TW201345921A

TW201345921A - 細胞死亡誘導分子（ｃｄｉｍ）結合蛋白類及彼等之用途

Info

Publication number: TW201345921A
Application number: TW102105337A
Authority: TW
Inventors: Nelson N H Teng; Neelima M Bhat; Marcia M Bieber; Bruce A Keyt
Original assignee: Igm Biosciences Inc
Priority date: 2012-02-08
Filing date: 2013-02-08
Publication date: 2013-11-16
Also published as: CN104254544B; BR112014019459B1; CA2863714A1; CN104254544A; JP6335796B2; BR112014019459A8; EP2812356B1; US20140044739A1; BR112014019459A2; DK2812356T3; AU2013200903B2; KR20150001728A; ES2735289T3; MX2014009628A; IN2014MN01781A; MX363819B; KR102102111B1; TWI606064B; WO2013120012A2; WO2013120012A3

Abstract

本發明關於細胞死亡誘導分子(CDIM)結合蛋白及彼等之醫藥組成物。特別是，本發明提供可用於選擇性除盡及殺滅B細胞之CDIM結合蛋白，該等B細胞包括腫瘤性B細胞以及非B細胞來源之表現CDIM樣抗原之腫瘤樣細胞。此外，本發明包含編碼該經揭示之抗原結合蛋白之多核苷酸，以及用於產製該相同物之表現系統。本發明另包含藉由投予該CDIM結合蛋白以治療B細胞增生性及B細胞媒介性疾病病患之方法，以及用於識別與CDIM結合之蛋白質的診斷試驗。本發明另包含用於識別可以CDIM結合蛋白治療之病患族群的診斷試驗。

Description

細胞死亡誘導分子(CDIM)結合蛋白類及彼等之用途

本案包含序列表，該序列表業已經由EFS-Web以ASCII格式提出，藉此以參照方式將其整體納入。該ASCII副本係於2013年2月7日製作，其名稱為0155-005WO1_SL.txt，大小為225,619位元組。

本發明關於細胞死亡誘導分子(以下稱為CDIM)結合蛋白及彼等之醫藥組成物。特別是，本發明提供可用於選擇性除盡及殺滅B細胞之CDIM結合蛋白，該等B細胞包括腫瘤性B細胞以及表現CDIM或CDIM樣抗原之其他腫瘤細胞。本發明亦提供編碼該經揭示之CDIM結合蛋白之多核苷酸，以及用於產製該相同物之表現系統。本發明另包含藉由投予該CDIM結合蛋白以治療B細胞增生性及B細胞媒介性疾病病患之方法。本發明另包含用於識別可以CDIM結合蛋白治療之病患族群的診斷試驗。

免疫系統之功能主要是由稱為淋巴細胞之白血球負責進行。淋巴細胞可被分成兩大類，即T細胞和B細胞。T細胞(即T淋巴細胞)源自骨髓中之幹細胞，其在胸腺中發育，負責分泌淋巴介質。B細胞(即B淋巴細胞)源自骨髓中之幹細胞，其為抗體之來源。事實上，B細胞產生五種不同類型的抗體，包括IgM、IgG、IgA、IgD及IgE。這些抗體可中和可誘發免疫反應之物質，也就是抗原，抗體藉由與抗原上之特定部位連接以阻斷抗原。IgM是最大的抗體，其為對抗紅血球上之A及B抗原之主要抗體。在結構上，IgM形成聚合物，其中多個免疫球蛋白經雙硫鍵共價連接，主要形成五聚體，但也可能形成六聚體。IgM之五聚體形式的分子量大約為900kDa。由於每個單體具有二個抗原結合部位，因此五聚體IgM具有十個結合部位。

許多疾病與B細胞改變或功能異常有關，包括但不限於自體免疫疾病及癌。B細胞之增生及分化係由位在細胞表面之受體調節。這些受體之結合誘導細胞內傳訊蛋白之活化，因而傳遞受體信號至細胞內控制細胞性反應之特定標靶。許多傳訊蛋白是腫瘤基因之產物，而許多腫瘤基因與腫瘤發生有關。控制B細胞增生及分化之傳訊途徑的分子機轉仍在研究中(Jumaa et al.(2005)Annu.Rev.Immunol.23：415-445)。

一種涉及腫瘤性B淋巴細胞之疾病實例係急性淋巴胚細胞白血病(ALL)。在對抗此疾病上的一些進展可歸因於增強之化學治療及對於幼年型及成人型ALL更好的支持療法。雖然幼年型ALL之復發風險較低，但若是復發，不論幼年或成人病患皆面臨嚴重後果。儘管採取積極療法及幹細胞移植，只有不到三分之一的ALL復發病童及少數ALL復發成人可以存活。因此需要新穎之治療以期能超越習用化療。一些關於ALL之單株抗體包括利妥昔單抗(Rituximab)、依帕珠單抗(epratuzumab)及吉妥珠單抗(gemtuzumab)的臨床前及早期臨床資料指出，單獨使用單株抗體或與標準化療組合使用是可行的治療選擇。

美國專利第5,593,676號描述誘導腫瘤性B細胞之細胞死亡的方法，該方法使用與特定B細胞表位(稱為細胞死亡誘導分子(CDIM))結合之劑。其中，B細胞特定寡糖表位CDIM被用來作為腫瘤性B細胞標記。對此標記具專一性之IgM抗體被投予至宿主體內以誘導腫瘤性B細胞之死亡。相同概念可被應用於體外臨床情況以選擇性移除B細胞。辨識B細胞表位CDIM之人單株抗體(即MAb 216)對於腫瘤性及正常B細胞具細胞毒性，其與人週邊血液及脾臟中所有的CD19+及CD20+ B淋巴細胞結合。另外，MAb 216無法區別B細胞表現之同型，其以相同強度與IgG+及IgM+細胞結合。MAb 216亦與所有B細胞結合，不論CD5表現為何。因此，MAb 216可用於診斷及治療。亦見Bhat et al.(2000),Scand.J.Immunol..51：134-140。

然而，本領域當中仍然需要識別對B細胞具專一性之抗體，以選擇性殺滅及/或移除宿主體內之B細胞，並且減少標靶外之結合及/或組織傷害之不良反應。癌治療仍然亟需這類治療性抗體。因此本申請案關於這些需求。

本發明之詳細說明

此處使用之段落標題僅供組織之目的，不可被視為限制該敘述之主題。

除非此處另外加以定義，關於本案所使用之科學性及技術性用語應具有該領域之一般技藝人士所通常了解之意義。另外，除非內文另外要求，單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。

一般來說，與此處所描述之細胞培養、組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、基因學以及蛋白質及核酸化學和雜交有關所使用之命名法及技術係該領域所廣為週知且經常使用者。本申請案之方法及技術通常根據該領域所廣為周知之習用方法進行，除非另外說明否則如同本說明書各處引述及討論之各種一般性及更具體之參考文獻所述。見例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992),and Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，該等文獻以參照方式併入本文。酶反應及純化技術係根據製造商說明書，以該領域經常完成或此處所描述之方式進行。與此處所述之分析化學、合成有機化學、醫學及製藥化學有關所使用之用語和實驗室方法及技術係該領域所廣為週知且經常使用者。標準技術可被用於化學合成、化學分析、藥物製劑、調製和遞送及病患治療。

應了解的是，本發明並不限於此處所描述之特定方法、步驟及試劑等，因此可能有所差異。此處所使用之用語只是為了描述特定實施態樣，並不意圖限制僅由該權利要求範圍所定義之揭示範圍。

除了在操作實施例或另外說明之處以外，應了解所有表示此處所使用之成分之量或反應條件之數字在所有情況下由用語「約」所修飾。當與百分比一起使用時，用語「約」可能表示+/-1%。

一般概況

本發明提供關於治療或診斷涉及表現CDIM抗原之細胞的增生性疾病之材料及方法。特別是，本發明提供體外及體內表現增進之CDIM結合蛋白，其可用於選擇性殺滅及/或除盡腫瘤性B細胞，特別是用於罹患特徵為B細胞增生性及B細胞媒介性疾病之病況的病患。此外，CDIM結合蛋白可用於治療表現CDIM抗原之實體腫瘤。本發明揭示之CDIM結合蛋白可單獨使用或與小分子化學治療劑組合使用。由於該揭示之CDIM結合蛋白具有獨特之孔誘導效應，也就是造成細胞膜損傷，因此使化療分子得以進入標靶細胞。因此，該揭示之結合蛋白特別適用於治療原本對於與相同物組合之小分子化合物具抗性之細胞。

定義

此處使用之下列用語應具有下列意義。

用語「抗原」係指能誘導特定免疫反應且能與特定抗體反應之任何物質。

此處使用之「抗原結合蛋白」或「CDIM結合蛋白」是一種具有抗體樣結合活性之支架蛋白或為一種抗體，即抗CDIM抗體。

此處所使用之用語「CDIM」(細胞死亡誘導分子)係指附著於細胞表面分子之聚n-乙醯基乳糖胺糖化形式。CDIM表位可見於幾乎所有週邊B淋巴細胞及脾臟B淋巴細胞以及某些經培養的B細胞淋巴瘤細胞系上。該表位亦可見於不同組織病理學分類之原發B細胞淋巴瘤，以及某些實體腫瘤之細胞上。

在更特定之用語中，CDIM表位係一線性B細胞乳糖胺抗原(即聚-N-乙醯基乳糖胺第2型決定簇，有或無末端唾液酸)，其具有立體結構構型，對於內-β-半乳糖苷酶敏感。該表位不具分支或取代基，可附著於糖脂或糖蛋白。在糖蛋白上，該表位可自甘露糖架構(例如酶MGAT4)伸出，或可為自一「大I」結構伸出之長鏈，但在分支Gal β 1-4 GlcNac β 1-3 Gal β 1-4 Glc β 1之後的直鏈中通常至少有約4個己糖部分(第2型)；至少約6個己糖以具有良好親和性；及最長形式中至少約12個己糖。該鏈係由酶(例如B3GNT1、B4GALT1)產製，該等酶添加交互糖至該表位。應注意的是，該糖基化表位CDIM存在於多種蛋白質上，從分子量約20KD至大於約200KD之蛋白質都有。

該CDIM表位已被進一步闡釋，該抗原之糖化形式係經唾液酸加帽，其為更成熟之糖基化形式。

用語「表位」通常指抗原(即分子之抗原性決定簇)之一部分，其由免疫系統辨識。表位可由糖、脂質及/或胺基酸或其混合物組成，其係由免疫細胞如特定T細胞、B細胞及/或B細胞產製之抗體辨識。當免疫細胞辨識特定表位且受到該表位活化時，它們啟動免疫反應。或者，當抗體辨識及結合特定表位時，攜帶該表位之細胞可能會被除盡、殺滅、去活、受傷、移除及/或改變。

此處所使用之用語「支架蛋白」或「抗原結合蛋白」係指具有暴露之表面區域之多肽或蛋白，而該暴露之表面區域對胺基酸插入、取代或刪除具有高度耐受性。可用於本發明之支架蛋白之實例包括來自金黃葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)之蛋白質A、來自大菜粉蝶(Pieris brassicae)之膽素結合蛋白或其他脂質運載蛋白(lipocalin)、錨蛋白(ankyrin)重複蛋白及人纖維粘連蛋白(fibronectin)(於Binz and Plückthun(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16：459-69回顧)。支架蛋白之工程可被視為移植或嵌入親和性功能至穩定摺疊之蛋白的結構架構之上或之中。親和性功能係指如本發明所述之蛋白結合親和性。支架在構造上可與授予結合特異性之胺基酸序列分開。一般來說，似乎適用於發展這類人造親和性試劑之蛋白質可能藉由合理或最常見之組合式蛋白工程技術獲得，諸如在試管內展示之人造支架庫中篩選針對CDIM之結合劑(不論是經純化之蛋白或在細胞表面展示之蛋白)，該等技術係為該領域所知(見例如Skerra,A.(2000)J.Mol.Recog.13：167-187；Binz and Plückthun，同上)。此外，具有類抗體結合活性之支架蛋白可源自包含該支架結構域之接受者(acceptor)多肽，該多肽可接受捐贈者多肽之結合結構域之移植以將該捐贈者多肽之結合特異性授予包含該接受者多肽之支架結構域。該插入之結合結構域可能為例如抗體之互補決定區(CDR)，特別是抗CDIM抗體。插入可藉由該領域之技藝人士所知之各種方法完成，包括例如多肽合成、核酸合成編碼胺基酸以及該領域之技藝人士所熟知之各種形式之重組方法。重要的是，用語「重鏈」或「輕鏈」應被廣義地理解為支架蛋白(其內嵌經揭示之CDR之一或數者)，而非限制於該等用語在抗體技術範疇內之傳統意義。

另外，此處使用之用語「抗體」或「CDIM結合抗體」包括單株抗體、多株抗體、重組抗體、人化抗體(Jones et al.(1986)Nature 321：522-525；Riechmann et al.(1988)Nature 332：323-329；及Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596)、嵌合抗體(Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855)、由至少二個抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)或彼等之抗體片段。用語「抗體片段」包含前述抗體之任何部分，較佳為彼等之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab片段、Fab’片段、(Fab’)₂片段、Fv片段、雙價抗體(diabodies)(Hollinger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448)、單鏈抗體分子(Plückthun in：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113,Rosenburg and Moore,EDS,Springer Verlag,N.Y.(1994),269-315)及其他片段，只要它們能表現與CDIM結合之所欲能力。

此外，此處所使用之用語「抗體」或「CDIM結合抗體」可能包括含有抗體之工程化次結構域之類抗體分子或天然發生之抗體變異體。這些類抗體分子可能為單結構域抗體，諸如源自天然來源如駱駝(Muyldermans et al.(2001)Reviews in Molecular Biotechnology 74：277-302)或經由試管內展示源自人、駱駝或其他物種之庫(Holt et al.2003 Trends Biotechnol.21：484-90)之僅V_H 或僅V_L之結構域。

根據本發明，「Fv片段」係包含完整抗原辨識及抗原結合部位之最小抗體片段。此區域係由一個重鏈可變結構域及一個輕鏈可變結構域以緊密、非共價連接所形成之二聚體組成。在這種配置下，各可變結構域之三個CDR(重鏈CDRH1、CDRH2及CDRH3；輕鏈CDRL1、CDRL2及CDRL3)交互作用以定義在V_H-V_L二聚體之表面上的抗原結合部位。整體來說，這六個CDR賦予抗原結合特異性給抗體。然而，即使單一可變結構域(或僅包含3個具抗原專一性之CDR的半個Fv)也具有辨識及結合抗原之能力。「Fab片段」亦包含輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。「Fab片段」與「Fab’片段」之不同處在於Fab’片段之重鏈CH1結構域的羧基端增加數個殘基，包括一或多個來自抗體絞鏈區之半胱胺酸。「F(ab’)₂片段」本來被產製為一對「Fab’片段」，彼等之間具有絞鏈半胱胺酸。製備這類抗體片段之方法(諸如木瓜酶或胃蛋白酶消化)係該領域之技藝人士所知。

在本發明之一些實施態樣中，抗CDIM抗體屬於IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體，較佳為IgG或IgM抗體，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1及IgM2抗體。在大部分實施態樣中，該抗體係IgM抗體。該輕鏈可能為λ-1、λ-2或κ。可能包括或不包括J鏈。

IgG具有數種亞型，包括但不限於IgG1、 lgG2、lgG3及lgG4。IgA亞型包括IgA1及lgA2。在人類中，IgA同型包含四條重鏈及四條輕鏈；IgG及IgE同型包含二條重鏈及二條輕鏈；而IgM同型包含10條或12條重鏈及10條或12條輕鏈(五聚體或六聚體)。在天然發生之IgM分子中，該J鏈穩定該五聚體構型。

重鏈C區通常包含一或多個可能負責效應功能之結構域。重鏈恆定區結構域之數量將依同型而定。在一實施態樣中，該CDIM結合蛋白係IgM亞型。在全長輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區可由約12或更多個胺基酸之「J」區連接，且重鏈亦包括約10或更多個胺基酸之「D」區。(見例如Fundamental Immunology,2nd ed.,Ch.7(Paul,W.,ed.)(1989)New York：Raven Press)。

CDIM結合蛋白

本發明之第一態樣關於一種經分離之結合蛋白，該結合蛋白與人周邊B淋巴細胞、脾臟B淋巴細胞、腫瘤性B淋巴細胞及一些實質腫瘤上之細胞死亡誘導分子(CDIM)表位結合。

在一實施態樣中，該抗原結合蛋白包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈包含CDRH1、CDRH2及CDRH3之至少一者，該CDRH1、CDRH2及CDRH3具有如SEQ ID NO：1至22中任一者所示之序列，該輕鏈包含如SEQ ID NO：23或24所示之CDRL1、CDRL2及CDRL3之至少一者。在一實施態樣中，該抗原結合蛋白包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含至少一個如SEQ ID NO：1至22所示之CDRH3。在另一實施態樣中，該抗原結合蛋白包含各一個如SEQ ID NO：1至22所示之CDRH1、CDRH2及CDRH3，以及輕鏈。在其他實施態樣中，該抗原結合蛋白額外包含SEQ ID NO：23或24之CDRL1、CDRL2及CDRL3，該CDRL1、CDRL2及CDRL3係嵌入輕鏈之中。在一些實施態樣中，該抗原結合蛋白額外具有如SEQ ID NO：1至22中所示之FR1，該FR1係嵌入重鏈之中。

在另一實施態樣中，該抗原結合蛋白包含如SEQ ID NO：1至22中任一者所示之重鏈可變區。此外，本發明包括其中該抗原結合蛋白包含輕鏈可變區之一實施態樣，該輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：23或24所示之序列。另外，本發明考慮包含如SEQ ID NO：1至22中任一者所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO：23或24所示之輕鏈可變區的抗原結合蛋白。圖1A至D說明此處所揭示之CDIM結合蛋白之22種示範性獨特重鏈可變區。圖1E說明二種輕鏈可變區(SEQ ID NO：23及24)。圖1F顯示重鏈恆定區(Ig μ)(SEQ ID NO：25)，以及輕鏈恆定區(Ig λ及Ig κ)(SEQ ID NO：26及27)。SEQ ID NO：108代表MAb 216(Bhat et al,2000，同上)，一種CDIM結合抗體，其被用來作為評估效價及專一性之試驗參考抗體。見以下之實施例。

各重鏈可變區可與重鏈恆定區連接以形成全長重鏈，各輕鏈可變區可與輕鏈恆定區連接以形成全長輕鏈。此處揭示之示範性全長重鏈之胺基酸序列具有如SEQ ID NO：28至49所示之序列。此處揭示之示範性輕鏈之胺基酸序列具有如SEQ ID NO：50及51所示之胺基酸序列。如上所述，二個重鏈及二個輕鏈序列可形成一全長抗體四聚體。特別在此揭示示範性CDIM結合抗體四聚體，經命名為IGM1、IGM2、IGM3、IGM4、IGM5、IGM6、IGM7、IGM8、IGM9、IGM10、IGM11、IGM12、IGM13、IGM14、IGM15、IGM16、IGM17、IGM18、IGM19、IGM20、IGM21、IGM22、IGM23、IGM24、IGM25、IGM26、IGM27、IGM28、IGM29、IGM30、IGM31、IGM32、IGM33、IGM34、IGM35、IGM36、IGM37、IGM38、IGM39、IGM40、IGM41、IGM42、IGM43及IGM44(在此處亦統稱為IGM1至IGM44)。如圖2A至2V所示，這44個經揭示之CDIM結合蛋白包含SEQ ID NO：28至49之重鏈，該等重鏈各自與SEQ ID NO：50至51之輕鏈之任一者組合。下表3顯示各種多肽及多核苷酸SEQ ID NO與IGM1至IGM44抗原結合蛋白之間的關係。

在一實施態樣中，該經分離之抗原結合蛋白與CDIM結合，其包含重鏈CDR3序列X₁X₂X₃AX₄GX₅SX₆X₇，其中：X₁係G、A或R；X₂係R、G或A；X₃係M、T或R； X₄係R、W或Y；X₅係A、S或G；X₆係I、V或Y；且X₇係N或無胺基酸；且其中在位置1至3(相對於重鏈可變區之位置98至100，位置97係位於該CDR3區之前的不可變之精胺酸)存有一個且不超過一個精胺酸。

在另一實施態樣中，該經分離之抗原結合蛋白與CDIM結合，其包含重鏈CDR3序列X₁X₂X₃AX₄GX₅SX₆X₇，其中：X₁係G、A或R；X₂係R、G或A；X₃係M、T或R；X₄係R或W；X₅係A或S；X₆係I或V；且X₇係N或無胺基酸；且其中在位置1至3(相對於重鏈可變區之位置98至100，位置97係位於該CDR3區之前的不可變之精胺酸)存有一個且不超過一個精胺酸。

根據本發明，應了解本發明之結合蛋白的胺基酸序列並不限於20種習用胺基酸(見Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以參照方式納入此處)。舉例來說，該等胺基酸可能包含該20個習用胺基酸之立體異構物(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸諸如α-,α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非習用之胺基酸。非習用胺基酸之實例(其亦可能作為本發明之結合蛋白之適用成份)包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似之胺基酸及亞胺酸，例如4-羥基脯胺酸。

另外，根據本發明，在SEQ ID NO：1至51中所示之胺基酸序列中的輕微變異被認為包含於本發明，只要該胺基酸序列中之變異維持如SEQ ID NO：1至51中所示之至少75%、更佳至少80%、90%、95%且最佳99%之序列。該等變異可發生在架構區內(即CDR之外)、CDR內或在架構區及CDR之內。在SEQ ID NO：1至51中所示之胺基酸序列中的較佳變異(即刪除、插入及/或取代至少一個胺基酸)發生在靠近功能性結構域之邊界。結構性及功能性結構域可藉由比較該核苷酸及/或胺基酸序列資料與公開或專用序列資料庫加以確認。電腦比較法可被用來找出發生在其他已知結構及/或功能之結合蛋白中之序列模體(motif)或預測之蛋白質構形結構域。鑑別經摺疊成已知之三維結構的蛋白序列之方法係該領域所知。見例如Bowie et al.(1991)Science 253：164；Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,Ed.,W.H. Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze,eds.,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；and Thornton et al.1991 Nature 354：105，該等文獻皆以參照方式併入本文。因此，該領域之技藝人士可辨識可能用來定義本發明所述之結構性及功能性結構域之序列模體及結構構形。

在SEQ ID NO：1至51中所示之胺基酸序列中，特別較佳之變異為該些導致對蛋白水解或氧化之感受性降低、改變糖基化模式或改變結合親和性或授予或修飾該結合蛋白之其他物理化學或功能性特性之變異。特別是可考慮保守性胺基酸取代。保守性取代係指該些發生於側鏈相關之胺基酸家族內之取代。較佳之胺基酸家族包括下列：酸性家族=天冬胺酸、麩胺酸；鹼性家族=離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性家族=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及不帶電極性家族=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。更佳之家族包括：脂肪族羥基家族=絲胺酸及蘇胺酸；含醯胺家族=天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族家族=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；及芳香性家族=苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。舉例來說，可以合理期待以異白胺酸或纈胺酸獨立取代白胺酸、以麩胺酸獨立取代天冬胺酸、以絲胺酸獨立取代蘇胺酸或以結構相關之胺基酸類似地取代胺基酸將不會對該形成之結合蛋白的結合或特性產生重大影響，特別是如果該取代並未牽涉在架構區內之胺基酸。胺基酸改變是否會導致功能性結合蛋白，即是否導致與CDIM結合之抗原結合蛋白可利用ELISA或FACS試驗輕易地測定。

在一些實施態樣中，該CDIM結合蛋白為具有抗體樣結合活性之「支架蛋白」，其中SEQ ID NO：1至24中之一或多個CDR係如上定義嵌入支架中。在一些實施態樣中，至少CDRH3及CDRL3係嵌入支架中。在一些實施態樣中，所有六個CDR係嵌入支架中。該支架蛋白是否具有CDIM結合活性可利用與MAb 216競爭結合之ELISA或FACS試驗(MAb 216是一種天然發生之CDIM結合抗體)或試管內或體內功能性試驗輕易測定。

另外，根據本發明，應了解的是本發明之CDIM結合抗體為全人或人化抗體。人抗體避免與異種抗體有關之某些問題，例如具有小鼠或大鼠可變區及/或恆定區之抗體。異種源性蛋白如小鼠或大鼠源性蛋白之存在可導致病患產生針對該抗體之免疫反應，繼而導致快速廓清該抗體、經由中和該抗體而喪失治療效用及/或嚴重、甚至致命之過敏反應。

此處描述之抗原結合蛋白可能是抗體或可能源自抗體。在某些實施態樣中，該抗原結合蛋白之多肽結構係基於抗體，包括但不限於單株抗體、雙特異性抗體、迷你抗體(minibodies)、結構域抗體、合成抗體(此處有時稱為「抗體擬似物」)、嵌合抗體、人化抗體、人抗體、抗體融合(此處有時稱為「抗體共軛物」)及彼等之片段。此處提供之抗原結合蛋白已顯示能與所有B細胞上之CDIM表位結合，包括腫瘤性B細胞及一些實質腫瘤細胞。如實施例所示，受傷B細胞自行修復及存活之能力係減少或受到抑制。因此，該揭示之抗原結合蛋白能除盡及殺滅B細胞，包括腫瘤細胞。此處揭示之抗原結合蛋白具有多種用途。舉例來說，這些抗原結合蛋白中有些能用於特定結合試驗以親和性純化CDIM表現細胞，有些可用於篩選試驗以識別CDIM表現細胞包括實質腫瘤細胞及B細胞來源之細胞。此外，該揭示之抗原結合蛋白可被用於診斷及/或治療疾病，如B細胞增生性疾病及自體免疫疾病。就此而言，本發明揭示之抗原結合蛋白可單獨使用或與小分子化學治療劑組合使用。

在一實施態樣中，該抗原結合蛋白係多價CDIM結合蛋白(即具有二或多個CDIM表位之結合位點的CDIM結合蛋白)。因此，該結合蛋白可作為對CDIM表位具有特定親和性及親合力之受體，通常至少約10^-6M，更佳為至少約10^-7M。該受體之多價特性允許同時結合在細胞膜表面上之至少二個CDIM表位。可使用來自任何免疫球蛋白家族之抗體，如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM；該抗體不需要具有與特定Fc啟動作用有關之各種細胞毒性作用。在一實施態樣中，該抗體將為IgM，因為此分子之五聚體或六聚體結構允許不受立體位阻干擾之交聯。在一些實施態樣中，該抗體組成物係IgM五聚體及IgM六聚體之混合物，包括至少20%六聚體、至少30%六聚體、至少40%六聚體、至少50%六聚體、至少60%六聚體、至少70%六聚體、或至少80%六聚體。或者，可使用抗體片段或彼等之類似抗體作用之合成性替代物。舉例來說，可設計允許與CDIM表位特定結合及交聯之小型合成性分子。

在一實施態樣中，該抗體具有J鏈，在另一實施態樣中，該抗體無J鏈。

在一態樣中，該抗原結合蛋白係根據VH4-34種系序列建構之重組抗體。VH4-34基因(重鏈可變區)為53個已發現之人功能性抗體種系基因的其中之一。VH4-34基因存在於所有單體型，自不相關個體分離之種系DNA中並未發現序列變異。抗B細胞VH4-34抗體對B細胞具有細胞毒性(Bhat et al.(1997)Clin.Exp.Immunol.108：151and Bhat et al.(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39：59)。如上所暗示，由抗體誘導之細胞膜缺損或破洞比其他廣為周知之孔形成蛋白所形成者為大。藉由通透化細胞，該揭示之CDIM結合蛋白能有效顯著地除盡標靶細胞(亦見專利公開號20100322849)。通透化之B細胞更容易受其他細胞毒性劑之影響，包括但不限於放射性同位素、細胞毒性抗體、免疫共軛物、配體共軛物、免疫抑制劑、細胞生長調節劑及/或抑制劑、毒素及/或其混合物。受到破壞之細胞膜能讓細胞毒性劑進入，如化學治療劑，因而增加該化學治療劑之療效，甚至對該劑具有抗性或該劑無法穿透之細胞亦同。任何分別表現CDIM 表位或類CDIM表位之B細胞或癌細胞可利用CDIM結合蛋白處理，且可經由該揭示之抗原結合蛋白除盡及殺滅。

本發明之CDIM結合蛋白辨識人周邊B淋巴細胞、脾臟B淋巴細胞、腫瘤性B淋巴細胞及一些實質腫瘤上之CDIM表位。許多IgM抗體為多反應性，即它們可與許多不同且結構不相關之自體及非自體外來抗原結合。然而，本發明揭示之抗原結合蛋白被發現相較於一些天然發生之CDIM抗體較不具多反應性。因此，該揭示之抗原結合蛋白比較不會發生非標靶結合，使它們成為體內應用上較佳的治療及診斷候選物。它們的多反應性之減少係於圖5A至5E中說明，這些圖顯示本發明揭示之抗原結合蛋白實例減少或喪失對多種非CDIM抗原之結合親和性，特別是ssDNA、dsDNA、脂質A、心脂及MDA-LDL。這表示該揭示之CDIM結合蛋白在治療應用上比較安全，因為結合標靶細胞之所需劑量將較低，因為這些抗體沒有所謂的「抗原水槽」(與CDIM以外之抗原結合)。多反應性抗體對不同抗原之親和性可相差至1000倍之多，該親和性通常低於單反應性抗體對彼之抗原之親和性。許多多反應性抗體通常為種系或近種系抗體，雖然有些具有少量取代。多反應性抗體會比單反應性抗體更快地自循環清除。多反應性抗體之快速廓清可能是因為這些抗體與內源性宿主抗原結合(見例如Zhou et al.(2007)J.Autoimmun.29(4)：219-228)。許多天然抗體為多反應性抗體，其具有廣泛之抗菌活性。此部分地解釋新生兒血清在無已知抗原性刺激存在下之抗菌活性(亦見Zhou et al.(2007)，同上)。然而，以治療目的而言，通常希望採取單特異性且不要太快被清除之抗體，以達到結合及殺滅表現CDIM表位之B細胞及癌細胞。

在特定治療應用中，例如在治療自體免疫疾病中，理想的是該CDIM結合蛋白選擇性結合及殺滅B細胞，因為B細胞藉由許多機轉造成多種自體免疫疾病(Browning,J.L.(2006)Nature(Reviews)5：564-576)。快速除盡B細胞減少免疫系統之活性，因而減少許多相關不良反應，如發炎及組織傷害。在癌治療中，最好能殺滅選擇性細胞族群，諸如腫瘤性B細胞或癌細胞，以停止這些細胞之過度增生及癌擴散至其他器官。在本發明中，與其他劑及癌藥物之組合療法可有利地引導對特定細胞之殺滅。因此，CDIM結合蛋白具有自體免疫疾病及癌治療之治療應用。

如上討論，該揭示之抗原結合蛋白與彼之線性乳糖胺配體之結合，導致細胞膜干擾及形成大型膜孔洞，造成細胞溶解。組合例如長春新鹼(vincristine)與該揭示之抗原結合蛋白，相較於各單一劑單獨使用之加成效應，導致增加程度之對B細胞之細胞毒性。因此，該CDIM結合蛋白可被單獨投予至病患，也可與其他劑及/或癌藥物組合投予，以達到腫瘤靶向及療效。另外，該CDIM結合蛋白可被單獨投予至病患，也可與其他劑及/或癌藥物組合投予，以治療及/或診斷各種疾病包括癌及自體免疫疾病。可與CDIM結合蛋白組合使用之其他劑的實例如下表1所示：

在一些實施態樣中，本發明之抗原結合蛋白係與標記基團偶合。該等結合蛋白特別適用於診斷應用。此處使用之用語「標記基團」係指可檢測之標記，例如經放射性標記之胺基酸，或可由經共軛之抗生物素蛋白檢測之生物素基部分(例如與螢光標記結合之鏈黴抗生物素蛋白或可由光學或比色方法檢測之酶活性)。多種用於標記多肽及糖蛋白(諸如抗體)之方法係該領域所知且可被用於實施本發明。適當標記基團之實例包括但不限於：放射性同位素或放射性核種(例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、螢光基團(例如FITC、若丹明、鑭磷光體)、酶基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團，或預先測定之由第二報告子辨識之多肽表位(例如白胺酸拉鍊對序列、第二抗體之結合位點、金屬結合結構域、表位標籤)。在某些態樣中，可能希望該等標記基團藉由不同長度之間隔臂連接以減少潛在之空間位阻。

或者，此處揭示之抗原結合蛋白在本發明之另一較佳之實施態樣中可能與效應物基團偶合。該等結合蛋白特別適用於治療應用。本發明所使用之用語「效應物基團」係指細胞毒性基團諸如放射性同位素或放射性核種、毒素、治療性基團或其他該領域已知之效應物基團。適當效應物基團之實例為放射性同位素或放射性核種(例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、卡利奇黴素(calicheamicin)、海兔毒素(dolastatin)類似物諸如耳抑素(auristatin)及化學治療劑諸如膠達納黴素(geldanamycin)及美坦素(maytansine)衍生物包括DM1。在某些態樣中，可能希望該等效應物基團藉由不同長度之間隔臂連接以減少潛在之空間位阻。

編碼CDIM結合蛋白之多核苷酸及表現系統

本發明之另一態樣關於一種經分離之核酸分子，其編碼本發明之結合蛋白。在本發明之範疇中，用語「經分離之核酸分子」係指基因組、cDNA或合成性來源之多核苷酸或彼等之某些組合，就其來源而言，該「經分離之核酸分子」(1)不與在天然中發現該「經分離之多核苷酸」之多核苷酸的所有或部分相連，(2)與在天然中不相連之多核苷酸可操作地連接，或(3)不以較大序列之部分在天然中發生。另外，此處所使用之用語「核酸分子」係指長度至少10個鹼基之核苷酸的聚合體形式，不論是核糖核苷酸或去氧核苷酸或任一核苷酸類型之經修飾形式，諸如具有經修飾或經取代之糖基及該類似物之核苷酸。該用語亦包括單股及雙股形式之DNA。

編碼IGM1至IGM44之重鏈序列的示範性完整核酸序列(SEQ ID NO：52至73)係提供於圖3A至K。編碼IGM1至IGM44之輕鏈序列的示範性完整核酸序列(SEQ ID NO：74及75)係提供於圖3L。當然，由於遺傳基因之簡併性，其他編碼此處所述之CDIM結合蛋白之核酸可被考慮。

在本發明之一實施態樣中，本發明之核酸分子係與控制序列可操作性連接。此處所使用之用語「控制序列」係指使其所連接之編碼序列得以表現及處理所必需之多核苷酸序列。該等控制序列之性質依宿主有機體而異。在原核生物中，該等控制序列通常包含啟動子、核糖體結合位置及轉錄終止序列。在真核生物中，該等控制序列通常包括啟動子及轉錄終止序列。根據本發明，用語「控制序列」意圖起碼包括彼等之存在為表現及處理所必要之所有成份，且亦可包括彼等之存在具有好處之額外成份，例如前導序列及融合夥伴序列。另外，此處所使用之用語「可操作性連接」係指所描述之成份的位置之關係允許彼等以預定方式發揮功能。另外，根據本發明，與編碼序列可操作性連接之表現控制序列的連接方式，可使該編碼序列之表現在與該表現控制序列相容的條件下達成。

本發明之其他態樣為一種載體，其包含編碼本發明之結合蛋白之核酸分子。該核酸分子可與控制序列可操作性連接。另外，該載體可能額外包含複製起點或篩選標誌基因。可能根據本發明被使用之載體的實例包括例如質體、黏質體(cosmids)、噬菌體及病毒等。

本發明之另一態樣關於一種宿主細胞，其經本發明之核酸分子或載體轉形。轉形可利用將多核苷酸導入宿主細胞之任何已知方法進行，包括例如將多核苷酸包進病毒(或病毒載體)中並將該病毒(或載體)轉導至宿主細胞，或藉由該領域已知之轉染方法進行，如美國專利第4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455號所示，該等專利以參照方式納入此處。特別是，將異源性多核苷酸導入哺乳動物細胞之方法係該領域所廣為周知，包含經葡聚糖媒介之轉染、磷酸鈣沉澱、經凝聚胺媒介之轉染、原生質體融合、電穿孔、將多核苷酸包封至脂質體及直接顯微注射DNA至細胞核。可根據本發明使用之宿主細胞之實例為雜交瘤、真核細胞(例如哺乳動物細胞，諸如倉鼠、兔、大鼠、豬、小鼠或其他動物細胞)、植物細胞及真菌細胞(例如玉米、菸草、啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))、原核細胞諸如大腸桿菌，以及該領域用於產製抗體之其他細胞。特別是，可用來作為表現宿主之哺乳動物細胞系為該領域所廣為周知，其包括許多可得自美國菌種保存中心(ATCC)之永生化細胞系，包括但不限於中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(如Hep G2)及許多其他細胞。

CDIM結合蛋白之醫藥組成物及治療和診斷之方法

本發明之另一態樣關於CDIM結合蛋白之醫藥組成物。該結合蛋白係經調製成可用於本發明之方法之醫藥劑。任何可刺激與該CDIM結合蛋白和B淋巴細胞之CDIM表位之結合有關的生物反應之組成物或化合物可被用來作為本發明之醫藥劑。有關調製及投予技術之一般細節係詳述於科學文獻(見“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,Maack Publishing Co,Easton Pa.)。CDIM結合蛋白醫藥調製劑可根據該領域已知之任何用於製造醫藥劑之方法製備。該CDIM結合蛋白可經調製為以任何習用可接受之方式投予，包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、口服、局部或經由其他途徑投予。示例性實例係於下闡述。

用於口服投予之醫藥調製劑可利用該領域廣為周知之醫藥上可接受之載劑調製成適合用於經口投予之劑量。該等載劑使該醫藥調製劑得以調製成適合由病患攝食之單位劑量形式，如錠劑、丸劑、粉劑、膠囊、液劑、含錠、膠、糖漿、漿液、懸浮液及類似形式。口服用途之醫藥製劑可經由組合該CDIM結合蛋白與固體賦形劑，可任意選擇地研磨所形成之混合物，並且在添加適當之額外化合物之後(若有需要)處理該顆粒混合物，以獲得錠劑或丸劑。適當之固體賦形劑為碳水化合物或蛋白質填料，包括但不限於糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇)、來自玉米、小麥、米、馬鈴薯或其他植物之澱粉、纖維素(如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧基甲基纖維素鈉)、膠(包括阿拉伯膠及黃蓍膠)及蛋白質(如明膠及膠原蛋白)。若有需要，可添加崩解劑或助溶劑，如經交聯之聚乙烯基吡咯烷酮、洋菜膠、藻酸或彼等之鹽，如藻酸鈉。亦可經口服使用之本發明之醫藥製劑為例如由明膠製成之推入適配(push-fit)膠囊，以及由明膠及包覆劑如甘油或山梨醇製成之軟密封膠囊。推入適配膠囊可包含與填料或粘結劑(如乳糖或澱粉)、潤滑劑(如滑石或硬脂酸鎂)及可任意選擇之穩定劑混合之CDIM結合蛋白。在軟膠囊中，該CDIM結合蛋白可被溶解或懸浮於適當液體中，如有或無穩定劑之脂質油、液體石蠟或液體聚乙二醇。

本發明之水性懸浮液包含與適用於製造水性懸浮液之賦形劑混合之CDIM結合蛋白。該等賦形劑包括懸浮劑(如羧基甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠及阿拉伯膠)及分散或潤濕劑如天然發生之磷脂質(如卵磷脂)、伸烷基氧與脂肪酸之縮合產物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)、乙烯氧與長鏈脂肪族醇之縮合產物(如伸十七烷基氧乙醇)、乙烯氧與衍生自脂肪酸及己醣醇之部分酯的縮合產物(如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯)，或乙烯氧與衍生自脂肪酸及己醣醇酐之部分酯的縮合產物(如聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯)。該水性懸浮液亦可包含一或多種保存劑(如對羥苯甲酸乙酯或對羥苯甲酸正丙酯)、一或多種增色劑、一或多種添味劑及一或多種甜味劑(如蔗糖、阿斯巴甜或糖精)。調製劑可經滲透壓之調整。

油懸浮液可藉由懸浮CDIM結合蛋白於植物油(如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(如液體石蠟)中調製。油懸浮液可包含增稠劑，如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟基醇。甜味劑可被添加以提供適口之口服製劑。這些調製劑可藉由添加抗氧化劑如抗壞血酸加以保存。

適合藉由添加水以製備水性懸浮液之本發明之分散粉劑及顆粒，可自與分散劑、懸浮劑及/或潤濕劑及一或多種保存劑混合之CDIM結合蛋白調製。適當之分散劑或潤濕劑及懸浮劑係以上述者為例。其他賦形劑，例如甜味劑、調味劑及增色劑，亦可存在。

該CDIM結合蛋白醫藥調製劑亦可呈油在水中之乳劑形式。該油相可為植物油(如橄欖油或花生油)、礦物油(如液體石蠟)或彼等之混合物。適當之乳化劑包括天然發生之膠(如阿拉伯膠及黃蓍膠)、天然發生之磷脂質(如大豆卵磷脂)、衍生自脂肪酸與己醣醇酐之酯或部分酯(如去水山梨醇單油酸酯)及這些部分酯與乙烯氧之縮合產物(如聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯)。該乳劑亦可包含甜味劑及調味劑。糖漿及酏劑可與甜味劑一起調製，如甘油、山梨醇或蔗糖。該等調製劑亦可包含緩和劑、保存劑、調味劑或增色劑。

當CDIM結合蛋白係藉由靜脈注射遞送時，該醫藥調製劑可為無菌注射製劑形式，如無菌注射水性或油性懸浮液。此懸浮液可根據已知技藝，利用如上述之適當分散或潤濕劑及懸浮劑調製。該無菌注射製劑亦可為在非毒性非經腸可接受性稀釋劑或溶劑中之無菌注射溶液或懸浮液。可使用之可接受性載具及溶劑為水及林格氏(Ringer)液(等張氯化鈉溶液)。此外，無菌不揮發油可被慣用地作為溶劑或懸浮介質。就此目的而言，任何緩和不揮發油皆可被使用，包括合成性單甘油酯或雙甘油酯。此外，脂肪酸(如油酸)同樣可被用於製備注射用劑。

本發明之方法治療人及非人病患，該等病患罹患淋巴樣癌或白血病(如B細胞急性淋巴胚細胞白血病或ALL)、任何形式之涉及B細胞之自體免疫疾病(如類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡或SLE)、任何形式之B細胞過度增生如淋巴瘤及骨髓瘤(如非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤)、某些形式之表現CDIM抗原之實質腫瘤及/或相關病況。可適當達成此目的之CDIM結合蛋白之量被認為是治療有效劑量。或者，可適當達成此目的之與另一劑或另一藥物組合之CDIM結合蛋白之量也被認為是治療有效劑量。其他劑為(例如)細胞毒性劑，包括但不限於放射性同位素、細胞毒性抗體、免疫共軛物、配體共軛物、免疫抑制劑、細胞生長調節劑及/或抑制劑、毒素或彼等之混合物。化學治療劑或化合物(亦見表1)通常為干擾微管聚合或去聚合化微管之劑，如紫杉烷(taxane)、長春花生物鹼或秋水仙鹼(colchicine)，或彼等之混合物。長春花生物鹼包括長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)或長春瑞濱(vinorelbine)，或彼等之混合物。紫杉烷包括但不限於太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)，或彼等之混合物。可與本發明揭示之抗原結合蛋白組合投予之細胞毒性抗體通常能與B細胞上之細胞表面受體專一性結合，這些受體包括CD11a、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD34、CD37、CD38、CD40、CD45、CD52、CD80、CD86、IL-4R、IL-6R、IL-8R、IL-13、IL-13R、α-4/β-1整合素(VLA4)、BLYS受體、細胞表面遺傳性型Ig、腫瘤壞死因子(TNF)，或彼等之混合。因此，細胞毒性抗體可為依法利珠單抗(efalizumab)(RAPTIVA)、利妥昔單抗(rituximab)(RITUXAN)、達利珠單抗(daclizumab)(ZENAPAX)、依帕珠單抗(epratuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)(SIMULECT)、抗CD52(CAMPATH)、那他珠單抗(natalizumab)、英利昔單抗(infliximab) (REMICADE)及類似物。免疫抑制劑包括但不限於糖皮質素、鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、抗增生/抗代謝劑或免疫抑制抗體。在一實施態樣中，該等劑為依扥泊苷(etoposide)(VP-16)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(taxol)、ara-C(阿糖胞苷(cytarabine))、長春新鹼(vincristine)、噻氨酯噠唑(nocodazole)、秋水仙鹼(colchicine)、正定黴素(daunorubicin)、細胞鬆弛素、海綿環肽(jasplakinolide)及類似物。

在本發明之一實施態樣中，該醫藥組成物所包含之至少一種此處揭示之結合蛋白係與效應物偶合，如卡利奇黴素(calicheamicin)、耳抑素-PE(Auristatin-PE)、放射性同位素或毒性化學治療劑如膠達納黴素(geldanamycin)及美坦素(maytansine)。特別是，這些結合蛋白共軛物可用於靶向表現CDIM之細胞，例如癌細胞以供清除。

另外，使此處揭示之結合蛋白與放射性同位素連接，提供腫瘤治療之優點。與化學治療及其他形式之癌治療不同的是，放射性免疫治療或投予放射性同位素-結合蛋白之組合可直接以癌細胞為標靶，因此對周圍正常健康組織之傷害最小。利用這種「神奇子彈」，病患可以遠少於目前可用之其他形式之治療的放射性同位素之量治療。一些放射性同位素包括釔⁹⁰(⁹⁰Y)、銦¹¹¹(¹¹¹In)、¹³¹碘、⁹⁹鎝、放射性銀-111、放射性銀-199及鉍²¹³。放射性同位素與結合蛋白之連接可利用例如習用之雙官能性螯合劑進行。由於銀及金可以單價狀態存在，因此在連接放射性銀-111及放射性銀-199時可使用硫基底之連接劑(Hazra et al.(1994)Cell Biophys.24-25：1-7)。銀放射性同位素之連接可能涉及以抗壞血酸還原免疫球蛋白。另外，替坦(tiuxetan)是一種與伊莫單抗(ibritumomab)連接以形成替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(澤娃靈(Zevalin))之MX-DTPA連接螯合劑(Witzig,T.E.(2001)Cancer Chemother.Pharmacol.48 Suppl 1：91-5)。替伊莫單抗可分別與放射性同位素諸如銦¹¹¹(¹¹¹In)或⁹⁰Y反應以形成¹¹¹In-替伊莫單抗及⁹⁰Y-替伊莫單抗。

另外，此處所揭示之結合蛋白，特別是當用於治療癌時，可能與毒性化學治療藥物共軛，諸如卡利奇黴素(calicheamicin)(Hamann et al.(2002)Bioconjug.Chem.13：40-46)、膠達納黴素(Mandler et al.(2002)J.Natl.Cancer Inst.,92：1549-1951)及美坦素例如類美坦素藥物DM1(Liu et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：8618-8623)。在酸性或還原條件下或暴露至特定蛋白酶時釋放該藥物之不同連接子可被用於此技術。根據本發明，此處揭示之結合蛋白可如習知技藝所述加以共軛。

舉例來說，耳抑素-PE是一種抗微管劑，其為海洋無殼軟體動物肽組成份海兔毒素(dolastatin)10之結構修飾物。耳抑素-PE具有抗腫瘤活性及抗腫瘤血管活性(Otani et al.(2000)Jpn.J.Cancer Res.91：837-44)。舉例來說，耳抑素-PE抑制胰癌細胞系之細胞生長及誘發細胞週期停止及細胞凋亡(Li et al.(1999)Int.J.Mol.Med.3：647-653)。因此，為了使耳抑素-PE之抗腫瘤活性及抗腫瘤血管活性特異性地針對特定腫瘤，耳抑素-PE可與此處揭示之結合蛋白共軛。

欲有效達成此用途之給藥時程及量，即「給藥方案」，將依許多因素而定，包括疾病或病況之期別、疾病或病況之嚴重性、不良反應之嚴重性、病患整體健康狀態、病患身體狀況、年齡及類似因素。在計算病患之給藥方案時，投藥模式亦應列入考慮因素。給藥方案也必須考慮藥物動力學，即吸收速率、生物可利用性、代謝、廓清及類似因素(見例如Liedtke et al.(2012)Haematologica 97(1)：30-37)。

現有技藝能讓醫師決定每位個別病患之給藥方案。CDIM結合蛋白可被單獨投予或與其他化合物組合投予。若與其他化合物組合投予，將可預期較佳之病患反應及更持久之結果。該經組合之化合物可能以協同或加成方式作用。

以下提供作為示範性實例之CDIM結合蛋白使用指南，當實施此處揭示之方法時，其可被用來據以決定給藥方案，即任何經投予之CDIM結合蛋白的投藥時程及給藥量。CDIM結合蛋白之臨床療效可藉由共投第二化合物如長春新鹼(vincristine)或類似劑加以增強。同樣地，小分子化學治療劑之療效亦可藉由與CDIM抗原結合蛋白共投加以增強。CDIM結合蛋白之有效劑量範圍約自 0.25mg/kg至100mg/kg。單次或多次投予之CDIM結合蛋白調製劑，可依照病患所需及可耐受之劑量和頻率投予，該等病患罹患淋巴樣癌或白血病(如B細胞急性淋巴胚細胞白血病或ALL)、任何形式之涉及B細胞之自體免疫疾病(如類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡或SLE)，或任何形式之B細胞過度增生如淋巴瘤及骨髓瘤(如非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤)及/或相關病況。該等調製劑應提供足夠量之CDIM結合蛋白以有效改善該病況。舉例來說，此處揭示之44種抗原結合蛋白中之任一種可經由單一療法(即無其他醫藥)或與例如長春新鹼(vincristine)或其他劑(見上)組合投予給病患。對B細胞上之CDIM表位具有專一結合性之抗原結合蛋白可以自約2.5至約3000mg/m²、或更佳地自約25至1000mg/m²，或特別是約75、150、300或600mg/m²之劑量投予。在其他態樣中，該抗體係以自約0.25mg/kg至約100mg/kg之劑量投予，且更佳地為1.25、2.5、5、10或20mg/kg。該抗CDIM抗體通常係每周投予一次，在一些實施態樣中，每周投予超過一次，以每天一次之頻率投予。其他細胞毒性抗體可以組合療法之形式，以每周10至375mg/m²之量投予四周，或以每周0.4至20mg/kg投予2至10周。在一實施態樣中，CDIM結合蛋白目前以單一療法之形式，每天以自約0.25mg/kg至約100mg/kg之量投予至病患。在另一實施態樣中，CDIM結合蛋白以自約0.15mg/kg至約50mg/kg之量，與第二劑以組合療法之形式每天投予至病患，該第二劑係選自長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)或彼等之混合物。

值得注意的是，經投予至病患之特定CDIM結合蛋白之劑量可隨年齡、疾病程度、藥物耐受性、共投藥物及共病狀況而異。CDIM結合蛋白可與另一藥物組合投予至病患，以增強該CDIM結合蛋白之效應並減少不良反應。使用第二藥物時，共投之CDIM結合蛋白之活性可被增強自10%至90%，該組合療法將持續進行，直到認為該組合療法不再有利或必要。該等CDIM結合蛋白可同時投予至病患，或彼此在特定時間間隔內投予。不同的CDIM結合蛋白可以分開之丸劑或錠劑或以組合丸劑之形式同時投予至病患。

疾病和病狀

本發明之CDIM結合蛋白可用於治療罹患下列疾病或病狀之病患：淋巴樣癌或白血病、任何形式之涉及B細胞之自體免疫疾病，或任何形式之B細胞過度增生，如急性或慢性白血病、淋巴瘤及骨髓瘤及/或相關疾病。特徵為B細胞過度增生之任何病況，包括淋巴樣癌、病毒感染、免疫不全或自體免疫疾病，皆可利用CDIM結合蛋白治療。類似地，任何表現CDIM表位或類CDIM抗原之腫瘤細胞或癌細胞，皆可利用CDIM結合蛋白治療。

本發明提供經改善之CDIM結合蛋白，以用於選擇性殺滅及除盡與自體免疫有關之疾病中的B細胞，該等疾病包括但不限於多發性硬化症、類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、重症肌無力、尋常天皰瘡、葛瑞夫茲(Grave)病及自體免疫血小板減少症。自體反應性B細胞會分泌以自體蛋白為目標之自體抗體。B淋巴細胞不僅產生自體抗體，但也具有與它們產製抗體之功能無關之重要調節功能。此與自體免疫有重要關係，因為自體反應性B細胞具有活化致病性T細胞，使之產製促發炎細胞介素之能力。重症肌無力、尋常天皰瘡、葛瑞夫茲(Grave)病及自體免疫血小板減少症即為由致病性抗體驅動臨床表型之疾病的良好實例(見Browning,J.F，同上)。此外，自體免疫疾病導致過度活化及增加數量之B細胞，這些B細胞應該被移除，以防止大量發炎及組織傷害。因此，除盡B淋巴細胞對於該等自體免疫疾病之治療有好處。由於許多風濕性自體免疫疾病如類風濕性關節炎之治療主要倚賴使用細胞毒性免疫抑制劑及皮質類固醇，病患通常會出現其他嚴重不良反應。除此之外，病患復發率仍然很高。因此需要提供更安全且更有效之藥物，像是本發明之CDIM結合蛋白。

淋巴樣癌係指B細胞來源之任何急性或慢性白血病或淋巴瘤，包括但不限於急性淋巴細胞性白血病(ALL)、非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、伯奇(Burkitt)氏淋巴瘤、B祖細胞ALL、成年ALL、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)及瓦登斯壯(Waldenstrom)氏大球蛋白血症。該CDIM結合蛋白與被發現位於癌性B細胞上之表位CDIM結合。

為了能夠預測將對該揭示之CDIM抗原結合蛋白治療有反應之病患，可實施試管內或體內分析。在治療前可進行體內造影，藉由投予CDIM抗原結合蛋白作為共軛物，能看見受關注之組織上的CDIM抗原。可建立特定量之反應性，以允許預測病患對治療的反應。或者，這種分析可能有助於基於腫瘤負荷建立投藥參數。試管內分析可在治療前於病患之淋巴樣細胞(週邊血液、骨髓或其他)樣本進行。細胞將以CDIM抗原結合蛋白染色，利用標準流式細胞分析測定。將建立一截留值，得以預測治療後之正面結果。舉例來說，可建立預測正面結果之最小平均螢光強度。

本發明當搭配隨附之圖式一起閱讀時能被最佳理解，該等圖式作為說明實施態樣之用。然而應當瞭解，本發明並不限於該等圖式所揭示之特定實施態樣。

圖1A至D繪示具代表性之此處揭示之CDIM結合蛋白的重鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：1至22)。三個重鏈互補決定區(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及重鏈可變區之架構區(FR1、FR2及FR3)以及J_H(連結區)係經顯示。

圖1E繪示具代表性之此處揭示之CDIM結合蛋白的輕鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO：23及24)。三個輕鏈互補決定區(CDRL1、CDRL2及CDRL3)及輕鏈可變區之架構區(FR1、FR2及FR3)以及J_L(連結區)係經顯示。

圖1F繪示重鏈恆定區之胺基酸序列(Ig μ)(SEQ ID NO：25)及二個輕鏈恆定區(分別為Ig λ及Ig κ)(SEQ ID NO：26及27)，彼等被使用於此處揭示之代表性實施例。

圖2A至2V繪示此處揭示之44種抗CDIM抗體(命名為IGM1至IGM44)之完整胺基酸序列。該44種揭示抗體係藉由組合該22種揭示重鏈之各者(SEQ ID NO：28至49)與該2種揭示輕鏈之各者(SEQ ID NO：50及51)形成。

圖3繪示此處揭示之代表性H1至H22 CDIM結合蛋白之CDR3序列。各序列中之精胺酸殘基係經畫底線。

圖4A至K繪示編碼此處揭示之抗原結合蛋白的22種重鏈之示範性多核苷酸序列(SEQ ID NO：52至73)。

圖4L繪示編碼此處揭示之抗原結合蛋白的2種輕鏈(λ及κ)之示範性多核苷酸序列(SEQ ID NO：74及75)。

圖5顯示分別得自表現H1至H7(A圖)及 H9至H21(B圖)之CHO細胞的粗製細胞萃取物之天然SDS膠體。在1,048 kD處之條帶代表IgM五聚體，在1,236 kD處之條帶代表IgM六聚體。

圖6顯示CDIM結合蛋白與人B細胞系上所表現之CDIM之結合，及該揭示抗體造成之後續細胞毒性結果。收集細胞培養，利用流式細胞技術分析，使用(1)平均螢光強度以定量結合，及(2)碘化丙啶之攝取以區別活細胞及死細胞。如圖6A所示，所有廣泛劑量範圍之受測抗體皆與人B細胞系NALM-6結合。圖6B顯示該等抗體與CDIM表位結合後之細胞毒性結果。

圖7顯示該等抗體與CDIM表位結合後之細胞毒性結果。

圖8之A至E圖繪示ELISA基底之結合資料，其代表CDIM結合蛋白與非CDIM抗原之結合。使用單股DNA(ssDNA)、雙股DNA(dsDNA)、脂質A、心脂及丙二醛LDL(MDA-LDL)抗原之結果分別顯示於A至E圖。如圖所示，廣泛劑量範圍之MAb 216與所有抗原結合，相較之下，所有揭示抗體顯示顯著減少或完全缺乏之與該些選定抗原之結合。

圖9之A至F圖繪示ELISA基底之結合資料，其代表CDIM結合蛋白與非CDIM抗原之結合。使用單股DNA(ssDNA)、雙股DNA(dsDNA)、脂多醣、心脂、軟骨素及乙醯肝素抗原之結果分別顯示於A至F圖。如圖所示，廣泛劑量範圍之MAb 216與所有抗原結合，相較之下，所有揭示抗體顯示顯著減少或完全缺乏之與該些選定抗原之結合。

下列實施例係示範說明本發明之用，不應被視為對權利要求範圍之限制。

實施例1：示範性CDIM結合蛋白之產製及序列測定

質體DNA建構。所有H系列的μ鏈建構物重鏈可變區(命名為H1至H22)係由Genscript合成，在5’及3’端分別具有Xba1-Kpn1位點。所有H系列的μ鏈建構物之組合，係藉由分離各個重鏈可變區為Xba1-Kpn1片段，並以三部分接合方式，將它們與帶有μ恆定區之Kpn1-BamH1片段以及經Xba1及BamH1消化之表現載體AB11連接。該經接合之質體被轉形至勝任細菌中。該形成之選殖質體係經直接定序證實。利用Qiagen製備質體midi-preps，以提供適當量之用於轉染至CHO-S細胞之DNA。

輕鏈質體係以類似方式建構。該λ插入物係經三部分接合選殖，該可變λ區被命名為XbaI-EcoRI片段，其與EcoRI-BamHI λ恆定區片段混合，並且被接合至AB2載體中介於XbaI及BamHI位點之間。L2 κ插入物係經分離為XbaI-BamHI片段，並且被連接至AB2-κ載體之中。

以H1-H22/L2質體DNA轉染CHO-S細胞。對應重鏈及輕鏈之DNA係經製備以用於共轉染(等量之L2及H1至22)，其使用PEI技術。用於轉染之CHO-S細胞(1E⁸之對數期生長)係於RPMI1640培養基中生長。DNA與PEI係以1：2混合，此DNA：PEI混合物被加至於添加0.5x Pen/Strep、Glutamax及HT之CD OptiCHO培養基中之CHO-S細胞。於震盪燒瓶中隔夜培養後，將培養基更換成含有0.5x P/S及Glu之CD OptiCHO培養基。在轉染後第7天，藉由離心細胞以獲得細胞培養上清液(100ml)。為了特徵化這些IgM實例，取15ml之細胞培養上清液，利用Centricon濃縮離心管濃縮10倍。

22種不同的重鏈可變區之胺基酸序列係如圖1A至D所示。2種不同的輕鏈可變區之胺基酸序列係如圖1E所示。該重鏈及輕鏈之恆定區的胺基酸序列係如圖1F所示。應了解，不論κ或λ恆定區皆可被使用。該經識別及經分離之CDIM結合蛋白IGM1至IGM44的胺基酸序列係如圖2A至2V所示。H1至H22之CDR3序列係如圖3所示。

可被用於編碼該44種經揭示之CDIM結合蛋白的多核苷酸序列實例係如圖4A至L所示。應了解的是，由於基因密碼之簡併性，其他序列亦可被用於編碼該相同之胺基酸序列。該等抗體之重鏈可變區的各種互補決定區(CDRH)及架構區(FR)之序列係經測定，包括架構區1(FR1)、互補決定區1(CDRH1)、架構區2 (FR2)、互補決定區2(CDRH2)、架構區3(FR3)及互補決定區3(CDRH3)。

實施例2：製備CDIM結合蛋白

此實施例說明如何製備一些經揭示之結合蛋白。序列係由重鏈及輕鏈可變區變異體組成(κ及λ恆定區皆經編碼)。重鏈及輕鏈變異體之特定組合係經轉染至CHO細胞，即DG44 CHO細胞，進行過渡性轉染。自該初步轉染獲得10至100μg/ml之表現量。IgM抗體係藉由親和性層析純化、由膠體電泳評估，並且由細胞結合、細胞毒性試驗測試生物活性，及由ELISA試驗測試與多種生物分子之結合。由功能性試驗獲得之結果可用於引導優先候選物之選擇。一經選定後，該優先候選物被穩定轉染至CHO細胞，再次選殖至20盤(約2000孔)，由ELISA篩選最高分泌量。前50個選殖株被擴增至T75角瓶，然後再選擇最佳的24株以擴增轉移至震盪角瓶。來自這24株之IgM係經純化及定量，前6株(由IgM抗體分泌量選擇)係於甲胺喋呤(methotrexate)(50nM,100nM,200nM,400nM)之進一步篩選下生長，以促進高分泌細胞系之生長。

實施例3：利用非還原性SDS-PAGE評估IgM表現

非還原性膠體電泳是一種通常用於蛋白質體之分離方法，其根據分子質量及寡聚結構拆分蛋白質。在非還原性之條件下，蛋白雙硫鍵被完整保留，因此IgM寡聚體可被拆分成五聚體或六聚體結構。

為了證實由CHO-S細胞上清液過渡性轉染之IgM抗體表現，我們進行非還原性SDS聚丙醯胺膠體電泳，如Vorauer-Uhl,et al,J Immunol.Methods 359(2010)：21-27所述。此實施例描述如何測定過渡性轉染之IgM mAb之純度及多聚結構。感興趣之蛋白樣本係與NuPage SDS樣本緩衝液一起於室溫中培養5分鐘。在培養後，將分子量標準物及測試樣本加至膠體，以100V恆定電壓電泳約2小時，直到染料前端達到膠體底部。在電泳後，將膠體自XCell Mini-Cell設備取出，固定處理，並以Colloidal Blue染料染色。

為了顯示五聚體及六聚體形成，對CHO細胞之濃縮上清液進行非還原性SDS PAGE電泳，該等CHO細胞係經不同的CDIM結合蛋白樣本(分別為L1至L7及L9至L21)轉染，使用SDS PAGE,Life Technologies’(Carlsbad,CA)Native Page Novex 3-12% Bis-Tris膠體。

圖5顯示根據Colloidal Blue染色程序(Life Technologies,Carlsbad,CA)所染色之SDS膠體，在1,048 kD處之明顯條帶代表IgM五聚體，在1,236 kD處之明顯條帶代表IgM六聚體。如圖中所示，IgM樣本之五聚體形成(實線箭頭)比六聚體形成更為明顯。類似地，該經分離之人IgM 216主要呈現五聚體形式(虛線箭頭)，然而其分子量似乎較低，這是因為此IgM形式中包含較小之λ輕鏈。

實施例4：CDIM結合蛋白與CDIM抗原之結合

此實施例說明如何測定該揭示之抗體的結合特性。抗體係經親和性層析準備。在圖6A中，在細胞表面表現CDIM抗原之人原B細胞系NALM-6係經一系列重組IgM抗體染色。該等抗體被用來測定劑量反應，該劑量始於20μg/試管，經2倍稀釋至終濃度0.039μg。細胞以100μl體積於3% FBS/PBS於冰上染色1小時，然後經與DyLight-488共軛之抗人IgM(Jackson Immuno)1μg/ml於4 C染色20分鐘。

CDIM結合之分析係於FACScan流式細胞儀，利用CellQuest分析軟體進行。結果顯示為原始資料點，Y軸為平均螢光強度(MFI)，X軸為一級抗體之濃度(μg/100μl)。

該資料再利用GraphPad分析程式分析，以利用非線性回歸曲線擬合配適結果。各抗體之EC₅₀(μg/100μl)為：(a)IGM1 10.6，(b)IGM23 2.2，(c)IGM34 2.2，及(d)IGM36 1.7。

實施例5：由CDIM結合蛋白之細胞結合導致之細胞毒性

此實施例說明如何測定該CDIM結合蛋白之細胞毒性。人原B細胞系NALM-6係以如上圖6A所述之相同方式染色。在圖6B中，細胞殺滅係藉由測量染色1 小時後之細胞存活性評估。藉由定量未攝取碘化丙啶之細胞比例，可計算存活細胞百分比。結果顯示為原始資料，Y軸為存活%，X軸為濃度(μg/100μl)。

相同結果利用GraphPad分析程式作圖，利用非線性回歸曲線擬合配適資料。利用上述相同方法計算各抗體之EC₅₀。各抗體之EC₅₀(μg/100μl)為：(a)IGM1 3.0，(b)IGM23 0.6，(c)IGM34 0.6，及(d)IGM36 0.3。

由圖6A及6B之結果顯示，廣泛劑量範圍之該揭示抗體皆與人B細胞結合，這些抗體對B細胞具細胞毒性，導致細胞死亡。

實施例6：由人補體依賴性細胞毒性試驗測試CDIM結合蛋白之細胞毒性

「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在時溶解目標細胞。典型補體途徑之活化係始於補體系統之第一成份(C1q)與抗體結合，該抗體係與彼等之同源抗原結合。為了評估補體活化，可進行例如Hinton et al,J.Immunol.2006 Jan 1；176(1)：346-56所述之CDC檢測。簡言之，此實施例說明如何測定該CDIM結合蛋白之細胞毒性。人原B細胞NALM-6(50,000)係經接種於96孔平底微滴定盤。添加最佳測試稀釋倍數之人補體，並添加或不添加含有感興趣之表現抗體之連續稀釋上清液。經24小時後，添加比色受質CCK8反應3小時，然後在微量孔盤讀取儀上測量在450nm波長之光學密度(OD)。該OD定量之增加係與存活之增生性NALM-6細胞成正比。不含上清液之未經處理之Nalm6的OD被用來當作100%計算，再據此正常化上清液OD值以獲得存活百分比。在圖8中，結果以Y軸之存活百分比及X軸之上清液抗體濃度(ug/ml)作圖顯示。這些結果利用GraphPad程式分析，資料利用四參數非線性回歸曲線擬合模型化。利用上述相同方法計算各抗體之IC50。

實施例7：CDIM結合蛋白與非CDIM抗原之結合

此實施例說明CDIM結合蛋白與非CDIM抗原之結合特異性。抗體係經親和性層析純化。利用市售ELISA套組測試廣泛劑量範圍之抗體與多種可得抗原之結合。ELISA盤預先經這些抗原包覆：ssDNA(Inova Diagnostics,Inc,San Diego,CA)、dsDNA(Inova Diagnostics,Inc.,San Diego,CA.)、心脂(Inova Diagnostics,Inc.,San Diego,CA.)、MDA-LDL(經丙二醛修飾之低密度脂蛋白)(Rocky Mountain Diagnostics,Colorado Springs,CO.)，這些抗原購自不同廠商。脂質A(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)係買來作為抗原，將其溶解於乙醇，以100mM碳酸鈉緩衝液pH 9.5稀釋，然後將其包覆於ELISA盤上。抗CDIM抗體係以所示濃度使用，並根據廠商建議實施ELISA。簡言之，孔盤係以BSA奶粉封閉1小時，然後清洗。添加所示濃度之該揭示抗體。讓該抗體於室溫中結合1.5小時，然後進行清洗步驟。添加經HRP共軛之抗人IgM抗體，然後添加受質。結果以450nm之吸光度定量(Bio-Tek Synergy HT)。如圖8及9所示，MAb 216與所有受測抗原結合，然而每種揭示抗體皆顯示結合降低(ssDNA)或完全清除對抗原之特異性(心脂)。這些結果顯示，該揭示抗體比MAb 216具有更嚴格之抗原結合特異性。

表2摘列此處揭示之各種CDIM結合蛋白之效價及特異性特徵。

表2摘列圖6及圖7A至7F顯示之分別包含重鏈可變區H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18、H19、H20及H21之CDIM結合蛋白的資料。該ELISA值係指在過渡性轉染IgM重鏈及輕鏈後之條件培養基中測得之IgM濃度。該細胞毒性IC₅₀係指在培養IgM抗體與人補體及Nalm-6細胞時，導致50%細胞死亡之抗體的一半最大濃度(亦見圖6)。該IC₅₀值代表此處揭示之各種CDIM結合蛋白之效價。

與其他抗原之額外結合(LPS、ssDNA、dsDNA等)係如ELISA形式中觀察到之結合(亦見圖9A至9F)。IgM樣本與各種抗原之相對反應性係根據當IgM為10μg/ml時之最大反應(OD₄₅₀nm)。該顯示之值代表各種CDIM結合蛋白非特異性反應之值。相對反應性之得分如下：OD₄₅₀為0至0.3，得分給予(-)負分。當最大ELISA值分別為0.3至1、1至2、2至3及3以上，給予(+)、(++)、(+++)及(++++)之得分。

本發明之各種修飾及變化將為該領域之技藝人士所顯見，其不背離本發明之範圍及精神。雖然本發明描述特定實施態樣，當能了解申請專利範圍不應被不當限制於該等特定實施態樣。事實上，用於實施本發明之所述模式的各種修飾為該領域之技藝人士所理解，且意圖屬於該權利要求範圍之內。

<110> 尼爾森泰(TENG,NELSON N.H.) 倪立馬巴哈特(BHAT,NEELIMA M.) 瑪沙畢伯(BIEBER,MARCIA M.) 布魯斯基特(KEYT,BRUCE A.)

<120> 細胞死亡誘導分子(CDIM)結合蛋白類及彼等之用途

<130> 0155-005001

<140>

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<150> 61/633,330

<151> 2012-02-08

<160> 108

<170> PatentIn version 3.5

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<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 18

<210> 19

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 19

<210> 20

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 20

<210> 21

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 21

<210> 22

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 22

<210> 23

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 23

<210> 24

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 24

<210> 25

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 25

<210> 26

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 26

<210> 27

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 27

<210> 28

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 28

<210> 29

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 29

<210> 30

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 30

<210> 31

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 31

<210> 32

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 32

<210> 33

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 33

<210> 34

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 34

<210> 35

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 35

<210> 36

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 36

<210> 37

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 37

<210> 38

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 38

<210> 39

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 39

<210> 40

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 40

<210> 41

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 41

<210> 42

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 42

<210> 43

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 43

<210> 44

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 44

<210> 45

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 45

<210> 46

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 46

<210> 47

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 47

<210> 48

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 48

<210> 49

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 49

<210> 50

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 50

<210> 51

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽

<400> 51

<210> 52

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多肽多核苷酸

<400> 52

<210> 53

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 53

<210> 54

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 54

<210> 55

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 55

<210> 56

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 56

<210> 57

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 57

<210> 58

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 58

<210> 59

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 59

<210> 60

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 60

<210> 61

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 61

<210> 62

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 62

<210> 63

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 63

<210> 64

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 64

<210> 65

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 65

<210> 66

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 66

<210> 67

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 67

<210> 68

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 68

<210> 69

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 69

<210> 70

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 70

<210> 71

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 71

<210> 72

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 72

<210> 73

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 73

<210> 74

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 74

<210> 75

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性多核苷酸

<400> 75

<210> 76

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 76

<210> 77

<21> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 77

<210> 78

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 78

<210> 79

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 79

<210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 80

<210> 81

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 81

<210> 82

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 82

<210> 83

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 83

<210> 84

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 84

<210> 85

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 85

<210> 86

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 86

<210> 87

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 87

<210> 88

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 88

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 89

<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 90

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 91

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 92

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 93

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 94

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 95

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 96

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 97

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 98

<210> 99

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 99

<210> 100

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 100

<210> 101

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 101

<210> 102

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 102

<210> 103

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 103

<210> 104

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 104

<210> 105

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 105

<210> 106

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 106

<210> 107

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 107

<210> 108

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成性肽

<400> 108

Claims

一種與細胞死亡誘導分子(CDIM)結合之經分離之抗原結合蛋白，其包含重鏈，該重鏈包含互補決定區3(CDRH3)，該CDRH3具有如SEQ ID NO：78至99中任一者所示之序列。
如申請專利範圍第1項之抗體，其另包含輕鏈，該輕鏈包含互補決定區3(CDRL3)，該CDRL3具有如SEQ ID NO：104或105之任一者所示之序列。
如申請專利範圍第1項之經分離之抗原結合蛋白，其實質上不與單股DNA(ssDNA)、雙股DNA(dsDNA)、脂多醣、心脂、軟骨素及乙醯肝素交叉反應。
如申請專利範圍第1項之經分離之抗原結合蛋白，其另包含重鏈，該重鏈包含如SEQ ID NO：1至22中任一者所示之架構區1(FR1)。
如申請專利範圍第1項之經分離之抗原結合蛋白，其另包含：(a)包含CDRH1及CDRH2之重鏈，該CDRH1具有如SEQ ID NO：76所示之序列，且該CDRH2具有如SEQ ID NO：77所示之序列；及(b)包含CDRL1及CDRL2之輕鏈，該CDRL1具有如SEQ ID NO：100或102所示之序列，且該CDRL2具有如SEQ ID NO：101或103所示之序列。
如申請專利範圍第5項之經分離之抗原結合蛋白，其另包含重鏈，該重鏈包含FR1，該FR1具有如SEQ ID NO：1至22中任一者所示之序列。
一種與CDIM結合之經分離之抗原結合蛋白，其包含選自SEQ ID NO：1至22之重鏈可變區。
一種與CDIM結合之經分離之抗原結合蛋白，其包含選自SEQ ID NO：23或24之輕鏈可變區。
一種與CDIM結合之經分離之抗原結合蛋白，其包含選自SEQ ID NO：1至22之重鏈序列及選自SEQ ID NO：23或24之輕鏈序列。
一種與CDIM結合之經分離之抗原結合蛋白，其包含重鏈CDR3序列X₁X₂X₃AX₄GX₅SX₆X₇，其中：X₁係G、A或R；X₂係R、G或A；X₃係M、T或R；X₄係R、W或Y；X₅係A、S或G；X₆係I、V或Y；且X₇係N或無胺基酸；且其中在位置1至3(相對於重鏈可變區之位置98至100，位置97係位於該CDR3區之前的不可變之精胺酸)存有一個且不超過一個精胺酸。
如申請專利範圍第10項之經分離之結合蛋白，其中： X₁係G、A或R；X₂係R、G或A；X₃係M、T或R；X₄係R或W；X₅係A或S；X₆係I或V；且X₇係N或無胺基酸。
如申請專利範圍第10項之經分離之抗原結合蛋白，其另包含重鏈CDR2序列：EINHSGSTNYNPSLKS(位置50至65)，且其中位置53之His53可經酪胺酸取代。
如申請專利範圍第12項之經分離之抗原結合蛋白，其另包含重鏈CDR1序列：FSGYYWS(位置29至35)，且其中位置35之Ser35可經蘇胺酸取代。
如申請專利範圍第10項之經分離之抗原結合蛋白，其實質上不與單股DNA(ssDNA)、雙股DNA(dsDNA)、脂多醣、心脂、軟骨素及肝素交叉反應。
一種與CDIM結合之經分離之抗原結合蛋白，其包含(a)選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14之重鏈可變區；及(b)選自SEQ ID NO：23或SEQ ID：24之輕鏈可變區。
一種經分離之抗原結合蛋白，其與包含SEQ ID NO：1至22之重鏈可變區序列中任一者之抗體競爭與CDIM之結合。
如申請專利範圍第16項之經分離之抗原結合蛋白，其與CDIM結合之效力比MAb 216強五倍。
如申請專利範圍第16項之經分離之抗原結合蛋白，其與CDIM結合之效力比MAb 216強十倍。
如申請專利範圍第16項之經分離之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白與單股DNA(ssDNA)、雙股DNA(dsDNA)、脂多醣、心脂、軟骨素及/或肝素之結合相較於MAb 216低二倍。
如申請專利範圍第1至19項中任一項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係單株抗體、多株抗體、重組抗體、人抗體、人化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或彼等之抗體片段。
如申請專利範圍第20項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗體片段係Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段、Fv片段、雙價抗體或單鏈抗體分子。
如申請專利範圍第20項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係人抗體。
如申請專利範圍第20項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係單株抗體。
如申請專利範圍第20項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係選自IgA、IgD、IgM、IgG或IgE。
如申請專利範圍第24項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係IgM。
如申請專利範圍第25項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係與標記基團偶合。
如申請專利範圍第26項之經分離之抗原結合蛋白，其中該標記基團係放射性同位素、放射性核種、螢光基團、酶催化基團、化學發光基團、生物素化基團或預先測定之多肽基團。
如申請專利範圍第1至19項中任一項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係與效應物基團偶合。
如申請專利範圍第28項之經分離之抗原結合蛋白，其中該效應物基團係放射性同位素、放射性核種、毒素、治療性基團或化學治療性基團。
如申請專利範圍第29項之經分離之抗原結合蛋白，其中該治療性或化學治療性基團係選自卡利奇黴素(calicheamicin)、耳抑素-PE(auristatin-PE)、膠達納黴素(geldanamycin)、美坦素(maytansine)或彼等之衍生物。
如申請專利範圍第20項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白之特徵係(a)存有J鏈或(b)無J鏈。
一種如申請專利範圍第25項之抗原結合蛋白之混合物，其中該混合物係包含五聚體及六聚體之混合物。
一種醫藥組成物，其包含作為活性劑之至少一種如申請專利範圍第1項之經分離之結合蛋白及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或佐劑。
如申請專利範圍第33項之組成物，其係用於治療用途。
如申請專利範圍第33項之組成物，其係用於診斷用途。
一種套組，其包含如申請專利範圍第1項之經分離之結合蛋白。
如申請專利範圍第36項之套組，其包含其他治療劑。
如申請專利範圍第37項之套組，其中該其他治療劑係抗腫瘤劑。
如申請專利範圍第38項之套組，其中該抗腫瘤劑係抗腫瘤抗體或化學治療劑。
一種用於治療與異常B細胞增生有關之疾病之方法，該方法包含對需要治療之病患投予如申請專利範圍第33項之醫藥組成物。
如申請專利範圍第40項之方法，其中該疾病係選自淋巴樣癌或白血病。
如申請專利範圍第41項之方法，其中該白血病係B細胞急性淋巴胚細胞白血病(ALL)。
如申請專利範圍第40項之方法，其中該疾病係涉及B細胞之自體免疫疾病。
如申請專利範圍第40項之方法，其中該疾病係類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、多發性硬化症或B細胞過度增生之形式。
如申請專利範圍第44項之方法，其中該B細胞過度增生之形式包括急性或慢性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤。
如申請專利範圍第45項之方法，其中該疾病係特徵為B細胞過度增生之任何病況，其包括淋巴樣癌、病毒感染、免疫不全及自體免疫疾病。
如申請專利範圍第40項之方法，其中選自依扥泊苷(Etoposide)(VP-16)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(Taxol)、Ara-C(阿糖胞苷(Cytarabine))、長春新鹼(Vincristine)、噻氨酯噠唑(Nocodazole)、秋水仙鹼(Colchicine)、正定黴素(Daunorubicin)、細胞鬆弛素(Cytochalasin)或海綿環肽(Jasplakinolide)之化學治療性化合物係與該醫藥組成物共投。
如申請專利範圍第40項之方法，其中該疾病係特徵為與如申請專利範圍第1至19項之抗原結合蛋白結合之實質腫瘤。
一種用於診斷與異常B細胞增生有關之疾病之方法，該方法包含使含有B細胞之病患樣本與如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗原結合蛋白接觸。
一種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至19項中任一項之抗原結合蛋白。
一種重組表現系統，其包含如申請專利範圍第50項之編碼多核苷酸，該編碼多核苷酸與使其有效表現之序列可操作性連接。
一種重組宿主細胞，其包含如申請專利範圍第51項之表現系統。
如申請專利範圍第52項之重組宿主細胞，其中該宿主細胞係真核宿主細胞。
如申請專利範圍第53項之重組宿主細胞，其中該宿主細胞係酵母菌細胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
一種製備抗原結合蛋白之方法，該方法包含培養如申請專利範圍第52項之細胞及收集該蛋白。