或G；X5是A或N；并且X6是A或S
表31.2177路径2
对于SEQ ID NO:152，X1是P、Q或S；X2是A或G；X3是A或N；X4是G或Q。
表32.2177路径1
对于SEQ ID NO:153，X1是W或Y；X2是D、E、S或H；X3是F、W或Y。
对于SEQ ID NO:154，X1是A、E、T或V；
表33.2177路径2
对于SEQ ID NO:155，X1是A、F、V、W或Y；X2是G、H、N、R或S；X3是D、E、S或T；X4是F、L或Y。
表34.2191路径1
对于SEQ ID NO:156，X1是H或Y；X2是D或S；X3是A、E、R或S；并且X4是I、W或Y。
表35.2191路径2
对于SEQ ID NO:157，X1是A、T、V或Y；X2是D或S；X3是G、H、R或S；X4是A、N、Q、R或S；并且X5是H、L、W或Y。
表36.2191路径1
对于SEQ ID NO:158，X1是A、E、H、L、T或Y；X2是D、G、I、S、V或W；X3是G或R；并且X4是W或Y。
表37.2191路径2
蛋白质和抗体可变区序列
表38.
表39.
表40.CD27和CD70蛋白质
表41.抗体恒定区序列
表42.抗体核苷酸序列

Claims (18)

1.一种分离的人CD27抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含：
SEQ ID NO:62的CDRL1氨基酸序列；
SEQ ID NO:68的CDRL2氨基酸序列；和
SEQ ID NO:75的CDRL3氨基酸序列，并且所述重链可变区包含：
选自SEQ ID NO:44和161的CDRH1氨基酸序列；
SEQ ID NO:47的CDRH2氨基酸序列；和
SEQ ID NO:58的CDRH3氨基酸序列。
2.一种分离的人CD27抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变氨基酸序列和重链可变氨基酸序列，其中所述轻链可变氨基酸序列是SEQ ID NO:143，并且所述重链可变氨基酸序列是SEQ ID NO:133。
3.根据权利要求1或2所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段，还包含IgG4重链恒定区和IgG4轻链恒定区。
4.根据权利要求3所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区是SEQ ID NO:159的氨基酸序列，并且所述轻链恒定区是SEQ ID NO:160的氨基酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段，其中如通过表面等离振子共振测定的，所述抗体或其抗原结合片段以1×10-7M或更小的KD与人CD27结合。
6.一种包含药学上可接受的制剂的制造制品，所述药学上可接受的制剂包含权利要求1-4中任一项所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段。
7.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段。
8.一种或多种用于表达权利要求1-4中任一项所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段的分离的载体，包含权利要求7所述的分离的核酸分子。
9.一种用于产生权利要求1-4中任一项所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段的原核或真核宿主细胞，包含权利要求8所述的一种或多种分离的核酸载体。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下列的至少一种：COS-1、COS-7、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、293、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞，或它们的任何衍生物、永生化细胞或转化细胞。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下列的至少一种：HEK293或SP2/0。
12.一种用于产生权利要求1-4中任一项所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段的非治疗性方法，包括将权利要求7所述的分离的核酸分子掺入载体内，转化宿主细胞、转基因动物或转基因植物以表达抗体或其抗原结合片段，以及回收所表达的抗体或其抗原结合片段。
13.权利要求1-4中任一项所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制T细胞介导的B细胞抗体产生的方法的药物中的用途，所述方法包括：使受试者的T细胞的一部分与有效量的权利要求1-4中任一项所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段接触；以及在人CD70蛋白质或人CD70蛋白质的一部分的存在下，所述分离的人CD27抗体或其抗原结合片段抑制所述T细胞上的CD27活化。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述受试者患有炎性病症。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述炎性病症是系统性红斑狼疮。
16.根据权利要求13所述的用途，其中所述受试者表现出与选自下列的病症相关的抗原特异性体液免疫应答：肺或胸膜系统的疾病、中枢或外周神经系统的疾病、眼或视觉系统的疾病、胃肠道和消化系统的疾病、心血管系统的疾病、传染性疾病和寄生虫感染。
17.根据权利要求13所述的用途，其中将所述分离的人CD27抗体或其抗原结合片段全身性地施用于所述受试者。
18.权利要求1-4中任一项所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制幼稚T细胞增殖的方法的药物中的用途，所述方法包括：使组织与有效量的权利要求1-4中任一项所述的分离的人CD27抗体或其抗原结合片段接触；以及在人CD70蛋白质或人CD70蛋白质的一部分的存在下，所述分离的人CD27抗体或其抗原结合片段抑制所述T细胞上的CD27活化。
CN201380025446.3A 2012-03-15 2013-03-14 人抗cd27抗体、方法和用途 Active CN104284678B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261611332P 2012-03-15 2012-03-15
US61/611332 2012-03-15
PCT/US2013/031314 WO2013138586A1 (en) 2012-03-15 2013-03-14 Human anti-cd27 antibodies, methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104284678A CN104284678A (zh) 2015-01-14
CN104284678B true CN104284678B (zh) 2018-04-24

Family

ID=49157853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380025446.3A Active CN104284678B (zh) 2012-03-15 2013-03-14 人抗cd27抗体、方法和用途

Country Status (28)

Country Link
US (6) US9102737B2 (zh)
EP (1) EP2825200A4 (zh)
JP (1) JP6487839B2 (zh)
KR (1) KR102153374B1 (zh)
CN (1) CN104284678B (zh)
AR (1) AR090356A1 (zh)
AU (1) AU2013232087B2 (zh)
BR (2) BR122020002414B1 (zh)
CA (1) CA2867299C (zh)
CL (1) CL2014002416A1 (zh)
CO (1) CO7071095A2 (zh)
CR (1) CR20140415A (zh)
EA (1) EA030828B1 (zh)
EC (1) ECSP14018641A (zh)
GT (1) GT201400193A (zh)
HK (1) HK1206251A1 (zh)
JO (1) JO3787B1 (zh)
MX (1) MX363946B (zh)
MY (1) MY175224A (zh)
NZ (1) NZ629697A (zh)
PE (1) PE20142242A1 (zh)
PH (2) PH12014502011A1 (zh)
SG (2) SG11201405437QA (zh)
TW (2) TW201730214A (zh)
UA (1) UA121844C2 (zh)
UY (1) UY34680A (zh)
WO (1) WO2013138586A1 (zh)
ZA (2) ZA201407440B (zh)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201690310A1 (ru) 2010-04-13 2016-12-30 Селлдекс Терапьютикс Инк. Антитела, связывающие cd27 человека, и их применение
PT2686347T (pt) 2011-03-16 2018-07-05 Argenx Bvba Anticorpos dirigidos contra cd70
WO2014140374A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Novo Nordisk A/S Monovalent cd27 antibodies
TWI713453B (zh) 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
FR3025517B1 (fr) * 2014-09-10 2016-12-23 Repropharm Ligands potentialisants de la bioactivite des gonadotrophines
WO2017044752A1 (en) * 2015-09-10 2017-03-16 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Anti-fibrotic effect of cd70
MA43055A (fr) * 2015-09-30 2018-08-08 Janssen Biotech Inc Anticorps agonistes se liant de manière spécifique au cd40 humain et procédés d'utilisation
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
JP6917368B2 (ja) * 2015-10-23 2021-08-11 アポジェニックス アーゲー 一本鎖ｃｄ２７受容体アゴニストタンパク質
WO2017117384A1 (en) 2015-12-31 2017-07-06 Development Center For Biotechnology Anti-vegfr antibody and uses thereof
EA201892362A1 (ru) 2016-04-18 2019-04-30 Селлдекс Терапьютикс, Инк. Агонистические антитела, которые связываются с cd40 человека, и варианты их применения
CN116903741A (zh) 2016-06-20 2023-10-20 科马布有限公司 特异性结合于pd-l1的抗体或其抗原结合片段及其用途
JOP20190055A1 (ar) * 2016-09-26 2019-03-24 Merck Sharp & Dohme أجسام مضادة ضد cd27
TW201813979A (zh) * 2016-09-29 2018-04-16 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 抗ｃｄ２７抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
US11242402B2 (en) 2016-12-23 2022-02-08 Macrogenics, Inc. ADAM9-binding molecules, and methods of use thereof
US11622977B2 (en) 2017-05-12 2023-04-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
JP2020525470A (ja) * 2017-07-03 2020-08-27 ディヴェロップメント センター フォー バイオテクノロジー 抗ｖｅｇｆｒ抗体及びその使用
WO2019037131A1 (zh) * 2017-08-25 2019-02-28 深圳市博奥康生物科技有限公司 一种cd27真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
WO2019156223A1 (ja) * 2018-02-09 2019-08-15 国立大学法人大阪大学 チクングニアウイルスに対する抗体またはその抗原結合断片、およびその用途
JP2021519088A (ja) * 2018-03-28 2021-08-10 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 抗ｃｄ２７抗体、その抗原結合フラグメント及びその医学的使用
CN112292399A (zh) * 2018-04-04 2021-01-29 百时美施贵宝公司 抗cd27抗体及其用途
WO2019196117A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Anti-cd27 antibodies and use thereof
CN112292185A (zh) 2018-04-17 2021-01-29 塞德斯医疗公司 抗cd27和抗pd-l1抗体及双特异性构建体
MX2020012028A (es) 2018-05-11 2021-03-29 Crispr Therapeutics Ag Metodos y composiciones para tratar el cancer.
CA3103629A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
GB201811410D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd OX40 Binding molecules
WO2020123444A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy
TWI848030B (zh) 2018-12-18 2024-07-11 比利時商阿根思公司 Ｃｄ７０組合治療
US20220144961A1 (en) * 2019-03-11 2022-05-12 Xyence Therapeutics, Inc. Cd27-binding antibodies and uses thereof
SG11202112032WA (en) 2019-04-30 2021-11-29 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
CA3140914A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 Elixiron Immunotherapeutics (hong Kong) Limited Anti-csf1r antibodies, il10 fusion proteins, and uses thereof
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
EP4172323A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
CN112646029B (zh) * 2020-12-30 2022-07-29 深圳清华大学研究院 成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒
AU2022246895A1 (en) 2021-03-31 2023-10-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
CN116120451A (zh) * 2021-06-17 2023-05-16 南京蓝盾生物科技有限公司 抗cd70内化的抗体、抗体偶联物及其应用
JP2024525475A (ja) 2021-06-29 2024-07-12 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド タノトランスミッションを促進するように操作された免疫細胞及びその使用
WO2023178192A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Compugen Ltd. Il-18bp antagonist antibodies and their use in monotherapy and combination therapy in the treatment of cancer
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
CN118667002A (zh) * 2023-03-16 2024-09-20 上海赛金生物医药有限公司 抗cd27单克隆抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102007147A (zh) * 2008-06-30 2011-04-06 协和发酵麒麟株式会社 抗cd27抗体
WO2012004367A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 N.V. Organon Agonistic antibody to cd27

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6218525B1 (en) 1988-02-25 2001-04-17 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding CD28
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992019759A1 (en) 1991-04-25 1992-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5573924A (en) 1992-09-08 1996-11-12 Immunex Corporation CD27 ligand
US7148061B2 (en) 2000-02-11 2006-12-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Identification of a novel domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US6982361B1 (en) 2000-02-25 2006-01-03 The Regents Of The University Of California Method of screening a compound for anxiolytic activity in an Apolipoprotein e knockout animal
WO2002043478A2 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2003025019A1 (en) 2001-09-20 2003-03-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-pdgf antibodies and methods for producing engineered antibodies
AU2003210266A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Bioinvent International Ab Treatment, diagnosis and imaging of disease
WO2004074320A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic targets in cancer
WO2006117910A1 (ja) 2005-04-28 2006-11-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
US20110129412A1 (en) 2005-06-02 2011-06-02 Astrazeneca Ab Antibodies Directed to CD20 and Uses Thereof
GB0620894D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Univ Southampton Human immune therapies using a CD27 agonist alone or in combination with other immune modulators
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
ES2564523T3 (es) 2007-12-19 2016-03-23 Janssen Biotech, Inc. Diseño y generación de bibliotecas de presentación en fago por pIX de novo humanas mediante fusión con pIX o pVII, vectores, anticuerpos y métodos
EP2090320A1 (en) * 2008-02-15 2009-08-19 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Ligands of the Natural Killer (NK) cell surface marker CD27 and therapeutic uses thereof
CN102918059A (zh) * 2009-12-29 2013-02-06 协和发酵麒麟株式会社 抗cd27抗体
EA201690310A1 (ru) * 2010-04-13 2016-12-30 Селлдекс Терапьютикс Инк. Антитела, связывающие cd27 человека, и их применение

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102007147A (zh) * 2008-06-30 2011-04-06 协和发酵麒麟株式会社 抗cd27抗体
WO2012004367A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 N.V. Organon Agonistic antibody to cd27

Also Published As

Publication number Publication date
US20170320957A1 (en) 2017-11-09
CO7071095A2 (es) 2014-09-30
CA2867299C (en) 2019-08-27
UA121844C2 (uk) 2020-08-10
PH12017501908A1 (en) 2018-10-01
HK1206251A1 (zh) 2016-01-08
US20240141055A1 (en) 2024-05-02
JO3787B1 (ar) 2021-01-31
CL2014002416A1 (es) 2015-01-16
US20130243795A1 (en) 2013-09-19
US11732050B2 (en) 2023-08-22
KR20140133940A (ko) 2014-11-20
EA030828B1 (ru) 2018-10-31
MY175224A (en) 2020-06-16
PE20142242A1 (es) 2015-01-08
CN104284678A (zh) 2015-01-14
ZA201500887B (en) 2016-01-27
PH12014502011B1 (en) 2014-11-24
BR112014022812A2 (pt) 2017-07-18
AU2013232087B2 (en) 2018-02-08
ZA201407440B (en) 2016-07-27
US20200277393A1 (en) 2020-09-03
ECSP14018641A (es) 2018-10-31
AU2013232087A1 (en) 2014-09-25
NZ629697A (en) 2017-01-27
MX2014011100A (es) 2014-12-05
KR102153374B1 (ko) 2020-09-10
CA2867299A1 (en) 2013-09-19
MX363946B (es) 2019-04-09
WO2013138586A1 (en) 2013-09-19
US20150299330A1 (en) 2015-10-22
US10301392B2 (en) 2019-05-28
US9102737B2 (en) 2015-08-11
AR090356A1 (es) 2014-11-05
UY34680A (es) 2013-09-30
JP6487839B2 (ja) 2019-03-20
JP2015511965A (ja) 2015-04-23
PH12017501908B1 (en) 2018-10-01
EP2825200A1 (en) 2015-01-21
TW201345922A (zh) 2013-11-16
US10689453B2 (en) 2020-06-23
SG11201405437QA (en) 2014-10-30
PH12014502011A1 (en) 2014-11-24
TW201730214A (zh) 2017-09-01
BR122020002414B1 (pt) 2022-03-03
SG10201710574UA (en) 2018-02-27
CR20140415A (es) 2014-11-18
US9683046B2 (en) 2017-06-20
US20190248910A1 (en) 2019-08-15
GT201400193A (es) 2017-06-14
EA201491700A1 (ru) 2015-02-27
EP2825200A4 (en) 2015-08-26
TWI576354B (zh) 2017-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104284678B (zh) 人抗cd27抗体、方法和用途
JP7317272B2 (ja) Ｔｉｇｉｔ抗体、その抗原結合断片及びその医療用途 本願は、２０１９年９月２９日に出願された出願番号ｃｎ２０１７１０９０８５６５．３に基づいたものであり、その優先権を主張する。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
CN105026428B (zh) PD‑l抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN103842382B (zh) 拮抗cd40之抗体多肽
AU2009296937B2 (en) Anti-CD147 antibodies, methods, and uses
CN109071648A (zh) 抗il-2抗体及其组合物和用途
KR101920250B1 (ko) 인간 온코스타틴 m 항체 및 이용 방법
BRPI1014016B1 (pt) anticorpos humanizados para receptor tipo toll 2 e usos dos mesmos.
US20130090457A1 (en) Toll-Like Receptor 3 Antagonists for the Treatment of Metabolic and Cardiovascular Diseases
EP3919516A1 (en) Anti-cd79b antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
CN110114370A (zh) 能够与人白细胞介素-6受体结合的抗体或其抗原结合片段
CN111094340B (zh) 抗Abeta抗体、其抗原结合片段及应用
WO2016025331A1 (en) Anti-ospa antibodies and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant