TR201807939T4 - Kimerik antijen reseptörü. - Google Patents

Abstract

Aşağıdakileri içeren bir disialogangliosit (GD2) bağlayıcı domeni içeren bir kimerik antijen reseptörün (CAR) provizyonudur: - a) aşağıda belirtilen diziler ile tamamlayıcılığı belirleyen bölgelere (CDR'ler) sahip olan bir ağır zincir değişken bölgesi (VH): - b) aşağıda belirtilen diziler ile CDR'lere sahip hafif zincir değişken bölgesi (VL): bu tür bir CAR'yi eksprese eden T hücreleri, bazı kanserlerin tedavisinde faydalıdır.

Description

TARIFNAME KIMERIK ANTIJEN RESEPTÖRÜ BULUS SAHASI Mevcut bulus, kanser antijen disialogangliositi (GD2) baglayan kimerik antijen reseptörüne (CAR) iliskindir. Bu tür bir CAR"si eksprese eden T hücreleri, nöroblastom gibi kanseröz hastaliklarin tedavisinde faydalidir. BULUSUN ALT YAPISI Disialogangliosit (GD2, pubchem: 6450346), birincil olarak hücre yüzeyinde eksprese edilen siyalik asit içeren bir glikosfingolipiddir. Bu karbohidrat antijenin islevi, tam olarak anlasilamamistir ancak tümör hücrelerinin ekstraselüler matris proteinlerine baglanmasinda önemli bir rol oynadigi düsünülmektedir. GD2; nöroblastom üzerinde yogun, homojen ve neredeyse evrensel olarak eksprese edilir. Normal dokularda GD2 ekspresyonu, büyük ölçüde cilt melanositleri ve periferik agri lifi miyelin kiliflari ile sinirlidir. CNS içerisinde GD2, embriyonik bir antijen olarak görünmektedir ancak saçilmis oligodendrositlerde ve posterior hipofiz bezi içerisinde belirsiz bir sekilde eksprese edilir. Bu da GD2'yi, hedeflenen anti tümör tedavisi için uygun hale getirir. Anti-GD2 antikorlari, nöroblastomda bir tedavi olarak kapsamli sekilde test edilmistir. Iki izotopun lgG2a'ya (14g2a) geçmesinden sonra ve son olarak ch14.18`i olusturmak için insan IgG1 ile kimerizasyondan sonra bir fare IgG3'ü olarak test edilmistir. Bu sonuncu antikor, randomize bir çalismada açik bir etkinlige yol açmistir: ABD Çocuk Onkoloji Grubu, ilk tedaviden sonra radyolojik gerileme saglayan yüksek riskli nöroblastomali çocuklarda ch14218'in randomize faz Ill çalismasini bildirdi. Bu hastalarda ortalamq 2.1 yillik takip süresi ile ch14:18 kolunda EFS'de %20 gelisme vardi. Önemli olarak en yaygin haliyle Nöropatiye neden olan kronik bir agri ve daha az yaygin haliyle oftalmopleji olan nörotoksisite bu ajanlarla birlikte temel doz sinirlayici toksisitedir. Bu terapötik mAb'Ierin aritilmasina devam edilmistir: ch14.18'den türetilen bir IL-2 immünositokini açiklanmistir. Bu, minimal rezidüel hastalik üzerinde bazi etkilere sahip olan, ancak hacimli hastaliga karsi hiçbir etkisi olmayan oldukça toksik bir ajandir. Ch14.18, tamamen hümanizedir ve Fc, tümleyici aktivasyonu inhibe etmek için mutasyona ugradi. Ch14.18'in bu ihümanize versiyonu, klinik bir çalismada yer almistir ancak sadece çok sinirli sayida veri mevcuttur. 3F8 antikorunun hümanize edilmesi de açiklanmistir. GD2 seroterapisindeki klinik veriler umut verici olsa da, sürekli tam remisyonlar halen sinirlidir ve minimal hastalik ayarlari disinda antikorlar için klinik olarak yararli bir rol için hiçbir kanit yoktur. Dolayisiyla, nöroblastom ve diger GD2'yi eksprese eden kanserlerin tedavisinde iyilestirilmis terapötik yaklasimlara ihtiyaç vardir. Kimerik Antijen Reseptörleri (CAR'Ier) Kimerik antijen reseptörleri, normal formatinda, bir T-hücresinin efektör fonksiyonuna bir monoklonal antikorun (mAb) özgünlügünü ileten proteinlerdir. Normal sekli, bir antijen tanima amino ucu, bir aralayici, bir T-hücre sagkalimini ve aktivasyon sinyallerini ileten bir bilesik endodomenine bagli olan bir transmembran domenine sahip bir tip l transmembran domen proteinidir (bakiniz Sekil 1a). Bu moleküllerin en yaygin sekli, bir aralayici ve sinyal endodomenine bir transmembran domeni yoluyla kaynastirilmis bir hedef antijeni taniyan monoklonal antikorlardan türevlenen basit Zincirli degisken parçaciklarin (scFv) füzyonlaridir. Bu tür moleküller, hedefinin scFv'si yoluyla tanimaya karsilik olarak T-hücresinin aktivasyonu ile sonuçlanir. T hücreleri bu tür bir CAR'yi eksprese ettiginde, hedef antijeni eksprese eden hedef hücreleri tanir ve öldürürler. Tümöre iliskin antijenlere karsi çesitli CAR'Ier gelistirilmistir ve bu tür CAR eksprese edici T hücrelerini kullanarak adoptif aktarim yaklasimlari halen çesitli kanserlerin tedavisi için klinik çalismadadir. GD2iye karsi kimerik antijen reseptörleri, antijen baglayici domenin, scFv 1492a'ya Bir 14gZa-CD28-OX40-g CAR'yi eksprese eden insan T hücrelerinin, bazi anti tümör aktivitesine sahip oldugu ancak hastaligi tamamen yok edemedigini gösterdi (yukarida belirtilen sekilde Yvon et al (2009)). Mevcut bulusçular, gelismis özelliklere sahip bir alternatif GD2'yi hedefleyen CAR yapmayi arastirmaktadir. SEKILLERIN AÇIKLAMASI Sekil 1 - Kimerik Antijen Reseptörü (CAR) tasarimi. (a) bir CAR'nin jeneralize mimarisi: Baglayici bir domen, antijeni tanir; aralayici, baglayici domeni hücre yüzeyinden yükseltir; trans-membran domeni, proteini membrana baglar ve endodomen, sinyalleri iletir. (b) ila (d): CAR endodomenlerinin farkli jenerasyonlari ve permütasyonlari: (b) ilk olarak FccR1-y veya CDs-Zeta endodomeni yoluyla sadece iletilen ITAM sinyalleri tasarlar, daha sonra ilave (c) bir veya (d) cis içerisinde iki ko-stimulatuvar sinyali iletmek üzere tasarlar. Sekil 2 - Yapilandirilan anti-GD2 CAR'Ierinin varyantlari (a) insan IgG1 aralayicisi ve CD28-OX40-Zeta endodomeni ile scFv gibi fare KM666 antikorunu kullanarak anti-GD2 CAR; (b) (a) ile ayni formatta Nakamura hümanize antikoru huKM666'yi kullanarak anti-GD2 CAR'si; (0) FC domeninin, Fc reseptörü tanima motiflerini çikarmak üzere degistirilmesi haricinde (b) ile ayni format; (d) aralayicinin IgG1 mentesesi - CD8 sapi olmasi haricinde (c) ile ayni; (e) aralayicinin yalniz CD8 sapi olmasi haricinde (c) ile ayni; (f) aralayicinin yalniz lgG1 mentesesi olmasi haricinde (c) ile ayni. Sekil 3 - muKM 3 normal donörden periferik kan T-hücreleri üzerinde ekspresyon; (b) bir histogram olarak gösterilen bu çizimlerin ortalama flüoresan yogunlugu; (c) transduse edilmemis, muKM666 ve huKM666 transduse T-hücrelerini A ve LAN-1 (GD2 pozitif) hedeflerine karsi efektör olarak kullanarak krom serbestleme tayini; (d) ayni yüklemeden lL-2 üretimi; (e) ayni yüklemeden interferon-gama üretimi; ve (f) ayni Sekil 4. (a) CAR ile CD34 markör geninin 111 birlikte ekspresyonuna Izin veren retroviral yapi; (b) CAR ekspresonu (HA etiketi) ve CD34 markör genininin akis sitometrik analizi; (c) Dönüstürülmemis T-hücrelerinin ve GD2 pozitif hedeflerine (LAN- 1) ve GD2 negatif hedeflerine (A204) karsi 3 farkli CAR varyanti ile dönüstürülmüs T- hücrelerinin krom serbestleme tayini; (d) interferon gama serbestlemesi; (e) lL-2 serbestlemesi; ve (f) ayni hedeflerin ve efektörlerin proliferasyonu. Sekil 5 - FC aralayicisina mutasyonlari bozan FcR baglayicisinin dahil edilmesi (a) dahil edilen mutasyonlar; (b) anti-FC boyamasi ile belirlenen sekilde CAR'nin ekspresyonu: dönüstürülmemis, vvt ve mutasyona ugramis; (c) dönüstürülmemis, wt Fc ve mutasyona ugramis Fc anti-GD2 CAR T hücreleri ile GD2 negatif ve GD2 pozitif hedeflerin öldürülmesi; (d) FcR eksprese edici hücre hatti THP-1 ile dönüstürülmemis, wt Fc ve mutasyona ugramis Fc anti-GD2 T hücrelerinin aktivasyonu; dönüstürülmemis, wt Fc ve mutasyona ugramis Fc CAR T hücrelerine karsilik olarak THP-1 hücre hatti yoluyla IL-1 Beta serbestlemesi. Sekil 6 - Ekspresyon Kasetinin optimizasyonu (a) kasete uygulanan harita optimizasyonlari: SAR veya CHS4; (b) wt veya kodon ile optimize edilen açik okuma çerçevesi ile farkli modifikasyonlarla CAR"nin temsili ekspresyonu. SAR yapisi, istenilen ekspresyonun siki bir pikini verir. (0) 3 normal donörden bu FACS verilerinin çubuk grafik temsili. Sekil 7 - Farkli endodomenlerin kiyaslamasi Üç farkli kimerik antijen reseptörü kiyaslandi. Reseptörlerin tümü, FcR baglanmasini ve CD28 transmembran domenini indirgemek üzere degistirilen IgG1'in Fc domeni olan huK666 scFv'den olustu. CAR "28tmZ", bir CD3 Zeta endodomenine sahiptir; "282", CD28 - CDSZeta endodomen bilesigine sahiptir; "280XZ", CD28, OX4O ve CD3Zeta'yi içeren bir bilesik endodomenidir, normal donörlerden periferik kan T hücreleri, benzer titrelerin retroviral vektörleri ile bu yapilarla dönüstürüldü. Bu farkli T-hücreleri, kontroller olarak dönüstürülmemis T-hücreleri ile birlikte kiyaslandi. T-hücreleri, A204 hücreleri (GD2 negatif olan bir rabdomiyosarkoma hücre hatti) ve LAN-1 hücreleri (GD2 pozitif olan bir nöroblastom hücre hatti) ile engellendi. Proliferasyon ve sitokin serbestlemesi, reseptör aktivitesinin 28tmZ < 282 < 280XZ oldugunu göstermektedir. Sekil 8 - iCasp9 intihar geni ile birlikte ekspresyon (A) FMD-2A dizisini kullanarak anti-GDZCAR ile iCasp9'un birlikte ekspresyonu; (b) yalniz NT T-hücrelerinde, GDZCAR dönüstürülmüs T-hücrelerinde ve iCasp9-2A- GD2CAR T-hücrelerinde ve CID ile muamele sonrasinda CAR ekspresyonu; (c) CID ile muamele edilmis veya edilmemis, dönüstürülmemis, GDZCAR dönüstürülmüs ve iCasp ve negatif (A204) hedeflerinin öldürülmesi. 5 normal donör T-hücresinin ortalamasi. Sekil 9 - RQR8 intihar geni ile birlikte ekspresyon (a) CARhuKGGGFc, bir retroviral vektörde RQR8 sinifi intihar geni ile birlikte eksprese edildi. (b) T-hücreleri, bu retroviral vektör ile dönüstürüldü ve CAR ve RQR8'in birlikte ekspresyonu, bir poliklonal anti-FC ve monoklonal antikor QBendiO ile dönüstürülen T- hücrelerini boyayarak belirlendi. (c) Bu T-hücrelerinden CAR pozitif popülasyonu, Rituksimab ve komplementin varliginda yoksun hale getirildi. (d) Rituksimab ile yoksun hale getirilen T-hüoreleri, artik GD2'yi eksprese eden hedefleri tanimadi. Sekil 10 - (a) GM3sentaz ve GD2sentazi eksprese eden bisistronik vektör. (b) Bu vektör ile dönüsen SupT1 hücreleri, GD2 pozitif hale gelir (dönüsmemis bos çizim; dönüsmüs gri renkli çizim). Sekil 11 - Asagidaki kohortlarda farelerdeki bireysel tümörlerin büyüme egrileri: sol üst: anti-GD2 CAR splenositlerini alan CT26 tümörlerini eksprese eden GD2'ye sahip fareler; sag üst: Yalanci dönüstürülmüs splenositleri alan CT26 tümörlerini eksprese eden GD2; sol alt: anti-GD2 CAR splenositlerine sahip GD2 negatif (wt) CT26 tümörleri; sag alt: ve splenosit almayan CT26 tümörlerini eksprese eden GD2 B. Sekil 2`de (b)'de gösterilen sekilde anti-GD2 CAR (huKM666-HCH2CH3-CD28OXZ - C. Sekil 2ide (0)'da gösterilen sekilde anti-GD2 CAR (huKMBöö-HCHZCHBpvaa- CD80XZ - SEQ ID No. 28) D. Sekil 2'de (d)'de gösterilen sekilde anti-GDZ CAR (huKMööö-HSTK-CD280XZ - E. Sekil 2`de (e)'de gösterilen sekilde anti-GD2 CAR (huKM666-STK-0D28XOXZ - F. Sekil 2lde (f)'de gösterilen sekilde anti-GD2 CAR (huKMööö-HNG-CD280XZ - SEQ G. Sekil 2'de (0)'de gösterilen sekilde ama 1.jenerasyon endodomen ile anti-GD2 CAR H. Sekil 2'de (c)'de gösterilen sekilde ama 2.jenerasy0n endodomen ile anti-GD2 CAR J. RQR8 intihar geni ile birlikte eksprese edilen anti-GD2 CAR - SEQ ID No. 35 Sekil 13 - GD2'nin yapisi Sekil 14 - huK test edilen yapilarin haritalari: dizi ile birlikte eksprese edilen 2.jenerasyon GD2 CAR için kodlanan retroviral vektörlerdir. Yapilar arasindaki tek fark, birinde scFv, huK666'dir ve digerinde ise 14g2a'dir. Bu yapilar ile dönüstürülen T-hücrelerine, A204 (bir GD2 negatif rabdomiyosarkoma hücre hatti) ve LAN-1 (bir GD2 pozitif hücre hatti) ile 1:1 oraninda meydan okundu. (b) 24 saatte, inteiferon-gama, üst fazdan ölçüldü. huKööö CAR T- hücreleri, daha fazla IF-G üretir. (c) Bir hafta sonra T-hücreleri sayilir, huKööö, daha fazla proliferasyon gösterir. hatti LAN1 arasindaki birlikte kültürün akis sitometrik analizi. (a) Deney kurulur. Bir haftalik birlikte kültürden sonra hücreler, hasat edildi ve akis sitometrisi yoluyla analiz edildi. CD45 ekspresyonu, Ienfoid hücrelerinden ve LAN-1 hücreleri olarak CD45- hücreleri ile Iendoif olmayan hücrelerden ayrim yapmaya Izin verdi. CD3/QBEND/1O ile diger boyama, CAR-T hücrelerinin sayimina imkan sagladi. (b) Yalniz T-hücreleri; (c) NT T-hücreleri ve LAN-1 hücreleri; (d) huK666-28-Z CAR T-hücreleri ve LAN-1 hücreleri; (e) 1492a-28-Z CAR T-hücreleri ve LAN-1 hücreleri. LAN-1 hücrelerinin bir artigi, 14gZa CAR T-hücresi birlikte kültüründe görülmüstür. BULUS AÇILARININ KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulusçular, K666 antikoruna dayanan bir GD2-baglayici domeni içeren yeni bir kimerik antijen reseptörü (CAR) hedefleyen GD2'yi yapmislardir. Anti-GD2 antikoru 14923, altin standart olarak görülebilir çünkü terapötik bir antikor olarak kullanilir ve bir CAR çalismasinda bugüne kadar test edilen tek scFv`dir (PMID: 18978797). Mevcut bulusçular, klinik çalismalarda en yaygin kullanilan CAR formati olmasindan ötürü ikinci jenerasyon formatinda CAR'ye dayanan 1492a ve huK666'yi kiyasladi. huK666 CAR T-hücrelerinin, daha fazla IFN-y serbestledigi, daha iyi çogaldigi ve 14g2a'nin denklerinden daha fazla öldügü bulundu. Bu nedenle birinci açidan mevcut bulus, asagida belirtilenleri içeren bir disialogangliosit (GDZ)-baglayici domeni içeren bir kimerik antijen reseptörü (CAR) saglar a) SEQ ID No: 10'da gösterilen diziye sahip olan bir VH domenini içeren bir agir zincir degisken bölgesi (VH) b) SEQ ID No: 12'de gösterilen diziye sahip olan bir VL domenini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi (VL). GD2 baglayici domeni, SEQ ID No.8 olarak gösterilen diziyi kapsayabilir. GD2-baglayici domeni ve transmembran domeni, bir aralayici yoluyla baglanabilir. Aralayici, asagida belirtilenlerden birini içerebilir: bir insan lgG1 Fc domeni; bir lgG1 mentesesi; bir lgG1 mentesesi-CD8 sapi; veya bir CD8 sapi. Aralayici, bir lgG1 mentesesi-CDS sapi veya bir CD8 sapini içerebilir. Aralayici, bir lgG1 Fc domeni veya bununla ilgili bir varyanti içerebilir. Aralayici, SEQ ID No. 23 veya SEQ ID No. 24 olarak gösterilen diziyi veya en az %80 dizi tanimasina sahip olan bir varyanti içeren bir lgG1 Fc domenini içerebilir. CAR, intraselüler T hücresi sinyal domenini içerebilir veya bununla ilgili olabilir. intraselüler T hücresi sinyal domeni, asagida belirtilen endodomenlerden bir veya daha fazlasini içerebilir: CD28 endodomeni; OX40 ve CD3-Zeta endodomeni. intraselüler T hücresi sinyal domeni, asagida belirtilen endodomenlerin tümünü içerebilir: 0028 endodomeni; OX40 ve CD3-Zeta endodomeni. SEO ID No. 10 ve 12'de gösterilen dizilere sahip olan bir VH ve bir VL domenini içeren CAR, SEQ lD No. 27 ila 35'ten herhangi birinde gösterilen diziyi veya en az %80 dizi tanimasina sahip ama i) GD2'yi baglama ve ii) T-hücresi sinyalini indükleme kapasitesini sürdüren bir varyanti içerebilir. Ikinci açida mevcut bulus, bulusun birinci açisina göre bir CAR'yi kodlayan bir nükleik asit dizisi saglar. Nükleik asit dizisi, kodon ile optimize edilebilir. BuIUSUn birinci açisina göre bir CAR'yi kodlayan nükleik asit dizisi, SEQ ID No. 25 olarak gösterilen diziyi veya en az %90 dizi tanimasina sahip olan bir varyanti içerebilir. Nükleik asit ayni zamanda bir intihar genini de kodlayabilir. Üçüncü açida mevcut bulus, bulusun ikinci açisina göre bir nükleik asit dizisini içeren bir vektör saglar. Dördüncü açida mevcut bulus, bulusun birinci açisina göre bir CAR'yi eksprese eden bir hücreyi saglar. Hücre, bir T hücresi veya dogal katil (NK) hücre gibi bir sitolitik immün hücre olabilir. Hücre, bulusun birinci açisina göre bir CAR`yi ve bir intihar genini birlikte eksprese edebilir. Intihar geni, örnegin, iCasp9 veya RQR8 olabilir. Besinci açida mevcut bulus, bulusun ikinci açisina göre bir nükleik asidin ex vivo olarak bir hücrenin içerisine yerlestirilmesini asamasini içeren sekilde bulusun dördüncü açisina göre bir hücreni yapim yöntemini vermektedir. Altinci açida mevcut bulus, birlikte farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici, seyreltici veya yardimci madde olarak ifade edilen sekilde bulusun üçüncü açisina göre bir vektörü veya bulusun dördüncü açisina göre bir hücreyi içeren farmasötik bir bilesimi vermektedir. Yedinci açida mevcut bulus, bulusun üçüncü açisina göre bir vektörün veya bulusun dördüncü açisina göre bir hücrenin bir denege uygulanmasi asamasini içeren sekilde kanser tedavisi için bir yöntemi vermektedir. Kanser, nöroblastom olabilir. Sekizinci açida mevcut bulus, bir kanserin tedavisinde kullanim için bulusun üçüncü açisina göre bir vektörü veya bulusun dördüncü açisina göre bir hücreyi vermektedir. DETAYLI AÇIKLAMA KIMERIK ANTIJEN RESEPTÖRLERI (CAR'LAR) Kimerik antijen reseptörleri (CAR'Ier), ayni zamanda kimerik T hücresi reseptörleri olarak da bilinir, yapay T hücresi reseptörleri ve kimerik immünoreseptörler; bir immün efektör hücrenin üzerine istege bagli bir özgünlügü nakleden tasarlanmis reseptörlerdir. Klasik bir CAR'de monoklonal bir antikorun özgünlügü, bir T hücresinin üzerine nakledilir. CAR kodlayici nükleik asitler, örnegin, retroviral vektörleri, kullanarak T hücrelerine aktarilabilir. Bu sekilde çok sayida kansere özgü T hücresi, adoptif hücre aktarimi için olusturulabilir. Bu yaklasimin Faz I klinik çalismalari, etkinligi gösterir. Bir CAR'nin hedef-antijen baglayici domeni, siklikla bir aralayici ve transmembran domeni yoluyla bir sinyal endodomenine kaynasir. CAR, hedef-antijeni baglarken bu durum, eksprese edilen T hücresine aktive edici bir sinyalin iletimi ile sonuçlanir. Mevcut bulusun CAR'si, KM666 monoklonal antikora dayanan bir GD2 baglayici Mevcut bulusun CAR`si, asagida belirtilenleri içeren bir GDZ- baglayici domeni içerir 3) SEQ ID No: 10'da gösterilen diziye sahip olan bir VH domenini içeren bir agir zincir degisken bölgesi (VH). b) SEQ ID No: 12a gösterilen diziye sahip olan bir VL domenini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi (VL). Burada açiklanan CAR, asagida belirtilenleri içeren bir GD2- baglayici domeni içerir a) asagidaki diziler ile tamamlayiciligi belirleyen bölgelere (CDR'ler) sahip bir agir zincir degisken bölgesi (VH): CDR1 - SYNIH (SEQ ID No. 1); CDR2 - VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID No. 2) CDR3 - RSDDYSWFAY (SEO ID No. 3); ve b) asagidaki diziler ile CDR'lere sahip bir hafif zincir degisken bölgesi (VL): CDR1 - RASSSVSSSYLH (SEQ ID No. 4); CDR2 - STSNLAS (SEQ ID No. 5) CDR3 - QQYSGYPIT (SEQ ID No. 6). Bulusun bir parçasi olmamakla birlikte, açiklamaya göre, GD2 baglayici aktivitesini olumsuz olarak etkilemeden her bir CDR'ye bir veya daha fazla mutasyonun (ikameler, eklemeler veya çikarmalar) dahil edilmesi mümkün olabilir. Her bir CDR, örnegin, bir, iki veya üç amino asit mutasyonlarina sahip olabilir. Murin KM666 dizisi, SEQ lD No.? olarak gösterilen amino asit dizisine sahiptir. SEQ ID No. 7 (Murin KMGGB dizisi) QVOLKESGPVLVAPSQTLSITCTVSG FSLASY N | HWVROP PGKG LEWLGV l WAGGS T NY NSALMS RLSISKD NS KSOVF LOM NSLO T DDTAMYYCAKRSDD YSWFAY'ßi'GOG T LVTVSASGGGGSGGGGSGGGGSE NVLTQSPAI MSASPGEKVTMTCRASSSVSSS YL HWYQOKSGASPKVWIYSTSN LAS GVPGR F:SGSGSGTSYSLTISSVEAE DAATYY COOYSGYPITFGAGTKVEVKR Bu dizi, asagida belirtilen VH ve VL dizilerini kapsar: SEO ID No. 9 (Murin KM QVO LK ES GPV LVAPSQT LSITCTVSGFSLASY N | HWVROP PG KG LEWLGV l WAGGS TNYNSALMS RLSIS KDN S KSOVFLOMNSLOTODTAMYYCAKRSDDYSWFAYWGOG SEQ ID No. 11 (Murin KM ENVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCRAS SSVSSSYLHWYOOKSGASPKW'VIYSTSNLA SGVPGRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCOOYSGYPI TFGAGTKVEVK Mevcut bulusun CAR'si, asagida belirtilen amino asit dizisini içerebilir: SEQ ID No. 8 (Hümanize KM666 dizisi) QVOLQES GPG LVKPSOT LSlTCTVSG FSLASYNI HWVROP PGKGLEWLGVI WAGGS T NY NSALMS RLT IS KDNS KN OVF LKMSSLTAADTAVYYCAKRSD DYSWFAYWGOG T LVTVSS GGG GSGGGGS GGGGSENOMTOSPSS LSASVGDRVT M TC RASSSVS 88 YL HM"NOOKSGKAP KVWl YSTSN L AS GV PSRFSGSGS GTDYTLTISSLO PE DFATYY CQOYSGYPITFGQGTKVEIKR Mevcut bulusun CAR'i, asagida belirtilen VH dizisini içerir: SEO ID No. 10 (Hümanize KM QVQLOESGPGLVKPSOTLSITCTVSGFSLASYNlHV'NROPPGKGLEVli'LGVlWAGGS TNYNSALMSRLTISKDNSKNOVFLKMSSLTAAOTAVYYCAKRSDDYSWFAYWGOG Mevcut bulusun CAR'i, asagida belirtilen VL dizisini içerir: SEQ ID No. 12 (Hümanize KM ENOMTOSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSSSYLHWYOOKSGKAPKVWIYSTSNL ASGVPSRFSGSGSGTDYTLTlSSLOPEDFATYYCOOYSGYPITFGOGTKVEIK Iki polipeptit dizisi arasindaki oran tanimasi, ücretsiz olarak httpzllblastncbi.nlm.nih.gov adresinde bulunan BLAST gibi programlar yoluyla belirlenebilir. TRANSMEMBRAN DOMENI Bulusun CARii ayni zamanda membrani kapsayan bir transmembran domenini de içerebilir. Bir hidrofobik alfa sarmalini içerebilir. Transmembran domeni, iyi reseptör stabilitesi veren CD28'den türevlenebilir. Transmembran domeni, SEQ ID N0.13 olarak gösterilen diziyi kapsayabilir. FWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV INTRASELÜLER T HÜCRESI SINYAL DOMENI (ENDODOMEN) Endodomen, CAR'nIn sinyal-iletim kismidir. Antijen tanimasindan sonra reseptörler kümelenir ve hücreye bir sinyal iletilir. En yaygin kullanilan endodomen bileseni, 3 aktivasyon sinyalini T hücresine iletir. CD3-zeta, tam kompetan aktivasyon sinyali saglamayabiir ve ilave bir yardimci uyaran sinyal de gerekli olabilir. Örnegin, bir proliferatif/survival sinyalini iletmek için CD3-Zeta ile birlikte kimerik CD28 ve OX40 kullanilabilir veya tüm üçü de birlikte kullanilabilir. Mevcut bulusun CAR'sinin endodomeni. CD28 endodomenini ve OX40 ve CD3-Zeta endodomenini içerebilir. Mevcut bulusun CAR'sinin transmembran ve intraselüler T-hücresi sinyal domeni SEO ID No. 14 (CD28 endodomeni) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY SEO ID No. 15 (CD40 endodomeni) RSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI SEQ ID No. 16 (CD3 zeta endodomeni) RSRVKFSRSADAPAYQQGONQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPOEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMO SEO ID NO. 17 (CD282) RSKRSRLLHSDYMNMTpRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYO OGONOLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPOEGLYNELOKDKMA EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMOALPPR SEO ID No. 18 (CD28OXZ) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYOPYAPPROFAAYRSRDORLPPDAHKPPG GGSFRTPIQEEOADÄHSTLAKIRVKFSRSADAPAYOOGONOLYNELNLGRREEYDV LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPOEGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDG LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR Bir varyant dizisi, dizinin, etkin bir transmembran domeni/Intraselüler T hücresi sinyal SINYAL PEPTIDI Mevcut bulusun CAR'si, bir sinyal peptidi içerebilir dolayisiyla CAR, bir T hücresi gibi bir hücrenin içinde eksprese edilir, nasent protein endoplasmik retikuluma ve ardindan eksprese edildigi hücre yüzeyine yönlendirilir. Sinyal peptidinin çekirdegi, tekli alfa-sarmali olusturma egilimine sahip hidrofobik amino asitlerin uzun germesini içerebilir. Sinyal peptidi, translokasyon esnasinda polipeptidin uygun olan topolojisini yerine getirmeye yardimci olan sekilde amino asitlerin kisa pozitif yüklü germesi ile baslayabilir. Sinyal peptidin sonunda, tipik olarak sinyal peptidaz yoluyla taninan ve bölünen amino asitlerin germesi yer alir. Sinyal peptidaz, serbest bir sinyal peptidi ve matür bir proteini olusturmak için translokasyonun tamamlanmasi esnasinda veya sonrasinda bölünebilir. Serbest sinyal peptitleri daha sonra spesifik proteazlar yoluyla parçalanirlar. Sinyal peptidi, molekülün amino ucunda olabilir. Bulusun CAR'i, asagidaki genel formüle sahip olabilir: Sinyal peptidi - GD2-baglayici domen - aralayici domeni - transmembran domeni - intraselüler T hücresi sinyali domeni Sinyal peptidi, SEQ ID No. 19lu veya sinyal peptidinin halen CAR'nin hücre yüzeyi ekspresyonuna neden olmak üzere islev saglamasi kaydiyla 5, 4, 3, 2 veya 1 amino asit mutasyonuna (eklemeler, ikameler veya ilaveler) sahip bir varyantini içerebilir. SEQ ID No. 19: METDTLLLWVLLLWVPGSTG SEQ ID No. 19'un sinyal peptidi, kompakt ve yüksek seviyede etkilidir. Terminal glisinden sonra yaklasik % 95'lik bir klevaj vermesi, sinyal peptidazi ile etkin bir sekilde uzaklastirilmasi beklenmektedir. ARALAYICI Mevcut bulusun CARisi, GD2 baglayici domeni transmembran domene baglamak ve uzamsal olarak GD2 baglayici domeni endodomenden ayirmak için bir aralayici dizisini içerebilir. Esnek bir aralayici, GD2 baglayici domeninin GD2 baglanmasini etkinlestirmek için farkli yönlerde yönlendirilmesini saglar. Aralayici dizisi, örnegin, bir lgG1 Fc bölgesini, bir lgG1 mentesesini veya bir CD8 sapini veya bunlarin bir kombinasyonunu içerebilir. Aralayici alternatif olarak bir lgG1 FC bölgesi, bir lgG1 mentesesi veya bir CD8 sapi gibi domen aralayici özelliklere ve/veya benzer uzunluga sahip alternatif bir diziyi de içerebilir. Bir insan lgG1 aralayicisi, FC baglayici motiflerin çikarilmasi için degistirilebilir. Bu aralayicilar için amino asit dizilerinin örnekleri, asagida verilmistir: SEQ ID No. 20 (mentese-insan IgG1'in CHZCHS) AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKA LPAPlEKTlSKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVE'.".'ESN GOP ENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSK LTVDKSRWOOG NVFSCSVMH EALH NHYTQK SLSLSPGK KD SEO ID No. 21 (insan CD8 sapi): TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI SEQ ID No. 22 (insan lgG1 mentesesi): AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK SEQ ID No. 23 (lgG1 Mentese-FC) AEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOK SLSLSPGKKDPK SEQ ID No. 24 (F0 reseptörü tanima motiflerini çikarmak için degistirilen lgG1 Mentesesi - FC) AEPKSPDKTHTCPPCPAPPEGPSVFLF PPKPKDTLMl/ßRTPEVTCWVDVSHEDP EVK FNVVYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSN K ALPAPIEKTISKAKGOPREPQVYTLPPSRDE LTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GOP ENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQG NVFSCSVMH EALH N HYTOK SLSLSPGKKDPK Modifiye edilen artiklarin alti çizilidir; *, bir silmeyi ifade eder. GD2, temel olarak insanlarda beyincik ve periferik sinirlere olmak üzere, normal dokular üzerinde yüksek oranda kisitlanmis olarak insan nöroblastom ve melanomu içeren nöroektodermal orijinli tümörler üzerinde eksprese edilen bir disialogangliosittir. GDZ'nin nispeten tümöre özgü olan ekspresyonu, bunu, immünoterapi için uygun bir hedef haline getirir. NÜKLEIK ASIT DIZISI Bulusun ikinci açisi, bulusun birinci açisinin bir CAR'sini kodlayan bir nükleik asit dizisine iliskindir. Nükleik asit dizisi, SEQ ID No. 27-35'ten herhangi biri olarak gösterilen amino asit dizisine sahip bir CAR'i kodlama kapasitesine sahip olabilir. Nükleik asit dizisi, asagidaki dizi olabilir veya bunu içerebilir: Ekspresyonu iyilestirmek için bir SAR bölgesi ve bir kodonla optimize edilen çerçeve ile RQR8 intihar geni ile birlikte eksprese edilen anti-GDZ CAR'sini içeren retroviral kasetin SEQ ID No. 25 DNA dizisi nc :actgiga .L acutg'_ gg vicivu' nam' CCBCCQBCC ntquctua:: Liigkîl'iil :~. .ani-'1 E 7 r' NT ...imL-idîîlî'l" unsnrîqrnü .i_-.-_-qt.caqîq\î l. ::isz L :::guL iv-;mu Hizi," WJLCUJ. cu lîlîggiztitigg 1 III Lrguz,:,L:L i'i'nqv li", f." golu-çitiri: 9:, 1.1152? i'm. I ipH qii .up~iqti:w1 ct ;ant At ;s asçirrl .';iiii cüausqsccc L iL gggiuma isilgcgg'. L: 22'i] ri'iijrri-rîii-r tga-;ei-.i-taii .ni' -i-rqi-r f. -Jt aq: : izî. i: ama :irctaan 7"iiqi- 79 i- 841-1 PPPTI'AF.? 'r !errr'uqqr qnr-rr'iî nr asm-iirA'fiQ f_ D'Ittâli'. :C C". :IQ-!uncu ct-zqinq-:iq af..!! nizcrfc 'Sir-Tnifinqin iJurtqcrhim: «:crqssqqmq F`FI~7I 1›,. Mazi› .::gt ;isin-.c ACKZICCIClîî antep. ::att i amaca-:::3: ` i` cunouzqc: at-:cuC-:icca .79- ;r'r çr? r-ii" -m-rr .` iuyvrv ::im-r TT i'I `FP' Iiî! 7.`1'T › WG' .:LgçuuuL'_ Lniuuçigi: L.'\.'iIJi'N_'I.nu ;iuqugtiun L Lî. iyi-:ca :-: iscztqt 213.1. q Ella-ECE.? .çitiigiicc L Lccii'. ::::1 tanisti:: ii Günde TT. 5-2 .~7'.\r;r? - 71 .31 C" i-i-im-i 9999`?995?9 u-fqi'au'ra uqsrcccawo qgnsagqzcr LqaLqAi:: _'u qii'. 4:. canli.' .au-::annen Luwiunguut uiqitLLuu; qi' :ni-:mu: içrürrigr-ii ataicaqcts C :GRE: 6 CSI: CQÜCKÂCCSC nicnccttc: accaqzqci: Lzmczcciii Ac::::citi_:i ""11" 'm1 i-r-"iil injury. r? ali-Arma UQBQ* QüLl LLQÜ-QUIQH çri ' :sinav-7" r- iigi-r @inv- aq:coiaoqs .::itcmicz :y 9;!.chsciq i'r'IY çu "i-i _.J taciactqcc aq:aa:scaq i_ Laura& gg; T""GIFG'ÜO .::itgcrçs incrqrqraa -7~niniir` .14.11 qqnqiifqij riiqqirrir `IL-[tanitim Prînriirii -i-i-qiçaur-r ir-içqv :3' n:- i ::gg-gl.: iict Aci-g. güçgcugtgu unuttcauta :AL:i.-±=^iiai.\ L_'.i.Lr_agt_ GÜRCCE'J'J'- zamana::: QQCIJICCIQIJ :::MISCCI -r-,qmirqmi Tjqijaqnîn `way-713: iqgçi--insii i v 7 . , :m .' "iiqxjf ' I' 7n-.arr'iit m1 .çngcuingg *rriqnfqar 7.-q' ari-su? - ::v-gm çar-r. i-riwi-s-e ni- ittl uttzaatqta :atqcaaiqa tiqtt:t:t: atttctaaqa ::qaqtztct cszqtqtaat qattstttiq 46"'il ni' r." i-vii 1iriiî$rf :'li'iirh ^:' :'IMIH-iuii 'AH'îi-î ."12 trt.! #rh irlill d"bl ::taazqqtc ::ttastttt :::astsict cttiatnztc atacaatcia atiagcaatc :ttt:tttqt 4631 wsLlûggAcL :Lg-gta::. igiiiLLllL uLuLiuiuLg ..gta-Lg.: gguiigciic L-LiLLiLLL *TH li' ijiii-.n'iv grirph-ri'fî Il ilflllfi rilnl nin'i n**i-i"i-'.q' nun-1 iii iiiqiiiiiq 3 ::RH - 5111 l.::Lg-gi:!i:l tutarinin!. : uuiuiciicî. i.:i'..g_:i.:'..!.'..gs: temanin-Lt 1.› liiska .............. v? Ecza :qutaaqcaq ESCI ::i-giiuigi Lggiicigi:: giii.il.ggv._:i: ::in-Lmggi'_ Atutgiggri 5741 :ungggtgui: uciiggicci giiiLgiiizm L:_:L:L::.:L'_A'_ &tgiiciiic ciiicigiic gc:LL::L::c_::L 1.11( 4 ........ - EEEI tig-giçzgirix: i .Amaciciig k:-gl!.gLI-!.LI `:9i::LLgLgç_: Nükleik asit dizisi, SEQ ID No. 25 ile kodlanan ile ayni amino asit dizisini kodlayabilir, ancak genetik kodun dejenerasyonuna bagli olarak farkli bir nükleik asit dizisine sahip olabilir. Nükleik asit dizisi, bulusun birinci açisinda tanimlanan sekilde bir CAR'yi veya 99 tanimaya sahip olabilir. INTIHAR GENLERI T-hücrelerinin yerlestirilebilir ve otonom olmalarindan ötürü anti-GD2 T hücrelerinin alicilarinda CAR T-hücrelerinin selektif olarak silinmesi için araçlar istenilir. Intihar genleri, kabul edilemez toksisite yüzünde infüze edilen T-hücrelerinin selektif yikimi ile sonuçlanan genetik olarak kodlanabilir mekanizmalardir. Intihar genleri ile ilgili en erken zamandaki klinik deneyim, Gansiklovir'e duyarli T hücrelerini olusturan Herpes Virus Timidin Kinaz (HSV-TK) ile iliskilidir. HSV-TK, yüksek seviyede etkin bir intihar genidir. Ancak, önceden olusturulmus immün yanitlar, kullaniminin, haploidentik kök hücre transplantasyonu gibi önemli immünosüpresyon klinik ayarlarin kullanimini kisitlayabilir. Indüklenebilir Kaspaz 9 (iCasp9), modifie edilmis FKBP12 ile Kaspaz 9'un aktive edici domeninin degistirilmesi ile olusturulan bir intihar genidir. iCasp9, dimerizasyonun inert küçük moleküler kimyasal indükleyicisi (CID) yoluyla aktive edilebilir. iCasp9, yakin zamanda haploidentik HSCT'nin ayarlarinda test edilmistir ve GvHD"yi durdurabilir. iCasp9'un en büyük kisitlamasi, klinik seviyede tescilli CID"nin kullanilabilirligine olan bagimliligidir. Hem iCasp9 hem de HSV-TK, intraselüler proteinlerdir dolayisiyla tek basina transgen olarak kullanildiklarinda, dönüstürülmüs hücrelerin seçimine izin vermek üzere bir markör geni ile birlikte eksprese edilirler. tanimasina sahip bir varyantini içerebilir. MLEGVOVETISPGDGRTFPKRGOTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGK OEVIRGWEEGVAOMSVGORAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESG GGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNI DCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQODHGALDCCVWILSHGCOA SHLOFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIOACGGEQKDHGFEV ASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWR DPKSGSWYVETLDDlFEOWAHSEDLOSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKL Mevcut bulusçular, yakin zamanda RQR8 olarak bilinen ve QBEndiO antikoru ile saptanabilen ve terapötik antikor Rituksimab ile çözünen hücreleri eksprese edebilen yeni bir markör/intihar geni tarif etmistir. tanimasina sahip bir varyantini içerebilir. MGTSLLC'.".'MALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAK PTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTlASOPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG LDFACDlYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV Intihar geni, örnegin iki dizi arasinda kendi kendine bölünen bir peptidi kullanarak, CAR ile tek bir polipeptit olarak eksprese edilebilir. VEKTÖR vektör saglar. Bu tür bir vektör, nükleik asit dizisinin konak hücreye yerlestirilmesi için kullanilabilir böylece bulusun birinci açisina göre bir molekülü eksprese eder ve üretir. Vektör, örnegin, bir plasmid veya bir retroviral vektör veya bir Ientiviral vektör gibi bir viral vektör olabilir. Vektör, bir T hücresini transfekte etme veya dönüstürme kapasitesine sahip olabilir. Vektör ayni zamanda iCasp9 veya RQR8 gibi bir intihar genini kodlayan bir nükleik asit dizisini de içerebilir. KONAK HÜCRE Bulus ayni zamanda bulusa göre bir nükleik asidi içeren bir konak hücre saglar. Konak hücre, bulusun birinci açisina göre bir CAR'i eksprese etme kapasitesine sahip olabilir. Konak hücre, bir insan T hücresi veya dogal katil (NK) hücre gibi bir sitolitik immün hücre olabilir. Bulusa göre bir CARiyi eksprese etme kapasitesine sahip olan bir T hücresi, CAR kodlayici nükleik asit ile bir T hücresini dönüstürerek veya transfekte ederek olusturulabilir. CAR T hücresi, ex vivo olarak olusturulabilir. T hücresi, bir hastadan veya bir donörden bir periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) örneginden alinabilir. T hücreleri, örnegin bir anti-CD3 monoklonal antikoru ile muamele gibi, CAR kodlayici nükleik asit ile dönüstürülmeden önce aktive edilebilir ve/veya genisletilebilir. FARMASÖTIK BILESIM Mevcut blus ayni zamanda bir vektör veya farmasötik olarak kabul edilebilen bir tasiyici, seyreltici veya yardimci madde ve istege bagli olarak bir veya daha fazla farmasötik olarak aktif polipeptit ve/veya bilesikler ile birlikte bulusun bir CAR eksprese edici T hücresini içeren farmasötik bir bilesim ile iliskilidir. Bu tür bir formülasyon, örnegin, intravenöz infüzyon için uygun bir sekilde olabilir). MUAMELE YÖNTEMI Mevcut bulusun bir CAR molekülünü eksprese eden T hücreleri, nöroblastom hücreleri gibi kanser öldürücü hücreleri içerebilir. CAR eksprese edici T hücreleri, ex vivo olarak hastanin kendi periferik kanundan (1. taraf) veya donörün periferik kanundan bir hematopoietik kök hücre transplantasyonu ayarindan (2. taraf) veya baglantisi olmayan bir donörün periferik kanindan (3. taraf) olusturulabilir. Alternatif olarak CAR T hücreleri, indüklenebilir projenitör hücrelerin veya embriyonik projenitör hücrelerin T hücrelerine ex vivo diferansiyasyonundan türevlenebilir. Bu örneklerde, CAR T hücreleri, bir viral vektörü, DNA veya RNA ile transfeksiyon dahil olmak üzere birçok araçtan biriyle CAR için DNA veya RNA kodlamasi getirilerek üretilir. Mevcut bulusun bir CAR molekülünü eksprese eden T hücreleri, kanseröz bir hastaligin, özellikle de GD2 ekspresyonu ile iliskili kanseröz bir hastaligin tedavisi için kullanilabilir. Kanser, bir ektodermal tümör olabilir. Artan GD2 ekspresyonu seviyeleri ile korele olan kanserlerin örnekleri: nöroblastom, melanom, medulloblastom, yumusak doku sarkomalari, osteosarkoma ve NSCLC gibi küçük hücreli akciger kanserleridir. Hastaligin tedavisi için bir yöntem, bulusun T hücresinin veya bir vektörünün terapötik kullanimina iliskindir. Bu baglamda, vektör veya T hücresi, hastalikla iliskili en az bir semptomun azaltilmasi, hafifletilmesi veya iyilestirilmesi ve/veya hastaligin ilerlemesinin yavaslatilmasi, azaltilmasi veya engellenmesi için mevcut bir hastaliga veya duruma sahip bir hastaya uygulanabilir. Bulusun yöntemi, kanser hücreleri gibi GD2 eksprese edici hücrelerin T hücresi aracilikli öldürmesine neden olabilir veya bunu destekleyebilir. GD2EKSPRESEEDEIHÜCRE Burada tarif edilen, GD2 ekspreSe edici bir hücrenin, GM3 sentazini kodlayan bir nükleik asidin ve GD2 sentazi kodlayan bir nükleik asidin bir hücreye yerlestirilmesi asamasini içeren bir yöntemdir. Nükleik asit, örnegin bir plazmid veya viral vektör gibi bir vektörü kullanilarak, transfeksiyon veya transdüksiyon yoluyla yerlestirilebilir. Burada tarif edilen, GM3 sentazini kodlayan bir heterolog nükleik asidi ve GD2 sentazini kodlayan bir heterolog nükleik asidi içeren bir GD2 eksprese edici hücredir. Nükleik asit, genellikle hücre içerisinde mevcut olmayan sekilde bu baglamda Hücre, bir hücre hattindan olabilir. Hücre, mevcut bulusun T hücreleri gibi GDZCAR T-hücrelerinin stimüle edilmesi için kullanilabilir. Bulus, simdi, bulusun gerçeklestirilmesinde teknikte siradan deneyime sahip bir kisiye yardimci olmayi amaçlayan ve bulusun kapsamini herhangi bir sekilde kisitlama amaci tasimayan Örnekler yoluyla detayli olarak açiklanacaktir. ÖRNEKLER Örnek 1- Baglayici olarak hümanize antikor huK666,nin kullanimi CAR'Ier, fare antikoru KM666'dan veya onun hümanize versiyonu huKööö'dan Nakamura vd. tarafindan (2001 - yukarida belirtilen sekilde) tarif edildigi üzere (yukaridaki Sekil 2'de varyantlar (a) ve (b)) kullanilarak scFv'ler ile olusturuldu. Bu reseptörler, ekspresyon/stabilite için kiyaslandi ve her iki reseptör için de esit oldugu bulundu. Daha sonra, bu reseptörler ile transdüksiyona tabi tutulan T-hücrelerinin öldürülmesi, sitokin serbestlemesi ve proliferasyonu, ya GD2"yi eksprese etmeyen veya eksprese eden hedef hücreler tarafindan meydan okundugunda test edildi. Her iki reseptörün öldürülmesinin benzer oldugu sonucuna varildi, ancak hümanize scFv bazli reseptör, üstün IL2 üretimi ve proliferasyonu ile sonuçlandi (Sekil 3). Örnek 2 - Ekspresyon ve islev üzerinde farkli aralayici formatlarinin etkilerinin test edilmesi Fc aralayici, Mentese, Mentese-CD8 sapi ve Cd8 sapi ile anti-GD2 CAR'Ier olusturuldu (Sekil 2 sirasiyla (b), (d), (e) ve (f)). Bu car'ler, dogru kiyaslamaya imkan saglamak için 2A sap hastaligi kendi kendine bölünmüs peptidi ile bagli bir 1:1 tasariminda olmak üzere, markör gen, kesik CD34 ile birlikte eksprese edildi (Sekil 4a). Ayrica, huK666 scFv, transgene karsi CAR ekspresyonunun kiyaslanmasina izin vermek amaciyla bir aminoterminal HA etiketi ile etiketlendi. Bu yapilar ile dönüstürülen normal donör T hücrelerinin akis sitometrik analizi, asagidaki sirada, daha parlak CAR ekspresyonu gösterdi: Fc Mentese-sap = sap Mentese (Sekil 4b). GD2 negatif hedeflerine iliskin GD2 pozitif hedeflerin öldürülmesi, krom serbestleme tayinleri kullanilarak kiyaslandi. Bu da, asagidaki sirada öldürme etkinligini gösterdi: Fc Mentese-sap = sap Mentese (Sekil 40). Interferon-gama serbestlemesi ve IL-2 serbestlemesi; CAR T-hücrelerinin, GD2 pozitif veya negatif hedeflerle karsi karsiya gelmesi durumunda kiyaslandi. Interferon-gama serbestlemesi, Fc, mentese-sap ve sap ile CAR'Ierde benzerdi ancak mentese varyantinda daha düsüktü. IL2 serbestlemesi, asagidaki sirada belirlendi: Fc, sap, mentese-sap, mentese (Sekiller 4d ve e). Son olarak CAR T hücrelerinin proliferasyonu; CAR T-hücrelerinin, GD2 pozitif veya negatif hedeflerle karsi karsiya gelmesi durumunda kiyaslandi. Proliferasyon, asagidaki sirada belirlendi: Sap, mentese-sap, FC, mentese (Sekiller 4d ve e). Örnek 3 - FcR mgtasvonlari. spesifik ol_mavan akt_ivitevi iptal ett_i Yukaridaki Örneklerden elde edilen genel veriler, FC aralayicisinin en iyi genel performansi gösterdigini öne sürdü. Ancak in vivo olarak Fc bölgesi, Fc reseptörlerini eksprese eden hücrelerden spesifik olmayan aktivasyona yol açabilir. Bu etkiyi ortadan kaldirmak için, mutasyonlar Sekil 5(a)'da gösterilen sekilde FC bölgesine yerlestirildi. Bu mutasyonlar, Sekil 5(b)'de gösterilen sekilde CAR ekspresyonu üzerinde zararli etkilere sahip degildi. Ayrica bu mutasyonlarin, CAR öldürme fonksiyonu üzerinde de etkisinin olmadigi gösterildi (Sekil 5(c)). Son olarak bu mutasyonlarin, FcR'yi eksprese eden hedeflerin (THP1 olarak adlandirilan bir monositoid hat) spesifik olmayan sekilde öldürülmesi ve bu monositler tarafindan IL-1 Beta serbestlemesi açisindan istenen etkiye sahip oldugu gösterildi (Sekil 5e). Örnek 4 - Ekspresvon kasetinin optimizasyonu Reseptörün ekspresyonunu optimize etmek amaciyla, asagidaki belirtilenler test edildi: (a) kasetin içerisine bir iskelet atasmani bölgesinin (SAR) dahil edilmesi; (b) 3'LTR içerisine tavuk beta hemoglobin kromatin insulatörünün (CHS4) dahil edilmesi ve (C) açik okuma çerçevesinin kodon optimizasyonu (Sekil 6a). Bir SAR'nin dahil edilmesinin, CHS4'ün çok az etkisi oldugunda (Sekil 6b), kodon optimizasyonunun yaptigi gibi ekspresyonun dogasini gelistirdigi gösterildi. SAR ve kodon optimizasyonunun kombine edilmesi, ekspresyonu ek olarak gelistirdi (Sekil 60). Örnek 5 - Farkli endodomenlerin kiyaslamasi Üç farkli endodomene sahip yapilar olusturuldu: CD3-zeta endodomeni (CD28tmZ) ile CD28 trans-membran domeni; CD28 endodomeni ve CD3-zeta endodomeni (CD282) ve CD28 transmembran domeni, CD28 endodomeni, OX30 endodomeni ile CD28 transmembran domeni, FC aralayici formatinda bir CAR ile CD3-zeta endodomen (CD280XZ). Proliferasyon, IFNy serbestlemesi ve IL-2 serbestlemesinin, CD28tmZ < CD282 < CD280XZ (Sekil 7) sirasinda arttigi belirtildi. Örnek Sekil 6 - iCaspQ intjhar geni ile birlikte ekspresvon fonksiyonu göstermek için istege bagli olarak seçilen Fc-aralayici, CD280XZ formatindaydi). CAR, iCasp9 ile birlikte ekspresyona karsin iyi eksprese edilebilirdi (Sekil 8b). iCaspQ'un küçük moleküler dimerizer ile aktivasyonu, CAR pozitif T- hücrelerinin silinmesine yol açti (Sekil 8b). Bu dimerizere maruz kalan iCasp9- GDZCAR T-hücreleri, dimerizere maruz kaldiklarinda GD2 özgünlüklerini kaybeti (Sekil Örnek Sekil 7 - RQR8 intihar geni ile I_airlikte ekspresvon Anti-GD2 CAR, RQR8 sinifi intihar geni ile birlikte eksprese edildi. (Sekil 9a - CAR, fonksiyonu göstermek için istege bagli olarak seçilen Fc-aralayici, CD282 formatindaydi). Reseptör ve CAR'nin birlikte eksprese edilmesi mümkündü (Sekil 9b). RQRS'in Rituksimab ve komplement ile intihar gen fonksiyonunun aktivasyonu, dönjüstürülmüs T-hücrelerinin silinmesi ve GD2 tanimasinin kaybi ile sonuçlandi (Sekiller 90 ve d). Örnek 8 - GDZ sentazi ve GM3 sentazinin ekspresyonu, herhanqi bir hücre hattinda GD2 ekspresyonu ile sonuçlanir GD2CAR T-hücrelerini, ideal GD2 veya GD2+ hedeflerine sahip olmak ve küçük hayvan modelleri için sinojenik hücreler üretebilmek amaciyla kültür içinde stimüle etmek için, GD2'nin bir hücre hatti üzerinde transjenik olarak eksprese edilmesi istenilir. GD2, bir protein degildir ve kompleks bir enzim seti tarafindan sentezlenmesi gerekir. Burada, yalniz iki enzimin transjenik ekspresyonu gösterilmistir: GMßsentaz ve GDZSentaz, simdiye dek dönüstürülen tüm hücre hatlarinda parlak GD2 ekspresyonu ile sonuçlanir (Sekil 10). Örnek 9 - Anti-Goz CARinin in vivo fonksiyonu CT26 hücre hatti, yukarida açiklanan sekilde GD2'yi eksprese etmesi için tasarlandi pozitif CD26 hücreleri, CS7BL/6 fare bögrüne inoküle edildi (CT26 ile genetik olarak özdes). Tümör yüklemesinden 10 gün sonra, yalanci-dönüstürülmüs ve anti-GD2 CAR dönüstürülmüs genetik olarak özdes splenositler hazirlandi. Fareler, asagidaki 4 kohortta ayrildi: anti-GD2 CAR splenositleri alan CT26 tümörlerini eksprese eden GD2'Ii fareler, yalanci-dönüstürülmüs splenositleri alan CT26 tümörlerini eksprese eden GD2; anti-GDZ CAR splenositler ile GD2 negatif (wt) CT26 tümörleri; ve splenosit almayan CT26 tümörlerini eksprese eden GD2. Tümör, 3 boyutta bir dijital kumpas kullanilarak ölçüldü ve hacim tahmin edildi. Sekil 11, tümörlerin büyüme egrilerini göstermektedir. Yalniz anti-GD2 CAR T-hücreleri alan farelerde GD2 pozitif tümörlerinde çok az büyüme vardi veya hiç yoktu. Örnek 10 - hi_iK666 ve 1492a-tabanli antiien baglayici domenleri içeren car'lerin fonksiyonunun kivaslanmasi Bir CAR'nin antijen baglayici domeni, fonksiyonunu etkileyebilir. Bu çalismada, bir CAR ile huK666iya dayanan bir antijen baglayici domen ile bulusun CAR'nin fonksiyonu, 14g2a'ya dayanan bir antijen baglayici domene sahip olan denk bir CAR ile kiyaslandi. Terapötik bir mAb olarak kullanildigindan ve bir CAR çalismasinda bugüne kadar test edilen tek scFv olmasindan ötürü 14g2a antikoru, GD2"ye karsi altin standard olarak görülebilir. Ikinci jenerasyon CAR'Ier, huK666 veya 14g2a'ya dayanarak olusturuldu ve eksprese edildi. Yapilari, Sekil 14a'da gösterilmistir. Retrovirüsler, GD2 CAR'Ieri, gag/pol'yi ve zarf proteini RD114'ü kodlayan plazmidler ile 293T hücrelerinin geçici transfeksiyonu yoluyla üretildi. 3 gün sonra, üst fazlar toplandi ve retronektin kapli plakalarda esit retrovirüs titreleriyle PHA/IL2 ile aktive edilen PBMC'Ieri dönüstürmek için kullanildi. CAR'Ier, antijen baglayici domenleri açisindan farklilik gösterdi. Her iki durumda da baglanma alanlari bir IgG Fc segmenti ile membrana baglandi ve CD28 ve CD3-zeta'dan intraselüler aktivasyon motiflerini içerdi. Transdüksiyondan alti gün sonra CAR-ekspresyonu, akis sitometrisi yoluyla dogrulandi ve PBMC'Ier, GD2-pozitif Lan1 hücreleri (bir GD2 pozitif hücre hatti) veya GD2-negatif A204 hücreleri (bir GD2 negatif rabdomiyosarkoma hücre hatti) ile 1:1 oraninda kültürlendi. Bir gün sonra, bu birlikte kültürlerden alinan üst fazlar, ELISA yoluyla interferon-y seviyeleri için test edildi ve 6 gün sonra T hücresi proliferasyonu, akis sitometrisi ile degerlendirildi. Sonuçlar, Sekiller 14 ve 15'te gösterilmistir. 24 saatte, interferon-gama, üst fazdan ölçüldü. huK. Bir hafta sonra T hücreleri sayildi ve huK666 CARinin daha fazla proliferasyona sahip Nöroblastom hücre hatti LAN1 ile bir haftalik birlikte kültür sonrasinda, hücreler toplandi ve akis sitometrisi ile analiz edildi. CD45 ekspresyonu, Ienfoid hücrelerinden ve LAN-1 hücreleri olarak CD45-hücreleri ile Iendoif olmayan hücrelerden ayrim yapmaya izin verdi. CD3/QBEND/10 ile diger boyama, CAR-T hücrelerinin sayimina imkan sagladi. huK666 CAR T-hücrelerinin, daha iyi çogaldigi ve 14g2a'nin denklerinden daha fazla öldügü bulundu (Sekil 15). DIZI LISTESI <110 UCL Business PLC <120› KIMERIK ANTIJEN RESEPTÖRÜ <130 P103293PCT <160 37 <170 Patentln versiyonu 3.5 <210 1 < 211› 5 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› Agir zincir degisken bölgesi CDR1 <400 1 <210 2 < 211› 16 < 212 PRT < 213 Yapay dizi <220 < 223 Agir zincir degisken bölgesi CDR2 <400 2 Vai Ile Trp Ala Gly Giy Ser Thr Asu Ty: Asn Ser Ala Leu Met Ser 1 5 10 15 <210 3 < 211› 10 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 Agir zincir degisken bölges CDR3 <400 3 Arg Ser Asp Asp Tyr Ser Trp Phe Ala Tyr <210 4 < 211 12 < 212› PRT < 213 Yapay dizi <220 < 223 Hafif zincir degisken bölgesi CDR1 <400 4 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His <210 5 < 211› 7 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 Hafif zincir degisken bölgesi CDR2 <400 5 <2106 <2119 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 Hafif zincir degisken bölgesi CDR3 <400 6 Sin Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Ile Thr <210 7 < 211› 243 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› Murin KM666 dizisi <400 7 Sin Vai Gin Leu Lys Giu Sex Gly Pro Vai Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Asn Ile His Trp Val Arc Gln Pro Pro Gly Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asu Ser Arq Lev Ser Ile Ser Lys Asp Ran Ser <2108 < 211 242 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› Hümanize KM666 dizisi <400 8 Gln Vai Gin Leu Gin Giu Ser Giy Pro Giy Leu Vai Lys Pro Ser Sin Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Se: Gly Phe Ser Leu Ala Ser Tyr 10611 <210 9 < 211› 118 < 212› PRT < 213 Yapay dizi <220 < 223 Murin KM dizisi 011,( <400 9 <210 10 < 211› 118 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 Hümanize KM666 VH dizisi <400 10 <210 11 <211108 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 Murin KM dizisi <400 11 <210 12 < 211 108 < 212 PRT < 213 Yapay dizi <220 < 223› Hümanize KM666 VH dizisi Ser Lys Asp Asn Ser Lya Aan Gin Vai Pha Leu Thr Ala Ala hap Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Tyr Ser frp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr <400 12 Giu Aßn Gln Met Thr Gin Se: Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Giy 1 5 10 15 Asp Arq Vai Thr Met Thr Cy: Axq Ala Sor Sor Sor Vai 51: S.: 5:: Ty: Lou His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Va] Trp 40 45 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 BU Pro Giu Asp Phe Ala Thr Ty: Ty: Cya Gln Gln Tyr Ser Giy Tyr Pro 85 90 95 11- ?hr Ph. Gly Gln Gly ?hr Lys Val Glu Il. Lys 100 105 <210 13 < 211 27 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› Transmembran domeni <400 13 Phe Trp Vai Leu Vai Vai Vai Giy Giy Vai Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Tip Val <210 14 < 211› 39 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› CD28 endodomeni <400 14 Arg Ser Lya Axg Ser Arg Leu Leu Has Ser Asp Ty: Met Asn Met Thr 1 5 lü 15 Pro Arg Arq Pro Gly Pro rh: Azg Lya His Ty: Gln Pro Tyr Ala Pro 25 30 <21015 < 211 38 < 212 PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› CD4O endodomeni <400 15 Arg Se: Arg Asp Gin Arg Leu ?:0 Pro Asp Ala His Lys Pzo Pzo Giy Giy Giy Ser Phe Arq Thr Pro Ile Gin Glu Giu Gin Ala Asp Ala 813 <210 16 < 211› 114 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› CD3 zeta endodomeni <400 16 <210 17 < 211› 153 < 212 PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 CD282 <40017 <210 18 < 211› 189 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› CD280XZ <400 18 <210 19 < 211› 20 < 212 PRT < 213 Yapay dizi <220 < 223› Sinyal peptidi <400 19 Mat Glu Thr Asp Thr Lou Lau Lou Trp Val Lou Lou Lou Trp Val Pro <210 20 < 211› 234 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› Mentese-Insan IgG1 aralayicisinin CH20H3'ü <400 20 Ser Lya Leu Th: Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Giy Aan Vai Phe 195 200 205 Ser Cys Se: VaL Met His Glu ALa Leu His Aan His Tyr Thr Gin Lys 210 215 220 Sir Liu Sir Liu Sir Pro Gly Lyi Lys Asp 225 230 <210 21 < 211 46 < 212 PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 Insan CD8 sapi aralayicisi <400 21 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Sor Gln Pro Liu Sir Lou Arg Pro Giu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Giy 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Lou Asp Ph. Ala Cys Asp Ile 40 45 <210 22 < 211› 20 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› Insan IgG1 mentesesi aralayicisi <400 22 Ala Giu Pro Lya Ser Pro Asp Lya Tnr His Thr Cys Pro Pro Cya Pro 1 5 10 15 <210 23 < 211 237 < 212 PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› [961 mentese-Fc aralayicisi <400 23 <210 24 < 211› 236 < 212› PRT < 213› Yapay dizi 3.1.5 <220 < 223› Fc reseptörü tanima motiflerinin çikarilmasi için degistirilen IgG1 Mentesesi aralayicisi - Fc <400 24 Aia Giu Pro Lya Ser Pro Asp Lys Thr uxs Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 !5 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Axg Thr Pro Glu vai Thr Cys val val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Giy Vai Glu Vai His Lan Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Giu Gin 65 70 75 80 Tyr Asn Sir Thr Tyr Arg Vnl Val Sor Val Liu Thr Val Liu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Giy Lys Giu Ty: Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Ala 100 l05 110 Lou Pro Ala Pro 119 Glu Lya Thr Ile Ser Lys Ala Lya Gly Gln Pro 115 120 125 Ara Glu Pro Gln Va] Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arc Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Lou Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser .hap Ile Ala Val Glu Tip Glu Sex. Asli. Gly Gln Pr'u Glu Asu Asu Tyi.' 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Giy Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lya Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Set Cys Ser Val Met "is Glu Ala Lev His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys 225 230 235 <210 25 <211 6014 <212 DNA <213 Yapay dizi <220 < 223 Retroviral kaset <400 25 LcctchaqL tvuccccqaq Laagcagitc Lctagtgict qachqat Ct; QQCCGLBLQE aqcacqiagt ligâcââßal qaqcntîqfq ctqgaiigga gtQÂQSQCCQ tqcccigcac ctqchqcag iticacgccg 5999C91995 çtclggccca GCtQâCCdLC CQGOCCCGBE acctqßqch aqchnqrî? ggcclqqtgu qqnqchgca acotaaqcsc QCquQQGÜQ Ctggcqgcag ccetgacztg cacigtcctq cgtgaiçcat guuiLaIUuL 99C3QÖGQCC titgcaatqi i 1' "r" 4" "J""J natcnngqqa tgaqntqacn QGtQQîOQOR ulaLLuvLun 93C9939t99 qçgaacgtct tcaqnntgac Luluhyuutu <21026 <211 719 QOthaOOQC < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 ntcagtqgtc <400 26 Hat Giu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Ala Pro Sir Gln Thr Lou S.: 110 Vai Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gin Gin 610 615 620 Asu Gin Leu Tyr Aan Giu Leu Asn Leu Giy Arg Arg Giu Glu 625 630 635 Val Leu Asp Lys Arq Arq Gly Arq Asp Pro Glu Met Gly Gly 645 650 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Aan Glu Leu Gln 660 665 670 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 675 680 685 Arg Giy Lys Giy Hie Asp Giy Leu Tyr Gin Giy Leu Ser Thr 690 695 700 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Liu His Mit Gln Âla Lou Pro Pro 705 710 715 <210 27 < 211› 718 < 212 PRT < 213› Yapay dizi <220 <400 2? Net Giu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Giy Ser Thr Giy Gin Vai Gin Leu Gin Giu Ser Giy Pro Gly Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Ile Thr Cya Thr Val Ser Gly 40 45 Leu Ala Ser Tyr Asn Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn 65 70 ?5 Set Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp aan Ser 1.911 1311: 1.315 <210 28 < 211 717 < 212› PRT < 213 Yapay dizi <220 <400 28 1.1.0 <210 29 < 211› 527 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 anti-GD2 CAR, huKMGGG-HSTK-CD28OXZ <400 29 3.1.5 (31)! <210 30 < 211› 527 < 212› PRT < 213 Yapay dizi <220 < 223 anti-GD2 CAR, huKM666-STK-CD28XOXZ <400 30 Mat Giu Thr Asp Thr Leu Lou Lou Trp Vai Lou Lou Lou Trp Val Pro 1-11.: 811.: Gly Ser Thr Gly Gln Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu val Pro Glii Ala <210 31 <211 501 <212 PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223› anti-GD2 CAR, huKM666-HNG-CD28OXZ <400 31 Met Lys Giy Giu Arg Arg Arg Giy Lya Gly His Asp Giy Leu Tyr 610 Gly Lou Sir Thr Ala Thr Ly: Rsp Thr Ty: Asp Ala Liu His Mat Gln <210 32 < 211› 642 < 212› PRT < 213 Yapay dizi <220 <400 32 141.› (311) 3.1.3 <210 33 < 211 681 < 212 PRT < 213 Yapay dizi <220 1.315 <400 33 7:11: A511. (1111 Ala Leu His Asn Hia Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Giy 485 490 495 Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu 500 505 510 Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Vai rh: Vai Ala Phe Iie Iie Phe Trp Vai 515 520 525 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 530 535 540 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Ty: Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arq Vai Lys Phe Ser Arg Ser 565 570 575 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 580 585 590 Lou Asn Leu Gly Arq Arq Glu Clu Tyr Asp Val Lou Asp Lys Arq Arq 595 600 605 Gly Arq Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arq Arq Lys Asn Pro Gln 610 615 620 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Lev Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Sir Glu Il. Gly Mat Lys Gly Glu Arq Arg Arg Gly Lys Gly His kap 645 650 655 Gly Leu Tyr Gln Gly Lou Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 660 665 670 Lou His Mat Gln Ala Lou Pro Pro Arg 675 680 <210 34 < 211 1103 < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 iCasp9 intihar geni ile birlikte eksprese edilen anti-GD2 CAR <400 34 8.1.& 61.11 61.:: 61:.! 1.el› (3111 Gly Val Glu Val His Aan Ala Lya ?hr Lys Pro Arc Glu Glu Gln Tyr 755 760 765 Ann Sar Thr Tyr Ârq Val Val Sar Va] !AU Thr Va] !Au His Cln Asp 770 7?5 ?80 Trp Leu &en Giy Lys Giu Tyr Lya Cye Lya Vai Ser Aen Lya Ala Leu 805 310 315 Glu Ero Gln Val Ty: th: Lou Pro Pro Sir Arg Asp ulu Lou Thr Lys 820 825 830 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cya ieu Val Lya Gly Phe Tyr Pro Se: Asp 835 840 845 850 855 860 Thr Thr Pro Pro Val Lou Asp Sir Asp Gly Sir Ph. Ph. Liu Ty: Sir Lya Lou Thr Va] Asp :ya Ser Arq Trp Gln Gln Gly Aan Val Phe Ser 885 890 895 Cyu Sur Val Mah 815 Glu Ala Leu Hi: Ann Mi: Ty: Tur Glu Lyu Sex 900 905 910 Leu Ser Leu Ser Pro Giy Lys Lya Asp Pro Lya Phe Tip Vai Leu Vai 915 920 925 Val Va] Glv Gly Val Lou Ala Cys ?yt Ser Lou Lev Val ?hr Val Ala 930 935 940 Phe Ile Ile Phe Trp Vai Arg Ser Lys Arg Ser Arq Leu Leu Hia Ser Asp Tyr Met Aan Met Thr Pro Axg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lye Hie 965 970 975 Ty: Sin ?:0 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Ph. Ala Ala Ty: Arg Sor Arg 980 985 990 vai Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gin Gln Giy Gin han Gin Leu Tyr Asu Giu Leu Asu Leu Giy Arg Arg Giu Giu Tyr Asp Vai Lou Asp Lys Arq Arq Gly Arq Asp Pro Glo Met Gly Gly Lys Pro Arq Arq Lys Asn Pro Gln Glu Gly Lou Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser G1u Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leo Ser Tbr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 610 <210 35 < 211 858 < 212 PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 RQR8 intihar geni ile birlikte eksprese edilen anti-GD2 CAR <400 35 Met Giy Thr Ser Leo Leu Cys Trp Met Ala Leo Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Aia Cys Pro Tyr Ser Ann Pro Ser Leu Cya Ser Giy 25 30 Gly Gly Gly Str Glu Liu Pro Thr Gln Gly Thr Ph. Sir Asn Val Sir 40 45 Thr Aan Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cya Pro Tyr Ser 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro 65 70 75 Bu Pro Thr Pro Ala Pro Thr Iie Aia Ser Gin Pro Leu Ser Leu Axg Pro 85 90 95 (315! 111-: <210 36 < 211› 402 (31:) < 212› PRT < 213› Yapay dizi <220 < 223 Indüklenebilir Kaspaz 9 (iCasp9) dizisi <400 36 011.: <210 37 < 211 157 < 212 PRT < 213 Yapay dizi <220 < 223 Yeni markör/intihar geni RQR8 dizisi <400 37 TR

Claims (1)

1.ISTEMLER . Asagida belirtilenleri içeren bir disialogangliosit (GD2)-baglayici domene sahip bir kimerik antijen reseptörüdür (CAR) a) SEQ ID No: 10'da gösterilen diziye sahip olan bir VH domenini içeren bir agir zincir degisken bölgesi (VH); ve b) SEQ ID No: 12'de gösterilen diziye sahip olan bir VL domenini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi (VL). . istem 1'e göre bir CAR olup, özelligi GD2 baglayici domenin, SEQ ID N0.8 olarak gösterilen diziyi kapsamasidir. . Önceki herhangi bir isteme göre bir CAR olup, özelligi SEQ ID No. 27 ila 35'ten herhangi birinde gösterilen diziyi veya en az %80 dizi tanimasina sahip ama i) GD2`yi baglama ve ii) T-hücresi sinyalini indükleme kapasitesini sürdüren bir varya nti içermesidir. . Önce belirtilen istemlerden herhangi birine göre bir CAR'i kodlayan bir nükleik asit dizisidir. . Istem 4'e göre bir nükleik asit dizi olup, özelligi SEQ lD No. 25 olarak gösterilen diziyi veya en az %90 dizi tanimasina sahip olan bir varyanti içermesidir. . istem 4 veya 5'e göre bir nükleik asit olup, özelligi ayni zamanda bir intihar genini de kodlamasidir. . Istemler 4 ila 6'dan herhangi birine göre bir nükleik asit dizisini içeren bir vektörd ü r. . Istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre bir CAR'yi eksprese eden bir hücredir. . Istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre bir CAR,yi ve bir intihar genini birlikte eksprese eden bir hücredir. istem 9'a göre bir hücre olup, özelligi intihar geninin, iCasp9 veya RQR8 olmasidir. Istemler 8 ila 10'dan herhangi birine göre bir hücre yapmak için bir yöntem olup, özelligi istemler 4 ila 6'dan herhangi birine göre bir nükleik asidin bir hücreye ex vivo olarak uygulanmasi asamasini içermesidir. istem 7'ye göre bir vektör veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici, Seyreltici veya yardimci madde ile birlikte, istemler 8 ila 10'dan herhangi birine göre bir hücre içeren farmasötik bir bilesimdir. istem 7`e göre bir vektör veya kanserin tedavi edilmesinde kullanim için istemler 8 ila 10'dan herhangi birine göre bir hücredir. istem 13'e göre kullanim için bir hücre olupi özelligi kanserin, nöroblastom olmasidir. TR