SU1126308A1

SU1126308A1 - Method of cleaning biologic solutions by diafiltering

Info

Publication number: SU1126308A1
Application number: SU823550117A
Authority: SU
Inventors: Владимир Петрович Жемков; Николай Борисович Иванов; Вячеслав Иванович Громов; Георгий Александрович Меркулов; Юрий Васильевич Лапыкин; Александр Евгеньевич Полоцкий; Андрей Николаевич Черкасов; Владимир Артемович Пасечник; Всеволод Иванович Огарков
Original assignee: Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Особо Чистых Биопрепаратов
Priority date: 1982-12-02
Filing date: 1982-12-02
Publication date: 1984-11-30

Abstract

СПОСОБ ОЧИСТКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ РАСТВОРОВ МЕТОДОМ ДИАФШТЬТРАЦИИ, включающий промывку раствора растворителем под давлением при посто нном тангенциальном потоке раствора в апIпарате над поверхностью мембраны, о тличающийс, тем, что, с целью повьшени производительности процесса, промывку раствора растворителем осуществл ют путем воздействи на него создаваемыми в аппарате импульсами давлени продолжительностью 0,1-20 с с интервалом 0,1-20 с, при этом скорость тангенциального потока на входе в аппарат составл ет 0,05-0,2 м/с. (ЛTHE METHOD FOR CLEANING BIOLOGICAL SOLUTIONS BY DIAFSTRATION METHOD, including washing the solution with a solvent under pressure with a constant tangential flow of the solution in the apparatus over the membrane surface, which is such that, in order to increase the performance of the process, wash the solution by means of influencing the solution, using the effects of the process, you will have to go through the same way, you will have to go through the same procedure, you will have to go through the procedure, you will have to go through the same way, you will have to go through the procedure, you will have to go through the same procedure, you will be in the position of the solution to wash the solution with the help of the solution). pressure pulses with a duration of 0.1–20 s with an interval of 0.1–20 s, with the tangential flow velocity at the entrance to the apparatus being 0.05-0.2 m / s. (L

Description

11 Изобретение отнЪситс к прикладной вирусологии и микробиологии, а именно к процессам глубокой очистки растворов методом диафильтрации. Известно применение диафильтрации дл разделени растворов, содержащих крупнодисперсньй компонент (найример, вирусы, бактерии, клетки) и примесные мелкодисперсные компонен ты (например, балластные белки, пептиды , аминокислоты, соли и т.д.), при этом.исходные или сконцентрированные растворы или суспензии промывают физиологическим или буферным раствором в непрерьшном режимег дл вымьшани мелкодисперсных частиц и низкомолекул рных примесей 1J . Недостатком процессов диафильтрации данных систем вл етс то, что в результате действи гелевой концентрационной пол ризации не обеспечиваетс высокой степени разделени круп но- и мелкодисперсного компонента и достаточной производительности процесса , так как расходуетс , большое . количество буфера. Дл повьшени эффективности разделени прибегают к значительным ско рост м тан1енциальног6 потока и повьшению рабочего давлени . Это приводит к усложнению фильтрационного оборудовани , требует применени мощных высокопроизводительных насосов, резко повьшает энергетические затраты и, в то же врем , не приводит к существенному улучшению процесса разделени 2j и з1. Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности и достигае мому результату сйособ очистки биоло гических растворов методом диафильтрации , включающий промывку раствора растворителем под давлением при пос то нном тангенциальном потоке .растзо ра в аппарате над поверхности) мембраны А . Недостатком известного способа вл етс низка эффективность процес са диафильтрации, обусловленна малой производительностью процесса очистки раствора и большими энергетическими затратами. Цель изобретени - ускорение процесса очистки растворов. Поставленна цель достигаетс что согласно способу очистки биологических растворов методом диафильтрации , включающему промывку раствотем 08 ра растворителем под давлением при посто нном тангенциальном потоке раствора в аппарате над поверхностью мембраны, промывку раствора растворителем осуществл ют путем воздействи на него создаваемыми в аппарате импульсами давлени продолжительностью 0,1-20 с i интервалом 0,120 с, при этом скорость тангенциального потока на входе в аппарат составл ет 0,05-0,2 м/с. Предлагаемый способ осуществл ют следукицим образом. Процесс очистки биологических растворов (вирусов, бактерий) провод т в ультрафильтрационных аппаратах типа фильтр-пресс, укомплектованных полупроницаемыми мембранами Биопор. На входе в фильтрационный модуль создают скорость тангенциального потока жидкости 0,05-0,2 м/с при рабочем давлении пор дка 0,05 МПа. По мере удалени фильтрата через полупроницаемую мембрану промывочный раствор (буфер) подают в исходную камеру. Процесс диафильтрации провод т в непрерывном режиме,при этом в ходе процесса периодически перекрывают , линию отвода фильтрата, что создает в аппарате импульсы давлени продолжительностью 0,1-20 с с интервалом 0,1-20 с за счет выравнивани давлени между зоной тангенциального потока (над мембраной) и зоной сбора фильтрата (под мембраной). Возникающий в аппарате гидродинамический режим преп тствует возникновению над поверхностью мембраны гелеподобного концентрационного сло , что, в свою очередь, приводит к ускорению прохождени раствора через мембрану, т.е. к повышению производительности процесса диафильтрации и улз чшению его раздел ющих характеристик. I Пример 1. Используют фильтрационньй модуль типа фильтр-лресс С рабочей поверхностью 11440 см, укоплектованный ацетатцеллюлозными мембранами Виопор (производство ВНИИ ОЧВ) со средним размером 30 нм. Исходна биологическа суспензи сконцентрированна аллантоисна жидкость (ВАЖ), содержаща вирус гриппа Ал/Бангкок. Объем концентрата 1000 мл, титр вируса по реакции геммагглютинации (РГА) 1:8192, соержание общего белка по Лоури 4,65 мг/мл. Диафильтрацию концентрата провод т т рис -буфером (С 0,5 М, рН 7,2). Кратность отмывки 10. Диафильтрацию провод т в режиме подачи импульсов давлени с амплитудой 0,033 МПа. Длительность импульсов 10 с, интервалы между ними 10 с. Скорость тангенциального потока над поверхностью мембран 0,05 м/с Производительность процесса 32 л/ч-м. Объем концентрата ВАЖ после очистки диафильтрацией 1000 мл, титр вируса по РГА 1:8192, содержание общего белка по Лоури 0,130 мг/мл, степень очистки вируса по белку 36. Пример 2. Используют фильтрационный модуль типа фильтр-пресс с рабочей поверхностью 520 см. Мейб рана типа Биопор (по приме .ру 1). Биологическа суспензи сконцентрированна ВАЖ, соде-ржаща штамм вируса гриппа Aj/Ленинград. Объем концентрата 1200 мл, титр вируса по РГА 1:16384, содержание общего белка 5,0 мг/мл, концентраци овальбумина, измеренна методом реакции непр мой гемагглютинации (РИГА), 200 мкг/мл. Диафильтрацию концентрата ВАЖ ведут трис -буфе-ром . Кратность отмывки 13. Диафильтрацию провод т в режиме подачи импульсов давлени с амплитудой 0,1 МПа. Скорость тангенциаль ного потока над мембраной 0,18 м/с. Длительность импульсов давлени 0,1 интервал между импульсами 0,1 с. Пр изводительность процесса 36 л/ЧМ. Объем концентрата после диафильтрации 1200 мл, титр вируса 1:32768. Содержание общего белка по Йоури 0,230 мг/мл, содержание овальбумина 1 мкг/мл. Степень очистки по белку 22, степень очистки по овальбумину 200. Пример 3. Используют фильт рационный модуль типа фильтр-пресс с рабочей поверхностью 3000 см. Ме рана типа Биопор (аналогична примеру 1). Исходна библогическа сус пензи - сконцентрированна питател на среда, содержаща бактерии Е.Со li в концентрации 1/мл. Содер жание общего белка в надосадочной жидкости после центрифугирование 2000 мкг/мл, объем суспензии 350 мл Диафильтрацию провод т физиологическим раствором. Кратностьдиафильтрующего объема 5. Диафильтрацию провод т- в режиме подачи импульсов давлени величиной 0,08 МПа, длительность импульсов 20 с, промежутки между импульсами 20 с. Скорость тангенциального потока над ме1 браной 0,1 м/с. Производительность процесса 27 л/ч м. После диафштьтрации содержание, общего белка в надосадочной жидкости 80 мкг/мл. Степень очистки по белку 25. Пример 4. Дл проведени контрольного опыта по способу-прототипу использовали оборудование и мембраны, аналогичные примеру 1. Площадь модул 11440 см. Исходна биологическа суспензи - сконцентрированна аллантоисна жидкость (ВАЖ), содержаща вирус гриппа Ал/Бангкок. Объем концентрата 1000 мл, вируса по реакции гемагглютинации (РГА) 1:8192, содержание общего белка по Лоури 4,65 мг/мл. 2000 мл концентрата ВАЖ разделили поровну - дл примера 1 и примера 4. Очистку концентрата ВАЖ вели до содержани общего белка по Лоури 0,130 мг/мл. Диафильтрацию проводили по режиму способа-прототипа. Ско- рость тангенциального потока над поверхностью мембра1а1 1 ,7 м/с при давлении 0,35 МПа. Диафильтрующий раствор - Трис -буфер (,5 М, рН 7,2). Кратность отмывки 38. Производительность процесса 17 л/ч-м. Объем концентрата ВАЖ после очистки диафильтрацией 1000 мл, титр вируса по РГА 1:8192, содержание общего белка по Лоури 9,132 мг/мл. Степень очистки 36. В результате осуществлени предлагаемого способа при выбранных rtapaметрах проведени его значительно увеличиваетс производительность процесса, о чем свидетельствуют данные, представленные в таблице. По сравнению с известным предлагаемый способ позвол ет в 2 раза ускорить процесс очистки биологических растворов без потери их начальной активности вследствие исключени образовани гелеподобного концентрационного сло над поверхностю мембраны .11 The invention relates to applied virology and microbiology, in particular, to the processes of deep purification of solutions by the method of diafiltration. It is known to use diafiltration to separate solutions containing a coarse component (nurimer, viruses, bacteria, cells) and fine impurity components (e.g., ballast proteins, peptides, amino acids, salts, etc.), with this or original or concentrated solutions or the suspensions are washed with a physiological or buffer solution in a continuous mode to vyzhanshany fine particles and low molecular weight impurities 1J. A disadvantage of the diafiltration processes of these systems is that, as a result of the gel concentration polarization, a large degree of separation of the coarsely and finely dispersed component and sufficient process efficiency are not ensured, since it is consumed large. amount of buffer. In order to increase the separation efficiency, significant speeds of one-sixth flow and higher operating pressure are used. This leads to complication of filtration equipment, requires the use of powerful high-performance pumps, dramatically increases energy costs and, at the same time, does not lead to a significant improvement in the separation process 2j and h1. Closest to the proposed method of purification of biological solutions by the diafiltration method proposed by the technical essence, including washing the solution with a solvent under pressure with a steady tangential flow of a razdora in the apparatus above the surface of membrane A). The disadvantage of this method is the low efficiency of the diafiltration process, due to the low productivity of the solution cleaning process and high energy costs. The purpose of the invention is to accelerate the process of cleaning solutions. The goal is achieved that according to the method of purification of biological solutions by the method of diafiltration, which includes washing with a solvent solution under pressure at a constant tangential flow of the solution in the apparatus above the membrane surface, washing the solution with a solvent is carried out by applying pressure pulses of 0.1 -20 sec i with an interval of 0.120 sec, with the tangential flow velocity at the entrance to the apparatus being 0.05-0.2 m / s. The proposed method is carried out in the following manner. The process of purification of biological solutions (viruses, bacteria) is carried out in ultrafiltration apparatus of the filter press type, equipped with Biopore semi-permeable membranes. At the entrance to the filtration module, a tangential fluid flow rate of 0.05-0.2 m / s is created at an operating pressure in the order of 0.05 MPa. As the filtrate is removed through the semipermeable membrane, the washing solution (buffer) is fed into the initial chamber. The diafiltration process is carried out in continuous mode, during which the process periodically overlaps the filtrate drain line, which creates pressure pulses in the apparatus with a duration of 0.1–20 s with an interval of 0.1–20 s due to pressure equalization between the tangential flow zone above the membrane) and the collection area of the filtrate (under the membrane). The hydrodynamic regime arising in the apparatus prevents the formation of a gel-like concentration layer above the membrane surface, which, in turn, accelerates the passage of the solution through the membrane, i.e. to improve the performance of the diafiltration process and to improve its separating characteristics. I Example 1. A filter-pressure type filtration module is used. With a working surface of 11440 cm, Viopor (manufactured by the VNII OCHV) equipped with cellulose acetate membranes with an average size of 30 nm is used. The original biological suspension is a concentrated allantoic fluid (IVA) containing the influenza virus Al / Bangkok. The volume of the concentrate is 1000 ml, the titer of the hemmagglutination reaction (DSA) is 1: 8192, the total protein content according to Lowry is 4.65 mg / ml. The diafiltration of the concentrate is carried out with rice buffer (C 0.5 M, pH 7.2). The washing ratio 10. The diafiltration is carried out in the mode of supplying pressure pulses with an amplitude of 0.033 MPa. The duration of the pulses is 10 s, the intervals between them are 10 s. The tangential flow rate above the membrane surface is 0.05 m / s. The process productivity is 32 l / h-m. The volume of the VAZH concentrate after purification by diafiltration is 1000 ml, the virus titer for RSA is 1: 8192, the total protein content according to Lowry is 0.130 mg / ml, the degree of virus purification by protein 36. Example 2. A filtration press filter module with a working surface of 520 cm is used. Mabe wound type Biopor (as per example 1). Biological suspension is concentrated in the IVA, containing strain of influenza virus Aj / Leningrad. The volume of the concentrate is 1200 ml, the viral titer of DGA 1: 16384, the total protein content of 5.0 mg / ml, the concentration of ovalbumin, measured by the method of the reaction of indirect hemagglutination (RIGA), 200 µg / ml. Diafiltration of an IVA concentrate is carried out by a tris buffer. The washing ratio is 13. The diafiltration is carried out in the mode of supplying pressure pulses with an amplitude of 0.1 MPa. The tangential flow rate over the membrane is 0.18 m / s. Duration of pressure pulses 0.1 interval between pulses 0.1 s. Process yield 36 l / chm. The volume of concentrate after diafiltration 1200 ml, virus titer 1: 32768. The content of total protein by Youri 0,230 mg / ml, the content of ovalbumin 1 mg / ml. The degree of purification for protein is 22, the degree of purification for ovalbumin 200. Example 3. A filter press-type filter module with a working surface of 3000 cm is used. Meat of the Biopor type (as in Example 1). The initial biblogical suspenzi is a concentrated feeder on the medium containing E.Co li bacteria at a concentration of 1 / ml. The content of total protein in the supernatant after centrifugation is 2000 µg / ml, the suspension volume is 350 ml. Diafiltration is carried out with a physiological solution. The multiplicity of the diafiltering volume is 5. The diafiltration is carried out in the mode of supplying pressure pulses with a value of 0.08 MPa, a pulse duration of 20 s, and intervals between pulses of 20 s. The tangential flow velocity is over 0.1 m / s. The productivity of the process is 27 l / h m. After diafstratcii, the content of total protein in the supernatant is 80 μg / ml. The degree of purification of the protein is 25. Example 4. Equipment and membranes similar to example 1 were used for the control method of the prototype method. The module area is 11440 cm. The initial biological suspension is concentrated allantoic fluid (IVAH) containing the Al / Bangkok virus. The volume of the concentrate is 1000 ml, the virus according to the hemagglutination reaction (DSA) is 1: 8192, the total protein content according to Lowry is 4.65 mg / ml. 2000 ml of the IMA concentrate were divided equally for Example 1 and Example 4. The IVAR concentrate was purified to 0.130 mg / ml of Lowry total protein. Diafiltration was performed according to the mode of the prototype method. The speed of the tangential flow over the surface of the membrane is 1.1-1.7 m / s at a pressure of 0.35 MPa. Diafiltration solution - Tris-buffer (, 5 M, pH 7.2). The frequency of washing 38. The performance of the process 17 l / h-m. The volume of the VAZH concentrate after purification by diafiltration is 1000 ml, the virus titer according to DAA 1: 8192, the total protein content according to Lowry is 9.132 mg / ml. The degree of purification is 36. As a result of the implementation of the proposed method, with the selected rtaparameters of conducting it, the process productivity significantly increases, as evidenced by the data presented in the table. Compared with the known method, the proposed method allows speeding up the purification process of biological solutions by 2 times without losing their initial activity due to the exclusion of the formation of a gel-like concentration layer over the membrane surface.

ог-og-

tNtN

r rjr rj

CM CM

0000

CM 10.CM 10.

оabout

r- mr- m

о roabout ro

О tnO tn

oooo

- чО- cho

rr

-CM-Cm

«M"M

CMCM

vOvO

ГОGO

vOл vOl

0000

(1(one

t --елt -el

смСП Пsmsp n

о оoh oh

1Г| 1G |

юYu

ОvO vOOvo vo

vOvO

« «""

vt о vt o

со - смwith - see

CNCN

о о о Ioh oh I

1Л1L

юYu

ю оyoo o

гоgo

оabout

.0.0

АBUT

4141

1Л1L

ш оw o

1Л1L

оabout

о Йк :::about Ik :::

аS оaS o

Нсо .Nso.

жа: -и оMs: and o

в)а) г-1 cfс о ко и смc) a) d-1 cfc o ko and cm

о. гabout. g

trfо ы vO 00trfs vO 00

о о oh oh

«- о - см"- o - cm

о смo see

т-CTit-CTi

nсм-г- - Tinsm-g- - Ti

« "

г-ооg-oo

г ооg oo

шsh

0 0

г о about

0000

0000оо0000oo

г оо vOg oo vO

о о оLtd

о оoh oh

оabout

оооLtd

оabout

лллlll

оооLtd

,0, 0

оabout

о смo see

оabout

чh

VV

ч h

II

чh

«ч"H

чh

ftft

смcm

С-ч CNJCNJ

смcm

CNCN

смcm

о о oh oh

о о о о см 1о - - -тг - оо oh oh oh oh see 1o - - -tg

ч « о о о смh “oh oh oh see

о оо - см см смoo - see cm see

ш оw o

1Л «1Л11L "1L1

ю оyoo o

1Л1L

SS

1Л1L

1Г11G1

о оoh oh

оabout

ю оyoo o

1Л1L

SS

шsh

1Л1L

смcm

соwith

о оoh oh

оabout

АBUT

«ч"H

чh

оabout

о.about.

Claims

DIAGNOSIS OF CLEANING BIOLOGICAL SOLUTIONS BY THE DIAFILTRATION METHOD, including washing the solution with a solvent under pressure at a constant tangential flow of the solution in the apparatus above the membrane surface, which is different in that, in order to increase the productivity of the process, washing the solution with the solvent is carried out by applying impulses created in the apparatus to it pressure with a duration of 0.1-20 s with an interval of 0.1-20 s, while the tangential flow velocity at the inlet of the apparatus is 0.05-0.2 m / s. ''